活性型Ｆｃ受容体に選択的な抗体の製造方法
本発明は、ＩＴＡＭモチーフ(単数又は複数)(免疫受容体チロシン活性化モチーフ)を含む活性型抗体Ｆｃ領域受容体に選択的な抗体を製造する方法であって、以下のステップ：ハイブリドーマから、ヘテロハイブリドーマから、又は任意の動物、植物、又はヒト細胞株からモノクローナル抗体を取得し；当該抗体のＦｃ領域のＨｉｓ３１０及びＨｉｓ４３５残基(カバットの番号付け)の各々を、リジン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、又はスレオニンから選ばれる残基で置換し；そして次にＩＴＩＭモチーフ(免疫受容体チロシン抑制性モチーフ)を含む抑制型ＦｃＲへの結合性が、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に対して少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、７０％、８０％、又は少なく十９０％だけ低減される抗体を選択することを含む方法に関する。本発明は、癌及び感染性病変の治療において特に使用するための医薬の製造における本発明の方法から生成された抗体の使用にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＴＡＭモチーフ(免疫受容体チロシン活性化モチーフ)(単数又は複数)を含む活性型抗体Ｆｃ領域受容体(ＦｃＲ)に選択的な抗体を製造する方法であって、ハイブリドーマ、ヘテロハイブリドーマ、又は任意の動物、植物若しくはヒトの細胞株からモノクローナル抗体を取得し、当該抗体のＦｃ領域のＨｉｓ３１０及びＨｉｓ４３５残基(カバットの番号付け)の各々をリジン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、又はスレオニンから選ばれる残基で置換し、そしてＩＴＩＭモチーフ(免疫受容体チロシン抑制性モチーフ)を含む抑制型ＦｃＲへの結合性が、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に対して少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、７０％、８０％、又は少なくとも９０％だけ低減された抗体を選択することを含む、前記方法に関する。本発明は、特に癌及び感染症の治療用の医薬の製造における本発明の方法から得られた抗体の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
血漿又は生物工学由来の治療用の多くの抗体製剤が、現在市場に流通しているか、又は臨床開発フェーズにある。特異的に標的に結合し、そして効果的に免疫細胞をリクルートできる治療ツールを得るために、抗体の性質が利用される。
【０００３】
ここ数年間、研究は、抗体の有効性を改善すること、そしてより具体的に、定常Ｆｃ領域を操作することに向けられてきた。定常Ｆｃ領域こそが、抗体のエフェクター性質に関与し、定常Ｆｃ領域がエフェクター免疫細胞及び補体分子の動員を可能にする。この能力は、特定の免疫細胞上に糖タンパク質であるＦｃ受容体、つまりＦｃＲが存在することにより可能になる。これらの受容体は、特に、抗体がその可変領域により標的抗原に結合すると、当該抗体の定常領域に結合できる。これらの細胞と接触すると、抗体は貪食及びＡＤＣＣ(抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用)などの種々の細胞メカニズムを引き起こす。
【０００４】
しかしながら、種々のヒトＦｃＲクラスが存在する。後者は、染色体１に位置する８種のヒト遺伝子によりコードされる。これらの遺伝子のあるものは、異なる受容体アロタイプを生成し、異なるＩｇＧ結合性質を有するアレル多型を示し(Hulett M. D. & Hogarth P.M., Advances in Immunology, vol. 57, Blood, Vol. 99, no.3, 754-758)、異なるエフェクター性質を導く(Cartonら、(２００２)blood, vol. 99, no. 3, 754-758)。同定された主要なヒトＦｃＲクラスは、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４、Ａ及びＢイソ型を有する)、ＦｃγＲＩＩ受容体(ＣＤ３２、Ａ及びＢイソ型を有する)及びＦｃγＲＩＩＩ受容体(ＣＤ１６、Ａ及びＢイソ型を有する)である。ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩ受容体、並びにＦｃγＲＩＩＡ受容体は、その配列又は鎖に付随する配列が有するＩＴＡＭモチーフを用いて活性化されると、標的細胞の溶解などのエフェクター機能を引き起こすことができるので「活性型」と分類される。逆に、ＦｃγＲＩＩＢ受容体は、その配列が含むＩＴＩＭモチーフを介して受容体を活性化する伝達経路を抑制し、そしてＦｃＲ、或いはＢ細胞抗原受容体(ＢＣＲ)又はｃ-ｋｉｔなどの成長因子受容体などの他の表面分子を介して誘導されるＡＤＣＣメカニズムなどのエフェクターメカニズムを負に調節するので、「抑制型」受容体と分類される。
【０００５】
その結果、ＦｃＲ受容体の多様度、特に同じ細胞上で発現される活性型ＦｃＲと抑制型ＦｃＲの存在は、治療抗体の有効性を調節することができ、抑制型のＦｃＲの関与が、活性型ＦｃＲの関与と平衡を保つことができる。
【発明の開示】
【０００６】
その結果、治療抗体であって、その有効性、つまり、多様なＦｃＲ受容体により、特に抑制型ＦｃＲにより全く又はわずかだけしか調節されないエフェクター免疫細胞を活性化する能力を有する抗体を提供することが出願人の意図である。
【０００７】
WO2005/040216の文献の出願人は、一次配列を改変した抗体であって、ＩｇＧ４置換治療、又は移植片拒絶の予防のため、或いは抗破傷風、抗ジフテリア薬として、又は病原体又は派生される毒素に対する薬剤として特に有用であるように改変された抗体を記載する。
【０００８】
しかしながら、驚くべきことに、このように改変された抗体が、活性型受容体に依存したエフェクター機能を誘導する能力を保ち、一方、抑制型受容体をリクルートする能力を最早持たなかったということを本出願人が発見した。
【０００９】
その結果、治療抗体であって、その有効性、つまりエフェクター免疫細胞を活性化する能力が、多様なＦｃＲ受容体、特に抑制型ＦｃＲによって全く調節されないか、又はわずかにしか調節されないところの、治療抗体を提供することを可能とする方法を出願人は開発した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、第一に、活性型ＦｃＲをリクルートする能力を有するが、抑制型ＦｃＲをリクルートする能力が、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に比べて低減された抗体(つまり、当該抗体のＦｃ領域は、活性型の抗体Ｆｃ領域受容体(ＦｃＲ)に選択的に結合する)を製造する方法であって、以下のステップ：
ａ) ハイブリドーマ、ヘテロハイブリドーマ、又は任意の動物、植物、又はヒトの細胞株からモノクローナル抗体を取得し；
ｂ) 抗体のＦｃ領域のＨｉｓ３１０及びＨｉｓ４３５残基(カバットの番号付け)の各々を、リジン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、又はスレオニンから選ばれる残基で置換し；
ｃ) Ｆｃ領域の抑制型ＦｃＲへ結合が、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に比べて少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、７０％、８０％、又は少なくとも９０％だけ低減される抗体を選択する
を含む、前記方法に関する。
【００１１】
本発明の目的では、「抗体」は、その特異性及びそのイソ型に関わらず、Ｆｃ領域、又はＦｃ領域と同じ機能及び同じ特徴を有する領域を含む、任意の抗体を意味する。こうして、抗体は、全抗体又は抗体断片、例えば、Ｆｃ抗体断片、又はＦｃ領域をその末端の一つに含む融合分子でありうる。さらに、本発明に記載される方法において使用される抗体は、ＩｇＧ、つまり任意のＩｇＧ１、任意のＩｇＧ２、任意のＩｇＧ３(Ｇ３ｍ(ｓ)又はＧ３ｍ(ｓｔ)アロタイプ)及び任意のＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＤ、又はそれらの１以上の混合物でありうる。さらに、本発明に記載される方法に使用される抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体の場合、これらの抗体は、キメラ、ヒト化、ヒト又は動物由来でありうる。
【００１２】
さらに、「抗体」という用語は、同じ生物学的システムにおいて発現される同じアミノ酸配列を有する抗体分子から構成され、そして少なくとも１の賦形剤又は医薬として許容されるビヒクルを含む抗体組成物であって、当該組成物が予防及び／又は治療目的のために医薬投与を可能にするために剤形された組成物を指す。
【００１３】
ステップｂ)の終わりに、本発明の改変抗体をコードする配列は、適切な生物学的システムで発現される(ステージｂ')。
【００１４】
本発明の目的では、「同じ抗体」は、本発明のプロセスにおけるステップｂ)に従い、そして本発明の改変抗体と同じ生物学的生産システムにおいて産生された非改変抗体を意味する。「同じ抗体」は、同じ天然の一次配列(但し、本発明の抗体において改変されたＨｉｓ３１０とＨｉｓ４３５残基は除く)を有し、そして同じ生物学的システムにおいて産生されるので、本発明の方法により得られる抗体と同じ翻訳後修飾が付される。
【００１５】
本発明の目的では、ステップａ)の抗体は、モノクローナル抗体組成物の形態で得られる。各モノクローナル抗体組成物は、同じアミノ酸配列を有し、そうして、同じ特異性を有し、同じ生物学的システムにおいて発現される抗体分子から構成される。これらの組成物は適宜、少なくとも１の賦形剤又は医薬として許容されるビヒクルを含むことができ、その結果、これらの組成物は、予防及び／又は治療目的のために医薬投与を可能にするように剤形されうる。
【００１６】
ステップａ)の抗体は、天然Ｆｃ領域を含む。つまり、当該抗体は、そのＦｃ領域の３１０位及び４３５位(カバット番号付け)においてヒスチジン残基を有する。好ましくは、このような抗体のＦｃ領域は、活性型受容体と抑制型受容体の両方に結合できる。本発明の目的では、「抗体の天然Ｆｃ領域」は、Ｈｉｓ３１０とＨｉｓ４３５残基について、化学的又は生命工学的方法によって改変されていないＦｃ領域を意味する。より具体的に、「抗体の天然Ｆｃ領域」は、Ｆｃ領域のＨｉｓ３１０及びＨｉｓ４３５残基が、化学的又は生命工学的方法によって、リジン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、又はスレオニンから選ばれる残基で置換されていないＦｃ領域を意味する。
【００１７】
一例として、本発明において利用される抗体は、抗-Ｅｐ-ＣＡＭ、抗-ＫＩＲ３ＤＬ２、抗-ＥＧＦＲ、抗-ＶＥＧＦＲ、抗-ＨＥＲ１、抗-ＨＥＲ２、抗-ＧＤ、抗-ＧＤ２、抗-ＧＤ３、抗-ＣＤ２０、抗-ＣＤ２３、抗-ＣＤ２５、抗-ＣＤ３０、抗-ＣＤ３３、抗-ＣＤ３８、抗-ＣＤ４４、抗-ＣＤ５２、抗-ＣＡ１２５及び抗-タンパク質Ｃ、抗-ＨＬＡ-ＤＲ、抗ウイルス：ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ及びＲＳＶから選ぶことができ、そしてより具体的には、以下の表１の抗体から選ぶことができる。
【００１８】
【表１】
【００１９】
本発明の目的では、「活性型抗体Ｆｃ領域受容体(ＦｃＲ)に選択的な抗体」又は「そのＦｃ領域が活性型抗体Ｆｃ領域受容体(ＦｃＲ)に選択的に結合するところの抗体」は、活性型ＦｃＲをリクルートする能力を有するが、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に比べて抑制型ＦｃＲに寄与する能力が低減されているか又は当該能力を全く有さない全ての抗体を意味する。
【００２０】
こうして、本発明の抗体は、活性型ＦｃＲをリクルートする(つまり、そのＦｃ領域により結合する)能力を有するが、抑制型ＦｃＲ受容体に寄与する(つまり、そのＦｃ領域により結合する)能力は、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に比べて低減されるか、又は失われている。
【００２１】
活性型ＦｃＲは、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＡ及びＦｃγＲ１Ｂ、ＦｃγＲ、ＦｃγＲ１及びマウスにおいて記載されたＦｃγＲＩＶのヒト相当物を意味する。抑制型ＦｃＲは、ＦｃγＲＩＩＢを意味する。
【００２２】
ステップｃ)の間に、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に比べてＦｃＲへの結合性が低下された抗体(複数)、つまり種々の抗体組成物を選択することができる。この低下は、例えば、本発明の抗体が結合するＦｃＲを発現する細胞の数又は割合を定量し、そして天然Ｆｃ領域を有する抗体が結合するＦｃＲを発現する細胞の数又は割合を比較することによって計測することができる。
【００２３】
本発明の好ましい実施態様では、ステップｃ）において、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に比べて抑制型ＦｃγＲへの結合が失われている抗体(複数)、つまり種々の抗体組成物は、以前に記載された方法と同様の方法に従って選択される。こうして、本発明の方法に従って調製された抗体は、活性型ＦｃＲに結合するが、抑制型受容体に結合しないＦｃ領域を有する。一方、同じ生物学的システムにより産生されるが、本発明の方法に従って改変されていないＦｃ領域を有する同じ抗体は、そのＦｃ領域により、活性型ＦｃγＲ及び抑制型ＦｃγＲに結合する。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様では、Ｈｉｓ３１０とＨｉｓ４３５残基は、リジン残基に置換される。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様では、Ｈｉｓ３１０とＨｉｓ４３５残基は、部位特異的変異誘導又は分子進化によって置換される。
【００２６】
別の実施態様では、Ｈｉｓ３１０とＨｉｓ４３５残基は、化学処理によって、例えばＤＥＰＣ(ジエチルピロカーボネート、当該物質はヒスチジン改変薬である)での処理により改変される。
【００２７】
抗体のＣＨ２/ＣＨ３境界に位置する２の特定のヒスチジン残基Ｈｉｓ３１０及びＨｉｓ４３５を、リジン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン又はスレオニンから選ばれる残基により、そして好ましくはリジンにより変異誘導することは、このように改変された抗体の抑制型ＦｃＲ、特にＦｃγＲＩＩＢに対する結合性に主要な影響を与え、そして活性型ＦｃＲ、特にＦｃγＲＩＩＩＡに対する抗体の結合性について中程度の影響を与えるということを出願人は驚くべきことに発見した。このように改変された本発明の抗体がもはや、又は実質的にもはやｉｎ ｖｉｔｒｏ結合試験において抑制型ＦｃγＲＩＩＢ受容体に結合せず、一方、変異誘導をされていない抗体に比べて、活性型ＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＡ受容体への結合性がかなり部分的にしか阻害されていないということを出願人は示した(以下を参照のこと)。この変異誘導された抗体は、抑制型ＦｃγＲＩＩＢへの関与を避けることにより、ＡＤＣＣ型の細胞毒性に関わる活性型受容体(ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＡ)に寄与できる抗体である。その結果、ＦｃγＲＩＩＢの寄与に続いてＡＤＣＣが負に調節されることなく、このような抗体は、標的細胞(赤血球、腫瘍細胞、アロ反応性細胞、微生物病原に感染した細胞)に対してＡＤＣＣを誘導することを可能にする。この変異誘導された抗体を含む免疫複合体が、樹状細胞上に同様に存在する抑制型ＦｃγＲＩＩＢを活性化することなく、樹状細胞上に発現される活性型ＦｃγＲによってのみ捕捉されるという事実のため、このような抗体が、樹状細胞による抗原提示を最適化することを可能にする。
【００２８】
活性型受容体及び抑制型受容体についての「示差的」振舞いは、本発明の抗体を治療に、特に癌又は感染病原体の枠組みの中で抗体を用いるために必須の利点である。実際、このような抗体は、ＡＤＣＣメカニズムが抑制型ＦｃγＲにより負に調節されることなく、活性型ＦｃγＲを介してＡＤＣＣメカニズムを誘導することができる。さらに、このような抗体が、樹状細胞上の活性型ＦｃγＲのみをリクルートし、そして同じ細胞の表面に存在する抑制型ＦｃγＲをリクルートすることはないということを出願人は発見した。樹状細胞の表面の抑制型ＦｃγＲの関与が、これらの細胞の成熟について及び抗原をエフェクターＴリンパ球に対して効果的に提示する能力について負の影響を与えるということが近年示されてきた。抗原と複合体形成したこのような抗体が、樹状細胞の表面に発現された活性型ＦｃγＲのみを認識し、そして抑制型ＦｃγＲを認識しない場合、当該事象により生じた樹状細胞による抗原提示が最適であり、そして最適化された特異的免疫応答の活性化の効果が最適化される。
【００２９】
有利な態様では、本発明の方法から生じた抗体のＦｃ領域が、活性型Ｆｃ受容体に結合し、その一方で当該Ｆｃ領域は、抑制型Ｆｃ受容体には結合しない。
【００３０】
有利な態様では、本発明の方法の抗体は、抑制型Ｆｃ受容体、特にＢリンパ球により発現される抑制型Ｆｃ受容体をリクルートすることはない。
【００３１】
特に有利な態様では、本発明の方法の抗体は、抑制型Ｆｃ受容体をリクルートしないが、Ｂリンパ球の表面の分子には結合する。
【００３２】
有利な態様では、本発明の抗体は、抑制型Ｆｃ受容体をリクルートしないが、腫瘍細胞の表面、特に腫瘍性Ｂリンパ球の表面の分子に結合する。
【００３３】
有利な態様では、本発明の抗体は、抑制型Ｆｃ受容体をリクルートすることはないが、Ｂ-ＣＬＬ腫瘍性リンパ球の表面の分子に結合する。有利な態様では、本発明の抗体は、抑制型Ｆｃ受容体をリクルートすることはないが、Ｂ-ＣＬＬ腫瘍性リンパ球の表面のＣＤ２０分子に結合する。
【００３４】
特に有利な態様では、本発明の方法の抗体は、ＦｃγＲＩＩＩ受容体(Ａ及びＢイソ型)、及び/又はＦｃγＲＩＩＡ受容体、及び/又はＦｃγＲＩ受容体(Ａ及びＢイソ型)に結合し、その一方、当該抗体は、ＦｃγＲＩＩＢ受容体(Ｂ１及びＢ２イソ型)には結合しない。具体的な実施態様では、ＦｃγＲＩＩＢ受容体は、ＦｃγＲＩＩＢ１受容体である。
【００３５】
好ましくは、本発明の方法に関与する受容体は、ヒト受容体である。
【００３６】
本発明の特定の実施態様では、抗体のＦｃ領域の受容体は、単球、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、及びＢリンパ球に位置する。
【００３７】
本発明の別の特定の実施態様では、当該抗体のＦｃ領域の抑制型受容体は、腫瘍細胞、例えば悪性メラノーマ細胞、腫瘍性Ｂリンパ球、例えばリンパ腫、Ｂ-ＣＬＬ(Ｂ慢性リンパ白血病)細胞及びミエローマ細胞上に位置する。
【００３８】
有利な態様では、本発明の方法の抗体は、その可変領域により、Ｂ-ＣＬＬ腫瘍性リンパ球の表面でＣＤ２０分子に結合する。本発明のこのような抗体は、特にＢ-ＣＬＬ腫瘍性リンパ球の表面に存在する抑制型Ｆｃ受容体をリクルートしない。
【００３９】
有利な態様では、本発明の「ｍ」の文字で表された抗体は、モノクローナル抗体である。これらのモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体組成物の形態で任意の適切な生物学的システムにより生産することができ、当該組成物は、少なくとも１の賦形剤又は医薬として許容されるビヒクルを含み、その結果、これらの組成物は、予防及び/又は治療目的のため医薬の投与を許容するために剤形することができる。「生物学的システム」は、当該抗体を発現するために、１以上のベクターを用いてトランスフェクションされた動物又は植物細胞株、植物又は非ヒトトランスジェニック動物、並びに任意のハイブリドーマ、ヘテロハイブリドーマを意味する。これらの細胞の中から、当該抗体をコードする遺伝子を含むベクターを用いてトランスフェクションされた細胞株から生じた細胞、例えば真核細胞又は原核細胞、特に哺乳動物、昆虫、植物、細菌、又は酵母の細胞を選択することができる。優先的に、ラット骨髄腫細胞、例えばＹＢ２／０(ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１６６２)を用いる。
【００４０】
ＣＨＯ細胞、特に、ＣＨＯ-Ｋ、ＣＨＯ-Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ-Ｌｅｃ１０ ＣＨＯ Ｐｒｏ-５、ＣＨＯ ｄｈｆｒ-、或いはＷｉｌ-２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ-４、ＣＯＳ-７、２９３-ＨＥＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳＯ、ＳＰ２／０-Ａｇ１４及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８.６５３、ＰＥＲＣ６又はＢＨＫを使用することも可能である。
【００４１】
本発明の別の目的は、抗感染及び抗腫瘍ワクチン化を意図した医薬の製造のための、Ｆｃ領域のＨｉｓ３１０及びＨｉｓ４３５残基(カバット番号付け)の各々が、リジン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン又はスレオニンから選ばれる残基により置換された抗体、又は本発明の方法により得られた抗体の使用であり、ここで本発明の抗体は、抗原提示細胞(単球、マクロファージ、樹状細胞、上皮ランゲルハンス細胞、Ｂリンパ球)の活性型ＦｃＲγにのみ結合することができる免疫複合体に寄与する。
【００４２】
好ましくは、このような医薬の製造のために、そのＦｃ領域のＨｉｓ３１０及びＨｉｓ４３５残基(カバット番号付け)の各々が、リジン残基で置換された抗体が用いられる。
【００４３】
本発明の別の対象は、癌の治療、及びより好ましくはリンパ腫、白血病、骨髄所、サルコーマ、固形腫瘍、例えば哺乳動物癌腫、直腸腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、胃腫瘍、胚腫瘍、卵巣腫瘍、子宮頚部腫瘍、眼腫瘍、甲状腺腫瘍、ＥＮＴスフィアの腫瘍(tumeurs de la sphere ORL)、悪性メラノーマ、神経腫瘍、例えば膠芽細胞腫、及び神経芽細胞腫の治療のための医薬の製造のための、Ｈｉｓ３１０とＨｉｓ４３５残基(カバットの番号付け)の各々が、リジン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、又はスレオニンに置換された抗体、又は本発明の方法により産生された抗体の使用に関する。
【００４４】
好ましくは、このような医薬の製造のために、そのＦｃ領域のＨｉｓ３１０及びＨｉｓ４３５残基(カバットの番号付け)の各々が、リジン残基で置換された抗体が使用される。
【００４５】
本発明の別の対象は、感染性疾患、例えばＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＲＳＶ(呼吸器合胞体ウイルス)、ＳＡＲＳウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、天然痘による感染、細菌感染、例えばコッホ杆菌、髄膜炎菌、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Criptococcocus neoformans)、クロストリジウム、ボツリヌス中毒症、炭疽、破傷風、結核、及び腸球菌感染の原因となる細菌により引き起こされる感染の治療用の医薬を製造するための、Ｈｉｓ３１０及びＨｉｓ４３５残基(カバットの番号付け)が、リジン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、又はスレオニンにより置換される抗体、或いは本発明の方法により産生される抗体の使用である。
【００４６】
好ましくは、このような医薬の製造のため、そのＦｃ領域の各Ｈｉｓ３１０及びＨｉｓ４３５残基(カバットの番号付け)がリジン残基で置換された抗体が使用される。
【００４７】
最終的に、本発明の最後の態様は、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に比べて、抑制型ＦｃＲへの結合が、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、７０％、８０％、又は少なくとも９０％又は１００％だけ低減される、抗体組成物に関する。
【００４８】
好ましくは、本発明の組成物は、抗体のＦｃ領域が、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に比べて、抑制型受容体に結合する能力が失われた組成物である。
【００４９】
特に有用な態様では、本発明の組成物は、抗-ＣＤ２０抗体組成物である。
【００５０】
本発明の他の態様及び利点は、以下の実施例に記載され、この実施例は例示と認められ、そして本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００５１】
実施例１：Ｈｉｓ３１０-４３５Ｌｙｓの二重変異を有する抗体の製造
トランスフェクションされ、そしてＥＭＡＢ５抗体(WO 2005/040216に記載される)(当該抗体は、Ｒｈ(Ｄ)抗原に対するヒトＩｇＧ１(γ)である)を産生する細胞株ＹＢ２／０(ラット骨髄腫株、ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１６６２号)を無血清培地中における培養に適用した。
ＥＭＡＢ５をセファロース-タンパク質Ａ上でアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
ＨＰＣＥ-ＬＩＦにより、大部分のグリカン構造が、二分岐型の多糖であり、約２５％のフコースを含むということが示された。
【００５２】
断片の調製
精製されたＥＭＡＢ５を５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８.０に対して一晩透析した。５０ｍＭ・ＣａＣｌ2及び１０ｍＭシステインに調節された抗体溶液を、３０分間３７℃でインキュベートし、次にトリプシン溶液(１ｍｇ／ｍｌ)を、酵素／基質比１／２５で加えた。
５分間３７℃でインキュベートした後に、ジイソプロピルフルオロホスフェート(１ｍＭ、終量)を添加することにより反応を止めた。加水分解物を、５０ｍＭイミダゾール緩衝液、ｐＨ７.８に対して一晩透析した。
Ｆｃ断片の精製のため、透析された加水分解物を抗体３.６ｇあたり１ｍｌのゲルの割合で、タンパク質Ｌ-アファロースと接触させた。攪拌下で室温にて4時間インキュベートした後に、ゲルをカラムにロードし、そして５０ｍＭイミダゾール緩衝液、ｐＨ７.８で洗浄した。Ｆｃ断片を含む流出物及び洗浄緩衝液を合わせ、そして製造者により記載された条件を用いてＶｉｖａｓｐｉｎ２０で遠心することにより濃縮した。
【００５３】
部位特異的変異誘導：
抗Ｒｈ(Ｄ)抗体ＥＭＡＢ５の重鎖のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、ＰＣＲによる二重部位特異的変異誘導を行なうためのマトリックスとして用いた(ＰＣＲ-に基づく部位特異的変異誘導)。以下の４つのヌクレオチド置換を導入した：
- Ｈｉｓ３３８残基(カバット番号付けによると３１０位)をＬｙｓへと変換するＣ１２２９Ａ及びＣ１３０１Ｇ、つまりＣＡＣ→ＡＡＧ；
- Ｈｉｓ４６３残基(カバット番号付けによると４３５位)をＬｙｓへと変異誘導するＣ１６７４Ａ及びＣ１６７６Ｇ、つまりＣＡＣ→ＡＡＧ。
【００５４】
変異誘導された抗体の重鎖は、ヌクレオチド配列では配列番号１、そしてペプチド配列では配列番号２(変異誘導されたアミノ酸が、配列番号２において３３８位及び４６３位に現れる。これらはそれぞれアミノ酸Ｌｙｓ３１０及びＬｙｓ４３５に相当する)を有する。番号付けは、リーダー配列を考慮する(３３８及び４６３位)か、又は考慮しない(後者において、いわゆるカバットの番号付けで、３１０及び４３５位が用いられる)。
【００５５】
変異誘導されたＥＭＡＢ５-Ｈ-Ｋ３３８-Ｋ４６３-１ベクターとＥＭＡＢ５抗体の軽鎖をコードするＥＭＡＢ５-ｄｈｆｒ-Ｋ-ＳｐｅＩベクターを電気穿孔により共トランスフェクトしたＹＢ２／０細胞を、５％透析済みＦＣＳ、０.５％Ｇ４１８、及び２５ｎＭのメトトレキセート(ＭＴＸ)を加えたＲＰＭＩ培地中で培養した。最も高いレベルのヒトＩｇＧを分泌するクローンを、ＭＴＸを伴わない培地中で２４ウェルプレート上で培養した。７日間の培養後に回収した上清を、以下に記載される試験を行なうために用いた。
【００５６】
実施例２：ヒトＩｇＧ１／ＦｃＲγ相互作用についての、ジエチルピロカーボネート(ＤＥＰＣ)による抗-ＲｈＤモノクローナルＩｇＧ１のＣＨ２／ＣＨ３境界におけるヒスチジンの改変の効果
ヒトＩｇＧ１／ＦｃγＲ相互作用についてのヒトＩｇＧ１のヒスチジンの改変の影響を試験するために、抗ＲｈＤモノクローナル抗体、Ｔ１２５(ＹＢ２／０)をジエチルピロカーボネート(ＤＥＰＣ)で処理した。ＤＥＰＣは、ヒスチジン環の窒素原子と、ＤＥＰＣ分子の炭素原子との間に共有結合を生成することにより、ヒスチジン残基を改変する。ＤＥＰＣで処理されるか又は処理されなかったモノクローナル抗体を、タンパク質Ａ-セファロースのカラムで分画した。ヒスチジン４３５は、タンパク質ＡへのＩｇＧの結合に重要であり、ＤＥＰＣで処理され、そしてタンパク質Ａに保持されないモノクローナル抗体の画分は、少なくともＨｉｓ435残基が改変されたＩｇＧ１に相当する。ＤＥＰＣで処理されないか又は処理され、そしてタンパク質Ａに保持されないモノクローナル抗体Ｔ１２５(ＹＢ２／０)は、異なるタイプのヒトＦｃＲγに対する結合性について比較された(図１)。ジエチルピロカーボネート(ＤＥＰＣ)で処理されるか又は処理されていない抗ＲｈＤモノクローナル抗体Ｔ１２５(ＹＢ２／０)のヒトＦｃγＲＩＩＩＡ(Ａ)、ＦｃγＲＩＩＡ(Ｂ)、ＦｃγＲＩＩＢ１(Ｃ)及びＦｃγＲＩ(Ｄ)(ｈＦｃγＲ)への結合性を間接的な免疫蛍光により分析した。指標細胞であるＪｕｒｋａｔ-ＨｕＦｃＹＲＩＩＩＡ(Ａ)、Ｋ５６２(Ｂ)、ＩＩＡ.１.６-ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１(Ｃ)及びＴｆ２-１３(Ｄ)を、ＤＥＰＣで処理されたか又は処理されていない種々の濃度のＴ１２５(ＹＢ２／０)とインキュベートした。モノクローナル抗体の結合を、ＦＩＴＣに結合されたマウス抗ヒトＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)Ｆ(ａｂ')2により検出した。Ｔ１２５(ＹＢ２／０)は、低濃度(０.０５μｇ／ｍｌ〜)においてＦｃγＲＩＩＩＡに結合し、そして０.５μｇ／ｍｌでかなり顕著な結合を示した(９５％が陽性細胞)。このモノクローナル抗体をＤＥＰＣで処理した場合、高濃度(１〜５μｇ／ｍｌ)の濃度で低下し(１μｇ／ｍｌで約９０％低下し)、そして低濃度(０.０２５μｇ／ｍｌ〜０.０５μｇ／ｍｌ)で悪くなった(図１Ａ)。ＤＥＰＣでの処理は、(それぞれ５０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌで)Ｔ１２５(ＹＢ２／０)のＦｃγｒＩＩＡへの結合性の７６％及び６４％の低下を誘導した。同様に、ＤＥＰＣで処理されたＴ１２５(ＹＢ２／０)のＦｃγＲＩＩＢ１への結合性は、５０μｇ／ｍｌで低下し、ＤＥＰＣで処理されたＴ１２５(ＹＢ２／０)の結合性は悪く、一方、同じ濃度の未処理のＴ１２５(ＹＢ２／０)では、約４０％の細胞が陽性であった(図１Ｃ)。他方、ＤＥＰＣによるｍＡｂの改変は、ＦｃγＲＩへの結合性について中程度の効果を有する。ＤＥＰＣでの処理は、０.５μｇ／ｍｌと１μｇ／ｍｌにおけるＴ１２５(ＹＢ２／０)のＦｃγＲＩへの結合性について１５％の低下をもたらした(図１Ｄ)。
【００５７】
結論として、Ｔ１２５(ＹＢ２／０)中に存在するヒスチジンをＤＥＰＣによりブロッキングすることは、そのＦｃγＲＩＩＩＡ(図１Ａ)、ＦｃγＲＩＩＡ(図１Ｂ)、ＦｃγＲＩＩＢ(図１Ｃ)に対する結合性を低下し、そして、ヒトＦｃγＲＩ(図１Ｄ)に対してそれより少しの程度だけ結合性を低下させる。
【００５８】
実施例３：ヒトＩｇＧ１／ＦｃγＲ相互作用についての抗ＲｈＤモノクローナルＩｇＧ１のＨｉｓ４３５とＨｉｓ３１０残基の変異誘導の効果
モノクローナルＩｇＧ１のＨｉｓ残基の改変が、ヒトＦｃγＲとの相互作用に影響するということが前述の結果により示唆された。しかしながら、ＤＥＰＣでの処理では、どのＨｉｓが改変されたかを決定することはできなかった。
【００５９】
構造試験は、ＩｇＧ１／ＦｃγＲ相互作用におけるＩｇＧ１のヒンジ領域のいずれかの側に位置するＨｉｓ435とＨｉｓ310の重要性を示した。それゆえ、モノクローナル抗体のヒトＦｃＲγへの結合性について、Ｔ１２５(ＹＢ２／０)のＨｉｓ４３５とＨｉｓ３１０残基のリジンへの変異誘導の効果を試験した(図２)。モノクローナル抗体(Ｔ１２５(ＹＢ２／０)又は二重変異体Ｔ１２５(ＹＢ２／０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ435ＬｙｓのヒトＦｃγＲＩＩＩＡ(Ａ)、ＦｃγＲＩＩＡ(Ｂ)、ＦｃγＲＩＩＢ１(ｃ)及びＦｃγＲＩ(Ｄ)(ｈＦｃγＲ)に対する結合性を、間接的免疫蛍光により分析した。指標細胞であるＪｕｒｋａｔ-ｈｕＦｃγＲＩＩＩＡ(Ａ)、Ｋ５６２(Ｂ)、ＩＩＡ.１.６-ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１(Ｃ)、及びＴｆ２-１３(Ｄ)を、種々の濃度のＴ１２５(ＹＢ２／０)又は二重変異体Ｔ１２５(ＹＢ２／０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ435Ｌｙｓとインキュベートした。ｍＡｂの結合性を、ＦＩＴＣに結合されたマウス抗ヒトＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)Ｆ(ａｂ')2断片により検出した。変異誘導していない抗体の結合性に比べて、ＪａｒｋａｔＣＤ１６細胞により発現されるヒトＦｃγＲＩＩＩＡへの二重変異体Ｔ１２５(ＹＢ２Ｏ)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ435Ｌｙｓの結合性はわずかに低下した(図２Ａ)。この結合性は、ヒトＦｃγＲＩＩＡを発現する指標細胞(Ｋ５６２)を用いて行った場合に低下した(図２Ｂ)。対照的に、Ｔ１２５(ＹＢ２／０)Ｈｉｓ３１０とＨｉｓ４３５残基の変異誘導は、完全に当該抗体のヒトＦｃγＲＩＩＢ１への結合性を無くしてしまう(図２Ｃ)。Ｔ１２５(ＹＢ２０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ435ＬｙｓのヒトＦｃγＲＩへの結合性は影響されなかった(図２Ｄ)。
【００６０】
実施例４：そのエフェクター性質についての抗-ＲｈＤモノクローナルＩｇＧ１のＨｉｓ435とＨｉｓ310の変異誘導効果
出願人は、当該抗体の活性化エフェクター機能についてのＴ１２５(ＹＢ２／０)のＨｉｓ３１０とＨｉｓ４３５の残基の変異誘導の効果を分析した。
Ｊｕｒｋａｔ-ｈｕＦｃγＲＩＩＩＡ、つまりＦｃγＲＩＩＩＡ＋細胞、によるＩＬ-２の産生を誘導する二重変異体及び変異誘導をされてないモノクローナル抗体の能力は、ＥＬＩＳＡにより比較された(図３)。３回の異なる実験から得られた結果を標準化するために、異なる量のモノクローナル抗体により誘導されるＩＬ-２の産生量を、１０μｇ／ｍｌのＴ１２５(ＹＢ２／０)により誘導されるＩＬ-２の産生量の割合として報告した。このＴ１２５(ＹＢ２／０)の量は、行なわれた全ての実験において検出されたＩＬ２における最大産生量をもたらす量に一致した。１、５、及び１０μｇ／ｍｌの変異誘導体Ｔ１２５(ＹＢ２／０)により産生されるＩＬ-２の産生量は、変異誘導を行なっていないモノクローナル抗体の同じ量により誘導されるＩＬ-２の放出に対して、それぞれ６１％、５３％、及び５４％だけ低減した(図３)。Ｊｕｒｋａｔ-ｈｕＦｃγＲＩＩＩＡ(ＦｃγＲＩＩＩＡ＋)細胞は、３７℃で１５時間、種々の濃度のＴ１２５(ＹＢ２／０)又は二重変異体Ｔ１２５(ＹＢ２０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ４３５／Ｌｙｓにより、ラビット抗ヒトＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)Ｆ(ａｂ')2断片の存在下で刺激して、抗ＲｈＤヒトモノクローナル抗体を凝集させた。Ｊｕｒｋａｔ-ｈｕＦｃγＲＩＩＩＡ細胞によるＩＬ-２の産生は、次にＥＬＩＳＡにより検出した。種々の濃度の２個のｍＡｂの存在下において誘導されたＩＬ-２の産生量は、１０μｇ／ｍｌのＴ１２５(ＹＢ２／０)により誘導されるＩＬ-２の割合として報告した。
【００６１】
これらの結果により、モノクローナルＩｇＧ１のＣＨ２／ＣＨ３境界におけるＨｉｓ３１０とＨｉｓ４３５の改変が、このｍＡｂのヒトＦｃγＲＩＩＩＡへの結合性を部分的に低下させ、そしてこれらの活性型ＦｃＲγに依存したサイトカインの産生を誘導する能力を部分的に低下させた。それにもかかわらず、二重変異体モノクローナル抗体Ｔ１２５(ＹＢ２０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ435Ｌｙｓは、活性型ＦｃγＲＩＩＩＡのリクルートを可能にし、そしてこれらの受容体に依存したエフェクター機能の活性化を誘導できた。
【００６２】
実施例５：Ｔ１２５(ＹＢ２／０)、Ｔ１２５(ＹＢ２／０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ435Ｌｙｓ及びＴ１２５(ＣＨＯ)のヒトＦｃγＲへの関与プロファイルの比較
二重変異モノクローナル抗体Ｔ１２５(ＹＢ２０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｙｓ４３５Ｌｙｓが活性型受容体(ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＡ)への関与を可能とするが、抑制型ＦｃγＲＩＩＢに結合するその能力を欠いていることをこれまでの実験が示した。このモノクローナル抗体の振舞いをよりよく特徴付けるために、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢへのその結合性を、Ｔ１２５(ＣＨＯ)の結合性と比較した(図４)。ここで、Ｔ１２５（ＣＨＯ）について、構造的な性質及び種々のタイプのＦｃγＲとの関与のプロファイルが正確に規定されていた。。(Ａ)及び(Ｃ)、ｍＡｂ Ｔ１２５(ＹＢ２／０)、Ｔ１２５(ＹＢ２／０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ435Ｌｙｓ及びＴ１２５(ＣＨＯ)の、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ(Ａ)、及びＦｃγＲＩＩＢ１(Ｃ)への結合性を、間接的な免疫蛍光により分析した。指標細胞であるＪｕｒｋａｔ-ｈｕＦｃγＲＩＩＩＡ(Ａ)、又はＩＩＡ.１.６-ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１(Ｃ)を種々の濃度のＴ１２５(ＹＢ２／０)、Ｔ１２５(ＹＢ２／０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ435Ｌｙｓ及びＴ１２５(ＣＨＯ)とインキュベートした。モノクローナル抗体の結合性を、ＦＩＴＣに結合されたマウス抗ヒトＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)Ｆ(ａｂ')2断片により検出した。
【００６３】
(Ｂ)及び(Ｄ)、３Ｇ８-ＰＥ抗体(抗ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＩＩＢ)(Ｂ)又はＡＴ１０-ＦＩＴＣ(抗-ヒトＦｃγＲＩＩＡ/ＩＩＢ)(Ｄ)の結合性を抑制するモノクローナル抗体Ｔ１２５(ＹＢ２／０)、Ｔ１２５(ＹＢ２／０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ435Ｌｙｓ及びＴ１２５(ＣＨＯ)の能力を比較した。指標細胞であるＪｕｒｋａｔ-ｈｕＦｃγＲＩＩＩＡ(Ｂ)又はＩＩＡ.１.６-ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１(Ｄ)を種々の濃度のＴ１２５(ＹＢ２/０)、又はＴ１２５(ＹＢ２/０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ/Ｈｉｓ435Ｌｙｓ又はＴ１２５(ＣＨＯ)でインキュベートし、次に４０ｎｇ/ｍｌの３Ｇ８-ＰＥ(Ｂ)又は４０ｎｇ/ｍｌのＡＴ１０-ＦＩＴＣ(Ｄ)をそれぞれインキュベートした。競合モノクローナル抗体の濃度の関数として３Ｇ８-ＰＥ又はＡＴ１０-ＦＩＴＣの結合性の阻害割合を計算し：Ｔ１２５(ＣＨＯ)（Ｔ１２５（ＣＨＯ）は１２５(ＹＢ２/０)よりもフコシル化されている）は、ＦｃγＲＩＩＢ１に依存した抑制機能を誘導できる。他方、Ｔ１２５（ＣＨＯ）は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡに弱く結合するのみであり、ＦｃγＲＩＩＩＡに依存した活性化機能の弱い誘導物質である。
【００６４】
二重変異誘導モノクローナル抗体Ｔ１２５(ＹＢ２０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ/Ｈｉｓ435ＬｙｓのＦｃＲγＩＩＩＡへの結合が、Ｔ１２５(ＹＢ２/０)の結合性に比べて少し低下しているが、その結合性は、Ｔ１２５(ＣＨＯ)の結合性よりもずっと高いままである(図４Ａ)ということが間接的な免疫蛍光実験により示された。出願人は、ヒトＦｃＲγＩＩＩＡとＦｃγＲＩＩＩＢ結合部位をブロックする４０ｎｇ/ｍｌの３Ｇ８-ＰＥを用いた競合実験により、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡへの結合性について、Ｔ１２５(ＣＨＯ)とＴ１２５(ＹＢ２/０)の二重変異誘導体の間の差違を確認した。Ｔ１２５(ＹＢ２/０)の場合約１５μｇ/ｍｌの濃度及びＴ１２５(ＹＢ２/０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ４３５の場合４０μｇ/ｍｌの濃度が、Ｊｕｒｋａｔ-ｈｕＦｃγＲＩＩＩＡ細胞の表面で発現されたＦｃＲγＩＩＩＡへのモノクローナル抗体３Ｇ８-ＰＥの結合性の５０％阻害を誘導するために必要とされる。対照的に、１００μｇ/ｍ超の(約１３０μｇ/ｍｌ)の用量が、３Ｇ８-ＰＥ結合の５０％阻害を達成するために必要とされる。
【００６５】
二重変異体Ｔ１２５(ＹＢ２０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ/Ｈｉｓ435ＬｙｓのＨＡ.１.６-ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１(ＦｃγＲＩＩＢ１+)指標細胞への結合性は完全に失われた一方、Ｔ１２５(ＣＨＯ)の結合性は、Ｔ１２５(ＹＢ２/０)に比べて、当該ｍＡｂがＦｃＲγＩＩＢ１に結合する能力が低下したにも関わらず維持されたということが間接的な免疫蛍光実験により示された(図４Ｃ)。同様に、どのような濃度が試験された場合でも、二重変異体Ｔ１２５(ＹＢ２０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ/Ｈｉｓ435Ｌｙｓは、４０ｎｇ/ｍｌのＡｔ１０ＦＩＴＣ抗体のＨＡ.１.６-ｈｕＦｃＲγＩＩＢ１細胞への結合を抑制できず、一方Ｔ１２５(ＣＨＯ)は、ＡＴ１０-ＦＩＴＣ抗体のＦｃγＲＩＩＢ１への結合性の抑制を誘導できるが、この抑制はＴ１２５(ＹＢ２/０)により誘導されるものよりも低かった(図４Ｄ)。
【００６６】
その結果、二重変異体Ｔ１２５(ＹＢ２０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ/Ｈｉｓ435Ｌｙｓは、ＦｃγＲとの相互作用の点で、Ｔ１２５(ＣＨＯ)の振舞いとは異なる振舞いを示し：Ｔ１２５(ＹＢ２０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ/Ｈｉｓ435Ｌｙｓは、活性型ＦｃγＲＩＩＩＡを効果的にリクルートするということが、これらの免疫蛍光実験により示された。他方、このモノクローナル抗体は、ＦｃγＲＩＩＢと関与することができない。
【００６７】
実施例６：Ｔ１２５抗体(ＹＢ２/０)、二重変異体Ｔ１２５抗体(ＹＢ２/０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ/Ｈｉｓ435Ｌｙｓ及びＴ１２５抗体(ＣＨＯ)で得られたＡＤＣＣの比較
単核細胞(エフェクター細胞の起源)及びテゲリン(Ｔｅｇｅｌｉｎｅ)(２５００μｇ/ｍｌ)の存在下で種々の抗Ｄｓにより誘導されるＲｈ陽性赤血球のＡＤＣＣ溶解を誘導する能力を、種々の抗Ｄ抗体について比較した。ＡＤ１抗体は、ＡＤＣＣ応答を引き起こさない抗Ｄ抗体であり、そしてその結果陰性対照として機能する。Ｔ１２５抗体は、２つの異なる細胞型：ＹＢ２/０(Ｔ１２５抗体(ＹＢ２/０)を産生する)とＣＨＯ(Ｔ１２５抗体(ＣＨＯ)を産生する)で発現された。さらに、Ｔ１２５抗体は、そのＨｉｓ３１０とＨｉｓ４３５残基の各々を置換するために、リジン残基で変異誘導される(Ｔ１２５(ＹＢ２/０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ/Ｈｉｓ435Ｌｙｓ)。
【００６８】
結果は図５に示され：変異されたヒスチジン抗体(Ｈ３１０ＫＨ４３５Ｋ)は、変異誘導されていないＴ１２５抗体(ＹＢ２/０)で得られたＲｈ陽性赤血球のＡＤＣＣよりもわずかに低いＲｈ陽性の赤血球のＡＤＣＣを誘導したが、ＡＤ１よりもずっと高かった。これらの実験条件下で、ＣＨＯで発現された抗Ｄ対照抗体は、ＡＤＣＣがあるとしてもかなり少ないＡＤＣＣしか誘導しなかったということに留意すべきである(結果は示していない)。
【００６９】
実施例７：ヒスチジン３１０と４３５のリジンへの変異誘導の構造への影響
Ｔ１２５(ＹＢ２／０)とＴ１２５Ｈ３１０Ｋ-Ｈ４３５Ｋ(ＹＢ２／０)(例えば実施例６)の結晶構造の比較により、ヒスチジン３１０及び４３５のリジンへの変異誘導が、Ｆｃ断片の一般的な立体配置を変更しなかった。WO2005/040216号の文献で(当該文献は本明細書に援用される)、変異を誘導されていない抗体、その結果Ｈｉｓ３１０及びＨｉｓ４３５残基を有する抗体は、亜鉛カチオン(Ｚｎ2+)に結合する能力を有することを示した。リジンを有するＦｃ断片は、Ｚｎ2+カチオンに結合する能力を失っていたが；これらの残基の側鎖の位置、並びにその３次元構造は、Ｔ１２５(ＹＢ２/０)のＦｃ断片のヒスチジン残基の位置及び３次元構造と重なりあった。この事実は、ヒトの治療においてこのタイプの抗体を使用するのに重要である。なぜなら、この事実により、Ｔ１２５抗体Ｈ３１０Ｋ-Ｈ３２５Ｋ(ＹＢ２/０)のＦｃｎＲへの結合性、そしてその結果生じる異化が変更されていないということが示唆されるからである。対照的に、ヒスチジン３１０及び４３５残基のリジンへの変異は、Ｆｃ断片のＣＨ２ドメインの配向に影響を有する。実際、Ｔ１２５(ＹＢ２/０)のＦｃ断片の結晶構造と、二重変異体Ｔ１２５Ｈ１２５Ｈ３１０Ｋ-Ｈ４３５Ｋ(ＹＢ２/０)のＦｃ断片の結晶構造との比較により、Ｔ１２５(ＹＢ２/０)のＦｃ断片のＣＨ２ドメインに比べて、二重変異体は、２個のＣＨ２ドメインが互いに近いより近接した立体配置を有する。立体配置におけるこの差が、ヒトＦｃγＲへの抗体の結合についてのＨ３１０ＫとＨ４３５Ｋ変異の影響の原因でありうる(実施例３、４、及び５)。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ヒトＦｃγＲをリクルートする抗体の能力についての、ジエチルピロカーボネートによる抗ＲｈＤｍＡｂ Ｔ１２５(ＹＢ２/０)のヒスチジンの改変の効果。
【図２】ヒトＦｃγＲに結合する抗体の能力についての、抗ＲｈＤｍＡｂ Ｔ１２５(ＹＢ２/０)におけるヒスチジン３１０と４３５のリジンへの変異誘導の効果。
【図３】ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ依存性のＩＬ-２産生を誘導するｍＡｂの能力についての抗-ＲｈＤｍＡｂ Ｔ１２５(ＹＢ２/０)におけるヒスチジン３１０と４３５の変異誘導の効果。
【図４】ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢに対するＴ１２５(ＹＢ２/０)、二重変異体Ｔ１２５(ＹＢ２／０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ435Ｌｙｓ、及びＴ１２５(ＣＨＯ)の結合性の比較。
【図５】ＹＢ２／０において産生された天然(野生型)抗体及びＣＨＯにおいて産生された天然(野生型)抗体と比較されたヒトＦｃγＲＩＩＩＡに依存するＡＤＣＣを誘導するモノクローナル抗体の能力についての抗-ＲｈＤモノクローナル抗体Ｔ１２５(ＹＢ２／０)のヒスチジン３１０及び４３５の変異誘導の効果。
【図６】亜鉛(Ａ)及びＴ１２５Ｈ３１０Ｋ-Ｈ４３５Ｋ(ＹＢ２／０)(Ｂ)の存在下におけるＴ１２５(ＹＢ２／０)のＦｃ断片の結晶構造の表面の表示。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＴＡＭモチーフ(免疫受容体チロシン活性化モチーフ)(単数又は複数)を含む活性型抗体Ｆｃ領域受容体(ＦｃＲ)に選択的な抗体を製造する方法であって、ハイブリドーマ、ヘテロハイブリドーマ、又は任意の動物、植物若しくはヒトの細胞株からモノクローナル抗体を取得し、当該抗体のＦｃ領域のＨｉｓ３１０及びＨｉｓ４３５残基(カバットの番号付け)の各々をリジン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、又はスレオニンから選ばれる残基で置換し、そしてＩＴＩＭモチーフ(免疫受容体チロシン抑制性モチーフ)を含む抑制型ＦｃＲへの結合性が、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に対して少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、７０％、８０％、又は少なくとも９０％だけ低減された抗体を選択することを含む、前記方法に関する。本発明は、特に癌及び感染症の治療用の医薬の製造における本発明の方法から得られた抗体の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
血漿又は生物工学由来の治療用の多くの抗体製剤が、現在市場に流通しているか、又は臨床開発フェーズにある。特異的に標的に結合し、そして効果的に免疫細胞をリクルートできる治療ツールを得るために、抗体の性質が利用される。
【０００３】
ここ数年間、研究は、抗体の有効性を改善すること、そしてより具体的に、定常Ｆｃ領域を操作することに向けられてきた。定常Ｆｃ領域こそが、抗体のエフェクター性質に関与し、定常Ｆｃ領域がエフェクター免疫細胞及び補体分子の動員を可能にする。この能力は、特定の免疫細胞上に糖タンパク質であるＦｃ受容体、つまりＦｃＲが存在することにより可能になる。これらの受容体は、特に、抗体がその可変領域により標的抗原に結合すると、当該抗体の定常領域に結合できる。これらの細胞と接触すると、抗体は貪食及びＡＤＣＣ(抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用)などの種々の細胞メカニズムを引き起こす。
【０００４】
しかしながら、種々のヒトＦｃＲクラスが存在する。後者は、染色体１に位置する８種のヒト遺伝子によりコードされる。これらの遺伝子のあるものは、異なる受容体アロタイプを生成し、異なるＩｇＧ結合性質を有するアレル多型を示し(Hulett M. D. & Hogarth P.M., Advances in Immunology, vol. 57, Blood, Vol. 99, no.3, 754-758)、異なるエフェクター性質を導く(Cartonら、(２００２)blood, vol. 99, no. 3, 754-758)。同定された主要なヒトＦｃＲクラスは、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４、Ａ及びＢイソ型を有する)、ＦｃγＲＩＩ受容体(ＣＤ３２、Ａ及びＢイソ型を有する)及びＦｃγＲＩＩＩ受容体(ＣＤ１６、Ａ及びＢイソ型を有する)である。ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩ受容体、並びにＦｃγＲＩＩＡ受容体は、その配列又は鎖に付随する配列が有するＩＴＡＭモチーフを用いて活性化されると、標的細胞の溶解などのエフェクター機能を引き起こすことができるので「活性型」と分類される。逆に、ＦｃγＲＩＩＢ受容体は、その配列が含むＩＴＩＭモチーフを介して受容体を活性化する伝達経路を抑制し、そしてＦｃＲ、或いはＢ細胞抗原受容体(ＢＣＲ)又はｃ-ｋｉｔなどの成長因子受容体などの他の表面分子を介して誘導されるＡＤＣＣメカニズムなどのエフェクターメカニズムを負に調節するので、「抑制型」受容体と分類される。
【０００５】
その結果、ＦｃＲ受容体の多様度、特に同じ細胞上で発現される活性型ＦｃＲと抑制型ＦｃＲの存在は、治療抗体の有効性を調節することができ、抑制型のＦｃＲの関与が、活性型ＦｃＲの関与と平衡を保つことができる。
【発明の開示】
【０００６】
その結果、治療抗体であって、その有効性、つまり、多様なＦｃＲ受容体により、特に抑制型ＦｃＲにより全く又はわずかだけしか調節されないエフェクター免疫細胞を活性化する能力を有する抗体を提供することが出願人の意図である。
【０００７】
WO2005/040216の文献の出願人は、一次配列を改変した抗体であって、ＩｇＧ４置換治療、又は移植片拒絶の予防のため、或いは抗破傷風、抗ジフテリア薬として、又は病原体又は派生される毒素に対する薬剤として特に有用であるように改変された抗体を記載する。
【０００８】
しかしながら、驚くべきことに、このように改変された抗体が、活性型受容体に依存したエフェクター機能を誘導する能力を保ち、一方、抑制型受容体をリクルートする能力を最早持たなかったということを本出願人が発見した。
【０００９】
その結果、治療抗体であって、その有効性、つまりエフェクター免疫細胞を活性化する能力が、多様なＦｃＲ受容体、特に抑制型ＦｃＲによって全く調節されないか、又はわずかにしか調節されないところの、治療抗体を提供することを可能とする方法を出願人は開発した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、第一に、活性型ＦｃＲをリクルートする能力を有するが、抑制型ＦｃＲをリクルートする能力が、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に比べて低減された抗体(つまり、当該抗体のＦｃ領域は、活性型の抗体Ｆｃ領域受容体(ＦｃＲ)に選択的に結合する)を製造する方法であって、以下のステップ：
ａ) ハイブリドーマ、ヘテロハイブリドーマ、又は任意の動物、植物、又はヒトの細胞株からモノクローナル抗体を取得し；
ｂ) 抗体のＦｃ領域のＨｉｓ３１０及びＨｉｓ４３５残基(カバットの番号付け)の各々を、リジン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、又はスレオニンから選ばれる残基で置換し；
ｃ) Ｆｃ領域の抑制型ＦｃＲへ結合が、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に比べて少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、７０％、８０％、又は少なくとも９０％だけ低減される抗体を選択する
を含む、前記方法に関する。
【００１１】
本発明の目的では、「抗体」は、その特異性及びそのイソ型に関わらず、Ｆｃ領域、又はＦｃ領域と同じ機能及び同じ特徴を有する領域を含む、任意の抗体を意味する。こうして、抗体は、全抗体又は抗体断片、例えば、Ｆｃ抗体断片、又はＦｃ領域をその末端の一つに含む融合分子でありうる。さらに、本発明に記載される方法において使用される抗体は、ＩｇＧ、つまり任意のＩｇＧ１、任意のＩｇＧ２、任意のＩｇＧ３(Ｇ３ｍ(ｓ)又はＧ３ｍ(ｓｔ)アロタイプ)及び任意のＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＤ、又はそれらの１以上の混合物でありうる。さらに、本発明に記載される方法に使用される抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体の場合、これらの抗体は、キメラ、ヒト化、ヒト又は動物由来でありうる。
【００１２】
さらに、「抗体」という用語は、同じ生物学的システムにおいて発現される同じアミノ酸配列を有する抗体分子から構成され、そして少なくとも１の賦形剤又は医薬として許容されるビヒクルを含む抗体組成物であって、当該組成物が予防及び／又は治療目的のために医薬投与を可能にするために剤形された組成物を指す。
【００１３】
ステップｂ)の終わりに、本発明の改変抗体をコードする配列は、適切な生物学的システムで発現される(ステージｂ')。
【００１４】
本発明の目的では、「同じ抗体」は、本発明のプロセスにおけるステップｂ)に従い、そして本発明の改変抗体と同じ生物学的生産システムにおいて産生された非改変抗体を意味する。「同じ抗体」は、同じ天然の一次配列(但し、本発明の抗体において改変されたＨｉｓ３１０とＨｉｓ４３５残基は除く)を有し、そして同じ生物学的システムにおいて産生されるので、本発明の方法により得られる抗体と同じ翻訳後修飾が付される。
【００１５】
本発明の目的では、ステップａ)の抗体は、モノクローナル抗体組成物の形態で得られる。各モノクローナル抗体組成物は、同じアミノ酸配列を有し、そうして、同じ特異性を有し、同じ生物学的システムにおいて発現される抗体分子から構成される。これらの組成物は適宜、少なくとも１の賦形剤又は医薬として許容されるビヒクルを含むことができ、その結果、これらの組成物は、予防及び／又は治療目的のために医薬投与を可能にするように剤形されうる。
【００１６】
ステップａ)の抗体は、天然Ｆｃ領域を含む。つまり、当該抗体は、そのＦｃ領域の３１０位及び４３５位(カバット番号付け)においてヒスチジン残基を有する。好ましくは、このような抗体のＦｃ領域は、活性型受容体と抑制型受容体の両方に結合できる。本発明の目的では、「抗体の天然Ｆｃ領域」は、Ｈｉｓ３１０とＨｉｓ４３５残基について、化学的又は生命工学的方法によって改変されていないＦｃ領域を意味する。より具体的に、「抗体の天然Ｆｃ領域」は、Ｆｃ領域のＨｉｓ３１０及びＨｉｓ４３５残基が、化学的又は生命工学的方法によって、リジン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、又はスレオニンから選ばれる残基で置換されていないＦｃ領域を意味する。
【００１７】
一例として、本発明において利用される抗体は、抗-Ｅｐ-ＣＡＭ、抗-ＫＩＲ３ＤＬ２、抗-ＥＧＦＲ、抗-ＶＥＧＦＲ、抗-ＨＥＲ１、抗-ＨＥＲ２、抗-ＧＤ、抗-ＧＤ２、抗-ＧＤ３、抗-ＣＤ２０、抗-ＣＤ２３、抗-ＣＤ２５、抗-ＣＤ３０、抗-ＣＤ３３、抗-ＣＤ３８、抗-ＣＤ４４、抗-ＣＤ５２、抗-ＣＡ１２５及び抗-タンパク質Ｃ、抗-ＨＬＡ-ＤＲ、抗ウイルス：ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ及びＲＳＶから選ぶことができ、そしてより具体的には、以下の表１の抗体から選ぶことができる。
【００１８】
【表１】
【００１９】
本発明の目的では、「活性型抗体Ｆｃ領域受容体(ＦｃＲ)に選択的な抗体」又は「そのＦｃ領域が活性型抗体Ｆｃ領域受容体(ＦｃＲ)に選択的に結合するところの抗体」は、活性型ＦｃＲをリクルートする能力を有するが、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に比べて抑制型ＦｃＲに寄与する能力が低減されているか又は当該能力を全く有さない全ての抗体を意味する。
【００２０】
こうして、本発明の抗体は、活性型ＦｃＲをリクルートする(つまり、そのＦｃ領域により結合する)能力を有するが、抑制型ＦｃＲ受容体に寄与する(つまり、そのＦｃ領域により結合する)能力は、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に比べて低減されるか、又は失われている。
【００２１】
活性型ＦｃＲは、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＡ及びＦｃγＲ１Ｂ、ＦｃγＲ、ＦｃγＲ１及びマウスにおいて記載されたＦｃγＲＩＶのヒト相当物を意味する。抑制型ＦｃＲは、ＦｃγＲＩＩＢを意味する。
【００２２】
ステップｃ)の間に、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に比べてＦｃＲへの結合性が低下された抗体(複数)、つまり種々の抗体組成物を選択することができる。この低下は、例えば、本発明の抗体が結合するＦｃＲを発現する細胞の数又は割合を定量し、そして天然Ｆｃ領域を有する抗体が結合するＦｃＲを発現する細胞の数又は割合を比較することによって計測することができる。
【００２３】
本発明の好ましい実施態様では、ステップｃ）において、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に比べて抑制型ＦｃγＲへの結合が失われている抗体(複数)、つまり種々の抗体組成物は、以前に記載された方法と同様の方法に従って選択される。こうして、本発明の方法に従って調製された抗体は、活性型ＦｃＲに結合するが、抑制型受容体に結合しないＦｃ領域を有する。一方、同じ生物学的システムにより産生されるが、本発明の方法に従って改変されていないＦｃ領域を有する同じ抗体は、そのＦｃ領域により、活性型ＦｃγＲ及び抑制型ＦｃγＲに結合する。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様では、Ｈｉｓ３１０とＨｉｓ４３５残基は、リジン残基に置換される。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様では、Ｈｉｓ３１０とＨｉｓ４３５残基は、部位特異的変異誘導又は分子進化によって置換される。
【００２６】
別の実施態様では、Ｈｉｓ３１０とＨｉｓ４３５残基は、化学処理によって、例えばＤＥＰＣ(ジエチルピロカーボネート、当該物質はヒスチジン改変薬である)での処理により改変される。
【００２７】
抗体のＣＨ２/ＣＨ３境界に位置する２の特定のヒスチジン残基Ｈｉｓ３１０及びＨｉｓ４３５を、リジン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン又はスレオニンから選ばれる残基により、そして好ましくはリジンにより変異誘導することは、このように改変された抗体の抑制型ＦｃＲ、特にＦｃγＲＩＩＢに対する結合性に主要な影響を与え、そして活性型ＦｃＲ、特にＦｃγＲＩＩＩＡに対する抗体の結合性について中程度の影響を与えるということを出願人は驚くべきことに発見した。このように改変された本発明の抗体がもはや、又は実質的にもはやｉｎ ｖｉｔｒｏ結合試験において抑制型ＦｃγＲＩＩＢ受容体に結合せず、一方、変異誘導をされていない抗体に比べて、活性型ＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＡ受容体への結合性がかなり部分的にしか阻害されていないということを出願人は示した(以下を参照のこと)。この変異誘導された抗体は、抑制型ＦｃγＲＩＩＢへの関与を避けることにより、ＡＤＣＣ型の細胞毒性に関わる活性型受容体(ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＡ)に寄与できる抗体である。その結果、ＦｃγＲＩＩＢの寄与に続いてＡＤＣＣが負に調節されることなく、このような抗体は、標的細胞(赤血球、腫瘍細胞、アロ反応性細胞、微生物病原に感染した細胞)に対してＡＤＣＣを誘導することを可能にする。この変異誘導された抗体を含む免疫複合体が、樹状細胞上に同様に存在する抑制型ＦｃγＲＩＩＢを活性化することなく、樹状細胞上に発現される活性型ＦｃγＲによってのみ捕捉されるという事実のため、このような抗体が、樹状細胞による抗原提示を最適化することを可能にする。
【００２８】
活性型受容体及び抑制型受容体についての「示差的」振舞いは、本発明の抗体を治療に、特に癌又は感染病原体の枠組みの中で抗体を用いるために必須の利点である。実際、このような抗体は、ＡＤＣＣメカニズムが抑制型ＦｃγＲにより負に調節されることなく、活性型ＦｃγＲを介してＡＤＣＣメカニズムを誘導することができる。さらに、このような抗体が、樹状細胞上の活性型ＦｃγＲのみをリクルートし、そして同じ細胞の表面に存在する抑制型ＦｃγＲをリクルートすることはないということを出願人は発見した。樹状細胞の表面の抑制型ＦｃγＲの関与が、これらの細胞の成熟について及び抗原をエフェクターＴリンパ球に対して効果的に提示する能力について負の影響を与えるということが近年示されてきた。抗原と複合体形成したこのような抗体が、樹状細胞の表面に発現された活性型ＦｃγＲのみを認識し、そして抑制型ＦｃγＲを認識しない場合、当該事象により生じた樹状細胞による抗原提示が最適であり、そして最適化された特異的免疫応答の活性化の効果が最適化される。
【００２９】
有利な態様では、本発明の方法から生じた抗体のＦｃ領域が、活性型Ｆｃ受容体に結合し、その一方で当該Ｆｃ領域は、抑制型Ｆｃ受容体には結合しない。
【００３０】
有利な態様では、本発明の方法の抗体は、抑制型Ｆｃ受容体、特にＢリンパ球により発現される抑制型Ｆｃ受容体をリクルートすることはない。
【００３１】
特に有利な態様では、本発明の方法の抗体は、抑制型Ｆｃ受容体をリクルートしないが、Ｂリンパ球の表面の分子には結合する。
【００３２】
有利な態様では、本発明の抗体は、抑制型Ｆｃ受容体をリクルートしないが、腫瘍細胞の表面、特に腫瘍性Ｂリンパ球の表面の分子に結合する。
【００３３】
有利な態様では、本発明の抗体は、抑制型Ｆｃ受容体をリクルートすることはないが、Ｂ-ＣＬＬ腫瘍性リンパ球の表面の分子に結合する。有利な態様では、本発明の抗体は、抑制型Ｆｃ受容体をリクルートすることはないが、Ｂ-ＣＬＬ腫瘍性リンパ球の表面のＣＤ２０分子に結合する。
【００３４】
特に有利な態様では、本発明の方法の抗体は、ＦｃγＲＩＩＩ受容体(Ａ及びＢイソ型)、及び/又はＦｃγＲＩＩＡ受容体、及び/又はＦｃγＲＩ受容体(Ａ及びＢイソ型)に結合し、その一方、当該抗体は、ＦｃγＲＩＩＢ受容体(Ｂ１及びＢ２イソ型)には結合しない。具体的な実施態様では、ＦｃγＲＩＩＢ受容体は、ＦｃγＲＩＩＢ１受容体である。
【００３５】
好ましくは、本発明の方法に関与する受容体は、ヒト受容体である。
【００３６】
本発明の特定の実施態様では、抗体のＦｃ領域の受容体は、単球、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、及びＢリンパ球に位置する。
【００３７】
本発明の別の特定の実施態様では、当該抗体のＦｃ領域の抑制型受容体は、腫瘍細胞、例えば悪性メラノーマ細胞、腫瘍性Ｂリンパ球、例えばリンパ腫、Ｂ-ＣＬＬ(Ｂ慢性リンパ白血病)細胞及びミエローマ細胞上に位置する。
【００３８】
有利な態様では、本発明の方法の抗体は、その可変領域により、Ｂ-ＣＬＬ腫瘍性リンパ球の表面でＣＤ２０分子に結合する。本発明のこのような抗体は、特にＢ-ＣＬＬ腫瘍性リンパ球の表面に存在する抑制型Ｆｃ受容体をリクルートしない。
【００３９】
有利な態様では、本発明の「ｍ」の文字で表された抗体は、モノクローナル抗体である。これらのモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体組成物の形態で任意の適切な生物学的システムにより生産することができ、当該組成物は、少なくとも１の賦形剤又は医薬として許容されるビヒクルを含み、その結果、これらの組成物は、予防及び/又は治療目的のため医薬の投与を許容するために剤形することができる。「生物学的システム」は、当該抗体を発現するために、１以上のベクターを用いてトランスフェクションされた動物又は植物細胞株、植物又は非ヒトトランスジェニック動物、並びに任意のハイブリドーマ、ヘテロハイブリドーマを意味する。これらの細胞の中から、当該抗体をコードする遺伝子を含むベクターを用いてトランスフェクションされた細胞株から生じた細胞、例えば真核細胞又は原核細胞、特に哺乳動物、昆虫、植物、細菌、又は酵母の細胞を選択することができる。優先的に、ラット骨髄腫細胞、例えばＹＢ２／０(ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１６６２)を用いる。
【００４０】
ＣＨＯ細胞、特に、ＣＨＯ-Ｋ、ＣＨＯ-Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ-Ｌｅｃ１０ ＣＨＯ Ｐｒｏ-５、ＣＨＯ ｄｈｆｒ-、或いはＷｉｌ-２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ-４、ＣＯＳ-７、２９３-ＨＥＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳＯ、ＳＰ２／０-Ａｇ１４及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８.６５３、ＰＥＲＣ６又はＢＨＫを使用することも可能である。
【００４１】
本発明の別の目的は、抗感染及び抗腫瘍ワクチン化を意図した医薬の製造のための、Ｆｃ領域のＨｉｓ３１０及びＨｉｓ４３５残基(カバット番号付け)の各々が、リジン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン又はスレオニンから選ばれる残基により置換された抗体、又は本発明の方法により得られた抗体の使用であり、ここで本発明の抗体は、抗原提示細胞(単球、マクロファージ、樹状細胞、上皮ランゲルハンス細胞、Ｂリンパ球)の活性型ＦｃＲγにのみ結合することができる免疫複合体に寄与する。
【００４２】
好ましくは、このような医薬の製造のために、そのＦｃ領域のＨｉｓ３１０及びＨｉｓ４３５残基(カバット番号付け)の各々が、リジン残基で置換された抗体が用いられる。
【００４３】
本発明の別の対象は、癌の治療、及びより好ましくはリンパ腫、白血病、骨髄所、サルコーマ、固形腫瘍、例えば哺乳動物癌腫、直腸腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、胃腫瘍、胚腫瘍、卵巣腫瘍、子宮頚部腫瘍、眼腫瘍、甲状腺腫瘍、ＥＮＴスフィアの腫瘍(tumeurs de la sphere ORL)、悪性メラノーマ、神経腫瘍、例えば膠芽細胞腫、及び神経芽細胞腫の治療のための医薬の製造のための、Ｈｉｓ３１０とＨｉｓ４３５残基(カバットの番号付け)の各々が、リジン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、又はスレオニンに置換された抗体、又は本発明の方法により産生された抗体の使用に関する。
【００４４】
好ましくは、このような医薬の製造のために、そのＦｃ領域のＨｉｓ３１０及びＨｉｓ４３５残基(カバットの番号付け)の各々が、リジン残基で置換された抗体が使用される。
【００４５】
本発明の別の対象は、感染性疾患、例えばＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＲＳＶ(呼吸器合胞体ウイルス)、ＳＡＲＳウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、天然痘による感染、細菌感染、例えばコッホ杆菌、髄膜炎菌、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Criptococcocus neoformans)、クロストリジウム、ボツリヌス中毒症、炭疽、破傷風、結核、及び腸球菌感染の原因となる細菌により引き起こされる感染の治療用の医薬を製造するための、Ｈｉｓ３１０及びＨｉｓ４３５残基(カバットの番号付け)が、リジン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、又はスレオニンにより置換される抗体、或いは本発明の方法により産生される抗体の使用である。
【００４６】
好ましくは、このような医薬の製造のため、そのＦｃ領域の各Ｈｉｓ３１０及びＨｉｓ４３５残基(カバットの番号付け)がリジン残基で置換された抗体が使用される。
【００４７】
最終的に、本発明の最後の態様は、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に比べて、抑制型ＦｃＲへの結合が、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、７０％、８０％、又は少なくとも９０％又は１００％だけ低減される、抗体組成物に関する。
【００４８】
好ましくは、本発明の組成物は、抗体のＦｃ領域が、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に比べて、抑制型受容体に結合する能力が失われた組成物である。
【００４９】
特に有用な態様では、本発明の組成物は、抗-ＣＤ２０抗体組成物である。
【００５０】
本発明の他の態様及び利点は、以下の実施例に記載され、この実施例は例示と認められ、そして本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００５１】
実施例１：Ｈｉｓ３１０-４３５Ｌｙｓの二重変異を有する抗体の製造
トランスフェクションされ、そしてＥＭＡＢ５抗体(WO 2005/040216に記載される)(当該抗体は、Ｒｈ(Ｄ)抗原に対するヒトＩｇＧ１(γ)である)を産生する細胞株ＹＢ２／０(ラット骨髄腫株、ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１６６２号)を無血清培地中における培養に適用した。
ＥＭＡＢ５をセファロース-タンパク質Ａ上でアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
ＨＰＣＥ-ＬＩＦにより、大部分のグリカン構造が、二分岐型の多糖であり、約２５％のフコースを含むということが示された。
【００５２】
断片の調製
精製されたＥＭＡＢ５を５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８.０に対して一晩透析した。５０ｍＭ・ＣａＣｌ2及び１０ｍＭシステインに調節された抗体溶液を、３０分間３７℃でインキュベートし、次にトリプシン溶液(１ｍｇ／ｍｌ)を、酵素／基質比１／２５で加えた。
５分間３７℃でインキュベートした後に、ジイソプロピルフルオロホスフェート(１ｍＭ、終量)を添加することにより反応を止めた。加水分解物を、５０ｍＭイミダゾール緩衝液、ｐＨ７.８に対して一晩透析した。
Ｆｃ断片の精製のため、透析された加水分解物を抗体３.６ｇあたり１ｍｌのゲルの割合で、タンパク質Ｌ-アファロースと接触させた。攪拌下で室温にて4時間インキュベートした後に、ゲルをカラムにロードし、そして５０ｍＭイミダゾール緩衝液、ｐＨ７.８で洗浄した。Ｆｃ断片を含む流出物及び洗浄緩衝液を合わせ、そして製造者により記載された条件を用いてＶｉｖａｓｐｉｎ２０で遠心することにより濃縮した。
【００５３】
部位特異的変異誘導：
抗Ｒｈ(Ｄ)抗体ＥＭＡＢ５の重鎖のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、ＰＣＲによる二重部位特異的変異誘導を行なうためのマトリックスとして用いた(ＰＣＲ-に基づく部位特異的変異誘導)。以下の４つのヌクレオチド置換を導入した：
- Ｈｉｓ３３８残基(カバット番号付けによると３１０位)をＬｙｓへと変換するＣ１２２９Ａ及びＣ１３０１Ｇ、つまりＣＡＣ→ＡＡＧ；
- Ｈｉｓ４６３残基(カバット番号付けによると４３５位)をＬｙｓへと変異誘導するＣ１６７４Ａ及びＣ１６７６Ｇ、つまりＣＡＣ→ＡＡＧ。
【００５４】
変異誘導された抗体の重鎖は、ヌクレオチド配列では配列番号１、そしてペプチド配列では配列番号２(変異誘導されたアミノ酸が、配列番号２において３３８位及び４６３位に現れる。これらはそれぞれアミノ酸Ｌｙｓ３１０及びＬｙｓ４３５に相当する)を有する。番号付けは、リーダー配列を考慮する(３３８及び４６３位)か、又は考慮しない(後者において、いわゆるカバットの番号付けで、３１０及び４３５位が用いられる)。
【００５５】
変異誘導されたＥＭＡＢ５-Ｈ-Ｋ３３８-Ｋ４６３-１ベクターとＥＭＡＢ５抗体の軽鎖をコードするＥＭＡＢ５-ｄｈｆｒ-Ｋ-ＳｐｅＩベクターを電気穿孔により共トランスフェクトしたＹＢ２／０細胞を、５％透析済みＦＣＳ、０.５％Ｇ４１８、及び２５ｎＭのメトトレキセート(ＭＴＸ)を加えたＲＰＭＩ培地中で培養した。最も高いレベルのヒトＩｇＧを分泌するクローンを、ＭＴＸを伴わない培地中で２４ウェルプレート上で培養した。７日間の培養後に回収した上清を、以下に記載される試験を行なうために用いた。
【００５６】
実施例２：ヒトＩｇＧ１／ＦｃＲγ相互作用についての、ジエチルピロカーボネート(ＤＥＰＣ)による抗-ＲｈＤモノクローナルＩｇＧ１のＣＨ２／ＣＨ３境界におけるヒスチジンの改変の効果
ヒトＩｇＧ１／ＦｃγＲ相互作用についてのヒトＩｇＧ１のヒスチジンの改変の影響を試験するために、抗ＲｈＤモノクローナル抗体、Ｔ１２５(ＹＢ２／０)をジエチルピロカーボネート(ＤＥＰＣ)で処理した。ＤＥＰＣは、ヒスチジン環の窒素原子と、ＤＥＰＣ分子の炭素原子との間に共有結合を生成することにより、ヒスチジン残基を改変する。ＤＥＰＣで処理されるか又は処理されなかったモノクローナル抗体を、タンパク質Ａ-セファロースのカラムで分画した。ヒスチジン４３５は、タンパク質ＡへのＩｇＧの結合に重要であり、ＤＥＰＣで処理され、そしてタンパク質Ａに保持されないモノクローナル抗体の画分は、少なくともＨｉｓ435残基が改変されたＩｇＧ１に相当する。ＤＥＰＣで処理されないか又は処理され、そしてタンパク質Ａに保持されないモノクローナル抗体Ｔ１２５(ＹＢ２／０)は、異なるタイプのヒトＦｃＲγに対する結合性について比較された(図１)。ジエチルピロカーボネート(ＤＥＰＣ)で処理されるか又は処理されていない抗ＲｈＤモノクローナル抗体Ｔ１２５(ＹＢ２／０)のヒトＦｃγＲＩＩＩＡ(Ａ)、ＦｃγＲＩＩＡ(Ｂ)、ＦｃγＲＩＩＢ１(Ｃ)及びＦｃγＲＩ(Ｄ)(ｈＦｃγＲ)への結合性を間接的な免疫蛍光により分析した。指標細胞であるＪｕｒｋａｔ-ＨｕＦｃＹＲＩＩＩＡ(Ａ)、Ｋ５６２(Ｂ)、ＩＩＡ.１.６-ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１(Ｃ)及びＴｆ２-１３(Ｄ)を、ＤＥＰＣで処理されたか又は処理されていない種々の濃度のＴ１２５(ＹＢ２／０)とインキュベートした。モノクローナル抗体の結合を、ＦＩＴＣに結合されたマウス抗ヒトＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)Ｆ(ａｂ')2により検出した。Ｔ１２５(ＹＢ２／０)は、低濃度(０.０５μｇ／ｍｌ〜)においてＦｃγＲＩＩＩＡに結合し、そして０.５μｇ／ｍｌでかなり顕著な結合を示した(９５％が陽性細胞)。このモノクローナル抗体をＤＥＰＣで処理した場合、高濃度(１〜５μｇ／ｍｌ)の濃度で低下し(１μｇ／ｍｌで約９０％低下し)、そして低濃度(０.０２５μｇ／ｍｌ〜０.０５μｇ／ｍｌ)で悪くなった(図１Ａ)。ＤＥＰＣでの処理は、(それぞれ５０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌで)Ｔ１２５(ＹＢ２／０)のＦｃγｒＩＩＡへの結合性の７６％及び６４％の低下を誘導した。同様に、ＤＥＰＣで処理されたＴ１２５(ＹＢ２／０)のＦｃγＲＩＩＢ１への結合性は、５０μｇ／ｍｌで低下し、ＤＥＰＣで処理されたＴ１２５(ＹＢ２／０)の結合性は悪く、一方、同じ濃度の未処理のＴ１２５(ＹＢ２／０)では、約４０％の細胞が陽性であった(図１Ｃ)。他方、ＤＥＰＣによるｍＡｂの改変は、ＦｃγＲＩへの結合性について中程度の効果を有する。ＤＥＰＣでの処理は、０.５μｇ／ｍｌと１μｇ／ｍｌにおけるＴ１２５(ＹＢ２／０)のＦｃγＲＩへの結合性について１５％の低下をもたらした(図１Ｄ)。
【００５７】
結論として、Ｔ１２５(ＹＢ２／０)中に存在するヒスチジンをＤＥＰＣによりブロッキングすることは、そのＦｃγＲＩＩＩＡ(図１Ａ)、ＦｃγＲＩＩＡ(図１Ｂ)、ＦｃγＲＩＩＢ(図１Ｃ)に対する結合性を低下し、そして、ヒトＦｃγＲＩ(図１Ｄ)に対してそれより少しの程度だけ結合性を低下させる。
【００５８】
実施例３：ヒトＩｇＧ１／ＦｃγＲ相互作用についての抗ＲｈＤモノクローナルＩｇＧ１のＨｉｓ４３５とＨｉｓ３１０残基の変異誘導の効果
モノクローナルＩｇＧ１のＨｉｓ残基の改変が、ヒトＦｃγＲとの相互作用に影響するということが前述の結果により示唆された。しかしながら、ＤＥＰＣでの処理では、どのＨｉｓが改変されたかを決定することはできなかった。
【００５９】
構造試験は、ＩｇＧ１／ＦｃγＲ相互作用におけるＩｇＧ１のヒンジ領域のいずれかの側に位置するＨｉｓ435とＨｉｓ310の重要性を示した。それゆえ、モノクローナル抗体のヒトＦｃＲγへの結合性について、Ｔ１２５(ＹＢ２／０)のＨｉｓ４３５とＨｉｓ３１０残基のリジンへの変異誘導の効果を試験した(図２)。モノクローナル抗体(Ｔ１２５(ＹＢ２／０)又は二重変異体Ｔ１２５(ＹＢ２／０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ435ＬｙｓのヒトＦｃγＲＩＩＩＡ(Ａ)、ＦｃγＲＩＩＡ(Ｂ)、ＦｃγＲＩＩＢ１(ｃ)及びＦｃγＲＩ(Ｄ)(ｈＦｃγＲ)に対する結合性を、間接的免疫蛍光により分析した。指標細胞であるＪｕｒｋａｔ-ｈｕＦｃγＲＩＩＩＡ(Ａ)、Ｋ５６２(Ｂ)、ＩＩＡ.１.６-ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１(Ｃ)、及びＴｆ２-１３(Ｄ)を、種々の濃度のＴ１２５(ＹＢ２／０)又は二重変異体Ｔ１２５(ＹＢ２／０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ435Ｌｙｓとインキュベートした。ｍＡｂの結合性を、ＦＩＴＣに結合されたマウス抗ヒトＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)Ｆ(ａｂ')2断片により検出した。変異誘導していない抗体の結合性に比べて、ＪａｒｋａｔＣＤ１６細胞により発現されるヒトＦｃγＲＩＩＩＡへの二重変異体Ｔ１２５(ＹＢ２Ｏ)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ435Ｌｙｓの結合性はわずかに低下した(図２Ａ)。この結合性は、ヒトＦｃγＲＩＩＡを発現する指標細胞(Ｋ５６２)を用いて行った場合に低下した(図２Ｂ)。対照的に、Ｔ１２５(ＹＢ２／０)Ｈｉｓ３１０とＨｉｓ４３５残基の変異誘導は、完全に当該抗体のヒトＦｃγＲＩＩＢ１への結合性を無くしてしまう(図２Ｃ)。Ｔ１２５(ＹＢ２０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ435ＬｙｓのヒトＦｃγＲＩへの結合性は影響されなかった(図２Ｄ)。
【００６０】
実施例４：そのエフェクター性質についての抗-ＲｈＤモノクローナルＩｇＧ１のＨｉｓ435とＨｉｓ310の変異誘導効果
出願人は、当該抗体の活性化エフェクター機能についてのＴ１２５(ＹＢ２／０)のＨｉｓ３１０とＨｉｓ４３５の残基の変異誘導の効果を分析した。
Ｊｕｒｋａｔ-ｈｕＦｃγＲＩＩＩＡ、つまりＦｃγＲＩＩＩＡ＋細胞、によるＩＬ-２の産生を誘導する二重変異体及び変異誘導をされてないモノクローナル抗体の能力は、ＥＬＩＳＡにより比較された(図３)。３回の異なる実験から得られた結果を標準化するために、異なる量のモノクローナル抗体により誘導されるＩＬ-２の産生量を、１０μｇ／ｍｌのＴ１２５(ＹＢ２／０)により誘導されるＩＬ-２の産生量の割合として報告した。このＴ１２５(ＹＢ２／０)の量は、行なわれた全ての実験において検出されたＩＬ２における最大産生量をもたらす量に一致した。１、５、及び１０μｇ／ｍｌの変異誘導体Ｔ１２５(ＹＢ２／０)により産生されるＩＬ-２の産生量は、変異誘導を行なっていないモノクローナル抗体の同じ量により誘導されるＩＬ-２の放出に対して、それぞれ６１％、５３％、及び５４％だけ低減した(図３)。Ｊｕｒｋａｔ-ｈｕＦｃγＲＩＩＩＡ(ＦｃγＲＩＩＩＡ＋)細胞は、３７℃で１５時間、種々の濃度のＴ１２５(ＹＢ２／０)又は二重変異体Ｔ１２５(ＹＢ２０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ４３５／Ｌｙｓにより、ラビット抗ヒトＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)Ｆ(ａｂ')2断片の存在下で刺激して、抗ＲｈＤヒトモノクローナル抗体を凝集させた。Ｊｕｒｋａｔ-ｈｕＦｃγＲＩＩＩＡ細胞によるＩＬ-２の産生は、次にＥＬＩＳＡにより検出した。種々の濃度の２個のｍＡｂの存在下において誘導されたＩＬ-２の産生量は、１０μｇ／ｍｌのＴ１２５(ＹＢ２／０)により誘導されるＩＬ-２の割合として報告した。
【００６１】
これらの結果により、モノクローナルＩｇＧ１のＣＨ２／ＣＨ３境界におけるＨｉｓ３１０とＨｉｓ４３５の改変が、このｍＡｂのヒトＦｃγＲＩＩＩＡへの結合性を部分的に低下させ、そしてこれらの活性型ＦｃＲγに依存したサイトカインの産生を誘導する能力を部分的に低下させた。それにもかかわらず、二重変異体モノクローナル抗体Ｔ１２５(ＹＢ２０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ435Ｌｙｓは、活性型ＦｃγＲＩＩＩＡのリクルートを可能にし、そしてこれらの受容体に依存したエフェクター機能の活性化を誘導できた。
【００６２】
実施例５：Ｔ１２５(ＹＢ２／０)、Ｔ１２５(ＹＢ２／０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ435Ｌｙｓ及びＴ１２５(ＣＨＯ)のヒトＦｃγＲへの関与プロファイルの比較
二重変異モノクローナル抗体Ｔ１２５(ＹＢ２０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｙｓ４３５Ｌｙｓが活性型受容体(ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＡ)への関与を可能とするが、抑制型ＦｃγＲＩＩＢに結合するその能力を欠いていることをこれまでの実験が示した。このモノクローナル抗体の振舞いをよりよく特徴付けるために、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢへのその結合性を、Ｔ１２５(ＣＨＯ)の結合性と比較した(図４)。ここで、Ｔ１２５（ＣＨＯ）について、構造的な性質及び種々のタイプのＦｃγＲとの関与のプロファイルが正確に規定されていた。。(Ａ)及び(Ｃ)、ｍＡｂ Ｔ１２５(ＹＢ２／０)、Ｔ１２５(ＹＢ２／０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ435Ｌｙｓ及びＴ１２５(ＣＨＯ)の、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ(Ａ)、及びＦｃγＲＩＩＢ１(Ｃ)への結合性を、間接的な免疫蛍光により分析した。指標細胞であるＪｕｒｋａｔ-ｈｕＦｃγＲＩＩＩＡ(Ａ)、又はＩＩＡ.１.６-ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１(Ｃ)を種々の濃度のＴ１２５(ＹＢ２／０)、Ｔ１２５(ＹＢ２／０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ435Ｌｙｓ及びＴ１２５(ＣＨＯ)とインキュベートした。モノクローナル抗体の結合性を、ＦＩＴＣに結合されたマウス抗ヒトＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)Ｆ(ａｂ')2断片により検出した。
【００６３】
(Ｂ)及び(Ｄ)、３Ｇ８-ＰＥ抗体(抗ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＩＩＢ)(Ｂ)又はＡＴ１０-ＦＩＴＣ(抗-ヒトＦｃγＲＩＩＡ/ＩＩＢ)(Ｄ)の結合性を抑制するモノクローナル抗体Ｔ１２５(ＹＢ２／０)、Ｔ１２５(ＹＢ２／０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ435Ｌｙｓ及びＴ１２５(ＣＨＯ)の能力を比較した。指標細胞であるＪｕｒｋａｔ-ｈｕＦｃγＲＩＩＩＡ(Ｂ)又はＩＩＡ.１.６-ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１(Ｄ)を種々の濃度のＴ１２５(ＹＢ２/０)、又はＴ１２５(ＹＢ２/０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ/Ｈｉｓ435Ｌｙｓ又はＴ１２５(ＣＨＯ)でインキュベートし、次に４０ｎｇ/ｍｌの３Ｇ８-ＰＥ(Ｂ)又は４０ｎｇ/ｍｌのＡＴ１０-ＦＩＴＣ(Ｄ)をそれぞれインキュベートした。競合モノクローナル抗体の濃度の関数として３Ｇ８-ＰＥ又はＡＴ１０-ＦＩＴＣの結合性の阻害割合を計算し：Ｔ１２５(ＣＨＯ)（Ｔ１２５（ＣＨＯ）は１２５(ＹＢ２/０)よりもフコシル化されている）は、ＦｃγＲＩＩＢ１に依存した抑制機能を誘導できる。他方、Ｔ１２５（ＣＨＯ）は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡに弱く結合するのみであり、ＦｃγＲＩＩＩＡに依存した活性化機能の弱い誘導物質である。
【００６４】
二重変異誘導モノクローナル抗体Ｔ１２５(ＹＢ２０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ/Ｈｉｓ435ＬｙｓのＦｃＲγＩＩＩＡへの結合が、Ｔ１２５(ＹＢ２/０)の結合性に比べて少し低下しているが、その結合性は、Ｔ１２５(ＣＨＯ)の結合性よりもずっと高いままである(図４Ａ)ということが間接的な免疫蛍光実験により示された。出願人は、ヒトＦｃＲγＩＩＩＡとＦｃγＲＩＩＩＢ結合部位をブロックする４０ｎｇ/ｍｌの３Ｇ８-ＰＥを用いた競合実験により、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡへの結合性について、Ｔ１２５(ＣＨＯ)とＴ１２５(ＹＢ２/０)の二重変異誘導体の間の差違を確認した。Ｔ１２５(ＹＢ２/０)の場合約１５μｇ/ｍｌの濃度及びＴ１２５(ＹＢ２/０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ４３５の場合４０μｇ/ｍｌの濃度が、Ｊｕｒｋａｔ-ｈｕＦｃγＲＩＩＩＡ細胞の表面で発現されたＦｃＲγＩＩＩＡへのモノクローナル抗体３Ｇ８-ＰＥの結合性の５０％阻害を誘導するために必要とされる。対照的に、１００μｇ/ｍ超の(約１３０μｇ/ｍｌ)の用量が、３Ｇ８-ＰＥ結合の５０％阻害を達成するために必要とされる。
【００６５】
二重変異体Ｔ１２５(ＹＢ２０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ/Ｈｉｓ435ＬｙｓのＨＡ.１.６-ｈｕＦｃγＲＩＩＢ１(ＦｃγＲＩＩＢ１+)指標細胞への結合性は完全に失われた一方、Ｔ１２５(ＣＨＯ)の結合性は、Ｔ１２５(ＹＢ２/０)に比べて、当該ｍＡｂがＦｃＲγＩＩＢ１に結合する能力が低下したにも関わらず維持されたということが間接的な免疫蛍光実験により示された(図４Ｃ)。同様に、どのような濃度が試験された場合でも、二重変異体Ｔ１２５(ＹＢ２０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ/Ｈｉｓ435Ｌｙｓは、４０ｎｇ/ｍｌのＡｔ１０ＦＩＴＣ抗体のＨＡ.１.６-ｈｕＦｃＲγＩＩＢ１細胞への結合を抑制できず、一方Ｔ１２５(ＣＨＯ)は、ＡＴ１０-ＦＩＴＣ抗体のＦｃγＲＩＩＢ１への結合性の抑制を誘導できるが、この抑制はＴ１２５(ＹＢ２/０)により誘導されるものよりも低かった(図４Ｄ)。
【００６６】
その結果、二重変異体Ｔ１２５(ＹＢ２０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ/Ｈｉｓ435Ｌｙｓは、ＦｃγＲとの相互作用の点で、Ｔ１２５(ＣＨＯ)の振舞いとは異なる振舞いを示し：Ｔ１２５(ＹＢ２０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ/Ｈｉｓ435Ｌｙｓは、活性型ＦｃγＲＩＩＩＡを効果的にリクルートするということが、これらの免疫蛍光実験により示された。他方、このモノクローナル抗体は、ＦｃγＲＩＩＢと関与することができない。
【００６７】
実施例６：Ｔ１２５抗体(ＹＢ２/０)、二重変異体Ｔ１２５抗体(ＹＢ２/０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ/Ｈｉｓ435Ｌｙｓ及びＴ１２５抗体(ＣＨＯ)で得られたＡＤＣＣの比較
単核細胞(エフェクター細胞の起源)及びテゲリン(Ｔｅｇｅｌｉｎｅ)(２５００μｇ/ｍｌ)の存在下で種々の抗Ｄｓにより誘導されるＲｈ陽性赤血球のＡＤＣＣ溶解を誘導する能力を、種々の抗Ｄ抗体について比較した。ＡＤ１抗体は、ＡＤＣＣ応答を引き起こさない抗Ｄ抗体であり、そしてその結果陰性対照として機能する。Ｔ１２５抗体は、２つの異なる細胞型：ＹＢ２/０(Ｔ１２５抗体(ＹＢ２/０)を産生する)とＣＨＯ(Ｔ１２５抗体(ＣＨＯ)を産生する)で発現された。さらに、Ｔ１２５抗体は、そのＨｉｓ３１０とＨｉｓ４３５残基の各々を置換するために、リジン残基で変異誘導される(Ｔ１２５(ＹＢ２/０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ/Ｈｉｓ435Ｌｙｓ)。
【００６８】
結果は図５に示され：変異されたヒスチジン抗体(Ｈ３１０ＫＨ４３５Ｋ)は、変異誘導されていないＴ１２５抗体(ＹＢ２/０)で得られたＲｈ陽性赤血球のＡＤＣＣよりもわずかに低いＲｈ陽性の赤血球のＡＤＣＣを誘導したが、ＡＤ１よりもずっと高かった。これらの実験条件下で、ＣＨＯで発現された抗Ｄ対照抗体は、ＡＤＣＣがあるとしてもかなり少ないＡＤＣＣしか誘導しなかったということに留意すべきである(結果は示していない)。
【００６９】
実施例７：ヒスチジン３１０と４３５のリジンへの変異誘導の構造への影響
Ｔ１２５(ＹＢ２／０)とＴ１２５Ｈ３１０Ｋ-Ｈ４３５Ｋ(ＹＢ２／０)(例えば実施例６)の結晶構造の比較により、ヒスチジン３１０及び４３５のリジンへの変異誘導が、Ｆｃ断片の一般的な立体配置を変更しなかった。WO2005/040216号の文献で(当該文献は本明細書に援用される)、変異を誘導されていない抗体、その結果Ｈｉｓ３１０及びＨｉｓ４３５残基を有する抗体は、亜鉛カチオン(Ｚｎ2+)に結合する能力を有することを示した。リジンを有するＦｃ断片は、Ｚｎ2+カチオンに結合する能力を失っていたが；これらの残基の側鎖の位置、並びにその３次元構造は、Ｔ１２５(ＹＢ２/０)のＦｃ断片のヒスチジン残基の位置及び３次元構造と重なりあった。この事実は、ヒトの治療においてこのタイプの抗体を使用するのに重要である。なぜなら、この事実により、Ｔ１２５抗体Ｈ３１０Ｋ-Ｈ３２５Ｋ(ＹＢ２/０)のＦｃｎＲへの結合性、そしてその結果生じる異化が変更されていないということが示唆されるからである。対照的に、ヒスチジン３１０及び４３５残基のリジンへの変異は、Ｆｃ断片のＣＨ２ドメインの配向に影響を有する。実際、Ｔ１２５(ＹＢ２/０)のＦｃ断片の結晶構造と、二重変異体Ｔ１２５Ｈ１２５Ｈ３１０Ｋ-Ｈ４３５Ｋ(ＹＢ２/０)のＦｃ断片の結晶構造との比較により、Ｔ１２５(ＹＢ２/０)のＦｃ断片のＣＨ２ドメインに比べて、二重変異体は、２個のＣＨ２ドメインが互いに近いより近接した立体配置を有する。立体配置におけるこの差が、ヒトＦｃγＲへの抗体の結合についてのＨ３１０ＫとＨ４３５Ｋ変異の影響の原因でありうる(実施例３、４、及び５)。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ヒトＦｃγＲをリクルートする抗体の能力についての、ジエチルピロカーボネートによる抗ＲｈＤｍＡｂ Ｔ１２５(ＹＢ２/０)のヒスチジンの改変の効果。
【図２】ヒトＦｃγＲに結合する抗体の能力についての、抗ＲｈＤｍＡｂ Ｔ１２５(ＹＢ２/０)におけるヒスチジン３１０と４３５のリジンへの変異誘導の効果。
【図３】ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ依存性のＩＬ-２産生を誘導するｍＡｂの能力についての抗-ＲｈＤｍＡｂ Ｔ１２５(ＹＢ２/０)におけるヒスチジン３１０と４３５の変異誘導の効果。
【図４】ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢに対するＴ１２５(ＹＢ２/０)、二重変異体Ｔ１２５(ＹＢ２／０)Ｈｉｓ310Ｌｙｓ／Ｈｉｓ435Ｌｙｓ、及びＴ１２５(ＣＨＯ)の結合性の比較。
【図５】ＹＢ２／０において産生された天然(野生型)抗体及びＣＨＯにおいて産生された天然(野生型)抗体と比較されたヒトＦｃγＲＩＩＩＡに依存するＡＤＣＣを誘導するモノクローナル抗体の能力についての抗-ＲｈＤモノクローナル抗体Ｔ１２５(ＹＢ２／０)のヒスチジン３１０及び４３５の変異誘導の効果。
【図６】亜鉛(Ａ)及びＴ１２５Ｈ３１０Ｋ-Ｈ４３５Ｋ(ＹＢ２／０)(Ｂ)の存在下におけるＴ１２５(ＹＢ２／０)のＦｃ断片の結晶構造の表面の表示。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性型ＦｃＲをリクルートする能力を有するが、抑制型ＦｃＲをリクルートする能力が、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に比べて低減される抗体の製造方法であって、以下のステップ：
ａ)ハイブリドーマ、ヘテロハイブリドーマ、又は任意の動物、植物若しくはヒトの細胞株からモノクローナル抗体を取得し、
ｂ)上記抗体のＦｃ領域のＨｉｓ３１０とＨｉｓ４３５残基(カバットの番号付け)の各々を、リジン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン又はスレオニンから選ばれる残基で置換し、
ｃ)抑制型ＦｃＲへの結合性が、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に比べて、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、７０％、８０％、又は少なくとも９０％だけ低減された抗体を選択する
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ステップｃ)において、抑制型ＦｃＲへの結合性が失われた抗体が選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択された残基がリジンであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップｂ)から得られた抗体が、ＹＢ２/０(ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１６６２号)で発現されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップｃ)から選ばれる前記抗体のＦｃ領域が、活性型Ｆｃ受容体に結合する一方、当該Ｆｃ領域が抑制型Ｆｃ受容体に結合しないことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、ＦｃγＲＩＩＩ受容体(Ａ及びＢイソ型)及び/又はＦｃγＲＩＩＡ受容体及び/又はＦｃγＲＩ受容体(Ａ及びＢイソ型)に結合する一方、ＦｃγＲＩＩＢ受容体(Ｂ１及びＢ２イソ型)に結合しないことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記受容体がヒト受容体であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
抗体のＦｃ領域の前記受容体が、樹状細胞、単球、マクロファージ、Ｂリンパ球上に位置することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
抗体のＦｃ領域の前記抑制型受容体が、悪性メラノーマ細胞などの腫瘍細胞、リンパ腫及びＢ-ＣＬＬなどの腫瘍性Ｂリンパ球並びに骨髄腫細胞上に位置する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が、Ｂ-ＣＬＬ腫瘍性リンパ球の表面のＣＤ２０分子に結合することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記残基が、部位特異的変異誘導又は分子進化により置換されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
抗感染及び抗腫瘍ワクチン化を意図された医薬の製造のための請求項１〜１１のいずれか一項に定義される方法によって産生された抗体であって、当該抗体が抗原提示細胞の活性型ＦｃγＲによってのみ結合されうる免疫複合体に関与する抗体の使用。
【請求項１３】
癌治療用の医薬の製造のための、請求項１〜１１のいずれか一項に定義される方法によって産生された抗体の使用。
【請求項１４】
リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫、乳癌などの固形腫瘍、直腸腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、胃腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、子宮頚部腫瘍、眼腫瘍、甲状腺腫瘍、ＥＮＴスフィアの腫瘍、悪性メラノーマ、膠芽細胞腫、神経芽細胞種などの神経腫瘍から選ばれる癌の治療用の医薬を製造するための、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
ＨＩＶ(ヒト免疫不全ウイルス)、ＨＢＶ(Ｂ型肝炎ウイルス)、ＨＣＶ(Ｃ型肝炎ウイルス)、ＲＳＶ(呼吸器合胞体ウイルス)、ＳＡＲＳウイルス(新型肺炎ウイルス)、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、天然痘による感染などの感染性疾患、コッホ杆菌、髄膜炎菌、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、クロストリジウム、結核菌、及び腸球菌により引き起こされる感染症などの細菌感染症の治療用の医薬の製造のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により産生された抗体の使用。
【請求項１】
活性型ＦｃＲをリクルートする能力を有するが、抑制型ＦｃＲをリクルートする能力が、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に比べて低減される抗体の製造方法であって、以下のステップ：
ａ)ハイブリドーマ、ヘテロハイブリドーマ、又は任意の動物、植物若しくはヒトの細胞株からモノクローナル抗体を取得し、
ｂ)上記抗体のＦｃ領域のＨｉｓ３１０とＨｉｓ４３５残基(カバットの番号付け)の各々を、リジン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン又はスレオニンから選ばれる残基で置換し、
ｃ)抑制型ＦｃＲへの結合性が、天然Ｆｃ領域を有する同じ抗体に比べて、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、７０％、８０％、又は少なくとも９０％だけ低減された抗体を選択する
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ステップｃ)において、抑制型ＦｃＲへの結合性が失われた抗体が選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択された残基がリジンであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップｂ)から得られた抗体が、ＹＢ２/０(ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１６６２号)で発現されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップｃ)から選ばれる前記抗体のＦｃ領域が、活性型Ｆｃ受容体に結合する一方、当該Ｆｃ領域が抑制型Ｆｃ受容体に結合しないことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、ＦｃγＲＩＩＩ受容体(Ａ及びＢイソ型)及び/又はＦｃγＲＩＩＡ受容体及び/又はＦｃγＲＩ受容体(Ａ及びＢイソ型)に結合する一方、ＦｃγＲＩＩＢ受容体(Ｂ１及びＢ２イソ型)に結合しないことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記受容体がヒト受容体であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
抗体のＦｃ領域の前記受容体が、樹状細胞、単球、マクロファージ、Ｂリンパ球上に位置することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
抗体のＦｃ領域の前記抑制型受容体が、悪性メラノーマ細胞などの腫瘍細胞、リンパ腫及びＢ-ＣＬＬなどの腫瘍性Ｂリンパ球並びに骨髄腫細胞上に位置する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が、Ｂ-ＣＬＬ腫瘍性リンパ球の表面のＣＤ２０分子に結合することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記残基が、部位特異的変異誘導又は分子進化により置換されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
抗感染及び抗腫瘍ワクチン化を意図された医薬の製造のための請求項１〜１１のいずれか一項に定義される方法によって産生された抗体であって、当該抗体が抗原提示細胞の活性型ＦｃγＲによってのみ結合されうる免疫複合体に関与する抗体の使用。
【請求項１３】
癌治療用の医薬の製造のための、請求項１〜１１のいずれか一項に定義される方法によって産生された抗体の使用。
【請求項１４】
リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫、乳癌などの固形腫瘍、直腸腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、胃腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、子宮頚部腫瘍、眼腫瘍、甲状腺腫瘍、ＥＮＴスフィアの腫瘍、悪性メラノーマ、膠芽細胞腫、神経芽細胞種などの神経腫瘍から選ばれる癌の治療用の医薬を製造するための、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
ＨＩＶ(ヒト免疫不全ウイルス)、ＨＢＶ(Ｂ型肝炎ウイルス)、ＨＣＶ(Ｃ型肝炎ウイルス)、ＲＳＶ(呼吸器合胞体ウイルス)、ＳＡＲＳウイルス(新型肺炎ウイルス)、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、天然痘による感染などの感染性疾患、コッホ杆菌、髄膜炎菌、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、クロストリジウム、結核菌、及び腸球菌により引き起こされる感染症などの細菌感染症の治療用の医薬の製造のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により産生された抗体の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【公表番号】特表２００９−５１９０３０（Ｐ２００９−５１９０３０Ａ）
【公表日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４５０４６（Ｐ２００８−５４５０４６）
【出願日】平成１８年１２月１５日（２００６．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００６／００２７４８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８０２７７
【国際公開日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【出願人】（５０８１７８７２２）エルエフベ バイオテクノロジ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１５日（２００６．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００６／００２７４８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８０２７７
【国際公開日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【出願人】（５０８１７８７２２）エルエフベ バイオテクノロジ (1)
【Ｆターム（参考）】
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