炭素イオンビーム照射を用いた酵母の変異株取得法
【課題】アルコールの生産能又はＧＡＢＡ等のアミノ酸の有用成分の生産能が高く、しかも醤油・味噌などの高塩分の食品の醸造にも利用可能であり、生育が良好であるジゴサッカロミセス属の酵母を得る。
【解決手段】ジゴサッカロミセス・ルキシーに炭素イオンビーム照射を行って突然変異を誘発し、その後、シクロヘキシミド耐性を示す株を選抜することによって、従来の方法では得ることができなかった、アルコールの生産能が著しく高く、かつ親株に比較して生育も良好なＺ．ルキシー変異株、又はＧＡＢＡおよび各種アミノ酸の生産能が高く、かつ親株に比較して生育も良好なＺ．ルキシー変異株を取得できる。
【解決手段】ジゴサッカロミセス・ルキシーに炭素イオンビーム照射を行って突然変異を誘発し、その後、シクロヘキシミド耐性を示す株を選抜することによって、従来の方法では得ることができなかった、アルコールの生産能が著しく高く、かつ親株に比較して生育も良好なＺ．ルキシー変異株、又はＧＡＢＡおよび各種アミノ酸の生産能が高く、かつ親株に比較して生育も良好なＺ．ルキシー変異株を取得できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炭素イオンビームの照射およびシクロヘキシミド耐性株のスクリーニングによる、アルコール又はγ−アミノ酪酸や各種アミノ酸の生産能が著しく向上し、かつ生育が良好な酵母ジゴサッカロマイセス・ルキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ、以下「Ｚ．ルキシー」と表記する場合もある）の変異株の取得法、該取得法によって得られるＺ．ルキシーの変異株、該変異株を用いた醤油や味噌あるいは清酒や焼酎などの醸造食品に係るものである。
【背景技術】
【０００２】
醤油、味噌、清酒、焼酎等の醸造食品の製造では、各種の酵母が重要な役割を果たす。たとえば、醤油の醸造では、Ｚ．ルキシーが、清酒の醸造ではサッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、以下「Ｓ．セルビシエ」と表記）がもろみ中の糖類の分解等に関与し、各種有用成分の生産や完成した食品の香味に対して大きく寄与している。
【０００３】
Ｚ．ルキシーは、アルコール生産能が低く、たとえばこれを用いて醤油を製造したとしても、アルコール濃度３％付近までしかアルコール発酵を行うことができない。そのため、醤油醸造に用いる場合、醸造した醤油の防黴性を高めるためには、必要により発酵終了後に食用のアルコールを別途添加することが必要であった。また、アルコール生産能が低いため、当該酵母を清酒や焼酎の製造に用いられることはなかった。
【０００４】
一方、Ｓ．セルビシエは、Ｚ．ルキシーに比較して耐塩性が低いことから、醤油や味噌の製造に利用することはできないが、アルコール生産能が高いことから清酒や焼酎の製造に用いられている。また、変異処理することなく、または変異処理したＳ．セルビシエ株のうち、オリゴマイシンやシクロヘキシミドを含む薬剤含有培地における生存株を選択することで、より高濃度のアルコールを含むもろみを製造する株を育種できることも報告されている（特許文献１）。しかしながら、当該方法では親株に比べて１０％程度上昇したアルコール高生産株を取得するのが限界であり、より実用的な方法が切望されていた。
【０００５】
また、一般的に、Ｓ．セルビシエの乾燥酵母菌体１ｇあたり０．０２〜０．０４ｍｇ程度のγ−アミノ酪酸（以下「ＧＡＢＡ」と呼ぶ）が存在しているが、Ｓ．セルビシエにフェムト秒レーザーを照射することで突然変異を誘発し、ＧＡＢＡ及びグリシンを高生産する酵母変異株を高頻度に獲得できることが報告されている（特許文献２）。しかしながら、当該変異株は、乾燥菌体１ｇあたりのＧＡＢＡ生産量が約０．０４ｍｇから５ｍｇ程度にまで増加させることが可能ではあるものの、得られた変異株は親株に比べて生育が非常に悪く、フェムト秒レーザー照射による変異株の取得は実用な方法とは到底考えられていなかった。
【０００６】
さらに最近、微生物に対し、突然変異率が高く、かつ幅広い突然変異を効率的に誘発することのできる新たな手段として、微生物菌体に、５００〜１２００ｋｅＶ／μｍの線エネルギー付与（ＬＥＴ）を有する重イオンビーム（鉄イオンビーム、キセノンイオンビーム、またはクリプトンイオンビームなど）を照射し、該微生物の遺伝子に、挿入変異、欠失変異、点変異などの変異を導入する、微生物に対する突然変異誘発方法が公開され（特許文献３）、この方法では、微生物として酵母も例示されている。しかし、実際の酵母の実施例はなく、鉄イオンビーム照射を用いたショ糖感受性根粒菌株の作出法が唯一具体的に記載されているだけである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−６０５３８号公報
【特許文献２】特開２００８−１５４４９７号公報
【特許文献３】特開２００８−３０６９９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって本発明の目的は、第一に、Ｓ．セルビシエとＺ．ルキシーの両方の特徴と兼ね備えた酵母、すなわち、耐塩性が高く、かつアルコール生産能又はＧＡＢＡ等のアミノ酸等の有用成分の生産能も高い変異株を取得することにあり、第二に、これらの変異株を醤油・味噌などの高塩分の食品の醸造に応用することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を行った結果、実用的な方法ではないと考えられているフェムト秒レーザー照射に代わり、最近、糸状菌等の変異株の作出に利用されているイオンビーム照射による変異株の作出（特開２００９−１９５２０５号公報、特開２００９−９５２８０号公報、特開２００９−９５２７９号公報、及び特開２００７−２２８８４９号公報）をＺ．ルキシーに応用し、更にシクロヘキミド耐性株のスクリーニングにより、上記第１と第２のそれぞれの目標に合致した変異株の取得に成功し、本発明を完成させたものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の［１］から［１２］に関するものである。
［１］．ジゴサッカロミセス・ルキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）（Ｚ．ルキシー）に属する酵母の変異株を取得する方法において、
（１）Ｚ．ルキシーに属する酵母に炭素イオンビームを照射し、変異を誘発する工程、
（２）炭素イオンビーム照射後の酵母から、シクロヘキシミド耐性を有する株をスクリーニングする工程、
（３）当該スクリーニングされた株より、アルコールまたはアミノ酸の生産能が親株に比べて高い変異株を選抜する工程、
を含む、変異株の取得法。
［２］．工程（３）におけるアミノ酸がγ−アミノ酪酸である、上記［１］に記載の取得法。
［３］．工程（３）におけるアミノ酸が、γ−アミノ酪酸に加えて、更に、β−アラニン、オルニチン及びアルギニンである、上記［２］に記載の取得法。
［４］．工程（２）において、炭素イオンビームを照射線量１００−５００Ｇｙの範囲で照射する、上記［１］から［３］のいずれかに記載の取得法。
［５］．耐塩性が高く、かつ、アルコールまたはアミノ酸の生産能が親株に比べて高く、更に、生育能が親株に比べて高い、Ｚ．ルキシーに属する酵母の変異株。
［６］．アミノ酸がγ−アミノ酪酸である、上記［５］に記載の変異株。
［７］．アミノ酸が、γ−アミノ酪酸に加えて、更に、β−アラニン、オルニチン及びアルギニンである、上記［６］に記載の変異株。
［８］．上記［１］から［４］のいずれかの取得法によって得られる、上記［５］から［７］のいずれかに記載の変異株。
［９］．受領番号が「ＮＩＴＥ ＡＰ−８２１」又は「ＮＩＴＥ ＡＰ−８２０」である、上記［５］から［８］のいずれかに記載の変異株。
［１０］．上記［５］から［９］のいずれかに記載の変異株を用いて醸造した醸造食品。
［１１］．醸造食品が、含塩食品である、上記［１０］に記載の醸造食品。
［１２］．含塩食品が味噌又は醤油である、上記［１１］に記載の醸造食品。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の変異株の取得法は、炭素イオンビーム照射とシクロヘキシミド耐性のスクリーニングを組み合わせることを特徴とし、耐塩性が高く、生育が良好で、かつアルコール生産能又はＧＡＢＡ等のアミノ酸等の有用成分の生産能も高い変異株の実用的な取得法を初めて提供するものである。
本発明の取得法で取得したアルコール生産能の高いＺ．ルキシー変異株を用いることで、アルコールを豊富に蓄積した香味豊かな醤油、味噌等の含塩食品を製造することができる。また、アルコール生産能が低く、従来酒類の製造には適していないとされてきたＺ．ルキシーにおいて、新たにアルコールをよく生産する変異株を得たことで、従来なかった全く新たな酒類や味醂などのアルコール含有調味料を生産することも可能である。
さらに、本発明の取得法で取得したＧＡＢＡ等のアミノ酸等の有用成分の生産能の高いＺ．ルキシー変異株を用いることで、ＧＡＢＡや各種アミノ酸などの有用成分を豊富に蓄積した醤油、味噌等の含塩食品を製造することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、Ｚ．ルキシーの変異株であるＧＡＢＡ−１株と親株である１８２株を、ＹＰＤ培地を用いて振盪培養した際の、ＯＤ６００の値の変化を示したものである。図中、四角形のプロットで結ばれた線がＧＡＢＡ−１株、ダイヤ形のプロットで結ばれた線が親株の値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の変異株の取得法に用いる親株である酵母は、醤油や味噌、清酒、焼酎等の醸造食品の製造に用いることができ、ジゴサッカロマイセス・ルキシー（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）に属するものであれば、いかなる酵母でも使用することができる。また、これらのジゴサッカロマイセス・ルキシー（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）に属する酵母を親株として作出された変異株、遺伝子組換株であっても構わない。
【００１４】
本発明の取得法は、炭素イオンビーム照射とシクロヘキシミド耐性のスクリーニングを組み合わせることを特徴としている。各種のイオンビーム照射と数々のスクリーリング法の組み合わせを検討する中で、炭素イオンビーム照射とシクロヘキシミド耐性の変異株のスクリーニングの組み合わせが、耐塩性が高く、かつアルコール生産能あるいはＧＡＢＡ等のアミノ酸等の有用成分の生産能も高く、更には生育能も高い変異株を、いずれも最も効率よく取得することができる。
【００１５】
炭素イオンビームの照射は、当該酵母を液体培地中で培養した後に、凍結乾燥体を作成し、これに対して行うのが好ましいが、炭素イオンビーム照射による変異誘発が適切に行われる方法であれば、当該方法に限定されない。
【００１６】
炭素イオンビームの照射量は、当該酵母に過度の損傷を与えず、かつ変異を与えられるような範囲であれば特に限定されるものではない。例えばＺ・ルキシーに炭素イオンビームを照射する場合の照射量の範囲として、照射線量１００〜５００Ｇｙ程度であり、好ましくは１００〜２００Ｇｙ、とくに好ましくは１００Ｇｙ程度である。
【００１７】
本発明の変異株の取得法では、Ｚ・ルキシーに炭素イオンビームを照射して変異を誘発したＺ・ルキシーを、引き続きそのまま、シクロヘキシミド耐性のスクリーニングに供する。スクリーニング方法としては、具体的には、炭素イオンビーム照射した菌体を、シクロヘキシミドを含有する選択培地上に塗布し、耐性を示す株だけを選抜すればよい。培地中のシクロヘキシミド濃度としては、通常用いられる濃度を適用すればよいが、具体的には、０．１〜１０μｇ／ｍｌが好ましい。
【００１８】
変異株が目的の性質を有することを確認するためには、酵母のアミノ酸生産能またはアルコール生産能を測定する。測定法としては公知の方法を採用することができ、たとえばアミノ酸生産能を計測するときには、凍結乾燥した目的酵母の抽出液を用いてアミノ酸分析計で初期のアミノ酸の濃度を測定する。また、アルコール生産能を計測するときには、目的酵母をＹＰＤ培地で静置培養し、培養液中のアルコール濃度を測定すればよい。生育能を計測するときには、同様に目的酵母をＹＰＤ培地で静置培養し、培養液の吸光度を測定すればよい。耐塩性の測定は、目的酵母を、ＹＰＤ培地に食塩１０％を添加した高塩性の培地で培養し、生育の様子を確認すればよい。すなわち、この培地で少なくとも正常に生育するものは耐塩性が高いといえる。
【００１９】
このようにして取得した本発明の変異株は、耐塩性が高く、かつアルコール生産能あるいはＧＡＢＡ等のアミノ酸等の有用成分の生産能が親株に比べて高く、更には生育能も親株に比べて高いものである。ここで、耐塩性が高いとは、酵母である親株Ｚ・ルキシーは、本来、耐塩性が高いものであり、この本来の高い耐塩性が少なくとも損なわれない程度の高さの耐塩性を意味する。また、親株に比べて高いアルコール生産能とは、親株と同じ条件で培養したときの培養液中のアルコールの濃度が少なくとも３倍高いことを意味する。ＧＡＢＡ等のアミノ酸等の有用成分の生産能が親株に比べて高いとは、ＧＡＢＡの生産量が、乾燥菌体１ｇ当り少なくとも５ｍｇであることを意味し、更に好ましくは、ＧＡＢＡ、β−アラニン、オルニチン及びアルギニンの生産量が、乾燥菌体１ｇ当り少なくともそれぞれ０．１ｍｇ、５ｍｇ、１ｍｇ及び９ｍｇであることを意味する。また、親株に比べて生育能が高いとは、親株と同じ条件で培養したときの培養液の吸光度が少なくとも２倍高いことを意味する。
このような変異株として、より具体的には、後述する実施例においてアルコール生産能が高く生育能が高い変異株として取得され、平成２１年１０月１日に特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、Zygosaccharomyces rouxii koba-2として寄託され受領番号として「ＮＩＴＥ ＡＰ−８２１」が付与された耐性株−１株、 ＧＡＢＡ、β−アラニン、オルニチン及びアルギニンの生産能が高く生育能が高い株として取得され、平成２１年１０月１日に特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、Zygosaccharomyces rouxii koba-1として寄託され受領番号として「ＮＩＴＥ ＡＰ−８２０」が付与されたＧＡＢ−１株が挙げられる。
【００２０】
以上に説明した本発明の酵母の変異株は、醤油や味噌などの含塩食品、酒類や味醂などのアルコール含有調味料等の醸造食品の製造に応用することができる。より具体的には、アルコール生産能が高い変異株又はＧＡＢＡ等のアミノ酸等の有用成分の生産能が高い変異株は、特に醤油や味噌などの含塩食品の製造に好ましく用いることができる。これらの変異株を用いて醤油や味噌などの含塩食品を製造するには、公知の方法を用いることができる。たとえば、該酵母を用いて醤油を製造する場合、通常の麹原料、たとえば撒水して蒸煮した大豆原料と炒熬割砕した小麦原料の混合物に麹菌を接種混合して麹を調製し、得られた麹を通常の仕込みタンクに適当な濃度の食塩水で仕込み、適宜撹拌しつつ発酵熟成させ、乳酸発酵が終了する仕込み１ヶ月程度の時点で本願発明の変異酵母を添加する。添加後、さらに２〜５ヶ月間程度発酵熟成させて醤油諸味を得、常法により圧搾、精製、必要により火入れを行い、製品醤油（生醤油あるいは火入醤油）とする。
【００２１】
また、本発明のアルコール生産能が高い変異株は、高いアルコール生産能を有することから、特に酒類や味醂などのアルコール含有調味料の醸造に応用することが可能である。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例によって更に詳細に説明するが、本発明は、これら実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１
炭素イオンビーム照射による、エタノール高生産性Ｚ．ルキシー変異株の取得
親株のＺ．ルキシー１８２株を、ＹＰＤ液体培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、２％グルコース）１００ｍｌ中、３０℃で２日間振盪培養した。集菌後、菌体を滅菌水および保護用培地（６％ポリビニルピロリドンＫ９０、３％グルタミン酸ナトリウム、５％ラクトース、０．１Ｍリン酸（Ｋ−Ｋ）緩衝液（ｐＨ７．０））で洗浄し、保護用培地３０ｍｌに懸濁した。その後、乾燥後の厚さが１ｍｍ以下で均一になるよう、直径５ｃｍのプレート上に、酵母を懸濁した保護用培地を塗布した。酵母を塗布したプレートを真空乾燥し、共雑を避けるためにカプトン膜（厚さ７．５μｍ）をかぶせた。イオンビーム照射には日本原子力研究開発機構 高崎量子応用研究所のイオン照射研究施設ＴＩＡＲＡを用い、炭素イオンビームを照射エネルギー２２０ＭｅＶ、吸収線量１００〜５００Ｇｙにて照射した。
【００２３】
イオンビーム照射した酵母を復水培地（１％グルコース、０．５％ペプトン、０．３％酵母エキス、０．３％酵母エキス）に懸濁した後、シクロヘキシミド３ｐｐｍを含むＹＰＤ寒天培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、２％グルコース、１．５％寒天）に塗布し、３０℃で３日間培養した。生育したシクロヘキシミド耐性株の数を数え、塗布した細胞数に対する生育コロニー数の比率をシクロヘキシミド耐性株の生育率とした。照射した炭素イオンビームの各照射線量における変異率、すなわち生育率を表１に示す。なお照射線量を２００Ｇｙ以上にすると、シクロヘキシミド耐性株の耐塩性が欠失する傾向が見られた。
【００２４】
【表１】
【００２５】
シクロヘキシミド耐性を獲得した変異株７株をピックアップし、ＹＰＤ液体培地１０ｍｌで３０℃２日間振盪培養して、前培養とした。該前培養液を、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＹＰＤ２０培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、２０％グルコース）に植菌し、３０℃で７日間静置培養した。培養終了後に培養液中のアルコール濃度およびＯＤ６００を測定した結果を表２に示す。
【００２６】
表２に示したとおり、シクロヘキシミド耐性株の中の高濃度ＧＡＢＡ蓄積株（耐性株−６（ＧＡＢＡ−１）及び耐性株−７（ＧＡＢＡ−２））以外の株（耐性株−１、耐性株−２、耐性株−３、耐性株−４及び耐性株−５）では、アルコール発酵能が著しく向上していた。また、生育も親株よりも良好であった。
このように、イオンビーム照射を行った株のうち、シクロヘキシミド耐性を呈する株を選抜することにより、アルコール生産能が高いうえに、生育能も高い変異株を取得できることが明らかになった。
【００２７】
【表２】
【００２８】
実施例２
本発明のＺ．ルキシー変異株を利用したアルコール高濃度含有醤油の製造
実施例１で選択したＺ．ルキシー変異株を使用して醤油を製造し、醸造特性を調べた。すなわち、脱脂大豆５ｋｇに１５０％散水し、２ｋｇ／ｃｍ２で１３分間加圧蒸煮後、４０℃に冷却したものに炒熬割砕した小麦４．８ｋｇを混合して粉合せ原料を得、これに麹菌を接種混合して小型通風製麹装置内で送風温度２８℃で２４時間、次いで２６℃で２０時間製麹して醤油麹を得た。
【００２９】
得られた麹１０ｋｇに２４．５％食塩水１５．３リットル（Ｌ）を加えて小型容器に仕込み、１５℃で１ヶ月発酵熟成させた後、実施例１にて「耐性株−１」として得られたアルコール高生産性Ｚ．ルキシー変異株を１０３個／ｍｌ添加し、次いで、３０℃で５ヶ月間発酵熟成させた。得られた諸味を濾紙濾過により液汁と固形分に分けて諸味液汁を得、諸味液汁を加熱処理して醤油を得た。その結果、アルコール濃度が３％以上の香味豊かな醤油が得られることを確認した。
なお、耐性株−１株は、平成２１年１０月１日に特許生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、Zygosaccharomyces rouxii koba-2として寄託され、受領番号として「ＮＩＴＥ ＡＰ−８２１」が付与されている。
【００３０】
実施例３
炭素イオンビーム照射によるアミノ酸高生産性Ｚ．ルキシー変異株の取得
実施例１で取得したシクロヘキシミド耐性株をＹＰＤ液体培地５ｍｌで３０℃一晩振盪培養して、集菌した後、２回水洗した。洗浄した菌体を凍結乾燥し、その乾燥菌体の重量を測定した。
【００３１】
凍結乾燥した上記菌体に水１ｍｌを添加し、４０℃で１時間撹拌した後、メタノール１ｍｌを添加し、４０℃で１時間撹拌した。遠心後、抽出液を４０倍に減圧濃縮し、薄層クロマトグラフにてＧＡＢＡ生産量を比較した（展開溶媒は、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝３：２：１とした）。実施例１で取得したシクロヘキシミド耐性株の７株のうち、親株よりもＧＡＢＡ生産量が増加した株を２株取得し、表２にも記載したように、最もＧＡＢＡ生産能が高いと思われる株をＧＡＢＡ−１株とし、次に高い株をＧＡＢＡ−２株とした。さらに、このＧＡＢＡ−１株について、抽出液中の各アミノ酸含量をアミノ酸分析計にて測定した。アミノ酸分析計の測定値を、乾燥菌体あたりに換算した結果を表３に示す。
【００３２】
表３に示す結果から、ＧＡＢＡ−１株は、ＧＡＢＡだけでなく、β−アラニン、オルニチン、アルギニンなどの各種のアミノ酸についても、親株よりも多く蓄積している上に、表２の結果からも明らかなように生育も良好であることが分かった。
【００３３】
【表３】
【００３４】
また、ＧＡＢＡ−１株と親株である１８２株とを、１０ｍｌのＹＰＤ培地中において３０℃で２日間振盪培養し、前培養とした。前培養液を、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で振盪培養し、経時的に菌液をサンプリングして、ＯＤ６００を測定した。
結果を図１に示した。図１から分かるように、ＧＡＢＡ−１株は、親株である１８２株よりも増殖速度が速く、最終ＯＤ６００も高いものであり、より良好な生育を示した。
【００３５】
このように、イオンビーム照射を行った株のうち、シクロヘキシミド耐性を呈する株を選抜することにより、ＧＡＢＡおよび各種アミノ酸の生産能が高いうえに、生育能も高い変異株を取得できることが明らかになった。なお、ＧＡＢＡ−１株は、平成２１年１０月１日に特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、Zygosaccharomyces rouxii koba-1として寄託され、受領番号として「ＮＩＴＥ ＡＰ−８２０」が付与されている。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明によれば、炭素イオンビーム照射とシクロヘキシミド耐性のスクリーニングを組み合わせたＺ．ルキシー変異株の取得法であって、生育が良好で、かつアルコール生産能又はＧＡＢＡ等のアミノ酸等の有用成分の生産能も高い変異株の実用的な取得法が提供される。本発明の取得法で取得したアルコール生産能の高いＺ．ルキシー変異株を用いることで、アルコールを豊富に蓄積した香味豊かな醤油、味噌等の含塩食品を製造することができる。また、アルコール生産能が低く、従来酒類の製造には適していないとされてきたＺ．ルキシーにおいて、新たにアルコールをよく生産する変異株を得たことで、従来なかった全く新たな酒類や味醂などのアルコール含有調味料を生産することも可能である。
さらに、本発明の取得法で取得したＧＡＢＡ等のアミノ酸等の有用成分の生産能の高いＺ．ルキシー変異株を用いることで、ＧＡＢＡや各種アミノ酸などの有用成分を豊富に蓄積した醤油、味噌等の含塩食品を製造することもできる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炭素イオンビームの照射およびシクロヘキシミド耐性株のスクリーニングによる、アルコール又はγ−アミノ酪酸や各種アミノ酸の生産能が著しく向上し、かつ生育が良好な酵母ジゴサッカロマイセス・ルキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ、以下「Ｚ．ルキシー」と表記する場合もある）の変異株の取得法、該取得法によって得られるＺ．ルキシーの変異株、該変異株を用いた醤油や味噌あるいは清酒や焼酎などの醸造食品に係るものである。
【背景技術】
【０００２】
醤油、味噌、清酒、焼酎等の醸造食品の製造では、各種の酵母が重要な役割を果たす。たとえば、醤油の醸造では、Ｚ．ルキシーが、清酒の醸造ではサッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、以下「Ｓ．セルビシエ」と表記）がもろみ中の糖類の分解等に関与し、各種有用成分の生産や完成した食品の香味に対して大きく寄与している。
【０００３】
Ｚ．ルキシーは、アルコール生産能が低く、たとえばこれを用いて醤油を製造したとしても、アルコール濃度３％付近までしかアルコール発酵を行うことができない。そのため、醤油醸造に用いる場合、醸造した醤油の防黴性を高めるためには、必要により発酵終了後に食用のアルコールを別途添加することが必要であった。また、アルコール生産能が低いため、当該酵母を清酒や焼酎の製造に用いられることはなかった。
【０００４】
一方、Ｓ．セルビシエは、Ｚ．ルキシーに比較して耐塩性が低いことから、醤油や味噌の製造に利用することはできないが、アルコール生産能が高いことから清酒や焼酎の製造に用いられている。また、変異処理することなく、または変異処理したＳ．セルビシエ株のうち、オリゴマイシンやシクロヘキシミドを含む薬剤含有培地における生存株を選択することで、より高濃度のアルコールを含むもろみを製造する株を育種できることも報告されている（特許文献１）。しかしながら、当該方法では親株に比べて１０％程度上昇したアルコール高生産株を取得するのが限界であり、より実用的な方法が切望されていた。
【０００５】
また、一般的に、Ｓ．セルビシエの乾燥酵母菌体１ｇあたり０．０２〜０．０４ｍｇ程度のγ−アミノ酪酸（以下「ＧＡＢＡ」と呼ぶ）が存在しているが、Ｓ．セルビシエにフェムト秒レーザーを照射することで突然変異を誘発し、ＧＡＢＡ及びグリシンを高生産する酵母変異株を高頻度に獲得できることが報告されている（特許文献２）。しかしながら、当該変異株は、乾燥菌体１ｇあたりのＧＡＢＡ生産量が約０．０４ｍｇから５ｍｇ程度にまで増加させることが可能ではあるものの、得られた変異株は親株に比べて生育が非常に悪く、フェムト秒レーザー照射による変異株の取得は実用な方法とは到底考えられていなかった。
【０００６】
さらに最近、微生物に対し、突然変異率が高く、かつ幅広い突然変異を効率的に誘発することのできる新たな手段として、微生物菌体に、５００〜１２００ｋｅＶ／μｍの線エネルギー付与（ＬＥＴ）を有する重イオンビーム（鉄イオンビーム、キセノンイオンビーム、またはクリプトンイオンビームなど）を照射し、該微生物の遺伝子に、挿入変異、欠失変異、点変異などの変異を導入する、微生物に対する突然変異誘発方法が公開され（特許文献３）、この方法では、微生物として酵母も例示されている。しかし、実際の酵母の実施例はなく、鉄イオンビーム照射を用いたショ糖感受性根粒菌株の作出法が唯一具体的に記載されているだけである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−６０５３８号公報
【特許文献２】特開２００８−１５４４９７号公報
【特許文献３】特開２００８−３０６９９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって本発明の目的は、第一に、Ｓ．セルビシエとＺ．ルキシーの両方の特徴と兼ね備えた酵母、すなわち、耐塩性が高く、かつアルコール生産能又はＧＡＢＡ等のアミノ酸等の有用成分の生産能も高い変異株を取得することにあり、第二に、これらの変異株を醤油・味噌などの高塩分の食品の醸造に応用することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を行った結果、実用的な方法ではないと考えられているフェムト秒レーザー照射に代わり、最近、糸状菌等の変異株の作出に利用されているイオンビーム照射による変異株の作出（特開２００９−１９５２０５号公報、特開２００９−９５２８０号公報、特開２００９−９５２７９号公報、及び特開２００７−２２８８４９号公報）をＺ．ルキシーに応用し、更にシクロヘキミド耐性株のスクリーニングにより、上記第１と第２のそれぞれの目標に合致した変異株の取得に成功し、本発明を完成させたものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の［１］から［１２］に関するものである。
［１］．ジゴサッカロミセス・ルキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）（Ｚ．ルキシー）に属する酵母の変異株を取得する方法において、
（１）Ｚ．ルキシーに属する酵母に炭素イオンビームを照射し、変異を誘発する工程、
（２）炭素イオンビーム照射後の酵母から、シクロヘキシミド耐性を有する株をスクリーニングする工程、
（３）当該スクリーニングされた株より、アルコールまたはアミノ酸の生産能が親株に比べて高い変異株を選抜する工程、
を含む、変異株の取得法。
［２］．工程（３）におけるアミノ酸がγ−アミノ酪酸である、上記［１］に記載の取得法。
［３］．工程（３）におけるアミノ酸が、γ−アミノ酪酸に加えて、更に、β−アラニン、オルニチン及びアルギニンである、上記［２］に記載の取得法。
［４］．工程（２）において、炭素イオンビームを照射線量１００−５００Ｇｙの範囲で照射する、上記［１］から［３］のいずれかに記載の取得法。
［５］．耐塩性が高く、かつ、アルコールまたはアミノ酸の生産能が親株に比べて高く、更に、生育能が親株に比べて高い、Ｚ．ルキシーに属する酵母の変異株。
［６］．アミノ酸がγ−アミノ酪酸である、上記［５］に記載の変異株。
［７］．アミノ酸が、γ−アミノ酪酸に加えて、更に、β−アラニン、オルニチン及びアルギニンである、上記［６］に記載の変異株。
［８］．上記［１］から［４］のいずれかの取得法によって得られる、上記［５］から［７］のいずれかに記載の変異株。
［９］．受領番号が「ＮＩＴＥ ＡＰ−８２１」又は「ＮＩＴＥ ＡＰ−８２０」である、上記［５］から［８］のいずれかに記載の変異株。
［１０］．上記［５］から［９］のいずれかに記載の変異株を用いて醸造した醸造食品。
［１１］．醸造食品が、含塩食品である、上記［１０］に記載の醸造食品。
［１２］．含塩食品が味噌又は醤油である、上記［１１］に記載の醸造食品。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の変異株の取得法は、炭素イオンビーム照射とシクロヘキシミド耐性のスクリーニングを組み合わせることを特徴とし、耐塩性が高く、生育が良好で、かつアルコール生産能又はＧＡＢＡ等のアミノ酸等の有用成分の生産能も高い変異株の実用的な取得法を初めて提供するものである。
本発明の取得法で取得したアルコール生産能の高いＺ．ルキシー変異株を用いることで、アルコールを豊富に蓄積した香味豊かな醤油、味噌等の含塩食品を製造することができる。また、アルコール生産能が低く、従来酒類の製造には適していないとされてきたＺ．ルキシーにおいて、新たにアルコールをよく生産する変異株を得たことで、従来なかった全く新たな酒類や味醂などのアルコール含有調味料を生産することも可能である。
さらに、本発明の取得法で取得したＧＡＢＡ等のアミノ酸等の有用成分の生産能の高いＺ．ルキシー変異株を用いることで、ＧＡＢＡや各種アミノ酸などの有用成分を豊富に蓄積した醤油、味噌等の含塩食品を製造することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、Ｚ．ルキシーの変異株であるＧＡＢＡ−１株と親株である１８２株を、ＹＰＤ培地を用いて振盪培養した際の、ＯＤ６００の値の変化を示したものである。図中、四角形のプロットで結ばれた線がＧＡＢＡ−１株、ダイヤ形のプロットで結ばれた線が親株の値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の変異株の取得法に用いる親株である酵母は、醤油や味噌、清酒、焼酎等の醸造食品の製造に用いることができ、ジゴサッカロマイセス・ルキシー（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）に属するものであれば、いかなる酵母でも使用することができる。また、これらのジゴサッカロマイセス・ルキシー（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）に属する酵母を親株として作出された変異株、遺伝子組換株であっても構わない。
【００１４】
本発明の取得法は、炭素イオンビーム照射とシクロヘキシミド耐性のスクリーニングを組み合わせることを特徴としている。各種のイオンビーム照射と数々のスクリーリング法の組み合わせを検討する中で、炭素イオンビーム照射とシクロヘキシミド耐性の変異株のスクリーニングの組み合わせが、耐塩性が高く、かつアルコール生産能あるいはＧＡＢＡ等のアミノ酸等の有用成分の生産能も高く、更には生育能も高い変異株を、いずれも最も効率よく取得することができる。
【００１５】
炭素イオンビームの照射は、当該酵母を液体培地中で培養した後に、凍結乾燥体を作成し、これに対して行うのが好ましいが、炭素イオンビーム照射による変異誘発が適切に行われる方法であれば、当該方法に限定されない。
【００１６】
炭素イオンビームの照射量は、当該酵母に過度の損傷を与えず、かつ変異を与えられるような範囲であれば特に限定されるものではない。例えばＺ・ルキシーに炭素イオンビームを照射する場合の照射量の範囲として、照射線量１００〜５００Ｇｙ程度であり、好ましくは１００〜２００Ｇｙ、とくに好ましくは１００Ｇｙ程度である。
【００１７】
本発明の変異株の取得法では、Ｚ・ルキシーに炭素イオンビームを照射して変異を誘発したＺ・ルキシーを、引き続きそのまま、シクロヘキシミド耐性のスクリーニングに供する。スクリーニング方法としては、具体的には、炭素イオンビーム照射した菌体を、シクロヘキシミドを含有する選択培地上に塗布し、耐性を示す株だけを選抜すればよい。培地中のシクロヘキシミド濃度としては、通常用いられる濃度を適用すればよいが、具体的には、０．１〜１０μｇ／ｍｌが好ましい。
【００１８】
変異株が目的の性質を有することを確認するためには、酵母のアミノ酸生産能またはアルコール生産能を測定する。測定法としては公知の方法を採用することができ、たとえばアミノ酸生産能を計測するときには、凍結乾燥した目的酵母の抽出液を用いてアミノ酸分析計で初期のアミノ酸の濃度を測定する。また、アルコール生産能を計測するときには、目的酵母をＹＰＤ培地で静置培養し、培養液中のアルコール濃度を測定すればよい。生育能を計測するときには、同様に目的酵母をＹＰＤ培地で静置培養し、培養液の吸光度を測定すればよい。耐塩性の測定は、目的酵母を、ＹＰＤ培地に食塩１０％を添加した高塩性の培地で培養し、生育の様子を確認すればよい。すなわち、この培地で少なくとも正常に生育するものは耐塩性が高いといえる。
【００１９】
このようにして取得した本発明の変異株は、耐塩性が高く、かつアルコール生産能あるいはＧＡＢＡ等のアミノ酸等の有用成分の生産能が親株に比べて高く、更には生育能も親株に比べて高いものである。ここで、耐塩性が高いとは、酵母である親株Ｚ・ルキシーは、本来、耐塩性が高いものであり、この本来の高い耐塩性が少なくとも損なわれない程度の高さの耐塩性を意味する。また、親株に比べて高いアルコール生産能とは、親株と同じ条件で培養したときの培養液中のアルコールの濃度が少なくとも３倍高いことを意味する。ＧＡＢＡ等のアミノ酸等の有用成分の生産能が親株に比べて高いとは、ＧＡＢＡの生産量が、乾燥菌体１ｇ当り少なくとも５ｍｇであることを意味し、更に好ましくは、ＧＡＢＡ、β−アラニン、オルニチン及びアルギニンの生産量が、乾燥菌体１ｇ当り少なくともそれぞれ０．１ｍｇ、５ｍｇ、１ｍｇ及び９ｍｇであることを意味する。また、親株に比べて生育能が高いとは、親株と同じ条件で培養したときの培養液の吸光度が少なくとも２倍高いことを意味する。
このような変異株として、より具体的には、後述する実施例においてアルコール生産能が高く生育能が高い変異株として取得され、平成２１年１０月１日に特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、Zygosaccharomyces rouxii koba-2として寄託され受領番号として「ＮＩＴＥ ＡＰ−８２１」が付与された耐性株−１株、 ＧＡＢＡ、β−アラニン、オルニチン及びアルギニンの生産能が高く生育能が高い株として取得され、平成２１年１０月１日に特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、Zygosaccharomyces rouxii koba-1として寄託され受領番号として「ＮＩＴＥ ＡＰ−８２０」が付与されたＧＡＢ−１株が挙げられる。
【００２０】
以上に説明した本発明の酵母の変異株は、醤油や味噌などの含塩食品、酒類や味醂などのアルコール含有調味料等の醸造食品の製造に応用することができる。より具体的には、アルコール生産能が高い変異株又はＧＡＢＡ等のアミノ酸等の有用成分の生産能が高い変異株は、特に醤油や味噌などの含塩食品の製造に好ましく用いることができる。これらの変異株を用いて醤油や味噌などの含塩食品を製造するには、公知の方法を用いることができる。たとえば、該酵母を用いて醤油を製造する場合、通常の麹原料、たとえば撒水して蒸煮した大豆原料と炒熬割砕した小麦原料の混合物に麹菌を接種混合して麹を調製し、得られた麹を通常の仕込みタンクに適当な濃度の食塩水で仕込み、適宜撹拌しつつ発酵熟成させ、乳酸発酵が終了する仕込み１ヶ月程度の時点で本願発明の変異酵母を添加する。添加後、さらに２〜５ヶ月間程度発酵熟成させて醤油諸味を得、常法により圧搾、精製、必要により火入れを行い、製品醤油（生醤油あるいは火入醤油）とする。
【００２１】
また、本発明のアルコール生産能が高い変異株は、高いアルコール生産能を有することから、特に酒類や味醂などのアルコール含有調味料の醸造に応用することが可能である。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例によって更に詳細に説明するが、本発明は、これら実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１
炭素イオンビーム照射による、エタノール高生産性Ｚ．ルキシー変異株の取得
親株のＺ．ルキシー１８２株を、ＹＰＤ液体培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、２％グルコース）１００ｍｌ中、３０℃で２日間振盪培養した。集菌後、菌体を滅菌水および保護用培地（６％ポリビニルピロリドンＫ９０、３％グルタミン酸ナトリウム、５％ラクトース、０．１Ｍリン酸（Ｋ−Ｋ）緩衝液（ｐＨ７．０））で洗浄し、保護用培地３０ｍｌに懸濁した。その後、乾燥後の厚さが１ｍｍ以下で均一になるよう、直径５ｃｍのプレート上に、酵母を懸濁した保護用培地を塗布した。酵母を塗布したプレートを真空乾燥し、共雑を避けるためにカプトン膜（厚さ７．５μｍ）をかぶせた。イオンビーム照射には日本原子力研究開発機構 高崎量子応用研究所のイオン照射研究施設ＴＩＡＲＡを用い、炭素イオンビームを照射エネルギー２２０ＭｅＶ、吸収線量１００〜５００Ｇｙにて照射した。
【００２３】
イオンビーム照射した酵母を復水培地（１％グルコース、０．５％ペプトン、０．３％酵母エキス、０．３％酵母エキス）に懸濁した後、シクロヘキシミド３ｐｐｍを含むＹＰＤ寒天培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、２％グルコース、１．５％寒天）に塗布し、３０℃で３日間培養した。生育したシクロヘキシミド耐性株の数を数え、塗布した細胞数に対する生育コロニー数の比率をシクロヘキシミド耐性株の生育率とした。照射した炭素イオンビームの各照射線量における変異率、すなわち生育率を表１に示す。なお照射線量を２００Ｇｙ以上にすると、シクロヘキシミド耐性株の耐塩性が欠失する傾向が見られた。
【００２４】
【表１】
【００２５】
シクロヘキシミド耐性を獲得した変異株７株をピックアップし、ＹＰＤ液体培地１０ｍｌで３０℃２日間振盪培養して、前培養とした。該前培養液を、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＹＰＤ２０培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、２０％グルコース）に植菌し、３０℃で７日間静置培養した。培養終了後に培養液中のアルコール濃度およびＯＤ６００を測定した結果を表２に示す。
【００２６】
表２に示したとおり、シクロヘキシミド耐性株の中の高濃度ＧＡＢＡ蓄積株（耐性株−６（ＧＡＢＡ−１）及び耐性株−７（ＧＡＢＡ−２））以外の株（耐性株−１、耐性株−２、耐性株−３、耐性株−４及び耐性株−５）では、アルコール発酵能が著しく向上していた。また、生育も親株よりも良好であった。
このように、イオンビーム照射を行った株のうち、シクロヘキシミド耐性を呈する株を選抜することにより、アルコール生産能が高いうえに、生育能も高い変異株を取得できることが明らかになった。
【００２７】
【表２】
【００２８】
実施例２
本発明のＺ．ルキシー変異株を利用したアルコール高濃度含有醤油の製造
実施例１で選択したＺ．ルキシー変異株を使用して醤油を製造し、醸造特性を調べた。すなわち、脱脂大豆５ｋｇに１５０％散水し、２ｋｇ／ｃｍ２で１３分間加圧蒸煮後、４０℃に冷却したものに炒熬割砕した小麦４．８ｋｇを混合して粉合せ原料を得、これに麹菌を接種混合して小型通風製麹装置内で送風温度２８℃で２４時間、次いで２６℃で２０時間製麹して醤油麹を得た。
【００２９】
得られた麹１０ｋｇに２４．５％食塩水１５．３リットル（Ｌ）を加えて小型容器に仕込み、１５℃で１ヶ月発酵熟成させた後、実施例１にて「耐性株−１」として得られたアルコール高生産性Ｚ．ルキシー変異株を１０３個／ｍｌ添加し、次いで、３０℃で５ヶ月間発酵熟成させた。得られた諸味を濾紙濾過により液汁と固形分に分けて諸味液汁を得、諸味液汁を加熱処理して醤油を得た。その結果、アルコール濃度が３％以上の香味豊かな醤油が得られることを確認した。
なお、耐性株−１株は、平成２１年１０月１日に特許生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、Zygosaccharomyces rouxii koba-2として寄託され、受領番号として「ＮＩＴＥ ＡＰ−８２１」が付与されている。
【００３０】
実施例３
炭素イオンビーム照射によるアミノ酸高生産性Ｚ．ルキシー変異株の取得
実施例１で取得したシクロヘキシミド耐性株をＹＰＤ液体培地５ｍｌで３０℃一晩振盪培養して、集菌した後、２回水洗した。洗浄した菌体を凍結乾燥し、その乾燥菌体の重量を測定した。
【００３１】
凍結乾燥した上記菌体に水１ｍｌを添加し、４０℃で１時間撹拌した後、メタノール１ｍｌを添加し、４０℃で１時間撹拌した。遠心後、抽出液を４０倍に減圧濃縮し、薄層クロマトグラフにてＧＡＢＡ生産量を比較した（展開溶媒は、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝３：２：１とした）。実施例１で取得したシクロヘキシミド耐性株の７株のうち、親株よりもＧＡＢＡ生産量が増加した株を２株取得し、表２にも記載したように、最もＧＡＢＡ生産能が高いと思われる株をＧＡＢＡ−１株とし、次に高い株をＧＡＢＡ−２株とした。さらに、このＧＡＢＡ−１株について、抽出液中の各アミノ酸含量をアミノ酸分析計にて測定した。アミノ酸分析計の測定値を、乾燥菌体あたりに換算した結果を表３に示す。
【００３２】
表３に示す結果から、ＧＡＢＡ−１株は、ＧＡＢＡだけでなく、β−アラニン、オルニチン、アルギニンなどの各種のアミノ酸についても、親株よりも多く蓄積している上に、表２の結果からも明らかなように生育も良好であることが分かった。
【００３３】
【表３】
【００３４】
また、ＧＡＢＡ−１株と親株である１８２株とを、１０ｍｌのＹＰＤ培地中において３０℃で２日間振盪培養し、前培養とした。前培養液を、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で振盪培養し、経時的に菌液をサンプリングして、ＯＤ６００を測定した。
結果を図１に示した。図１から分かるように、ＧＡＢＡ−１株は、親株である１８２株よりも増殖速度が速く、最終ＯＤ６００も高いものであり、より良好な生育を示した。
【００３５】
このように、イオンビーム照射を行った株のうち、シクロヘキシミド耐性を呈する株を選抜することにより、ＧＡＢＡおよび各種アミノ酸の生産能が高いうえに、生育能も高い変異株を取得できることが明らかになった。なお、ＧＡＢＡ−１株は、平成２１年１０月１日に特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、Zygosaccharomyces rouxii koba-1として寄託され、受領番号として「ＮＩＴＥ ＡＰ−８２０」が付与されている。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明によれば、炭素イオンビーム照射とシクロヘキシミド耐性のスクリーニングを組み合わせたＺ．ルキシー変異株の取得法であって、生育が良好で、かつアルコール生産能又はＧＡＢＡ等のアミノ酸等の有用成分の生産能も高い変異株の実用的な取得法が提供される。本発明の取得法で取得したアルコール生産能の高いＺ．ルキシー変異株を用いることで、アルコールを豊富に蓄積した香味豊かな醤油、味噌等の含塩食品を製造することができる。また、アルコール生産能が低く、従来酒類の製造には適していないとされてきたＺ．ルキシーにおいて、新たにアルコールをよく生産する変異株を得たことで、従来なかった全く新たな酒類や味醂などのアルコール含有調味料を生産することも可能である。
さらに、本発明の取得法で取得したＧＡＢＡ等のアミノ酸等の有用成分の生産能の高いＺ．ルキシー変異株を用いることで、ＧＡＢＡや各種アミノ酸などの有用成分を豊富に蓄積した醤油、味噌等の含塩食品を製造することもできる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジゴサッカロミセス・ルキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）（Ｚ．ルキシー）に属する酵母の変異株を取得する方法において、
（１）Ｚ．ルキシーに属する酵母に炭素イオンビームを照射し、変異を誘発する工程、
（２）炭素イオンビーム照射後の酵母から、シクロヘキシミド耐性を有する株をスクリーニングする工程、
（３）当該スクリーニングされた株より、アルコールまたはアミノ酸の生産能が親株に比べて高い変異株を選抜する工程、
を含む、変異株の取得法。
【請求項２】
工程（３）におけるアミノ酸がγ−アミノ酪酸である、請求項１に記載の取得法。
【請求項３】
工程（３）におけるアミノ酸が、γ−アミノ酪酸に加えて、更に、β−アラニン、オルニチン及びアルギニンである、請求項２に記載の取得法。
【請求項４】
工程（２）において、炭素イオンビームを照射線量１００−５００Ｇｙの範囲で照射する、請求項１から３のいずれかに記載の取得法。
【請求項５】
耐塩性が高く、かつ、アルコールまたはアミノ酸の生産能が親株に比べて高く、更に、生育能が親株に比べて高い、Ｚ．ルキシーに属する酵母の変異株。
【請求項６】
アミノ酸がγ−アミノ酪酸である、請求項５に記載の変異株。
【請求項７】
アミノ酸が、γ−アミノ酪酸に加えて、更に、β−アラニン、オルニチン及びアルギニンである、請求項６に記載の変異株。
【請求項８】
請求項１から４のいずれかの取得法によって得られる、請求項５から７のいずれかに記載の変異株。
【請求項９】
受領番号が「ＮＩＴＥ ＡＰ−８２１」又は「ＮＩＴＥ ＡＰ−８２０」である、請求項５から８に記載の変異株。
【請求項１０】
請求項５から９のいずれかに記載の変異株を用いて醸造した醸造食品。
【請求項１１】
醸造食品が、含塩食品である、請求項１０に記載の醸造食品。
【請求項１２】
含塩食品が味噌又は醤油である、請求項１１に記載の醸造食品。
【請求項１】
ジゴサッカロミセス・ルキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）（Ｚ．ルキシー）に属する酵母の変異株を取得する方法において、
（１）Ｚ．ルキシーに属する酵母に炭素イオンビームを照射し、変異を誘発する工程、
（２）炭素イオンビーム照射後の酵母から、シクロヘキシミド耐性を有する株をスクリーニングする工程、
（３）当該スクリーニングされた株より、アルコールまたはアミノ酸の生産能が親株に比べて高い変異株を選抜する工程、
を含む、変異株の取得法。
【請求項２】
工程（３）におけるアミノ酸がγ−アミノ酪酸である、請求項１に記載の取得法。
【請求項３】
工程（３）におけるアミノ酸が、γ−アミノ酪酸に加えて、更に、β−アラニン、オルニチン及びアルギニンである、請求項２に記載の取得法。
【請求項４】
工程（２）において、炭素イオンビームを照射線量１００−５００Ｇｙの範囲で照射する、請求項１から３のいずれかに記載の取得法。
【請求項５】
耐塩性が高く、かつ、アルコールまたはアミノ酸の生産能が親株に比べて高く、更に、生育能が親株に比べて高い、Ｚ．ルキシーに属する酵母の変異株。
【請求項６】
アミノ酸がγ−アミノ酪酸である、請求項５に記載の変異株。
【請求項７】
アミノ酸が、γ−アミノ酪酸に加えて、更に、β−アラニン、オルニチン及びアルギニンである、請求項６に記載の変異株。
【請求項８】
請求項１から４のいずれかの取得法によって得られる、請求項５から７のいずれかに記載の変異株。
【請求項９】
受領番号が「ＮＩＴＥ ＡＰ−８２１」又は「ＮＩＴＥ ＡＰ−８２０」である、請求項５から８に記載の変異株。
【請求項１０】
請求項５から９のいずれかに記載の変異株を用いて醸造した醸造食品。
【請求項１１】
醸造食品が、含塩食品である、請求項１０に記載の醸造食品。
【請求項１２】
含塩食品が味噌又は醤油である、請求項１１に記載の醸造食品。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−７８３３１（Ｐ２０１１−７８３３１Ａ）
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３１４４３（Ｐ２００９−２３１４４３）
【出願日】平成２１年１０月５日（２００９．１０．５）
【出願人】（０００００６７７０）ヤマサ醤油株式会社 (56)
【出願人】（５０５３７４７８３）独立行政法人 日本原子力研究開発機構 (727)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月５日（２００９．１０．５）
【出願人】（０００００６７７０）ヤマサ醤油株式会社 (56)
【出願人】（５０５３７４７８３）独立行政法人 日本原子力研究開発機構 (727)
【Ｆターム（参考）】
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