糖尿病発症を予防または遅延させるためのゾヌリンのペプチドアンタゴニストの使用方法
【課題】ゾヌリンのペプチドアンタゴニストを用いて糖尿病発症を予防または遅延させる方法を提供すること。
【解決手段】糖尿病発症を予防または遅延させる方法であって、該方法は、糖尿病発症を予防または遅延させる必要のある被験体に、薬学的に有効量のゾヌリンのペプチドアンタゴニストを投与する工程を包含し、ここで該ペプチドアンタゴニストは、閉鎖帯毒素レセプターに結合するが、哺乳動物の接着結合の開きを薬学的に修飾しない、方法。
【解決手段】糖尿病発症を予防または遅延させる方法であって、該方法は、糖尿病発症を予防または遅延させる必要のある被験体に、薬学的に有効量のゾヌリンのペプチドアンタゴニストを投与する工程を包含し、ここで該ペプチドアンタゴニストは、閉鎖帯毒素レセプターに結合するが、哺乳動物の接着結合の開きを薬学的に修飾しない、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の開発は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｙｌａｎｄ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）によってサポートされた。本明細書中に記載される発明は、国立衛生研究所からの資金提供によってサポートされた（ＤＫ ４８３７３−０５）。合衆国政府は一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、糖尿病（特に、Ｉ型糖尿病）の発症を予防するかまたは遅らせるための、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストの使用に関する。ペプチドアンタゴニストは、ｚｏｎｕｌａ ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ毒素レセプターに対して結合するが、それにもかかわらず、哺乳動物の固い結合を開くことを生理学的には調節しない。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
（Ｉ．腸管の固い結合部の機能およびその調節）
腸管の上皮は、外部の環境と内部の環境との間に最も大きな界面（２，０００，０００ｃｍ２より多い）を示す。細胞内での固い結合（「ｔｊ」）能力の維持は、可能性のある有害な環境因子（例えば、細菌、ウイルス、毒素、食物アレルギー、および腸管のバリアを通過するマクロ分子）の移動を妨げる。この能力は、胃腸管に影響を与える種々の臨床的な状態（食物アレルギー、腸管の感染、吸収不良症候群、および炎症性の腸疾患を含む）において有意に危険に曝される。
【０００４】
ｔｊまたはｚｏｎｕｌａ ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ（本明細書中では以後、「ＺＯ」）は、上皮の吸収および分泌の特徴の１つである（Ｍａｄａｒａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８３：１０８９−１０９４（１９８９）；およびＭａｄａｒａ、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ Ｄｉａｒｒｈｅａ、Ｌｅｂｅｎｔｈａｌら編、第１１章、１２５−１３８頁（１９９０））。先端部分の区画と基底側の区画との間のバリアとして、これらは、細胞近辺の（ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）経路を通じるイオンおよび水可溶性の溶質の受動的な拡散を選択的に調節する（Ｇｕｍｂｉｎｅｒ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２５３（Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２）：Ｃ７４９−７５８（１９８７））。このバリアは、細胞を通過する通路に関係している経路の活性によって作成される任意の勾配を維持する（Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｔ，２０：１０−１８（１９７７））。
【０００５】
上皮を通過する導電率におけるバリエーションは、通常は、細胞近辺の経路の透過性における変化が原因にあると考えられ得る。なぜなら、腸内細胞（ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ）の血漿膜の抵抗が、比較的高いからである（Ｍａｄａｒａ（１９８９，１９９０）、前出）。ＺＯは、この細胞近辺の経路において主用なバリアを示し、そして上皮組織の電気的な抵抗は、凍結割断の電子顕微鏡写真によって観察されるように、膜貫通タンパク質の鎖の数、およびＺＯにおけるそれらの複合性に依存するようである（Ｍａｄａｒａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０１：２１２４−２１３３（１９８５））。
【０００６】
ＺＯは、静力学的な構造として一旦認識されると、実際には、種々の発達の環境に（Ｍａｇｎｕｓｏｎら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，６７：２１４−２２４（１９７８）；Ｒｅｖｅｌら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，４０：４４３−４５５（１９７６）；およびＳｃｈｎｅｅｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，３２：３０７−３２４（１９７８））、生理学的な環境に（Ｇｉｌｕｌａら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，５０：１４２−１６８（１９７６）；Ｍａｄａｒａら、Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１００：１４９−１６４（１９８７）；Ｍａｚａｒｉｅｇｏｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，９８：１８６５−１８７７（１９８４）；およびＳａｒｄｅｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，８０：９６−１１７（１９７９））、そして病理学的な環境に（Ｍｉｌｋｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０３：２７２９−２７３８（１９８６）；Ｎａｓｈら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５９：５３１−５３７（１９８８）；およびＳｈａｓｂｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２５５（Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２４：Ｃ７８１−Ｃ７８８（１９８８））、動的にそして容易に適合するという、豊富な証拠が存在する。この適合の根底にある調節機構は、なお完全には理解されていない。しかし、Ｃａ２＋の存在下では、ＺＯのアセンブリは、最終的にＺＯエレメントの組織化されたネットワークの形成および調節を導く生化学的な事象の複雑なカスケードを誘発する細胞性の相互作用の結果であることが明らかである。ＺＯエレメントの組織化されたネットワークの組成は、部分的に特徴付けられているのみである（Ｄｉａｍｏｎｄ、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｔ，２０：１０−１８（１９７７））。膜貫通タンパク質の鎖の候補であるｏｃｃｌｕｄｅｎが、最近、同定されている（Ｆｕｒｕｓｅら、Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，８７：１４１−１５０（１９８５））。
【０００７】
膜の接触の基礎を形成する細胞質の偽膜性のプラーク中で６個のタンパク質が同定されているが、これらの機能は確立されている状態のままである（Ｄｉａｍｏｎｄ、前出）。ＺＯ−１およびＺＯ−２は、特徴付けられていない１３０ｋＤのタンパク質（ＺＯ−３）との分解安定性の複合体中でヘテロニ量体として存在する（Ｇｕｍｂｉｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：３４６０−３４６４（１９９１））。ほとんどの免疫電子顕微鏡による研究によって、ＺＯ−１は正確に膜の接触の下に局在化された（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８３：１２９−１４５（１９８８））。２つの他のタンパク質である、シングリン（ｃｉｎｇｕｌｉｎ（Ｃｉｔｉら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３３３：２７２−２７５（１９８８））および７Ｈ６抗原（Ｚｈｏｎｇら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２０：４７７−４８３（１９９３））は、さらに、膜から局在化され、そしてまだクローン化されていない。Ｒａｂ １３は小さいＧＴＰ結合タンパク質であり、これはまた、最近、結合領域に局在化されている（Ｚａｈｒａｏｕｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２４：１０１−１１５（１９９４））。他の小さいＧＴＰ結合タンパク質は、皮質性の細胞骨格を調節することが公知であり、すなわち、ｒｈｏは、局所的な接触においてアクチン−膜の接着を調節し（Ｒｉｄｌｅｙら、Ｃｅｌｌ ７０：３８９−３９９（１９９２））、そしてｒａｃは、成長因子によって誘導される膜の波打ち運動を調節する（Ｒｉｄｌｅｙら、Ｃｅｌｌ ７０：４０１−４１０（１９９２））。良好に特徴付けられた細胞の結合部、局所的な接触（Ｇｕａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５８：６９０−６９２（１９９２））、および接着結合部位（Ｔｓｕｋｉｔａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２３：１０４９−１０５３（１９９３））におけるプラークタンパク質の公知の機能との類似性に基づいて、ｔｊに関係しているプラークタンパク質は、細胞膜の両方の方向の通過、および皮質性のアクチンの細胞骨格に対する連結を調節することにおいて、シグナルを伝達することに関係していると仮定されている。
【０００８】
上皮が供される多くの多様な生理学的および病理学的なチャレンジを受けるためには、ＺＯは、複雑な調節システムの存在を必要とする迅速でありそして調整された応答をし得なければならない。ＺＯの組立ておよび調節に関係している機構の正確な特徴付けは、現在活発に研究が行われている分野である。
【０００９】
ｔｊの構造および機能的な連関が、アクチンの細胞骨格と、吸収性の細胞のｔｊ複合体との間に存在することの証拠の物体が、現在存在する（Ｇｕｍｂｉｎｅｒら、前出；Ｍａｄａｒａら、前出；およびＤｒｅｎｃｈａｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０７：１０３７−１０４８（１９８８））。アクチンの細胞骨格は、その正確な幾何学的配置が、アクチン結合タンパク質の大きな骨子によって調節される、微小繊維の複雑なネットワークから構成される。アクチン結合タンパク質のリン酸化の状態が、細胞の血漿膜に対する細胞骨格の連結を調節する方法の一例は、ミリストイル化されたアラニンを多く含むＣキナーゼ基質（本明細書中では以後、「ＭＡＲＣＫＳ」）である。ＭＡＲＣＫＳは、血漿膜の細胞質表面に会合している特異的なプロテインキナーゼＣ（本明細書中では、以後「ＰＫＣ」）基質である（Ａｄｅｒｅｍ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｓｃｉ．Ｐｕｂ．（ＵＫ）、４３８−４４３頁（１９９２））。その非リン酸化形態においては、ＭＡＲＣＫＳは、膜のアクチンを架橋する。従って、ＭＡＲＣＫＳを通じて膜と会合しているアクチンのネットワークは、比較的固いようである（Ｈａｒｔｗｉｇら、Ｎａｔｕｒｅ，３５６：６１８−６２２（１９９２））。活性化されたＰＫＣは、膜から放出されたＭＡＲＣＫＳをリン酸化する（Ｒｏｓｅｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７２：１２１１−１２１５（１９９０）；およびＴｈｅｌｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５１：３２０−３２２（１９９１））。ＭＡＲＣＫＳに連結されたアクチンは、膜から空間的に分離されるようであり、そしてより可塑性となる。ＭＡＲＣＫＳが脱リン酸化されると、これは、膜に戻され、ここでこれは再び、アクチンを架橋する（Ｈａｒｔｗｉｇら、前出；およびＴｈｅｌｅｎら、前出）。これらのデータは、Ｆ−アクチンのネットワークが、アクチン結合タンパク質を含むＰＫＣ依存性のリン酸化プロセス（ＭＡＲＣＫＳはそのうちの１つである）によって再度配置され得ることを示唆する。
【００１０】
種々の細胞内媒介因子は、ｔｊの機能および／または構造を変更することが示されている。両生類の胆嚢（Ｄｕｆｆｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ，２０４：４５１−４５２（１９８１））、ならびに、金魚（Ｂａｋｋｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２４６：Ｇ２１３−Ｇ２１７（１９８４））およびヒラメ（Ｋｒａｓｎｅｙら、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．，４２：１１００（１９８３））の両方の腸管の固い結合は、細胞内のｃＡＭＰが増大した場合に、受動的なイオンの流れに対して増強させられた耐性を示す。また、Ｃａ２＋イオノフォアに対する両生類の胆嚢の暴露は、ｔｊ耐性を増強するようであり、そしてｔｊ構造における変更を誘導するようである（Ｐａｌａｎｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２４５：Ｃ２０３−２１２（１９８３））。さらに、ホルボールエステルによるＰＫＣの活性化は、腎臓（Ｅｌｌｉｓら、Ｃ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６３（Ｒｅｎａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３２）：Ｆ２９３−Ｆ３００（１９９２））、および腸管（Ｓｔｅｎｓｏｎら、Ｃ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６５（Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８）：Ｇ９５５−Ｇ９６２（１９９３））の上皮細胞株の両方において、細胞近辺の透過性を増大させる。
【００１１】
（ＩＩ．Ｚｏｎｕｌａ Ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ毒素）
コレラ毒素（ＣＴ）をコードするｃｔｘＡ遺伝子を欠失させることによって構築されたほとんどのＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅワクチンの候補は、高い抗体応答を誘発し得るが、ワクチンの半分より多くがなお穏やかな下痢を生じる（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５６（１）：１６１−１６７（１９８８））。ＣＴの非存在下で誘導される下痢の程度を考慮して、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅは、他の腸毒性の因子を生じると仮定された。これらはなお、ｃｔｘＡ配列が欠失させられた株中に存在する（Ｌｅｖｉｎｅら、前出）。結果として、第２の毒素であるｚｏｎｕｌａ ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ毒素（本明細書中以後「ＺＯＴ」）が、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅによって合成され、そしてこれは、残っている下痢に関係することが、発見された（Ｆａｓａｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８：５２４２−５２４６（１９９１））。ｚｏｔ遺伝子は、ｃｔｘ遺伝子にすぐ隣接して配置されている。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株の中での、ｚｏｔ遺伝子のｃｔｘ遺伝子との高い割合での共存（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，３１／３：７３２−７３３（１９９３）；およびＫａｒａｓａｗａら、ＦＥ
ＢＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１０６：１４３−１４６（１９９３））は、コレラの典型である急性の脱水状態となる下痢の原因における、ＺＯＴの共作用性の役割の可能性を示唆する。最近、ｚｏｔ遺伝子はまた、他の腸病原体においても同定されている（Ｔｓｃｈａｐｅ、２ｎｄ Ａｓｉａｎ−Ｐａｃｉｆｉｃ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｔｙｐｈｏｉｄ ｆｅｖｅｒ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌｏｓｉｓ，４７（Ａｂｓｔｒ．）（１９９４））。
【００１２】
ウサギの回腸の粘膜について試験した場合には、ＺＯＴが細胞内ｔｊの構造を調節することによって腸管の透過性を増大させることが、以前に見出されている（Ｆａｓａｎｏら、前出）。細胞近辺の経路の改変の結果として、腸管の粘膜がより透過性になることが見出されている。活性な輸送体に結合させられたＮａ＋−グルコースには影響を与えないＺＯＴが細胞毒性ではなく、そして上皮を通過する抵抗を完全に回避することはできないこともまた見出された（Ｆａｓａｎｏら、前出）。
【００１３】
より最近は、ＺＯＴが腸管の粘膜中で可逆的にｔｊを開き得ることが見出されている。従って、ＺＯＴは、（例えば、糖尿病の処置において、腸管への薬物送達のための経口投与量の組成物中で使用された場合に）治療薬（例えば、インシュリン）と同時に投与された場合には、治療薬の腸管への送達に影響を与ええることが見出された（第ＷＯ９６／３７１９６号；米国特許第５，８２７，５３４号；米国特許第５，６６５，３８９号；およびＦａｓａｎｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９９：１１５８−１１６４（１９９７）；これらのそれぞれは、本明細書中でそれらの全体において参考として援用されている）。ＺＯＴが鼻の粘膜中でｔｊを可逆的に開き得ることもまた見出されている。従って、ＺＯＴは、治療薬と同時に投与された場合には、治療薬の鼻での吸収を増強し得る（米国特許第５，９０８，８２５号；これは、その全体において本明細書中で参考として援用されている）。
【００１４】
米国特許第５，８６４，０１４号（これは、その全体おいて本明細書中で参考として援用されている）においては、ＺＯＴレセプターが同定されており、そして腸管の細胞株から精製されている（すなわち、ＣａＣｏ２細胞）。さらに、米国特許第５，９１２，３２３号（これは、その全体において本明細書中で参考として援用されている）においては、ヒトの腸管、心臓、および脳組織に由来するＺＯＴレセプターが同定されており、そして精製されている。ＺＯＴレセプターは、腸管および鼻の透過性の調節に関係している、細胞近辺の経路の最初の工程を示す。
【００１５】
（ＩＩＩ．ゾヌリン）
米国特許第５，９４５，５１０号および同第５，９４８，６２９号（これらは、それらの全体において本明細書中で参考として援用されている）においては、ＺＯＴに免疫学的および機能的に関係しており、そして哺乳動物の固い結合の生理学的な調節因子として作用する、哺乳動物のタンパク質が、同定されそして精製されている。「ゾヌリン（ｚｏｎｕｌｉｎ）」と呼ばれるこれらの哺乳動物のタンパク質は、腸管および鼻の粘膜のｔｊを通過する、そして血液の脳バリアのｔｊを通過する治療薬の吸収を増強するために有用である。
【００１６】
（ＩＶ．ゾヌリンのペプチドアンタゴニスト）
ゾヌリンのペプチドアンタゴニストは、１９９８年８月３日に出願された、米国特許出願番号第０９／１２７，８１５号（これは、その全体において本明細書中で参考として援用されており、これは、第ＷＯ００／０７６０９号に対応する）において最初に同定され、そして記載された。上記のペプチドアンタゴニストは、ＺＯＴレセプターに結合するが、しかし、哺乳動物の固い結合を開くことを生理学的に調節するようには機能しない。ペプチドアンタゴニストは、ＺＯＴおよびＺＯＴレセプターに対するゾヌリンの結合を競合的に阻害し、それによって哺乳動物の固い結合を開くことを生理学的に調節する、ＺＯＴおよびゾヌリンの能力を阻害する。
【００１７】
（Ｖ．糖尿病）
糖尿病に関係している罹患率および死亡率は、ひどい。米国の糖尿病の個体の総数は、１５７０万人である。これらのうちで、Ｉ型糖尿病の個体の１００％、およびＩＩ型糖尿病の個体の４０％が、インシュリンの定期的な投与に依存している。１年の基準で、糖尿病に伴う直接的な医薬品のコストは、４００億ドルを超える。さらに、１４０億ドルが、障害、失業、および早産児の死亡率に関係している。
【００１８】
経口によるインシュリン薬の送達のストラテジーが、多くの研究の努力の焦点となっているが、これらは、小腸の生理学的な性質が、インシュリンのようなマクロ分子の吸収を妨げるので、大きくは成功していない。
【００１９】
糖尿病の処置のために細胞近辺の経路へインシュリンの送達を標的化するためのＺＯＴを含有している経口投与量の組成物が、米国特許第５，８２７，５３４号および同第５，６６５，３８９号に記載されている。ＺＯＴを使用する細胞近辺の経路を生理学的に調節することによって、現在では、全身的な循環に種々の広範な治療薬を導入することが可能である。この薬物送達システムは、多くの経口の薬学的な試薬の設計を長い間制限していた、標的特異性を付加する。このシステムの有用性は、インシュリンの送達に限定されず、そして経口によって投与される薬学的な試薬の設計の新しい方法を示し得る。
【００２０】
糖尿病のような衰弱していく疾患についての革新的な処置ストラテジーが提供されつつあるが、疾患の発症を予防するかまたはそれを遅らせることが、広範囲に関係している。任意の疾患プロセスの病因を理解することは、困難な作業である。従って、糖尿病の発症を予防するかまたは遅らせる能力を有している薬学的な試薬の証拠は、以前には存在していない。本発明においては、新たな注目が、疾患の進行において重要かつ初期の工程が、細胞近辺の透過性における変更を残すことを実証することによって、糖尿病の病因、その発症の予防および遅延に注がれている。本発明においては、細胞近辺の透過性の増大が、糖尿病に進行するために必須であることが実証されている。この内因性の経路をブロックするゾヌリンのペプチドアンタゴニストは、糖尿病への進行を妨げることが、本発明において見出されている。従って、本発明は、糖尿病の長期間の合併症を予防するために有用であると考えられる。さらに自己免疫疾患に関係する透過性の変化は、長い間放置されており、そして本発明の初期の発明は、糖尿病患者に対して数えきれない利点を与えると考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
（発明の要旨）
本発明の１つの目的は、糖尿病の発症を予防するかまたは遅らせるための方法を提供することである。
【００２２】
本明細書中で以後に提供される発明の詳細な記載から明らかである本発明のこの目的および他の目的は、１つの実施態様においては、糖尿病（特に、Ｉ型糖尿病）の発症を予防するかまたは遅延させるための方法によって、達成されている。この方法は、このような発症の予防または遅延を必要としている被験体に対して、薬学的有効量のゾヌリンのペプチドアンタゴニストを投与する工程を包含する。ここでは、上記のペプチドアンタゴニストは、ＺＯＴレセプターに結合するが、哺乳動物の接着結合の孔を生理学的には調節しない。
例えば、本発明は、以下を提供する：
（項目１） 糖尿病発症を予防または遅延させる方法であって、該方法は、糖尿病発症を予防または遅延させる必要のある被験体に、薬学的に有効量のゾヌリンのペプチドアンタゴニストを投与する工程を包含し、ここで該ペプチドアンタゴニストは、閉鎖帯毒素レセプターに結合するが、哺乳動物の接着結合の開きを薬学的に修飾しない、方法。
（項目２） 項目１に記載の方法であって、ここで前記ペプチドアンタゴニストが以下のアミノ酸配列：
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４
を含む、方法。
（項目３） 項目１に記載の方法であって、ここで前記ペプチドアンタゴニストが８〜１１０個のアミノ酸の大きさである、方法。
（項目４） 項目３に記載の方法であって、ここで前記ペプチドアンタゴニストが８〜４０個のアミノ酸の大きさである、方法。
（項目５） 項目１に記載の方法であって、ここで前記ペプチドアンタゴニストが配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む、方法。
（項目６） 項目１に記載の方法であって、ここで前記ペプチドアンタゴニストが配列番号１５に記載のアミノ酸配列から成る、方法。
（項目７） 項目１に記載の方法であって、ここで前記糖尿病が、Ｉ型糖尿病である、方法。
（項目８） 項目１に記載の方法であって、ここで前記ペプチドアンタゴニストが、腸管送達のためのの経口投与組成物として投与される、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、種々のヒト組織から精製されたゾヌリンのＮ末端の配列およびＺＯＴの生物学的に活性なフラグメントのＮ末端の配列（アミノ酸２８８〜３９９）を有するＩｇＭ重鎖のＮ末端配列との比較を示す。
【図２】図２は、Ｕｓｓｉｎｇチャンバー中に固定したウサギの回腸の組織抵抗性（Ｒｔ）に対する、ＺＯＴ、ゾヌリンｉ、ゾヌリンｈ（いずれも単独で（黒バー））またはペプチドアンタゴニストＦＺＩ／０と組合せて（白バー）、またはＦＺＩ／１と組合せて（影をつけたバー）の効果を、ネガティブコントロールと比較して示す。Ｎは、３〜５に等しく、そして＊は、ｐ＜０．０１に等しい。
【図３】図３は、糖尿病の傾向があるラットおよび糖尿病耐性のラットの両方における、管内のゾヌリン濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。これは、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定された。サンプルは、通常の生理食塩水中での腸管の洗浄によって得られた。それぞれの場合の最初のバーは、糖尿病耐性（ＤＲ）のラットを示す。第２のバーは、糖尿病の傾向がある（ＤＰ）動物を示し、そして第３のバーは、慢性的な糖尿病（ＣＤ）を有するラットを示す。糖尿病の傾向があるラットの＜９％は、糖尿病にはならず、そして糖尿病耐性のラットの＜９％が糖尿病を発症する。
【図４】図４は、本研究で使用したラットの糖尿病を発症した割合を示す。
【図５】図５は、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定された、糖尿病のラットにおける管内のゾヌリン濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【図６】図６は、糖尿病耐性（ＤＲ）のラット、Ｕｓｓｉｎｇチャンバー中で決定された糖尿病の傾向がある処置されていないラット（ＤＰ未処置；第２のバー）、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストで処置された糖尿病の傾向があるラット（ＤＰ処置；第３のバー）における、エキソビボでの腸管の透過性を示す。＊はｐ＜０．０５に等しい；＊＊はｐ＜０．０５に等しく、そしてＤＰで処置されたものと比較される場合にはｐ＜０．０００１に等しい。
【図７】図７は、糖尿病を発症したかまたは糖尿病を発症しなかったかのいずれかである、糖尿病の傾向がある未処置のラットの小腸の中の、エキソビボでの腸管の透過性を示す。＊はｐ＜０．０４に等しい。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
上記で議論されているように、１つの実施態様においては、本発明の上記の目的は、糖尿病（特に、Ｉ型糖尿病）の発症を予防するかまたは遅延させるための方法によって達成されている。この方法は、そのような発症の予防または遅延を必要としている被験体に対して、薬学的に有効量のゾヌリンのペプチドアンタゴニストを投与する工程を包含する。ここでは、上記のペプチドアンタゴニストは、ＺＯＴレセプターに結合するが、しかし、哺乳動物の接着結合の孔を生理学的には調節しない。
【００２５】
本発明において使用されるゾヌリンの特定のペプチドアンタゴニストは、ここでは重要ではない。上記のペプチドアンタゴニストの例として、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含有しているペプチドが挙げられる：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４。
【００２６】
ペプチドアンタゴニストの大きさは、本発明にとっては重要ではない。一般的には、ペプチドアンタゴニストの大きさは、８〜１１０アミノ酸まで、好ましくは、８〜４０アミノ酸の範囲であり、より好ましくは、８アミノ酸である。
【００２７】
このペプチドアンタゴニストは、Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｉｅｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｅｐａｒｅｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｍａｎｔら編、Ｃ．Ｒ．Ｃ．Ｐｒｅｓｓ（１９９１）に記載されているような周知の技術、およびペプチド合成装置（例えば、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ））を使用して、または組換えＤＮＡ技術を使用することによって（すなわち、ここでは、ペプチドをコードするヌクレオチド配列が適切な発現ベクター（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母の発現ベクター）中に挿入され、それぞれの宿主細胞中で発現され、そして周知の技術を使用してそれらから精製される）化学的に合成され、かつ精製され得る。
【００２８】
ペプチドアンタゴニストは、小腸への送達のための経口投与組成物として投与され得る。このような、小腸への送達のための経口投与組成物は当該分野で周知であり、そして一般的には、胃腸管耐性の錠剤またはカプセル剤を含む（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版、Ｏｓｏｌ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，第８９章（１９８０）；Ｄｉｇｅｎｉｓら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８３：９１５−９２１（１９９４）；Ｖａｎｔｉｎｉら、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｔｅｒａｐｅｕｔｉｃａ，１４５：４４５−４５１（１９９３）；Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４０：１９０２−１９０５（１９９２）；Ｔｈｏｍａら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，４６：３３１−３３６（１９９１）；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，７：３０９−３１９（１９９１）；およびＬｉｎら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓ．，８：９１９−９２４（１９９１）；これらは各々、これら全体が本明細書中で参考として援用される）。
【００２９】
錠剤は、例えば、セルロース酢酸フタレートまたはセルロース酢酸テレフタレートのいずれかの添加によって、胃腸管耐性にされる。
【００３０】
カプセルは、ペプチドアンタゴニスト（単数または複数）が、固いかまたは軟らかい、可溶性のゼラチンの容器または殻のいずれかの中に封入された、固体の投与量形態である。カプセルの製造で使用されるゼラチンは、加水分解によってコラーゲン様の材料から得られる。２つのタイプのゼラチンが存在する。タイプＡは、酸処理によってブタの皮膚から誘導され、そしてタイプＢは、アルカリ処理によって骨および動物の皮膚から得られる。固いゼラチンカプセルの使用によって、単一のペプチドアンタゴニストまたは、個々の被験体について最良と考えられる厳密な投与量レベルでそれらの組合せを処方することにおける選択を可能にする。固いゼラチンのカプセルは、２つの部分から構成される。一方が他方の中に滑り込み、それによってペプチドアンタゴニストを完全に取り囲む。これらのカプセルは、カプセルのより長いほうの端部にペプチドアンタゴニストまたはペプチドアンタゴニストを含有している胃腸管耐性のビーズを導入することによって充填され、そして次いで、キャップに滑り込ませる。固いゼラチンのカプセルは、ゼラチン、ＦＤ＆Ｃ着色料、およびしばしば、乳白剤（例えば、ニ酸化チタン）から大部分が作製される。ＵＳＰは、製造の間の分解を防ぐという目的のために、ゼラチンが０．１５％（ｗ／ｖ）のニ酸化イオウを含有することを認可している。
【００３１】
本発明の状況においては、小腸への送達のための経口投与組成物はまた、ペプチドアンタゴニストが、胃の中の胃液によって有意に不活化されるのを妨ぐ水性の緩衝剤を含む液体の組成物を含み、それによってペプチドアンタゴニストが活性な形態で小腸に到達することを可能にする。本発明において使用され得るこのような水性の緩衝剤の例として、重炭酸塩緩衝液（ｐＨ ５．５から８．７、好ましくは、約ｐＨ ７．４）が挙げられる。
【００３２】
経口投与組成物が液体組成物である場合には、安定性の問題を最少にするために、組成物が投与の直前に調製されることが好ましい。この場合には、液体の組成物は、水性の緩衝剤中で凍結乾燥されたペプチドアンタゴニストを溶解させることによって調製され得る。
【００３３】
使用されるペプチドアンタゴニストの薬学的有効量は、本発明にとっては重要ではなく、そして処置される被験体の年齢、体重および性別に依存して変化する。一般的には、糖尿病の発送を妨げるかまたは遅延させるために本発明において使用されるペプチドアンタゴニストの量は、約７．５×１０−６Ｍから７．５×１０−３Ｍの範囲、好ましくは、約７．５×１０−６Ｍから７．５×１０−４Ｍの範囲である。このような最終濃度を、例えば、腸管または血液中で達成するためには、本発明の単一の経口投与組成物中のペプチドアンタゴニストの量は、一般的には、約１．０μｇ〜１０００μｇ、好ましくは、約１．０μｇ〜１００μｇである。
【００３４】
以下の実施例は、例示的目的のためのみに提供され、そしていかなる場合においても本発明の範囲を限定するようには意図されない。
【実施例】
【００３５】
（実施例１）
（ゾヌリンのペプチドアンタゴニスト）
ＺＯＴ（ヒトの腸管のゾヌリン（ゾヌリンｉ）およびヒトの心臓のゾヌリン（ゾヌリンｈ）は全て腸管（Ｆａｓａｎｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１１２：８３９（１９９７）；Ｆａｓａｎｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６：７１０（１９９５））および内皮のｔｊに対して作用し、そして３個全てが、腸管内でのＺＯＴレセプターの分布と一致する（Ｆａｓａｎｏら（１９９７）前出；およびＦａｓａｎｏら（１９９５）前出））同様の局所的な効果を有する（Ｆａｓａｎｏら（１９９７）前出）ので、１９９８年８月３日に出願された米国特許出願番号第０９／１２７，８１５号においては、これらの３個分子は、同じレセプター結合部位と相互作用すると仮定された。従って、腸管のｔｊの調節に関係するレセプター−リガンド相互作用の絶対的な構造要件に関する知見を提供するために、ＺＯＴおよびヒトのゾヌリンの一次アミノ酸構造の比較を、本明細書中で行った。これらの分子のＮ末端の分析によって、以下の共通のモチーフ（図１中で四角で囲んだアミノ酸残基８〜１５）を明らかにした：非極性（腸管についてはＧｌｙ、脳についてはＶａｌ）、可変、非極性、可変、非極性、極性、可変、極性（Ｇｌｙ）。８位のＧｌｙ、１２位のＶａｌ、および１３位のＧｌｎは、全て、ＺＯＴ、ゾヌリンｉ、およびゾヌリンｈにおいて高度に保存されている（図１を参照のこと）。これは、腸管内でのレセプター結合機能について重要であると考えられる。これらを確認するために、合成の８ペプチドである、Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ（配列番号１５）（ＦＺＩ／０と命名し、そしてヒトの胎児のゾヌリンｉのアミノ酸残基８〜１５に対応している）を化学的に合成した。
【００３６】
次に、上記のようにＵｓｓｉｎｇチャンバー中に固定したウサギの回腸を、１００μｇのＦＺＩ／０（配列番号１５）、１００μｇのＦＺＩ／１（配列番号２９）、１．０μｇの６×Ｈｉｓ−ＺＯＴ（１９９８年８月３日に出願された、米国特許出願番号第０９／１２７，８１５号の実施例１に記載されているように得た）、１．０μｇのゾヌリンｉ（１９９８年８月３日に出願された、米国特許出願番号第０９／１２７，８１５号の実施例３に記載されているように得た）、または１．０μｇのゾヌリンｈ（１９９８年８月３日に出願された、米国特許出願番号第０９／１２７，８１５号の実施例３に記載されているように得た）の単独で暴露したか；あるいは、１００μｇのＦＺＩ／０またはＦＺＩ／１に２０分間予め暴露し、その時点で、１．０μｇの６×Ｈｉｓ−ＺＯＴ、１．０μｇのゾヌリンｉ、または１．０μｇのゾヌリンｈを添加した。次いで、ΔＲｔを、上記ように算出した。結果を、図２に示す。
【００３７】
図２に示すように、ＦＺＩ／０は、Ｒｔにおいてはいかなる有意な変化をも誘導しなかった（ネガティブコントロールと比較して、０．５％）（黒バーを参照のこと）。対照的に、ＺＦＩ／０での２０分間の予備処理は、Ｒｔに対するＺＯＴ、ゾヌリンｉ、およびゾヌリンｈの効果を、それぞれ、７５％、９７％、および１００％減少させた（白バーを参照のこと）。また図２に示されるように、この阻害効果は、８位のＧｌｙ、１２位のＶａｌ、および１３位のＧｌｙ（ゾヌリンに対して言及されるような）をゾヌリンｂの対応するアミノ酸残基（それぞれ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、およびＡｒｇ、配列番号３０を参照のこと）で変更することによって化学的に合成された第二の合成ペプチド（ＦＺＩ／配列番号２９）が使用される場合には、完全に除去された（影をつけたバーを参照のこと）。
【００３８】
上記の結果は、ＺＯＴのＮ末端の残基８〜１５間にわたる領域および標的レセプターに結合のために重要なゾヌリンのファミリーでが存在すること、および８位、１２位、および１３位のアミノ酸残基がこの結合の組織特異性を決定することを実証する。
【００３９】
（実施例２）
（糖尿病のラットのモデル）
腸管の透過性における変化は、糖尿病の発症に関係している事前の生理学的な変化の１つであることが示されている（Ｍｅｄｄｉｎｇｓ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７６：Ｇ９５１−９５７（１９９９））。傍細胞輸送の輸送および腸管の透過性は、完全には解明されていない機構を通じて細胞内ｔｊによって調節される。
【００４０】
ゾヌリンおよびその原核生物のアナログであるＺＯＴは両方とも、ｔｊを調節することによって腸管の透過性を変更する。この実施例においては、最初に、ｔｊのゾヌリンに関係している障害が、糖尿病の病因に関係していること、およびゾヌリンのペプチドアンタゴニストの投与によって糖尿病が予防され得るかまたは発症が遅延され得ることが、実証されている。
【００４１】
最初に、２つの遺伝的な交配品種（すなわち、ＢＢ／Ｗｏｒ糖尿病の傾向がある（ＤＰ）ラットおよび糖尿病耐性の（ＤＲ）ラット（Ｈａｂｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９５：８３２−８３７（１９９３））を、それらがゾヌリンの管内分泌および腸管の透過性に有意な変化を示すかどうかを決定するために評価した。
【００４２】
より詳細には、年齢が適合するＤＰおよびＤＲラット（２０、５０、７５、および＞１００日齢）を屠殺した。ラットを屠殺した後、２５Ｇの針を回腸の内腔に配置し、そしてＲｉｎｇｅｒの溶液を用いて腸管の洗浄を行って、管内のゾヌリンの存在を決定した。ゾヌリンの濃度を、以下のようなサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して評価した：
プラスチックのマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を、ポリクローナルウサギ抗ＺＯＴ抗体（１９９８年８月３日に出願された、米国特許出願番号第０９／１２７，８１５号の実施例２に記載されているように得た）（１：１００希釈）を用いて４℃で一晩コーティングし、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０を含有しているＰＢＳで３回洗浄し、次いで、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０を含有している３００μｌのＰＢＳを用いて、室温で１５分間のインキュベーションすることによってブロックした。次に、精製したヒトの腸管のゾヌリン（１９９８年８月３日に出願された、米国特許出願番号第０９／１２７，８１５号の実施例３に記載されているように得た）を、プレート上にコーティングした。
【００４３】
標準曲線を、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有しているＰＢＳ中で、以下の種々の濃度でゾヌリンを稀釈することによって得た：０．７８ｎｇ／ｍｌ、１．５６ｎｇ／ｍｌ、３．１２５ｎｇ／ｍｌ、６．２５ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、および５０ｎｇ／ｍｌ。
【００４４】
１００μｌのそれぞれの標準濃度または１００μｌの腸管の洗浄サンプルをウェル中にピペッティングし、そしてプレート振盪装置を使用して室温で１時間インキュベートした。結合していないゾヌリンをＰＢＳを使用して洗浄し、そしてウェルを、振盪させながら室温で１時間の間アルカリホスフェートと結合させた１００μｌの抗ＺＯＴ抗体とともにインキュベートした。結合していない結合体を、ＰＢＳを用いて洗い流し、そして、最初に、１／２００００に稀釈した１００μｌのＥｘｔｒａ−Ａｖｉｄｉｎ（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２、１．０％（ｗ／ｖ）のＢＳＡに、１５分間かけて添加し、そして次いで、１．０ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート基質（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有している１００μｌの溶液とともに３７℃で３０分間、それぞれのウェルをインキュベートすることによって、着色反応を起こさせた。吸光度を、４０５ｎｍでの酵素免疫アッセイリーダー上で読み取った。
【００４５】
ＥＬＩＳＡ−サンドイッチ方法のアッセイ内およびアッセイ間での精度を評価するために、係数偏差（ＣＶ）を、連続３日間、種々の濃度のゾヌリンを用いて２つのサンプルに由来する３個の複製物を使用して計算した。ＥＬＩＳＡ−サンドイッチ方法のアッセイ内試験によって、９．８％のＣＶ値を得た。アッセイ間試験のＣＶは、１日目は４．２％、２日目は３．３％、そして３日目は２．９％であった。
【００４６】
ゾヌリンの濃度を、腸管の洗浄液中で検出したｎｇ／ｍｇのタンパク質として表現し、そして暴露された表面積（ｍｍ２で）によって較正した。結果を図３に示す。
【００４７】
図３に示すように、管腔内のゾヌリンの４倍の増大を、最初に、糖尿病の傾向にあるラット（５０日齢）において観察した（第２番目の棒）。この管腔内のゾヌリンの増大は、腸管の透過性における増大と相関していることを見出した。管腔内のゾヌリンの増大は、これらの糖尿病の傾向にあるラットにおいては高いままであり、そして完全に発症した（ｂｌｏｗｎ）糖尿病への進行と相関することを見出した。注：糖尿病の傾向のあるラット（＞１００日齢）は、管腔内のゾヌリンの増大はなかった。これは、驚くべきである。なぜなら、このラットは、糖尿病に進行しなかったからである。このラットについての血液グルコースは正常であった。従って、ゾヌリンは、Ｉ型糖尿病の病因に関係している透過性の変化の原因である。ゾヌリンの分泌の増大は年齢に関係し、そして糖尿病の発症を進行させる。
【００４８】
次に、糖尿病がゾヌリンのペプチドアンタゴニストの投与によって予防され得るかどうかを決定するために、ＢＢ／Ｗｏｒラット（２１〜２６日齢）を、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｏｄｅｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｕｔｌａｎｄ，ＭＡ）から入手し、そして２つのグループ（すなわち、処置したグループおよびコントロールのグループ）にランダマイズした（１つのグループあたりｎ＝５）。両方のグループを、ラットの固形飼料（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｂ Ｄｉｅｔ ＃７０１２）の標準的な食餌で維持した。全ての食物および水を、あらかじめオートクレーブした。毎日、一日の水の摂取量を測定し、そして１００ｍｌの新しい水を与えた。処置したグループには、飲料水中に補充した１０μｇ／ｍｌのゾヌリンのペプチドアンタゴニスト（配列番号１５）を受容させた。ラットを、ヘパフィルターケージの中に収容した。
【００４９】
ラットの糖尿病を、以下のように診断した：ラットを、１週間に２回秤量した。血液グルコールを、ＯｎｅＴｏｕｃｈ（登録商標）グルコースモニタリングシステム（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）を使用して１週間に１回決定した。毎週、尿検査のための試薬の小片を、グルコース（Ｄｉａｓｔｉｘ（登録商標））およびケトン（Ｋｅｔｏｓｉｔｘ（登録商標））（Ｂａｙｅｒ）をモニターするために使用した。＞２５０ｍｇ／ｄｌの血液グルコースを有するラットを一晩断食させ、そして＞２００ｍｇ／ｄｌの血液グルコースレベルを糖尿病と考えた。これらの指針は、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｏｄｅｌｓ，Ｉｎｃ．によって供給されたデータに従う。結果を、図４に示す。
【００５０】
図４に示すように、コントロールのラットの８０％（４／５）、そしてゾヌリンのペプチドアンタゴニストで処置したラットの４０％（２／５）が、８０日齢までに糖尿病を発症した。ゾヌリンの分泌における変化は、糖尿病の発症と平行していた。
【００５１】
糖尿病の臨床的な所見の後、ラットを以下のように屠殺した：ラットに、ケタミン麻酔を使用して麻酔し、そして中線切開を行って心臓に接触できるようにした。１８Ｇの針を、心臓の内部に配置し、そして全採血によって死を生じさせた。次いで、ゾヌリンアッセイを、上記に記載するように行った。糖尿病が存在しなかったこれらのラットについては、研究の終わりを８０日齢とした。Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｏｄｅｌ，Ｉｎｃ．，に従うと、糖尿病の傾向にあるラットのうちの８０％が、８０日齢までに糖尿病を有して存在した。ゾヌリンアッセイの結果を、図５に示す。
【００５２】
図５に示すように、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストで処置しなかった糖尿病のラットが、図３に示す結果と一致して、管腔内ゾヌリンの増大を有することを観察した。さらに、管腔内のゾヌリンは、糖尿病を発症しなかった糖尿病の傾向にあるラット（ＤＰ−処置）およびコントロールのラット（ＤＰ−未処置）の両方と比較して、糖尿病のラット（ＤＲ）において２から４倍増大した。糖尿病を発症しなかった糖尿病ではないコントロールラットは、無視できるレベルのゾヌリンを有し、これは、図３に示すゾヌリンのレベルと一致した。さらに、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストでの処置にもかかわらず糖尿病を発症した２匹の糖尿病の傾向にあるラットは、良好に処置されたラット、および未処置のコントロールのラットよりも有意に高い、管腔内ゾヌリンのレベルを示した。ゾヌリンのこのレベルは、糖尿病の進行に必須の透過性の変化を開始するために十分であるが、ＺＯＴ／ゾヌリンレセプターは、ペプチドアンタゴニストによって効率良くブロックされた。
【００５３】
また、糖尿病の臨床的な所見の後、屠殺したラットの腸管組織を、エキソビボでの透過性における変化を評価するために、Ｕｓｓｉｎｇチャンバー中に固定した。
【００５４】
より詳細には、空腸および回腸の切片を屠殺したラットから単離し、そして腸管の内容物をリンスして除いた。それぞれの腸管のセグメントの６個の切片を調製し、そしてＬｕｃｉｔｅ Ｕｓｓｉｎｇチャンバー（０．３３ｃｍ２の開口部）に固定し、電圧クランプ装置（ＥＶＣ ４０００；Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｒａｔｏｓａ、ＦＬ）に接続し、そして５３ｍＭのＮａＣｌ、５．０ｍＭのＫＣｌ、３０．５ｍＭのＮａ２ＳＯ４、３０．５ｍＭのマンニトール、１．６９ｍＭのＮａ２ＰＯ４、０．３ｍＭのＮａＨＰＯ４、１．２５ｍＭのＣａＣｌ２、１．１ｍＭのＭｇＣｌ２および２５ｍＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ ７．４）を含有している新しく調製した緩衝液に浸した。浸す溶液を、一定温度の循環ポンプに接続し、そして９５％のＯ２および５％のＣＯ２でガス処理した水のカバーをかけたレザーバーを用いて３７℃で維持した。電位差を測定し、そして短い循環電流および組織抵抗を、Ｆａｓａｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５２４２−５２４６（１９９１）に記載されているように計算した。結果を、図６〜７に示す。
【００５５】
エキソビボでのＵｓｓｉｎｇチャンバーの透過性の研究において実証され、そして図６に示すように、糖尿病に進行した全てのラットが、それらの腸管の透過性を増大させた。糖尿病耐性の（ＤＲ）ラットは、細胞付近の透過性のにおいて感知できる程度の変更は有さなかった（第１の棒）。未処置の糖尿病の傾向にあるラット（ＤＰ−未処置；第２の棒）は、空腸および回腸の細胞付近の透過性の有意な増大を有した。より重要なことは、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストで処置した糖尿病の傾向にあるラット（ＤＰ−処置；第３の棒）が、空腸に制限された小腸の細胞付近の透過性において有意な増大を有したことである。しかし、図６に示すように、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストでの予備処置は、遠位の回腸においてこれらの変化を妨害した。結果として、病因に関係する細胞付近の透過性における変更は、回腸に限定される。また、図６に示すように、結腸の透過性においては有意な変化は存在しなかった。これは、ゾヌリンレセプターの分布の局所的な分布と一致する。
【００５６】
これらの結果を、さらに、糖尿病を発症したラット（ＤＰ−Ｄ）または糖尿病を発症していないラット（ＤＰ−Ｎ）のいずれかである、未処置の糖尿病の傾向にあるラットの小腸中での、エキソビボでの腸管の透過性の比較によって確認した（図７）。回腸のＲｔにおいては、ＤＰ−ＤラットとＤＰ−Ｎラットとの間で有意な変化は観察されなかったが、ＤＰ−Ｎラットと比較して、ＤＰ−Ｄラットの回腸の粘膜の有意に低いＲｔが観察された（図７）。
【００５７】
従って、以下の結論を作成し得る：（１）ペプチドアンタゴニストは、糖尿病の発症のために必要とされる透過性の変化を効率良くブロックすることが可能であった；そして（２）ペプチドアンタゴニストで処置したこれらのラットにおいては、管腔内のゾヌリンのレベルは、糖尿病を発症していない処置したラットよりも３倍高い。糖尿病を発症した処置したラットのこの集団においては、ペプチドアンタゴニストの量は、糖尿病を予防するために必要な十分な数のＺＯＴ／ゾヌリンレセプターをブロックするためには十分ではない場合がある。
【００５８】
処置したラットの６０％は、糖尿病を発症しなかった。ラットのこの集団においては、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストは、糖尿病の発症に必要な腸管の透過性の増大を効率良く妨げた。図５に示すように、処置したラットは、未処置のコントロールに匹敵する管腔内ゾヌリンのレベルを有したが、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストの存在に起因して、小腸の全体的な透過性は、糖尿病の進行に必要な生理学的な変化を開始するために十分には変更されなかった。興味深いことに、図５に示すように、糖尿病を発症しなかった１匹のコントロールの動物は、無視できるゾヌリンのレベルを有し、このことはさらに、糖尿病の病因におけるゾヌリンの役割をサポートする。
【００５９】
従って、ＢＢ／Ｗｏｒラットにおける糖尿病の病因の初期の事象は、ゾヌリンによって媒介される腸管の細胞付近の透過性の変化を含む。さらに、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストの使用を用いたゾヌリンのシグナル伝達システムの阻害は、糖尿病の発症を妨げるか、または少なくとも一部遅延させる。
【００６０】
本発明は、詳細に、そしてその特異的な実施態様を参照して記載されているが、種々の変更および改変が、本発明の精神および範囲を逸脱することなくその中で行われ得ることが、当業者に明らかである。
【技術分野】
【０００１】
本発明の開発は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｙｌａｎｄ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）によってサポートされた。本明細書中に記載される発明は、国立衛生研究所からの資金提供によってサポートされた（ＤＫ ４８３７３−０５）。合衆国政府は一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、糖尿病（特に、Ｉ型糖尿病）の発症を予防するかまたは遅らせるための、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストの使用に関する。ペプチドアンタゴニストは、ｚｏｎｕｌａ ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ毒素レセプターに対して結合するが、それにもかかわらず、哺乳動物の固い結合を開くことを生理学的には調節しない。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
（Ｉ．腸管の固い結合部の機能およびその調節）
腸管の上皮は、外部の環境と内部の環境との間に最も大きな界面（２，０００，０００ｃｍ２より多い）を示す。細胞内での固い結合（「ｔｊ」）能力の維持は、可能性のある有害な環境因子（例えば、細菌、ウイルス、毒素、食物アレルギー、および腸管のバリアを通過するマクロ分子）の移動を妨げる。この能力は、胃腸管に影響を与える種々の臨床的な状態（食物アレルギー、腸管の感染、吸収不良症候群、および炎症性の腸疾患を含む）において有意に危険に曝される。
【０００４】
ｔｊまたはｚｏｎｕｌａ ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ（本明細書中では以後、「ＺＯ」）は、上皮の吸収および分泌の特徴の１つである（Ｍａｄａｒａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８３：１０８９−１０９４（１９８９）；およびＭａｄａｒａ、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ Ｄｉａｒｒｈｅａ、Ｌｅｂｅｎｔｈａｌら編、第１１章、１２５−１３８頁（１９９０））。先端部分の区画と基底側の区画との間のバリアとして、これらは、細胞近辺の（ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）経路を通じるイオンおよび水可溶性の溶質の受動的な拡散を選択的に調節する（Ｇｕｍｂｉｎｅｒ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２５３（Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２）：Ｃ７４９−７５８（１９８７））。このバリアは、細胞を通過する通路に関係している経路の活性によって作成される任意の勾配を維持する（Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｔ，２０：１０−１８（１９７７））。
【０００５】
上皮を通過する導電率におけるバリエーションは、通常は、細胞近辺の経路の透過性における変化が原因にあると考えられ得る。なぜなら、腸内細胞（ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ）の血漿膜の抵抗が、比較的高いからである（Ｍａｄａｒａ（１９８９，１９９０）、前出）。ＺＯは、この細胞近辺の経路において主用なバリアを示し、そして上皮組織の電気的な抵抗は、凍結割断の電子顕微鏡写真によって観察されるように、膜貫通タンパク質の鎖の数、およびＺＯにおけるそれらの複合性に依存するようである（Ｍａｄａｒａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０１：２１２４−２１３３（１９８５））。
【０００６】
ＺＯは、静力学的な構造として一旦認識されると、実際には、種々の発達の環境に（Ｍａｇｎｕｓｏｎら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，６７：２１４−２２４（１９７８）；Ｒｅｖｅｌら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，４０：４４３−４５５（１９７６）；およびＳｃｈｎｅｅｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，３２：３０７−３２４（１９７８））、生理学的な環境に（Ｇｉｌｕｌａら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，５０：１４２−１６８（１９７６）；Ｍａｄａｒａら、Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１００：１４９−１６４（１９８７）；Ｍａｚａｒｉｅｇｏｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，９８：１８６５−１８７７（１９８４）；およびＳａｒｄｅｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，８０：９６−１１７（１９７９））、そして病理学的な環境に（Ｍｉｌｋｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０３：２７２９−２７３８（１９８６）；Ｎａｓｈら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５９：５３１−５３７（１９８８）；およびＳｈａｓｂｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２５５（Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２４：Ｃ７８１−Ｃ７８８（１９８８））、動的にそして容易に適合するという、豊富な証拠が存在する。この適合の根底にある調節機構は、なお完全には理解されていない。しかし、Ｃａ２＋の存在下では、ＺＯのアセンブリは、最終的にＺＯエレメントの組織化されたネットワークの形成および調節を導く生化学的な事象の複雑なカスケードを誘発する細胞性の相互作用の結果であることが明らかである。ＺＯエレメントの組織化されたネットワークの組成は、部分的に特徴付けられているのみである（Ｄｉａｍｏｎｄ、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｔ，２０：１０−１８（１９７７））。膜貫通タンパク質の鎖の候補であるｏｃｃｌｕｄｅｎが、最近、同定されている（Ｆｕｒｕｓｅら、Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，８７：１４１−１５０（１９８５））。
【０００７】
膜の接触の基礎を形成する細胞質の偽膜性のプラーク中で６個のタンパク質が同定されているが、これらの機能は確立されている状態のままである（Ｄｉａｍｏｎｄ、前出）。ＺＯ−１およびＺＯ−２は、特徴付けられていない１３０ｋＤのタンパク質（ＺＯ−３）との分解安定性の複合体中でヘテロニ量体として存在する（Ｇｕｍｂｉｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：３４６０−３４６４（１９９１））。ほとんどの免疫電子顕微鏡による研究によって、ＺＯ−１は正確に膜の接触の下に局在化された（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８３：１２９−１４５（１９８８））。２つの他のタンパク質である、シングリン（ｃｉｎｇｕｌｉｎ（Ｃｉｔｉら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３３３：２７２−２７５（１９８８））および７Ｈ６抗原（Ｚｈｏｎｇら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２０：４７７−４８３（１９９３））は、さらに、膜から局在化され、そしてまだクローン化されていない。Ｒａｂ １３は小さいＧＴＰ結合タンパク質であり、これはまた、最近、結合領域に局在化されている（Ｚａｈｒａｏｕｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２４：１０１−１１５（１９９４））。他の小さいＧＴＰ結合タンパク質は、皮質性の細胞骨格を調節することが公知であり、すなわち、ｒｈｏは、局所的な接触においてアクチン−膜の接着を調節し（Ｒｉｄｌｅｙら、Ｃｅｌｌ ７０：３８９−３９９（１９９２））、そしてｒａｃは、成長因子によって誘導される膜の波打ち運動を調節する（Ｒｉｄｌｅｙら、Ｃｅｌｌ ７０：４０１−４１０（１９９２））。良好に特徴付けられた細胞の結合部、局所的な接触（Ｇｕａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５８：６９０−６９２（１９９２））、および接着結合部位（Ｔｓｕｋｉｔａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２３：１０４９−１０５３（１９９３））におけるプラークタンパク質の公知の機能との類似性に基づいて、ｔｊに関係しているプラークタンパク質は、細胞膜の両方の方向の通過、および皮質性のアクチンの細胞骨格に対する連結を調節することにおいて、シグナルを伝達することに関係していると仮定されている。
【０００８】
上皮が供される多くの多様な生理学的および病理学的なチャレンジを受けるためには、ＺＯは、複雑な調節システムの存在を必要とする迅速でありそして調整された応答をし得なければならない。ＺＯの組立ておよび調節に関係している機構の正確な特徴付けは、現在活発に研究が行われている分野である。
【０００９】
ｔｊの構造および機能的な連関が、アクチンの細胞骨格と、吸収性の細胞のｔｊ複合体との間に存在することの証拠の物体が、現在存在する（Ｇｕｍｂｉｎｅｒら、前出；Ｍａｄａｒａら、前出；およびＤｒｅｎｃｈａｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０７：１０３７−１０４８（１９８８））。アクチンの細胞骨格は、その正確な幾何学的配置が、アクチン結合タンパク質の大きな骨子によって調節される、微小繊維の複雑なネットワークから構成される。アクチン結合タンパク質のリン酸化の状態が、細胞の血漿膜に対する細胞骨格の連結を調節する方法の一例は、ミリストイル化されたアラニンを多く含むＣキナーゼ基質（本明細書中では以後、「ＭＡＲＣＫＳ」）である。ＭＡＲＣＫＳは、血漿膜の細胞質表面に会合している特異的なプロテインキナーゼＣ（本明細書中では、以後「ＰＫＣ」）基質である（Ａｄｅｒｅｍ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｓｃｉ．Ｐｕｂ．（ＵＫ）、４３８−４４３頁（１９９２））。その非リン酸化形態においては、ＭＡＲＣＫＳは、膜のアクチンを架橋する。従って、ＭＡＲＣＫＳを通じて膜と会合しているアクチンのネットワークは、比較的固いようである（Ｈａｒｔｗｉｇら、Ｎａｔｕｒｅ，３５６：６１８−６２２（１９９２））。活性化されたＰＫＣは、膜から放出されたＭＡＲＣＫＳをリン酸化する（Ｒｏｓｅｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７２：１２１１−１２１５（１９９０）；およびＴｈｅｌｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５１：３２０−３２２（１９９１））。ＭＡＲＣＫＳに連結されたアクチンは、膜から空間的に分離されるようであり、そしてより可塑性となる。ＭＡＲＣＫＳが脱リン酸化されると、これは、膜に戻され、ここでこれは再び、アクチンを架橋する（Ｈａｒｔｗｉｇら、前出；およびＴｈｅｌｅｎら、前出）。これらのデータは、Ｆ−アクチンのネットワークが、アクチン結合タンパク質を含むＰＫＣ依存性のリン酸化プロセス（ＭＡＲＣＫＳはそのうちの１つである）によって再度配置され得ることを示唆する。
【００１０】
種々の細胞内媒介因子は、ｔｊの機能および／または構造を変更することが示されている。両生類の胆嚢（Ｄｕｆｆｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ，２０４：４５１−４５２（１９８１））、ならびに、金魚（Ｂａｋｋｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２４６：Ｇ２１３−Ｇ２１７（１９８４））およびヒラメ（Ｋｒａｓｎｅｙら、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．，４２：１１００（１９８３））の両方の腸管の固い結合は、細胞内のｃＡＭＰが増大した場合に、受動的なイオンの流れに対して増強させられた耐性を示す。また、Ｃａ２＋イオノフォアに対する両生類の胆嚢の暴露は、ｔｊ耐性を増強するようであり、そしてｔｊ構造における変更を誘導するようである（Ｐａｌａｎｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２４５：Ｃ２０３−２１２（１９８３））。さらに、ホルボールエステルによるＰＫＣの活性化は、腎臓（Ｅｌｌｉｓら、Ｃ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６３（Ｒｅｎａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３２）：Ｆ２９３−Ｆ３００（１９９２））、および腸管（Ｓｔｅｎｓｏｎら、Ｃ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６５（Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８）：Ｇ９５５−Ｇ９６２（１９９３））の上皮細胞株の両方において、細胞近辺の透過性を増大させる。
【００１１】
（ＩＩ．Ｚｏｎｕｌａ Ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ毒素）
コレラ毒素（ＣＴ）をコードするｃｔｘＡ遺伝子を欠失させることによって構築されたほとんどのＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅワクチンの候補は、高い抗体応答を誘発し得るが、ワクチンの半分より多くがなお穏やかな下痢を生じる（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５６（１）：１６１−１６７（１９８８））。ＣＴの非存在下で誘導される下痢の程度を考慮して、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅは、他の腸毒性の因子を生じると仮定された。これらはなお、ｃｔｘＡ配列が欠失させられた株中に存在する（Ｌｅｖｉｎｅら、前出）。結果として、第２の毒素であるｚｏｎｕｌａ ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ毒素（本明細書中以後「ＺＯＴ」）が、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅによって合成され、そしてこれは、残っている下痢に関係することが、発見された（Ｆａｓａｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８：５２４２−５２４６（１９９１））。ｚｏｔ遺伝子は、ｃｔｘ遺伝子にすぐ隣接して配置されている。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株の中での、ｚｏｔ遺伝子のｃｔｘ遺伝子との高い割合での共存（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，３１／３：７３２−７３３（１９９３）；およびＫａｒａｓａｗａら、ＦＥ
ＢＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１０６：１４３−１４６（１９９３））は、コレラの典型である急性の脱水状態となる下痢の原因における、ＺＯＴの共作用性の役割の可能性を示唆する。最近、ｚｏｔ遺伝子はまた、他の腸病原体においても同定されている（Ｔｓｃｈａｐｅ、２ｎｄ Ａｓｉａｎ−Ｐａｃｉｆｉｃ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｔｙｐｈｏｉｄ ｆｅｖｅｒ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌｏｓｉｓ，４７（Ａｂｓｔｒ．）（１９９４））。
【００１２】
ウサギの回腸の粘膜について試験した場合には、ＺＯＴが細胞内ｔｊの構造を調節することによって腸管の透過性を増大させることが、以前に見出されている（Ｆａｓａｎｏら、前出）。細胞近辺の経路の改変の結果として、腸管の粘膜がより透過性になることが見出されている。活性な輸送体に結合させられたＮａ＋−グルコースには影響を与えないＺＯＴが細胞毒性ではなく、そして上皮を通過する抵抗を完全に回避することはできないこともまた見出された（Ｆａｓａｎｏら、前出）。
【００１３】
より最近は、ＺＯＴが腸管の粘膜中で可逆的にｔｊを開き得ることが見出されている。従って、ＺＯＴは、（例えば、糖尿病の処置において、腸管への薬物送達のための経口投与量の組成物中で使用された場合に）治療薬（例えば、インシュリン）と同時に投与された場合には、治療薬の腸管への送達に影響を与ええることが見出された（第ＷＯ９６／３７１９６号；米国特許第５，８２７，５３４号；米国特許第５，６６５，３８９号；およびＦａｓａｎｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９９：１１５８−１１６４（１９９７）；これらのそれぞれは、本明細書中でそれらの全体において参考として援用されている）。ＺＯＴが鼻の粘膜中でｔｊを可逆的に開き得ることもまた見出されている。従って、ＺＯＴは、治療薬と同時に投与された場合には、治療薬の鼻での吸収を増強し得る（米国特許第５，９０８，８２５号；これは、その全体において本明細書中で参考として援用されている）。
【００１４】
米国特許第５，８６４，０１４号（これは、その全体おいて本明細書中で参考として援用されている）においては、ＺＯＴレセプターが同定されており、そして腸管の細胞株から精製されている（すなわち、ＣａＣｏ２細胞）。さらに、米国特許第５，９１２，３２３号（これは、その全体において本明細書中で参考として援用されている）においては、ヒトの腸管、心臓、および脳組織に由来するＺＯＴレセプターが同定されており、そして精製されている。ＺＯＴレセプターは、腸管および鼻の透過性の調節に関係している、細胞近辺の経路の最初の工程を示す。
【００１５】
（ＩＩＩ．ゾヌリン）
米国特許第５，９４５，５１０号および同第５，９４８，６２９号（これらは、それらの全体において本明細書中で参考として援用されている）においては、ＺＯＴに免疫学的および機能的に関係しており、そして哺乳動物の固い結合の生理学的な調節因子として作用する、哺乳動物のタンパク質が、同定されそして精製されている。「ゾヌリン（ｚｏｎｕｌｉｎ）」と呼ばれるこれらの哺乳動物のタンパク質は、腸管および鼻の粘膜のｔｊを通過する、そして血液の脳バリアのｔｊを通過する治療薬の吸収を増強するために有用である。
【００１６】
（ＩＶ．ゾヌリンのペプチドアンタゴニスト）
ゾヌリンのペプチドアンタゴニストは、１９９８年８月３日に出願された、米国特許出願番号第０９／１２７，８１５号（これは、その全体において本明細書中で参考として援用されており、これは、第ＷＯ００／０７６０９号に対応する）において最初に同定され、そして記載された。上記のペプチドアンタゴニストは、ＺＯＴレセプターに結合するが、しかし、哺乳動物の固い結合を開くことを生理学的に調節するようには機能しない。ペプチドアンタゴニストは、ＺＯＴおよびＺＯＴレセプターに対するゾヌリンの結合を競合的に阻害し、それによって哺乳動物の固い結合を開くことを生理学的に調節する、ＺＯＴおよびゾヌリンの能力を阻害する。
【００１７】
（Ｖ．糖尿病）
糖尿病に関係している罹患率および死亡率は、ひどい。米国の糖尿病の個体の総数は、１５７０万人である。これらのうちで、Ｉ型糖尿病の個体の１００％、およびＩＩ型糖尿病の個体の４０％が、インシュリンの定期的な投与に依存している。１年の基準で、糖尿病に伴う直接的な医薬品のコストは、４００億ドルを超える。さらに、１４０億ドルが、障害、失業、および早産児の死亡率に関係している。
【００１８】
経口によるインシュリン薬の送達のストラテジーが、多くの研究の努力の焦点となっているが、これらは、小腸の生理学的な性質が、インシュリンのようなマクロ分子の吸収を妨げるので、大きくは成功していない。
【００１９】
糖尿病の処置のために細胞近辺の経路へインシュリンの送達を標的化するためのＺＯＴを含有している経口投与量の組成物が、米国特許第５，８２７，５３４号および同第５，６６５，３８９号に記載されている。ＺＯＴを使用する細胞近辺の経路を生理学的に調節することによって、現在では、全身的な循環に種々の広範な治療薬を導入することが可能である。この薬物送達システムは、多くの経口の薬学的な試薬の設計を長い間制限していた、標的特異性を付加する。このシステムの有用性は、インシュリンの送達に限定されず、そして経口によって投与される薬学的な試薬の設計の新しい方法を示し得る。
【００２０】
糖尿病のような衰弱していく疾患についての革新的な処置ストラテジーが提供されつつあるが、疾患の発症を予防するかまたはそれを遅らせることが、広範囲に関係している。任意の疾患プロセスの病因を理解することは、困難な作業である。従って、糖尿病の発症を予防するかまたは遅らせる能力を有している薬学的な試薬の証拠は、以前には存在していない。本発明においては、新たな注目が、疾患の進行において重要かつ初期の工程が、細胞近辺の透過性における変更を残すことを実証することによって、糖尿病の病因、その発症の予防および遅延に注がれている。本発明においては、細胞近辺の透過性の増大が、糖尿病に進行するために必須であることが実証されている。この内因性の経路をブロックするゾヌリンのペプチドアンタゴニストは、糖尿病への進行を妨げることが、本発明において見出されている。従って、本発明は、糖尿病の長期間の合併症を予防するために有用であると考えられる。さらに自己免疫疾患に関係する透過性の変化は、長い間放置されており、そして本発明の初期の発明は、糖尿病患者に対して数えきれない利点を与えると考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
（発明の要旨）
本発明の１つの目的は、糖尿病の発症を予防するかまたは遅らせるための方法を提供することである。
【００２２】
本明細書中で以後に提供される発明の詳細な記載から明らかである本発明のこの目的および他の目的は、１つの実施態様においては、糖尿病（特に、Ｉ型糖尿病）の発症を予防するかまたは遅延させるための方法によって、達成されている。この方法は、このような発症の予防または遅延を必要としている被験体に対して、薬学的有効量のゾヌリンのペプチドアンタゴニストを投与する工程を包含する。ここでは、上記のペプチドアンタゴニストは、ＺＯＴレセプターに結合するが、哺乳動物の接着結合の孔を生理学的には調節しない。
例えば、本発明は、以下を提供する：
（項目１） 糖尿病発症を予防または遅延させる方法であって、該方法は、糖尿病発症を予防または遅延させる必要のある被験体に、薬学的に有効量のゾヌリンのペプチドアンタゴニストを投与する工程を包含し、ここで該ペプチドアンタゴニストは、閉鎖帯毒素レセプターに結合するが、哺乳動物の接着結合の開きを薬学的に修飾しない、方法。
（項目２） 項目１に記載の方法であって、ここで前記ペプチドアンタゴニストが以下のアミノ酸配列：
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４
を含む、方法。
（項目３） 項目１に記載の方法であって、ここで前記ペプチドアンタゴニストが８〜１１０個のアミノ酸の大きさである、方法。
（項目４） 項目３に記載の方法であって、ここで前記ペプチドアンタゴニストが８〜４０個のアミノ酸の大きさである、方法。
（項目５） 項目１に記載の方法であって、ここで前記ペプチドアンタゴニストが配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む、方法。
（項目６） 項目１に記載の方法であって、ここで前記ペプチドアンタゴニストが配列番号１５に記載のアミノ酸配列から成る、方法。
（項目７） 項目１に記載の方法であって、ここで前記糖尿病が、Ｉ型糖尿病である、方法。
（項目８） 項目１に記載の方法であって、ここで前記ペプチドアンタゴニストが、腸管送達のためのの経口投与組成物として投与される、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、種々のヒト組織から精製されたゾヌリンのＮ末端の配列およびＺＯＴの生物学的に活性なフラグメントのＮ末端の配列（アミノ酸２８８〜３９９）を有するＩｇＭ重鎖のＮ末端配列との比較を示す。
【図２】図２は、Ｕｓｓｉｎｇチャンバー中に固定したウサギの回腸の組織抵抗性（Ｒｔ）に対する、ＺＯＴ、ゾヌリンｉ、ゾヌリンｈ（いずれも単独で（黒バー））またはペプチドアンタゴニストＦＺＩ／０と組合せて（白バー）、またはＦＺＩ／１と組合せて（影をつけたバー）の効果を、ネガティブコントロールと比較して示す。Ｎは、３〜５に等しく、そして＊は、ｐ＜０．０１に等しい。
【図３】図３は、糖尿病の傾向があるラットおよび糖尿病耐性のラットの両方における、管内のゾヌリン濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。これは、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定された。サンプルは、通常の生理食塩水中での腸管の洗浄によって得られた。それぞれの場合の最初のバーは、糖尿病耐性（ＤＲ）のラットを示す。第２のバーは、糖尿病の傾向がある（ＤＰ）動物を示し、そして第３のバーは、慢性的な糖尿病（ＣＤ）を有するラットを示す。糖尿病の傾向があるラットの＜９％は、糖尿病にはならず、そして糖尿病耐性のラットの＜９％が糖尿病を発症する。
【図４】図４は、本研究で使用したラットの糖尿病を発症した割合を示す。
【図５】図５は、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定された、糖尿病のラットにおける管内のゾヌリン濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【図６】図６は、糖尿病耐性（ＤＲ）のラット、Ｕｓｓｉｎｇチャンバー中で決定された糖尿病の傾向がある処置されていないラット（ＤＰ未処置；第２のバー）、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストで処置された糖尿病の傾向があるラット（ＤＰ処置；第３のバー）における、エキソビボでの腸管の透過性を示す。＊はｐ＜０．０５に等しい；＊＊はｐ＜０．０５に等しく、そしてＤＰで処置されたものと比較される場合にはｐ＜０．０００１に等しい。
【図７】図７は、糖尿病を発症したかまたは糖尿病を発症しなかったかのいずれかである、糖尿病の傾向がある未処置のラットの小腸の中の、エキソビボでの腸管の透過性を示す。＊はｐ＜０．０４に等しい。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
上記で議論されているように、１つの実施態様においては、本発明の上記の目的は、糖尿病（特に、Ｉ型糖尿病）の発症を予防するかまたは遅延させるための方法によって達成されている。この方法は、そのような発症の予防または遅延を必要としている被験体に対して、薬学的に有効量のゾヌリンのペプチドアンタゴニストを投与する工程を包含する。ここでは、上記のペプチドアンタゴニストは、ＺＯＴレセプターに結合するが、しかし、哺乳動物の接着結合の孔を生理学的には調節しない。
【００２５】
本発明において使用されるゾヌリンの特定のペプチドアンタゴニストは、ここでは重要ではない。上記のペプチドアンタゴニストの例として、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含有しているペプチドが挙げられる：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４。
【００２６】
ペプチドアンタゴニストの大きさは、本発明にとっては重要ではない。一般的には、ペプチドアンタゴニストの大きさは、８〜１１０アミノ酸まで、好ましくは、８〜４０アミノ酸の範囲であり、より好ましくは、８アミノ酸である。
【００２７】
このペプチドアンタゴニストは、Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｉｅｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｅｐａｒｅｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｍａｎｔら編、Ｃ．Ｒ．Ｃ．Ｐｒｅｓｓ（１９９１）に記載されているような周知の技術、およびペプチド合成装置（例えば、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ））を使用して、または組換えＤＮＡ技術を使用することによって（すなわち、ここでは、ペプチドをコードするヌクレオチド配列が適切な発現ベクター（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母の発現ベクター）中に挿入され、それぞれの宿主細胞中で発現され、そして周知の技術を使用してそれらから精製される）化学的に合成され、かつ精製され得る。
【００２８】
ペプチドアンタゴニストは、小腸への送達のための経口投与組成物として投与され得る。このような、小腸への送達のための経口投与組成物は当該分野で周知であり、そして一般的には、胃腸管耐性の錠剤またはカプセル剤を含む（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版、Ｏｓｏｌ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，第８９章（１９８０）；Ｄｉｇｅｎｉｓら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８３：９１５−９２１（１９９４）；Ｖａｎｔｉｎｉら、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｔｅｒａｐｅｕｔｉｃａ，１４５：４４５−４５１（１９９３）；Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４０：１９０２−１９０５（１９９２）；Ｔｈｏｍａら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，４６：３３１−３３６（１９９１）；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，７：３０９−３１９（１９９１）；およびＬｉｎら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓ．，８：９１９−９２４（１９９１）；これらは各々、これら全体が本明細書中で参考として援用される）。
【００２９】
錠剤は、例えば、セルロース酢酸フタレートまたはセルロース酢酸テレフタレートのいずれかの添加によって、胃腸管耐性にされる。
【００３０】
カプセルは、ペプチドアンタゴニスト（単数または複数）が、固いかまたは軟らかい、可溶性のゼラチンの容器または殻のいずれかの中に封入された、固体の投与量形態である。カプセルの製造で使用されるゼラチンは、加水分解によってコラーゲン様の材料から得られる。２つのタイプのゼラチンが存在する。タイプＡは、酸処理によってブタの皮膚から誘導され、そしてタイプＢは、アルカリ処理によって骨および動物の皮膚から得られる。固いゼラチンカプセルの使用によって、単一のペプチドアンタゴニストまたは、個々の被験体について最良と考えられる厳密な投与量レベルでそれらの組合せを処方することにおける選択を可能にする。固いゼラチンのカプセルは、２つの部分から構成される。一方が他方の中に滑り込み、それによってペプチドアンタゴニストを完全に取り囲む。これらのカプセルは、カプセルのより長いほうの端部にペプチドアンタゴニストまたはペプチドアンタゴニストを含有している胃腸管耐性のビーズを導入することによって充填され、そして次いで、キャップに滑り込ませる。固いゼラチンのカプセルは、ゼラチン、ＦＤ＆Ｃ着色料、およびしばしば、乳白剤（例えば、ニ酸化チタン）から大部分が作製される。ＵＳＰは、製造の間の分解を防ぐという目的のために、ゼラチンが０．１５％（ｗ／ｖ）のニ酸化イオウを含有することを認可している。
【００３１】
本発明の状況においては、小腸への送達のための経口投与組成物はまた、ペプチドアンタゴニストが、胃の中の胃液によって有意に不活化されるのを妨ぐ水性の緩衝剤を含む液体の組成物を含み、それによってペプチドアンタゴニストが活性な形態で小腸に到達することを可能にする。本発明において使用され得るこのような水性の緩衝剤の例として、重炭酸塩緩衝液（ｐＨ ５．５から８．７、好ましくは、約ｐＨ ７．４）が挙げられる。
【００３２】
経口投与組成物が液体組成物である場合には、安定性の問題を最少にするために、組成物が投与の直前に調製されることが好ましい。この場合には、液体の組成物は、水性の緩衝剤中で凍結乾燥されたペプチドアンタゴニストを溶解させることによって調製され得る。
【００３３】
使用されるペプチドアンタゴニストの薬学的有効量は、本発明にとっては重要ではなく、そして処置される被験体の年齢、体重および性別に依存して変化する。一般的には、糖尿病の発送を妨げるかまたは遅延させるために本発明において使用されるペプチドアンタゴニストの量は、約７．５×１０−６Ｍから７．５×１０−３Ｍの範囲、好ましくは、約７．５×１０−６Ｍから７．５×１０−４Ｍの範囲である。このような最終濃度を、例えば、腸管または血液中で達成するためには、本発明の単一の経口投与組成物中のペプチドアンタゴニストの量は、一般的には、約１．０μｇ〜１０００μｇ、好ましくは、約１．０μｇ〜１００μｇである。
【００３４】
以下の実施例は、例示的目的のためのみに提供され、そしていかなる場合においても本発明の範囲を限定するようには意図されない。
【実施例】
【００３５】
（実施例１）
（ゾヌリンのペプチドアンタゴニスト）
ＺＯＴ（ヒトの腸管のゾヌリン（ゾヌリンｉ）およびヒトの心臓のゾヌリン（ゾヌリンｈ）は全て腸管（Ｆａｓａｎｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１１２：８３９（１９９７）；Ｆａｓａｎｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６：７１０（１９９５））および内皮のｔｊに対して作用し、そして３個全てが、腸管内でのＺＯＴレセプターの分布と一致する（Ｆａｓａｎｏら（１９９７）前出；およびＦａｓａｎｏら（１９９５）前出））同様の局所的な効果を有する（Ｆａｓａｎｏら（１９９７）前出）ので、１９９８年８月３日に出願された米国特許出願番号第０９／１２７，８１５号においては、これらの３個分子は、同じレセプター結合部位と相互作用すると仮定された。従って、腸管のｔｊの調節に関係するレセプター−リガンド相互作用の絶対的な構造要件に関する知見を提供するために、ＺＯＴおよびヒトのゾヌリンの一次アミノ酸構造の比較を、本明細書中で行った。これらの分子のＮ末端の分析によって、以下の共通のモチーフ（図１中で四角で囲んだアミノ酸残基８〜１５）を明らかにした：非極性（腸管についてはＧｌｙ、脳についてはＶａｌ）、可変、非極性、可変、非極性、極性、可変、極性（Ｇｌｙ）。８位のＧｌｙ、１２位のＶａｌ、および１３位のＧｌｎは、全て、ＺＯＴ、ゾヌリンｉ、およびゾヌリンｈにおいて高度に保存されている（図１を参照のこと）。これは、腸管内でのレセプター結合機能について重要であると考えられる。これらを確認するために、合成の８ペプチドである、Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ（配列番号１５）（ＦＺＩ／０と命名し、そしてヒトの胎児のゾヌリンｉのアミノ酸残基８〜１５に対応している）を化学的に合成した。
【００３６】
次に、上記のようにＵｓｓｉｎｇチャンバー中に固定したウサギの回腸を、１００μｇのＦＺＩ／０（配列番号１５）、１００μｇのＦＺＩ／１（配列番号２９）、１．０μｇの６×Ｈｉｓ−ＺＯＴ（１９９８年８月３日に出願された、米国特許出願番号第０９／１２７，８１５号の実施例１に記載されているように得た）、１．０μｇのゾヌリンｉ（１９９８年８月３日に出願された、米国特許出願番号第０９／１２７，８１５号の実施例３に記載されているように得た）、または１．０μｇのゾヌリンｈ（１９９８年８月３日に出願された、米国特許出願番号第０９／１２７，８１５号の実施例３に記載されているように得た）の単独で暴露したか；あるいは、１００μｇのＦＺＩ／０またはＦＺＩ／１に２０分間予め暴露し、その時点で、１．０μｇの６×Ｈｉｓ−ＺＯＴ、１．０μｇのゾヌリンｉ、または１．０μｇのゾヌリンｈを添加した。次いで、ΔＲｔを、上記ように算出した。結果を、図２に示す。
【００３７】
図２に示すように、ＦＺＩ／０は、Ｒｔにおいてはいかなる有意な変化をも誘導しなかった（ネガティブコントロールと比較して、０．５％）（黒バーを参照のこと）。対照的に、ＺＦＩ／０での２０分間の予備処理は、Ｒｔに対するＺＯＴ、ゾヌリンｉ、およびゾヌリンｈの効果を、それぞれ、７５％、９７％、および１００％減少させた（白バーを参照のこと）。また図２に示されるように、この阻害効果は、８位のＧｌｙ、１２位のＶａｌ、および１３位のＧｌｙ（ゾヌリンに対して言及されるような）をゾヌリンｂの対応するアミノ酸残基（それぞれ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、およびＡｒｇ、配列番号３０を参照のこと）で変更することによって化学的に合成された第二の合成ペプチド（ＦＺＩ／配列番号２９）が使用される場合には、完全に除去された（影をつけたバーを参照のこと）。
【００３８】
上記の結果は、ＺＯＴのＮ末端の残基８〜１５間にわたる領域および標的レセプターに結合のために重要なゾヌリンのファミリーでが存在すること、および８位、１２位、および１３位のアミノ酸残基がこの結合の組織特異性を決定することを実証する。
【００３９】
（実施例２）
（糖尿病のラットのモデル）
腸管の透過性における変化は、糖尿病の発症に関係している事前の生理学的な変化の１つであることが示されている（Ｍｅｄｄｉｎｇｓ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７６：Ｇ９５１−９５７（１９９９））。傍細胞輸送の輸送および腸管の透過性は、完全には解明されていない機構を通じて細胞内ｔｊによって調節される。
【００４０】
ゾヌリンおよびその原核生物のアナログであるＺＯＴは両方とも、ｔｊを調節することによって腸管の透過性を変更する。この実施例においては、最初に、ｔｊのゾヌリンに関係している障害が、糖尿病の病因に関係していること、およびゾヌリンのペプチドアンタゴニストの投与によって糖尿病が予防され得るかまたは発症が遅延され得ることが、実証されている。
【００４１】
最初に、２つの遺伝的な交配品種（すなわち、ＢＢ／Ｗｏｒ糖尿病の傾向がある（ＤＰ）ラットおよび糖尿病耐性の（ＤＲ）ラット（Ｈａｂｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９５：８３２−８３７（１９９３））を、それらがゾヌリンの管内分泌および腸管の透過性に有意な変化を示すかどうかを決定するために評価した。
【００４２】
より詳細には、年齢が適合するＤＰおよびＤＲラット（２０、５０、７５、および＞１００日齢）を屠殺した。ラットを屠殺した後、２５Ｇの針を回腸の内腔に配置し、そしてＲｉｎｇｅｒの溶液を用いて腸管の洗浄を行って、管内のゾヌリンの存在を決定した。ゾヌリンの濃度を、以下のようなサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して評価した：
プラスチックのマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を、ポリクローナルウサギ抗ＺＯＴ抗体（１９９８年８月３日に出願された、米国特許出願番号第０９／１２７，８１５号の実施例２に記載されているように得た）（１：１００希釈）を用いて４℃で一晩コーティングし、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０を含有しているＰＢＳで３回洗浄し、次いで、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０を含有している３００μｌのＰＢＳを用いて、室温で１５分間のインキュベーションすることによってブロックした。次に、精製したヒトの腸管のゾヌリン（１９９８年８月３日に出願された、米国特許出願番号第０９／１２７，８１５号の実施例３に記載されているように得た）を、プレート上にコーティングした。
【００４３】
標準曲線を、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有しているＰＢＳ中で、以下の種々の濃度でゾヌリンを稀釈することによって得た：０．７８ｎｇ／ｍｌ、１．５６ｎｇ／ｍｌ、３．１２５ｎｇ／ｍｌ、６．２５ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、および５０ｎｇ／ｍｌ。
【００４４】
１００μｌのそれぞれの標準濃度または１００μｌの腸管の洗浄サンプルをウェル中にピペッティングし、そしてプレート振盪装置を使用して室温で１時間インキュベートした。結合していないゾヌリンをＰＢＳを使用して洗浄し、そしてウェルを、振盪させながら室温で１時間の間アルカリホスフェートと結合させた１００μｌの抗ＺＯＴ抗体とともにインキュベートした。結合していない結合体を、ＰＢＳを用いて洗い流し、そして、最初に、１／２００００に稀釈した１００μｌのＥｘｔｒａ−Ａｖｉｄｉｎ（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２、１．０％（ｗ／ｖ）のＢＳＡに、１５分間かけて添加し、そして次いで、１．０ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート基質（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有している１００μｌの溶液とともに３７℃で３０分間、それぞれのウェルをインキュベートすることによって、着色反応を起こさせた。吸光度を、４０５ｎｍでの酵素免疫アッセイリーダー上で読み取った。
【００４５】
ＥＬＩＳＡ−サンドイッチ方法のアッセイ内およびアッセイ間での精度を評価するために、係数偏差（ＣＶ）を、連続３日間、種々の濃度のゾヌリンを用いて２つのサンプルに由来する３個の複製物を使用して計算した。ＥＬＩＳＡ−サンドイッチ方法のアッセイ内試験によって、９．８％のＣＶ値を得た。アッセイ間試験のＣＶは、１日目は４．２％、２日目は３．３％、そして３日目は２．９％であった。
【００４６】
ゾヌリンの濃度を、腸管の洗浄液中で検出したｎｇ／ｍｇのタンパク質として表現し、そして暴露された表面積（ｍｍ２で）によって較正した。結果を図３に示す。
【００４７】
図３に示すように、管腔内のゾヌリンの４倍の増大を、最初に、糖尿病の傾向にあるラット（５０日齢）において観察した（第２番目の棒）。この管腔内のゾヌリンの増大は、腸管の透過性における増大と相関していることを見出した。管腔内のゾヌリンの増大は、これらの糖尿病の傾向にあるラットにおいては高いままであり、そして完全に発症した（ｂｌｏｗｎ）糖尿病への進行と相関することを見出した。注：糖尿病の傾向のあるラット（＞１００日齢）は、管腔内のゾヌリンの増大はなかった。これは、驚くべきである。なぜなら、このラットは、糖尿病に進行しなかったからである。このラットについての血液グルコースは正常であった。従って、ゾヌリンは、Ｉ型糖尿病の病因に関係している透過性の変化の原因である。ゾヌリンの分泌の増大は年齢に関係し、そして糖尿病の発症を進行させる。
【００４８】
次に、糖尿病がゾヌリンのペプチドアンタゴニストの投与によって予防され得るかどうかを決定するために、ＢＢ／Ｗｏｒラット（２１〜２６日齢）を、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｏｄｅｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｕｔｌａｎｄ，ＭＡ）から入手し、そして２つのグループ（すなわち、処置したグループおよびコントロールのグループ）にランダマイズした（１つのグループあたりｎ＝５）。両方のグループを、ラットの固形飼料（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｂ Ｄｉｅｔ ＃７０１２）の標準的な食餌で維持した。全ての食物および水を、あらかじめオートクレーブした。毎日、一日の水の摂取量を測定し、そして１００ｍｌの新しい水を与えた。処置したグループには、飲料水中に補充した１０μｇ／ｍｌのゾヌリンのペプチドアンタゴニスト（配列番号１５）を受容させた。ラットを、ヘパフィルターケージの中に収容した。
【００４９】
ラットの糖尿病を、以下のように診断した：ラットを、１週間に２回秤量した。血液グルコールを、ＯｎｅＴｏｕｃｈ（登録商標）グルコースモニタリングシステム（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）を使用して１週間に１回決定した。毎週、尿検査のための試薬の小片を、グルコース（Ｄｉａｓｔｉｘ（登録商標））およびケトン（Ｋｅｔｏｓｉｔｘ（登録商標））（Ｂａｙｅｒ）をモニターするために使用した。＞２５０ｍｇ／ｄｌの血液グルコースを有するラットを一晩断食させ、そして＞２００ｍｇ／ｄｌの血液グルコースレベルを糖尿病と考えた。これらの指針は、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｏｄｅｌｓ，Ｉｎｃ．によって供給されたデータに従う。結果を、図４に示す。
【００５０】
図４に示すように、コントロールのラットの８０％（４／５）、そしてゾヌリンのペプチドアンタゴニストで処置したラットの４０％（２／５）が、８０日齢までに糖尿病を発症した。ゾヌリンの分泌における変化は、糖尿病の発症と平行していた。
【００５１】
糖尿病の臨床的な所見の後、ラットを以下のように屠殺した：ラットに、ケタミン麻酔を使用して麻酔し、そして中線切開を行って心臓に接触できるようにした。１８Ｇの針を、心臓の内部に配置し、そして全採血によって死を生じさせた。次いで、ゾヌリンアッセイを、上記に記載するように行った。糖尿病が存在しなかったこれらのラットについては、研究の終わりを８０日齢とした。Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｏｄｅｌ，Ｉｎｃ．，に従うと、糖尿病の傾向にあるラットのうちの８０％が、８０日齢までに糖尿病を有して存在した。ゾヌリンアッセイの結果を、図５に示す。
【００５２】
図５に示すように、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストで処置しなかった糖尿病のラットが、図３に示す結果と一致して、管腔内ゾヌリンの増大を有することを観察した。さらに、管腔内のゾヌリンは、糖尿病を発症しなかった糖尿病の傾向にあるラット（ＤＰ−処置）およびコントロールのラット（ＤＰ−未処置）の両方と比較して、糖尿病のラット（ＤＲ）において２から４倍増大した。糖尿病を発症しなかった糖尿病ではないコントロールラットは、無視できるレベルのゾヌリンを有し、これは、図３に示すゾヌリンのレベルと一致した。さらに、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストでの処置にもかかわらず糖尿病を発症した２匹の糖尿病の傾向にあるラットは、良好に処置されたラット、および未処置のコントロールのラットよりも有意に高い、管腔内ゾヌリンのレベルを示した。ゾヌリンのこのレベルは、糖尿病の進行に必須の透過性の変化を開始するために十分であるが、ＺＯＴ／ゾヌリンレセプターは、ペプチドアンタゴニストによって効率良くブロックされた。
【００５３】
また、糖尿病の臨床的な所見の後、屠殺したラットの腸管組織を、エキソビボでの透過性における変化を評価するために、Ｕｓｓｉｎｇチャンバー中に固定した。
【００５４】
より詳細には、空腸および回腸の切片を屠殺したラットから単離し、そして腸管の内容物をリンスして除いた。それぞれの腸管のセグメントの６個の切片を調製し、そしてＬｕｃｉｔｅ Ｕｓｓｉｎｇチャンバー（０．３３ｃｍ２の開口部）に固定し、電圧クランプ装置（ＥＶＣ ４０００；Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｒａｔｏｓａ、ＦＬ）に接続し、そして５３ｍＭのＮａＣｌ、５．０ｍＭのＫＣｌ、３０．５ｍＭのＮａ２ＳＯ４、３０．５ｍＭのマンニトール、１．６９ｍＭのＮａ２ＰＯ４、０．３ｍＭのＮａＨＰＯ４、１．２５ｍＭのＣａＣｌ２、１．１ｍＭのＭｇＣｌ２および２５ｍＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ ７．４）を含有している新しく調製した緩衝液に浸した。浸す溶液を、一定温度の循環ポンプに接続し、そして９５％のＯ２および５％のＣＯ２でガス処理した水のカバーをかけたレザーバーを用いて３７℃で維持した。電位差を測定し、そして短い循環電流および組織抵抗を、Ｆａｓａｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５２４２−５２４６（１９９１）に記載されているように計算した。結果を、図６〜７に示す。
【００５５】
エキソビボでのＵｓｓｉｎｇチャンバーの透過性の研究において実証され、そして図６に示すように、糖尿病に進行した全てのラットが、それらの腸管の透過性を増大させた。糖尿病耐性の（ＤＲ）ラットは、細胞付近の透過性のにおいて感知できる程度の変更は有さなかった（第１の棒）。未処置の糖尿病の傾向にあるラット（ＤＰ−未処置；第２の棒）は、空腸および回腸の細胞付近の透過性の有意な増大を有した。より重要なことは、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストで処置した糖尿病の傾向にあるラット（ＤＰ−処置；第３の棒）が、空腸に制限された小腸の細胞付近の透過性において有意な増大を有したことである。しかし、図６に示すように、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストでの予備処置は、遠位の回腸においてこれらの変化を妨害した。結果として、病因に関係する細胞付近の透過性における変更は、回腸に限定される。また、図６に示すように、結腸の透過性においては有意な変化は存在しなかった。これは、ゾヌリンレセプターの分布の局所的な分布と一致する。
【００５６】
これらの結果を、さらに、糖尿病を発症したラット（ＤＰ−Ｄ）または糖尿病を発症していないラット（ＤＰ−Ｎ）のいずれかである、未処置の糖尿病の傾向にあるラットの小腸中での、エキソビボでの腸管の透過性の比較によって確認した（図７）。回腸のＲｔにおいては、ＤＰ−ＤラットとＤＰ−Ｎラットとの間で有意な変化は観察されなかったが、ＤＰ−Ｎラットと比較して、ＤＰ−Ｄラットの回腸の粘膜の有意に低いＲｔが観察された（図７）。
【００５７】
従って、以下の結論を作成し得る：（１）ペプチドアンタゴニストは、糖尿病の発症のために必要とされる透過性の変化を効率良くブロックすることが可能であった；そして（２）ペプチドアンタゴニストで処置したこれらのラットにおいては、管腔内のゾヌリンのレベルは、糖尿病を発症していない処置したラットよりも３倍高い。糖尿病を発症した処置したラットのこの集団においては、ペプチドアンタゴニストの量は、糖尿病を予防するために必要な十分な数のＺＯＴ／ゾヌリンレセプターをブロックするためには十分ではない場合がある。
【００５８】
処置したラットの６０％は、糖尿病を発症しなかった。ラットのこの集団においては、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストは、糖尿病の発症に必要な腸管の透過性の増大を効率良く妨げた。図５に示すように、処置したラットは、未処置のコントロールに匹敵する管腔内ゾヌリンのレベルを有したが、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストの存在に起因して、小腸の全体的な透過性は、糖尿病の進行に必要な生理学的な変化を開始するために十分には変更されなかった。興味深いことに、図５に示すように、糖尿病を発症しなかった１匹のコントロールの動物は、無視できるゾヌリンのレベルを有し、このことはさらに、糖尿病の病因におけるゾヌリンの役割をサポートする。
【００５９】
従って、ＢＢ／Ｗｏｒラットにおける糖尿病の病因の初期の事象は、ゾヌリンによって媒介される腸管の細胞付近の透過性の変化を含む。さらに、ゾヌリンのペプチドアンタゴニストの使用を用いたゾヌリンのシグナル伝達システムの阻害は、糖尿病の発症を妨げるか、または少なくとも一部遅延させる。
【００６０】
本発明は、詳細に、そしてその特異的な実施態様を参照して記載されているが、種々の変更および改変が、本発明の精神および範囲を逸脱することなくその中で行われ得ることが、当業者に明らかである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載される発明。
【請求項１】
本明細書に記載される発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１１−２１３７４２（Ｐ２０１１−２１３７４２Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−１６９６５４（Ｐ２０１１−１６９６５４）
【出願日】平成２３年８月２日（２０１１．８．２）
【分割の表示】特願２００１−５８５７９４（Ｐ２００１−５８５７９４）の分割
【原出願日】平成１３年３月２１日（２００１．３．２１）
【出願人】（５０２３９９２３７）ユニバーシティ オブ メリーランド，ボルチモア (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１６９６５４（Ｐ２０１１−１６９６５４）
【出願日】平成２３年８月２日（２０１１．８．２）
【分割の表示】特願２００１−５８５７９４（Ｐ２００１−５８５７９４）の分割
【原出願日】平成１３年３月２１日（２００１．３．２１）
【出願人】（５０２３９９２３７）ユニバーシティ オブ メリーランド，ボルチモア (5)
【Ｆターム（参考）】
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