細胞外マトリクス成分産生抑制剤
【課題】細胞外マトリクス成分の産生抑制、マトリクス分解酵素産生の促進、及び／又は、線維芽細胞増殖の抑制をする作用を有する新規の剤であって、副腎脂質ステロイド及び前記クロストリジウム由来の精製コラゲナーゼのような副作用がなく、安定かつ安全な剤を開発する。
【解決手段】本発明は、パルミチン酸と、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物からなる、細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤を提供する。
【解決手段】本発明は、パルミチン酸と、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物からなる、細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パルミチン酸等からなる、細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲン、エラスチン等の細胞外マトリクス成分は線維芽細胞で産生される。前記細胞外マトリクス成分産生の亢進、マトリクス分解酵素産生の低下、及び、線維芽細胞数の増加は、さまざまな組織及び器官で線維化を伴う症状を生じさせる。前記線維化を伴う症状には、肺線維症、肝硬変、動脈硬化症、強皮症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症及び間質性腎炎等の疾患症状が含まれる（非特許文献１）。また、前記線維化を伴う症状には、外傷及び術後の肥厚瘢痕等の皮膚状態も含まれる。
【０００３】
従来、前記線維化を伴う症状を改善するため、例えば、副腎脂質ステロイド等の薬剤が使用されている（非特許文献１）。しかし、副腎脂質ステロイドは、免疫力低下、糖尿病等の副作用があり、長期間の使用には適さない。
【０００４】
セルライトは、肥満が進行した人の臀部等の皮膚の表面に見られる皮膚表面の凹陥である。セルライトが発生した皮膚の組織では、皮下脂肪細胞が真皮の結合組織内に突出している。セルライトのある皮膚にコラゲナーゼが注入されると、セルライトが改善することが知られている（特許文献１）。そこでセルライトには、真皮細胞での細胞外マトリクス成分産生の亢進、及び／又は、マトリクス分解酵素産生の低下が関与すると考えられる。
【０００５】
特許文献１に開示されるコラゲナーゼの注入処置では、ヒト以外の生物種由来のコラゲナーゼ、典型的には、細菌のクロストリジウム由来の精製コラゲナーゼが用いられるため、前記処置を繰り返すとアレルギー反応を起こす危険がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００９−５２７５７０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】尹 浩信、医学のあゆみ、２３０：１００８（２００９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、細胞外マトリクス成分の産生抑制、マトリクス分解酵素産生の促進、及び／又は、線維芽細胞増殖の抑制をする作用を有する新規の剤であって、副腎脂質ステロイド及び前記クロストリジウム由来の精製コラゲナーゼのような副作用がなく、安定かつ安全な剤を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、パルミチン酸と、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物からなる、細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤を提供する。本発明は、パルミチン酸と、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物を含む、細胞外マトリクス成分産生抑制、マトリクス分解酵素産生促進、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制のための組成物を提供する。
【００１０】
本発明の剤において、前記細胞外マトリクス成分は、コラーゲン及び／又はエラスチンの場合がある。前記コラーゲンはＩ型コラーゲンα鎖の場合がある。本発明の組成物において、前記細胞外マトリクス成分は、コラーゲン及び／又はエラスチンの場合がある。前記コラーゲンはＩ型コラーゲンα鎖の場合がある。
【００１１】
本発明の剤において、前記マトリクス分解酵素はマトリクスメタロプロティナーゼ１（ＭＭＰ１）の場合がある。本発明の組成物において、前記マトリクス分解酵素はマトリクスメタロプロティナーゼ１（ＭＭＰ１）の場合がある。
【００１２】
本発明は、オレイン酸と、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物からなる、線維芽細胞増殖抑制剤を提供する。本発明は、オレイン酸と、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物を含む、線維芽細胞増殖抑制のための組成物を提供する。
【００１３】
本発明の剤は食品として用いられる場合がある。本発明の組成物は食品として用いられる場合がある。
【００１４】
本発明の剤は化粧品として用いられる場合がある。本発明の組成物は化粧品として用いられる場合がある。
【００１５】
本発明の剤において、前記化粧品はセルライト改善のための化粧品の場合がある。本発明の組成物において、前記化粧品はセルライト改善のための化粧品の場合がある。
【００１６】
本発明の細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤は医薬品として用いられる場合がある。本発明の細胞外マトリクス成分産生抑制、マトリクス分解酵素産生促進、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制のための組成物は医薬品として用いられる場合がある。
【００１７】
本発明の細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤において、前記医薬品は、線維化を伴う症状、あるいはセルライトのための医薬品の場合がある。本発明の細胞外マトリクス成分産生抑制、マトリクス分解酵素産生促進、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制のための組成物において、前記医薬品は、線維化を伴う症状、あるいはセルライトのための医薬品の場合がある。
【００１８】
本発明の細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤において、前記線維化を伴う症状は、肺線維症、肝硬変、動脈硬化症、強皮症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、間質性腎炎、外傷及び術後の肥厚瘢痕からなるグループから選択される場合がある。本発明の細胞外マトリクス成分産生抑制、マトリクス分解酵素産生促進、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制のための組成物において、前記線維化を伴う症状は、肺線維症、肝硬変、動脈硬化症、強皮症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、間質性腎炎、外傷及び術後の肥厚瘢痕からなるグループから選択される場合がある。
【００１９】
本発明の細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤において、前記医薬品は治療剤の場合がある。本発明の細胞外マトリクス成分産生抑制、マトリクス分解酵素産生促進、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制のための組成物において、前記医薬品は治療剤の場合がある。
【００２０】
本発明の細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤において、前記医薬品は予防剤の場合がある。本発明の細胞外マトリクス成分産生抑制、マトリクス分解酵素産生促進、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制のための組成物において、前記医薬品は予防剤の場合がある。
【００２１】
本発明は、パルミチン酸と、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物からなる、細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤を投与するステップを含む、皮膚状態の悪化を予防及び／又は改善する方法を提供する。前記皮膚状態の悪化は、皮膚の粘弾性の低下の場合がある。
【００２２】
本発明は、パルミチン酸と、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物からなる、細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤を投与するステップを含む、線維化を伴う症状、あるいはセルライトを治療及び／又は予防する方法を提供する。前記剤は、治療剤及び予防剤を含む医薬品の場合がある。前記細胞外マトリクス成分は、コラーゲン及び／又はエラスチンの場合がある。前記コラーゲンはＩ型コラーゲンα鎖の場合がある。前記マトリクス分解酵素はマトリクスメタロプロティナーゼ１（ＭＭＰ１）の場合がある。前記線維化を伴う症状は、肺線維症、肝硬変、動脈硬化症、強皮症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、間質性腎炎、外傷及び術後の肥厚瘢痕からなるグループから選択される場合がある。
【００２３】
本発明は、パルミチン酸と、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物からなる、細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤を投与するステップを含む、皮膚の美容状態の悪化を予防及び／又は改善する方法を提供する。前記剤は化粧品の場合がある。前記細胞外マトリクス成分は、コラーゲン及び／又はエラスチンの場合がある。前記コラーゲンはＩ型コラーゲンα鎖の場合がある。前記マトリクス分解酵素はマトリクスメタロプロティナーゼ１（ＭＭＰ１）の場合がある。本発明の皮膚の美容状態の悪化を予防及び／又は改善する方法において、皮膚の美容状態の悪化はセルライトの場合があるが、これに限定されない。
【００２４】
本発明において、セルライト（ｃｅｌｌｕｌｉｔｅ）とは、肥満が進行した人の臀部等の皮膚の表面に見られる皮膚表面の凹陥を伴う皮膚の状態をいう。セルライトが発生した皮膚の組織では、皮下脂肪細胞が真皮の結合組織内に突出する。セルライトは大腿・臀部脂肪異栄養症（ｇｙｎｏｉｄ ｌｉｐｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）ともよばれる。
【００２５】
本発明において、マトリクス分解酵素とは、細胞外マトリクスの構成成分を分解する酵素をいう。マトリクス分解酵素には、マトリクスメタロプロティナーゼ（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＭＭＰ）と総称されるタンパク質分解酵素遺伝子ファミリーに属する酵素が含まれる。マトリクスメタロプロティナーゼは、金属、特に亜鉛と結合し、細胞外マトリクスの構成成分を切断する活性を有する。マトリクスメタロプロティナーゼには２５個以上のファミリーのメンバー酵素が同定されている。マトリクスメタロプロティナーゼのメンバー酵素のアミノ酸及びポリヌクレオチド配列については、ＯＭＩＭ（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ）データベースを含む米国ＮＣＢＩのサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｇｑｕｅｒｙ）から検索することができる。マトリクスメタロプロティナーゼファミリーのメンバーのうち、ヒトＭＭＰ１は、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型のコラーゲンを分解する。ヒトＭＭＰ２及び９はエラスチンを分解する。ヒトＭＭＰ１とマウスＭＭＰ１３とは相同遺伝子である。
【００２６】
本発明においてパルミチン酸の「塩」とは、パルミチン酸が、細胞外マトリクス成分産生を抑制する効果、マトリクス分解酵素産生を促進する効果、及び／又は、線維芽細胞増殖を抑制する効果を損なわないことを条件として、金属塩、アミン塩等を含むいずれかの塩をいう。前記金属塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等を含む場合がある。前記アミン塩は、トリエチルアミン塩、ベンジルアミン塩等を含む場合がある。
【００２７】
本明細書においてパルミチン酸の「誘導体」とは、パルミチン酸が、細胞外マトリクス成分産生を抑制する効果、マトリクス分解酵素産生を促進する効果、及び／又は、線維芽細胞増殖を抑制する効果を損なわないことを条件として、パルミチン酸が、カルボキシル基か、側鎖かにおいて、いずれかの原子団と共有結合したものを指す。前記いずれかの原子団は、Ｎ−フェニルアセチル基、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基等のような保護基と、タンパク質、ペプチド、糖、脂質、核酸等のような生体高分子と、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステル等のような合成高分子と、エステル基等のような官能基とを含むがこれらに限定されない。前記エステル基は、例えば、メチルエステル、エチルエステルその他の脂肪族エステルか、芳香族エステルかを含む場合がある。
【００２８】
本発明のパルミチン酸は、以下の実施例に示すとおり、培養ヒト線維芽細胞に対して１０〜３０μＭの濃度範囲で細胞外マトリクス成分産生を抑制する効果、マトリクス分解酵素産生を促進する効果、及び／又は、５〜３０μＭの濃度範囲で増殖を抑制する効果を有する。したがって、本発明の剤又は組成物に含まれるパルミチン酸の量は、この濃度範囲のパルミチン酸が生体皮膚組織の線維芽細胞に送達されることを条件として、いかなる含有量であってもかまわない。本発明の剤が外用剤の場合におけるパルミチン酸の含有量は、本発明の剤全量中０．０００１質量％から５０質量％か配合可能な最大質量濃度かまでの範囲であればよい。すなわち前記剤が外用剤の場合におけるパルミチン酸の含有量は、０．０００１質量％〜３０質量％が望ましく、０．０００１質量％〜３質量％が最も望ましい。本発明の剤が内服剤の場合におけるパルミチン酸の含有量は、０．０００１質量％〜１００質量％の範囲であればよい。本発明の剤が内服剤の場合におけるパルミチン酸の含有量は、０．０００１質量％〜８０質量％が望ましく、０．０００１質量％〜６０質量％であることが最も望ましい。
【００２９】
本発明の剤は、パルミチン酸、パルミチン酸の塩、及び／又は、生体内で薬物代謝酵素その他によってパルミチン酸を放出できる誘導体に加えて、パルミチン酸の細胞外マトリクス成分産生を抑制する効果、マトリクス分解酵素産生を促進する効果、及び／又は、線維芽細胞増殖を抑制する効果を損なわないことを条件として、さらに１種類又は２種類以上の薬学的に許容される添加物を含む場合がある。前記添加物は、希釈剤及び膨張剤と、結合剤及び接着剤と、滑剤と、流動促進剤と、可塑剤と、崩壊剤と、担体溶媒と、緩衝剤と、着色料と、香料と、甘味料と、防腐剤及び安定化剤と、吸着剤と、当業者に知られたその他の医薬品添加剤とを含むが、これらに限られない。
【００３０】
本発明の剤は、有効成分として、パルミチン酸、パルミチン酸の塩、及び／又は、生体内で薬物代謝酵素その他によってパルミチン酸を放出できる誘導体のみを使用して調製することも可能であるが、通常本発明の効果を損なわない範囲で、医薬部外品を含む化粧品や医薬品等の皮膚外用剤等に用いられる他の成分を、必要に応じて適宜配合することができる。前記他の成分（任意配合成分）としては、例えば、油分、界面活性剤、粉末、色材、水、アルコール類、増粘剤、キレート剤、シリコーン類、酸化防止剤、紫外線吸収剤、保湿剤、香料、各種薬効成分、防腐剤、ｐＨ調整剤、中和剤等が挙げられる。
【００３１】
本発明の剤型は、例えば軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、ジェル剤、貼付剤等の外用剤と、例えば粉末、顆粒、ソフトカプセル、錠剤等の経口剤と、例えば経鼻スプレー等の経鼻剤と、注射剤とを含む、従来の医薬部外品及び医薬品に用いるものであればいかなるものでもかまわない。
【００３２】
本発明の食品は、パルミチン酸、パルミチン酸の塩、及び／又は、生体内で薬物代謝酵素その他によってパルミチン酸を放出できる誘導体に加えて、パルミチン酸の細胞外マトリクス成分産生を抑制する効果、マトリクス分解酵素産生を促進する効果、及び／又は、線維芽細胞増殖を抑制する効果を損なわないことを条件として、調味料、着色料、保存料その他の食品として許容される成分を含む場合がある。
【００３３】
本発明の食品は、例えば、キャンディー、クッキー、味噌、フレンチドレッシング、マヨネーズ、フランスパン、醤油、ヨーグルト、ふりかけ、調味料・納豆のたれ、納豆、もろみ黒酢等の従来食品に用いるものであればいずれでもよく、前記例示に限定されるものでない。
【００３４】
本発明において、線維芽細胞数と、細胞外マトリクスを構成する遺伝子及びマトリクス分解酵素遺伝子の発現量との測定は、美容及び医療分野の当業者に周知のいかなる測定方法を使用して実施されてもかまわない。
【００３５】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】マウス線維芽細胞の増殖に対するパルミチン酸の影響を示す棒グラフ。
【図２】マウス線維芽細胞の増殖に対するオレイン酸の影響を示す棒グラフ。
【図３】マウス線維芽細胞の増殖に対するステアリン酸の影響を示す棒グラフ。
【図４】マウス線維芽細胞のＩ型コラーゲンα鎖遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を示す棒グラフ。
【図５】マウス線維芽細胞のエラスチン遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を示す棒グラフ。
【図６】マウス線維芽細胞のマトリクスメタロプロティナーゼ１３遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を示す棒グラフ。
【図７】ヒト線維芽細胞の増殖に対するパルミチン酸の影響を示す棒グラフ。
【図８】ヒト線維芽細胞のＩ型コラーゲンα鎖遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を示す棒グラフ。
【図９】ヒト線維芽細胞のエラスチン遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を示す棒グラフ。
【図１０】ヒト線維芽細胞のマトリクスメタロプロティナーゼ１遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を示す棒グラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例１】
【００３８】
パルミチン酸のマウス線維芽細胞増殖抑制効果
１．材料及び方法
（１）細胞培養
細胞は、マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞が用いられた。前記細胞は、３ｘ１０４個／ｍＬとなるように市販の２４ウェルの培養プレート（３５３０４７、ファルコン、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に播種され、市販の細胞培養用培地（Ｄ−ＭＥＭ、１１８８５０８４、ＧＩＢＣＯ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）にウシ血清（１６０１０１５９、ＧＩＢＣＯ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を１０％添加した培地を用いて培養された。前記細胞は、３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で６時間培養された。
【００３９】
その後、前記マウス線維芽細胞を培養する培地は、前記細胞培養用培地に前記ウシ血清を０．５％添加した培地（以下、「マウス線維芽細胞増殖評価培地」という。）に切り換えられ、前記マウス線維芽細胞は、３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で１２時間培養された。
【００４０】
（２）飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸の添加
前記線維芽細胞の増殖における飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸の効果を検討する場合には、５μＭ及び１０μＭのパルミチン酸（Ｓ−３３、和光純薬工業株式会社）か、５μＭ及び１０μＭのオレイン酸（０７５０１、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）か、１μＭ、３μＭ及び１０μＭのステアリン酸（Ｓ３３８１、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）かが培養１２時間後のマウス線維芽細胞増殖評価培地に添加され、前記線維芽細胞は、３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で４８時間培養された。これらの飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸を添加しない培地での細胞培養が対照とされた。
【００４１】
（３）線維芽細胞の細胞増殖率の決定
その後、培地にａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標、ＤＡＬ１０２５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を最終濃度１０％となるように添加し、２時間後に、製造者の指示書に従って励起波長５４４ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍで上清の蛍光強度を測定した。細胞増殖率（％）は、各実験条件でのａｌａｍａｒＢｌｕｅの蛍光強度を、飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸を添加しない対照群の蛍光強度で除算した商の百分率として計算された。
【００４２】
２．結果
（１）パルミチン酸添加
図１は、マウス線維芽細胞の増殖に対するパルミチン酸の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、対照群及び実験群それぞれのウェル３個の細胞増殖を測定し、同一条件で複数回繰り返した実験結果の測定値の標準誤差を示す。また、フィッシャーのＰＬＳＤ検定において、アステリスク（＊＊＊）はｐ値が０．１％未満であることを示す。グラフ中の「ｎ．ｓ．」との記載は、対照と比較して有意差がないことを示す。図１に示されるとおり、１０μＭのパルミチン酸を添加すると、細胞増殖は統計学的に有意に低下した。
【００４３】
（２）オレイン酸添加
図２は、マウス線維芽細胞の増殖に対するオレイン酸の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、対照群及び実験群それぞれのウェル３個の細胞増殖を測定し、同一条件で複数回繰り返した実験結果の測定値の標準誤差を示す。また、フィッシャーのＰＬＳＤ検定において、アステリスク（＊＊＊）はｐ値が０．１％未満であり、アステリスク（＊＊）はｐ値が１％未満であることを示す。図２に示されるとおり、５μＭ及び１０μＭのオレイン酸を添加すると、細胞増殖は統計学的に有意に低下した。
【００４４】
（３）ステアリン酸添加
図３は、マウス線維芽細胞の増殖に対するステアリン酸の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、対照群及び実験群それぞれのウェル３個の細胞増殖を測定し、同一条件で複数回繰り返した実験結果の測定値の標準誤差を示す。グラフ中の「ｎ．ｓ．」との記載は、対照と比較して有意差がないことを示す。図３に示されるとおり、１μＭないし１０μＭのステアリン酸の添加では、細胞増殖は統計学的に有意に低下しなかった。
【００４５】
３．結論
本実施例の実験結果から、マウス線維芽細胞の増殖抑制効果は、パルミチン酸及びオレイン酸では認められた一方、ステアリン酸では認められなかった。したがって、パルミチン酸及びオレイン酸を摂取することによって、線維芽細胞の増殖を抑制できることが示唆された。
【実施例２】
【００４６】
パルミチン酸のマウス線維芽細胞での遺伝子発現に対する効果
１．材料及び方法
細胞培養と、パルミチン酸の添加とは実施例１と同様に行われた。マウス線維芽細胞は、３ｘ１０４個／ｍＬとなるように市販の１２ウェルの培養プレート（３５３０４３、ファルコン、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に播種され、培養された。
【００４７】
Ｉ型コラーゲンα鎖、エラスチン及びマトリクスメタロプロティナーゼ１３の遺伝子発現量の定量
培地はアスピレーターで除去され、各ウェルはそれぞれＰＢＳ ２ｍＬで２回洗浄された。ＲＮＡがＲＮｅａｓｙ Ｐｒｏｔｅｃｔ Ｋｉｔ（７４１０４、株式会社キアゲン）を用いて各ウェルの細胞それぞれから製造者の指示に従って抽出された。ｃＤＮＡが定法に従って作成され、リアルタイムＰＣＲで用いられた。前記リアルタイムＰＣＲには、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ＭａｓｔｅｒＰＬＵＳ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（カタログ番号０３ ５１５ ８８５ ００１、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）が用いられた。Ｉ型コラーゲンα鎖、エラスチン、マトリクスメタロプロティナーゼ１３及び２８Ｓ ｒＲＮＡの遺伝子を増幅するために、配列番号１及び２と、配列番号３及び４と、配列番号５及び６と、配列番号７及び８との順方向及び逆方向プライマーそれぞれが用いられた。ＰＣＲは、９５°Ｃ、１０分間を１回と、９５°Ｃ、１５秒間、６０°Ｃ、５秒間及び７２°Ｃ、５秒間を３５回との反応条件で行われた。Ｉ型コラーゲンα鎖、エラスチン及びマトリクスメタロプロティナーゼ１３の遺伝子発現量は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ．３．５（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）で解析され、２８Ｓ ｒＲＮＡの発現量で標準化された。また、Ｉ型コラーゲンα鎖、エラスチン及びマトリクスメタロプロティナーゼ１３の遺伝子発現率（％）は、各実験条件での遺伝子発現量を、パルミチン酸を添加しない対照群の遺伝子発現量で除算した商の百分率として計算された。
【００４８】
２．結果
（１）Ｉ型コラーゲンα鎖の発現
図４は、マウス線維芽細胞のＩ型コラーゲンα鎖遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、対照群及び実験群それぞれのウェル３個の遺伝子発現を測定し、同一条件で複数回繰り返した実験結果の測定値の標準誤差を示す。また、フィッシャーのＰＬＳＤ検定において、アステリスク（＊）はｐ値が５％未満であることを示す。グラフ中の「ｎ．ｓ．」との記載は、対照と比較して有意差がないことを示す。図４に示されるとおり、１０μＭのパルミチン酸を添加すると、Ｉ型コラーゲンα鎖の遺伝子発現は統計学的に有意に低下した。
【００４９】
（２）エラスチンの発現
図５は、マウス線維芽細胞のエラスチン遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、対照群及び実験群それぞれのウェル３個の遺伝子発現を測定し、同一条件で複数回繰り返した実験結果の測定値の標準誤差を示す。また、フィッシャーのＰＬＳＤ検定において、アステリスク（＊）はｐ値が５％未満であることを示す。グラフ中の「ｎ．ｓ．」との記載は、対照と比較して有意差がないことを示す。図５に示されるとおり、１０μＭのパルミチン酸を添加すると、エラスチンの遺伝子発現は統計学的に有意に低下した。
【００５０】
（３）マトリクスメタロプロティナーゼ１３の発現
図６は、マウス線維芽細胞のマトリクスメタロプロティナーゼ１３遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、対照群及び実験群それぞれのウェル３個の遺伝子発現を測定し、同一条件で複数回繰り返した実験結果の測定値の標準誤差を示す。また、フィッシャーのＰＬＳＤ検定において、アステリスク（＊＊＊）はｐ値が０．１％未満であることを示す。グラフ中の「ｎ．ｓ．」との記載は、対照と比較して有意差がないことを示す。図６に示されるとおり、１０μＭのパルミチン酸を添加すると、マトリクスメタロプロティナーゼ１３の遺伝子発現は統計学的に有意に増大した。
【００５１】
３．結論
本実施例の実験結果から、パルミチン酸には、Ｉ型コラーゲンα鎖及びエラスチンの遺伝子発現の抑制効果と、マトリクスメタロプロティナーゼ１３の遺伝子発現の増大効果とが認められた。なお、オレイン酸及びステアリン酸には、コラーゲン及びエラスチンの遺伝子発現の抑制効果と、マトリクスメタロプロティナーゼ１３の遺伝子発現の増大効果とは認められなかった（データは示されない）。
【実施例３】
【００５２】
パルミチン酸のヒト線維芽細胞増殖抑制効果
１．材料及び方法
細胞培養と、パルミチン酸の添加と、線維芽細胞の細胞増殖率の決定とは実施例１と同様に行われた。ヒト線維芽細胞（ＣＣ−２５０９、Ｌｏｎｚａ Ｊａｐａｎ Ｌｔｄ）が、市販の細胞培養用培地（Ｄ−ＭＥＭ、１１８８５０８４、ＧＩＢＣＯ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）にウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｗｅｓｔ）を１０％添加した培地を用いて６時間培養された。その後、前記ヒト線維芽細胞を培養する培地は、前記細胞培養用培地に前記ウシ胎仔血清を０．５％添加した培地（以下、「ヒト線維芽細胞増殖評価培地」という。）に切り換えられ、前記ヒト線維芽細胞は、３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で１２時間培養された。５μＭ、１０μＭ、２０μＭ及び３０μＭのパルミチン酸（Ｓ−３３、和光純薬工業株式会社）が培養１２時間後のヒト線維芽細胞増殖評価培地に添加された。
【００５３】
２．結果
パルミチン酸添加
図７は、ヒト線維芽細胞の増殖に対するパルミチン酸の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、対照群及び実験群それぞれのウェル３個の細胞増殖を測定し、同一条件で複数回繰り返した実験結果の測定値の標準誤差を示す。また、フィッシャーのＰＬＳＤ検定において、アステリスク（＊）はｐ値が５％未満であり、アステリスク（＊＊＊）はｐ値が０．１％未満であることを示す。図７に示されるとおり、５μＭないし３０μＭのパルミチン酸を添加すると、細胞増殖は、添加されたパルミチン酸の濃度に依存して統計学的に有意に低下した。本実施例の実験結果から、パルミチン酸の増殖抑制効果は、マウス線維芽細胞だけでなく、ヒト線維芽細胞でも認められた。
【実施例４】
【００５４】
パルミチン酸のヒト線維芽細胞での遺伝子発現に対する効果
１．材料及び方法
細胞培養と、パルミチン酸の添加とは実施例１と同様に行われた。３μＭ、１０μＭ及び３０μＭのパルミチン酸が添加された。遺伝子発現量の定量は実施例２と同様に行われた。Ｉ型コラーゲンα鎖、エラスチン、マトリクスメタロプロティナーゼ１の遺伝子を増幅するために、配列番号９及び１０と、配列番号１１及び１２と、配列番号１３及び１４との順方向及び逆方向プライマーそれぞれが用いられた。Ｉ型コラーゲンα鎖、エラスチン及びマトリクスメタロプロティナーゼ１の遺伝子発現率（％）は、各実験条件での遺伝子発現量を、パルミチン酸を添加しない対照群の遺伝子発現量で除算した商の百分率として計算された。
【００５５】
２．結果
（１）Ｉ型コラーゲンα鎖の発現
図８は、ヒト線維芽細胞のＩ型コラーゲンα鎖遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、対照群及び実験群それぞれのウェル３個の遺伝子発現を測定し、同一条件で複数回繰り返した実験結果の測定値の標準誤差を示す。また、フィッシャーのＰＬＳＤ検定において、アステリスク（＊＊＊）はｐ値が０．１％未満であることを示す。グラフ中の「ｎ．ｓ．」との記載は、対照と比較して有意差がないことを示す。図８に示されるとおり、１０μＭ及び３０μＭのパルミチン酸を添加すると、Ｉ型コラーゲンα鎖の遺伝子発現は、添加されたパルミチン酸の濃度に依存して統計学的に有意に低下した。
【００５６】
（２）エラスチンの発現
図９は、ヒト線維芽細胞のエラスチン遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、対照群及び実験群それぞれのウェル３個の遺伝子発現を測定し、同一条件で複数回繰り返した実験結果の測定値の標準誤差を示す。また、フィッシャーのＰＬＳＤ検定において、アステリスク（＊）はｐ値が５％未満であり、アステリスク（＊＊＊）はｐ値が０．１％未満であることを示す。図９に示されるとおり、３μＭないし３０μＭのパルミチン酸を添加すると、エラスチンの遺伝子発現は、添加されたパルミチン酸の濃度に依存して統計学的に有意に低下した。
【００５７】
（３）マトリクスメタロプロティナーゼ１の発現
図１０は、ヒト線維芽細胞のマトリクスメタロプロティナーゼ１遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、対照群及び実験群それぞれのウェル３個の遺伝子発現を測定し、同一条件で複数回繰り返した実験結果の測定値の標準誤差を示す。また、フィッシャーのＰＬＳＤ検定において、アステリスク（＊＊＊）はｐ値が０．１％未満であることを示す。グラフ中の「ｎ．ｓ．」との記載は、対照と比較して有意差がないことを示す。図１０に示されるとおり、１０μＭ及び３０μＭのパルミチン酸を添加すると、マトリクスメタロプロティナーゼ１の遺伝子発現は、添加されたパルミチン酸の濃度に依存して統計学的に有意に増大した。
【００５８】
３．結論
本実施例の実験結果から、パルミチン酸には、Ｉ型コラーゲンα鎖及びエラスチンの遺伝子発現の抑制効果と、マトリクスメタロプロティナーゼ１の遺伝子発現の増大効果とが認められた。したがって、細胞外マトリクス成分産生の亢進による皮膚状態の悪化は、パルミチン酸を摂取することによって予防及び／又は改善できることが示唆された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パルミチン酸等からなる、細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲン、エラスチン等の細胞外マトリクス成分は線維芽細胞で産生される。前記細胞外マトリクス成分産生の亢進、マトリクス分解酵素産生の低下、及び、線維芽細胞数の増加は、さまざまな組織及び器官で線維化を伴う症状を生じさせる。前記線維化を伴う症状には、肺線維症、肝硬変、動脈硬化症、強皮症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症及び間質性腎炎等の疾患症状が含まれる（非特許文献１）。また、前記線維化を伴う症状には、外傷及び術後の肥厚瘢痕等の皮膚状態も含まれる。
【０００３】
従来、前記線維化を伴う症状を改善するため、例えば、副腎脂質ステロイド等の薬剤が使用されている（非特許文献１）。しかし、副腎脂質ステロイドは、免疫力低下、糖尿病等の副作用があり、長期間の使用には適さない。
【０００４】
セルライトは、肥満が進行した人の臀部等の皮膚の表面に見られる皮膚表面の凹陥である。セルライトが発生した皮膚の組織では、皮下脂肪細胞が真皮の結合組織内に突出している。セルライトのある皮膚にコラゲナーゼが注入されると、セルライトが改善することが知られている（特許文献１）。そこでセルライトには、真皮細胞での細胞外マトリクス成分産生の亢進、及び／又は、マトリクス分解酵素産生の低下が関与すると考えられる。
【０００５】
特許文献１に開示されるコラゲナーゼの注入処置では、ヒト以外の生物種由来のコラゲナーゼ、典型的には、細菌のクロストリジウム由来の精製コラゲナーゼが用いられるため、前記処置を繰り返すとアレルギー反応を起こす危険がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００９−５２７５７０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】尹 浩信、医学のあゆみ、２３０：１００８（２００９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、細胞外マトリクス成分の産生抑制、マトリクス分解酵素産生の促進、及び／又は、線維芽細胞増殖の抑制をする作用を有する新規の剤であって、副腎脂質ステロイド及び前記クロストリジウム由来の精製コラゲナーゼのような副作用がなく、安定かつ安全な剤を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、パルミチン酸と、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物からなる、細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤を提供する。本発明は、パルミチン酸と、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物を含む、細胞外マトリクス成分産生抑制、マトリクス分解酵素産生促進、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制のための組成物を提供する。
【００１０】
本発明の剤において、前記細胞外マトリクス成分は、コラーゲン及び／又はエラスチンの場合がある。前記コラーゲンはＩ型コラーゲンα鎖の場合がある。本発明の組成物において、前記細胞外マトリクス成分は、コラーゲン及び／又はエラスチンの場合がある。前記コラーゲンはＩ型コラーゲンα鎖の場合がある。
【００１１】
本発明の剤において、前記マトリクス分解酵素はマトリクスメタロプロティナーゼ１（ＭＭＰ１）の場合がある。本発明の組成物において、前記マトリクス分解酵素はマトリクスメタロプロティナーゼ１（ＭＭＰ１）の場合がある。
【００１２】
本発明は、オレイン酸と、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物からなる、線維芽細胞増殖抑制剤を提供する。本発明は、オレイン酸と、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物を含む、線維芽細胞増殖抑制のための組成物を提供する。
【００１３】
本発明の剤は食品として用いられる場合がある。本発明の組成物は食品として用いられる場合がある。
【００１４】
本発明の剤は化粧品として用いられる場合がある。本発明の組成物は化粧品として用いられる場合がある。
【００１５】
本発明の剤において、前記化粧品はセルライト改善のための化粧品の場合がある。本発明の組成物において、前記化粧品はセルライト改善のための化粧品の場合がある。
【００１６】
本発明の細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤は医薬品として用いられる場合がある。本発明の細胞外マトリクス成分産生抑制、マトリクス分解酵素産生促進、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制のための組成物は医薬品として用いられる場合がある。
【００１７】
本発明の細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤において、前記医薬品は、線維化を伴う症状、あるいはセルライトのための医薬品の場合がある。本発明の細胞外マトリクス成分産生抑制、マトリクス分解酵素産生促進、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制のための組成物において、前記医薬品は、線維化を伴う症状、あるいはセルライトのための医薬品の場合がある。
【００１８】
本発明の細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤において、前記線維化を伴う症状は、肺線維症、肝硬変、動脈硬化症、強皮症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、間質性腎炎、外傷及び術後の肥厚瘢痕からなるグループから選択される場合がある。本発明の細胞外マトリクス成分産生抑制、マトリクス分解酵素産生促進、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制のための組成物において、前記線維化を伴う症状は、肺線維症、肝硬変、動脈硬化症、強皮症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、間質性腎炎、外傷及び術後の肥厚瘢痕からなるグループから選択される場合がある。
【００１９】
本発明の細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤において、前記医薬品は治療剤の場合がある。本発明の細胞外マトリクス成分産生抑制、マトリクス分解酵素産生促進、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制のための組成物において、前記医薬品は治療剤の場合がある。
【００２０】
本発明の細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤において、前記医薬品は予防剤の場合がある。本発明の細胞外マトリクス成分産生抑制、マトリクス分解酵素産生促進、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制のための組成物において、前記医薬品は予防剤の場合がある。
【００２１】
本発明は、パルミチン酸と、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物からなる、細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤を投与するステップを含む、皮膚状態の悪化を予防及び／又は改善する方法を提供する。前記皮膚状態の悪化は、皮膚の粘弾性の低下の場合がある。
【００２２】
本発明は、パルミチン酸と、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物からなる、細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤を投与するステップを含む、線維化を伴う症状、あるいはセルライトを治療及び／又は予防する方法を提供する。前記剤は、治療剤及び予防剤を含む医薬品の場合がある。前記細胞外マトリクス成分は、コラーゲン及び／又はエラスチンの場合がある。前記コラーゲンはＩ型コラーゲンα鎖の場合がある。前記マトリクス分解酵素はマトリクスメタロプロティナーゼ１（ＭＭＰ１）の場合がある。前記線維化を伴う症状は、肺線維症、肝硬変、動脈硬化症、強皮症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、間質性腎炎、外傷及び術後の肥厚瘢痕からなるグループから選択される場合がある。
【００２３】
本発明は、パルミチン酸と、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物からなる、細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤を投与するステップを含む、皮膚の美容状態の悪化を予防及び／又は改善する方法を提供する。前記剤は化粧品の場合がある。前記細胞外マトリクス成分は、コラーゲン及び／又はエラスチンの場合がある。前記コラーゲンはＩ型コラーゲンα鎖の場合がある。前記マトリクス分解酵素はマトリクスメタロプロティナーゼ１（ＭＭＰ１）の場合がある。本発明の皮膚の美容状態の悪化を予防及び／又は改善する方法において、皮膚の美容状態の悪化はセルライトの場合があるが、これに限定されない。
【００２４】
本発明において、セルライト（ｃｅｌｌｕｌｉｔｅ）とは、肥満が進行した人の臀部等の皮膚の表面に見られる皮膚表面の凹陥を伴う皮膚の状態をいう。セルライトが発生した皮膚の組織では、皮下脂肪細胞が真皮の結合組織内に突出する。セルライトは大腿・臀部脂肪異栄養症（ｇｙｎｏｉｄ ｌｉｐｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）ともよばれる。
【００２５】
本発明において、マトリクス分解酵素とは、細胞外マトリクスの構成成分を分解する酵素をいう。マトリクス分解酵素には、マトリクスメタロプロティナーゼ（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＭＭＰ）と総称されるタンパク質分解酵素遺伝子ファミリーに属する酵素が含まれる。マトリクスメタロプロティナーゼは、金属、特に亜鉛と結合し、細胞外マトリクスの構成成分を切断する活性を有する。マトリクスメタロプロティナーゼには２５個以上のファミリーのメンバー酵素が同定されている。マトリクスメタロプロティナーゼのメンバー酵素のアミノ酸及びポリヌクレオチド配列については、ＯＭＩＭ（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ）データベースを含む米国ＮＣＢＩのサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｇｑｕｅｒｙ）から検索することができる。マトリクスメタロプロティナーゼファミリーのメンバーのうち、ヒトＭＭＰ１は、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型のコラーゲンを分解する。ヒトＭＭＰ２及び９はエラスチンを分解する。ヒトＭＭＰ１とマウスＭＭＰ１３とは相同遺伝子である。
【００２６】
本発明においてパルミチン酸の「塩」とは、パルミチン酸が、細胞外マトリクス成分産生を抑制する効果、マトリクス分解酵素産生を促進する効果、及び／又は、線維芽細胞増殖を抑制する効果を損なわないことを条件として、金属塩、アミン塩等を含むいずれかの塩をいう。前記金属塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等を含む場合がある。前記アミン塩は、トリエチルアミン塩、ベンジルアミン塩等を含む場合がある。
【００２７】
本明細書においてパルミチン酸の「誘導体」とは、パルミチン酸が、細胞外マトリクス成分産生を抑制する効果、マトリクス分解酵素産生を促進する効果、及び／又は、線維芽細胞増殖を抑制する効果を損なわないことを条件として、パルミチン酸が、カルボキシル基か、側鎖かにおいて、いずれかの原子団と共有結合したものを指す。前記いずれかの原子団は、Ｎ−フェニルアセチル基、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基等のような保護基と、タンパク質、ペプチド、糖、脂質、核酸等のような生体高分子と、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステル等のような合成高分子と、エステル基等のような官能基とを含むがこれらに限定されない。前記エステル基は、例えば、メチルエステル、エチルエステルその他の脂肪族エステルか、芳香族エステルかを含む場合がある。
【００２８】
本発明のパルミチン酸は、以下の実施例に示すとおり、培養ヒト線維芽細胞に対して１０〜３０μＭの濃度範囲で細胞外マトリクス成分産生を抑制する効果、マトリクス分解酵素産生を促進する効果、及び／又は、５〜３０μＭの濃度範囲で増殖を抑制する効果を有する。したがって、本発明の剤又は組成物に含まれるパルミチン酸の量は、この濃度範囲のパルミチン酸が生体皮膚組織の線維芽細胞に送達されることを条件として、いかなる含有量であってもかまわない。本発明の剤が外用剤の場合におけるパルミチン酸の含有量は、本発明の剤全量中０．０００１質量％から５０質量％か配合可能な最大質量濃度かまでの範囲であればよい。すなわち前記剤が外用剤の場合におけるパルミチン酸の含有量は、０．０００１質量％〜３０質量％が望ましく、０．０００１質量％〜３質量％が最も望ましい。本発明の剤が内服剤の場合におけるパルミチン酸の含有量は、０．０００１質量％〜１００質量％の範囲であればよい。本発明の剤が内服剤の場合におけるパルミチン酸の含有量は、０．０００１質量％〜８０質量％が望ましく、０．０００１質量％〜６０質量％であることが最も望ましい。
【００２９】
本発明の剤は、パルミチン酸、パルミチン酸の塩、及び／又は、生体内で薬物代謝酵素その他によってパルミチン酸を放出できる誘導体に加えて、パルミチン酸の細胞外マトリクス成分産生を抑制する効果、マトリクス分解酵素産生を促進する効果、及び／又は、線維芽細胞増殖を抑制する効果を損なわないことを条件として、さらに１種類又は２種類以上の薬学的に許容される添加物を含む場合がある。前記添加物は、希釈剤及び膨張剤と、結合剤及び接着剤と、滑剤と、流動促進剤と、可塑剤と、崩壊剤と、担体溶媒と、緩衝剤と、着色料と、香料と、甘味料と、防腐剤及び安定化剤と、吸着剤と、当業者に知られたその他の医薬品添加剤とを含むが、これらに限られない。
【００３０】
本発明の剤は、有効成分として、パルミチン酸、パルミチン酸の塩、及び／又は、生体内で薬物代謝酵素その他によってパルミチン酸を放出できる誘導体のみを使用して調製することも可能であるが、通常本発明の効果を損なわない範囲で、医薬部外品を含む化粧品や医薬品等の皮膚外用剤等に用いられる他の成分を、必要に応じて適宜配合することができる。前記他の成分（任意配合成分）としては、例えば、油分、界面活性剤、粉末、色材、水、アルコール類、増粘剤、キレート剤、シリコーン類、酸化防止剤、紫外線吸収剤、保湿剤、香料、各種薬効成分、防腐剤、ｐＨ調整剤、中和剤等が挙げられる。
【００３１】
本発明の剤型は、例えば軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、ジェル剤、貼付剤等の外用剤と、例えば粉末、顆粒、ソフトカプセル、錠剤等の経口剤と、例えば経鼻スプレー等の経鼻剤と、注射剤とを含む、従来の医薬部外品及び医薬品に用いるものであればいかなるものでもかまわない。
【００３２】
本発明の食品は、パルミチン酸、パルミチン酸の塩、及び／又は、生体内で薬物代謝酵素その他によってパルミチン酸を放出できる誘導体に加えて、パルミチン酸の細胞外マトリクス成分産生を抑制する効果、マトリクス分解酵素産生を促進する効果、及び／又は、線維芽細胞増殖を抑制する効果を損なわないことを条件として、調味料、着色料、保存料その他の食品として許容される成分を含む場合がある。
【００３３】
本発明の食品は、例えば、キャンディー、クッキー、味噌、フレンチドレッシング、マヨネーズ、フランスパン、醤油、ヨーグルト、ふりかけ、調味料・納豆のたれ、納豆、もろみ黒酢等の従来食品に用いるものであればいずれでもよく、前記例示に限定されるものでない。
【００３４】
本発明において、線維芽細胞数と、細胞外マトリクスを構成する遺伝子及びマトリクス分解酵素遺伝子の発現量との測定は、美容及び医療分野の当業者に周知のいかなる測定方法を使用して実施されてもかまわない。
【００３５】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】マウス線維芽細胞の増殖に対するパルミチン酸の影響を示す棒グラフ。
【図２】マウス線維芽細胞の増殖に対するオレイン酸の影響を示す棒グラフ。
【図３】マウス線維芽細胞の増殖に対するステアリン酸の影響を示す棒グラフ。
【図４】マウス線維芽細胞のＩ型コラーゲンα鎖遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を示す棒グラフ。
【図５】マウス線維芽細胞のエラスチン遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を示す棒グラフ。
【図６】マウス線維芽細胞のマトリクスメタロプロティナーゼ１３遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を示す棒グラフ。
【図７】ヒト線維芽細胞の増殖に対するパルミチン酸の影響を示す棒グラフ。
【図８】ヒト線維芽細胞のＩ型コラーゲンα鎖遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を示す棒グラフ。
【図９】ヒト線維芽細胞のエラスチン遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を示す棒グラフ。
【図１０】ヒト線維芽細胞のマトリクスメタロプロティナーゼ１遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を示す棒グラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例１】
【００３８】
パルミチン酸のマウス線維芽細胞増殖抑制効果
１．材料及び方法
（１）細胞培養
細胞は、マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞が用いられた。前記細胞は、３ｘ１０４個／ｍＬとなるように市販の２４ウェルの培養プレート（３５３０４７、ファルコン、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に播種され、市販の細胞培養用培地（Ｄ−ＭＥＭ、１１８８５０８４、ＧＩＢＣＯ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）にウシ血清（１６０１０１５９、ＧＩＢＣＯ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を１０％添加した培地を用いて培養された。前記細胞は、３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で６時間培養された。
【００３９】
その後、前記マウス線維芽細胞を培養する培地は、前記細胞培養用培地に前記ウシ血清を０．５％添加した培地（以下、「マウス線維芽細胞増殖評価培地」という。）に切り換えられ、前記マウス線維芽細胞は、３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で１２時間培養された。
【００４０】
（２）飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸の添加
前記線維芽細胞の増殖における飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸の効果を検討する場合には、５μＭ及び１０μＭのパルミチン酸（Ｓ−３３、和光純薬工業株式会社）か、５μＭ及び１０μＭのオレイン酸（０７５０１、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）か、１μＭ、３μＭ及び１０μＭのステアリン酸（Ｓ３３８１、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）かが培養１２時間後のマウス線維芽細胞増殖評価培地に添加され、前記線維芽細胞は、３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で４８時間培養された。これらの飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸を添加しない培地での細胞培養が対照とされた。
【００４１】
（３）線維芽細胞の細胞増殖率の決定
その後、培地にａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標、ＤＡＬ１０２５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を最終濃度１０％となるように添加し、２時間後に、製造者の指示書に従って励起波長５４４ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍで上清の蛍光強度を測定した。細胞増殖率（％）は、各実験条件でのａｌａｍａｒＢｌｕｅの蛍光強度を、飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸を添加しない対照群の蛍光強度で除算した商の百分率として計算された。
【００４２】
２．結果
（１）パルミチン酸添加
図１は、マウス線維芽細胞の増殖に対するパルミチン酸の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、対照群及び実験群それぞれのウェル３個の細胞増殖を測定し、同一条件で複数回繰り返した実験結果の測定値の標準誤差を示す。また、フィッシャーのＰＬＳＤ検定において、アステリスク（＊＊＊）はｐ値が０．１％未満であることを示す。グラフ中の「ｎ．ｓ．」との記載は、対照と比較して有意差がないことを示す。図１に示されるとおり、１０μＭのパルミチン酸を添加すると、細胞増殖は統計学的に有意に低下した。
【００４３】
（２）オレイン酸添加
図２は、マウス線維芽細胞の増殖に対するオレイン酸の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、対照群及び実験群それぞれのウェル３個の細胞増殖を測定し、同一条件で複数回繰り返した実験結果の測定値の標準誤差を示す。また、フィッシャーのＰＬＳＤ検定において、アステリスク（＊＊＊）はｐ値が０．１％未満であり、アステリスク（＊＊）はｐ値が１％未満であることを示す。図２に示されるとおり、５μＭ及び１０μＭのオレイン酸を添加すると、細胞増殖は統計学的に有意に低下した。
【００４４】
（３）ステアリン酸添加
図３は、マウス線維芽細胞の増殖に対するステアリン酸の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、対照群及び実験群それぞれのウェル３個の細胞増殖を測定し、同一条件で複数回繰り返した実験結果の測定値の標準誤差を示す。グラフ中の「ｎ．ｓ．」との記載は、対照と比較して有意差がないことを示す。図３に示されるとおり、１μＭないし１０μＭのステアリン酸の添加では、細胞増殖は統計学的に有意に低下しなかった。
【００４５】
３．結論
本実施例の実験結果から、マウス線維芽細胞の増殖抑制効果は、パルミチン酸及びオレイン酸では認められた一方、ステアリン酸では認められなかった。したがって、パルミチン酸及びオレイン酸を摂取することによって、線維芽細胞の増殖を抑制できることが示唆された。
【実施例２】
【００４６】
パルミチン酸のマウス線維芽細胞での遺伝子発現に対する効果
１．材料及び方法
細胞培養と、パルミチン酸の添加とは実施例１と同様に行われた。マウス線維芽細胞は、３ｘ１０４個／ｍＬとなるように市販の１２ウェルの培養プレート（３５３０４３、ファルコン、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に播種され、培養された。
【００４７】
Ｉ型コラーゲンα鎖、エラスチン及びマトリクスメタロプロティナーゼ１３の遺伝子発現量の定量
培地はアスピレーターで除去され、各ウェルはそれぞれＰＢＳ ２ｍＬで２回洗浄された。ＲＮＡがＲＮｅａｓｙ Ｐｒｏｔｅｃｔ Ｋｉｔ（７４１０４、株式会社キアゲン）を用いて各ウェルの細胞それぞれから製造者の指示に従って抽出された。ｃＤＮＡが定法に従って作成され、リアルタイムＰＣＲで用いられた。前記リアルタイムＰＣＲには、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ＭａｓｔｅｒＰＬＵＳ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（カタログ番号０３ ５１５ ８８５ ００１、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）が用いられた。Ｉ型コラーゲンα鎖、エラスチン、マトリクスメタロプロティナーゼ１３及び２８Ｓ ｒＲＮＡの遺伝子を増幅するために、配列番号１及び２と、配列番号３及び４と、配列番号５及び６と、配列番号７及び８との順方向及び逆方向プライマーそれぞれが用いられた。ＰＣＲは、９５°Ｃ、１０分間を１回と、９５°Ｃ、１５秒間、６０°Ｃ、５秒間及び７２°Ｃ、５秒間を３５回との反応条件で行われた。Ｉ型コラーゲンα鎖、エラスチン及びマトリクスメタロプロティナーゼ１３の遺伝子発現量は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ．３．５（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）で解析され、２８Ｓ ｒＲＮＡの発現量で標準化された。また、Ｉ型コラーゲンα鎖、エラスチン及びマトリクスメタロプロティナーゼ１３の遺伝子発現率（％）は、各実験条件での遺伝子発現量を、パルミチン酸を添加しない対照群の遺伝子発現量で除算した商の百分率として計算された。
【００４８】
２．結果
（１）Ｉ型コラーゲンα鎖の発現
図４は、マウス線維芽細胞のＩ型コラーゲンα鎖遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、対照群及び実験群それぞれのウェル３個の遺伝子発現を測定し、同一条件で複数回繰り返した実験結果の測定値の標準誤差を示す。また、フィッシャーのＰＬＳＤ検定において、アステリスク（＊）はｐ値が５％未満であることを示す。グラフ中の「ｎ．ｓ．」との記載は、対照と比較して有意差がないことを示す。図４に示されるとおり、１０μＭのパルミチン酸を添加すると、Ｉ型コラーゲンα鎖の遺伝子発現は統計学的に有意に低下した。
【００４９】
（２）エラスチンの発現
図５は、マウス線維芽細胞のエラスチン遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、対照群及び実験群それぞれのウェル３個の遺伝子発現を測定し、同一条件で複数回繰り返した実験結果の測定値の標準誤差を示す。また、フィッシャーのＰＬＳＤ検定において、アステリスク（＊）はｐ値が５％未満であることを示す。グラフ中の「ｎ．ｓ．」との記載は、対照と比較して有意差がないことを示す。図５に示されるとおり、１０μＭのパルミチン酸を添加すると、エラスチンの遺伝子発現は統計学的に有意に低下した。
【００５０】
（３）マトリクスメタロプロティナーゼ１３の発現
図６は、マウス線維芽細胞のマトリクスメタロプロティナーゼ１３遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、対照群及び実験群それぞれのウェル３個の遺伝子発現を測定し、同一条件で複数回繰り返した実験結果の測定値の標準誤差を示す。また、フィッシャーのＰＬＳＤ検定において、アステリスク（＊＊＊）はｐ値が０．１％未満であることを示す。グラフ中の「ｎ．ｓ．」との記載は、対照と比較して有意差がないことを示す。図６に示されるとおり、１０μＭのパルミチン酸を添加すると、マトリクスメタロプロティナーゼ１３の遺伝子発現は統計学的に有意に増大した。
【００５１】
３．結論
本実施例の実験結果から、パルミチン酸には、Ｉ型コラーゲンα鎖及びエラスチンの遺伝子発現の抑制効果と、マトリクスメタロプロティナーゼ１３の遺伝子発現の増大効果とが認められた。なお、オレイン酸及びステアリン酸には、コラーゲン及びエラスチンの遺伝子発現の抑制効果と、マトリクスメタロプロティナーゼ１３の遺伝子発現の増大効果とは認められなかった（データは示されない）。
【実施例３】
【００５２】
パルミチン酸のヒト線維芽細胞増殖抑制効果
１．材料及び方法
細胞培養と、パルミチン酸の添加と、線維芽細胞の細胞増殖率の決定とは実施例１と同様に行われた。ヒト線維芽細胞（ＣＣ−２５０９、Ｌｏｎｚａ Ｊａｐａｎ Ｌｔｄ）が、市販の細胞培養用培地（Ｄ−ＭＥＭ、１１８８５０８４、ＧＩＢＣＯ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）にウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｗｅｓｔ）を１０％添加した培地を用いて６時間培養された。その後、前記ヒト線維芽細胞を培養する培地は、前記細胞培養用培地に前記ウシ胎仔血清を０．５％添加した培地（以下、「ヒト線維芽細胞増殖評価培地」という。）に切り換えられ、前記ヒト線維芽細胞は、３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で１２時間培養された。５μＭ、１０μＭ、２０μＭ及び３０μＭのパルミチン酸（Ｓ−３３、和光純薬工業株式会社）が培養１２時間後のヒト線維芽細胞増殖評価培地に添加された。
【００５３】
２．結果
パルミチン酸添加
図７は、ヒト線維芽細胞の増殖に対するパルミチン酸の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、対照群及び実験群それぞれのウェル３個の細胞増殖を測定し、同一条件で複数回繰り返した実験結果の測定値の標準誤差を示す。また、フィッシャーのＰＬＳＤ検定において、アステリスク（＊）はｐ値が５％未満であり、アステリスク（＊＊＊）はｐ値が０．１％未満であることを示す。図７に示されるとおり、５μＭないし３０μＭのパルミチン酸を添加すると、細胞増殖は、添加されたパルミチン酸の濃度に依存して統計学的に有意に低下した。本実施例の実験結果から、パルミチン酸の増殖抑制効果は、マウス線維芽細胞だけでなく、ヒト線維芽細胞でも認められた。
【実施例４】
【００５４】
パルミチン酸のヒト線維芽細胞での遺伝子発現に対する効果
１．材料及び方法
細胞培養と、パルミチン酸の添加とは実施例１と同様に行われた。３μＭ、１０μＭ及び３０μＭのパルミチン酸が添加された。遺伝子発現量の定量は実施例２と同様に行われた。Ｉ型コラーゲンα鎖、エラスチン、マトリクスメタロプロティナーゼ１の遺伝子を増幅するために、配列番号９及び１０と、配列番号１１及び１２と、配列番号１３及び１４との順方向及び逆方向プライマーそれぞれが用いられた。Ｉ型コラーゲンα鎖、エラスチン及びマトリクスメタロプロティナーゼ１の遺伝子発現率（％）は、各実験条件での遺伝子発現量を、パルミチン酸を添加しない対照群の遺伝子発現量で除算した商の百分率として計算された。
【００５５】
２．結果
（１）Ｉ型コラーゲンα鎖の発現
図８は、ヒト線維芽細胞のＩ型コラーゲンα鎖遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、対照群及び実験群それぞれのウェル３個の遺伝子発現を測定し、同一条件で複数回繰り返した実験結果の測定値の標準誤差を示す。また、フィッシャーのＰＬＳＤ検定において、アステリスク（＊＊＊）はｐ値が０．１％未満であることを示す。グラフ中の「ｎ．ｓ．」との記載は、対照と比較して有意差がないことを示す。図８に示されるとおり、１０μＭ及び３０μＭのパルミチン酸を添加すると、Ｉ型コラーゲンα鎖の遺伝子発現は、添加されたパルミチン酸の濃度に依存して統計学的に有意に低下した。
【００５６】
（２）エラスチンの発現
図９は、ヒト線維芽細胞のエラスチン遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、対照群及び実験群それぞれのウェル３個の遺伝子発現を測定し、同一条件で複数回繰り返した実験結果の測定値の標準誤差を示す。また、フィッシャーのＰＬＳＤ検定において、アステリスク（＊）はｐ値が５％未満であり、アステリスク（＊＊＊）はｐ値が０．１％未満であることを示す。図９に示されるとおり、３μＭないし３０μＭのパルミチン酸を添加すると、エラスチンの遺伝子発現は、添加されたパルミチン酸の濃度に依存して統計学的に有意に低下した。
【００５７】
（３）マトリクスメタロプロティナーゼ１の発現
図１０は、ヒト線維芽細胞のマトリクスメタロプロティナーゼ１遺伝子発現におけるパルミチン酸の影響を調べた実験結果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は、対照群及び実験群それぞれのウェル３個の遺伝子発現を測定し、同一条件で複数回繰り返した実験結果の測定値の標準誤差を示す。また、フィッシャーのＰＬＳＤ検定において、アステリスク（＊＊＊）はｐ値が０．１％未満であることを示す。グラフ中の「ｎ．ｓ．」との記載は、対照と比較して有意差がないことを示す。図１０に示されるとおり、１０μＭ及び３０μＭのパルミチン酸を添加すると、マトリクスメタロプロティナーゼ１の遺伝子発現は、添加されたパルミチン酸の濃度に依存して統計学的に有意に増大した。
【００５８】
３．結論
本実施例の実験結果から、パルミチン酸には、Ｉ型コラーゲンα鎖及びエラスチンの遺伝子発現の抑制効果と、マトリクスメタロプロティナーゼ１の遺伝子発現の増大効果とが認められた。したがって、細胞外マトリクス成分産生の亢進による皮膚状態の悪化は、パルミチン酸を摂取することによって予防及び／又は改善できることが示唆された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルミチン酸と、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物からなることを特徴とする、細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
前記細胞外マトリクス成分は、コラーゲン及び／又はエラスチンであることを特徴とする、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
前記マトリクス分解酵素はマトリクスメタロプロティナーゼ１（ＭＭＰ１）であることを特徴とする、請求項１に記載の剤。
【請求項１】
パルミチン酸と、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物からなることを特徴とする、細胞外マトリクス成分産生抑制剤、マトリクス分解酵素産生促進剤、及び／又は、線維芽細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
前記細胞外マトリクス成分は、コラーゲン及び／又はエラスチンであることを特徴とする、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
前記マトリクス分解酵素はマトリクスメタロプロティナーゼ１（ＭＭＰ１）であることを特徴とする、請求項１に記載の剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１２−１４４４９９（Ｐ２０１２−１４４４９９Ａ）
【公開日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４１３（Ｐ２０１１−５４１３）
【出願日】平成２３年１月１４日（２０１１．１．１４）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社 資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月１４日（２０１１．１．１４）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社 資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
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