脂質分解酵素の新規固定化担体
【目的】 エステル類の合成および交換反応に適した高活性な固定化酵素を得るための脂質分解酵素の固定化担体を提供する。
【構成】 １種もしくは２種以上の油性化合物を、水溶性有機溶剤中で、予め担体表面積の吸着分布において、変動係数Ｃ（Ｃ＝σ／ｍ、σ：標準偏差、ｍ：平均吸着量）が0.5 以下であり、吸着量が担体重量の５〜30重量％となるように、担体に均一吸着させてなることを特徴とする脂質分解酵素の新規固定化担体。
【構成】 １種もしくは２種以上の油性化合物を、水溶性有機溶剤中で、予め担体表面積の吸着分布において、変動係数Ｃ（Ｃ＝σ／ｍ、σ：標準偏差、ｍ：平均吸着量）が0.5 以下であり、吸着量が担体重量の５〜30重量％となるように、担体に均一吸着させてなることを特徴とする脂質分解酵素の新規固定化担体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は脂質分解酵素の固定化担体として用いられ、エステル類の合成及び交換反応に適した高活性な固定化酵素を得るための新規固定化担体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】脂質分解酵素の１種であるリパーゼは温和な条件下で反応すること、位置選択性、アルキル選択性等の特異性を有することを利用して油脂及びエステル類の合成・交換反応に利用されている。しかし、これらの反応はリパーゼ本来の加水分解反応と異なり水分の限定された系でのみ進みうる反応である。一方リパーゼのエステル合成活性や交換活性を増大せしめるためには、少量の水分を必要とする。特開昭55−71797 号公報に開示された低水分系の反応では、充分な反応速度が得られず、また反応速度を増大させるために必要以上の水分を与えると、エステルの分解反応が優先的に進行するという問題点がある。また特開昭60−19495 号公報及び特開昭60−203196号公報に開示された、反応を多水分系の分解工程と、水分を除去する合成工程の二段階に分けて行う方法の提案もあるが、後者の合成反応速度は通常のエステル交換速度に比して充分であるとは言えず、工程操作の複雑化も避けられない。以上の問題点を解決し、かつリパーゼを効率的に使用する目的で、リパーゼを固定化する試みが行われてきた。リパーゼの固定化により期待される利点は次の通りである。従来リパーゼを水溶液の状態で使用すると油中に均一に混合・分散することが困難であったが、リパーゼを不溶性担体表面に固定化する事により油中に容易に分散可能となり、かつ担体に適当量の水分を保持できるため、低水分下でのエステル合成・交換反応が行いやすくなる。また触媒としてコストの高いリパーゼの回収再使用がしやすく、エステル合成反応または交換反応の工業的実施においても反応装置の連続化が容易となる等の点である。
【０００３】しかし、以上のような利点を有する固定化酵素においても、リパーゼの合成活性増大のために必要な水分量を保持する事と、逆反応である加水分解の抑制とを両立するには至っていない。例えば、Journal of American oil Chemist's Soc-iety, 第60巻, 291 −294(1983）にも微量な水分を与えた場合加水分解反応が進行することが指摘されている。また、水に代えてグリセリンのような多価アルコールを添加した場合では加水分解反応はある程度抑制されるが、エステル合成・交換反応は遅くなる。また、酵素水分の保持を狙い多孔質担体、高吸水性樹脂をキトサンで包括結合後、粉砕した担体を用いる方法（特開昭59−213390号公報）によっても固定化酵素のエステル合成・交換反応と分解反応を両立させるため、二段階反応法(特開昭60−203196号公報) を採用している。また特開昭60−98984号公報および特開昭61−202688号公報には耐熱性を持ち80℃までの反応が可能なエステル交換、エステル合成を目的とした固定化酵素についての開示もあるが、この固定化方法が有効なのはムコール属の特定のリパーゼのみであり、ムコール属由来のリパーゼを固定化して用いた場合でも、その特徴とする60℃〜80℃という温度では、ジグリセリドの1,2 位から1,3 位への酵素的および非酵素的転移が速く、カカオ脂に類似したグリセリドの２位にオレイン酸を多く含有する対称型油脂の製造を目的とする場合には、よりエステル交換反応速度の速い固定化酵素の開発が望まれる。
【０００４】以上のようにエステル合成及び交換反応においては反応系内の水分を確実にコントロールするか、またはよりエステル合成及び交換活性の高い固定化酵素の開発が望まれる。エステル交換反応についてみると、水分コントロールについては先に述べた二段階反応（特開昭60−203196号公報）においても行われているが、装置的にも煩雑であること、また第１段の分解工程において1,2 −ジグリセリドを選択的、高収率で得ることと、更に第２段で1,2 −ジグリセリドから1,3 −ジグリセリドへの転移をさせることなく、選択的にトリグリセリドを合成することは難しく、特に温度が高くなるほどこの転移の悪影響を抑える事は難しくなり、溶剤の使用等が必要となる制約された条件に限られる。またエステル合成反応についてみると、従来の方法ではほとんどの例がリパーゼを水溶液として使用しており、分解と合成の平衡関係が大きく分解にかたよっており、目的とするエステルの収量は低いものにとどまっている（特開昭51−7754号公報、特開昭61−187795号公報）。しかし固定化酵素によって反応を行えば、より低水分条件下においてもエステル合成が行われ、酵素の回収も容易であるが、この場合においても通常の化学的方法と同等の反応速度を得るためには、より高活性な固定化酵素の開発が望まれる。
【０００５】リパーゼのエステル合成及びエステル交換活性を増加させる方法として、特開昭60−251884号公報に開示されたリパーゼに油脂を加え加水分解反応をさせることにより、油脂と脂肪酸の共存下で固定化を行う方法や、特開昭62−134090号公報に開示された脂肪酸誘導体の共存下に乾燥する方法があるが、こうした方法により得られた固定化リパーゼのエステル合成活性およびエステル交換活性は前述の工業的実施にあたっては実質的には未だ十分であるとは言えない。一方酵素固定化における、活性収率の面から見ると、特開昭52−87293 号公報に開示されたイオン交換樹脂の有機金属誘導体を担体としてリパーゼを固定化する方法や、特開昭53−27787 号公報に開示された多糖類の高級脂肪酸エステルを担体としてリパーゼを固定化する方法、あるいはEur. J. Appl. Microbiol. Bi-otechnol. に記載されたY.Kimura等のイオン交換樹脂にリパーゼを単にイオン結合により固定化する方法等の従来の方法ではいずれも低収率にとどまり、他の挟雑物の共存下でリパーゼのみを選択的に固定化することは極めて困難であると考えられていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは脂質分解酵素の分解活性のみならずエステル合成及びエステル交換活性を増大させる因子について鋭意研究を重ねた結果、１種もしくは２種以上の油性化合物を、水溶性有機溶剤中で、均一に吸着させた担体が、脂質分解酵素の固定化担体として優れ、このような固定化担体を用いて得られる固定化酵素はエステル合成及びエステル交換活性が増大することを見出し、本発明を完成するに到った。即ち、本発明は、１種もしくは２種以上の油性化合物を、水溶性有機溶剤中で、予め担体表面積の吸着分布において、変動係数Ｃ（Ｃ＝σ／ｍ、σ：標準偏差、ｍ：平均吸着量）が0.5 以下であり、吸着量が担体重量の５〜30重量％となるように、担体に均一吸着させてなることを特徴とする脂質分解酵素の新規固定化担体を提供するものである。
【０００７】本発明に用いられる油性化合物としては、脂肪酸、脂肪酸誘導体、アルコール類、エーテル類、カルボニル化合物類及びハロゲン化アルキル類から選ばれた１種もしくは２種以上の油性化合物が挙げられる。
【０００８】本発明の固定化担体を用いて脂質分解酵素を固定化すると、本発明の担体に吸着されている油性化合物が脂質分解酵素に接触結合し、著しく活性化できる事がわかった。これは、前述した様に界面で働く脂質分解酵素は、界面に配向した時に活性を発現する高次構造をとり、この高活性な状態を作り出すのに必要な物質として油性化合物、即ち比較的炭素数の大きな脂肪酸、脂肪酸誘導体、アルコール、エーテル、カルボニル化合物、ハロゲン化アルキル等の様に分子内に親油基と官能基を併せ持つ物質が非常に良好であることが分かった。また、リパーゼ等の脂質分解酵素においては、当然のことながら水と油脂の界面で働くため、水溶液で使用した場合には、界面と水溶液中に酵素の分散する平衡が存在すると考えられ、水溶液中の酵素を全て有効に使用できない。しかし本発明の担体を用いて酵素を固定化することにより、酵素を不溶性担体表面上に並べることができれば、用いた酵素を効率良く利用する事が可能となる。更に本発明の固定化担体のように、油性化合物を予め不溶性担体上に吸着させておくことにより、酵素を含む培養液など他の挟雑蛋白質や他の物質の中から酵素を短時間かつ選択的に高収率で固定化できる。
【０００９】すでに本出願人はこれらの知見を応用して、少量の水と油脂の共存下でリパーゼと不溶性担体を接触させ、界面に配向させると同時に固定化を行うという発明を完成し特許出願した（特開昭60−251884号公報）。しかし、このような従来の方法、即ち、１種または２種以上の油性化合物を水系溶媒中で担体に予め吸着させた場合、油性化合物は、その溶解度から全担体表面と内部に不均一に吸着した。その場合の吸着分布を分散度の指標となる変動係数Ｃ（Ｃ＝σ／ｍ、σ：標準偏差、ｍ：平均吸着量）から計算すると、0.75であったが、本発明の担体のように水溶性有機溶剤中で吸着処理した場合、変動係数は0.5 以下となり、油性化合物を全担体表面と内部に均一に吸着させることが可能となった。
【００１０】図１に、担体重量の15重量％に当たる油性化合物を水系溶媒中で担体に吸着させた場合と、本発明のように水溶性有機溶剤中で担体重量の15重量％に当たる油性化合物を担体に吸着させた場合について、それぞれ担体表面の吸着濃度分布について示した。これにより、水系溶媒中で行ったものは、油性化合物が全担体表面と内部に不均一に吸着し、本発明のものは全担体表面と内部に均一に吸着していることがわかる。
【００１１】本発明の担体は、全担体表面と内部に油性化合物が均一に吸着しており、更に担体表面に油性化合物からなる一定の厚みの層を形成させることができるため、高活性な固定化酵素を製造することができる。更に本発明の新規固定化担体の特徴としては、下記の使用例に示すように、本発明の新規固定化担体にリパーゼを固定化した固定化酵素によるエステル交換において、固定化酵素の含水量が２重量％未満の低水分領域でも従来不可能とされているエステル交換能が十分に発揮できることである。
【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の固定化担体を製造する方法としては、水溶性有機溶剤中に１種または２種以上の油性化合物を分散もしくは溶解させた後、不溶性担体を加えて油性化合物を担体上に吸着させた後、濾別、乾燥させる方法が挙げられる。ここで用いる油性化合物と不溶性担体の比率は、不溶性担体１重量部に対し油性化合物0.05〜0.3 重量部が適当であり、更に好ましくは 0.1〜0.2 重量部が適当である。過剰量の油性化合物は不溶性担体に吸着されず溶液中に遊離して酵素を吸着するため、不溶性担体上への固定化収率の低下を引き起こす事になるため有効ではない。適当な吸着温度としては０〜60℃、好ましくは５〜30℃が適当である。吸着時間としては５分〜２時間が適当である。以上の温度・時間は何れもこれらに限定されるものではない。本発明の固定化担体における油性化合物の吸着量は担体重量の５〜30重量％であり、その場合、吸着分布は変動係数Ｃ＝0.5 以下とし、担体表面に油性化合物からなる一定の厚みの層を形成させるよう均一吸着させることが望ましい。油性化合物の吸着量が５重量％未満であると、リパーゼ等の脂質分解酵素の高活性な構造を維持するのに不十分であり、また高活性発現はできないばかりでなく失活しやすくなる。30重量％を越えると、リパーゼ等の脂質分解酵素と固定化担体表面との接触が不十分となり、脂質分解酵素の安定性が低下し、更に脱離が起こる。また、変動係数Ｃが 0.5を越えると、上記の吸着量が５重量％未満あるいは30重量％を越える状態と同じ部分が担体表面にできることにより失活あるいは脱離が生じる。
【００１３】本発明に用いられる不溶性担体としては、水およびアルコール、各種有機溶剤、油脂類に不溶性の担体なら何れでも良く、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、モレキュラーシーブ、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体、及びセルロースパウダー、ポリビニルアルコール、キトサン、イオン交換樹脂、吸着樹脂、キレート樹脂等の有機高分子等の様なリパーゼ活性に影響を与えず、操作上から物理的・化学的に安定なものであれば何れも使用できる。また担体の形状としては、粉末状、果粒状、繊維状、スポンジ状等種々あるが、そのいずれでも使用できる。特に工程操作上の面からは400 〜1000μm の粒径を有し、細孔径 100〜1500Åの多孔性の担体を用いるのが好適である。特にこの種の固定化担体として、マクロ多孔性の吸着樹脂及びイオン交換樹脂、キレート樹脂があげられる。
【００１４】本発明に用いられる水溶性有機溶剤としては、好ましくはメタノール、エタノール、アセトン等が挙げられる。水溶性有機溶剤の使用量は、不溶性担体１重量部に対して５〜10重量部が適当であるがこれらに限定されるものではない。
【００１５】本発明に用いられる油性化合物としては、脂肪酸、脂肪酸誘導体、アルコール類、エーテル類、カルボニル化合物類及びハロゲン化アルキル類から選ばれたものが特に好ましい。本発明に用いられる脂肪酸としては特に規定はないが、通常自然界に存在する炭素数４〜24の直鎖状の飽和脂肪酸、例としてカプリル酸、ラウリン酸等の他、オレイン酸、リノール酸等の不飽和脂肪酸、リシノール酸等のヒドロキシ脂肪酸、もしくはイソステアリン酸等の化学的合成により得られた分岐脂肪酸等が挙げられる。本発明に用いられる適当な脂肪酸誘導体としては、モノグリセリド、ジグリセリド、及びその誘導体、あるいはプロピレングリコール、ポリグリセリン等の多価アルコール脂肪酸エステル、蔗糖脂肪酸エステル等の糖エステル、ソルビタン脂肪酸エステル等の糖アルコールエステル、燐脂質等が挙げられる。またトリグリセリドそのものでも良い。
【００１６】本発明に用いられるアルコール類としては特に規定はないが、炭素数８〜24の直鎖脂肪族１価アルコール、例としてはオクタノール、ラウリルアルコール等の飽和アルコール、オレイルアルコール等の不飽和アルコール、もしくは５−デカノール、イソステアリルアルコール等の分岐状のものでもよい。さらにヘキサメチレングリコール等の２価アルコールや多価アルコールも有効である。このほかに、アルキル置換フェノール等のフェノール化合物や、コレステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、カンペステロール等のステロール類が挙げられる。又、フィトール、ゲラニオール、ファルネソール、リナロール等のテルペンアルコール類、レチノール、トコフェロール等の脂溶性ビタミン類も有効である。
【００１７】本発明に用いられるエーテル類の例としては、ジオクチルエーテル等の長鎖のエーテル類、チミルアルコール、バチルアルコール等のグリセリルエーテル類、またはグリシジルエーテル等のグリセリド類似化合物、トリエチレングリコールモノメチルエーテル、ポリエチレングリコール等のポリオキシ化合物、前記アルコールのトリメチルシリルエーテル誘導体、ポリメチルシロキサン等のシリコン化合物もよい。本発明に用いられるカルボニル化合物の例としては、2,4 −デカジエナール、デカナール、ヘキサデカナール等の脂肪族アルデヒド類、レチナール等のテルペン系アルデヒド類、２−オクタノン、２−デカノン、オクチルデシルケトン等の脂肪族ケトン類等が挙げられる。本発明に用いられるハロゲン化アルキルの例としては、オレイルクロライド、オクチルクロライド、オクチルブロマイドのような長鎖アルキルハライド等が挙げられる。
【００１８】上記の油性化合物はいずれも常温で液状であることが工程操作上好ましいがこれに限定されるものではない。またこれらは単独で用いてもよいが、適当な組み合せにより一層の効果が発揮される。本発明の担体に固定化される脂質分解酵素としては、リパーゼ、ホスホリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、スフィンゴミエリナーゼ及び各種のエステラーゼが挙げられる。これらのうちリパーゼとしては、位置選択性に優れたリゾプス(Rhizopus)属、アスペルギルス（Aspergillus)属、ムコール(Mucour)属、脂肪酸特異性を有するジオトリケム(Geotrichum)属、特異性を示さないキャンディダ(Candida) 属、シュードモナス (Pseudomonas) 属、ペニシリウム（Penicillium)属、クロモバクテリウム（Chromobacterium)属等の微生物起源のリパーゼ及びすい臓リパーゼ等の動物リパーゼが挙げられる。これらのうち、特に合成活性の増加し易いリパーゼとしては中鎖以上のアルキル基に活性位の強いリゾプス属、ムコール属、クロモバクテリウム属起源のリパーゼが一層好ましい。コレステロールエステラーゼの例としては、キャンディダ(Candida）属等の微生物起源の物が挙げられる。また、ホスホリパーゼの例としては、キャベツ、ピーナッツ、ニンジン等の植物由来の物、及びストレプトマイセス属等の微生物起源の物、苔類由来の物等が挙げられる。
【００１９】本発明の担体を用いて固定化酵素を製造する方法としては、本発明の担体に酵素溶液を加えて接触撹拌させる事により該担体上に脂質分解酵素を吸着固定化し、次いで該溶液より不溶性担体を濾過しイオン交換水または緩衝液により洗浄する方法が挙げられる。酵素は予め水、緩衝溶液等の水性媒体に分散もしくは溶解して用いるか、或いは醗酵液より菌体を除去した濾液をそのまま用いることもできる。
【００２０】不溶性担体上に固定化する酵素量としては、不溶性担体１重量部に対し酵素0.001 〜１重量部（乾燥重量）が適当であるが、これに限定されるものではない。適当な固定化温度としては０〜40℃、好ましくは５〜30℃がよいがこれに限定されるものではない。適当な接触時間としては５分〜５時間程度で良い。
【００２１】こうして得られた固定化酵素は水分５重量％以下に乾燥することが好ましい。このようにして得られた固定化酵素を用いてカラム連続反応を行うには水分１〜２重量％に乾燥することが好ましく、１〜1.5 重量％に乾燥することが更に好ましい。乾燥温度としては室温〜80℃が良く、減圧下での乾燥が乾燥速度の点から好ましいが、これに限定されるものではない。乾燥速度は酵素活性発現上は特に重要ではないが、工程操作上可能な限り速いことが好ましい。
【００２２】酵素は各種緩衝液等の水性媒体に分散もしくは溶解して用いる。この場合に必要に応じて不溶分を遠心分離または濾過等の操作により除去することも有効である。酵素を分散もしくは溶解する溶液のpHは酵素の変性が起きないような範囲であればよく、pH３〜９の範囲が好ましい。緩衝液の種類は特に規定しないが、一般的な酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等を用いることができる。
【００２３】本発明の担体に固定化した固定化酵素を用いたエステル合成反応の例としては、通常のメタノール、エタノール、プロパノール、オレイルアルコール等の１価アルコール、ないしはプロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール及びポリグリセリン等の多価アルコール、またはゲラニオール、シトロネロール、メントール等のテルペンアルコール、あるいはコレステロール等のステロールと炭素数２〜24の脂肪酸とのエステル化反応が挙げられる。
【００２４】また本発明の担体に固定化した固定化酵素を用いたエステル交換反応の例としては、大豆油、オリーブ油、パーム油等の植物油脂、牛脂、豚脂、魚油などの動物油脂のエステル交換反応が挙げられる。これらの油脂は単独で用いてもよいが、２種以上の油脂を用いるか、油脂と高級脂肪酸あるいは油脂と高級脂肪酸の低級アルコールエステル間でエステル交換する事が好ましい。特定の油脂と他の油脂、脂肪酸もしくはその誘導体間でエステル交換する場合、両者の量比は特定の油脂１重量部に対し他の物質は0.05〜20重量部、好ましくは0.1 〜10重量部でないと油脂の改質効果は得られにくい。特に好ましくは、パーム油等の２位にオレイン酸残基を多く有する油脂とステアリン酸とのエステル交換である。この反応においてはステアリン酸の融点が高く、油脂の粘度が高いため、カラム反応で連続エステル交換反応を無溶剤で行なうためには、反応系の温度を60〜90℃に保つ必要がある。本発明の担体を用いた固定化酵素はこの目的に好適であり、また得られる油脂はチョコレート用として有用なものである。
【００２５】
【実施例】以下、本発明について実施例、比較例をもって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２６】実施例１市販の弱アニオン交換樹脂〔フェノールホルムアルデヒド系樹脂、商品名：デュオライト(Duolite)A-568、デュオライト・インターナショナル社製〕50ｇを0.1 Ｎ NaOH 500ml に加え、水洗後、pH５、500mM ，50mMの酢酸緩衝液で緩衝化を行う。濾別乾燥後10％オレイン酸（試薬、東京化成（株）製）エタノール溶液500 mlを加えて30分攪拌した。濾別乾燥して担体を得た。得られた担体のオレイン酸吸着量は15重量％であり、変動係数Ｃ＝0.25であった。得られた担体に、市販のリパーゼ〔リゾプス・ジャポニカス起源のリパーゼ製剤、商品名：リリパーゼＡ−10、ナガセ生化学工業社製〕を50mMのpH５、酢酸緩衝液に予め10％濃度で溶解させたリパーゼ溶液を500 ml加え２時間攪拌し、固定化を行った。次に樹脂を濾別後、pH５、50mM酢酸緩衝液で１時間洗浄後、樹脂を濾別し水分量２％になるよう常温にて減圧乾燥した。濾液中のリパーゼ活性より求めた活性収率は96％となり、加えたリパーゼのほとんどが固定化されていることがわかった。
【００２７】比較例１実施例１の10％オレイン酸エタノール溶液に代えてpH５、50mM酢酸緩衝液に分散させたオレイン酸溶液を使用する以外は実施例１と同様の方法で担体を得た。得られた担体のオレイン酸吸着量は15重量％であり、変動係数Ｃ＝0.75であった。得られた担体を用い実施例１と同様にして固定化リパーゼを得た。濾液中のリパーゼ活性より求めた活性収率は96％となり、加えたリパーゼのほとんどが固定化されていることがわかった。
【００２８】実施例２実施例１において、濾別分離した固定化リパーゼの水分含量を1.5 ％になるように乾燥する以外は実施例１と同様の方法で行い、低含水量の固定化リパーゼを得た。
【００２９】比較例２比較例１において、オレイン酸溶液による処理をせず、濾別分離した固定化リパーゼの水分含量を5.3 ％になるように乾燥する以外は比較例１と同様の方法で行い、固定化リパーゼを得た。
【００３０】使用例流通管型の連続反応装置を用いてエステル交換反応を行った。実施例１〜２及び比較例１〜２で得られた固定化酵素を酵素塔に38ｇ充填し、パーム油中融点部（ヨウ素価32.5、ジグリセリド含量4.6 ％）１重量部に対して1.5 重量部の割合で市販のステアリン酸（商品名：ルナックＳ−90、ステアリン酸純度93％、花王株式会社製）を混合溶解した原料を、水分含量を0.10〜0.11％に調整した後、酵素塔に通液させた（70℃）。反応物のGLC によるトリグリセリド組成、ステアリン酸取り込み率から反応速度定数（Ｋst) を求めた。酵素の活性により酵素塔内の滞留時間を0.23〜1.3 時間の範囲で流量を操作しエステル交換活性を測定した。結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
【発明の効果】本発明の担体は、油性化合物を担体表面及び内部に均一に吸着し、更に担体表面に油性化合物からなる一定の厚みの層を形成させているため、高活性な固定化酵素を製造でき、リパーゼ等の脂質分解酵素の持つ合成活性を十分に発揮させることができる。更に従来困難と考えられていた固定化酵素含水量２％未満でも十分なエステル交換能を発揮できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】担体重量の15重量％に当たる油性化合物を水系溶媒中で担体に吸着させた場合と、本発明のように水溶性有機溶剤中で担体重量の15重量％に当たる油性化合物を担体に吸着させた場合について、それぞれ担体表面の吸着濃度分布を示す図である。
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は脂質分解酵素の固定化担体として用いられ、エステル類の合成及び交換反応に適した高活性な固定化酵素を得るための新規固定化担体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】脂質分解酵素の１種であるリパーゼは温和な条件下で反応すること、位置選択性、アルキル選択性等の特異性を有することを利用して油脂及びエステル類の合成・交換反応に利用されている。しかし、これらの反応はリパーゼ本来の加水分解反応と異なり水分の限定された系でのみ進みうる反応である。一方リパーゼのエステル合成活性や交換活性を増大せしめるためには、少量の水分を必要とする。特開昭55−71797 号公報に開示された低水分系の反応では、充分な反応速度が得られず、また反応速度を増大させるために必要以上の水分を与えると、エステルの分解反応が優先的に進行するという問題点がある。また特開昭60−19495 号公報及び特開昭60−203196号公報に開示された、反応を多水分系の分解工程と、水分を除去する合成工程の二段階に分けて行う方法の提案もあるが、後者の合成反応速度は通常のエステル交換速度に比して充分であるとは言えず、工程操作の複雑化も避けられない。以上の問題点を解決し、かつリパーゼを効率的に使用する目的で、リパーゼを固定化する試みが行われてきた。リパーゼの固定化により期待される利点は次の通りである。従来リパーゼを水溶液の状態で使用すると油中に均一に混合・分散することが困難であったが、リパーゼを不溶性担体表面に固定化する事により油中に容易に分散可能となり、かつ担体に適当量の水分を保持できるため、低水分下でのエステル合成・交換反応が行いやすくなる。また触媒としてコストの高いリパーゼの回収再使用がしやすく、エステル合成反応または交換反応の工業的実施においても反応装置の連続化が容易となる等の点である。
【０００３】しかし、以上のような利点を有する固定化酵素においても、リパーゼの合成活性増大のために必要な水分量を保持する事と、逆反応である加水分解の抑制とを両立するには至っていない。例えば、Journal of American oil Chemist's Soc-iety, 第60巻, 291 −294(1983）にも微量な水分を与えた場合加水分解反応が進行することが指摘されている。また、水に代えてグリセリンのような多価アルコールを添加した場合では加水分解反応はある程度抑制されるが、エステル合成・交換反応は遅くなる。また、酵素水分の保持を狙い多孔質担体、高吸水性樹脂をキトサンで包括結合後、粉砕した担体を用いる方法（特開昭59−213390号公報）によっても固定化酵素のエステル合成・交換反応と分解反応を両立させるため、二段階反応法(特開昭60−203196号公報) を採用している。また特開昭60−98984号公報および特開昭61−202688号公報には耐熱性を持ち80℃までの反応が可能なエステル交換、エステル合成を目的とした固定化酵素についての開示もあるが、この固定化方法が有効なのはムコール属の特定のリパーゼのみであり、ムコール属由来のリパーゼを固定化して用いた場合でも、その特徴とする60℃〜80℃という温度では、ジグリセリドの1,2 位から1,3 位への酵素的および非酵素的転移が速く、カカオ脂に類似したグリセリドの２位にオレイン酸を多く含有する対称型油脂の製造を目的とする場合には、よりエステル交換反応速度の速い固定化酵素の開発が望まれる。
【０００４】以上のようにエステル合成及び交換反応においては反応系内の水分を確実にコントロールするか、またはよりエステル合成及び交換活性の高い固定化酵素の開発が望まれる。エステル交換反応についてみると、水分コントロールについては先に述べた二段階反応（特開昭60−203196号公報）においても行われているが、装置的にも煩雑であること、また第１段の分解工程において1,2 −ジグリセリドを選択的、高収率で得ることと、更に第２段で1,2 −ジグリセリドから1,3 −ジグリセリドへの転移をさせることなく、選択的にトリグリセリドを合成することは難しく、特に温度が高くなるほどこの転移の悪影響を抑える事は難しくなり、溶剤の使用等が必要となる制約された条件に限られる。またエステル合成反応についてみると、従来の方法ではほとんどの例がリパーゼを水溶液として使用しており、分解と合成の平衡関係が大きく分解にかたよっており、目的とするエステルの収量は低いものにとどまっている（特開昭51−7754号公報、特開昭61−187795号公報）。しかし固定化酵素によって反応を行えば、より低水分条件下においてもエステル合成が行われ、酵素の回収も容易であるが、この場合においても通常の化学的方法と同等の反応速度を得るためには、より高活性な固定化酵素の開発が望まれる。
【０００５】リパーゼのエステル合成及びエステル交換活性を増加させる方法として、特開昭60−251884号公報に開示されたリパーゼに油脂を加え加水分解反応をさせることにより、油脂と脂肪酸の共存下で固定化を行う方法や、特開昭62−134090号公報に開示された脂肪酸誘導体の共存下に乾燥する方法があるが、こうした方法により得られた固定化リパーゼのエステル合成活性およびエステル交換活性は前述の工業的実施にあたっては実質的には未だ十分であるとは言えない。一方酵素固定化における、活性収率の面から見ると、特開昭52−87293 号公報に開示されたイオン交換樹脂の有機金属誘導体を担体としてリパーゼを固定化する方法や、特開昭53−27787 号公報に開示された多糖類の高級脂肪酸エステルを担体としてリパーゼを固定化する方法、あるいはEur. J. Appl. Microbiol. Bi-otechnol. に記載されたY.Kimura等のイオン交換樹脂にリパーゼを単にイオン結合により固定化する方法等の従来の方法ではいずれも低収率にとどまり、他の挟雑物の共存下でリパーゼのみを選択的に固定化することは極めて困難であると考えられていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは脂質分解酵素の分解活性のみならずエステル合成及びエステル交換活性を増大させる因子について鋭意研究を重ねた結果、１種もしくは２種以上の油性化合物を、水溶性有機溶剤中で、均一に吸着させた担体が、脂質分解酵素の固定化担体として優れ、このような固定化担体を用いて得られる固定化酵素はエステル合成及びエステル交換活性が増大することを見出し、本発明を完成するに到った。即ち、本発明は、１種もしくは２種以上の油性化合物を、水溶性有機溶剤中で、予め担体表面積の吸着分布において、変動係数Ｃ（Ｃ＝σ／ｍ、σ：標準偏差、ｍ：平均吸着量）が0.5 以下であり、吸着量が担体重量の５〜30重量％となるように、担体に均一吸着させてなることを特徴とする脂質分解酵素の新規固定化担体を提供するものである。
【０００７】本発明に用いられる油性化合物としては、脂肪酸、脂肪酸誘導体、アルコール類、エーテル類、カルボニル化合物類及びハロゲン化アルキル類から選ばれた１種もしくは２種以上の油性化合物が挙げられる。
【０００８】本発明の固定化担体を用いて脂質分解酵素を固定化すると、本発明の担体に吸着されている油性化合物が脂質分解酵素に接触結合し、著しく活性化できる事がわかった。これは、前述した様に界面で働く脂質分解酵素は、界面に配向した時に活性を発現する高次構造をとり、この高活性な状態を作り出すのに必要な物質として油性化合物、即ち比較的炭素数の大きな脂肪酸、脂肪酸誘導体、アルコール、エーテル、カルボニル化合物、ハロゲン化アルキル等の様に分子内に親油基と官能基を併せ持つ物質が非常に良好であることが分かった。また、リパーゼ等の脂質分解酵素においては、当然のことながら水と油脂の界面で働くため、水溶液で使用した場合には、界面と水溶液中に酵素の分散する平衡が存在すると考えられ、水溶液中の酵素を全て有効に使用できない。しかし本発明の担体を用いて酵素を固定化することにより、酵素を不溶性担体表面上に並べることができれば、用いた酵素を効率良く利用する事が可能となる。更に本発明の固定化担体のように、油性化合物を予め不溶性担体上に吸着させておくことにより、酵素を含む培養液など他の挟雑蛋白質や他の物質の中から酵素を短時間かつ選択的に高収率で固定化できる。
【０００９】すでに本出願人はこれらの知見を応用して、少量の水と油脂の共存下でリパーゼと不溶性担体を接触させ、界面に配向させると同時に固定化を行うという発明を完成し特許出願した（特開昭60−251884号公報）。しかし、このような従来の方法、即ち、１種または２種以上の油性化合物を水系溶媒中で担体に予め吸着させた場合、油性化合物は、その溶解度から全担体表面と内部に不均一に吸着した。その場合の吸着分布を分散度の指標となる変動係数Ｃ（Ｃ＝σ／ｍ、σ：標準偏差、ｍ：平均吸着量）から計算すると、0.75であったが、本発明の担体のように水溶性有機溶剤中で吸着処理した場合、変動係数は0.5 以下となり、油性化合物を全担体表面と内部に均一に吸着させることが可能となった。
【００１０】図１に、担体重量の15重量％に当たる油性化合物を水系溶媒中で担体に吸着させた場合と、本発明のように水溶性有機溶剤中で担体重量の15重量％に当たる油性化合物を担体に吸着させた場合について、それぞれ担体表面の吸着濃度分布について示した。これにより、水系溶媒中で行ったものは、油性化合物が全担体表面と内部に不均一に吸着し、本発明のものは全担体表面と内部に均一に吸着していることがわかる。
【００１１】本発明の担体は、全担体表面と内部に油性化合物が均一に吸着しており、更に担体表面に油性化合物からなる一定の厚みの層を形成させることができるため、高活性な固定化酵素を製造することができる。更に本発明の新規固定化担体の特徴としては、下記の使用例に示すように、本発明の新規固定化担体にリパーゼを固定化した固定化酵素によるエステル交換において、固定化酵素の含水量が２重量％未満の低水分領域でも従来不可能とされているエステル交換能が十分に発揮できることである。
【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の固定化担体を製造する方法としては、水溶性有機溶剤中に１種または２種以上の油性化合物を分散もしくは溶解させた後、不溶性担体を加えて油性化合物を担体上に吸着させた後、濾別、乾燥させる方法が挙げられる。ここで用いる油性化合物と不溶性担体の比率は、不溶性担体１重量部に対し油性化合物0.05〜0.3 重量部が適当であり、更に好ましくは 0.1〜0.2 重量部が適当である。過剰量の油性化合物は不溶性担体に吸着されず溶液中に遊離して酵素を吸着するため、不溶性担体上への固定化収率の低下を引き起こす事になるため有効ではない。適当な吸着温度としては０〜60℃、好ましくは５〜30℃が適当である。吸着時間としては５分〜２時間が適当である。以上の温度・時間は何れもこれらに限定されるものではない。本発明の固定化担体における油性化合物の吸着量は担体重量の５〜30重量％であり、その場合、吸着分布は変動係数Ｃ＝0.5 以下とし、担体表面に油性化合物からなる一定の厚みの層を形成させるよう均一吸着させることが望ましい。油性化合物の吸着量が５重量％未満であると、リパーゼ等の脂質分解酵素の高活性な構造を維持するのに不十分であり、また高活性発現はできないばかりでなく失活しやすくなる。30重量％を越えると、リパーゼ等の脂質分解酵素と固定化担体表面との接触が不十分となり、脂質分解酵素の安定性が低下し、更に脱離が起こる。また、変動係数Ｃが 0.5を越えると、上記の吸着量が５重量％未満あるいは30重量％を越える状態と同じ部分が担体表面にできることにより失活あるいは脱離が生じる。
【００１３】本発明に用いられる不溶性担体としては、水およびアルコール、各種有機溶剤、油脂類に不溶性の担体なら何れでも良く、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、モレキュラーシーブ、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体、及びセルロースパウダー、ポリビニルアルコール、キトサン、イオン交換樹脂、吸着樹脂、キレート樹脂等の有機高分子等の様なリパーゼ活性に影響を与えず、操作上から物理的・化学的に安定なものであれば何れも使用できる。また担体の形状としては、粉末状、果粒状、繊維状、スポンジ状等種々あるが、そのいずれでも使用できる。特に工程操作上の面からは400 〜1000μm の粒径を有し、細孔径 100〜1500Åの多孔性の担体を用いるのが好適である。特にこの種の固定化担体として、マクロ多孔性の吸着樹脂及びイオン交換樹脂、キレート樹脂があげられる。
【００１４】本発明に用いられる水溶性有機溶剤としては、好ましくはメタノール、エタノール、アセトン等が挙げられる。水溶性有機溶剤の使用量は、不溶性担体１重量部に対して５〜10重量部が適当であるがこれらに限定されるものではない。
【００１５】本発明に用いられる油性化合物としては、脂肪酸、脂肪酸誘導体、アルコール類、エーテル類、カルボニル化合物類及びハロゲン化アルキル類から選ばれたものが特に好ましい。本発明に用いられる脂肪酸としては特に規定はないが、通常自然界に存在する炭素数４〜24の直鎖状の飽和脂肪酸、例としてカプリル酸、ラウリン酸等の他、オレイン酸、リノール酸等の不飽和脂肪酸、リシノール酸等のヒドロキシ脂肪酸、もしくはイソステアリン酸等の化学的合成により得られた分岐脂肪酸等が挙げられる。本発明に用いられる適当な脂肪酸誘導体としては、モノグリセリド、ジグリセリド、及びその誘導体、あるいはプロピレングリコール、ポリグリセリン等の多価アルコール脂肪酸エステル、蔗糖脂肪酸エステル等の糖エステル、ソルビタン脂肪酸エステル等の糖アルコールエステル、燐脂質等が挙げられる。またトリグリセリドそのものでも良い。
【００１６】本発明に用いられるアルコール類としては特に規定はないが、炭素数８〜24の直鎖脂肪族１価アルコール、例としてはオクタノール、ラウリルアルコール等の飽和アルコール、オレイルアルコール等の不飽和アルコール、もしくは５−デカノール、イソステアリルアルコール等の分岐状のものでもよい。さらにヘキサメチレングリコール等の２価アルコールや多価アルコールも有効である。このほかに、アルキル置換フェノール等のフェノール化合物や、コレステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、カンペステロール等のステロール類が挙げられる。又、フィトール、ゲラニオール、ファルネソール、リナロール等のテルペンアルコール類、レチノール、トコフェロール等の脂溶性ビタミン類も有効である。
【００１７】本発明に用いられるエーテル類の例としては、ジオクチルエーテル等の長鎖のエーテル類、チミルアルコール、バチルアルコール等のグリセリルエーテル類、またはグリシジルエーテル等のグリセリド類似化合物、トリエチレングリコールモノメチルエーテル、ポリエチレングリコール等のポリオキシ化合物、前記アルコールのトリメチルシリルエーテル誘導体、ポリメチルシロキサン等のシリコン化合物もよい。本発明に用いられるカルボニル化合物の例としては、2,4 −デカジエナール、デカナール、ヘキサデカナール等の脂肪族アルデヒド類、レチナール等のテルペン系アルデヒド類、２−オクタノン、２−デカノン、オクチルデシルケトン等の脂肪族ケトン類等が挙げられる。本発明に用いられるハロゲン化アルキルの例としては、オレイルクロライド、オクチルクロライド、オクチルブロマイドのような長鎖アルキルハライド等が挙げられる。
【００１８】上記の油性化合物はいずれも常温で液状であることが工程操作上好ましいがこれに限定されるものではない。またこれらは単独で用いてもよいが、適当な組み合せにより一層の効果が発揮される。本発明の担体に固定化される脂質分解酵素としては、リパーゼ、ホスホリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、スフィンゴミエリナーゼ及び各種のエステラーゼが挙げられる。これらのうちリパーゼとしては、位置選択性に優れたリゾプス(Rhizopus)属、アスペルギルス（Aspergillus)属、ムコール(Mucour)属、脂肪酸特異性を有するジオトリケム(Geotrichum)属、特異性を示さないキャンディダ(Candida) 属、シュードモナス (Pseudomonas) 属、ペニシリウム（Penicillium)属、クロモバクテリウム（Chromobacterium)属等の微生物起源のリパーゼ及びすい臓リパーゼ等の動物リパーゼが挙げられる。これらのうち、特に合成活性の増加し易いリパーゼとしては中鎖以上のアルキル基に活性位の強いリゾプス属、ムコール属、クロモバクテリウム属起源のリパーゼが一層好ましい。コレステロールエステラーゼの例としては、キャンディダ(Candida）属等の微生物起源の物が挙げられる。また、ホスホリパーゼの例としては、キャベツ、ピーナッツ、ニンジン等の植物由来の物、及びストレプトマイセス属等の微生物起源の物、苔類由来の物等が挙げられる。
【００１９】本発明の担体を用いて固定化酵素を製造する方法としては、本発明の担体に酵素溶液を加えて接触撹拌させる事により該担体上に脂質分解酵素を吸着固定化し、次いで該溶液より不溶性担体を濾過しイオン交換水または緩衝液により洗浄する方法が挙げられる。酵素は予め水、緩衝溶液等の水性媒体に分散もしくは溶解して用いるか、或いは醗酵液より菌体を除去した濾液をそのまま用いることもできる。
【００２０】不溶性担体上に固定化する酵素量としては、不溶性担体１重量部に対し酵素0.001 〜１重量部（乾燥重量）が適当であるが、これに限定されるものではない。適当な固定化温度としては０〜40℃、好ましくは５〜30℃がよいがこれに限定されるものではない。適当な接触時間としては５分〜５時間程度で良い。
【００２１】こうして得られた固定化酵素は水分５重量％以下に乾燥することが好ましい。このようにして得られた固定化酵素を用いてカラム連続反応を行うには水分１〜２重量％に乾燥することが好ましく、１〜1.5 重量％に乾燥することが更に好ましい。乾燥温度としては室温〜80℃が良く、減圧下での乾燥が乾燥速度の点から好ましいが、これに限定されるものではない。乾燥速度は酵素活性発現上は特に重要ではないが、工程操作上可能な限り速いことが好ましい。
【００２２】酵素は各種緩衝液等の水性媒体に分散もしくは溶解して用いる。この場合に必要に応じて不溶分を遠心分離または濾過等の操作により除去することも有効である。酵素を分散もしくは溶解する溶液のpHは酵素の変性が起きないような範囲であればよく、pH３〜９の範囲が好ましい。緩衝液の種類は特に規定しないが、一般的な酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等を用いることができる。
【００２３】本発明の担体に固定化した固定化酵素を用いたエステル合成反応の例としては、通常のメタノール、エタノール、プロパノール、オレイルアルコール等の１価アルコール、ないしはプロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール及びポリグリセリン等の多価アルコール、またはゲラニオール、シトロネロール、メントール等のテルペンアルコール、あるいはコレステロール等のステロールと炭素数２〜24の脂肪酸とのエステル化反応が挙げられる。
【００２４】また本発明の担体に固定化した固定化酵素を用いたエステル交換反応の例としては、大豆油、オリーブ油、パーム油等の植物油脂、牛脂、豚脂、魚油などの動物油脂のエステル交換反応が挙げられる。これらの油脂は単独で用いてもよいが、２種以上の油脂を用いるか、油脂と高級脂肪酸あるいは油脂と高級脂肪酸の低級アルコールエステル間でエステル交換する事が好ましい。特定の油脂と他の油脂、脂肪酸もしくはその誘導体間でエステル交換する場合、両者の量比は特定の油脂１重量部に対し他の物質は0.05〜20重量部、好ましくは0.1 〜10重量部でないと油脂の改質効果は得られにくい。特に好ましくは、パーム油等の２位にオレイン酸残基を多く有する油脂とステアリン酸とのエステル交換である。この反応においてはステアリン酸の融点が高く、油脂の粘度が高いため、カラム反応で連続エステル交換反応を無溶剤で行なうためには、反応系の温度を60〜90℃に保つ必要がある。本発明の担体を用いた固定化酵素はこの目的に好適であり、また得られる油脂はチョコレート用として有用なものである。
【００２５】
【実施例】以下、本発明について実施例、比較例をもって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２６】実施例１市販の弱アニオン交換樹脂〔フェノールホルムアルデヒド系樹脂、商品名：デュオライト(Duolite)A-568、デュオライト・インターナショナル社製〕50ｇを0.1 Ｎ NaOH 500ml に加え、水洗後、pH５、500mM ，50mMの酢酸緩衝液で緩衝化を行う。濾別乾燥後10％オレイン酸（試薬、東京化成（株）製）エタノール溶液500 mlを加えて30分攪拌した。濾別乾燥して担体を得た。得られた担体のオレイン酸吸着量は15重量％であり、変動係数Ｃ＝0.25であった。得られた担体に、市販のリパーゼ〔リゾプス・ジャポニカス起源のリパーゼ製剤、商品名：リリパーゼＡ−10、ナガセ生化学工業社製〕を50mMのpH５、酢酸緩衝液に予め10％濃度で溶解させたリパーゼ溶液を500 ml加え２時間攪拌し、固定化を行った。次に樹脂を濾別後、pH５、50mM酢酸緩衝液で１時間洗浄後、樹脂を濾別し水分量２％になるよう常温にて減圧乾燥した。濾液中のリパーゼ活性より求めた活性収率は96％となり、加えたリパーゼのほとんどが固定化されていることがわかった。
【００２７】比較例１実施例１の10％オレイン酸エタノール溶液に代えてpH５、50mM酢酸緩衝液に分散させたオレイン酸溶液を使用する以外は実施例１と同様の方法で担体を得た。得られた担体のオレイン酸吸着量は15重量％であり、変動係数Ｃ＝0.75であった。得られた担体を用い実施例１と同様にして固定化リパーゼを得た。濾液中のリパーゼ活性より求めた活性収率は96％となり、加えたリパーゼのほとんどが固定化されていることがわかった。
【００２８】実施例２実施例１において、濾別分離した固定化リパーゼの水分含量を1.5 ％になるように乾燥する以外は実施例１と同様の方法で行い、低含水量の固定化リパーゼを得た。
【００２９】比較例２比較例１において、オレイン酸溶液による処理をせず、濾別分離した固定化リパーゼの水分含量を5.3 ％になるように乾燥する以外は比較例１と同様の方法で行い、固定化リパーゼを得た。
【００３０】使用例流通管型の連続反応装置を用いてエステル交換反応を行った。実施例１〜２及び比較例１〜２で得られた固定化酵素を酵素塔に38ｇ充填し、パーム油中融点部（ヨウ素価32.5、ジグリセリド含量4.6 ％）１重量部に対して1.5 重量部の割合で市販のステアリン酸（商品名：ルナックＳ−90、ステアリン酸純度93％、花王株式会社製）を混合溶解した原料を、水分含量を0.10〜0.11％に調整した後、酵素塔に通液させた（70℃）。反応物のGLC によるトリグリセリド組成、ステアリン酸取り込み率から反応速度定数（Ｋst) を求めた。酵素の活性により酵素塔内の滞留時間を0.23〜1.3 時間の範囲で流量を操作しエステル交換活性を測定した。結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
【発明の効果】本発明の担体は、油性化合物を担体表面及び内部に均一に吸着し、更に担体表面に油性化合物からなる一定の厚みの層を形成させているため、高活性な固定化酵素を製造でき、リパーゼ等の脂質分解酵素の持つ合成活性を十分に発揮させることができる。更に従来困難と考えられていた固定化酵素含水量２％未満でも十分なエステル交換能を発揮できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】担体重量の15重量％に当たる油性化合物を水系溶媒中で担体に吸着させた場合と、本発明のように水溶性有機溶剤中で担体重量の15重量％に当たる油性化合物を担体に吸着させた場合について、それぞれ担体表面の吸着濃度分布を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 １種もしくは２種以上の油性化合物を、水溶性有機溶剤中で、予め担体表面積の吸着分布において、変動係数Ｃ（Ｃ＝σ／ｍ、σ：標準偏差、ｍ：平均吸着量）が0.5 以下であり、吸着量が担体重量の５〜30重量％となるように、担体に均一吸着させてなることを特徴とする脂質分解酵素の新規固定化担体。
【請求項２】 油性化合物が、脂肪酸、脂肪酸誘導体、アルコール類、エーテル類、カルボニル化合物類及びハロゲン化アルキル類から選ばれたものである請求項１記載の新規固定化担体。
【請求項１】 １種もしくは２種以上の油性化合物を、水溶性有機溶剤中で、予め担体表面積の吸着分布において、変動係数Ｃ（Ｃ＝σ／ｍ、σ：標準偏差、ｍ：平均吸着量）が0.5 以下であり、吸着量が担体重量の５〜30重量％となるように、担体に均一吸着させてなることを特徴とする脂質分解酵素の新規固定化担体。
【請求項２】 油性化合物が、脂肪酸、脂肪酸誘導体、アルコール類、エーテル類、カルボニル化合物類及びハロゲン化アルキル類から選ばれたものである請求項１記載の新規固定化担体。
【図１】
【公開番号】特開平５−３３６９６７
【公開日】平成５年（１９９３）１２月２１日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平４−１５１９６５
【出願日】平成４年（１９９２）６月１１日
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【公開日】平成５年（１９９３）１２月２１日
【国際特許分類】
【出願日】平成４年（１９９２）６月１１日
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
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