脳梗塞の改善又は発症防止薬

【課題】急性期脳梗塞に対する新たな治療薬を提供することにある。
【解決手段】ヒト由来の細胞から精製されたＨＳＰ２７タンパク質を有効成分とする脳梗塞の改善及び／又は発症防止薬。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳梗塞改善薬及び／又は脳梗塞発症防止薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳梗塞は、脳血管が閉塞又は狭窄することにより、脳虚血を来たし、脳組織が壊死した状態をいう。脳梗塞の原因は、主に血栓性、塞栓性及び血行力学性に分けられ、具体的にはアテローム血栓性脳梗塞、心原性脳梗塞、ラクナ梗塞、その他に分けられる。いずれの場合も、閉塞又は狭窄した脳血管の下流の細胞が壊死するため、麻痺、言語障害、失明、めまい、失調、意識障害、高次脳機能障害を生じ、死に至ることも多い。
【０００３】
脳梗塞部位では、炎症関連物質や酸化ストレス、小胞体ストレス等により神経細胞やグリア細胞が障害され、脳梗塞巣が広範囲に伸展する。脳梗塞は、中枢神経機能障害を主徴とする神経変性疾患であり、神経細胞の変性・壊死に続く梗塞巣形成にいたる急性期脳梗塞と、梗塞巣形成から中枢神経障害の固定にいたる亜慢性期・慢性期脳梗塞とに病理学的・組織学的に分類される。急性期脳梗塞治療として現在有効性が確立しているものは、発症３時間以内を限度とする組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）による血栓除去と、発症２４時間を限度とするエダラボンによるラジカル消去とがあるのみである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、急性期脳梗塞に対する新たな治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者は、ラットの脳梗塞モデルを用いて急性期脳梗塞巣の形成、拡大を防止できる薬剤のスクリーニングをしてきたところ、ヒト由来の細胞から精製されたＨＳＰ２７タンパク質の投与により、脳梗塞の形成、拡大が抑制され、神経障害が軽減できることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、ヒト由来の細胞から精製されたＨＳＰ２７タンパク質を有効成分とする脳梗塞の改善及び／又は発症防止薬を提供することにある。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、急性期脳梗塞に投与することにより、脳梗塞巣の拡大を防止できる結果、麻痺、言語障害、記憶障害等の中枢神経系障害を改善することができる。また、その発症防止も可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＨＳＰ投与群の脳梗塞部の染色像を示す。点線部が梗塞巣である。
【図２】ＨＳＰ非投与群の脳梗塞巣の染色像を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の脳梗塞改善薬及び／又は発症防止薬の有効成分は、ヒト由来の細胞から精製されたＨＳＰタンパク質である。ＨＳＰ２７タンパク質は、細胞が熱等のストレス条件下にさらされた際に発現が上昇して細胞を保護するタンパク質の一種であり、分子量２０〜３０万のものである。ＨＳＰ２７は、分子シャペロン機能を有しており、抗酸化ストレス、抗アポトーシス等の作用を有することが知られている。
【００１０】
本発明で用いるＨＳＰ２７は、ヒト由来の細胞から精製されたものであり、合成ＨＳＰ２７に比べて脳梗塞改善効果が顕著に高い。本発明で用いるヒト由来の細胞としては、ヒト血球及びヒト由来培養細胞が挙げられる。ヒト血球としては、リンパ球等が用いられる。またヒト由来培養細胞としては、神経芽腫細胞であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ、単核細胞（骨髄由来）等が挙げられる。
【００１１】
ヒト由来細胞からＨＳＰ２７タンパク質を採取するには、抗ＨＳＰ抗体を用いたアフィニティーカラムにより精製採取するのが好ましい。アフィニティーカラムに充填することができる抗ＨＳＰ抗体としては、ラット、ウサギ等の哺乳動物由来の抗体が用いられる。
【００１２】
得られるＨＳＰ２７タンパク質の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等により行うことができる。
【００１３】
ヒト組織由来の精製ＨＳＰ２７タンパク質は、後記の実施例に示すように、ラットの虚血・再還流脳梗塞モデルにおいて、脳梗塞巣の形成、拡大を顕著に防止し、種々の神経障害スコアを減少させる作用を有する。従って、ヒト由来の精製ＨＳＰ２７タンパク質は、抗アポトーシス作用、抗酸化ストレス作用などにより神経細胞死を抑制し、急性期脳梗塞における梗塞巣の拡大を防止し、運動麻痺、感覚障害、言語障害、視力障害、めまい、構音障害、失調、意識障害、高次機能障害等の症状を改善するための医薬として有用である。また脳梗塞発症防止薬としても有用である。
【００１４】
本発明の医薬は、ＨＳＰタンパク質をそのまま、又は薬学的に許容される担体とともに、非経口的に投与するための製剤とすることができる。
【００１５】
非経口投与用製剤としては、注射剤、坐剤、吸入剤等が挙げられる。
注射剤の調製には、ＨＳＰ２７タンパク質に塩酸、水酸化ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等のpH調節剤；塩化ナトリウム、ブドウ糖等の等張化剤；及び注射用蒸留水等を使用することができる。注射用剤には、静脈内投与用及び動脈内投与用注射剤が含まれる。
【００１６】
本発明の医薬は、対象疾患、年令、体重等により異なるが、一般に１０mg〜２００mgを１日１回又は数回に分けて投与することができる。
【実施例】
【００１７】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００１８】
実施例１
（ＨＳＰ２７の精製法）
ＨＳＰ２７はヒト血球、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ培養細胞より抗ＨＳＰ２７抗体（ウサギ）アフィニティ−カラムを用いて精製した。この方法により合成ＨＳＰ２７よりも生理的活性が高いＨＳＰ２７を精製した。より具体的には抗ＨＳＰ２７抗体をＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂに固定化しカラムに充填した。ヒト血球、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ培養細胞ホモジェネートをカラムに注入し、過剰量の抗原を含んだ溶液でＨＳＰ２７を溶出した。精製したＨＳＰ２７の純度はＳｏｄｉｕｍｄｅｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で確認した。電気泳動後のゲルの染色はクーマシーブリリアントブルーで実施した。本方法で９０−９５％の純度のＨＳＰ２７が得られ、使用するまでマイナス８０℃で保存した。
【００１９】
実施例２
（１）マウス中大脳動脈閉塞/再灌流モデル(マウス一過性局所脳虚血モデル)は次のように作成した。即ち、８週齢、雄性の野生型マウスであるＣ５７ＢＬ／６（Ｃ５７ＢＬ６Ｗｔｍｉｃｅ）、体重は２０−２２ｇのものを用い、麻酔下で直腸温を３７±０．５℃に維持しつつ、頸部を切開し左頸動脈の分岐部を露出、内外頸動脈を剥離した。その後、総頸動脈より(全体的に)シリコンコートで固めた８−０ナイロン糸を挿入し、内頸動脈を通じ中大脳動脈（ＭＣＡ）起始部に到達・固定することで左側中大脳動脈領域の血流を遮断し、虚血を負荷した。虚血1時間後、ナイロン糸を中大脳動脈血管外に引き抜くことで再灌流を施した。
【００２０】
（２）脳梗塞巣領域、脳浮腫の測定
マウス中大脳動脈１時間閉塞／再灌流モデルに対し、再灌流２４時間後にｓａｃｒｉｆｉｃｅを行った（ＭＣＡＯ（６０）２４ｈ）。ＰＢＳおよび４％ＰＦＡで灌流し、脳を摘出した。摘出した脳を４％パラホルムアルデヒドにつけて２４時間ｆｉｘし、その後３０％ｓｕｃｒｏｓｅに４８時間程度つけて置換した。凍結後、クリオスタット（ＣＭ−１９００，Ｌｅｉｃａ）にて２０μｍずつスライスし、２０切片ごとにスライドグラスに貼り付けを行った。各切片の左側に認めるクレジールバイオレット染色の脱落した箇所を梗塞領域とし、測定した各梗塞領域の面積を積算し脳梗塞巣のｖｏｌｕｍｅを算出した。
【００２１】
全脳または大脳皮質の梗塞体積（％）
＝〔全脳または大脳皮質の梗塞体積／全脳体積〕×１００
【００２２】
（３）脳機能障害（ＮｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌＤｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）の判定
ＭＣＡＯ処置を施し再灌流２４時間後に、次に示すスコアに従って脳機能障害を評価した。
【００２３】
【表１】