赤レタス
本発明は、芯を含めた結球全体にわたって赤い葉を有する、ラクチュカ・サチヴァ種の結球性レタス植物に関する。芯における赤い葉は、波長が４００ｎｍより短い光線が存在しなくても赤く、その際、播種から観測時までの全期間の生育環境で、４００ｎｍより短い波長の光線が存在しない。アントシアニンとクロロフィルとの間の比率は、４から５０の間、好ましくは９から２７の間である。本発明は上記植物の子孫にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤レタス植物と、それから得ることができるレタスの結球と、上記レタスの赤色の原因である遺伝子複合体とに関する。
【背景技術】
【０００２】
生活様式の変化、ならびに色彩が豊かで興味深い飾りを求めるレストランおよび配膳業者による需要、そしてすぐに使用できる加工済みサラダを求める主婦による需要さえ上昇し続けている。その結果、育種会社は際立った色、より良い風味、そして多彩な食感を有する品種を探求している。レタス市場は、３つの群、すなわち結球全体まるごと、結球全体をプレカットしたもの、およびベビーリーフに分けることができる。
【０００３】
現在、プレカットレタス混合物中の魅力的な赤色は、しばしば、現在利用可能な「赤」レタス（ラクチュカ・サチヴァ（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ））によって、あるいはラデッキオロッソ（チコリウム・インティブス（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ ｉｎｔｙｂｕｓ））、赤キャベツまたは赤フダンソウによって提供されている。今までに知られている「赤」レタスは、本当に葉全体が赤いわけではない。特に、結球型は、葉縁に沿ってのみ赤いものか、赤が斑入りしているものである。それらは、芯まで完全に赤いことは決してない。これは、結球における、日光、より詳細には紫外線にさらされている部分のみでそれらの赤色が発現されるという事実によって引き起こされる。したがって、いわゆる「赤」レタスの葉は、その大部分が緑色であり、それらの赤色はプレカットレタス混合物の赤色印象にはほとんど寄与しない。
【０００４】
葉の赤い部分と緑色の部分との間の移行段階で茶色を呈することが多い。この茶色は、視覚的に魅力ないものと考えられている。赤い斑入りのレタスは、植物疾患または血痕斑（ｂｌｏｏｄｓｔａｉｎ）と関連している。現在のところ、植物育種家は、茶色のものも、赤い斑入りのものも不可として選択する。加えて、斑入りまたは茶色のレタスの葉は、レタス包装産業および消費者の両方において廃棄されるのが多く見られることさえある。
【０００５】
レタス以外の他の植物の葉を用いることの不都合は、これらの他の植物の異なった風味がしばしば望ましくないものとして経験されることである。例えば、ラデッキオロッソは、にがみを有するチコリウム・インティブスである。赤キャベツの食感は、それよりはるかに柔らかいレタスの食感とは完全に異なっている。
【０００６】
レタスにおけるアントシアニン合成は紫外線によって誘導される（例えば、ＶｏｉｐｉｏおよびＡｕｔｉｏ、１９９５年、「Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｒｅｄ−ｌｅａｖｅｄ ｌｅｔｔｕｃｅ ｔｏ ｌｉｇｈｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＵＶ−Ａ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｏｔ ｚｏｎｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．」、Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ ３９９、「Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ．」、ＢＪ Ｂａｉｌｅｙ、Ｔ Ｔａｋａｋｕｒａ編集、日本国京都所在、１８３〜１８７頁；Ｂｅｎｏｉｔら、１９９８年、「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｆｉｌｍ ｏｎ ａ ｆｅｗ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｃｒｏｐｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｅｌｇｉａｎ Ｎｏｒｔｈ Ｓｅａ ｃｌｉｍａｔｅ．」、第１４回「プラスチックを利用した農業」の国際会議、イスラエル国テルアビブ、１９９７年３月、Ｌａｓｅｒ Ｐａｇｅｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、イスラエル国エルサレム所在、８１〜９２頁；Ｋｒｉｚｅｋら、１９９８年、「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｍｂｉｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｓｏｌａｒ ＵＶ−Ａ ａｎｄ ＵＶ−Ｂ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｃｖ． Ｎｅｗ Ｒｅｄ Ｆｉｒｅ ｌｅｔｔｕｃｅ．」、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ １０３（１）、１〜７頁；Ｋｌｅｉｎｈｅｎｚら、２００３年、「Ｖａｒｉｅｔｙ、ｓｈａｄｉｎｇ、ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｓｔａｇｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｐｉｇｍｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌｅｔｔｕｃｅ ｇｒｏｗｎ ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｇｉｍｅｎｓ．」、Ｈｏｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３（４）、６７７〜６８３頁を参照）。多くの植物における赤色の発生は、アントシアニンの産生に依存している。
【０００７】
レタスの多くの様々な品種は、しばしば３つのタイプに分類される。最も一般的なのはヘッドレタスであり、それにはクリスプヘッド（またはアイスバーグ）およびバターヘッドがある。ローメインレタス（またはコスレタス）は、直立したゆるい結球を形成する。「葉」レタスタイプは、非結球性であり、葉がばらばらである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
結球性レタスタイプでは、結球の芯は、多かれ少なかれ閉鎖されており、光は到達できない。したがって、アイスバーグレタスおよびバターレタスなどの閉じた結球、または緩く閉じた結球を有するローメインレタスではアントシアニン産生を有することができない。
【０００９】
関連した問題は、ガラス温室、ビニールトンネル、または密閉容器内で栽培された赤レタスの赤色化の不足である。紫外線は、ガラスまたはプラスチックの覆いによって反射され、または人工の同化光スペクトルで欠如しており、紫外線の不足のため、アントシアニンの発現は屋外条件よりはるかに少ない。これは、屋内条件下で赤レタスを産生する可能性を低減し、したがって、寒気、熱、およびあらゆる種類の降水など、有害な天気から保護された赤レタスを産生する可能性を低減する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、この度、芯を含めた結球全体にわたって赤い葉を有する赤レタスを提供する。本発明の赤レタスの芯葉は、本質的に完全に赤く、これは、それらが独特な高アントシアニン／クロロフィル比を含有することを意味する。これは、アントシアニンの合成に必要であると考えられている光、より詳細にはＵＶ光が結球の芯にまで透過できないので、極めて驚くべきことである。これは、本発明のレタスでは、光非依存性の機構がアントシアニン産生の原因となっていることを実証する。
【００１１】
この光非依存性は、ガラスもしくはプラスチックの下、または密閉容器内における、結球性または非結球性の赤レタスの栽培を可能にする。後者では人工的同化照明を使用し、これは通常、赤色の発色に問題を与える。これは、通常、アントシアニン合成を誘導するのに必須であるＵＶ波長（２８０〜４００ｎｍ）が多かれ少なかれこの光スペクトルで不足しているという事実による。
【００１２】
ガラスまたはプラスチックの下では、覆いの強度なＵＶ遮断によって、紫外線の同様な不足が通常引き起こされる。しかし、そのＵＶ非依存性のアントシアニン発現のため、本発明の赤レタスは、ガラス温室、ビニールハウス、および密閉容器内での栽培に適している。これは、本発明の光非依存性作用機序のためであり、それは、「ＵＶ非依存性アントシアニン発現」または「ＵＶ非依存性赤色化」とも表されるであろう。
【００１３】
本発明の特定の実施形態では、アントシアニンとクロロフィルの吸光度比Ａ５２３／Ａ６６５が４から５０の間、好ましくは９から２７の間である。
【００１４】
本発明におけるアントシアニン発現が紫外線に完全に非依存性であるか、または通常の赤レタス植物におけるアントシアニン発現に通常必要とされるよりはるかに低いレベルの紫外線によってそれが引き起こされるのかどうかは、いまだ完全には知られていない。しかし、本発明の実用的な有用性には、この相違は重要ではない。
【００１５】
本発明は結球性レタス型に特に有用であるが、本発明の光非依存性の赤色化は、葉レタスなどの他のレタス型、およびベビーリーフ生産でも使用できる。ベビーリーフ生産は、小さくて未熟な葉を採取するための若いレタス植物の生産である。
【００１６】
本発明の赤レタスの系図を実施例１に示す。
【００１７】
本発明は、結球の芯に赤い葉を有する元の親、および芯葉におけるクロロフィルとアントシアニンとの間の比率など、本発明の他の要件のうち１つまたは複数を満たす元の親のすべての子孫に関する。
【００１８】
加えて、本発明のＵＶ非依存性赤色化を有する非結球性植物、分離葉植物、またはベビーレタス植物は、完全に赤い結球性レタス植物の子孫であると考えられ、したがって、本発明の一部である。
【００１９】
既に本発明のレタス植物であるレタス植物、またはそれをもたらしうるレタス植物の選択は、赤色化した幼植物の肉眼選抜に基づいて行うことができる（ステップ１）。それに続いて、それらをガラスまたはプラスチックの下で生育させることによって、ＵＶ依存性のアントシアニン発現、すなわち、弱い赤色化と、ＵＶ非依存性のアントシアニン発現、すなわち、比較的強い赤色化とを識別することができる。後者の植物を植え、それらが結球するまで生育させる。その後、各植物の上端を切ることによって、赤い芯葉を有する植物の肉眼選抜を行う。その後、芯が赤い植物を選択して、子孫の種子を生産する。
【００２０】
赤色化のレベルを増強させるため、および／または成熟植物における要求されているレベルの結球性を獲得するために、交雑株を選択する。
【００２１】
本明細書で使用される場合、レタス植物は、特徴的な「結球」に関するＵＰＯＶのガイドライン（「ＴＧ／１３／９．Ｌｅｔｔｕｃｅ（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｄｕｃｔ ｏｆ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｄｉｓｔｉｎｃｔｎｅｓｓ， ｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．」、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗ Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ、スイス国ジュネーブ所在、２００４年）に従って、それが「オープンヘッド」または「クローズドヘッド」を有する場合に、結球性であると定義される。
【００２２】
本発明のレタスの芯は、好ましくは９より高い、より好ましくは１３以上の、クロロフィルとアントシアニンの吸光度比Ａ５２３／Ａ６６５を有する。通常の赤レタスでは、この比率が３より高いことは決してなかった。本発明の比率を決定するのに使用するクロロフィル濃度およびアントシアニン濃度は、分光光度法によって測定する。試料の調製および分析は実施例２に示す。
【００２３】
本発明の芯葉と同程度に高いアントシアニンレベルが、非結球性の他のレタス品種で見出される可能性に留意するべきである。そのような非結球性の品種の一部の例が、４０−０２０３１０３−Ｂ（Ｋｎｅｒｒ ＬＤ、２００５年、レタス栽培品種４０−０２０３１０３−Ｂ、米国特許出願第２００５／０１４４６７２Ａ１号）、ガラクティック（Ｇａｌａｃｔｉｃ）、ニューレッドファイヤー（Ｎｅｗ Ｒｅｄ Ｆｉｒｅ）、ロリナ（Ｒｏｌｉｎａ）（Ｋｌｅｉｎｈｅｎｚら、２００３年、「Ｖａｒｉｅｔｙ、ｓｈａｄｉｎｇ、ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｓｔａｇｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｐｉｇｍｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌｅｔｔｕｃｅ ｇｒｏｗｎ ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｇｉｍｅｎｓ．」、Ｈｏｒｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３（４）、６７７〜６８３頁）、レッドサラダボール（Ｒｅｄ Ｓａｌａｄ Ｂｏｗｌ）、およびセサム（Ｓｅｓａｍ）（Ｖｏｉｐｉｏ Ｉ．およびＡｕｔｉｏ Ｊ．、１９９５年、「Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｒｅｄ−ｌｅａｖｅｄ ｌｅｔｔｕｃｅ ｔｏ ｌｉｇｈｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＵＶ−Ａ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｏｔ ｚｏｎｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．」、Ａｃｔａ ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ ３９９、１８３〜１８７頁）である。
【００２４】
しかし、これらの品種は、非結球性の特性による高度な光曝露の結果、本発明の芯葉と比較して、クロロフィルレベルが非常に高い芯葉を有する。一方、結球性品種は、芯葉に、本発明の芯葉に類似した低クロロフィルレベルを有することが見出される可能性がある。しかし、これらの結球性品種の芯葉は、本発明の芯葉と比較して、高アントシアニンレベルを示さない。芯葉の光曝露が弱いため、通常、アントシアニン合成は貧弱にしか誘導されない。本発明では、アントシアニン産生がＵＶ非依存性である。これは、なぜ本発明のアントシアニン／クロロフィル比が前例がないほど高レベルであるかを説明する。
【００２５】
ＵＶ非依存性であるこの新型の赤色化は、結球性レタス植物で見出され、開発されたものであって、従来技術で提示された赤色化とは異なる。しかし、本発明は、本発明の「ＵＶ非依存性赤色化」という特徴を有する、分離葉もしくはベビーリーフレタス植物などの非結球性レタス植物、またはＵＶ量が少ない場所であるガラス温室内もしくはプラスチックの下で栽培されたレタス植物にも関する。
【００２６】
芯葉の赤色化は、ＲＨＳカラーチャート（王立園芸協会（Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、英国ロンドン所在）でも評点した。本発明の芯葉、とりわけ葉の頭頂部の葉身色は、１８３Ａ、１８４Ａ、または１８７Ｂと評点されたが、これらはすべて灰紫色グループに属した。葉身の残りの部分の色は、１８０Ｂ、１８０Ｃ、１８０Ｄ、または１８１Ｃと評点されたが、これらはすべて灰赤色グループに属した。
【００２７】
ガラスまたはプラスチックの下、すなわち屋外条件での光と比較して紫外線レベルが低減している状態で栽培された植物における赤色化およびアントシアニン発現も評点することが可能である。ここでも、本発明の植物は、通常の赤レタスより、高レベルのアントシアニンおよび濃い赤色を示しうる。特に、本発明の植物の新生葉は、通常の赤レタス植物の新生葉よりはるかに赤い。
【００２８】
本発明の赤レタスの遺伝解析は、実施例２に記載の通りに行った。この解析で、少なくとも３つの遺伝子が結球の芯の赤色化に関与していることが見出された。
【００２９】
したがって、本発明は、アントシアニンを発現することができて、それに加えて、少なくとも、結球の芯の赤色化に関与する３つの遺伝子を有するレタス植物に関する。本発明の植物は、実施例２に記載の完全な遺伝子複合体を含むことが好ましい。
【００３０】
ＡＦＬＰ、ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＳＣＡＲ、ＣＡＰＳ、ＳＳＲ、またはＳＮＰなど、密接に連鎖したＤＮＡマーカーによって、本発明の赤色化に関与する遺伝子座の存在を評価するのが可能である。例えば、上述の集団およびその子孫におけるマーカー形質連鎖解析によって、そのような密接に連鎖したＤＮＡマーカーを得ることができる。
【００３１】
本発明のように、あるレタス植物に、内葉赤色化に関する類似遺伝子構成が存在するかどうか、すなわち、あるレタス植物が本発明による植物であるかどうかの評価は、そのような潜在的な本発明の植物の表現型を、既知の本発明の植物の表現型と比較することによって、容易に評価することができる。例えば、内葉の赤色化、芯葉のアントシアニン／クロロフィル比、および／またはガラスもしくはプラスチックの下で栽培された植物の赤色化によって、表現型を評価することができる。
【００３２】
潜在的な本発明の植物と、既知の本発明の植物との間の遺伝子構成の類似性を評価する別の方法は、上記潜在的植物のマーカー遺伝子型を既知の本発明の植物のマーカー遺伝子型と比較することである。上記マーカー遺伝子型は、本発明の赤色発現に関与する遺伝子座と密接に連鎖しているＡＦＬＰ、ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＳＣＡＲ、ＣＡＰＳ、ＳＳＲ、またはＳＮＰなどの、１セットのＤＮＡベースマーカーによって定義する。
【００３３】
遺伝子構成の類似性を評価する別の方法は、潜在的な本発明の植物の遺伝子型を既知の本発明の植物の遺伝子型と比較することである。この遺伝子型比較は、上記潜在的な植物と、既知の本発明の植物との間の交雑から生じたＦ１植物を自己受精させることによって得られるＦ２集団に関して行う。表現型、すなわち内葉の赤色化の分離が存在しないかどうか、Ｆ２集団を調査することができる。すべての比較において、例えば、芯葉のアントシアニン／クロロフィル比、またはガラスもしくはプラスチックの下で栽培された植物における赤色化によって、表現型を評価することができる。
【００３４】
本発明による赤レタス植物の種子は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１３３７、ＮＣＩＭＢ４１３３８、およびＮＣＩＭＢ４１３３９の下に、２００５年７月１８日にＮＣＩＭＢに寄託した。
【００３５】
本発明は、これらの種子の子孫、ならびに本発明による赤色化をもたらす、本発明の植物の遺伝子構成または遺伝子複合体を交雑によって、または分子生物学的技法によって獲得した植物にも関する。本発明は、本発明の赤色化の形質を維持しているか、獲得したこれらの植物の子孫にも関する。
【００３６】
赤色の原因となる遺伝子を別の植物に導入するために、戻し交雑育種法を用いることができる。これには、望ましいホモ接合型品種または近交系植物が、反復親となる。導入される形質の供給源は、供与親と呼ばれる。この結果得られる植物は、反復親（例えば栽培品種）の特質と、供与親から導入された望ましい形質とを有すると予測される。最初の交雑の後、供与親の表現型（芯における葉の赤色化）を有する個体を選択し、繰り返して反復親と交雑（戻し交雑）する。この結果得られる植物は、反復親（例えば栽培品種）の特質と、供与親から導入された望ましい形質とを有すると予測される。赤色化の遺伝がもう一方の望ましい形質または形質の組合せの遺伝より複雑である場合、赤色化した芯葉を有する親を反復親として用いることができ、もう一方の望ましい形質または形質の組合せを有する親を供与親として用いることができる。様々な形質および作物に一般的に使用される他の育種法の詳細は、いくつかの参考図書（例えば、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎ社、１１５〜１６１頁、１９６０年；Ａｌｌａｒｄ、１９６０年；Ｓｉｍｍｏｎｄｓ、１９７９年；Ｓｎｅｅｐら、１９７９年；Ｆｅｈｒ、１９８７年）の１つに見出すことができる。
【００３７】
以下の実施例によって本発明をさらに説明するが、それらは単なる例示であって、いかなる意味でも本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００３８】
（実施例１）
本発明の赤レタスの系図
以下の系図に従って、本発明のレタスを獲得した。すなわち、１９８６年に、品種ピッポ（Ｐｉｐｐｏ）（Ｒｉｊｋ Ｚｗａａｎ社；赤色）の植物体と、品種ブロンドマレシェール（Ｂｌｏｎｄｅ Ｍａｒａｉｃｈｅｒｅ）（Ｃａｉｌｌａｒｄ社；緑色）の植物体との間で交雑株を作製した。
【００３９】
１９８８年に、この交雑株から得た赤い子孫植物を、品種グリンゴ（Ｇｒｉｎｇｏ）（Ｒｉｊｋ Ｚｗａａｎ社；赤色）の植物体との交雑における父親として用いた。同年に、品種ピエロ（Ｐｉｅｒｒｏｔ）（Ｒｉｊｋ Ｚｗａａｎ社；赤色）の植物体と、品種ロクセット（Ｒｏｘｅｔｔｅ）（Ｒｉｊｋ Ｚｗａａｎ社；緑色）の植物体との間の交雑株を作製した。
【００４０】
１９８９年に、この交雑株から得た赤い子孫植物を、品種クリチェット（Ｋｒｉｚｅｔ）（Ｒｉｊｋ Ｚｗａａｎ社；緑色）の植物体との交雑における父親として用いた。
【００４１】
１９９２年に、上述のクリチェット×（ピエロ×ロクセット）交雑株から赤いＦ３子孫植物体を選択し、それを、上述のグリンゴ×（ピッポ×ブロンドマレシェール）交雑株から選択された赤い子孫植物体である父親植物体との交雑における母親として用いた。１９９５年に、この新たに得られた１９９２年交雑株から赤いＦ４植物体を選択し、品種ロクセット（Ｒｉｊｋ Ｚｗａａｎ社；緑色）の植物体との交雑における母親として用いた。
【００４２】
型、結球性、および色に関する選択を、この交雑株から得られたＦ２、Ｆ３、およびＦ４世代で行い、その結果、１９９８年に赤いＦ４植物体（９８Ｐ．３１５８２）を得た。Ｆ５系統は色の分離（赤対緑色）を現したが、次の世代での選択の結果、完全に赤い芯葉を有する３体の結球性Ｆ５植物体（９９Ｐ．３８１５２；９９Ｐ．３８１５４；９９Ｐ．３０６３７）が得られた。これらを、その後、増殖させた。
【００４３】
子孫は緑色植物の分離を示さなかった。そして、種子は番号０２Ｒ．２４１３、０１Ｒ．１４３９、０２Ｒ．２４１８の下に寄託した。これらのＦ５植物およびそれらの子孫は、光非依存性の赤色化を有するレタスのさらなる育種のための親株供給源として用いられた。
【００４４】
結論として、使用された親品種、すなわち、ピッポ、ブロンドマレシェール、グリンゴ、ピエロ、ロクセット、およびクリチェットのいずれも、結球の芯に特徴的な赤い葉を有していなかったと言うことができる。本発明は、これらの赤色および緑色の親品種に由来する遺伝子の独特かつ新規な組合せを含み、この組合せは、結球の芯に完全に赤い葉を生じさせるものである。
【００４５】
（実施例２）
本発明の赤レタスの遺伝解析
本明細書で使用される場合、遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）（複数形：ｌｏｃｉ）は、ある遺伝子が位置する染色体上の特定位置と定義される（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＪＦ、Ｍｉｌｌｅｒ ＪＨ、Ｓｕｚｕｋｉ、ＤＴ、Ｌｅｗｏｎｔｉｎ ＲＣ、Ｇｅｌｂａｒｔ，ＷＭ、「Ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ．」、第６版、１９９６年、ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、米国ニューヨーク所在）。所与の植物体の赤色化の原因となっている遺伝子座の数は、この植物体と、緑色品種であるシャープシューター（Ｓｈａｒｐ Ｓｈｏｏｔｅｒ）との交雑株の子孫を遺伝解析することによって確定できる。
【００４６】
本発明の赤レタスの遺伝解析を以下の通りに行った。すなわち、Ｆ５植物、番号９９Ｐ．３０６３７、すなわち本発明の植物体の１つの子孫植物体と、明緑色（ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｇｒｅｅｎ）でないアイスバーグレタス植物である、品種シャープシューター（ＳＶＳ、Ｗａｙｃｏｔｔら、１９９９年：米国特許第５９７３２３２号明細書）との交雑を行った。この交雑の子孫から、２１２系統のランダムなＦ２植物をＦ３系統に増殖させた。
【００４７】
これら２１２のＦ３系統を、オランダ国ファインアールト（Ｆｉｊｎａａｒｔ）における秘密野外試験で評価した。２００２年６月１７日に、種子を泥炭塊上に播き、幼植物をガラス温室中で育て、２００２年７月５日に野外に移植した。収穫日（観測時）は、２００２年８月１９日から８月２３日までであった。区画サイズは、Ｆ３系統あたり２４体の植物体、すなわち、６体の植物４列であった。１試行における色形質の発現が非常に安定していたので、系統の複製は行わなかった。Ｆ３植物体ごとに観察を行った。
【００４８】
観察された形質は以下の通り、すなわち、ａ）色、そして赤の場合には、外葉におけるその強度、および発現パターン、ｂ）色、そして赤の場合には、内葉におけるその強度、および発現パターン、ｃ）結球の度合い、ｄ）外葉が緑色である場合には、明色（ｂｒｉｌｌｉａｎｔ）または非明色（ｎｏｎ−ｂｒｉｌｌｉａｎｔ）の２つのクラスにおける評点であった。
【００４９】
赤色化の強度および発現パターンは、弱い順に示されている以下の通りに評点した。すなわち、１）薄く色付いているか、赤らんでいる。すなわち、外葉および内葉の縁、または内葉葉脚が軽く赤色化している。２）赤色の斑点を有する。３）緑色の斑点を有する。すなわち、赤い葉の表面に緑色の斑点がある。４）完全に赤い。すなわち、外葉部の光に曝される部分、および内葉の場合には内葉全体にわたって、斑点のない強い赤色である。
【００５０】
結球性は、１）ローメインレタスまたはコスレタスのように、わずかに開いた結球と、２）アイスバーグレタスのように、明確に重なった葉を有する強い結球との間で評点した。
【００５１】
この試験における一部の植物体は収穫の前に死んだ。意図されていた５０８８体、すなわち２１２×２４体の植物体のうち、合計で５００７体のＦ３植物が収穫段階にまで達し、評点を受けた（表１を参照）。
【００５２】
すべての植物体が、少なくともローメインレタスまたはコスレタスに匹敵する結球レベルを示した。データは、合計２１２系統のうち、完全に緑色な５５系統が分離したことを示した。少なくとも１体の赤色化した植物体を有していた１５７系統のうち、２８系統は、すべて、外葉でアントシアニン発現を示した植物体からなっていた。これらの２８系統のうち、８系統は、すべて、芯葉でアントシアニン発現を示した植物体からなっていた。少なくとも１体の赤色化した植物体を有していた１５７系統のうち、３３系統における赤色化した植物体が、外葉のみでアントシアニン発現を示し、芯葉では示さなかった。上記１５７系統のうちの別の３３系統における赤色化した植物体は、外葉および芯葉の両方で常にアントシアニン発現を示した。残りの９１系統における赤色化した植物体は、すべて外葉でアントシアニン発現を示した。しかし、これらの植物体は、芯葉におけるアントシアニン発現の系統内分離を示した。アントシアニン発現のない緑色外葉を有し、かつ芯葉でアントシアニン発現を示す組合せのものは、５００７体の植物体のうち１体の植物体もなかった。
【００５３】
したがって、外葉におけるアントシアニン発現をもたらす１つまたは複数の遺伝子は、芯葉におけるアントシアニン発現にも必要であると結論される。赤色と緑色との間で分離があった場合、赤色と緑色との間での分離比は、外葉の色に関しては２３：１から１：２２の範囲であった。内葉に関しては、赤色化と緑色化との間での分離比は、緑色の外葉を有するすべての植物体を除外して、１８：１から１：２３の範囲であった。表１は、「９９Ｐ．３０６３７」×品種「シャープシューター」の交雑からランダムに取得した２１２のＦ３系統からなる集団に由来する、外葉および内葉の赤色化および緑色化を有する植物体の系統内分布を示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
これらの分離データを、独立メンデル分離比の仮定のもとに遺伝モデルを構築するのに用いた。内葉におけるＵＶ非依存性アントシアニン発現を得るのに、少なくとも３箇所の遺伝子座が関与していることが見出された。以下Ａ−ａと示す第１の遺伝子座は、既知の赤レタスにも存在し、アントシアニンの発現を得るのに、すべての場合で、優性対立遺伝子であるＡが必要である。おそらくこの遺伝子座は、ＣまたはＧ遺伝子座である（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９８３年、「Ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｌｅｔｔｕｃｅ ａｎｄ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ．」、Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ １、Ｊ Ｊａｎｉｃｋ編集、２６７〜２９３頁）。
【００５６】
以下Ｂ−ｂと示す第２の遺伝子座は、モデルのフィッティングを行うことによって見出され、モデルでは、Ａとの組合せにおいて、劣性対立遺伝子ｂがホモ接合型で存在することによって、外葉のアントシアニン発現が起こる。外葉におけるアントシアニン発現には、以下Ｃ−ｃおよびＤ−ｄと示すさらに２箇所の遺伝子座も関与していることが見出された。優性対立遺伝子Ｃが少なくとも１コピー存在するか、劣性対立遺伝子ｄがホモ接合型で存在することによって、外葉におけるアントシアニン発現が起こる。しかしこれは、対立遺伝子Ａも、少なくとも１コピー存在している場合のみである。
【００５７】
以下Ｅ−ｅ、Ｆ−ｆ、およびＧ−ｇと示すさらに３箇所の遺伝子座も見出された。内葉におけるＵＶ非依存性アントシアニン発現を得るためには、優性であるＥ対立遺伝子１コピーの存在、またはｆ対立遺伝子のホモ接合型での存在、またはｇ対立遺伝子のホモ接合型での存在と併せて、少なくとも１コピーのＡ対立遺伝子と２コピーのｂ対立遺伝子の存在とが必要である。したがって、少なくとも３箇所の遺伝子座、すなわちＡ−ａ、Ｂ−ｂ、およびＥ−ｅ、Ｆ−ｆ、もしくはＧ−ｇにおける、赤色化のための対立遺伝子の存在が、内葉におけるＵＶ非依存性アントシアニン発現に必要である。さらに、上述した遺伝子座のうち少なくとも３箇所、おそらくは７箇所すべての遺伝子座が本発明の赤色化の強度に関与していると想定されている。
【００５８】
（実施例３）
レタスの色、アントシアニン、およびクロロフィルの測定
１．試料の調製および分析
以下の仕様を有する分光光度計ＵｌｔｒｏｓｐｅｃＩＩＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いた。
−モノクロメーター：ホログラフィック回折格子（１２００列／ｍｍ）を有するツェルニーターナー分光計
−波長精度：±１ｎｍ
−波長再現精度：±０．５ｎｍ
−検出器型：単一固体シリコンフォトダイオード
−バンド幅：５ｎｍ
【００５９】
２．原理
赤色（アントシアニン）および緑色（クロロフィル）は生化学的方法で測定する。１つは総アントシアニンの尺度である５２３ｎｍの吸光度を測定するためであり、１つは総クロロフィル（クロロフィルａおよびｂ）の尺度である６６５ｎｍの吸光度を測定するためである２つの抽出物を調製する。
【００６０】
３．試料の調製
結球した成熟レタス植物を採取し、芯が残されるまで、外葉を除去する。レタスの芯は分析に用いる。植物体の頭頂における葉の小さな先端（最大１０％）を除いて、収穫前に、芯葉が日光に直接さらされることがないようにするべきである。芯は、長さ１ｃｍ以上の葉を少なくとも１０枚含有する。芯の最も古い葉は凹面であるべきである。
【００６１】
芯をビニール袋に入れ、＜−７０℃で冷凍する。＜−７０℃で少なくとも数日の後、冷凍した芯を大ハンマーで粉末化する。細かくされた試料を、液体窒素の存在下で（試料は冷凍状態に保たれるべきである）自由に浮遊するフタを用いたＧｒｉｎｄｏｍｉｘ（ＧＭ２００、Ｒｅｔｓｃｈ社、３０００ｒｐｍで５秒、その後５０００ｒｐｍで５秒）中で粉砕して、細粉を得る。
【００６２】
その後、上記粉末を管に入れ、粉末の入った管を液体窒素中で冷やし、所望により分析まで＜−７０℃で保存する。
【００６３】
４．分析
３グラムの粉末を、５０ｍｌ管４本に量り入れる。２本の管をアントシアニンの分析に用い、２本の管をクロロフィルの分析に用いる。
【００６４】
アントシアニンの測定には、上記２本の管に、１．０Ｍ ＨＣｌを含有する５０％メタノールを直ちに添加する。試料および抽出物の色に応じて、５〜１０ｍｌ／ｇ試料を用いる。用いた容積（ｍｌ）を記録する。手操作で試料溶液を混合し、氷上に置く。溶液の一部を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れ、４℃、１３０００ｒｐｍ、４分間、遠心分離する。
【００６５】
分光光度計を用いて、バンド幅５ｎｍでスペクトルを測定する。１ｃｍキュベットを用いる。
【００６６】
３６０〜９００ｎｍのスペクトルを測定し、５２３ｎｍの吸光度（必要な場合には抽出液で希釈した後）および最大波長（λｍａｘ）を決定する。λｍａｘは、約５２３ｎｍであるべきである。
【００６７】
クロロフィルは、上記２本の管に１００％メタノールを直ちに添加することによって測定する。試料および抽出物の色に応じて、５〜１０ｍｌ／ｇ試料のメタノールを用いる。用いた容積（ｍｌ）を記録する。試料溶液は、手操作および「脱気設定（ｓｅｔ ｄｅｇａｓ）」の超音波漕で５分間、超音波処理することによって混合する。溶液の一部を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れ、４℃、１３０００ｒｐｍ、４分間、遠心分離する。
【００６８】
３６０〜９００ｎｍのスペクトルを測定し、６６５ｎｍの吸光度（必要な場合には抽出液で希釈した後）および最大波長（λｍａｘ）を決定する。λｍａｘは、約６６５ｎｍであるべきである。
【００６９】
Ａ５２３およびＡ６６５を、１０ｍｌ抽出容積中に１ｇ新鮮重を含む溶液の吸光度を表すように補正する。Ａ５２３およびＡ６６５の補正値は、次の数式を使用して、計量された試料（ｇ）、抽出容積（ｍｌ）、および必要な場合は希釈率に関する補正を用いて計算する。
補正：
【００７０】
【数１】
Ａ５２３／Ａ６６５の比率を計算する。
【００７１】
表２ａは、仏国アラモン（Ａｒａｍｏｎ）におけるレタス（２００２年１月１０日に播種、２００２年２月１５日に移植、２００２年４月２５日に採取）で観測されたクロロフィルおよびアントシアニンの吸光度、ならびにアントシアニン／クロロフィル比を示す。系統０１Ｐ．８０１４６は、２世代の自家受精によって、植物９９Ｐ．３８１５４から得られた子孫系統である。ピエロ（Ｒｉｊｋ Ｚｗａａｎ社）、ダークランド（Ｄａｒｋｌａｎｄ）（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｖａｌｌｅｙ社）、シェラ（Ｓｉｅｒｒａ）（Ｖｉｌｍｏｒｉｎ社）、およびロクシー（Ｒｏｘｙ）（Ｅｎｚａ社）は一般的なレタス品種である。
【００７２】
表２ｂは、オランダ国ファインアールトで栽培されたレタス（２００２年５月２１日に播種、２００２年６月１０日に移植、２００２年８月２０日に採取）で観測されたクロロフィルおよびアントシアニンの吸光度、ならびにアントシアニン／クロロフィル比を示す。系統０１Ｐ．８０１４６は、２世代にわたる植物９９Ｐ．３８１５４の自家受精から得られた子孫系統である。ピエロ（Ｒｉｊｋ Ｚｗａａｎ社）、ピッポ（Ｒｉｊｋ Ｚｗａａｎ社）、レッドロザリータ（Ｒｅｄ Ｒｏｓａｌｉｔａ）（Ｊｏｈｎｎｙ’ｓ Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ＆ Ｏｒｓｅｔｔｉ社）、ダークランド（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｖａｌｌｅｙ社）、シェラ（Ｖｉｌｍｏｒｉｎ社）、およびロクシー（Ｅｎｚａ社）は一般的なレタス品種である。
【００７３】
【表２】
【００７４】
（寄託情報）
Ｆ５植物である０１Ｒ．１４３９、０２Ｒ．２４１３、および０２Ｒ．２４１８は、それぞれ寄託アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１３３７、ＮＣＩＭＢ４１３３８、およびＮＣＩＭＢ４１３３９で、２００５年７月１８日に、英国アバディーン（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ ＡＢ２１ ９ＹＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）所在のＮＣＩＭＢに寄託した。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】「９９Ｐ．３０６３７」×品種「シャープシューター」の交雑から取得した２１２のＦ３系統からなる集団に関する、外葉および内葉の赤色化の系統内分布を示す図である。この集団に、「赤い外側」、すなわち内葉の色に関係なく赤い外葉を有する植物体の系統内頻度；「赤い外側＆赤い内側」、すなわち赤い外葉および赤い内葉を有する植物体の系統内頻度；「赤い内側／赤い外側」、すなわち赤い外葉を有する植物体の系統合計内における赤い内葉を有する植物体の頻度という、赤色化に関する３つの分類を適用した。○＝観測値、Ｅ＝遺伝モデルによる予測値。
【図２】「９９Ｐ．３０６３７」×品種「シャープシューター」の交雑における分離に基づいたアントシアニン発現に関する遺伝モデルを示す図である。
【図３】図３ａは本発明の植物を示す図である。この幼植物は、系統０３Ｐ８２４２１から得た種子に由来する植物である。この系統は、三代にわたる植物９９Ｐ３８１５４の自家受精の後に得られた。図３ｂ、３ｃ、および３ｄは、それぞれ、親系統であるピエロ、ピッポ、およびグリンゴの幼植物を示す図である。図３ｅおよび３ｆは、それぞれ、比較品種であるアパッチ（Ａｐａｃｈｅ）およびビジュー（Ｂｉｊｏｕ）の幼植物を示す図である。これらすべての幼植物は、１６℃、１４時間の明期、および１２℃、１０時間の暗期を有する栽培室中、泥炭塊上で栽培した。光は、植物体の上０．６ｍの距離にある、０．２４平方ｍあたり１本の管のＰｈｉｌｉｐｓ ＴＬＤ ３６Ｗ ８４０ ＲＥＦＬＥＸ管によって与えた。
【図４】市販品種であるピッポ、ピエロ、およびグリンゴの幼葉との比較における、「ＮＥＷ」と示されている本発明の植物の幼葉を示す図である。これらの幼植物は、１６℃、１４時間の明期、および１２℃、１０時間の暗期を有する栽培室中、泥炭塊上で栽培した。光は、植物体の上０．６ｍの距離にある、０．２４平方ｍあたり１本の管のＰｈｉｌｉｐｓ ＴＬＤ ３６Ｗ ８４０ ＲＥＦＬＥＸ管によって与えた。
【図５】本発明の植物（０１Ｐ８０１４６）と、市販品種であるダークランド（「９９Ｒ１００４４」と示されている；図５ａ〜５ｄ）との間の比較を示す図である。ａ図は採取された結球全体を示し、ｂ図は外葉のない芯を示し、ｃ図は芯の縦断面を示し、ｄ図は切断された芯葉を示す。本発明のレタス植物は、結球の芯が完全に赤いが、その他のレタス植物は異なる。すべての植物は、仏国アラモンで２００２年に栽培された。すなわち、２００２年１月１０日に播種され、２００２年２月１５日に秘密野外試験地に移植され、２００２年４月２５日に採取された。
【図６】本発明の植物（０１Ｐ８０１４６）と、市販品種であるピエロ（「９５Ｇ２２３７」と示されている；図６ａ〜６ｄ）との間の比較を示す図である。ａ図は採取された結球全体を示し、ｂ図は外葉のない芯を示し、ｃ図は芯の縦断面を示し、ｄ図は切断された芯葉を示す。本発明のレタス植物は、結球の芯が完全に赤いが、その他のレタス植物は異なる。すべての植物は、仏国アラモンで２００２年に栽培された。すなわち、２００２年１月１０日に播種され、２００２年２月１５日に秘密野外試験地に移植され、２００２年４月２５日に採取された。
【図７】本発明の植物（０１Ｐ８０１４６）と、市販品種であるロクシー（「９９Ｒ１０２８３」と示されている；図７ａ〜７ｄ）との間の比較を示す図である。ａ図は採取された結球全体を示し、ｂ図は外葉のない芯を示し、ｃ図は芯の縦断面を示し、ｄ図は切断された芯葉を示す。本発明のレタス植物は、結球の芯が完全に赤いが、その他のレタス植物は異なる。すべての植物は、仏国アラモンで２００２年に栽培された。すなわち、２００２年１月１０日に播種され、２００２年２月１５日に秘密野外試験地に移植され、２００２年４月２５日に採取された。
【図８】本発明の植物（０１Ｐ８０１４６）と、市販品種であるシェラ（「９５Ｇ１９８６」と示されている；図８ａ〜８ｄ）との間の比較を示す図である。ａ図は採取された結球全体を示し、ｂ図は外葉のない芯を示し、ｃ図は芯の縦断面を示し、ｄ図は切断された芯葉を示す。本発明のレタス植物は、結球の芯が完全に赤いが、その他のレタス植物は異なる。すべての植物は、仏国アラモンで２００２年に栽培された。すなわち、２００２年１月１０日に播種され、２００２年２月１５日に秘密野外試験地に移植され、２００２年４月２５日に採取された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤レタス植物と、それから得ることができるレタスの結球と、上記レタスの赤色の原因である遺伝子複合体とに関する。
【背景技術】
【０００２】
生活様式の変化、ならびに色彩が豊かで興味深い飾りを求めるレストランおよび配膳業者による需要、そしてすぐに使用できる加工済みサラダを求める主婦による需要さえ上昇し続けている。その結果、育種会社は際立った色、より良い風味、そして多彩な食感を有する品種を探求している。レタス市場は、３つの群、すなわち結球全体まるごと、結球全体をプレカットしたもの、およびベビーリーフに分けることができる。
【０００３】
現在、プレカットレタス混合物中の魅力的な赤色は、しばしば、現在利用可能な「赤」レタス（ラクチュカ・サチヴァ（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ））によって、あるいはラデッキオロッソ（チコリウム・インティブス（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ ｉｎｔｙｂｕｓ））、赤キャベツまたは赤フダンソウによって提供されている。今までに知られている「赤」レタスは、本当に葉全体が赤いわけではない。特に、結球型は、葉縁に沿ってのみ赤いものか、赤が斑入りしているものである。それらは、芯まで完全に赤いことは決してない。これは、結球における、日光、より詳細には紫外線にさらされている部分のみでそれらの赤色が発現されるという事実によって引き起こされる。したがって、いわゆる「赤」レタスの葉は、その大部分が緑色であり、それらの赤色はプレカットレタス混合物の赤色印象にはほとんど寄与しない。
【０００４】
葉の赤い部分と緑色の部分との間の移行段階で茶色を呈することが多い。この茶色は、視覚的に魅力ないものと考えられている。赤い斑入りのレタスは、植物疾患または血痕斑（ｂｌｏｏｄｓｔａｉｎ）と関連している。現在のところ、植物育種家は、茶色のものも、赤い斑入りのものも不可として選択する。加えて、斑入りまたは茶色のレタスの葉は、レタス包装産業および消費者の両方において廃棄されるのが多く見られることさえある。
【０００５】
レタス以外の他の植物の葉を用いることの不都合は、これらの他の植物の異なった風味がしばしば望ましくないものとして経験されることである。例えば、ラデッキオロッソは、にがみを有するチコリウム・インティブスである。赤キャベツの食感は、それよりはるかに柔らかいレタスの食感とは完全に異なっている。
【０００６】
レタスにおけるアントシアニン合成は紫外線によって誘導される（例えば、ＶｏｉｐｉｏおよびＡｕｔｉｏ、１９９５年、「Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｒｅｄ−ｌｅａｖｅｄ ｌｅｔｔｕｃｅ ｔｏ ｌｉｇｈｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＵＶ−Ａ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｏｔ ｚｏｎｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．」、Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ ３９９、「Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ．」、ＢＪ Ｂａｉｌｅｙ、Ｔ Ｔａｋａｋｕｒａ編集、日本国京都所在、１８３〜１８７頁；Ｂｅｎｏｉｔら、１９９８年、「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｆｉｌｍ ｏｎ ａ ｆｅｗ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｃｒｏｐｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｅｌｇｉａｎ Ｎｏｒｔｈ Ｓｅａ ｃｌｉｍａｔｅ．」、第１４回「プラスチックを利用した農業」の国際会議、イスラエル国テルアビブ、１９９７年３月、Ｌａｓｅｒ Ｐａｇｅｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、イスラエル国エルサレム所在、８１〜９２頁；Ｋｒｉｚｅｋら、１９９８年、「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｍｂｉｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｓｏｌａｒ ＵＶ−Ａ ａｎｄ ＵＶ−Ｂ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｃｖ． Ｎｅｗ Ｒｅｄ Ｆｉｒｅ ｌｅｔｔｕｃｅ．」、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ １０３（１）、１〜７頁；Ｋｌｅｉｎｈｅｎｚら、２００３年、「Ｖａｒｉｅｔｙ、ｓｈａｄｉｎｇ、ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｓｔａｇｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｐｉｇｍｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌｅｔｔｕｃｅ ｇｒｏｗｎ ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｇｉｍｅｎｓ．」、Ｈｏｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３（４）、６７７〜６８３頁を参照）。多くの植物における赤色の発生は、アントシアニンの産生に依存している。
【０００７】
レタスの多くの様々な品種は、しばしば３つのタイプに分類される。最も一般的なのはヘッドレタスであり、それにはクリスプヘッド（またはアイスバーグ）およびバターヘッドがある。ローメインレタス（またはコスレタス）は、直立したゆるい結球を形成する。「葉」レタスタイプは、非結球性であり、葉がばらばらである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
結球性レタスタイプでは、結球の芯は、多かれ少なかれ閉鎖されており、光は到達できない。したがって、アイスバーグレタスおよびバターレタスなどの閉じた結球、または緩く閉じた結球を有するローメインレタスではアントシアニン産生を有することができない。
【０００９】
関連した問題は、ガラス温室、ビニールトンネル、または密閉容器内で栽培された赤レタスの赤色化の不足である。紫外線は、ガラスまたはプラスチックの覆いによって反射され、または人工の同化光スペクトルで欠如しており、紫外線の不足のため、アントシアニンの発現は屋外条件よりはるかに少ない。これは、屋内条件下で赤レタスを産生する可能性を低減し、したがって、寒気、熱、およびあらゆる種類の降水など、有害な天気から保護された赤レタスを産生する可能性を低減する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、この度、芯を含めた結球全体にわたって赤い葉を有する赤レタスを提供する。本発明の赤レタスの芯葉は、本質的に完全に赤く、これは、それらが独特な高アントシアニン／クロロフィル比を含有することを意味する。これは、アントシアニンの合成に必要であると考えられている光、より詳細にはＵＶ光が結球の芯にまで透過できないので、極めて驚くべきことである。これは、本発明のレタスでは、光非依存性の機構がアントシアニン産生の原因となっていることを実証する。
【００１１】
この光非依存性は、ガラスもしくはプラスチックの下、または密閉容器内における、結球性または非結球性の赤レタスの栽培を可能にする。後者では人工的同化照明を使用し、これは通常、赤色の発色に問題を与える。これは、通常、アントシアニン合成を誘導するのに必須であるＵＶ波長（２８０〜４００ｎｍ）が多かれ少なかれこの光スペクトルで不足しているという事実による。
【００１２】
ガラスまたはプラスチックの下では、覆いの強度なＵＶ遮断によって、紫外線の同様な不足が通常引き起こされる。しかし、そのＵＶ非依存性のアントシアニン発現のため、本発明の赤レタスは、ガラス温室、ビニールハウス、および密閉容器内での栽培に適している。これは、本発明の光非依存性作用機序のためであり、それは、「ＵＶ非依存性アントシアニン発現」または「ＵＶ非依存性赤色化」とも表されるであろう。
【００１３】
本発明の特定の実施形態では、アントシアニンとクロロフィルの吸光度比Ａ５２３／Ａ６６５が４から５０の間、好ましくは９から２７の間である。
【００１４】
本発明におけるアントシアニン発現が紫外線に完全に非依存性であるか、または通常の赤レタス植物におけるアントシアニン発現に通常必要とされるよりはるかに低いレベルの紫外線によってそれが引き起こされるのかどうかは、いまだ完全には知られていない。しかし、本発明の実用的な有用性には、この相違は重要ではない。
【００１５】
本発明は結球性レタス型に特に有用であるが、本発明の光非依存性の赤色化は、葉レタスなどの他のレタス型、およびベビーリーフ生産でも使用できる。ベビーリーフ生産は、小さくて未熟な葉を採取するための若いレタス植物の生産である。
【００１６】
本発明の赤レタスの系図を実施例１に示す。
【００１７】
本発明は、結球の芯に赤い葉を有する元の親、および芯葉におけるクロロフィルとアントシアニンとの間の比率など、本発明の他の要件のうち１つまたは複数を満たす元の親のすべての子孫に関する。
【００１８】
加えて、本発明のＵＶ非依存性赤色化を有する非結球性植物、分離葉植物、またはベビーレタス植物は、完全に赤い結球性レタス植物の子孫であると考えられ、したがって、本発明の一部である。
【００１９】
既に本発明のレタス植物であるレタス植物、またはそれをもたらしうるレタス植物の選択は、赤色化した幼植物の肉眼選抜に基づいて行うことができる（ステップ１）。それに続いて、それらをガラスまたはプラスチックの下で生育させることによって、ＵＶ依存性のアントシアニン発現、すなわち、弱い赤色化と、ＵＶ非依存性のアントシアニン発現、すなわち、比較的強い赤色化とを識別することができる。後者の植物を植え、それらが結球するまで生育させる。その後、各植物の上端を切ることによって、赤い芯葉を有する植物の肉眼選抜を行う。その後、芯が赤い植物を選択して、子孫の種子を生産する。
【００２０】
赤色化のレベルを増強させるため、および／または成熟植物における要求されているレベルの結球性を獲得するために、交雑株を選択する。
【００２１】
本明細書で使用される場合、レタス植物は、特徴的な「結球」に関するＵＰＯＶのガイドライン（「ＴＧ／１３／９．Ｌｅｔｔｕｃｅ（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｄｕｃｔ ｏｆ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｄｉｓｔｉｎｃｔｎｅｓｓ， ｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．」、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗ Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ、スイス国ジュネーブ所在、２００４年）に従って、それが「オープンヘッド」または「クローズドヘッド」を有する場合に、結球性であると定義される。
【００２２】
本発明のレタスの芯は、好ましくは９より高い、より好ましくは１３以上の、クロロフィルとアントシアニンの吸光度比Ａ５２３／Ａ６６５を有する。通常の赤レタスでは、この比率が３より高いことは決してなかった。本発明の比率を決定するのに使用するクロロフィル濃度およびアントシアニン濃度は、分光光度法によって測定する。試料の調製および分析は実施例２に示す。
【００２３】
本発明の芯葉と同程度に高いアントシアニンレベルが、非結球性の他のレタス品種で見出される可能性に留意するべきである。そのような非結球性の品種の一部の例が、４０−０２０３１０３−Ｂ（Ｋｎｅｒｒ ＬＤ、２００５年、レタス栽培品種４０−０２０３１０３−Ｂ、米国特許出願第２００５／０１４４６７２Ａ１号）、ガラクティック（Ｇａｌａｃｔｉｃ）、ニューレッドファイヤー（Ｎｅｗ Ｒｅｄ Ｆｉｒｅ）、ロリナ（Ｒｏｌｉｎａ）（Ｋｌｅｉｎｈｅｎｚら、２００３年、「Ｖａｒｉｅｔｙ、ｓｈａｄｉｎｇ、ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｓｔａｇｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｐｉｇｍｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌｅｔｔｕｃｅ ｇｒｏｗｎ ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｇｉｍｅｎｓ．」、Ｈｏｒｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３（４）、６７７〜６８３頁）、レッドサラダボール（Ｒｅｄ Ｓａｌａｄ Ｂｏｗｌ）、およびセサム（Ｓｅｓａｍ）（Ｖｏｉｐｉｏ Ｉ．およびＡｕｔｉｏ Ｊ．、１９９５年、「Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｒｅｄ−ｌｅａｖｅｄ ｌｅｔｔｕｃｅ ｔｏ ｌｉｇｈｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＵＶ−Ａ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｏｔ ｚｏｎｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．」、Ａｃｔａ ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ ３９９、１８３〜１８７頁）である。
【００２４】
しかし、これらの品種は、非結球性の特性による高度な光曝露の結果、本発明の芯葉と比較して、クロロフィルレベルが非常に高い芯葉を有する。一方、結球性品種は、芯葉に、本発明の芯葉に類似した低クロロフィルレベルを有することが見出される可能性がある。しかし、これらの結球性品種の芯葉は、本発明の芯葉と比較して、高アントシアニンレベルを示さない。芯葉の光曝露が弱いため、通常、アントシアニン合成は貧弱にしか誘導されない。本発明では、アントシアニン産生がＵＶ非依存性である。これは、なぜ本発明のアントシアニン／クロロフィル比が前例がないほど高レベルであるかを説明する。
【００２５】
ＵＶ非依存性であるこの新型の赤色化は、結球性レタス植物で見出され、開発されたものであって、従来技術で提示された赤色化とは異なる。しかし、本発明は、本発明の「ＵＶ非依存性赤色化」という特徴を有する、分離葉もしくはベビーリーフレタス植物などの非結球性レタス植物、またはＵＶ量が少ない場所であるガラス温室内もしくはプラスチックの下で栽培されたレタス植物にも関する。
【００２６】
芯葉の赤色化は、ＲＨＳカラーチャート（王立園芸協会（Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、英国ロンドン所在）でも評点した。本発明の芯葉、とりわけ葉の頭頂部の葉身色は、１８３Ａ、１８４Ａ、または１８７Ｂと評点されたが、これらはすべて灰紫色グループに属した。葉身の残りの部分の色は、１８０Ｂ、１８０Ｃ、１８０Ｄ、または１８１Ｃと評点されたが、これらはすべて灰赤色グループに属した。
【００２７】
ガラスまたはプラスチックの下、すなわち屋外条件での光と比較して紫外線レベルが低減している状態で栽培された植物における赤色化およびアントシアニン発現も評点することが可能である。ここでも、本発明の植物は、通常の赤レタスより、高レベルのアントシアニンおよび濃い赤色を示しうる。特に、本発明の植物の新生葉は、通常の赤レタス植物の新生葉よりはるかに赤い。
【００２８】
本発明の赤レタスの遺伝解析は、実施例２に記載の通りに行った。この解析で、少なくとも３つの遺伝子が結球の芯の赤色化に関与していることが見出された。
【００２９】
したがって、本発明は、アントシアニンを発現することができて、それに加えて、少なくとも、結球の芯の赤色化に関与する３つの遺伝子を有するレタス植物に関する。本発明の植物は、実施例２に記載の完全な遺伝子複合体を含むことが好ましい。
【００３０】
ＡＦＬＰ、ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＳＣＡＲ、ＣＡＰＳ、ＳＳＲ、またはＳＮＰなど、密接に連鎖したＤＮＡマーカーによって、本発明の赤色化に関与する遺伝子座の存在を評価するのが可能である。例えば、上述の集団およびその子孫におけるマーカー形質連鎖解析によって、そのような密接に連鎖したＤＮＡマーカーを得ることができる。
【００３１】
本発明のように、あるレタス植物に、内葉赤色化に関する類似遺伝子構成が存在するかどうか、すなわち、あるレタス植物が本発明による植物であるかどうかの評価は、そのような潜在的な本発明の植物の表現型を、既知の本発明の植物の表現型と比較することによって、容易に評価することができる。例えば、内葉の赤色化、芯葉のアントシアニン／クロロフィル比、および／またはガラスもしくはプラスチックの下で栽培された植物の赤色化によって、表現型を評価することができる。
【００３２】
潜在的な本発明の植物と、既知の本発明の植物との間の遺伝子構成の類似性を評価する別の方法は、上記潜在的植物のマーカー遺伝子型を既知の本発明の植物のマーカー遺伝子型と比較することである。上記マーカー遺伝子型は、本発明の赤色発現に関与する遺伝子座と密接に連鎖しているＡＦＬＰ、ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＳＣＡＲ、ＣＡＰＳ、ＳＳＲ、またはＳＮＰなどの、１セットのＤＮＡベースマーカーによって定義する。
【００３３】
遺伝子構成の類似性を評価する別の方法は、潜在的な本発明の植物の遺伝子型を既知の本発明の植物の遺伝子型と比較することである。この遺伝子型比較は、上記潜在的な植物と、既知の本発明の植物との間の交雑から生じたＦ１植物を自己受精させることによって得られるＦ２集団に関して行う。表現型、すなわち内葉の赤色化の分離が存在しないかどうか、Ｆ２集団を調査することができる。すべての比較において、例えば、芯葉のアントシアニン／クロロフィル比、またはガラスもしくはプラスチックの下で栽培された植物における赤色化によって、表現型を評価することができる。
【００３４】
本発明による赤レタス植物の種子は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１３３７、ＮＣＩＭＢ４１３３８、およびＮＣＩＭＢ４１３３９の下に、２００５年７月１８日にＮＣＩＭＢに寄託した。
【００３５】
本発明は、これらの種子の子孫、ならびに本発明による赤色化をもたらす、本発明の植物の遺伝子構成または遺伝子複合体を交雑によって、または分子生物学的技法によって獲得した植物にも関する。本発明は、本発明の赤色化の形質を維持しているか、獲得したこれらの植物の子孫にも関する。
【００３６】
赤色の原因となる遺伝子を別の植物に導入するために、戻し交雑育種法を用いることができる。これには、望ましいホモ接合型品種または近交系植物が、反復親となる。導入される形質の供給源は、供与親と呼ばれる。この結果得られる植物は、反復親（例えば栽培品種）の特質と、供与親から導入された望ましい形質とを有すると予測される。最初の交雑の後、供与親の表現型（芯における葉の赤色化）を有する個体を選択し、繰り返して反復親と交雑（戻し交雑）する。この結果得られる植物は、反復親（例えば栽培品種）の特質と、供与親から導入された望ましい形質とを有すると予測される。赤色化の遺伝がもう一方の望ましい形質または形質の組合せの遺伝より複雑である場合、赤色化した芯葉を有する親を反復親として用いることができ、もう一方の望ましい形質または形質の組合せを有する親を供与親として用いることができる。様々な形質および作物に一般的に使用される他の育種法の詳細は、いくつかの参考図書（例えば、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎ社、１１５〜１６１頁、１９６０年；Ａｌｌａｒｄ、１９６０年；Ｓｉｍｍｏｎｄｓ、１９７９年；Ｓｎｅｅｐら、１９７９年；Ｆｅｈｒ、１９８７年）の１つに見出すことができる。
【００３７】
以下の実施例によって本発明をさらに説明するが、それらは単なる例示であって、いかなる意味でも本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００３８】
（実施例１）
本発明の赤レタスの系図
以下の系図に従って、本発明のレタスを獲得した。すなわち、１９８６年に、品種ピッポ（Ｐｉｐｐｏ）（Ｒｉｊｋ Ｚｗａａｎ社；赤色）の植物体と、品種ブロンドマレシェール（Ｂｌｏｎｄｅ Ｍａｒａｉｃｈｅｒｅ）（Ｃａｉｌｌａｒｄ社；緑色）の植物体との間で交雑株を作製した。
【００３９】
１９８８年に、この交雑株から得た赤い子孫植物を、品種グリンゴ（Ｇｒｉｎｇｏ）（Ｒｉｊｋ Ｚｗａａｎ社；赤色）の植物体との交雑における父親として用いた。同年に、品種ピエロ（Ｐｉｅｒｒｏｔ）（Ｒｉｊｋ Ｚｗａａｎ社；赤色）の植物体と、品種ロクセット（Ｒｏｘｅｔｔｅ）（Ｒｉｊｋ Ｚｗａａｎ社；緑色）の植物体との間の交雑株を作製した。
【００４０】
１９８９年に、この交雑株から得た赤い子孫植物を、品種クリチェット（Ｋｒｉｚｅｔ）（Ｒｉｊｋ Ｚｗａａｎ社；緑色）の植物体との交雑における父親として用いた。
【００４１】
１９９２年に、上述のクリチェット×（ピエロ×ロクセット）交雑株から赤いＦ３子孫植物体を選択し、それを、上述のグリンゴ×（ピッポ×ブロンドマレシェール）交雑株から選択された赤い子孫植物体である父親植物体との交雑における母親として用いた。１９９５年に、この新たに得られた１９９２年交雑株から赤いＦ４植物体を選択し、品種ロクセット（Ｒｉｊｋ Ｚｗａａｎ社；緑色）の植物体との交雑における母親として用いた。
【００４２】
型、結球性、および色に関する選択を、この交雑株から得られたＦ２、Ｆ３、およびＦ４世代で行い、その結果、１９９８年に赤いＦ４植物体（９８Ｐ．３１５８２）を得た。Ｆ５系統は色の分離（赤対緑色）を現したが、次の世代での選択の結果、完全に赤い芯葉を有する３体の結球性Ｆ５植物体（９９Ｐ．３８１５２；９９Ｐ．３８１５４；９９Ｐ．３０６３７）が得られた。これらを、その後、増殖させた。
【００４３】
子孫は緑色植物の分離を示さなかった。そして、種子は番号０２Ｒ．２４１３、０１Ｒ．１４３９、０２Ｒ．２４１８の下に寄託した。これらのＦ５植物およびそれらの子孫は、光非依存性の赤色化を有するレタスのさらなる育種のための親株供給源として用いられた。
【００４４】
結論として、使用された親品種、すなわち、ピッポ、ブロンドマレシェール、グリンゴ、ピエロ、ロクセット、およびクリチェットのいずれも、結球の芯に特徴的な赤い葉を有していなかったと言うことができる。本発明は、これらの赤色および緑色の親品種に由来する遺伝子の独特かつ新規な組合せを含み、この組合せは、結球の芯に完全に赤い葉を生じさせるものである。
【００４５】
（実施例２）
本発明の赤レタスの遺伝解析
本明細書で使用される場合、遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）（複数形：ｌｏｃｉ）は、ある遺伝子が位置する染色体上の特定位置と定義される（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＪＦ、Ｍｉｌｌｅｒ ＪＨ、Ｓｕｚｕｋｉ、ＤＴ、Ｌｅｗｏｎｔｉｎ ＲＣ、Ｇｅｌｂａｒｔ，ＷＭ、「Ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ．」、第６版、１９９６年、ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、米国ニューヨーク所在）。所与の植物体の赤色化の原因となっている遺伝子座の数は、この植物体と、緑色品種であるシャープシューター（Ｓｈａｒｐ Ｓｈｏｏｔｅｒ）との交雑株の子孫を遺伝解析することによって確定できる。
【００４６】
本発明の赤レタスの遺伝解析を以下の通りに行った。すなわち、Ｆ５植物、番号９９Ｐ．３０６３７、すなわち本発明の植物体の１つの子孫植物体と、明緑色（ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｇｒｅｅｎ）でないアイスバーグレタス植物である、品種シャープシューター（ＳＶＳ、Ｗａｙｃｏｔｔら、１９９９年：米国特許第５９７３２３２号明細書）との交雑を行った。この交雑の子孫から、２１２系統のランダムなＦ２植物をＦ３系統に増殖させた。
【００４７】
これら２１２のＦ３系統を、オランダ国ファインアールト（Ｆｉｊｎａａｒｔ）における秘密野外試験で評価した。２００２年６月１７日に、種子を泥炭塊上に播き、幼植物をガラス温室中で育て、２００２年７月５日に野外に移植した。収穫日（観測時）は、２００２年８月１９日から８月２３日までであった。区画サイズは、Ｆ３系統あたり２４体の植物体、すなわち、６体の植物４列であった。１試行における色形質の発現が非常に安定していたので、系統の複製は行わなかった。Ｆ３植物体ごとに観察を行った。
【００４８】
観察された形質は以下の通り、すなわち、ａ）色、そして赤の場合には、外葉におけるその強度、および発現パターン、ｂ）色、そして赤の場合には、内葉におけるその強度、および発現パターン、ｃ）結球の度合い、ｄ）外葉が緑色である場合には、明色（ｂｒｉｌｌｉａｎｔ）または非明色（ｎｏｎ−ｂｒｉｌｌｉａｎｔ）の２つのクラスにおける評点であった。
【００４９】
赤色化の強度および発現パターンは、弱い順に示されている以下の通りに評点した。すなわち、１）薄く色付いているか、赤らんでいる。すなわち、外葉および内葉の縁、または内葉葉脚が軽く赤色化している。２）赤色の斑点を有する。３）緑色の斑点を有する。すなわち、赤い葉の表面に緑色の斑点がある。４）完全に赤い。すなわち、外葉部の光に曝される部分、および内葉の場合には内葉全体にわたって、斑点のない強い赤色である。
【００５０】
結球性は、１）ローメインレタスまたはコスレタスのように、わずかに開いた結球と、２）アイスバーグレタスのように、明確に重なった葉を有する強い結球との間で評点した。
【００５１】
この試験における一部の植物体は収穫の前に死んだ。意図されていた５０８８体、すなわち２１２×２４体の植物体のうち、合計で５００７体のＦ３植物が収穫段階にまで達し、評点を受けた（表１を参照）。
【００５２】
すべての植物体が、少なくともローメインレタスまたはコスレタスに匹敵する結球レベルを示した。データは、合計２１２系統のうち、完全に緑色な５５系統が分離したことを示した。少なくとも１体の赤色化した植物体を有していた１５７系統のうち、２８系統は、すべて、外葉でアントシアニン発現を示した植物体からなっていた。これらの２８系統のうち、８系統は、すべて、芯葉でアントシアニン発現を示した植物体からなっていた。少なくとも１体の赤色化した植物体を有していた１５７系統のうち、３３系統における赤色化した植物体が、外葉のみでアントシアニン発現を示し、芯葉では示さなかった。上記１５７系統のうちの別の３３系統における赤色化した植物体は、外葉および芯葉の両方で常にアントシアニン発現を示した。残りの９１系統における赤色化した植物体は、すべて外葉でアントシアニン発現を示した。しかし、これらの植物体は、芯葉におけるアントシアニン発現の系統内分離を示した。アントシアニン発現のない緑色外葉を有し、かつ芯葉でアントシアニン発現を示す組合せのものは、５００７体の植物体のうち１体の植物体もなかった。
【００５３】
したがって、外葉におけるアントシアニン発現をもたらす１つまたは複数の遺伝子は、芯葉におけるアントシアニン発現にも必要であると結論される。赤色と緑色との間で分離があった場合、赤色と緑色との間での分離比は、外葉の色に関しては２３：１から１：２２の範囲であった。内葉に関しては、赤色化と緑色化との間での分離比は、緑色の外葉を有するすべての植物体を除外して、１８：１から１：２３の範囲であった。表１は、「９９Ｐ．３０６３７」×品種「シャープシューター」の交雑からランダムに取得した２１２のＦ３系統からなる集団に由来する、外葉および内葉の赤色化および緑色化を有する植物体の系統内分布を示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
これらの分離データを、独立メンデル分離比の仮定のもとに遺伝モデルを構築するのに用いた。内葉におけるＵＶ非依存性アントシアニン発現を得るのに、少なくとも３箇所の遺伝子座が関与していることが見出された。以下Ａ−ａと示す第１の遺伝子座は、既知の赤レタスにも存在し、アントシアニンの発現を得るのに、すべての場合で、優性対立遺伝子であるＡが必要である。おそらくこの遺伝子座は、ＣまたはＧ遺伝子座である（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９８３年、「Ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｌｅｔｔｕｃｅ ａｎｄ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ．」、Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ １、Ｊ Ｊａｎｉｃｋ編集、２６７〜２９３頁）。
【００５６】
以下Ｂ−ｂと示す第２の遺伝子座は、モデルのフィッティングを行うことによって見出され、モデルでは、Ａとの組合せにおいて、劣性対立遺伝子ｂがホモ接合型で存在することによって、外葉のアントシアニン発現が起こる。外葉におけるアントシアニン発現には、以下Ｃ−ｃおよびＤ−ｄと示すさらに２箇所の遺伝子座も関与していることが見出された。優性対立遺伝子Ｃが少なくとも１コピー存在するか、劣性対立遺伝子ｄがホモ接合型で存在することによって、外葉におけるアントシアニン発現が起こる。しかしこれは、対立遺伝子Ａも、少なくとも１コピー存在している場合のみである。
【００５７】
以下Ｅ−ｅ、Ｆ−ｆ、およびＧ−ｇと示すさらに３箇所の遺伝子座も見出された。内葉におけるＵＶ非依存性アントシアニン発現を得るためには、優性であるＥ対立遺伝子１コピーの存在、またはｆ対立遺伝子のホモ接合型での存在、またはｇ対立遺伝子のホモ接合型での存在と併せて、少なくとも１コピーのＡ対立遺伝子と２コピーのｂ対立遺伝子の存在とが必要である。したがって、少なくとも３箇所の遺伝子座、すなわちＡ−ａ、Ｂ−ｂ、およびＥ−ｅ、Ｆ−ｆ、もしくはＧ−ｇにおける、赤色化のための対立遺伝子の存在が、内葉におけるＵＶ非依存性アントシアニン発現に必要である。さらに、上述した遺伝子座のうち少なくとも３箇所、おそらくは７箇所すべての遺伝子座が本発明の赤色化の強度に関与していると想定されている。
【００５８】
（実施例３）
レタスの色、アントシアニン、およびクロロフィルの測定
１．試料の調製および分析
以下の仕様を有する分光光度計ＵｌｔｒｏｓｐｅｃＩＩＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いた。
−モノクロメーター：ホログラフィック回折格子（１２００列／ｍｍ）を有するツェルニーターナー分光計
−波長精度：±１ｎｍ
−波長再現精度：±０．５ｎｍ
−検出器型：単一固体シリコンフォトダイオード
−バンド幅：５ｎｍ
【００５９】
２．原理
赤色（アントシアニン）および緑色（クロロフィル）は生化学的方法で測定する。１つは総アントシアニンの尺度である５２３ｎｍの吸光度を測定するためであり、１つは総クロロフィル（クロロフィルａおよびｂ）の尺度である６６５ｎｍの吸光度を測定するためである２つの抽出物を調製する。
【００６０】
３．試料の調製
結球した成熟レタス植物を採取し、芯が残されるまで、外葉を除去する。レタスの芯は分析に用いる。植物体の頭頂における葉の小さな先端（最大１０％）を除いて、収穫前に、芯葉が日光に直接さらされることがないようにするべきである。芯は、長さ１ｃｍ以上の葉を少なくとも１０枚含有する。芯の最も古い葉は凹面であるべきである。
【００６１】
芯をビニール袋に入れ、＜−７０℃で冷凍する。＜−７０℃で少なくとも数日の後、冷凍した芯を大ハンマーで粉末化する。細かくされた試料を、液体窒素の存在下で（試料は冷凍状態に保たれるべきである）自由に浮遊するフタを用いたＧｒｉｎｄｏｍｉｘ（ＧＭ２００、Ｒｅｔｓｃｈ社、３０００ｒｐｍで５秒、その後５０００ｒｐｍで５秒）中で粉砕して、細粉を得る。
【００６２】
その後、上記粉末を管に入れ、粉末の入った管を液体窒素中で冷やし、所望により分析まで＜−７０℃で保存する。
【００６３】
４．分析
３グラムの粉末を、５０ｍｌ管４本に量り入れる。２本の管をアントシアニンの分析に用い、２本の管をクロロフィルの分析に用いる。
【００６４】
アントシアニンの測定には、上記２本の管に、１．０Ｍ ＨＣｌを含有する５０％メタノールを直ちに添加する。試料および抽出物の色に応じて、５〜１０ｍｌ／ｇ試料を用いる。用いた容積（ｍｌ）を記録する。手操作で試料溶液を混合し、氷上に置く。溶液の一部を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れ、４℃、１３０００ｒｐｍ、４分間、遠心分離する。
【００６５】
分光光度計を用いて、バンド幅５ｎｍでスペクトルを測定する。１ｃｍキュベットを用いる。
【００６６】
３６０〜９００ｎｍのスペクトルを測定し、５２３ｎｍの吸光度（必要な場合には抽出液で希釈した後）および最大波長（λｍａｘ）を決定する。λｍａｘは、約５２３ｎｍであるべきである。
【００６７】
クロロフィルは、上記２本の管に１００％メタノールを直ちに添加することによって測定する。試料および抽出物の色に応じて、５〜１０ｍｌ／ｇ試料のメタノールを用いる。用いた容積（ｍｌ）を記録する。試料溶液は、手操作および「脱気設定（ｓｅｔ ｄｅｇａｓ）」の超音波漕で５分間、超音波処理することによって混合する。溶液の一部を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れ、４℃、１３０００ｒｐｍ、４分間、遠心分離する。
【００６８】
３６０〜９００ｎｍのスペクトルを測定し、６６５ｎｍの吸光度（必要な場合には抽出液で希釈した後）および最大波長（λｍａｘ）を決定する。λｍａｘは、約６６５ｎｍであるべきである。
【００６９】
Ａ５２３およびＡ６６５を、１０ｍｌ抽出容積中に１ｇ新鮮重を含む溶液の吸光度を表すように補正する。Ａ５２３およびＡ６６５の補正値は、次の数式を使用して、計量された試料（ｇ）、抽出容積（ｍｌ）、および必要な場合は希釈率に関する補正を用いて計算する。
補正：
【００７０】
【数１】
Ａ５２３／Ａ６６５の比率を計算する。
【００７１】
表２ａは、仏国アラモン（Ａｒａｍｏｎ）におけるレタス（２００２年１月１０日に播種、２００２年２月１５日に移植、２００２年４月２５日に採取）で観測されたクロロフィルおよびアントシアニンの吸光度、ならびにアントシアニン／クロロフィル比を示す。系統０１Ｐ．８０１４６は、２世代の自家受精によって、植物９９Ｐ．３８１５４から得られた子孫系統である。ピエロ（Ｒｉｊｋ Ｚｗａａｎ社）、ダークランド（Ｄａｒｋｌａｎｄ）（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｖａｌｌｅｙ社）、シェラ（Ｓｉｅｒｒａ）（Ｖｉｌｍｏｒｉｎ社）、およびロクシー（Ｒｏｘｙ）（Ｅｎｚａ社）は一般的なレタス品種である。
【００７２】
表２ｂは、オランダ国ファインアールトで栽培されたレタス（２００２年５月２１日に播種、２００２年６月１０日に移植、２００２年８月２０日に採取）で観測されたクロロフィルおよびアントシアニンの吸光度、ならびにアントシアニン／クロロフィル比を示す。系統０１Ｐ．８０１４６は、２世代にわたる植物９９Ｐ．３８１５４の自家受精から得られた子孫系統である。ピエロ（Ｒｉｊｋ Ｚｗａａｎ社）、ピッポ（Ｒｉｊｋ Ｚｗａａｎ社）、レッドロザリータ（Ｒｅｄ Ｒｏｓａｌｉｔａ）（Ｊｏｈｎｎｙ’ｓ Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ＆ Ｏｒｓｅｔｔｉ社）、ダークランド（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｖａｌｌｅｙ社）、シェラ（Ｖｉｌｍｏｒｉｎ社）、およびロクシー（Ｅｎｚａ社）は一般的なレタス品種である。
【００７３】
【表２】
【００７４】
（寄託情報）
Ｆ５植物である０１Ｒ．１４３９、０２Ｒ．２４１３、および０２Ｒ．２４１８は、それぞれ寄託アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１３３７、ＮＣＩＭＢ４１３３８、およびＮＣＩＭＢ４１３３９で、２００５年７月１８日に、英国アバディーン（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ ＡＢ２１ ９ＹＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）所在のＮＣＩＭＢに寄託した。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】「９９Ｐ．３０６３７」×品種「シャープシューター」の交雑から取得した２１２のＦ３系統からなる集団に関する、外葉および内葉の赤色化の系統内分布を示す図である。この集団に、「赤い外側」、すなわち内葉の色に関係なく赤い外葉を有する植物体の系統内頻度；「赤い外側＆赤い内側」、すなわち赤い外葉および赤い内葉を有する植物体の系統内頻度；「赤い内側／赤い外側」、すなわち赤い外葉を有する植物体の系統合計内における赤い内葉を有する植物体の頻度という、赤色化に関する３つの分類を適用した。○＝観測値、Ｅ＝遺伝モデルによる予測値。
【図２】「９９Ｐ．３０６３７」×品種「シャープシューター」の交雑における分離に基づいたアントシアニン発現に関する遺伝モデルを示す図である。
【図３】図３ａは本発明の植物を示す図である。この幼植物は、系統０３Ｐ８２４２１から得た種子に由来する植物である。この系統は、三代にわたる植物９９Ｐ３８１５４の自家受精の後に得られた。図３ｂ、３ｃ、および３ｄは、それぞれ、親系統であるピエロ、ピッポ、およびグリンゴの幼植物を示す図である。図３ｅおよび３ｆは、それぞれ、比較品種であるアパッチ（Ａｐａｃｈｅ）およびビジュー（Ｂｉｊｏｕ）の幼植物を示す図である。これらすべての幼植物は、１６℃、１４時間の明期、および１２℃、１０時間の暗期を有する栽培室中、泥炭塊上で栽培した。光は、植物体の上０．６ｍの距離にある、０．２４平方ｍあたり１本の管のＰｈｉｌｉｐｓ ＴＬＤ ３６Ｗ ８４０ ＲＥＦＬＥＸ管によって与えた。
【図４】市販品種であるピッポ、ピエロ、およびグリンゴの幼葉との比較における、「ＮＥＷ」と示されている本発明の植物の幼葉を示す図である。これらの幼植物は、１６℃、１４時間の明期、および１２℃、１０時間の暗期を有する栽培室中、泥炭塊上で栽培した。光は、植物体の上０．６ｍの距離にある、０．２４平方ｍあたり１本の管のＰｈｉｌｉｐｓ ＴＬＤ ３６Ｗ ８４０ ＲＥＦＬＥＸ管によって与えた。
【図５】本発明の植物（０１Ｐ８０１４６）と、市販品種であるダークランド（「９９Ｒ１００４４」と示されている；図５ａ〜５ｄ）との間の比較を示す図である。ａ図は採取された結球全体を示し、ｂ図は外葉のない芯を示し、ｃ図は芯の縦断面を示し、ｄ図は切断された芯葉を示す。本発明のレタス植物は、結球の芯が完全に赤いが、その他のレタス植物は異なる。すべての植物は、仏国アラモンで２００２年に栽培された。すなわち、２００２年１月１０日に播種され、２００２年２月１５日に秘密野外試験地に移植され、２００２年４月２５日に採取された。
【図６】本発明の植物（０１Ｐ８０１４６）と、市販品種であるピエロ（「９５Ｇ２２３７」と示されている；図６ａ〜６ｄ）との間の比較を示す図である。ａ図は採取された結球全体を示し、ｂ図は外葉のない芯を示し、ｃ図は芯の縦断面を示し、ｄ図は切断された芯葉を示す。本発明のレタス植物は、結球の芯が完全に赤いが、その他のレタス植物は異なる。すべての植物は、仏国アラモンで２００２年に栽培された。すなわち、２００２年１月１０日に播種され、２００２年２月１５日に秘密野外試験地に移植され、２００２年４月２５日に採取された。
【図７】本発明の植物（０１Ｐ８０１４６）と、市販品種であるロクシー（「９９Ｒ１０２８３」と示されている；図７ａ〜７ｄ）との間の比較を示す図である。ａ図は採取された結球全体を示し、ｂ図は外葉のない芯を示し、ｃ図は芯の縦断面を示し、ｄ図は切断された芯葉を示す。本発明のレタス植物は、結球の芯が完全に赤いが、その他のレタス植物は異なる。すべての植物は、仏国アラモンで２００２年に栽培された。すなわち、２００２年１月１０日に播種され、２００２年２月１５日に秘密野外試験地に移植され、２００２年４月２５日に採取された。
【図８】本発明の植物（０１Ｐ８０１４６）と、市販品種であるシェラ（「９５Ｇ１９８６」と示されている；図８ａ〜８ｄ）との間の比較を示す図である。ａ図は採取された結球全体を示し、ｂ図は外葉のない芯を示し、ｃ図は芯の縦断面を示し、ｄ図は切断された芯葉を示す。本発明のレタス植物は、結球の芯が完全に赤いが、その他のレタス植物は異なる。すべての植物は、仏国アラモンで２００２年に栽培された。すなわち、２００２年１月１０日に播種され、２００２年２月１５日に秘密野外試験地に移植され、２００２年４月２５日に採取された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
芯を含めた結球全体にわたって赤い葉を有するラクチュカ・サチヴァ種の結球性レタス植物。
【請求項２】
４００ｎｍより短い波長の光線が存在しなくても、芯に赤い葉を有するラクチュカ・サチヴァ種のレタス植物。
【請求項３】
播種から観測時までの全期間の生育環境で、４００ｎｍより短い波長の光線が存在しない、請求項２に記載のレタス植物。
【請求項４】
芯葉におけるアントシアニンとクロロフィルの吸光度比Ａ５２３／Ａ６６５が４から５０の間である、請求項１から３のいずれか一項に記載のレタス植物。
【請求項５】
芯葉におけるアントシアニンとクロロフィルの吸光度比Ａ５２３／Ａ６６５が９から２７の間である、請求項４に記載のレタス植物。
【請求項６】
１ｃｍより大きい１０枚の最も若い芯葉におけるアントシアニンとクロロフィルの吸光度比Ａ５２３／Ａ６６５が４から５０の間である、請求項１から３のいずれか一項に記載のレタス植物。
【請求項７】
１ｃｍより大きい１０枚の最も若い芯葉におけるアントシアニンとクロロフィルの吸光度比Ａ５２３／Ａ６６５が９から２７の間である、請求項６に記載のレタス植物。
【請求項８】
芯における葉の赤色化をもたらす遺伝子構成であって、アントシアニン発現のための遺伝子座と、結球の芯の赤色化に関与する少なくとも２箇所の遺伝子座とを含み、赤色化の強度に関与する少なくとも２箇所の遺伝子座を含んでいてもよい遺伝子構成を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載のレタス植物。
【請求項９】
アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１３３７、ＮＣＩＭＢ４１３３８、およびＮＣＩＭＢ４１３３９で２００５年７月１８日に英国ＮＣＩＭＢに寄託された種子から入手可能な、請求項１から８のいずれか一項に記載のレタス植物。
【請求項１０】
アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１３３７、ＮＣＩＭＢ４１３３８、およびＮＣＩＭＢ４１３３９で２００５年７月１８日に英国ＮＣＩＭＢに寄託された種子の遺伝子構成であって、結球の芯における葉の赤色化をもたらす遺伝子構成を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載のレタス植物。
【請求項１１】
播種から観測時までの全期間の生育環境で４００ｎｍより短い波長の光線が存在しなくても、赤い葉を有するラクチュカ・サチヴァ種のレタス植物。
【請求項１２】
アントシアニンとクロロフィルの吸光度比Ａ５２３／Ａ６６５が４から５０の間である、請求項１１に記載のレタス植物。
【請求項１３】
アントシアニンとクロロフィルの吸光度比Ａ５２３／Ａ６６５が９から２７の間である、請求項１１に記載のレタス植物。
【請求項１４】
１ｃｍより大きい１０枚の最も若い芯葉におけるアントシアニンとクロロフィルの吸光度比Ａ５２３／Ａ６６５が４から５０の間である、請求項１１または１２に記載のレタス植物。
【請求項１５】
１ｃｍより大きい１０枚の最も若い芯葉におけるアントシアニンとクロロフィルの吸光度比Ａ５２３／Ａ６６５が９から２７の間である、請求項１４に記載のレタス植物。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか一項に記載のレタス植物の子孫。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか一項に記載のレタス植物の種子。
【請求項１８】
請求項１から１６のいずれか一項に記載のレタス植物の結球。
【請求項１９】
芯を含めた結球全体にわたる葉の赤色化をもたらす、ラクチュカ・サチヴァ種のレタス植物における遺伝子複合体であって、アントシアニン発現のための遺伝子座と、結球の芯の赤色化に関与する少なくとも２箇所の遺伝子座とを含み、赤色化の強度に関与する少なくとも２箇所の遺伝子座を含んでいてもよい遺伝子複合体。
【請求項２０】
アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１３３７、ＮＣＩＭＢ４１３３８、およびＮＣＩＭＢ４１３３９で２００５年７月１８日に英国ＮＣＩＭＢに寄託された種子に存在する、請求項１９に記載の遺伝子複合体。
【請求項１】
芯を含めた結球全体にわたって赤い葉を有するラクチュカ・サチヴァ種の結球性レタス植物。
【請求項２】
４００ｎｍより短い波長の光線が存在しなくても、芯に赤い葉を有するラクチュカ・サチヴァ種のレタス植物。
【請求項３】
播種から観測時までの全期間の生育環境で、４００ｎｍより短い波長の光線が存在しない、請求項２に記載のレタス植物。
【請求項４】
芯葉におけるアントシアニンとクロロフィルの吸光度比Ａ５２３／Ａ６６５が４から５０の間である、請求項１から３のいずれか一項に記載のレタス植物。
【請求項５】
芯葉におけるアントシアニンとクロロフィルの吸光度比Ａ５２３／Ａ６６５が９から２７の間である、請求項４に記載のレタス植物。
【請求項６】
１ｃｍより大きい１０枚の最も若い芯葉におけるアントシアニンとクロロフィルの吸光度比Ａ５２３／Ａ６６５が４から５０の間である、請求項１から３のいずれか一項に記載のレタス植物。
【請求項７】
１ｃｍより大きい１０枚の最も若い芯葉におけるアントシアニンとクロロフィルの吸光度比Ａ５２３／Ａ６６５が９から２７の間である、請求項６に記載のレタス植物。
【請求項８】
芯における葉の赤色化をもたらす遺伝子構成であって、アントシアニン発現のための遺伝子座と、結球の芯の赤色化に関与する少なくとも２箇所の遺伝子座とを含み、赤色化の強度に関与する少なくとも２箇所の遺伝子座を含んでいてもよい遺伝子構成を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載のレタス植物。
【請求項９】
アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１３３７、ＮＣＩＭＢ４１３３８、およびＮＣＩＭＢ４１３３９で２００５年７月１８日に英国ＮＣＩＭＢに寄託された種子から入手可能な、請求項１から８のいずれか一項に記載のレタス植物。
【請求項１０】
アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１３３７、ＮＣＩＭＢ４１３３８、およびＮＣＩＭＢ４１３３９で２００５年７月１８日に英国ＮＣＩＭＢに寄託された種子の遺伝子構成であって、結球の芯における葉の赤色化をもたらす遺伝子構成を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載のレタス植物。
【請求項１１】
播種から観測時までの全期間の生育環境で４００ｎｍより短い波長の光線が存在しなくても、赤い葉を有するラクチュカ・サチヴァ種のレタス植物。
【請求項１２】
アントシアニンとクロロフィルの吸光度比Ａ５２３／Ａ６６５が４から５０の間である、請求項１１に記載のレタス植物。
【請求項１３】
アントシアニンとクロロフィルの吸光度比Ａ５２３／Ａ６６５が９から２７の間である、請求項１１に記載のレタス植物。
【請求項１４】
１ｃｍより大きい１０枚の最も若い芯葉におけるアントシアニンとクロロフィルの吸光度比Ａ５２３／Ａ６６５が４から５０の間である、請求項１１または１２に記載のレタス植物。
【請求項１５】
１ｃｍより大きい１０枚の最も若い芯葉におけるアントシアニンとクロロフィルの吸光度比Ａ５２３／Ａ６６５が９から２７の間である、請求項１４に記載のレタス植物。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか一項に記載のレタス植物の子孫。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか一項に記載のレタス植物の種子。
【請求項１８】
請求項１から１６のいずれか一項に記載のレタス植物の結球。
【請求項１９】
芯を含めた結球全体にわたる葉の赤色化をもたらす、ラクチュカ・サチヴァ種のレタス植物における遺伝子複合体であって、アントシアニン発現のための遺伝子座と、結球の芯の赤色化に関与する少なくとも２箇所の遺伝子座とを含み、赤色化の強度に関与する少なくとも２箇所の遺伝子座を含んでいてもよい遺伝子複合体。
【請求項２０】
アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１３３７、ＮＣＩＭＢ４１３３８、およびＮＣＩＭＢ４１３３９で２００５年７月１８日に英国ＮＣＩＭＢに寄託された種子に存在する、請求項１９に記載の遺伝子複合体。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【公表番号】特表２００９−５０８５０４（Ｐ２００９−５０８５０４Ａ）
【公表日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３１６１４（Ｐ２００８−５３１６１４）
【出願日】平成１８年９月２０日（２００６．９．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００９２１７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３９１３７
【国際公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【出願人】（５００５０２２２２）ライク・ズワーン・ザードテールト・アン・ザードハンデル・ベスローテン・フェンノートシャップ (19)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２０日（２００６．９．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００９２１７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３９１３７
【国際公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【出願人】（５００５０２２２２）ライク・ズワーン・ザードテールト・アン・ザードハンデル・ベスローテン・フェンノートシャップ (19)
【Ｆターム（参考）】
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