酢酸菌の保管方法、食酢の製造方法及び保管された酢酸菌
【課題】長期保管に耐え、ラグタイムが安定していることから正確なスケジュールで生産可能であり、かつあらゆる食酢製造に利用できる汎用性の高い酢酸菌の保管方法の提供。
【解決手段】本発明の酢酸菌の保管方法は、一次希釈工程、遠心分離及び二次希釈工程、凍結工程、保管工程を含む。一次希釈工程では、深部培養法にて酢酸発酵中の発酵液を採取して希釈溶媒を添加することにより、酢酸濃度が４重量／容量％以下となるように希釈する。遠心分離及び二次希釈工程では、一次希釈工程で希釈された酢酸菌発酵液を遠心分離しかつ希釈溶媒を添加し、酢酸濃度が０．１重量／容量％以下となるように希釈する。凍結工程では、遠心分離及び二次希釈工程を経て酢酸濃度が０．１重量／容量％以下となった酢酸菌を含有する酢酸菌含有液を凍結する。保管工程では、凍結工程を経て凍結された酢酸菌含有液を−５℃以下で保管する。
【解決手段】本発明の酢酸菌の保管方法は、一次希釈工程、遠心分離及び二次希釈工程、凍結工程、保管工程を含む。一次希釈工程では、深部培養法にて酢酸発酵中の発酵液を採取して希釈溶媒を添加することにより、酢酸濃度が４重量／容量％以下となるように希釈する。遠心分離及び二次希釈工程では、一次希釈工程で希釈された酢酸菌発酵液を遠心分離しかつ希釈溶媒を添加し、酢酸濃度が０．１重量／容量％以下となるように希釈する。凍結工程では、遠心分離及び二次希釈工程を経て酢酸濃度が０．１重量／容量％以下となった酢酸菌を含有する酢酸菌含有液を凍結する。保管工程では、凍結工程を経て凍結された酢酸菌含有液を−５℃以下で保管する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、深部発酵法にて発酵中の食酢発酵液から採取した酢酸菌を、後日別の機会に酢酸発酵を行う際の種酢（発酵の種となる「種菌」を含む発酵液）として使用するために、菌の活性を維持した状態で保管しておく酢酸菌の保管方法、食酢の製造方法、及び保管された酢酸菌に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
食酢の深部醗酵法では、発酵を開始する際に仕込み液に種酢を添加する必要がある。そして、従来においては、発酵中の食酢発酵液の一部を採取して残しておき、これを種酢として次の仕込み液に速やかに直接添加する方法が通常よく実施されている。しかしながら、この方法では種酢となるべき食酢の発酵を常に維持しておく必要があり、無駄な食酢ができるという問題点があった。
【０００３】
また、食酢製造用酢酸菌用培地にて前培養された前培養液をあらかじめ用意し、発酵を開始する際にこれを種酢として仕込み液に添加する方法も従来提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載の従来方法の場合、本発酵用の発酵装置とは別に小スケールの前培養用発酵装置を稼動させなければならず、二度手間で作業効率が悪いという問題がある。
【０００５】
それゆえ、食酢発酵液を採取及び保管しておき、生産計画に合わせて後日これを種酢として利用する技術が従来強く望まれている。そして、このような保管技術の一例として、深部発酵法にて発酵中の食酢の発酵液を、希釈溶媒の添加により酢酸濃度が２重量／容量％以上５重量／容量％以下となるように希釈し、かつ、液温が０℃以上１５℃以下となるように冷却して、２４時間以上保管する食酢発酵液の保管方法が提案されている（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−３３１１１号公報
【特許文献２】特開２００７−１６６９２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献２に記載の保管方法は、１週間程度か、長くても数ヶ月程度という短期間の保管にしか適用できないため、それ以上の期間保管したいような場合には適さない。また、特許文献２に記載の保管方法で保管した食酢発酵液を種酢として用いた場合、食酢発酵が立ち上がるまでの時間（ラグタイム）にばらつきが大きくなり、生産計画を正確に立てることができないという不具合が想定される。さらに、特許文献２に記載の方法によって例えば３ヶ月以上保管をすると、当該保管した食酢発酵液を種酢として用いて食酢発酵を行った場合に発酵の立ち上がりまでの時間（ラグタイム）が長くかかってしまうか、あるいは発酵が立ち上がらないという不具合が想定される。
【０００８】
また、特許文献２に記載の保管方法の場合、保管される発酵液には、酢酸菌の他、それぞれの食酢の種類に必要な原料の成分（例えばリンゴ酢ならリンゴ成分、米酢なら米の成分）が含まれている。そのため、保管された発酵液を使用できる範囲（使用できる食酢の種類）が極めて限定されたものとなる。
【０００９】
ここで、従来における他の菌保管方法として、次のような方法もある。即ち、発酵中の発酵液を採取後、希釈せずに遠心分離を行い、分離された沈殿物にグリセロールや糖化液などの菌凍結保存剤を添加する。そして、菌凍結保存剤が添加された菌沈殿物を凍結して、−８０℃程度の極低温で保管する、という方法である。この方法のメリットは、長期間（例えば３ヶ月〜半年）の保存が可能なことである。
【００１０】
しかしながら、極低温で保管する上記従来方法は、食酢の実生産工程に用いる種酢としての発酵液を保管するのには不向きである。なぜなら、実生産において発酵をすぐに立ち上げるだけの酢酸菌数を含む発酵液を−８０℃で保管するためには、大掛かりな設備と多くのコストがかかってしまい、現実的ではないからである。また、菌凍結保存剤を添加した酢酸菌発酵液は、食酢の発酵工程の種酢として用いると、本来の食酢原料以外の原料が混入することとにもなり得るため、好ましくないからである。勿論、食酢製造工程から抜き出した糖化液を菌凍結保存剤として用いるような場合は問題ないが、少なくとも使用できる品種が限定されることになり、やはり好ましくない。
【００１１】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、例えば半年〜１年程度の長期間の保管に耐え、ラグタイムが安定していることから正確なスケジュールで生産可能であり、かつあらゆる食酢製造に利用できる汎用性の高い酢酸菌の保管方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の課題を解決すべく、本願発明者が鋭意検討を行ったところ、深部発酵中の酢酸発酵液から採取した発酵液をあらかじめ希釈してから遠心分離及び希釈を行うことで所定の酢酸濃度以下とし、これを凍結することで、格段に長期の保管が可能となることを新規に見出した。そして、本願発明者は、この新規な知見に基づいてさらに鋭意検討を行い、下記の課題解決手段［１］〜［８］を完成させた。
【００１３】
［１］深部培養法にて酢酸発酵中の発酵液を採取して希釈溶媒を添加することにより、酢酸濃度が４重量／容量％以下となるように希釈する一次希釈工程と、前記一次希釈工程で希釈された酢酸菌発酵液を遠心分離しかつ希釈溶媒を添加することにより、酢酸濃度が０．１重量／容量％以下となるように希釈する遠心分離及び二次希釈工程と、前記遠心分離及び二次希釈工程を経て酢酸濃度が０．１重量／容量％以下となった酢酸菌を含有する酢酸菌含有液を凍結する凍結工程と、前記凍結工程を経て凍結された酢酸菌含有液を−５℃以下で保管する保管工程とを含むことを特徴とする酢酸菌の保管方法。
【００１４】
［２］前記酢酸発酵中の発酵液を採取してから前記酢酸菌含有液を凍結するまでの作業を７２時間以内に行うことを特徴とする上記手段１に記載の酢酸菌の保管方法。
【００１５】
［３］前記遠心分離及び二次希釈工程において、遠心分離の際に希釈溶媒を注ぎ入れることにより遠心分離と希釈とを同時に行うことを特徴とする上記手段１または２に記載の酢酸菌の保管方法。
【００１６】
［４］前記凍結工程にて凍結される酢酸菌含有液には、菌凍結保存剤が添加されていないことを特徴とする上記手段１乃至３のいずれか１項に記載の酢酸菌発酵液の保管方法。
【００１７】
［５］前記保管工程において、３０日以上の期間保管することを特徴とする上記手段１乃至４のいずれか１項に記載の酢酸菌の保管方法。
【００１８】
［６］上記手段１乃至５のいずれか１項に記載の方法により保管された酢酸菌。
【００１９】
［７］上記手段１乃至５のいずれか１項に記載の方法により保管された酢酸菌を種菌として用いて酢酸発酵を行うことで、食酢を製造することを特徴とする食酢の製造方法。
【発明の効果】
【００２０】
従って、請求項１〜５に記載の発明によると、例えば半年〜１年程度の長期間の保管に耐え、ラグタイムが安定していることから正確なスケジュールで生産可能であり、かつあらゆる食酢製造に利用できる汎用性の高い酢酸菌の保管方法を提供することができる。また、請求項６に記載の酢酸菌、請求項７に記載の製造方法によれば、効率のよい酢酸発酵が可能となり、目的とする食酢を確実に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を具体化した一実施の形態を詳細に説明する。
【００２２】
本発明における深部培養法にて用いられる酢酸菌としては特に限定されないが、例えばアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属の酢酸菌が用いられる。アセトバクター属酢酸菌の好適な具体例としては、アセトバクター・アセチＩＦＯ３２８１（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ ＩＦＯ３２８１）株、アセトバクター・アセチＩＦＯ３２８３（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ ＩＦＯ３２８３）株などがある。これらの酢酸菌は１０．０重量／容量％以下の酢酸濃度で食酢の発酵生産に用いられる酢酸菌であるが、高酸度食酢用の酢酸菌を用いることも可能である。その具体例としては、アセトバクター・ヨーロペウス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）などがある。
【００２３】
本発明において酢酸濃度とは、以下のようにして測定し、計算した結果得られる酢酸換算濃度（重量／容量％）のことを意味する。即ち、測定用試料として食酢（発酵液）５ｍＬをビーカーにとり、１Ｎ水酸化ナトリウムを用い、フェノールフタレインを指示薬として中和滴定し、得られた滴定量（ｍＬ）を１．２倍して酢酸濃度換算した値を酸度とし、％であらわした。
【００２４】
本発明において食酢発酵液を得るための深部培養法とは、培養装置内の発酵液に対する積極的な通気・攪拌を行うことにより、発酵液全体に酸素を供給し、液表面のみならずその深部についてまでも酢酸菌を生育させて発酵を行わせる培養法のことを指し、通常は表面発酵法と対比される。
【００２５】
深部培養を行うための装置としては特に限定されず、一般的な通気攪拌型の深部発酵装置を用いることができる。攪拌については従来公知の手段を採用することができ、例えばプロペラやロータ等の攪拌機を使用することが好適である。また、通気についても同様に従来公知の手段を採用することができ、その具体例としては、空気や酸素等の気体を通気管を通じて供給する方法などが挙げられる。通気量については発酵状況に応じて適宜設定すればよい。例えば、０．０２〜１ｖｖｍ（通気容量／発酵液量／分）の通気量にして、気体を発酵液の下部に供給し、これを攪拌機で微細化・拡散させ、発酵液中の溶存酸素が０．２〜８ｐｐｍ程度で維持されるように制御すればよい。
【００２６】
また、発酵形式についても、回分発酵法、半連続発酵法、二段発酵法など、従来から実施されてきた各種の方式を採用することができる。
【００２７】
そして、上記の深部培養法により得られた発酵中の食酢発酵液は、以下のようにして希釈される（一次希釈）。
【００２８】
食酢発酵液としては発酵中のもの（即ち酢酸生成中のもの）を採取する必要があり、より好ましくは発酵の初期段階及び終期段階を除く期間（便宜上、中期段階と呼ぶ。）のものを採取することがよい。この期間の食酢発酵液には、活性の高い酢酸菌が多く含まれているため、保管をする対象として適当だからである。これに対し、発酵の初期段階では発酵がまだ十分に開始していないため菌体の数が少なく、発酵の終期段階ではもはや菌体の活性が高いとはいえないため、いずれも長期にわたる保管をするのに適していないからである。
【００２９】
発酵中の食酢発酵液の採取時における酢酸菌の濃度は特に限定されず、使用する酢酸菌の種類によっても異なるが、例えば１０６個／ｍＬ以上であることが好ましく、特には１０７個／ｍＬ以上であることが好ましい。長期にわたり保管を行った場合、活性を有する酢酸菌数の減少はある程度避けられないが、あらかじめ高濃度の酢酸菌を採取しておけば、必要とする酢酸菌数を確保しやすくなるからである。
【００３０】
発酵中の食酢発酵液の液温はいわゆる常温であり、より詳しくいうと２０℃以上４０℃以下である。また、発酵中の食酢発酵液における酢酸濃度は、使用する酢酸菌の種類により異なるが、概して５重量／容量％以上である。また、発酵中の食酢発酵液においてアルコール（主としてエチルアルコール）は、通常０．１〜３．０重量／容量％程度含まれている。
【００３１】
酢酸発酵工程におけるアルコール濃度の測定の際には、精度の高いアルコール測定装置であるガスクロマトグラフィーや、ガスセンサーなどを利用するのが好ましい。例えば、島津製作所製ガスクロマトグラフィー（ＧＣ−１７Ａ）で、ＧＬサイエンス製カラム（ＴＣ−ＷＡＸ：０．５３ｍｍ×３０ｍ）を用い、ディテクション２２０℃、カラム温度４０℃で５分間保持し、４℃／分の条件で２２０℃まで昇温させて２２０℃で１０分保持する測定条件で、試料を１μＬ用いる方法などが例示される。
【００３２】
本発明における一次希釈は、採取した発酵中の食酢発酵液と希釈溶媒とを混合することにより行われる。かかる混合が行われる場所は、深部発酵用発酵装置の中であってもよいが、それとは別に用意された保管容器の中であってもよい。また、発酵装置から分岐している食酢発酵液の配管と、希釈溶媒が供給される配管とが合流することにより、連続的に混合されるような形態であってもよい。
【００３３】
ここで希釈溶媒としては、少なくとも採取した発酵中の食酢発酵液よりも酢酸濃度が低い溶液であれば任意の液体を使用することができる。ただし、後に食酢発酵のための種酢として使用する予定があるような場合の希釈溶媒としては、食酢成分として許容される成分（例えば水、原料糖液、アルコールなど）のみを含む液体を使用することが望ましい。水以外の成分を含んだ希釈溶媒を用いると、保管された菌を使用できる食酢の品種が限定されてしまう（例えば、純米酢は、米と水のみを原料として製造するため、他からアルコール分や糖分を混入できない）ため、特には水を使用することが望ましい。もちろん、純水だけに限らす若干のミネラル分等が含まれている水（水道水など）を用いてもよい。もちろん、遠心分離及び二次希釈工程において用いる希釈溶媒も上記と同様であり、水が好ましい。
【００３４】
そして一次希釈工程においては、このような希釈溶媒の添加によって、発酵中の食酢発酵液は、酢酸濃度が４重量／容量％以下となるように希釈される。仮に、希釈を行わないか、または酢酸濃度を４重量／容量％を超える程度に希釈した場合には、遠心分離工程を経ることで酢酸菌にダメージを与えてしまう。
【００３５】
この段階では、必要以上に希釈をすることは、以下の理由により好ましくない場合がある。即ち、初期の酢酸濃度や希釈する量などにもよるが、この段階で必要以上に希釈をすると、遠心分離にかける酢酸菌発酵液の量が多くなってしまうため、遠心分離工程に時間を要してしまう。その結果、酢酸発酵中の発酵液を採取してから酢酸菌含有液を凍結するまでの時間が必要以上にかかってしまい、菌にダメージを与えやすくなるため好ましくない。よって、一次希釈工程においては酢酸濃度が０．５重量／容量％以上となるように留めておく方が好ましい。
【００３６】
一次希釈工程では、液温を下げることは必須ではないが、低温とする方が菌へのダメージを抑えやすく好ましい。好ましくは２０℃以下、更に好ましくは１０℃以下、とすれば十分である。希釈時の温度は低い方が好ましい。なお、液温を下げるための手法としては、例えば冷却装置を用いながら一次希釈を行ってもよいほか、冷却装置を用いず希釈溶媒として冷水や氷水を使用して一次希釈を行ってもよい。
【００３７】
一次希釈工程で希釈された酢酸菌発酵液は、遠心分離機によって遠心分離を行う。使用する遠心分離機は、連続式でも回分式でも構わない。連続式の遠心分離機とは、連続的に分離用液を供給しながら、上清と沈降物とを分離していく形式であって、例えば斉藤遠心機工業製の遠心分離機（ADS-1001CS）などが利用できる。また、回分式の遠心分離機とは、分離液の供給、遠心分離の操作が分かれているものであって、例えば久保田商事株式会社のＫＵＢＯＴＡ３７００などが利用できる。処理量が多い場合には、沈降物を短時間で採取できる連続式が適している。処理量が少ない場合には、処理条件の微調整がいらない回分式が簡易であり適している。
【００３８】
本発明では凍結前に酢酸濃度を０．１重量／容量％以下となるように希釈する必要があるが（二次希釈）、その方法としては例えば以下のようなものが採用できる。
【００３９】
一次希釈された酢酸菌発酵液を連続式の遠心分離機に流入させながら遠心分離を行い、前記酢酸菌発酵液を全て流入させた後、続いて希釈溶媒を連続的に遠心分離機に流入させて所定時間遠心分離を行うことによって主に上清部分を希釈して、その結果遠心分離機内の酢酸濃度を下げる。そして、最終的に遠心分離機に蓄積された沈殿層を取り出し、凍結前の酢酸菌含有液とする。
【００４０】
あるいは、一次希釈された酢酸菌発酵液を回分式の遠心分離機に流入させて所定時間遠心分離を行い、沈殿物だけを採取して希釈溶媒と混合する。その後さらに回分式の遠心分離機に流入させて遠心分離を行い、最終的に遠心分離機に蓄積された沈殿層を取り出し、凍結前の酢酸菌含有液とする。
【００４１】
連続式の遠心分離機を用いた場合、作業性が向上するため好ましい。それだけでなく、一次希釈工程から遠心分離までの時間が短くて済むようになり、結果として酢酸存在下での酢酸菌へのダメージを与え難くなる（活性のある菌数が多くなる）ため、好ましい。
【００４２】
なお、遠心分離機の容量、回転数、動力は、遠心分離の処理をしたい量などに合わせて適宜選択すればよい。
【００４３】
遠心分離及び二次希釈工程においては、酢酸菌含有液の酢酸濃度が０．１重量／容量％以下となるまで希釈される。仮に、酢酸濃度が０．１重量／容量％を超える程度にしか希釈をしなかった場合、凍結保存中に酢酸菌がダメージを受けてしまい、活性のある酢酸菌数が減少してしまう。この結果、所定期間（例えば半年）保管した後に食酢発酵の種菌として用いた場合に、発酵立ち上がりまでのラグタイムが長く（例えば９６時間以上）かかってしまい、好ましくない。
【００４４】
この段階では、必要以上に希釈をすることは、以下の理由により好ましくない場合がある。即ち、遠心分離及び二次希釈を行う酢酸菌発酵液の量などにもよるが、この段階で必要以上に希釈をしようとすると、遠心分離にかける量が多くなってしまい、その結果凍結までの時間が長くかかってしまうことになる。あるいは、時間をかけないために遠心分離を十分に行わなければ、凍結保存する酢酸菌含有液の量が多くなってしまうため、保管設備費用や維持費用などが多くかかってしまい好ましくない。よって、遠心分離及び二次希釈工程においては酢酸濃度が０．００１重量／容量％以上となるように留めておく方が好ましい。
【００４５】
遠心分離及び二次希釈工程を経た段階（凍結直前）の酢酸菌含有液中には、できるだけ多くの酢酸菌が含まれていることが好ましく、具体的には１０７個／ｍＬ以上、特には１０８個／ｍＬ以上含まれていることがよい。酢酸菌の濃度が高ければ、保管期間が長期にわたった場合でも、種酢等としての利用が可能になるからである。
【００４６】
本発明において酢酸菌含有液を凍結する方法としては、従来公知の任意の方法を採用することができる。その好適な例を挙げると、例えば、酢酸菌含有液を凍結保管用のネジ式キャップチューブに入れ、それを−２０〜８０℃の冷凍庫に静置する方法などがある。
【００４７】
ここで、凍結を行うときのスピードは特に限定されないが、酢酸発酵中の発酵液を採取してから酢酸菌含有液を凍結するまでの作業時間をできるだけ短く（７２時間以内）することが必要であるため、できるだけ急速に凍結することが好ましい。当該作業時間を７２時間以内とするのは、菌体の活性をできるだけ維持した状態で凍結休眠状態に移行させるためである。好ましくは４８時間以内であり、さらに好ましくは２４時間以内であり、短いほどよい。
【００４８】
酢酸菌含有液は、酢酸菌の休眠状態を維持するため、凍結後に−５℃以下で保管される。この場合、さらに低温で保管した方が保管中の酢酸菌の活性を完全に抑えることができ、種菌として使用する際の活性のある酢酸菌数が多い状態で保管することができる。好ましくは−２０℃以下、より好ましくは−３０℃以下で保管することがよい。ただし、これ以上低温で保管しても、保管後の活性のある酢酸菌数は大きく変化せず、種菌として使用する際のラグタイムも変化しない。よって、設備コストや電力コストを考慮すると、−２０〜−３０℃が好ましい。
【００４９】
通常、研究所等において菌体を凍結保存するような場合には、グリセロールや糖化液などの菌凍結保存剤を１５〜５０％程度添加する。しかしながら、本発明の方法を用いれば、そのような菌凍結保存剤を使用しなくても、酢酸菌の活性が高い状態で長期保存を達成することが可能となる。保管する酢酸菌にグリセロールや糖化液を添加してしまうと、食酢の品種によっては、食酢の原料以外の成分が混入することになる。つまり、種菌として活用できる食酢の品種を限定してしまうこととなる。
【００５０】
菌凍結保存剤の例としては、グリセロールや糖化液の他に、例えばＤＭＳＯやスキムミルクなどがある。
【００５１】
そして、上述のように希釈及び冷却された食酢発酵液は、凍結した状態で長期間保管される。短期保管（例えば２９日以内）の場合には、本発明の方法を適用しなくとも特許文献２の方法などが利用可能である。ゆえに、本発明の方法は、３０日間以上、特には半年〜１年以上保管する場合に好適である。例えば本発明の保管方法によれば、年間数回しか生産されない小ロット品に対し、その食酢の品種に最適な能力を持った酢酸菌を保管することができる。
【００５２】
以上示した方法で保管しておいた食酢発酵液は、たとえ保管が長期にわたっていたとしても、好適な菌体活性を維持する。従って、これを別の酢酸発酵を行う際に種酢として使用して酢酸発酵を行えば、酢酸発酵を速やかに開始することができる。よって、前回の深部培養法と同様に深部培養法を行うことにより、所望の食酢を効率よく製造することができる。また本発明によれば、保管しておいた食酢発酵液中には菌凍結保存剤やその他の添加剤が何ら含まれていないため、これを種酢として用いたとしても食酢の風味、品質、純度等を低下させることにはつながらない。
【００５３】
以下に本発明をより具体化した実施例を記載するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５４】
[実施例１]保管用酢酸菌の作製（試験例１）
（１）本発明の方法による保管用酢酸菌の作製
【００５５】
（ａ）深部発酵が可能な発酵タンク（５Ｌ容量：ミツワ理化学工業社製）を用い、あらかじめ１Ｌの食酢発酵液を用意した。この食酢発酵液は米を原材料とする仕込液とアセトバクター・アセチを用いて培養されたものであって、酢酸濃度が８．０重量／容量％、アルコール濃度が０．３容量／容量％、液温が３０℃〜３５℃程度、酢酸菌濃度が約１０７個／ｍＬとなっている。
【００５６】
（ｂ）このような食酢発酵液を発酵の中期段階、即ち菌体の活性が高く発酵が盛んに起こっている段階で１６０ｍＬ採取して、これを、希釈溶媒である１５℃の水２０ｍＬをあらかじめ入れておいた８本の５０ｍＬ遠心分離用チューブ（耐酸性を有する保管容器）に２０ｍＬずつ速やかに添加し、両液を混合し４０ｍＬとした。希釈後の酢酸濃度は４．０重量／容量％であった。
【００５７】
（ｃ）次に、希釈された食酢発酵液を回分式遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ３７００ 久保田商事株式会社製）で、８０００ｒｐｍで遠心分離を５分間行った。遠心分離後、上清を全て廃棄し、２７℃の水を４０ｍＬ加えて沈澱を懸濁し、再度８０００ｒｐｍで遠心分離を５分間行った。遠心分離後、上清をすべて廃棄し、２７℃の水１ｍＬで沈澱を懸濁した。懸濁後の酢酸濃度は０．１重量／容量％であった。
【００５８】
（ｄ）懸濁した沈澱液は密閉性の高い１．５ｍＬ容量ポリプロピレン容器に入れ、冷凍庫に保管し２時間のうちに−３０℃に冷却した。このようにして保管菌サンプル１を作製した。なお、酢酸発酵中の発酵液を採取してから酢酸菌含有液を凍結するまでの作業時間は３時間であった。
さらに、基本的には上記方法と同じであるが、酢酸発酵中の発酵液を採取してから酢酸菌含有液を凍結するまでの作業時間を２４時間としたものを作製し、保管菌サンプル５とした。また、基本的には上記方法と同じであるが、酢酸発酵中の発酵液を採取してから酢酸菌含有液を凍結するまでの作業時間を７２時間としたものを作製し、保管菌サンプル６とした。
【００５９】
（２）希釈をせずに遠心分離と凍結とをした保管用酢酸菌の作製
【００６０】
（ａ）深部発酵が可能な発酵タンク（５Ｌ容量：ミツワ理化学工業社製）を用い、あらかじめ１Ｌの食酢発酵液を用意した。この食酢発酵液は米を原材料とする仕込液とアセトバクター・アセチを用いて培養されたものであって、酢酸濃度が８．０重量／容量％、アルコール濃度が０．３容量／容量％、液温が３０℃〜３５℃程度、酢酸菌濃度が約１０７個／ｍＬとなっている。
【００６１】
（ｂ）このような食酢発酵液を発酵の中期段階、即ち菌体の活性が高く発酵が盛んに起こっている段階で３２０ｍＬ採取して、一次希釈を行うことなく８本の５０ｍＬ遠心分離用チューブ（耐酸性を有する保管容器）に速やかに４０ｍＬずつ投入した。
【００６２】
（ｃ）次に、投入した食酢発酵液を回分式遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ３７００ 久保田商事株式会社製）で、８０００ｒｐｍで遠心分離を５分間行った。遠心分離後、上清を全て廃棄した。沈澱液の酢酸濃度は８．０重量／容量％であった。
【００６３】
（ｄ）そして、二次希釈を行うことなく、沈澱を回収した容器をそのまま冷凍庫に保管し、２時間のうちに−３０℃に冷却した。このようにして保管菌サンプル２を作製した。なお、酢酸発酵中の発酵液を採取してから酢酸菌含有液を凍結するまでの作業時間は３時間であった。
【００６４】
（３）一次希釈をせずに遠心分離をかけ、その後は本発明の方法のようにした保管用酢酸菌の作製
【００６５】
（ａ）深部発酵が可能な発酵タンク（５Ｌ容量：ミツワ理化学工業社製）を用い、あらかじめ１Ｌの食酢発酵液を用意した。この食酢発酵液は米を原材料とする仕込液とアセトバクター・アセチを用いて培養されたものであって、酢酸濃度が８．０重量／容量％、アルコール濃度が０．３容量／容量％、液温が３０℃〜３５℃程度、酢酸菌濃度が約１０７個／ｍＬとなっている。
【００６６】
（ｂ）このような食酢発酵液を発酵の中期段階、即ち菌体の活性が高く発酵が盛んに起こっている段階で３２０ｍＬ採取して、これを８本の５０ｍＬ遠心分離用チューブ（耐酸性を有する保管容器）に速やかに４０ｍＬずつ投入した。
【００６７】
（ｃ）次に、この食酢発酵液を回分式遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ３７００ 久保田商事株式会社製）で、８０００ｒｐｍで遠心分離を５分間行った。遠心分離後、上清を全て廃棄し、２７℃の水を４０ｍＬ加えて沈澱を懸濁し、再度８０００ｒｐｍ程度で遠心分離を５分間行った。遠心分離後、上清をすべて廃棄し、２７℃の水１ｍＬで沈澱を懸濁した。沈澱液の酢酸濃度は０．１重量／容量％であった。
【００６８】
（ｄ）懸濁した沈澱液は、密閉性の高い１．５ｍＬ容量ポリプロピレン容器に入れて冷凍庫に保管し、２時間のうちに−３０℃に冷却した。このようにして保管菌サンプル３を作製した。なお、酢酸発酵中の発酵液を採取してから酢酸菌含有液を凍結するまでの作業時間は３時間であった。
【００６９】
（４）一次希釈の後、遠心分離及び二次希釈工程を行うが０．２％までしか希釈をしない保管用酢酸菌の作製
【００７０】
（ａ）深部発酵が可能な発酵タンク（５Ｌ容量：ミツワ理化学工業社製）を用い、あらかじめ１Ｌの食酢発酵液を用意した。この食酢発酵液は米を原材料とする仕込液とアセトバクター・アセチを用いて培養されたものであって、酢酸濃度が７．０重量／容量％、アルコール濃度が０．３容量／容量％、液温が３０℃〜３５℃程度、酢酸菌濃度が約１０７個／ｍＬとなっている。
【００７１】
（ｂ）このような食酢発酵液を発酵の中期段階、即ち菌体の活性が高く発酵が盛んに起こっている段階で１６０ｍＬ採取して、これを、希釈溶媒である１５℃の水をあらかじめ入れておいた８本の５０ｍＬ遠心分離用チューブ（耐酸性を有する保管容器）に速やかに２０ｍＬずつ添加し、両液を混合し４０ｍＬとした。希釈後の酢酸濃度は４．０重量／容量％であった。
【００７２】
（ｃ）次に、この食酢発酵液を回分式遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ３７００ 久保田商事株式会社製）で、８０００ｒｐｍで遠心分離を５分間行った。遠心分離後、上清を１ｍＬ残して廃棄し、２７℃の水１６．５ｍＬで沈澱を懸濁した。懸濁後の酢酸濃度は０．２重量／容量％であった。
【００７３】
（ｄ）懸濁した沈澱液は密閉性の高い１．５ｍＬ容量ポリプロピレン容器に入れ、冷凍庫に保管し２時間のうちに−３０℃に冷却した。このようにして保管菌サンプル４を作製した。なお、酢酸発酵中の発酵液を採取してから酢酸菌含有液を凍結するまでの作業時間は３時間であった。
【００７４】
［実施例２］保管した酢酸菌を用いての発酵試験（試験例２）
試験例１で作製した保管菌サンプル１〜６を半年保管したものを食酢発酵に用いて比較した。米を原材料とする仕込み液をあらかじめ３Ｌ入れておいた深部発酵用の発酵タンク（５Ｌ容量：ミツワ理化学工業社製）内に各々の保管菌サンプルを投入した。なお、投入した保管菌サンプルの量は、それぞれの保管菌サンプルを作製する段階において、同量の発酵液（発酵液量で１５ｍＬ）から作製された保管菌サンプル量として初発の菌数を統一した。
【００７５】
この後、通気攪拌を行いながら、常法に従って酢酸菌の深部発酵を所定時間継続的に行い、玄米酢を製造した。仕込み液には、酒、種酢（菌体除去したもの）を混合したものを用いた。
【００７６】
ここで、培養を開始してから酢酸濃度が０．１％上昇し始めるまでの時間（つまり、発酵開始までのラグタイム）を保管菌サンプル１〜６についてそれぞれ計測した。これらの結果を表１に示す。
【００７７】
【表１】
（試験結果）
表１によると、保管菌サンプル２〜４では、発酵開始までのラグタイムが７２時間以上となってしまうことがわかった。ここで、実用上好ましいラグタイムの程度が７２時間以内、好ましくは４８時間以内であると定義した場合、保管菌サンプル２〜４の方法では、長期にわたる保管ができないことが明らかとなった。
【００７８】
これに対し、保管菌サンプル１，５，６については発酵開始までのラグタイム４０時間程度であることから、明らかに上記の好適範囲内であり、４８時間以内に収まっていた。従って、保管菌サンプル１，５，６の手順を踏めば、かなりの長期にわたって保管が可能になることが明らかになった。なお、保管菌サンプル１，５，６について、さらに酢酸濃度が１．５％上昇し始めるまでの時間を調査したところ、保管菌サンプル１，５では殆ど差がなかったが、保管菌サンプル６では時間が長くなる傾向が見られた。
【００７９】
［実施例３］本発明の保管方法により得た保管菌の多品種食酢への応用実験
試験例１の保管菌サンプル１を、米、玄米、ブドウ、リンゴ、をそれぞれ原料とする仕込み液３Ｌをあらかじめ入れておいた深部発酵用の発酵タンク（５Ｌ容量：ミツワ理化学工業社製）内に投入し、通気攪拌を行いながら、常法に従って酢酸菌の深部発酵を所定時間継続的に行い、米酢、黒酢、ブドウ酢、リンゴ酢を製造した。仕込み液には、米酢は米で作った酒と米酢の種酢（菌体除去したもの）とを混合したもの、黒酢は玄米で作った酒と黒酢の種酢（菌体除去したもの）とを混合したもの、ブドウ酢はブドウで作った酒とブドウ酢の種酢（菌体除去したもの）とを混合したもの、リンゴ酢はリンゴで作った酒とリンゴ酢の種酢（菌体除去したもの）とを混合したもの、を用いた。なお、投入した保管菌サンプルの量は、それぞれの保管菌サンプルを作製する段階において、同量の発酵液（発酵液量で１５ｍＬ）から作製された保管菌サンプル量として初発の菌数を統一した。
【００８０】
それぞれ保管菌サンプル投入から発酵開始までのラグタイムは、米酢は６０時間、黒酢は４０時間、ブドウ酢は６０時間、リンゴ酢は４０時間であり、全て７２時間以内となり、実生産で使用するにあたって良好な結果となった。また、余分な成分の有無を分析したところ、保管菌サンプル１を作製した食酢発酵液（玄米酢）由来の成分（アミノ酸、有機酸、糖など）は１／１０００００（１０万分の１）以下の濃度であり、玄米としては０．０６４５ｐｐｍ以下の含有量ということになり、本発明による保管菌を異品種の食酢製造に用いても問題がないレベルであることがわかった。
【００８１】
[実施例４]保管用酢酸菌の作製（遠心分離処理量大量）
（１）試験例１よりも大量の発酵液を遠心分離処理して保管菌を作製した。手順を以下に記載する。
【００８２】
（ａ）工場の大型発酵タンク５ｋＬで深部発酵している食酢発酵液を用意した。この食酢発酵液は米を原材料とする仕込液とアセトバクター・アセチを用いて培養されたものであって、酢酸濃度が８．０重量／容量％、アルコール濃度が０．３容量／容量％、液温が３０℃〜３５℃程度、酢酸菌濃度が約１０７個／ｍＬとなっている。
【００８３】
（ｂ）このような食酢発酵液を発酵の中期段階、即ち菌体の活性が高く発酵が盛んに起こっている段階で２０Ｌ採取して、これを、希釈溶媒である１５℃の水をあらかじめ１８０Ｌ入れておいたＳＵＳ製タンク（耐酸性を有する保管容器）に速やかに添加し、両液を混合した。混合液の酢酸濃度は０．８重量／容量％であった。
【００８４】
（ｃ）次に、希釈された食酢発酵液をタンクから連続式遠心分離機（ADS-1001CS 斉藤遠心機工業製）へ２００Ｌ／ｈで送液し、８０００ｒｐｍで遠心分離を行った。この時、上清は自動的に遠心機の外へ排出され、沈澱は遠心機内に溜まっていく。希釈された食酢発酵液を全て遠心分離後、１５℃の水１００Ｌを続けて同遠心機へ２００Ｌ／ｈで送液し、遠心機内の液体酢酸濃度を低下させた。水１００Ｌを全て遠心機へ投入した後、遠心機内に溜まっていた沈澱液を一気に排出し、回収した。回収液は約３Ｌであり、酢酸濃度は０．１重量／容量％であった。この沈澱液は５００ｍＬ容量ポリプロピレン容器（冷凍保管に耐えうる容器）に入れ、冷凍庫に保管し４時間のうちに−３０℃に冷却した。このようにして保管菌サンプル７を作製した。なお、酢酸発酵中の発酵液を採取してから酢酸菌含有液を凍結するまでの作業時間は７時間であった。
【００８５】
（２）作製した保管菌サンプル７を半年保管したものを実生産食酢発酵に用いた。即ち、米を原材料とする仕込み液をあらかじめ深部発酵用の大型発酵タンクに２ｋＬ入れておき、そこにこの保管菌を投入した。投入した保管菌の量は、発酵液２０Ｌ分から回収した菌体量（回収液３Ｌ全量）とした。
【００８６】
この後、通気攪拌を行いながら、常法に従って酢酸菌の深部発酵を所定時間継続的に行い、玄米酢を製造した。仕込み液には、米で作った酒と玄米酢の種酢（菌体除去したもの）とを混合したものを用いた。
【００８７】
保管菌サンプル投入から発酵開始までのラグタイムは４０時間となり、実生産で使用するにあたって良好な結果となった。従って、保管菌サンプル７の手順を踏めば、かなりの長期にわたって保管が可能であり、実生産の発酵で立上げ菌として使用可能であることが明らかになった。
【００８８】
（全体としての結論）
従って、上述した本発明によれば以下の効果を得ることができる。即ち、本発明にかかる酢酸菌の発酵方法によれば、あらゆる食酢製造に利用できる汎用性の高い酢酸菌の種菌を、低コストで長期間（例えば半年〜１年程度）保管することができる。保管する酢酸菌も食酢の品種ごとに用意する必要がなく極めて効率的である。また、当該保管した種菌を用いて食酢発酵を行えば、短期間（例えば４８時間以内）のラグタイムで発酵が立ち上がるため、あらゆる食酢の多品種少ロット生産の要請にも柔軟に対応することができる。しかも、ラグタイム自体が安定しており、生産計画に忠実な発酵を実施することが可能である。
【００８９】
以下、前述した実施の形態によって把握される技術的思想を以下に列挙する。
（１）請求項１乃至７のいずれか１項において、前記希釈溶媒は、食酢成分として許容される成分のみを含む液体であること。
（２）請求項１乃至７のいずれか１項において、前記希釈溶媒が水であること。
（３）請求項１乃至７のいずれか１項において、前記希釈溶媒が冷水または氷水であること。
（４）請求項１乃至７のいずれか１項において、深部培養法にて発酵中の食酢発酵液として、発酵の初期段階及び終期段階を除く期間にて採取されたものを用いること。
（５）請求項１乃至７のいずれか１項において、深部培養法にて発酵中の食酢発酵液として、酢酸菌の生育速度が安定している状態で採取されたものを用いること。
（６）請求項１乃至７のいずれか１項において、深部培養法にて発酵中の食酢発酵液として、酢酸菌濃度が１０７個／ｍＬ以上であるものを用いること。
（７）請求項１乃至７のいずれか１項において、希釈溶媒の添加によりアルコール濃度が０．２重量／容量％以下となるように希釈すること。
（８）請求項１乃至７のいずれか１項において、前記一次希釈工程では、前記酢酸濃度が４重量／容量％以下０．５重量／容量％以上となるように希釈すること。
（９）請求項１乃至７のいずれか１項において、前記遠心分離及び二次希釈工程では、前記酢酸濃度が０．１重量／容量％以下０．００１重量／容量％以上となるように希釈すること。
（１０）請求項１乃至７のいずれか１項において、前記保管工程では、前記酢酸菌含有液を−３０℃以上−２０℃以下で保管すること。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、深部発酵法にて発酵中の食酢発酵液から採取した酢酸菌を、後日別の機会に酢酸発酵を行う際の種酢（発酵の種となる「種菌」を含む発酵液）として使用するために、菌の活性を維持した状態で保管しておく酢酸菌の保管方法、食酢の製造方法、及び保管された酢酸菌に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
食酢の深部醗酵法では、発酵を開始する際に仕込み液に種酢を添加する必要がある。そして、従来においては、発酵中の食酢発酵液の一部を採取して残しておき、これを種酢として次の仕込み液に速やかに直接添加する方法が通常よく実施されている。しかしながら、この方法では種酢となるべき食酢の発酵を常に維持しておく必要があり、無駄な食酢ができるという問題点があった。
【０００３】
また、食酢製造用酢酸菌用培地にて前培養された前培養液をあらかじめ用意し、発酵を開始する際にこれを種酢として仕込み液に添加する方法も従来提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載の従来方法の場合、本発酵用の発酵装置とは別に小スケールの前培養用発酵装置を稼動させなければならず、二度手間で作業効率が悪いという問題がある。
【０００５】
それゆえ、食酢発酵液を採取及び保管しておき、生産計画に合わせて後日これを種酢として利用する技術が従来強く望まれている。そして、このような保管技術の一例として、深部発酵法にて発酵中の食酢の発酵液を、希釈溶媒の添加により酢酸濃度が２重量／容量％以上５重量／容量％以下となるように希釈し、かつ、液温が０℃以上１５℃以下となるように冷却して、２４時間以上保管する食酢発酵液の保管方法が提案されている（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−３３１１１号公報
【特許文献２】特開２００７−１６６９２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献２に記載の保管方法は、１週間程度か、長くても数ヶ月程度という短期間の保管にしか適用できないため、それ以上の期間保管したいような場合には適さない。また、特許文献２に記載の保管方法で保管した食酢発酵液を種酢として用いた場合、食酢発酵が立ち上がるまでの時間（ラグタイム）にばらつきが大きくなり、生産計画を正確に立てることができないという不具合が想定される。さらに、特許文献２に記載の方法によって例えば３ヶ月以上保管をすると、当該保管した食酢発酵液を種酢として用いて食酢発酵を行った場合に発酵の立ち上がりまでの時間（ラグタイム）が長くかかってしまうか、あるいは発酵が立ち上がらないという不具合が想定される。
【０００８】
また、特許文献２に記載の保管方法の場合、保管される発酵液には、酢酸菌の他、それぞれの食酢の種類に必要な原料の成分（例えばリンゴ酢ならリンゴ成分、米酢なら米の成分）が含まれている。そのため、保管された発酵液を使用できる範囲（使用できる食酢の種類）が極めて限定されたものとなる。
【０００９】
ここで、従来における他の菌保管方法として、次のような方法もある。即ち、発酵中の発酵液を採取後、希釈せずに遠心分離を行い、分離された沈殿物にグリセロールや糖化液などの菌凍結保存剤を添加する。そして、菌凍結保存剤が添加された菌沈殿物を凍結して、−８０℃程度の極低温で保管する、という方法である。この方法のメリットは、長期間（例えば３ヶ月〜半年）の保存が可能なことである。
【００１０】
しかしながら、極低温で保管する上記従来方法は、食酢の実生産工程に用いる種酢としての発酵液を保管するのには不向きである。なぜなら、実生産において発酵をすぐに立ち上げるだけの酢酸菌数を含む発酵液を−８０℃で保管するためには、大掛かりな設備と多くのコストがかかってしまい、現実的ではないからである。また、菌凍結保存剤を添加した酢酸菌発酵液は、食酢の発酵工程の種酢として用いると、本来の食酢原料以外の原料が混入することとにもなり得るため、好ましくないからである。勿論、食酢製造工程から抜き出した糖化液を菌凍結保存剤として用いるような場合は問題ないが、少なくとも使用できる品種が限定されることになり、やはり好ましくない。
【００１１】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、例えば半年〜１年程度の長期間の保管に耐え、ラグタイムが安定していることから正確なスケジュールで生産可能であり、かつあらゆる食酢製造に利用できる汎用性の高い酢酸菌の保管方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の課題を解決すべく、本願発明者が鋭意検討を行ったところ、深部発酵中の酢酸発酵液から採取した発酵液をあらかじめ希釈してから遠心分離及び希釈を行うことで所定の酢酸濃度以下とし、これを凍結することで、格段に長期の保管が可能となることを新規に見出した。そして、本願発明者は、この新規な知見に基づいてさらに鋭意検討を行い、下記の課題解決手段［１］〜［８］を完成させた。
【００１３】
［１］深部培養法にて酢酸発酵中の発酵液を採取して希釈溶媒を添加することにより、酢酸濃度が４重量／容量％以下となるように希釈する一次希釈工程と、前記一次希釈工程で希釈された酢酸菌発酵液を遠心分離しかつ希釈溶媒を添加することにより、酢酸濃度が０．１重量／容量％以下となるように希釈する遠心分離及び二次希釈工程と、前記遠心分離及び二次希釈工程を経て酢酸濃度が０．１重量／容量％以下となった酢酸菌を含有する酢酸菌含有液を凍結する凍結工程と、前記凍結工程を経て凍結された酢酸菌含有液を−５℃以下で保管する保管工程とを含むことを特徴とする酢酸菌の保管方法。
【００１４】
［２］前記酢酸発酵中の発酵液を採取してから前記酢酸菌含有液を凍結するまでの作業を７２時間以内に行うことを特徴とする上記手段１に記載の酢酸菌の保管方法。
【００１５】
［３］前記遠心分離及び二次希釈工程において、遠心分離の際に希釈溶媒を注ぎ入れることにより遠心分離と希釈とを同時に行うことを特徴とする上記手段１または２に記載の酢酸菌の保管方法。
【００１６】
［４］前記凍結工程にて凍結される酢酸菌含有液には、菌凍結保存剤が添加されていないことを特徴とする上記手段１乃至３のいずれか１項に記載の酢酸菌発酵液の保管方法。
【００１７】
［５］前記保管工程において、３０日以上の期間保管することを特徴とする上記手段１乃至４のいずれか１項に記載の酢酸菌の保管方法。
【００１８】
［６］上記手段１乃至５のいずれか１項に記載の方法により保管された酢酸菌。
【００１９】
［７］上記手段１乃至５のいずれか１項に記載の方法により保管された酢酸菌を種菌として用いて酢酸発酵を行うことで、食酢を製造することを特徴とする食酢の製造方法。
【発明の効果】
【００２０】
従って、請求項１〜５に記載の発明によると、例えば半年〜１年程度の長期間の保管に耐え、ラグタイムが安定していることから正確なスケジュールで生産可能であり、かつあらゆる食酢製造に利用できる汎用性の高い酢酸菌の保管方法を提供することができる。また、請求項６に記載の酢酸菌、請求項７に記載の製造方法によれば、効率のよい酢酸発酵が可能となり、目的とする食酢を確実に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を具体化した一実施の形態を詳細に説明する。
【００２２】
本発明における深部培養法にて用いられる酢酸菌としては特に限定されないが、例えばアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属の酢酸菌が用いられる。アセトバクター属酢酸菌の好適な具体例としては、アセトバクター・アセチＩＦＯ３２８１（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ ＩＦＯ３２８１）株、アセトバクター・アセチＩＦＯ３２８３（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ ＩＦＯ３２８３）株などがある。これらの酢酸菌は１０．０重量／容量％以下の酢酸濃度で食酢の発酵生産に用いられる酢酸菌であるが、高酸度食酢用の酢酸菌を用いることも可能である。その具体例としては、アセトバクター・ヨーロペウス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）などがある。
【００２３】
本発明において酢酸濃度とは、以下のようにして測定し、計算した結果得られる酢酸換算濃度（重量／容量％）のことを意味する。即ち、測定用試料として食酢（発酵液）５ｍＬをビーカーにとり、１Ｎ水酸化ナトリウムを用い、フェノールフタレインを指示薬として中和滴定し、得られた滴定量（ｍＬ）を１．２倍して酢酸濃度換算した値を酸度とし、％であらわした。
【００２４】
本発明において食酢発酵液を得るための深部培養法とは、培養装置内の発酵液に対する積極的な通気・攪拌を行うことにより、発酵液全体に酸素を供給し、液表面のみならずその深部についてまでも酢酸菌を生育させて発酵を行わせる培養法のことを指し、通常は表面発酵法と対比される。
【００２５】
深部培養を行うための装置としては特に限定されず、一般的な通気攪拌型の深部発酵装置を用いることができる。攪拌については従来公知の手段を採用することができ、例えばプロペラやロータ等の攪拌機を使用することが好適である。また、通気についても同様に従来公知の手段を採用することができ、その具体例としては、空気や酸素等の気体を通気管を通じて供給する方法などが挙げられる。通気量については発酵状況に応じて適宜設定すればよい。例えば、０．０２〜１ｖｖｍ（通気容量／発酵液量／分）の通気量にして、気体を発酵液の下部に供給し、これを攪拌機で微細化・拡散させ、発酵液中の溶存酸素が０．２〜８ｐｐｍ程度で維持されるように制御すればよい。
【００２６】
また、発酵形式についても、回分発酵法、半連続発酵法、二段発酵法など、従来から実施されてきた各種の方式を採用することができる。
【００２７】
そして、上記の深部培養法により得られた発酵中の食酢発酵液は、以下のようにして希釈される（一次希釈）。
【００２８】
食酢発酵液としては発酵中のもの（即ち酢酸生成中のもの）を採取する必要があり、より好ましくは発酵の初期段階及び終期段階を除く期間（便宜上、中期段階と呼ぶ。）のものを採取することがよい。この期間の食酢発酵液には、活性の高い酢酸菌が多く含まれているため、保管をする対象として適当だからである。これに対し、発酵の初期段階では発酵がまだ十分に開始していないため菌体の数が少なく、発酵の終期段階ではもはや菌体の活性が高いとはいえないため、いずれも長期にわたる保管をするのに適していないからである。
【００２９】
発酵中の食酢発酵液の採取時における酢酸菌の濃度は特に限定されず、使用する酢酸菌の種類によっても異なるが、例えば１０６個／ｍＬ以上であることが好ましく、特には１０７個／ｍＬ以上であることが好ましい。長期にわたり保管を行った場合、活性を有する酢酸菌数の減少はある程度避けられないが、あらかじめ高濃度の酢酸菌を採取しておけば、必要とする酢酸菌数を確保しやすくなるからである。
【００３０】
発酵中の食酢発酵液の液温はいわゆる常温であり、より詳しくいうと２０℃以上４０℃以下である。また、発酵中の食酢発酵液における酢酸濃度は、使用する酢酸菌の種類により異なるが、概して５重量／容量％以上である。また、発酵中の食酢発酵液においてアルコール（主としてエチルアルコール）は、通常０．１〜３．０重量／容量％程度含まれている。
【００３１】
酢酸発酵工程におけるアルコール濃度の測定の際には、精度の高いアルコール測定装置であるガスクロマトグラフィーや、ガスセンサーなどを利用するのが好ましい。例えば、島津製作所製ガスクロマトグラフィー（ＧＣ−１７Ａ）で、ＧＬサイエンス製カラム（ＴＣ−ＷＡＸ：０．５３ｍｍ×３０ｍ）を用い、ディテクション２２０℃、カラム温度４０℃で５分間保持し、４℃／分の条件で２２０℃まで昇温させて２２０℃で１０分保持する測定条件で、試料を１μＬ用いる方法などが例示される。
【００３２】
本発明における一次希釈は、採取した発酵中の食酢発酵液と希釈溶媒とを混合することにより行われる。かかる混合が行われる場所は、深部発酵用発酵装置の中であってもよいが、それとは別に用意された保管容器の中であってもよい。また、発酵装置から分岐している食酢発酵液の配管と、希釈溶媒が供給される配管とが合流することにより、連続的に混合されるような形態であってもよい。
【００３３】
ここで希釈溶媒としては、少なくとも採取した発酵中の食酢発酵液よりも酢酸濃度が低い溶液であれば任意の液体を使用することができる。ただし、後に食酢発酵のための種酢として使用する予定があるような場合の希釈溶媒としては、食酢成分として許容される成分（例えば水、原料糖液、アルコールなど）のみを含む液体を使用することが望ましい。水以外の成分を含んだ希釈溶媒を用いると、保管された菌を使用できる食酢の品種が限定されてしまう（例えば、純米酢は、米と水のみを原料として製造するため、他からアルコール分や糖分を混入できない）ため、特には水を使用することが望ましい。もちろん、純水だけに限らす若干のミネラル分等が含まれている水（水道水など）を用いてもよい。もちろん、遠心分離及び二次希釈工程において用いる希釈溶媒も上記と同様であり、水が好ましい。
【００３４】
そして一次希釈工程においては、このような希釈溶媒の添加によって、発酵中の食酢発酵液は、酢酸濃度が４重量／容量％以下となるように希釈される。仮に、希釈を行わないか、または酢酸濃度を４重量／容量％を超える程度に希釈した場合には、遠心分離工程を経ることで酢酸菌にダメージを与えてしまう。
【００３５】
この段階では、必要以上に希釈をすることは、以下の理由により好ましくない場合がある。即ち、初期の酢酸濃度や希釈する量などにもよるが、この段階で必要以上に希釈をすると、遠心分離にかける酢酸菌発酵液の量が多くなってしまうため、遠心分離工程に時間を要してしまう。その結果、酢酸発酵中の発酵液を採取してから酢酸菌含有液を凍結するまでの時間が必要以上にかかってしまい、菌にダメージを与えやすくなるため好ましくない。よって、一次希釈工程においては酢酸濃度が０．５重量／容量％以上となるように留めておく方が好ましい。
【００３６】
一次希釈工程では、液温を下げることは必須ではないが、低温とする方が菌へのダメージを抑えやすく好ましい。好ましくは２０℃以下、更に好ましくは１０℃以下、とすれば十分である。希釈時の温度は低い方が好ましい。なお、液温を下げるための手法としては、例えば冷却装置を用いながら一次希釈を行ってもよいほか、冷却装置を用いず希釈溶媒として冷水や氷水を使用して一次希釈を行ってもよい。
【００３７】
一次希釈工程で希釈された酢酸菌発酵液は、遠心分離機によって遠心分離を行う。使用する遠心分離機は、連続式でも回分式でも構わない。連続式の遠心分離機とは、連続的に分離用液を供給しながら、上清と沈降物とを分離していく形式であって、例えば斉藤遠心機工業製の遠心分離機（ADS-1001CS）などが利用できる。また、回分式の遠心分離機とは、分離液の供給、遠心分離の操作が分かれているものであって、例えば久保田商事株式会社のＫＵＢＯＴＡ３７００などが利用できる。処理量が多い場合には、沈降物を短時間で採取できる連続式が適している。処理量が少ない場合には、処理条件の微調整がいらない回分式が簡易であり適している。
【００３８】
本発明では凍結前に酢酸濃度を０．１重量／容量％以下となるように希釈する必要があるが（二次希釈）、その方法としては例えば以下のようなものが採用できる。
【００３９】
一次希釈された酢酸菌発酵液を連続式の遠心分離機に流入させながら遠心分離を行い、前記酢酸菌発酵液を全て流入させた後、続いて希釈溶媒を連続的に遠心分離機に流入させて所定時間遠心分離を行うことによって主に上清部分を希釈して、その結果遠心分離機内の酢酸濃度を下げる。そして、最終的に遠心分離機に蓄積された沈殿層を取り出し、凍結前の酢酸菌含有液とする。
【００４０】
あるいは、一次希釈された酢酸菌発酵液を回分式の遠心分離機に流入させて所定時間遠心分離を行い、沈殿物だけを採取して希釈溶媒と混合する。その後さらに回分式の遠心分離機に流入させて遠心分離を行い、最終的に遠心分離機に蓄積された沈殿層を取り出し、凍結前の酢酸菌含有液とする。
【００４１】
連続式の遠心分離機を用いた場合、作業性が向上するため好ましい。それだけでなく、一次希釈工程から遠心分離までの時間が短くて済むようになり、結果として酢酸存在下での酢酸菌へのダメージを与え難くなる（活性のある菌数が多くなる）ため、好ましい。
【００４２】
なお、遠心分離機の容量、回転数、動力は、遠心分離の処理をしたい量などに合わせて適宜選択すればよい。
【００４３】
遠心分離及び二次希釈工程においては、酢酸菌含有液の酢酸濃度が０．１重量／容量％以下となるまで希釈される。仮に、酢酸濃度が０．１重量／容量％を超える程度にしか希釈をしなかった場合、凍結保存中に酢酸菌がダメージを受けてしまい、活性のある酢酸菌数が減少してしまう。この結果、所定期間（例えば半年）保管した後に食酢発酵の種菌として用いた場合に、発酵立ち上がりまでのラグタイムが長く（例えば９６時間以上）かかってしまい、好ましくない。
【００４４】
この段階では、必要以上に希釈をすることは、以下の理由により好ましくない場合がある。即ち、遠心分離及び二次希釈を行う酢酸菌発酵液の量などにもよるが、この段階で必要以上に希釈をしようとすると、遠心分離にかける量が多くなってしまい、その結果凍結までの時間が長くかかってしまうことになる。あるいは、時間をかけないために遠心分離を十分に行わなければ、凍結保存する酢酸菌含有液の量が多くなってしまうため、保管設備費用や維持費用などが多くかかってしまい好ましくない。よって、遠心分離及び二次希釈工程においては酢酸濃度が０．００１重量／容量％以上となるように留めておく方が好ましい。
【００４５】
遠心分離及び二次希釈工程を経た段階（凍結直前）の酢酸菌含有液中には、できるだけ多くの酢酸菌が含まれていることが好ましく、具体的には１０７個／ｍＬ以上、特には１０８個／ｍＬ以上含まれていることがよい。酢酸菌の濃度が高ければ、保管期間が長期にわたった場合でも、種酢等としての利用が可能になるからである。
【００４６】
本発明において酢酸菌含有液を凍結する方法としては、従来公知の任意の方法を採用することができる。その好適な例を挙げると、例えば、酢酸菌含有液を凍結保管用のネジ式キャップチューブに入れ、それを−２０〜８０℃の冷凍庫に静置する方法などがある。
【００４７】
ここで、凍結を行うときのスピードは特に限定されないが、酢酸発酵中の発酵液を採取してから酢酸菌含有液を凍結するまでの作業時間をできるだけ短く（７２時間以内）することが必要であるため、できるだけ急速に凍結することが好ましい。当該作業時間を７２時間以内とするのは、菌体の活性をできるだけ維持した状態で凍結休眠状態に移行させるためである。好ましくは４８時間以内であり、さらに好ましくは２４時間以内であり、短いほどよい。
【００４８】
酢酸菌含有液は、酢酸菌の休眠状態を維持するため、凍結後に−５℃以下で保管される。この場合、さらに低温で保管した方が保管中の酢酸菌の活性を完全に抑えることができ、種菌として使用する際の活性のある酢酸菌数が多い状態で保管することができる。好ましくは−２０℃以下、より好ましくは−３０℃以下で保管することがよい。ただし、これ以上低温で保管しても、保管後の活性のある酢酸菌数は大きく変化せず、種菌として使用する際のラグタイムも変化しない。よって、設備コストや電力コストを考慮すると、−２０〜−３０℃が好ましい。
【００４９】
通常、研究所等において菌体を凍結保存するような場合には、グリセロールや糖化液などの菌凍結保存剤を１５〜５０％程度添加する。しかしながら、本発明の方法を用いれば、そのような菌凍結保存剤を使用しなくても、酢酸菌の活性が高い状態で長期保存を達成することが可能となる。保管する酢酸菌にグリセロールや糖化液を添加してしまうと、食酢の品種によっては、食酢の原料以外の成分が混入することになる。つまり、種菌として活用できる食酢の品種を限定してしまうこととなる。
【００５０】
菌凍結保存剤の例としては、グリセロールや糖化液の他に、例えばＤＭＳＯやスキムミルクなどがある。
【００５１】
そして、上述のように希釈及び冷却された食酢発酵液は、凍結した状態で長期間保管される。短期保管（例えば２９日以内）の場合には、本発明の方法を適用しなくとも特許文献２の方法などが利用可能である。ゆえに、本発明の方法は、３０日間以上、特には半年〜１年以上保管する場合に好適である。例えば本発明の保管方法によれば、年間数回しか生産されない小ロット品に対し、その食酢の品種に最適な能力を持った酢酸菌を保管することができる。
【００５２】
以上示した方法で保管しておいた食酢発酵液は、たとえ保管が長期にわたっていたとしても、好適な菌体活性を維持する。従って、これを別の酢酸発酵を行う際に種酢として使用して酢酸発酵を行えば、酢酸発酵を速やかに開始することができる。よって、前回の深部培養法と同様に深部培養法を行うことにより、所望の食酢を効率よく製造することができる。また本発明によれば、保管しておいた食酢発酵液中には菌凍結保存剤やその他の添加剤が何ら含まれていないため、これを種酢として用いたとしても食酢の風味、品質、純度等を低下させることにはつながらない。
【００５３】
以下に本発明をより具体化した実施例を記載するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５４】
[実施例１]保管用酢酸菌の作製（試験例１）
（１）本発明の方法による保管用酢酸菌の作製
【００５５】
（ａ）深部発酵が可能な発酵タンク（５Ｌ容量：ミツワ理化学工業社製）を用い、あらかじめ１Ｌの食酢発酵液を用意した。この食酢発酵液は米を原材料とする仕込液とアセトバクター・アセチを用いて培養されたものであって、酢酸濃度が８．０重量／容量％、アルコール濃度が０．３容量／容量％、液温が３０℃〜３５℃程度、酢酸菌濃度が約１０７個／ｍＬとなっている。
【００５６】
（ｂ）このような食酢発酵液を発酵の中期段階、即ち菌体の活性が高く発酵が盛んに起こっている段階で１６０ｍＬ採取して、これを、希釈溶媒である１５℃の水２０ｍＬをあらかじめ入れておいた８本の５０ｍＬ遠心分離用チューブ（耐酸性を有する保管容器）に２０ｍＬずつ速やかに添加し、両液を混合し４０ｍＬとした。希釈後の酢酸濃度は４．０重量／容量％であった。
【００５７】
（ｃ）次に、希釈された食酢発酵液を回分式遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ３７００ 久保田商事株式会社製）で、８０００ｒｐｍで遠心分離を５分間行った。遠心分離後、上清を全て廃棄し、２７℃の水を４０ｍＬ加えて沈澱を懸濁し、再度８０００ｒｐｍで遠心分離を５分間行った。遠心分離後、上清をすべて廃棄し、２７℃の水１ｍＬで沈澱を懸濁した。懸濁後の酢酸濃度は０．１重量／容量％であった。
【００５８】
（ｄ）懸濁した沈澱液は密閉性の高い１．５ｍＬ容量ポリプロピレン容器に入れ、冷凍庫に保管し２時間のうちに−３０℃に冷却した。このようにして保管菌サンプル１を作製した。なお、酢酸発酵中の発酵液を採取してから酢酸菌含有液を凍結するまでの作業時間は３時間であった。
さらに、基本的には上記方法と同じであるが、酢酸発酵中の発酵液を採取してから酢酸菌含有液を凍結するまでの作業時間を２４時間としたものを作製し、保管菌サンプル５とした。また、基本的には上記方法と同じであるが、酢酸発酵中の発酵液を採取してから酢酸菌含有液を凍結するまでの作業時間を７２時間としたものを作製し、保管菌サンプル６とした。
【００５９】
（２）希釈をせずに遠心分離と凍結とをした保管用酢酸菌の作製
【００６０】
（ａ）深部発酵が可能な発酵タンク（５Ｌ容量：ミツワ理化学工業社製）を用い、あらかじめ１Ｌの食酢発酵液を用意した。この食酢発酵液は米を原材料とする仕込液とアセトバクター・アセチを用いて培養されたものであって、酢酸濃度が８．０重量／容量％、アルコール濃度が０．３容量／容量％、液温が３０℃〜３５℃程度、酢酸菌濃度が約１０７個／ｍＬとなっている。
【００６１】
（ｂ）このような食酢発酵液を発酵の中期段階、即ち菌体の活性が高く発酵が盛んに起こっている段階で３２０ｍＬ採取して、一次希釈を行うことなく８本の５０ｍＬ遠心分離用チューブ（耐酸性を有する保管容器）に速やかに４０ｍＬずつ投入した。
【００６２】
（ｃ）次に、投入した食酢発酵液を回分式遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ３７００ 久保田商事株式会社製）で、８０００ｒｐｍで遠心分離を５分間行った。遠心分離後、上清を全て廃棄した。沈澱液の酢酸濃度は８．０重量／容量％であった。
【００６３】
（ｄ）そして、二次希釈を行うことなく、沈澱を回収した容器をそのまま冷凍庫に保管し、２時間のうちに−３０℃に冷却した。このようにして保管菌サンプル２を作製した。なお、酢酸発酵中の発酵液を採取してから酢酸菌含有液を凍結するまでの作業時間は３時間であった。
【００６４】
（３）一次希釈をせずに遠心分離をかけ、その後は本発明の方法のようにした保管用酢酸菌の作製
【００６５】
（ａ）深部発酵が可能な発酵タンク（５Ｌ容量：ミツワ理化学工業社製）を用い、あらかじめ１Ｌの食酢発酵液を用意した。この食酢発酵液は米を原材料とする仕込液とアセトバクター・アセチを用いて培養されたものであって、酢酸濃度が８．０重量／容量％、アルコール濃度が０．３容量／容量％、液温が３０℃〜３５℃程度、酢酸菌濃度が約１０７個／ｍＬとなっている。
【００６６】
（ｂ）このような食酢発酵液を発酵の中期段階、即ち菌体の活性が高く発酵が盛んに起こっている段階で３２０ｍＬ採取して、これを８本の５０ｍＬ遠心分離用チューブ（耐酸性を有する保管容器）に速やかに４０ｍＬずつ投入した。
【００６７】
（ｃ）次に、この食酢発酵液を回分式遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ３７００ 久保田商事株式会社製）で、８０００ｒｐｍで遠心分離を５分間行った。遠心分離後、上清を全て廃棄し、２７℃の水を４０ｍＬ加えて沈澱を懸濁し、再度８０００ｒｐｍ程度で遠心分離を５分間行った。遠心分離後、上清をすべて廃棄し、２７℃の水１ｍＬで沈澱を懸濁した。沈澱液の酢酸濃度は０．１重量／容量％であった。
【００６８】
（ｄ）懸濁した沈澱液は、密閉性の高い１．５ｍＬ容量ポリプロピレン容器に入れて冷凍庫に保管し、２時間のうちに−３０℃に冷却した。このようにして保管菌サンプル３を作製した。なお、酢酸発酵中の発酵液を採取してから酢酸菌含有液を凍結するまでの作業時間は３時間であった。
【００６９】
（４）一次希釈の後、遠心分離及び二次希釈工程を行うが０．２％までしか希釈をしない保管用酢酸菌の作製
【００７０】
（ａ）深部発酵が可能な発酵タンク（５Ｌ容量：ミツワ理化学工業社製）を用い、あらかじめ１Ｌの食酢発酵液を用意した。この食酢発酵液は米を原材料とする仕込液とアセトバクター・アセチを用いて培養されたものであって、酢酸濃度が７．０重量／容量％、アルコール濃度が０．３容量／容量％、液温が３０℃〜３５℃程度、酢酸菌濃度が約１０７個／ｍＬとなっている。
【００７１】
（ｂ）このような食酢発酵液を発酵の中期段階、即ち菌体の活性が高く発酵が盛んに起こっている段階で１６０ｍＬ採取して、これを、希釈溶媒である１５℃の水をあらかじめ入れておいた８本の５０ｍＬ遠心分離用チューブ（耐酸性を有する保管容器）に速やかに２０ｍＬずつ添加し、両液を混合し４０ｍＬとした。希釈後の酢酸濃度は４．０重量／容量％であった。
【００７２】
（ｃ）次に、この食酢発酵液を回分式遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ３７００ 久保田商事株式会社製）で、８０００ｒｐｍで遠心分離を５分間行った。遠心分離後、上清を１ｍＬ残して廃棄し、２７℃の水１６．５ｍＬで沈澱を懸濁した。懸濁後の酢酸濃度は０．２重量／容量％であった。
【００７３】
（ｄ）懸濁した沈澱液は密閉性の高い１．５ｍＬ容量ポリプロピレン容器に入れ、冷凍庫に保管し２時間のうちに−３０℃に冷却した。このようにして保管菌サンプル４を作製した。なお、酢酸発酵中の発酵液を採取してから酢酸菌含有液を凍結するまでの作業時間は３時間であった。
【００７４】
［実施例２］保管した酢酸菌を用いての発酵試験（試験例２）
試験例１で作製した保管菌サンプル１〜６を半年保管したものを食酢発酵に用いて比較した。米を原材料とする仕込み液をあらかじめ３Ｌ入れておいた深部発酵用の発酵タンク（５Ｌ容量：ミツワ理化学工業社製）内に各々の保管菌サンプルを投入した。なお、投入した保管菌サンプルの量は、それぞれの保管菌サンプルを作製する段階において、同量の発酵液（発酵液量で１５ｍＬ）から作製された保管菌サンプル量として初発の菌数を統一した。
【００７５】
この後、通気攪拌を行いながら、常法に従って酢酸菌の深部発酵を所定時間継続的に行い、玄米酢を製造した。仕込み液には、酒、種酢（菌体除去したもの）を混合したものを用いた。
【００７６】
ここで、培養を開始してから酢酸濃度が０．１％上昇し始めるまでの時間（つまり、発酵開始までのラグタイム）を保管菌サンプル１〜６についてそれぞれ計測した。これらの結果を表１に示す。
【００７７】
【表１】
（試験結果）
表１によると、保管菌サンプル２〜４では、発酵開始までのラグタイムが７２時間以上となってしまうことがわかった。ここで、実用上好ましいラグタイムの程度が７２時間以内、好ましくは４８時間以内であると定義した場合、保管菌サンプル２〜４の方法では、長期にわたる保管ができないことが明らかとなった。
【００７８】
これに対し、保管菌サンプル１，５，６については発酵開始までのラグタイム４０時間程度であることから、明らかに上記の好適範囲内であり、４８時間以内に収まっていた。従って、保管菌サンプル１，５，６の手順を踏めば、かなりの長期にわたって保管が可能になることが明らかになった。なお、保管菌サンプル１，５，６について、さらに酢酸濃度が１．５％上昇し始めるまでの時間を調査したところ、保管菌サンプル１，５では殆ど差がなかったが、保管菌サンプル６では時間が長くなる傾向が見られた。
【００７９】
［実施例３］本発明の保管方法により得た保管菌の多品種食酢への応用実験
試験例１の保管菌サンプル１を、米、玄米、ブドウ、リンゴ、をそれぞれ原料とする仕込み液３Ｌをあらかじめ入れておいた深部発酵用の発酵タンク（５Ｌ容量：ミツワ理化学工業社製）内に投入し、通気攪拌を行いながら、常法に従って酢酸菌の深部発酵を所定時間継続的に行い、米酢、黒酢、ブドウ酢、リンゴ酢を製造した。仕込み液には、米酢は米で作った酒と米酢の種酢（菌体除去したもの）とを混合したもの、黒酢は玄米で作った酒と黒酢の種酢（菌体除去したもの）とを混合したもの、ブドウ酢はブドウで作った酒とブドウ酢の種酢（菌体除去したもの）とを混合したもの、リンゴ酢はリンゴで作った酒とリンゴ酢の種酢（菌体除去したもの）とを混合したもの、を用いた。なお、投入した保管菌サンプルの量は、それぞれの保管菌サンプルを作製する段階において、同量の発酵液（発酵液量で１５ｍＬ）から作製された保管菌サンプル量として初発の菌数を統一した。
【００８０】
それぞれ保管菌サンプル投入から発酵開始までのラグタイムは、米酢は６０時間、黒酢は４０時間、ブドウ酢は６０時間、リンゴ酢は４０時間であり、全て７２時間以内となり、実生産で使用するにあたって良好な結果となった。また、余分な成分の有無を分析したところ、保管菌サンプル１を作製した食酢発酵液（玄米酢）由来の成分（アミノ酸、有機酸、糖など）は１／１０００００（１０万分の１）以下の濃度であり、玄米としては０．０６４５ｐｐｍ以下の含有量ということになり、本発明による保管菌を異品種の食酢製造に用いても問題がないレベルであることがわかった。
【００８１】
[実施例４]保管用酢酸菌の作製（遠心分離処理量大量）
（１）試験例１よりも大量の発酵液を遠心分離処理して保管菌を作製した。手順を以下に記載する。
【００８２】
（ａ）工場の大型発酵タンク５ｋＬで深部発酵している食酢発酵液を用意した。この食酢発酵液は米を原材料とする仕込液とアセトバクター・アセチを用いて培養されたものであって、酢酸濃度が８．０重量／容量％、アルコール濃度が０．３容量／容量％、液温が３０℃〜３５℃程度、酢酸菌濃度が約１０７個／ｍＬとなっている。
【００８３】
（ｂ）このような食酢発酵液を発酵の中期段階、即ち菌体の活性が高く発酵が盛んに起こっている段階で２０Ｌ採取して、これを、希釈溶媒である１５℃の水をあらかじめ１８０Ｌ入れておいたＳＵＳ製タンク（耐酸性を有する保管容器）に速やかに添加し、両液を混合した。混合液の酢酸濃度は０．８重量／容量％であった。
【００８４】
（ｃ）次に、希釈された食酢発酵液をタンクから連続式遠心分離機（ADS-1001CS 斉藤遠心機工業製）へ２００Ｌ／ｈで送液し、８０００ｒｐｍで遠心分離を行った。この時、上清は自動的に遠心機の外へ排出され、沈澱は遠心機内に溜まっていく。希釈された食酢発酵液を全て遠心分離後、１５℃の水１００Ｌを続けて同遠心機へ２００Ｌ／ｈで送液し、遠心機内の液体酢酸濃度を低下させた。水１００Ｌを全て遠心機へ投入した後、遠心機内に溜まっていた沈澱液を一気に排出し、回収した。回収液は約３Ｌであり、酢酸濃度は０．１重量／容量％であった。この沈澱液は５００ｍＬ容量ポリプロピレン容器（冷凍保管に耐えうる容器）に入れ、冷凍庫に保管し４時間のうちに−３０℃に冷却した。このようにして保管菌サンプル７を作製した。なお、酢酸発酵中の発酵液を採取してから酢酸菌含有液を凍結するまでの作業時間は７時間であった。
【００８５】
（２）作製した保管菌サンプル７を半年保管したものを実生産食酢発酵に用いた。即ち、米を原材料とする仕込み液をあらかじめ深部発酵用の大型発酵タンクに２ｋＬ入れておき、そこにこの保管菌を投入した。投入した保管菌の量は、発酵液２０Ｌ分から回収した菌体量（回収液３Ｌ全量）とした。
【００８６】
この後、通気攪拌を行いながら、常法に従って酢酸菌の深部発酵を所定時間継続的に行い、玄米酢を製造した。仕込み液には、米で作った酒と玄米酢の種酢（菌体除去したもの）とを混合したものを用いた。
【００８７】
保管菌サンプル投入から発酵開始までのラグタイムは４０時間となり、実生産で使用するにあたって良好な結果となった。従って、保管菌サンプル７の手順を踏めば、かなりの長期にわたって保管が可能であり、実生産の発酵で立上げ菌として使用可能であることが明らかになった。
【００８８】
（全体としての結論）
従って、上述した本発明によれば以下の効果を得ることができる。即ち、本発明にかかる酢酸菌の発酵方法によれば、あらゆる食酢製造に利用できる汎用性の高い酢酸菌の種菌を、低コストで長期間（例えば半年〜１年程度）保管することができる。保管する酢酸菌も食酢の品種ごとに用意する必要がなく極めて効率的である。また、当該保管した種菌を用いて食酢発酵を行えば、短期間（例えば４８時間以内）のラグタイムで発酵が立ち上がるため、あらゆる食酢の多品種少ロット生産の要請にも柔軟に対応することができる。しかも、ラグタイム自体が安定しており、生産計画に忠実な発酵を実施することが可能である。
【００８９】
以下、前述した実施の形態によって把握される技術的思想を以下に列挙する。
（１）請求項１乃至７のいずれか１項において、前記希釈溶媒は、食酢成分として許容される成分のみを含む液体であること。
（２）請求項１乃至７のいずれか１項において、前記希釈溶媒が水であること。
（３）請求項１乃至７のいずれか１項において、前記希釈溶媒が冷水または氷水であること。
（４）請求項１乃至７のいずれか１項において、深部培養法にて発酵中の食酢発酵液として、発酵の初期段階及び終期段階を除く期間にて採取されたものを用いること。
（５）請求項１乃至７のいずれか１項において、深部培養法にて発酵中の食酢発酵液として、酢酸菌の生育速度が安定している状態で採取されたものを用いること。
（６）請求項１乃至７のいずれか１項において、深部培養法にて発酵中の食酢発酵液として、酢酸菌濃度が１０７個／ｍＬ以上であるものを用いること。
（７）請求項１乃至７のいずれか１項において、希釈溶媒の添加によりアルコール濃度が０．２重量／容量％以下となるように希釈すること。
（８）請求項１乃至７のいずれか１項において、前記一次希釈工程では、前記酢酸濃度が４重量／容量％以下０．５重量／容量％以上となるように希釈すること。
（９）請求項１乃至７のいずれか１項において、前記遠心分離及び二次希釈工程では、前記酢酸濃度が０．１重量／容量％以下０．００１重量／容量％以上となるように希釈すること。
（１０）請求項１乃至７のいずれか１項において、前記保管工程では、前記酢酸菌含有液を−３０℃以上−２０℃以下で保管すること。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
深部培養法にて酢酸発酵中の発酵液を採取して希釈溶媒を添加することにより、酢酸濃度が４重量／容量％以下となるように希釈する一次希釈工程と、
前記一次希釈工程で希釈された酢酸菌発酵液を遠心分離しかつ希釈溶媒を添加することにより、酢酸濃度が０．１重量／容量％以下となるように希釈する遠心分離及び二次希釈工程と、
前記遠心分離及び二次希釈工程を経て酢酸濃度が０．１重量／容量％以下となった酢酸菌を含有する酢酸菌含有液を凍結する凍結工程と、
前記凍結工程を経て凍結された酢酸菌含有液を−５℃以下で保管する保管工程と
を有することを特徴とする酢酸菌の保管方法。
【請求項２】
前記酢酸発酵中の発酵液を採取してから前記酢酸菌含有液を凍結するまでの作業を７２時間以内に行うことを特徴とする請求項１に記載の酢酸菌の保管方法。
【請求項３】
前記遠心分離及び二次希釈工程において、遠心分離の際に希釈溶媒を注ぎ入れることにより遠心分離と希釈とを同時に行うことを特徴とする請求項１または２に記載の酢酸菌の保管方法。
【請求項４】
前記凍結工程にて凍結される酢酸菌含有液には、菌凍結保存剤が添加されていないことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の酢酸菌発酵液の保管方法。
【請求項５】
前記保管工程において、３０日以上の期間保管することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の酢酸菌の保管方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法により保管された酢酸菌。
【請求項７】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法により保管された酢酸菌を種菌として用いて酢酸発酵を行うことによって、食酢を製造することを特徴とする食酢の製造方法。
【請求項１】
深部培養法にて酢酸発酵中の発酵液を採取して希釈溶媒を添加することにより、酢酸濃度が４重量／容量％以下となるように希釈する一次希釈工程と、
前記一次希釈工程で希釈された酢酸菌発酵液を遠心分離しかつ希釈溶媒を添加することにより、酢酸濃度が０．１重量／容量％以下となるように希釈する遠心分離及び二次希釈工程と、
前記遠心分離及び二次希釈工程を経て酢酸濃度が０．１重量／容量％以下となった酢酸菌を含有する酢酸菌含有液を凍結する凍結工程と、
前記凍結工程を経て凍結された酢酸菌含有液を−５℃以下で保管する保管工程と
を有することを特徴とする酢酸菌の保管方法。
【請求項２】
前記酢酸発酵中の発酵液を採取してから前記酢酸菌含有液を凍結するまでの作業を７２時間以内に行うことを特徴とする請求項１に記載の酢酸菌の保管方法。
【請求項３】
前記遠心分離及び二次希釈工程において、遠心分離の際に希釈溶媒を注ぎ入れることにより遠心分離と希釈とを同時に行うことを特徴とする請求項１または２に記載の酢酸菌の保管方法。
【請求項４】
前記凍結工程にて凍結される酢酸菌含有液には、菌凍結保存剤が添加されていないことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の酢酸菌発酵液の保管方法。
【請求項５】
前記保管工程において、３０日以上の期間保管することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の酢酸菌の保管方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法により保管された酢酸菌。
【請求項７】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法により保管された酢酸菌を種菌として用いて酢酸発酵を行うことによって、食酢を製造することを特徴とする食酢の製造方法。
【公開番号】特開２０１０−１７２３２６（Ｐ２０１０−１７２３２６Ａ）
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２１９１１（Ｐ２００９−２１９１１）
【出願日】平成２１年２月２日（２００９．２．２）
【出願人】（３０１０５８３３３）株式会社ミツカンサンミ (13)
【出願人】（３９８０６５５３１）株式会社ミツカングループ本社 (157)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２日（２００９．２．２）
【出願人】（３０１０５８３３３）株式会社ミツカンサンミ (13)
【出願人】（３９８０６５５３１）株式会社ミツカングループ本社 (157)
【Ｆターム（参考）】
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