非天然アミノ酸のインビボ組込み用直交翻訳成分
【課題】大腸菌等の真正細菌宿主細胞又は酵母細胞等の真核宿主で産生された蛋白質に非天然アミノ酸を組込むことができるtRNAとアミノアシルtRNAシンテターゼの翻訳系の提供。
【解決手段】(a)p−ニトロ−L−フェニルアラニンである第1の非天然アミノ酸と;(b)第1の直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)と;(c)第1の直交tRNA(O−tRNA)を含み;前記第1のO−RSが前記第1の非天然アミノ酸と特定な配列からなるアミノ酸配列の前記第1のO−tRNAおよびO−RSを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも50%の効率で前記第1のO−tRNAを前記第1の非天然アミノ酸でアミノアシル化する翻訳系。
【解決手段】(a)p−ニトロ−L−フェニルアラニンである第1の非天然アミノ酸と;(b)第1の直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)と;(c)第1の直交tRNA(O−tRNA)を含み;前記第1のO−RSが前記第1の非天然アミノ酸と特定な配列からなるアミノ酸配列の前記第1のO−tRNAおよびO−RSを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも50%の効率で前記第1のO−tRNAを前記第1の非天然アミノ酸でアミノアシル化する翻訳系。
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【特許請求の範囲】
【請求項1】
(a)p−ニトロ−L−フェニルアラニンである第1の非天然アミノ酸と;
(b)第1の直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)と;
(c)第1の直交tRNA(O−tRNA)を含み;
前記第1のO−RSが前記第1の非天然アミノ酸と配列番号1に記載の前記第1のO−tRNAおよび配列番号10のアミノ酸配列を含むO−RSを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも50%の効率で前記第1のO−tRNAを前記第1の非天然アミノ酸でアミノアシル化する翻訳系。
【請求項2】
前記第1のO−RSがMethanococcus jannaschiiアミノアシルtRNAシンテターゼから誘導される請求項1に記載の翻訳系。
【請求項3】
前記第1のO−RSが野生型Methanococcus jannaschiiチロシルtRNAシンテターゼから誘導される請求項1に記載の翻訳系。
【請求項4】
前記第1のO−RSが配列番号10に記載のアミノ酸配列を有し、かつTyr
32 Leu,Glu 107 Ser, ASP 158 Pro, Ile 159 Leu, His 160 Asn, および Leu 162 Gluであるものと少なくとも90%が一致するアミノ酸配列を含む請求項1に記載の翻訳系。
【請求項5】
前記第1のO−tRNAがアンバーサプレッサーtRNAである請求項1に記載の翻訳系。
【請求項6】
前記第1のO−tRNAが配列番号1に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるものである請求項1に記載の翻訳系。
【請求項7】
該当蛋白質をコードする核酸を更に含み、その核酸が少なくとも1個のセレクターコドンを含み、そのセレクターコドンが前記第1のO−tRNAにより認識される請求項1に記載の翻訳系。
【請求項8】
第2のO−RSと第2のO−tRNAを更に含み、第2のO−RSが第2のO−tRNAを第1の非天然アミノ酸と異なる第2の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第2のO−tRNAが第1のO−tRNAにより認識されるセレクターコドンと異なるセレクターコドンを認識する請求項7に記載の翻訳系。
【請求項9】
前記翻訳系が宿主細胞を含み、その宿主細胞が前記第1の非天然アミノ酸と、前記第1のO−RSと、前記第1のO−tRNAを含む請求項1に記載の翻訳系。
【請求項10】
前記宿主細胞が真正細菌細胞である請求項9に記載の翻訳系。
【請求項11】
前記真正細菌細胞が大腸菌細胞ある請求項10に記載の翻訳系。
【請求項12】
前記宿主細胞が前記第1のO−RSをコードするポリヌクレオチドを含む請求項9に記載の翻訳系。
【請求項13】
前記ポリヌクレオチドが配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含む請求項12に記載の翻訳系。
【請求項14】
前記宿主細胞が前記第1のO−tRNSをコードするポリヌクレオチドを含む請求項9に記載の翻訳系。
【請求項15】
特定位置に非天然アミノ酸を含む蛋白質を宿主細胞で生産する方法であって、
(a)(i)p−ニトロ−L−フェニルアラニンである第1の非天然アミノ酸と;
(ii)第1の直交tRNA(O−tRNA)と;
(iii)第1の直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)(但し、前記第1のO−RSは、前記第1の非天然アミノ酸と配列番号1に記載の前記第1のO−tRNAおよび配列番号10のアミノ酸配列を含むO−RSを含む前記宿主細胞で観察される効率の少なくとも50%の効率で、前記第1のO−tRNAを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する)と;
(iv)前記蛋白質をコードし、前記第1のO−tRNAにより認識される少なくとも1個のセレクターコドンを含む核酸と、
を含む宿主細胞を提供する段階と;
(b)前記宿主細胞を増殖させる段階と;
(c)前記蛋白質の翻訳中に前記核酸のセレクターコドンの位置に対応する前記蛋白質の前記選択位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記選択位置に前記非天然アミノ酸を含む前記蛋白質を生産する段階とを含む前記方法。
【請求項16】
翻訳系を提供する前記段階が前記O−RSをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項17】
翻訳系を提供する前記段階がMethanococcus jannaschiiアミノアシルtRNAシンテターゼから誘導されるO−RSを提供する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項18】
翻訳系を提供する前記段階が野生型Methanococcus jannaschiiチロシルtRNAシンテターゼから誘導されるO−RSを提供する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項19】
翻訳系を提供する前記段階が配列番号10に記載のアミノ酸配列を有し、かつTyr 32 Leu,Glu 107 Ser, Asp 158 Pro, Ile 159 Leu, His 160 Asn, および Leu 162 Glu より成るものと少なくとも90%が一致するアミノ酸配列を含むO−RSを提供する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項20】
翻訳系を提供する前記段階が部位特異的突然変異誘発後により野生型のアミノアシルtRNAシンテターゼのアミノ酸結合ポッケトを突然変異させる段階と、前記O−tRNAを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する得られたO−RSを選択する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項21】
前記選択段階が部位特異的突然変異誘発後に得られた複数のアミノアシルtRNAシンテターゼ分子を含むプールから前記O−RSをポジティブ選択及びネガティブ選択する段階を含む請求項20に記載の方法。
【請求項22】
翻訳系を提供する前記段階が前記O−tRNAをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項23】
翻訳系を提供する前記段階がアンバーサプレッサーtRNAであるO−tRNAを提供する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項24】
翻訳系を提供する前記段階が配列番号1に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるO−tRNAを提供する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項25】
翻訳系を提供する前記段階がアンバーセレクターコドンを含む核酸を提供する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項26】
前記蛋白質が第1の非天然アミノ酸と異なる第2の非天然アミノ酸を更に含み、第2のO−RSと第2のO−tRNAを更に含む翻訳系を提供し、第2のO−RSが第2のO−tRNAを第1の非天然アミノ酸と異なる第2の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第2のO−tRNAが第1のO−tRNAにより認識されるセレクターコドンと異なる核酸中のセレクターコドンを認識する請求項15に記載の方法。
【請求項27】
翻訳系を提供する前記段階が宿主細胞を提供する段階を含み、前記宿主細胞が前記第1の非天然アミノ酸と、前記第1のO−RSと、前記第1のO−tRNAと、前記核酸を含み、前記組込み段階が前記宿主細胞を培養する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項28】
宿主細胞を提供する前記段階が真正細菌宿主細胞又は酵母宿主細胞を提供する段階を含む請求項27に記載の方法。
【請求項29】
真正細菌宿主細胞を提供する前記段階が大腸菌宿主細胞を提供する段階を含む請求項28に記載の方法。
【請求項30】
宿主細胞を提供する前記段階が前記O−RSをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する段階を含む請求項27に記載の方法。
【請求項31】
前記O−RSをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する前記段階が配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する段階を含む請求項30に記載の方法。
【請求項32】
翻訳系を提供する前記段階が細胞抽出液を提供する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項33】
配列番号10に記載のアミノ酸配列で、Tyr 32 Leu,Glu 107 Ser, ASP 158 Pro, Ile159 Leu, His 160 Asn, および Leu 162 Gluであるものと少なくとも90%が一致するポリペプチドを含む組成物であり、前記ポリペプチドが配列番号1に記載のO−tRNA、前記非天然アミノ酸および配列番号7のアミノ酸配列を含むアミノアシルtRNAシンテターゼを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも50%の効率で、コグネイト直交tRNA(O−tRNA)を前記非天然アミノ酸でアミノアシル化する前記組成物生物。
【請求項34】
請求項33に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項35】
前記ポリヌクレオチドが配列番号11のものである請求項34に記載のポリヌクレオチド。
【請求項36】
前記組成物がポリペプチドを含む細胞である請求項33に記載の組成物。
【請求項37】
配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項38】
請求項37に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項39】
請求項37に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項40】
請求項37に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞。
【請求項1】
(a)p−ニトロ−L−フェニルアラニンである第1の非天然アミノ酸と;
(b)第1の直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)と;
(c)第1の直交tRNA(O−tRNA)を含み;
前記第1のO−RSが前記第1の非天然アミノ酸と配列番号1に記載の前記第1のO−tRNAおよび配列番号10のアミノ酸配列を含むO−RSを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも50%の効率で前記第1のO−tRNAを前記第1の非天然アミノ酸でアミノアシル化する翻訳系。
【請求項2】
前記第1のO−RSがMethanococcus jannaschiiアミノアシルtRNAシンテターゼから誘導される請求項1に記載の翻訳系。
【請求項3】
前記第1のO−RSが野生型Methanococcus jannaschiiチロシルtRNAシンテターゼから誘導される請求項1に記載の翻訳系。
【請求項4】
前記第1のO−RSが配列番号10に記載のアミノ酸配列を有し、かつTyr
32 Leu,Glu 107 Ser, ASP 158 Pro, Ile 159 Leu, His 160 Asn, および Leu 162 Gluであるものと少なくとも90%が一致するアミノ酸配列を含む請求項1に記載の翻訳系。
【請求項5】
前記第1のO−tRNAがアンバーサプレッサーtRNAである請求項1に記載の翻訳系。
【請求項6】
前記第1のO−tRNAが配列番号1に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるものである請求項1に記載の翻訳系。
【請求項7】
該当蛋白質をコードする核酸を更に含み、その核酸が少なくとも1個のセレクターコドンを含み、そのセレクターコドンが前記第1のO−tRNAにより認識される請求項1に記載の翻訳系。
【請求項8】
第2のO−RSと第2のO−tRNAを更に含み、第2のO−RSが第2のO−tRNAを第1の非天然アミノ酸と異なる第2の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第2のO−tRNAが第1のO−tRNAにより認識されるセレクターコドンと異なるセレクターコドンを認識する請求項7に記載の翻訳系。
【請求項9】
前記翻訳系が宿主細胞を含み、その宿主細胞が前記第1の非天然アミノ酸と、前記第1のO−RSと、前記第1のO−tRNAを含む請求項1に記載の翻訳系。
【請求項10】
前記宿主細胞が真正細菌細胞である請求項9に記載の翻訳系。
【請求項11】
前記真正細菌細胞が大腸菌細胞ある請求項10に記載の翻訳系。
【請求項12】
前記宿主細胞が前記第1のO−RSをコードするポリヌクレオチドを含む請求項9に記載の翻訳系。
【請求項13】
前記ポリヌクレオチドが配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含む請求項12に記載の翻訳系。
【請求項14】
前記宿主細胞が前記第1のO−tRNSをコードするポリヌクレオチドを含む請求項9に記載の翻訳系。
【請求項15】
特定位置に非天然アミノ酸を含む蛋白質を宿主細胞で生産する方法であって、
(a)(i)p−ニトロ−L−フェニルアラニンである第1の非天然アミノ酸と;
(ii)第1の直交tRNA(O−tRNA)と;
(iii)第1の直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)(但し、前記第1のO−RSは、前記第1の非天然アミノ酸と配列番号1に記載の前記第1のO−tRNAおよび配列番号10のアミノ酸配列を含むO−RSを含む前記宿主細胞で観察される効率の少なくとも50%の効率で、前記第1のO−tRNAを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する)と;
(iv)前記蛋白質をコードし、前記第1のO−tRNAにより認識される少なくとも1個のセレクターコドンを含む核酸と、
を含む宿主細胞を提供する段階と;
(b)前記宿主細胞を増殖させる段階と;
(c)前記蛋白質の翻訳中に前記核酸のセレクターコドンの位置に対応する前記蛋白質の前記選択位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記選択位置に前記非天然アミノ酸を含む前記蛋白質を生産する段階とを含む前記方法。
【請求項16】
翻訳系を提供する前記段階が前記O−RSをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項17】
翻訳系を提供する前記段階がMethanococcus jannaschiiアミノアシルtRNAシンテターゼから誘導されるO−RSを提供する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項18】
翻訳系を提供する前記段階が野生型Methanococcus jannaschiiチロシルtRNAシンテターゼから誘導されるO−RSを提供する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項19】
翻訳系を提供する前記段階が配列番号10に記載のアミノ酸配列を有し、かつTyr 32 Leu,Glu 107 Ser, Asp 158 Pro, Ile 159 Leu, His 160 Asn, および Leu 162 Glu より成るものと少なくとも90%が一致するアミノ酸配列を含むO−RSを提供する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項20】
翻訳系を提供する前記段階が部位特異的突然変異誘発後により野生型のアミノアシルtRNAシンテターゼのアミノ酸結合ポッケトを突然変異させる段階と、前記O−tRNAを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する得られたO−RSを選択する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項21】
前記選択段階が部位特異的突然変異誘発後に得られた複数のアミノアシルtRNAシンテターゼ分子を含むプールから前記O−RSをポジティブ選択及びネガティブ選択する段階を含む請求項20に記載の方法。
【請求項22】
翻訳系を提供する前記段階が前記O−tRNAをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項23】
翻訳系を提供する前記段階がアンバーサプレッサーtRNAであるO−tRNAを提供する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項24】
翻訳系を提供する前記段階が配列番号1に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるO−tRNAを提供する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項25】
翻訳系を提供する前記段階がアンバーセレクターコドンを含む核酸を提供する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項26】
前記蛋白質が第1の非天然アミノ酸と異なる第2の非天然アミノ酸を更に含み、第2のO−RSと第2のO−tRNAを更に含む翻訳系を提供し、第2のO−RSが第2のO−tRNAを第1の非天然アミノ酸と異なる第2の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第2のO−tRNAが第1のO−tRNAにより認識されるセレクターコドンと異なる核酸中のセレクターコドンを認識する請求項15に記載の方法。
【請求項27】
翻訳系を提供する前記段階が宿主細胞を提供する段階を含み、前記宿主細胞が前記第1の非天然アミノ酸と、前記第1のO−RSと、前記第1のO−tRNAと、前記核酸を含み、前記組込み段階が前記宿主細胞を培養する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項28】
宿主細胞を提供する前記段階が真正細菌宿主細胞又は酵母宿主細胞を提供する段階を含む請求項27に記載の方法。
【請求項29】
真正細菌宿主細胞を提供する前記段階が大腸菌宿主細胞を提供する段階を含む請求項28に記載の方法。
【請求項30】
宿主細胞を提供する前記段階が前記O−RSをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する段階を含む請求項27に記載の方法。
【請求項31】
前記O−RSをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する前記段階が配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する段階を含む請求項30に記載の方法。
【請求項32】
翻訳系を提供する前記段階が細胞抽出液を提供する段階を含む請求項15に記載の方法。
【請求項33】
配列番号10に記載のアミノ酸配列で、Tyr 32 Leu,Glu 107 Ser, ASP 158 Pro, Ile159 Leu, His 160 Asn, および Leu 162 Gluであるものと少なくとも90%が一致するポリペプチドを含む組成物であり、前記ポリペプチドが配列番号1に記載のO−tRNA、前記非天然アミノ酸および配列番号7のアミノ酸配列を含むアミノアシルtRNAシンテターゼを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも50%の効率で、コグネイト直交tRNA(O−tRNA)を前記非天然アミノ酸でアミノアシル化する前記組成物生物。
【請求項34】
請求項33に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項35】
前記ポリヌクレオチドが配列番号11のものである請求項34に記載のポリヌクレオチド。
【請求項36】
前記組成物がポリペプチドを含む細胞である請求項33に記載の組成物。
【請求項37】
配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項38】
請求項37に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項39】
請求項37に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項40】
請求項37に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞。
【図1−1】
【図1−2】
【図1−3】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図1−2】
【図1−3】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【公開番号】特開2012−254073(P2012−254073A)
【公開日】平成24年12月27日(2012.12.27)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2011−255180(P2011−255180)
【出願日】平成23年11月22日(2011.11.22)
【分割の表示】特願2007−539228(P2007−539228)の分割
【原出願日】平成17年10月27日(2005.10.27)
【出願人】(399038620)ザ スクリプス リサーチ インスティチュート (51)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成24年12月27日(2012.12.27)
【国際特許分類】
【出願日】平成23年11月22日(2011.11.22)
【分割の表示】特願2007−539228(P2007−539228)の分割
【原出願日】平成17年10月27日(2005.10.27)
【出願人】(399038620)ザ スクリプス リサーチ インスティチュート (51)
【Fターム(参考)】
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