高濃度のグアニン・モノマーを含有するオリゴヌクレオチド
本発明は、オリゴヌクレオチド合成、特にグアニン・モノマーの高い含有量を含むオリゴヌクレオチドの合成のための方法に関連する。更に詳細に、本発明は、オリゴヌクレオチド合成の間、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドに、ヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるための方法に関連する。本発明は更に、本発明の方法によって入手可能なオリゴヌクレオチドに関連する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願についてのクロス・リファレンス）
本出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下で、２００６年１２月１２日に出願の米国仮特許出願番号第６０／８６９，５８８号に対する優先権を主張する。上記の出願の全ての教示は、参照することによりここに援用する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、オリゴヌクレオチド合成、特にグアニン・モノマーの高い含有量を含むオリゴヌクレオチドの合成のための方法に関連する。更に詳細に、本発明は、オリゴヌクレオチド合成の間、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドに、ヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるための方法に関連する。本発明は更に、本発明の方法によって入手可能なオリゴヌクレオチドに関連する。
（発明の背景）
【０００３】
化学的に合成されたＤＮＡ及びＲＮＡ（「オリゴヌクレオチド」）及びそのアナログは、大部分の分子生物学的応用で用いられる。オリゴヌクレオチド合成の方法は３０年間以上利用可能であり（Agarwal et al., Nature, 227:27-34 (1970)を参照）、現在、オリゴヌクレオチド合成で最も一般的な方法は、ホスホロアミダイト化学（McBride et al., Tetrahedron Lett., 24:245-248 (1983)を参照）によるものである。
【０００４】
ホスホラミダイト合成は、通常、最も３’側(3'-most)のヌクレオチドから始り、最も５’側(5'-most)のヌクレオチドが付加されるまで、繰り返される４ステップから成る一連のサイクルによって進行する。しかしながら、適当な構造のヌクレオシド・ホスホラミダイト及び第一のヌクレオシドを選択することにより、５’−３’方向へのホスホラミダイト合成を確立することは当業者の通常の技量の範囲内である。ここに開示される方法は合成の両方向に適用でき、３’−５’方向の合成が一般的に好まれる。
【０００５】
４つのステップは、脱保護、カップリング、キャッピング及び安定化（一般に酸化又は硫化）である。１つの変型例では、脱保護ステップの間、適した溶媒（例えばジクロロメタン又はトルエン）中でレシピエント・ヌクレオチドのペントース糖の５’−炭素に付加しているトリチル基がトリクロロ酢酸（イソチオシアン酸テトラメチルローダミン）又はジクロロ酢酸（ドライバー制御域）によって取り除かれ、反応性水酸基が残る。次のホスホラミダイト・モノマーは、カップリングステップで付加される。テトラゾール（弱酸）のような活性化因子はカップリングヌクレオシド・ホスホラミダイトと反応させるために用いられ、テトラゾリル・ホスホラミダイト中間体を形成する。この中間体はレシピエントの水酸基と反応し、５’から３’の結合が形成される。テトラゾールが再構成され、プロセスは続く。カップリングの失敗は、この時点でも５’末端に反応性水酸基を有しているオリゴヌクレオチドにおいて起こる。次のサイクルでオリゴヌクレオチドが反応性であること（欠損ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを製造する）を防ぐために、それらは、アセチル化剤（例えば無水酢酸の混合液及びＮ−メチルイミダゾール）により不可逆的にキャッピングされることによって更なる合成からは取り除かれる。この試薬は、オリゴヌクレオチドをキャッピングするために、遊離ヒドロキシル基とだけ反応する。酸化工程において、通常、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）及び水中の軽度の酸化剤としてのヨウ素の存在下で、伸長オリゴヌクレオチド及び最も後に付加されたヌクレオチド間の亜リン酸エステル結合は安定する。水は酸素供与体として作用し、ヨウ素は亜リン酸結合を有する付加物を形成する。付加物は水によって分解され、安定したリン酸トリエステル結合となる。
【０００６】
合成時間を減らし、プロダクトのより高い収率をつくるために、ホスホラミダイト合成に対して多くの有意な改変が行われた。合成においても更なる改変を必要とする改変ホスホラミダイト・モノマーが開発された。しかしながら、特定のオリゴヌクレオチドの合成において、まだ問題は残っている。１つの問題は、グアニン（Ｇ）−リッチ(guanine (G)-rich)・オリゴマーの合成であった。Ｇが豊富な領域を有するオリゴヌクレオチドは、種々の応用のために非常に有望だった。Ｇ−リッチ・オリゴヌクレオチドは、一般的に分子生物学及び医薬における有用な応用を有する複雑な構造に折りたたまれる。密集した４本鎖構造（例えばトロンビン・アプタマー）に折りたたむ種々のアプタマーが選択された。核酸におけるＧが豊富な繰り返しは、種々の生物学的役割を伴う特定の一価又は二価の金属イオンの存在下でこれらの四重体を形成する（Deng et al., PNAS (2001), 98, 13665-13670; Jin et al., PNAS (1992), 89, 8832-8836及びLee, Nucleic Acids Research (1990), 18, 6057-6060を参照）。
【０００７】
ＤＮＡの場合、この種のＧが豊富な配列の精製は、ｐＨ１２での陰イオン交換精製によって最も達成され、そのためにチミン及びグアニン・アミド官能性はイオン化され、構造形成に関与することができない。しかしながら、質の高い合成は、隣接するグアニン残基の数に依存して困難であり、おそらくカップリングステップにおける活性化ホスホラミダイトが５’−水酸基に接近できないことによる。
【０００８】
特定の長さ又は塩基組成に達したあと、サポートに結合し、保護されたＧ−リッチ・オリゴマーは、凝集が起こる、又はアセトニトリルの溶解性の問題を有しており、５’−水酸基が接近しづらい原因となっている。さらに、これもまた、合成のために用いられる固相担体の性質に関連している。したがって、凝集を妨げる、又は溶解性の問題を解決する混合溶媒又は溶媒に対するニーズが存在する。
【０００９】
提唱された方法は、カップリングステップにおいてグアニン・モノマーが豊富なオリゴマーに関する溶解性又は凝集の問題を軽減する、代替溶媒、特に極性非プロトン溶媒を提供する。
【００１０】
（簡単な発明の要約）
提唱された方法は、カップリングステップにおいてグアニン・モノマーが豊富なオリゴマーに関する溶解性又は凝集の問題を軽減する、代替溶媒、特に極性非プロトン溶媒を提供する。溶媒は、オリゴマー、特にグアニン残基の高い含有量を有するオリゴマーに、より良好な溶解性もたらすために、アセトニトリルに添加することができる。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
提唱された方法は、カップリングステップにおいてグアニン・モノマーが豊富なオリゴマーに関する溶解性又は凝集の問題を軽減する、代替溶媒、特に極性非プロトン溶媒を提供する。ここに開示される極性非プロトン溶媒は、単独、各々と組み合わせて、好ましくはアセトニトリルと組み合わせて用いることができる。極性非プロトン溶媒は、オリゴマー、特にグアニン残基の高い含有量を有するオリゴマーにより良好な溶解性をもたらすために、アセトニトリルに添加することができる。さらにまた、ここに開示される溶媒及び混合溶媒は、カップリング溶液中のヌクレオシド・ホスホラミダイトの高い溶解性をもたらし、その溶解性は好ましくは少なくとも０．０３Ｍである。一実施形態において、溶媒は、カップリングステップの間、アセトニトリル、モノマー及び活性化因子の混合液に添加される。アセトニトリルに対する溶媒の比は、変更することができる。ホスホラミダイト・モノマーは、従来のモノマー、又は改変されたモノマーであってもよい。一実施形態において、グアニン・モノマーは、酸に不安定な保護基、又は最終的なｄＧのカップリングのための脂溶性５’−Ｏ−保護基を有する改変グアニン・モノマーであってもよい。一実施形態において、用いられるｄＧモノマーは、トリイソプロピルシリル保護基を有するＮ２−イソブチリル−２´−デオキシグアノシン３´−Ｏ−ホスホラミダイトである。
【００１２】
提唱された方法は、改変されたヌクレオシド・モノマーと同様に、既知のヌクレオシド・モノマーを含むオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。この方法は、ＤＮＡ合成、又はＲＮＡ合成において用い得る。提唱された方法は、従来の陰イオン交換ＨＰＬＣを基とする精製において通常利用可能なものよりも高いスケールでの生産をも可能にする。
【００１３】
「Ｇが豊富な(G-rich)」又は「グアニンが豊富な(guanine-rich)」という用語は、高い濃度のグアニン・モノマーを有するオリゴヌクレオチドを意味する。一実施形態において、グアニン残基の濃度はオリゴヌクレオチドの溶解性を妨げる、又は減少させるのに十分大きく、それによって、合成が困難になり、所望のプロダクト収率又は純度が減少する。
【００１４】
用語「オリゴヌクレオチド」は、合成されたＲＮＡ又はＤＮＡポリマー及びそのアナログを意味し、「オリゴマー」及び「核酸」と同様の意味として用いられる。
【００１５】
オリゴヌクレオチド合成の収率を決定するための方法及びオリゴヌクレオチドの純度を決定するための方法は、従来技術において一般に公知である。本発明の方法の収率について言及する場合、収率は、通常、好ましくは、基本的に実施例７に開示されるように決定される。同様に、オリゴヌクレオチドの純度に言及する場合、純度は、通常、好ましくは、基本的に実施例７に開示されるように決定される。
【００１６】
一つの態様では、本発明はオリゴヌクレオチドの合成の間、ヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるための方法を提供し、方法はカップリング混合液として一つ以上の極性非プロトン溶媒と活性化剤を組み合わせることを含む。好ましい実施態様において、極性非プロトン溶媒はスルホランである。更なる好ましい実施態様において、極性非プロトン溶媒は、１−メチルピロリジン−２−オン(1-methylpyrrolidin-2-one)である。更なる好ましい実施態様において、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドである。更なる好ましい実施態様において、極性非プロトン溶媒は、テトラメチル尿素である。更なる好ましい実施態様において、活性化剤及び極性非プロトン溶媒は、アセトニトリルと組み合わせられる。更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは３０％以上のグアニン・モノマーを含む。更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、５０％以上のグアニン・モノマーを含む。更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、６０％以上のグアニン・モノマーを含む。更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、グアニン・モノマーが３つ以上の連続する領域を含む。更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、グアニン・モノマーが４つ以上の連続する領域を含む。更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、グアニン・モノマーが５つ以上の連続する領域を含む。更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号：１０である。
【００１７】
ここに記載されるカップリング反応は、オリゴヌクレオチドの合成の間、ヌクレオシド・ホスホラミダイトのユニバーサル・サポートへの最初のカップリングに有用である。そのようなユニバーサル・サポートは、、従来技術として用いられており、通常、好ましくはスクシナート−リンカーを含む。さらにまた、ここに記載されるカップリング反応は、オリゴヌクレオチドの合成の間、第一のヌクレオシドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるために有用であり、第一のヌクレオシドは遊離している、又は、好ましくはサポートに固定されている。さらにまた、ここに記載されるカップリング反応は、オリゴヌクレオチドの合成の間、伸長オリゴヌクレオチドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるために有用である。
【００１８】
したがって、更なる態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドの合成の間、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるための方法に関連しており、以下のステップを含んでいる：（ｉ）カップリング溶液を作製するステップであって、カップリング溶液は（ａ）極性非プロトン溶媒であって、アセトニトリルでない少なくとも１つの第一の溶媒；（ｂ）活性化剤；及び（ｃ）前記ヌクレオシド・ホスホラミダイトを含み、カップリング溶液中のヌクレオシド・ホスホラミダイトの濃度は少なくとも０．０３Ｍであって；好ましくは、カップリング溶液中の活性化剤の濃度は少なくとも０．０５Ｍである；及び（ｉｉ）カップリング溶液を、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドと接触させるステップ。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの合成の間、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるための方法に関連しており、以下のステップを含んでいる：（ｉ）カップリング溶液を作製するステップであってカップリング溶液は（ａ）極性非プロトン溶媒であって、アセトニトリルでない少なくとも１つの第一の溶媒；（ｂ）活性化剤；及び（ｃ）ヌクレオシド・ホスホラミダイトを含み、カップリング溶液中のヌクレオシド・ホスホラミダイトの濃度は少なくとも０．０３Ｍであって；好ましくは、カップリング溶液中の活性化剤の濃度は少なくとも０．０５Ｍである；及び（ｉｉ）カップリング溶液を、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドと接触させるステップ。
【００１９】
好ましい実施態様において、第一の溶媒は、（ａ）スクシノニトリル、（ｂ）グルタロニトリル、（ｃ）アジポニトリル、（ｄ）ピメロニトリル、（ｅ）バレロニトリル、（ｆ）ベンゾニトリル、（ｇ）カプロニトリルからなるグループからは選択されない。別の好ましい実施例では第一の溶媒は、（ａ）ジニトリル、（ｂ）モノ・ニトリル、（ｃ）グライム、（ｄ）ダイグライム、（ｅ）三グライム、（ｆ）トリメチルホスフェート、（ｇ）ジクロロメタン、（ｈ）テトラヒドロフラン、（ｉ）ジメトキシエタン及び（ｊ）ニトロメタンからなるグループからは選択されない。更なる好ましい実施態様において、前記極性非プロトン溶媒は、双極性非プロトン溶媒である。
【００２０】
更なる態様において、本発明は、本発明は、オリゴヌクレオチドの合成の間、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるための方法に関連しており、以下のステップを含んでいる：（ｉ）カップリング溶液を作製するステップであってカップリング溶液は（ａ）極性非プロトン溶媒であって、アセトニトリルでない少なくとも１つの第一の溶媒；（ｂ）活性化剤；（ｃ）ヌクレオシド・ホスホラミダイト；（ｄ）第２の溶媒を含み、第２の溶媒は化学的に少なくとも１つの第一の溶媒のいずれとも異なり、好ましくはアセトニトリルであり、カップリング溶液中のヌクレオシド・ホスホラミダイトの濃度は少なくとも０．０３Ｍであって；好ましくは、カップリング溶液中の活性化剤の濃度は少なくとも０．０５Ｍである；及び（ｉｉ）カップリング溶液を、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドと接触させるステップ。
【００２１】
別の好ましい実施例では、少なくとも一つの第一の溶媒は、（ａ）スルホラン；（ｂ）１−メチルピロリジン−２−オン；（ｃ）Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド；（ｄ）テトラメチル尿素；及び（ｅ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなるグループから選択され、好ましくは、少なくとも一つの第一の溶媒は、（ａ）スルホラン；（ｂ）１−メチルピロリジン−２−オン；（ｃ）Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド；及び（ｄ）テトラメチル尿素からなるグループから選択される。極めて好ましい実施態様において、少なくとも一つの第一の溶媒は、スルホランである。
【００２２】
前の請求項のいずれかの方法におけるカップリング溶液中のヌクレオシド・ホスホラミダイトの濃度は０．０３〜０．３Ｍ、好ましくは０．０３〜０．２０Ｍ、最も好ましくは０．０５〜０．１５Ｍである。
【００２３】
別の好ましい実施例では、カップリング溶液の前記活性化剤の濃度は、０．０５から０．９０Ｍ、好ましくは０．２５〜０．５０Ｍ、最も好ましくは０．３０から０．５Ｍである。更なる好ましい実施態様において、カップリング溶液は、少なくともちょうど一つの第一の溶媒の一つを含む。
【００２４】
更なる好ましい実施態様において、カップリング溶液は、（ａ）少なくとも一つの第一の溶媒のちょうど一つ；（ｂ）活性化剤；及び（ｃ）ヌクレオシド・ホスホラミダイトからなる。
【００２５】
更なる好ましい実施態様において、カップリング溶液は、第二の溶媒を更に含み、好ましくは第二溶媒は弱塩基性の溶媒である。極めて好ましい実施態様において、第二の溶媒はアセトニトリルである。
【００２６】
本発明の基礎をなしている化学反応、特にユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドへのヌクレオシド・ホスホラミダイトのカップリングを促進するために、第一及び／又は第二溶媒が好ましくは水を含まない形態として提供されることは技術者にとっては明白である。
【００２７】
更に好ましい実施態様において、前記カップリング溶液は、（ａ）少なくとも一つの第一の溶媒のちょうど一つ；（ｂ）活性化剤；（ｃ）ヌクレオシド・ホスホラミダイト；及び（ｄ）好ましくはアセトニトリルである第２の溶媒を含むか、好ましくはそれらからなる。
【００２８】
更に好ましい実施態様において、第二の溶媒に対する少なくとも一つの第一の溶媒の比（ｖ／ｖ）は、５：１から１：２の間で、好ましくは４：１から１：２の間で、より好ましくは３：１から２：５の間で、さらに好ましくは２：１から２：５の間で、さらに好ましくは２：１から１：１の間である。
【００２９】
更なる好ましい実施態様において、第二の溶媒に対する少なくとも一つの第一の溶媒の比（ｖ／ｖ）は、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１又は１：２であり、好ましくは約１：１であり、最も好ましくは１：１である。
【００３０】
更なる好ましい実施態様において、第一のヌクレオシド及び／又は伸長オリゴヌクレオチドは、サポートに固定され、そのサポートは、好ましくは（ａ）ポリスチレンサポート；及び（ｂ）シリカサポートから選択され、好ましくは制御細孔ガラス（ＣＰＧ）サポートである。
【００３１】
更なる好ましい実施態様において、サポートはポリスチレンサポートであって、好ましくはポリスチレンサポートはジビニルベンゼンによって架橋結合されており、更に好ましくはポリスチレンサポートは機能的水酸基によって特徴づけられ、更に好ましくはポリスチレンサポートは約９０μｍの平均粒度を含む。
【００３２】
更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも７５％のグアニン・モノマーを含む。
【００３３】
別の好ましい実施例では活性化剤は、（ａ）４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）；（ｂ）５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）；（ｃ）５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＢＴＴ）；及び（ｄ）５−（３，５−ビス−トリフロロメチル）フェニル−１Ｈ−テトラゾール（活性化因子４２）からなるグループから選択される。極めて好ましい実施態様において、活性化剤は、４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）である。
【００３４】
更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、グアニン・モノマーが３以上、好ましくは４以上、最も好ましくは５以上連続する領域を含む。
【００３５】
更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、グアニン・モノマーが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０連続する第一の領域を含む。
【００３６】
更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、グアニン・モノマーが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０連続する第二の領域を含む。
【００３７】
更なる好ましい実施態様において、第一の領域はオリゴヌクレオチドの３’−末端に位置する、及び／又は第二の領域はオリゴヌクレオチドの５’−末端に位置する。
【００３８】
更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは１０から５０、好ましくは２０〜４０、最も好ましくは３０のヌクレオチド・モノマーを含む。
【００３９】
更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドはパリンドローム配列を含み、好ましくはパリンドローム配列はＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号：２）である。
【００４０】
更なる好ましい実施態様において、パリンドローム配列は、少なくとも４、多くても２０、好ましくは多くても１０のグアノシンによってその５’−末端に隣接している；及び／又はパリンドローム配列は、少なくとも６、多くても２０、好ましくは多くても１０のグアノシンによってその３’−末端に隣接している。
【００４１】
更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、（ａ）ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：３）；（ｂ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：４）；（ｃ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：５）；（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：６）；（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：７）；（ｆ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：８）；（ｇ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：９）；（ｈ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１０）；及び（ｉ）ＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１１）からなるグループから選択されるヌクレオチドを含むか、好ましくはそれらからなる。極めて好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号：１０を含むか、好ましくはそれからなる。
【００４２】
更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドはデオキシヌクレオチドであり、好ましくはデオキシヌクレオチドはリン酸ジエステル結合モノマーのみからなる。
【００４３】
更なる態様において、本発明はオリゴヌクレオチドを製造するための方法に関連し、その方法は、オリゴヌクレオチドの合成の間、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるための、ここに記載される方法のいずれか一つを含む。
【００４４】
更なる態様において、本発明はオリゴヌクレオチドを製造するための方法に関連し、その方法は（ｉ）第一のヌクレオシドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるステップ（カップリングは、オリゴヌクレオチドの合成の間、ヌクレオシド・ホスホラミダイトを第一のヌクレオシドにカップリングさせるための、ここに記載される方法のいずれかを含む）；（ｉｉ）ステップ（ｉ）のプロダクトを酸化させることによって、伸長オリゴヌクレオチドを生成するステップ；（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のプロダクトに、ヌクレオシド・ホスホラミダイトを、通常及び好ましくは脱保護の後にカップリングさせるステップ（カップリングは、オリゴヌクレオチドの合成の間、ヌクレオシド・ホスホラミダイトを伸長オリゴヌクレオチドにカップリングさせるための、ここに記載される方法のいずれかを含む）；（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）のプロダクトを酸化させることによって、伸長オリゴヌクレオチドを生成するステップ；及び（ｖ）伸長オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの配列を含むまで、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）のステップを繰り返すステップ、を含む。
【００４５】
好ましい実施態様における方法は、変性条件の下でオリゴヌクレオチドを精製するステップをさらに含み、好ましくは変性条件は、ｐＨ１０から１４、好ましくはｐＨ１０から１３、より好ましくは約ｐＨ１２、最も好ましくはｐＨ１２として特徴づけられる。
【００４６】
更なる好ましい実施態様における方法は、ｐＨ１０から１４、好ましくはｐＨ１０から１３、より好ましくは約ｐＨ１２、最も好ましくはｐＨ１２でオリゴヌクレオチドを精製するステップをさらに含む。
【００４７】
更なる好ましい実施態様における精製は、陰イオン交換クロマトグラフィによって行われ、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィは四級アミン基で官能化された陰イオン−交換マトリックスを用いて行われ、より好ましくは陰イオン−交換マトリックスはポリスチレン及びポリメタクリレートから選択される材料からなり、更に好ましくは材料はポリメタクリレートである。
【００４８】
更なる好ましい実施態様におけるオリゴヌクレオチドは、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも３５％、最も好ましくは少なくとも４０％の第一のヌクレオシドに関するモル収率で製造される。
【００４９】
更なる好ましい実施態様におけるオリゴヌクレオチドの純度は、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％である。
【００５０】
更なる態様において、本発明は、ヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるための方法におけるカップリング溶液の使用に関するものであり、カップリング溶液は：（ａ）少なくとも極性非プロトン溶媒であってアセトニトリルでない一つの第一の溶媒；（ｂ）活性化剤；及び（ｃ）ヌクレオシド・ホスホラミダイトを含み、カップリング溶液中のヌクレオシド・ホスホラミダイトの濃度は少なくとも０．０３Ｍであり、カップリング溶液中の活性化剤の濃度は少なくとも０．０５Ｍである。好ましい実施態様における方法は、オリゴヌクレオチドの合成の間、第一のヌクレオシド又は伸長ヌクレオチドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるための、ここに記載される方法のいずれかの特性によって、更に特徴づけられる。
【００５１】
更なる態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドの合成の間、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるためのカップリング溶液に関連し、カップリング溶液は：（ａ）極性非プロトン溶媒であってアセトニトリルもしくはアジポニトリルではない少なくとも一つの第一の溶媒；（ｂ）活性化剤；及び（ｃ）ヌクレオシド・ホスホラミダイト；を含み、カップリング溶液中のヌクレオシド・ホスホラミダイトの濃度は少なくとも０．０３Ｍであり；カップリング溶液中の活性化剤の濃度は少なくとも０．０５Ｍである。好ましい実施態様における方法は、ここに開示される方法のいずれかの特性によって、更に特徴づけられる。好ましい実施態様において、カップリング溶液は、ここに開示されるいずれかの特性によって特徴づけられ、あらゆる組合せにより特徴づけられる。
【００５２】
極めて好ましい実施態様は、（ａ）ちょうど一つの第一の溶媒（極性非プロトン溶媒であって、（ｉ）スルホラン；（ｉｉ）１−メリルピロリジン−２−オン；（ｉｉｉ）Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド；（ｉｖ）テトラメチル尿素；及び（ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなるグループから選択され；好ましくは、第一の溶媒はスルホランである）；（ｂ）活性化剤；（ｃ）前記ヌクレオシド・ホスホラミダイト；及び（ｄ）第２の溶媒、を含むか、好ましくはそれからなり、第２の溶媒はアセトニトリルであり；カップリング溶液中のヌクレオシド・ホスホラミダイトの濃度は少なくとも０．０３Ｍであり；第２の溶媒に対する第一の溶媒の比（ｖ／ｖ）は、５：１から１：２の間であって、好ましくは、１：１である。
【００５３】
更なる態様において、本発明は、ここに開示されるいずれかの方法、特にここに開示されるオリゴヌクレオチドを製造するための方法のいずれかにより得られるオリゴヌクレオチドに関連する。
【００５４】
好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、（ａ）ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：３）；（ｂ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：４）；（ｃ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：５）；（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：６）；（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：７）；（ｆ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：８）；（ｇ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：９）；（ｈ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１０）；及び（ｉ）ＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１１）からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を含むか、好ましくはそれらからなる。極めて好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは配列番号：１０からなる。
【００５５】
更なる態様において、本発明は、（ａ）ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：３）；（ｂ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：４）；（ｃ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：５）；（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：６）；（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：７）；（ｆ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：８）；（ｇ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：９）；（ｈ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１０）；及び（ｉ）ＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１１）からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を含むか、好ましくはそれらからなるオリゴヌクレオチドに関連し、オリゴヌクレオチドの純度は、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％である。極めて好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは配列番号：１０からなる。
【００５６】
ここに開示される方法はオリゴヌクレオチド、例えば、ポリ−Ｇが隣接するメチル化されていないＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドなど、特にＧが豊富なオリゴヌクレオチドの大規模な合成に適している。この種の化合物は、薬学的応用において用いられる。例えば、それらは、既知の免疫系の刺激因子である。したがって、更なる態様において、本発明は、製薬及び／又はワクチンの製造における本発明のオリゴヌクレオチドの使用に関連する。
【００５７】
更なる態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドの合成の間、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるための方法に関連し：（ｉ）（ａ）極性非プロトン溶媒であってアセトニトリルでない少なくとも一つの第一の溶媒；（ｂ）活性化剤；及び（ｃ）ヌクレオシド・ホスホラミダイトを含むカップリング溶液を作製するステップであって、カップリング溶液中のヌクレオシド・ホスホラミダイトの濃度は少なくとも０．０３Ｍであり；カップリング溶液中の活性化剤の濃度は少なくとも０．０５Ｍである；及び（ｉｉ）ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドとカップリング溶液を接触させるステップ、を含む。好ましい実施態様において、第一の溶媒はアジポニトリルではない。
【００５８】
ここに記載される公報、特許出願及び特許を含む全ての文献は、それぞれの文献が単独で又は特異的に援用されたことが示され、その全てが説明されたかのようにここに引用されたものとする。
【００５９】
本発明の説明において（特に以下の請求項に関連して）、用語「a」及び「an」及び「the」及び類似した指示対象の使用は、特に明記しない限り、又は文脈により明らかに否定されない限り、単数及び複数を包含するように解釈される。用語「含む」、「有する」、「包含する」、及び「含有する」は、特に明記しない限り制限のない(open-ended)用語（すなわち、「含むがそれに限定されない」ことを意味する用語）として解釈される。ここにおける値の範囲の記載は、単に範囲内の個々の値を言及する簡便な方法として役割をなすことを目的とするものであり、特に明記しない限り、一つ一つが記載されるかのように、それぞれ個々の値は明細書に援用される。ここに記載される全ての方法は、特に明記しない限り、又は文脈により明らかに否定されない限り、あらゆる適切な順序で行われ得る。ここに提供されるあらゆる例及び全ての例、又は典型的な言語（例えば「のような」）の使用は、単に本発明をよりよく説明するためであり、請求されない限り、本発明の範囲を制限しない。明細書の文言は、クレームされていないエレメントが本発明を実施するために必須であることを示しているとは解釈されてはならない。
【００６０】
本発明の好ましい実施態様はここに記載されており、発明者の知る本発明を実施するための最良の形態を含む。それらの好ましい実施態様の変型例は、上述の記載を読むことにより当業者に明瞭となるであろう。発明者は、熟練した技術者が適切にこの種の変型例を使用し、特にここに記載される以外の別の方法で本発明が実施されると推測する。したがって、本発明は、適用法に認められるように、ここに追加される請求項において記載されるものの全ての改変物及び均等物を含む。さらに、その全てのあり得る変型例の上述のエレメントのあらゆる組合せは、特に明記しない限り、又は文脈によって明らかに否定されない限り、本発明に包含される。
【実施例】
【００６１】
以下の例は、本発明を更に説明するが、もちろんその範囲を制限するように解釈されてはならない。
【００６２】
（実施例1）
この実施例は、オリゴマー合成の互換性について試験された溶媒を記載する。以下の溶媒が試験された。
【００６３】
１−メチルピロリジン−２−オン（ＮＭＰ）−ＭＷ９９．１３；密度１．０３２ｇ／ｍｌ；粘性１．６７ｃＰ；双極子モーメント４．０９Ｄ。ペプチド合成グレードは、Flukaから得られた（カタログｎｏ．６９１１６；ロット及びフィリングコード１０５９１７８、２１５０４０５５）。ＧＣによる純度は９９．５％以上であり、含水量は０．０２％以下である。
【００６４】
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）−ＭＷ８７．１２；密度０．９４２ｇ／ｍｌ；２０℃における粘性１．０２ｃＰ；双極子モーメント３．７９Ｄ。ｐｕｒｉｓｓ．グレードは、Flukaから得られた（カタログｎｏ．３８８４０；ロット及びフィリングコード４５４９３６／１、４０５０４０５９）。ＧＣによる純度は、９９．５％以上である。
【００６５】
テトラメチル尿素（ＴＭＵ）−ＭＷ１１６．１６；密度０．９６８ｇ／ｍｌ。BioChemikaグレードは、Flukaから得られた（カタログｎｏ．８７８４９；ロット及びフィリングコード１０６３４０３、３０２０５０１０）。ＧＣによる純度は、９９．５％以上である。この材料は、使用前に４オングストロームのモレキュラーシーブ上で４８時間乾燥した。
【００６６】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）−ＭＷ７８．１３；密度１．１００ｇ／ｍｌ；２０℃における粘性１．９９６ｃＰ；双極子モーメント３．９６Ｄ。モレキュラーシーブの上のＰｕｒｉｓｓ．アブソルートは、Flukaから得られた（カタログｎｏ．４１６４７、ロット及びフィリングコード１０７３７２９、２２４０４４５６）。ＧＣによる純度は９９．５％以上であり、含水量は０．００５％以下である。
【００６７】
スルホラン−ＭＷ１２０．１７；密度１．２９３ｇ／ｍｌ；３０℃における粘性１０．３０ｃＰ；双極子モーメント４．８Ｄ。Ｐｕｒｉｓｓ．グレードは、Flukaから得られた（カタログｎｏ．８６１４８、ロット及びフィリング材コード１１８１０２５、４２３０６３３６）。ＧＣによる純度は、９９．５％以上である。この材料は、使用前に、最初に３５℃でオーブンにおいて液化され、４オングストローム・モレキュラーシーブ上で４８時間乾燥した。
【００６８】
１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）−ＭＷ１６８．０４；密度１．５９６ｇ／ｍｌ。ＵＶ分光学グレードは、Apollo Scientificから得られた（カタログｎｏ．ＰＣ ０８７７、ロットｎｏ．ＢＮＯ ＨＦＩＰ−０５−１４）。ＨＦＩＰは、ペプチドを可溶化するために頻繁に使用する極性のヒドロキシル溶媒であるので、コントロールとして含む。
【００６９】
（実施例２）
以下の実施例は、容積配合が１：１のアセトニトリル及び実施例１の溶媒中でのモノマー及び５−ベンジル・チオ・テトラゾール（ＢＴＴ）の溶解性を示す。
【００７０】
ＢＴＴ（ＭＷ１９２．２、含水量７５ｐｐｍ以下）は、emp Biotech GmbHによって供給された（カタログｎｏ．ＮＣ−０１０１−１Ｋ、チャージ／ロットｎｏ．０５０９０４）。ｄＴ（ＭＷ７４４．８３）、ｄＧｉｂｕ（ＭＷ８３９．９２）、ｄＡｂｚ（ＭＷ８５７．９３）、ｄＣｂｚ（ＭＷ８３３．９３）モノマーは、Proligoによって供給された。アセトニトリル（ＭｅＣＮ）は、２５℃において０．３４５ｃＰの粘性及び３．９２Ｄの双極子モーメントを有する。
【００７１】
ｄＴモノマー７４．５ｍｇ（１００μＭｏｌ）は、各々７つのねじふた式の１０ｍｌバイアルに計量された。ｄＧｉｂｕモノマーの８４ｍｇ（１００μｍｏｌ）は、各々７つのねじふた式の１０ｍｌバイアルに計量された。ｄＡｂｚモノマーの８６ｍｇ（１００μｍｏｌ）は、各々７つのねじふた式の１０ｍｌバイアルに計量された。ｄＣｂｚモノマーの８３ｍｇ（１００μｍｏｌ）は、各々７つのねじふた式の１０ｍｌバイアルに計量された。ＢＴＴの２２８ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）は、各々の７つのねじふた式の１０ｍｌバイアルに計量された。
【００７２】
６つの異なる溶媒混合物は、１０ｍｌの乾燥したアセトニトリルと上述した異なる６つのうち一つの溶媒１０ｍｌと、アルゴンの下で別々の乾燥した瓶中で混合することにより調製された。
【００７３】
異なる６つのうち一つの溶媒混合物、又は純粋なアセトニトリルの１ｍｌがＴモノマーの各別々のバイアルに添加された。バイアルは、直ちに閉じ、穏やかに攪拌された。これは、ｄＧ、ｄＡ及びｄＣモノマーのバイアルについて繰り返された。全てのモノマーは、標準シンセサイザー上での使用で必要とされるように、かなり迅速に０．１Ｍの濃度で７つ溶媒混合物中に溶解させた（１０分以内で、ＭｅＣＮ／スルホランの場合、溶解ははいくらか遅かった）。無色透明な溶液が得られた。
【００７４】
ＢＴＴの別々のバイアルのそれぞれに、６つのうち一つの溶媒混合物４ｍｌが添加された。ＨＦＩＰ／ＭｅＣＮ以外の全てのケースにおいて、溶解は、０．３Ｍでは（ＤＮＡ及びＲＮＡ合成のための典型的な標準濃度）ほぼ瞬間的であった。ＢＴＴは純粋なアセトニトリルに添加され、溶解は実施例１の６つの溶媒における溶解ほど早くなかった。穏やかな加温は、純粋なアセトニトリル中での迅速な溶解を達成するのに必要とされた。
【００７５】
全４つの標準保護されたＤＮＡモノマーは、アセトニトリル及びＮＭＰ、ＤＭＡ、ＴＭＵ、ＤＭＳＯ及びスルホランの１：１の混合物に０．１Ｍでは易溶性である。ＢＴＴは、０．３Ｍで５つの混合物の全てにおいて可溶性である。
【００７６】
（実施例３）
以下の実施例は、４８時間後の溶媒溶液のモノマー安定性を示す。様々な溶媒混合物のモノマーの安定性を確認するために、シリカゲルｔｌｃ分析は、室温で４８時間置いた後に、２８のモノマー溶液の１μｌアリコートそれぞれに対して行われた。明らかに、示される測定可能な不安定性は、その特定の溶媒の組合せが合成装置でのＤＮＡ合成に有用でないことを意味する。このために、選択される溶出剤は、３％トリエチルアミンを含有する酢酸エチル／１，２−ジクロロエタン（１：２ ｖ／ｖ）であった。ＭｅＣＮ／ＨＦＩＰ（これらは全ての淡黄色であり、脱トリチル及び分解によるものだろう）以外の全てのモノマー溶液は無色であった。２５４ｎｍ蛍光指示薬の、ｔｌｃのためのアルミニウム・カード上のシリカゲルは、Flukaから得られた（カタログｎｏ．６０７７８、ロットｎｏ．５０３０６６）。
【００７７】
６つの関連する溶媒混合物中の様々なモノマーについて、以下のスポットが観察された。０から０．２１のＲｆ値を有するｔｌｃ上の多数のスポットを伴って、主に予想されたように、溶媒混合物ＭｅＣＮ／ＨＦＩＰは全４つのモノマーの全分解に導いた。結果は、表１に記載された。
表１
【００７８】
ＴＭＵの場合、ｔｌｃスポットは、ＮＭＰ及びＤＭＡの値と比較して、わずかに増加したＲｆ値を有した。ＤＭＳＯにおいて、Ｒｆ値はやや減少していた。ほとんどの場合、両方のジアステレオアイソマーは観察された。ＮＭＰ、ＤＭＡ、ＴＭＵ及びＤＭＳＯのケースにおいて、非常にかすかな不純物スポットもまた観察され得た。スルホランの場合、Ｒｆ値０．２７のかすかな不純物スポットが、ｄＣｂｚモノマーについて観察された。
【００７９】
全４つの標準保護されたＤＮＡモノマーは、溶液してから室温で４８時間後では、ほとんど又は全く分解を示さない。全５つの混合物は、小規模でのオリゴ−ｄＧを含有する配列の合成を試みるために適しているようである。
【００８０】
（実施例４）
以下の例は、ＡＢＩ３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（Applied Biosystems）でのＧが豊富なオリゴヌクレオチド合成のカップリング・ステップで使われる場合の、実施例１の溶媒の有用性を示す。以下のグアニンが豊富なオリゴヌクレオチドが合成のために選択された。
配列番号：１ｄ［ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ］
【００８１】
純粋なアセトニトリルと比較した粘性の変化を参酌するための算出送達因子は、表２に記載される。
表２
【００８２】
ＡＢＩ３９４合成装置のサイクル・パラメータは調整された。１μモル・スケールの場合、関連したモノマー及びモノマー＋ｔｅｔの送達時間（秒）が下記の表に示されているＤＮＡ合成サイクルｎｏ．２０が用いられた。５つの異なる１：１の溶媒混合物についての修正された送達時間もまた表３に示されている。
表３
【００８３】
ＡＢＩ３９４−０８についての以下の合成パラメーターが用いられた。（ｄＧ）１０のトリチル−ｏｆｆ合成は、アセトニトリルとＮＭＰ、ＤＭＡ、ＴＭＵ、ＤＭＳＯ及びスルホラン各々の１：１混合物と、凝縮工程のための溶媒として純粋なアセトニトリルを用いて、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）及びポリスチレン（ＰＳ）サポート上の１μモル・スケールで行われた。ＤＮＡ合成サイクル２０は用いられ、以下の５つのステップを含んだ：（１）７５秒間の１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）中の５％ＤＣＡを用いた脱トリチル；（２）５分間の適切な混合溶媒中の０．１ＭｄＧモノマーを加えた０．５ＭＤＣＩを用いたカップリング；（３）１分間のｔａｃ無水物／ＭｅＣＮを用いたキャッピング；（４）１分間のピリジン／水（９：１ ｖ／ｖ）中の５０ｍＭＩ２を用いた酸化；及び（５）５秒間のキャッピング。「ｔｅｔ ｔｏ ｗａｓｔｅ」、「Ｂ ＋ ｔｅｔ ｔｏ ｃｏｌｕｍｎ」及び「ｔｅｔ ｔｏ ｃｏｌｕｍｎ」の送達時間は、様々な混合溶媒についての上述の表に従って調整された。
【００８４】
ＣＰＧ ｄｇ（ｔａｃ）５００Ａサポートは、SAFC Proligo（プロダクトｎｏ．Ｇ３０２００１、バルクｎｏ．５４５２、ロットｎｏ．２２３４６０）によって供給され、３５μｍｏｌ／ｇロードされた。したがって、２８．６ｍｇは、１μｍｏｌと当量である。７９μｍｏｌ／ｇでロードされるｄＧｉｂｕ ８０Ｓポリスチレンサポートは、GE Healthcare、オーダーｎｏ．１７−５２５２−８２、ロットｎｏ．１５０３０９５、ボトル１２から得られた。１２．７ｍｇは、１μｍｏｌと当量である。４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）は、SAFC Proligo（プロダクトｎｏ．Ｍ７００１００、ロットｎｏ．２３１２０６）から得られた。ＭＷは、１１８．１である。０．５Ｍ溶液は、アセトニトリル又は他の溶媒５０ｍｌ中に２．９５ｇの乾燥したＤＣＩである。ｄＧｉｂｕモノマーは、SAFC Proligo（プロダクトｎｏ．Ｇ１１１０１０−０１、ロットｎｏ．２３０３９４、ボトル１７）から得られた。ＭＷは、８３９．９２である。４２０ｍｇは、５ｍｌの０．１Ｍ溶液のために必要とされる。超乾燥(extra dry)１，２−ジクロロエタン（ＧＣによる９９．８％）は、Acros Organics（製品コード３２６８４ ００１０、ロットｎｏ．Ａ０２０８０１６）から得られた。酸化のための５０ｍＭヨード液は、Biosolve（カタログｎｏ．１５０７２４０２、バッチｎｏ．４５５００１）から得られた。ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）は、Fluka、カタログｎｏ．３５８１０、ロットｎｏ．Ｓ３６３１８ １２３０６Ｂ１２から得られた。Ｃａｐ Ｂ ＡＣＮは、SAFC Proligo（カタログｎｏ．ＬＢ５０２５０、バッチｎｏ．１６６７３）から得られた。Ｃａｐ ２ ＡＣＮは、SAFC Proligo（カタログｎｏ．ＬＲ５０２５０、バッチｎｏ．１６９５０）から得られた。
【００８５】
４２０ｍｇのｄＧｉｂｕモノマーは、それぞれ６つの別々のＡＢＩ１０ｍｌアミダイトボトルに入れられ、真空、オーバーナイトでＰ２Ｏ５及びＫＯＨペレットで乾燥させた。真空はアルゴンを放出され、各モノマーは溶媒混合物の一つで溶解させた。ＤＣＩ２．９５ｇアリコートは、６つの２５０ｍｌＡＢＩボトルに量り分け、真空中で乾燥させた。ＤＣＩの各部分は、６つの異なる溶媒（５つの混合物及び１つの純粋なアセトニトリル）の一つで溶解させた。
【００８６】
６つのＡＢＩスナップ・カラムは２８．６ｍｇのｄＧ（ｔａｃ）−ＣＰＧで満たされ、６つのカラムは１２．７ｍｇのｄＧｉｂｕ ８０Ｓポリスチレンサポートで満たされた。固相合成に用いる前に、ＰＳサポートはアセトニトリル中で１０分間膨張させた。
【００８７】
各合成が開始する前に、全ての送達経路は新しい試薬で満たされたことを確認するために、ＡＢＩ開始プロトコルが用いられた。トリチルの色は、成功したカップリングと一致していた。
【００８８】
全１２のサポートは、よく密封されたねじふた式のガラス・バイアルで、６５℃、２．５時間、３ｍｌの４０重量％メチルアミンを含む水（Aldrich、カタログｎｏ．４２，６４６−６、ロットｎｏ．Ｓ２３３２２−４０５）において脱保護された。冷却後、上清は、ファルコン・チューブに濾過され、サポートはそれぞれ３ｍｌの２０％水性エタノールで洗浄された。洗浄物は濾過され、対応する濾過液と組み合わせられた。試料は、Ｓｐｅｅｄｖａｃ中で２ｍｌまで真空濃縮された。各試料は、５ｍｌの総容積まで、純水で希釈された。
【００８９】
各試料の２６０ｎｍでの全光学密度を決定するために、各５０μｌアリコートは１Ｍトリス塩酸バッファｐＨ７．６（分子生物学のためのFluka Biochemika Ultra grade、カタログｎｏ．９３３１４、ロット及びフィリングコード１１８８９６０ ５４６０５２７５）で１ｍｌまで希釈された。各々の溶液について、光路が１ｃｍの使い捨てキュベット（Plastibrand、１．５ｍｌ ｓｅｍｉ−ｍｉｃｒｏ、カタログｎｏ．７５９１ ５０）でのＡ２６０ｎｍが測定された。各合成についての修正された初期光学密度／μｍｏｌを表４に示す。
表４
【００９０】
陰イオン交換ＨＰＬＣ分析は、それから全１２の粗合成について行われた。各粗合成０．５ｍｌを含む水５ｍｌは、０．５ｍｌのＨＰＬＣバッファＡ（５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＮａＯＨ及び０．２ｍＭＥＤＴＡを含む水）と混合された。１４×１ｍｌの試料は１．５ｍｌのショートスレッド・オートサンプラ・バイアル（VWR International（カタログ／技術ｎｏ．５４８−０１７７、バッチｎｏ．１９３１０／２００６０７６３））に入れられ、Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０ ＨＰＬＣシステム（GE Healthcare）に接続されるＡ−９００オートサンプラー（GE Healthcare）のトレイにロードされた。５０μｌの試料は、バイアルから注入され、１ｍｌ／分の流速で２５分間０から４０％ Ｂまでの勾配、及び２６０、２８０及び２９５ｎｍのＵＶ検出を用いて、５０℃でＤＮＡＰａｃ−１００カラム（Dionex）に分離された（Ｔｈｅｒｍａｓｐｈｅｒｅ ｃｏｌｕｍｎ ｈｅａｔｅｒ、 Phenomenex）。Ｂバッファーは、２．５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＮａＯＨ及び０．２ｍＭＥＤＴＡを含む水であった。各溶媒混合物及び各サポートについての完全長プロダクトのパーセンテージは、表５に示される。
表５
【００９１】
ＣＰＧでのＭｅＣＮについて、ＨＰＬＣの出力は、プロダクト・ピークの前で１２％の不純物及び３．５％のｎ＋物質を示した。ピークの高さは、８６３ｍＡＵであった。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ０２８。ＰＳでは、出力はプロダクト・ピークの前で１２％不純物及び３．３％のｎ＋物質を示した。ピークの高さは８１７ｍＡＵであった。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ００８。
【００９２】
ＣＰＧでのＤＭＳＯ／ＭｅＣＮについて、ＨＰＬＣの出力は、３４７ｍＡＵのプロダクト・ピークで主に不完全なカップリングを示した。ＰＳプロダクト・ピークの高さは、２１５ｍＡＵであった。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ００９。
【００９３】
ＣＰＧでのＤＭＡ／ＭｅＣＮについて、ＨＰＬＣの出力は、少量の不完全なカップリングのみが存在することを示した。８．１％の不純物が全て適度に均一の強度でメインピークの前に存在し、５．１％のｎ＋物質も存在した。プロダクト・ピークの高さは、７２５ｍＡＵであった。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ００３。ＰＳでは、１０．４％のみの不純物がプロダクト・ピークの前に存在し、０．４％のみのｎ＋物質だけが存在した。プロダクト・ピークの高さは、８０５ｍＡＵであった。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ０１０。
【００９４】
ＣＰＧでのスルホラン／ＭｅＣＮについて、ＨＰＬＣの出力は非常に小さい失敗のピーク（不完全なカップリング）、及びプロダクト・ピークの前に７．２％の不純物と４．６％のｎ＋物質を示した。プロダクト・ピークの高さは、８６７ｍＡＵであった。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ００４。ＰＳでは、０．８％のｎ＋物質だけであった。プロダクト・ピークの高さ６８３ｍＡＵ。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ０１１。
【００９５】
ＣＰＧでのＮＭＰ／ＭｅＣＮについて、ＨＰＬＣの出力は、メインピークの前で６．３％の失敗とほぼ等しいサイズの全ての失敗及び約４．８％のｎ＋物質を示した。プロダクト・ピークの高さは、６３９ｍＡＵであった。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ００５。ＰＳでは、更に２、３の顕著な失敗があったが、０．７％のｎ＋物質であった。プロダクト・ピークの高さは、７４８ｍＡＵであった。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ０１２。
【００９６】
ＣＧでのＴＭＵ／ＭｅＣＮについて、ＨＰＬＣの出力は、プロダクト・ピークの前の７％の失敗及び約７．５％の全ｎ＋物質を示した。プロダクト・ピークの高さは、５５１ｍＡＵであった。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ００７。ＰＳでは、プロダクト・ピークの前の約１１．８％の障害があり、純粋なＭｅＣＮを用いて得られた結果と非常に類似していた。全ｎ＋物質は、２．７％のみであった。プロダクト・ピークの高さは、７３５ｍＡＵであった。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ０１４。
【００９７】
（実施例５）
以下の実施例は、濃縮ステップの溶媒として純粋なアセトニトリルを用いているＣＰＧ、ＧＥポリスチレン及びＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ支持体上の配列番号：１０ｄ［ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ］の１μモル・スケール合成、及びアセトニトリルと、ＤＭＡ、スルホラン、ＮＭＰ及びＴＭＵの各々１：１の混合物を証明する。
【００９８】
実施例４のサイクル及びパラメータは、以下の例外を除いて用いられた。合成は、SAFC ProligoのｄＡｂｚモノマー（プロダクトｎｏ．Ａ１１１０１０−０１、ロットｎｏ．２２８９９２；ＭＷ８５４．９３；２．５ｍｌの０．１Ｍ溶液のために２１５ｍｇが必要とされる）；SAFC ProligoのｄＣｔａｃモノマー（プロダクトｎｏ．Ｃ１１１０２０−０１、ロットｎｏ．２２９９３４）；ＭＷ９２０．０４；３．２５ｍｌの０．１Ｍ溶液のために２９９ｍｇが必要とされる）；及びSAFC ProligoのｄＴモノマー（プロダクトｎｏ．Ｔ１１１０１０−０１、ロットｎｏ．２３１０６２；ＭＷ７４４．８１；１２．５ｍｌの０．１Ｍ溶液のために８６ｍｇが必要とされる）を包含した。８４０ｍｇのｄＧｉｂｕモノマーは、それぞれ５つの別々のＡＢＩ１０ｍｌａｍｉｄｉｔｅボトルに入れられ、真空、オーバーナイトでＰ２Ｏ５及びＫＯＨペレットで乾燥させた。真空はアルゴンを放出され、各モノマーは溶媒混合物の一つで溶解された。ＤＣＩ５．９ｇのアリコートは、５つの１８０ｍｌＡＢＩボトルに量り分け、真空中で乾燥させた。ＤＣＩの各部分は、５つの異なる溶媒（４つの混合物及び１つの純粋なアセトニトリル）の一つで溶解させた。
【００９９】
５つのＡＢＩスナップ・カラムは２８．６ｍｇのｄＧ（ｔａｃ）−ＣＰＧで満たされ、５つのカラムは約１２．７ｍｇのｄＧｉｂｕ８０Ｓポリスチレンサポートで満たされ、５つのカラムは約１１．９ｍｇのＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ ｄＧｉｂｕサポートで満たされた。正確な量は、表６に記載されている。固相合成に用いる前に、ＰＳサポートはアセトニトリル中で１０分間膨張させた。
表６
【０１００】
各合成が開始する前に、全ての送達経路は新しい試薬で満たされたことを確認するために、ＡＢＩ開始プロトコルが用いられた。合成終了後、カートリッジは、アルゴンで乾燥させた。
【０１０１】
カートリッジは慎重に開かれ、サポートは４ｍｌのねじふた式ガラス・バイアルに移され、メチルアミンを４０重量％含む水３ｍｌ（Aldrich、カタログｎｏ．４２，６４６−６、ロットｎｏ．Ｓ２３３２２−４０５））で６５℃、２時間脱保護した。冷却後、上清は、ファルコン・チューブに濾過され、サポートはそれぞれ２×３ｍｌの２０％水性エタノールで洗浄された。洗浄物は濾過され、対応する濾過液と組み合わせられた。サンプル体積は、１０ｍｌに調整され、３５μｌアリコートの各々は陰イオン−交換ＨＰＬＣによる分析のために取り除いた（５２５μｌアリコートは、試料Ｇ４、Ｐ４、Ｎ４、Ｇ５、Ｐ５及びＮ５のために取り除かれ、４７５のμｌの水及び溶液と混合されたそれぞれはオートサンプラー・バイアルに入れられ、Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１０ＨＰＬＣシステムを結合させたオートサンプラーで実行した）。ＨＰＬＣ分析は、分析的ＤＮＡＰａｃ ＰＡ−１００カラム、４×２５０ｍｍ（Dionex、プロダクトｎｏ．０４３０１０、ロットｎｏ．００５−２１−０１７及びシリアルｎｏ．００５４０２））で行われた。直線濃度勾配は１ｍｌ／分の流速で４０分間、０−５０％Ｂから行われ、カラム廃水は２６０、２８０及び２９５ｎｍのＵＶによってモニターされた。バッファＡは５０ｍＭＮａＣｌ及び１０ｍＭＮａＯＨを含む水であり、バッファＢは２．５ＭＮａＣｌ及び１０ｍＭＮａＯＨを含む水であった。それぞれの全てのピークを集積することによって得られた完全長プロダクト％は、表７に示される。
【０１０２】
試料は、Ｓｐｅｅｄｖａｃ中で乾燥するまで真空濃縮された。各試料は、１０ｍｌの総体積まで純水で希釈された。各試料の２６０ｎｍでの全光学密度を決定するために、各３０μｌアリコートは１Ｍトリス塩酸バッファｐＨ７．６（分子生物学のためのFluka Biochemika Ultra grade、カタログｎｏ．９３３１４、ロット及びフィリングコード１１８８９６０ ５４６０５２７５）で１ｍｌまで希釈された。各々の溶液について、光路が１ｃｍの使い捨てキュベット（Plastibrand、１．５ｍｌ ｓｅｍｉ−ｍｉｃｒｏ、カタログｎｏ．７５９１ ５０）でのＡ２６０ｎｍが測定された。各合成についての修正された初期光学密度／μｍｏｌを表７に示す。
表７
【０１０３】
（実施例６）
以下の実施例は、グアニンが豊富なオリゴヌクレオチドＧ１０（配列番号：１０）の大規模な合成を示す。Ｇ１０は、ｄＧｉｂｕと共に１２０μｍｏｌ／ｇでロードされるＮｉｔｔｏＰｈａｓｅサポートで充填されるＯＰＩＩカラムを用いて、凝縮工程の溶媒として１：１ｖ／ｖのアセトニトリル／スルホラン混合液の縮合剤としてＤＣＩを用いて、ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ １００で合成された。
【０１０４】
合成
トリチル−ｏｆｆ合成は、１２０μｍｏｌ／ｇでロードされ、１３３ｍＬのカラム体積に調製されたＯＰＩＩカラム（内径６ｃｍ、GE Healthcareコードｎｏ．１８−１１０７−６０）にパックされた２０ｇのＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ ｄＧｉｂｕサポート（ロットｎｏ．１９５１３６）を用いて、Ａｋｔａ ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ １００合成装置で２．４ｍｍｏｌスケールで行われた。用いられるモノマー濃度（４倍の過剰）はアセトニトリル／スルホラン（１：１ｖ／ｖ）中で０．２７Ｍであり、アセトニトリル／スルホラン（１：１ｖ／ｖ）中で０．５ＭのＤＣＩは１０分間のカップリング時間でカップリング剤として用いられた。モノマー濃度は、以下の通りに算出された：リサイクル・ループ量は、５ｍＬであり、用いられるカラム体積は１２０ｍＬ（トルエンにおいて膨張される場合のサポートの体積であり、６．０ｍＬ／ｇに基づいている）であり、充填カラムにおいて利用可能なオープンボリュームは、８４ｍＬ、０．７×１２０＝８４ｍＬであるので、全オープンボリュームは８９ｍＬである。これは、カップリングのために添加されることができるａｍｉｄｉｔｅ溶液と活性化因子の最大容量を表す。カップリング混合液のモノマー溶液に対する活性化因子溶液の比が６０：４０ｖ／ｖであったので、添加されるモノマー溶液の量は３５．６ｍＬであり、これはモノマーの９．６ｍｍｏｌ（４倍の過剰）を含有する；したがって、モノマー濃度は０．２７Ｍである。カップリングのために添加される活性化因子溶液の量は、５３．４ｍｌであって、２６．７ｍｍｏｌに相当し、ＤＣＩ：モノマーの比は２．７８：１となる。サポートは、膨張され、トルエンに入れられ、合成を始める前にアセトニトリルで洗浄された。
【０１０５】
脱保護合成終了後、サポート結合オリゴヌクレオチドは、シアノエチル保護基を取り除くために乾燥したアセトニトリル中の２０％ジエチルアミン（ＤＥＡ）で処理された。
【０１０６】
粗収率及び粗純度：粗収率は１８７．８のＡ２６０単位／μｍｏｌと見いだされ、粗純度はＨＰＬＣにより７０．２５％と決定された。
【０１０７】
精製
次のステップは、Ｗａｔｅｒｓ ＡＰ−５、５０×２００ｍｍカラム（パートｎｏ．ＷＡＴ０２３３２２）上の４つの実行の粗Ｇ１０の準備の陰イオン交換ＨＰＬＣ精製であって、ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ ２０μｍを台高１８．９ｃｍに充填し、プレップを用いて８２．５分間、１０−５５％Ｂの直線濃度勾配で５０ｍＬ／分で溶出した。ＨＰＬＣバッファー組成物は、上述を同定した。
【０１０８】
粗Ｇ１０溶液のｐＨは、ロードする前に１２ちょうどに調整され、試料はもう一度濾過された。４０ｍＬの画分は、上述のように収集され、分析的陰イオン−交換ＨＰＬＣにより分析された。陰イオン−交換ＨＰＬＣで測定されるように、分析的純度を有する画分（８５％以上）だけがプールされた。全てのピークの画分は、分析の前に、直ちに酢酸でｐＨ６−８に中和された。
【０１０９】
脱塩
上記の純粋なＧ１０の合わせられた画分（総体積２７００ｍＬ）は、０．０９３ｍ２の表面積を伴うシングル１ｋＤａ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ Ｏｍｅｇａ、ミディアム・スクリーン・カセット（Ｐａｌｌ、パートｎｏ．ＯＳ００１Ｃ１２、シリアルｎｏ．３６３２４０５５Ｒ）に適合させたＰａｌｌ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ ５００Ｓｂｅｎｃｈｔｏｐタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）システム（パートｎｏ．ＣＭ５００ＳＥ、コミッションｎｏ．Ｃ５００Ｓ−２０１７）で３００ｍＬに濃縮された。純水に対する１３の連続ダイアフィルトレーション・サイクルが塩及びバッファを取り除くために行われた。濃縮物は、更に２００ｍＬ量まで濃縮された。
【０１１０】
（実施例７）
用いられるサポートの重量がローディングで増やされたように（例えば、２０ｇ×１２０μｍｏｌ／ｇ＝２．４ｍｍｏｌ）、実施例６において記載される合成の全プロセス収率は出発材料のモル量を算出することによって決定された。１００％収率はプロダクトの同じモル量であり、プロダクトのモル質量を考慮する（すなわち配列番号：１０については９６１２ｍｇ／ｍｍｏｌ）。プロダクト特異的吸光係数（配列番号：１０は１ｃｍの径路長で１ ＡＵ２６０−３４０＝２７．８μｇ、）を用いてＵＶ分光法により定量化されるように、収率は実際に製造される相対量である。実施例６において記載される合成の全プロセス収率は、３１．４％であった。
【０１１１】
生じるオリゴヌクレオチドの純度は、プロダクトの５から１００μＭ溶液の４０μｌが２５℃のオーブン温度でＤＮＡＰａｃ ＰＡ−１００カラムに注入するように実行されるＨＰＬＣ分析で測定される。カラムは、７５％バッファーＡ（２０ｍＭＮａＯＨ）及び２５％バッファーＢ（２０ｍＭＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌ、４０％メタノール）で平衡化された。０．７５ｍｌ／分の流速が用いられた。検出波長は２６０ｎｍであった。注射の１分後、勾配は開始し、４分以内にバッファＢの割合は４０％まで増大され、バッファＢの割合は次の３５分以内で５５％まで増大された。その時、バッファＢの割合を１分以内に１００％まで増大させて３分間保ち、その後バッファーＢの割合を３．９分以内で２５％まで低下させた。純度は、全てのクロマトグラムにわたる全ピーク面積のメインピークの相対ピーク面積である。谷から谷の積分が行われたように、積分限度が設定された。実施例６において記載される合成プロダクトの純度は、８７．７５％であった。
【０１１２】
（実施例８）
オリゴヌクレオチドＧ１０（配列番号：１０）の合成は、基本的に実施例５にて説明したように行われる。以下のＭｅＣＮを含む極性非プロトン溶媒の混合液は、試験され、ＭｅＣＮと比較した：１．）ＤＭＡ／ＭｅＣＮ、２．）サルホラン／ＭｅＣＮ、３）ＮＭＰ／ＭｅＣＮ及び４）ＴＭＵ／ＭｅＣＮ。実験は６回繰り返され、各繰り返しにおいてＭｅＣＮに対する溶媒の割合（ｖ／ｖ）は５：１、４：１、３：１、２：１、１：１から１：２へ変更した。記載及び比較されるように、プロダクトの収率及び純度が決定される。
【０１１３】
（配列表）
配列番号：１
ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
配列番号：２
ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ
配列番号：３
ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ
配列番号：４
ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ
配列番号：５
ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ
配列番号：６
ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ
配列番号：７
ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ
配列番号：８
ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ
配列番号：９
ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
配列番号：１０
ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
配列番号：１１
ＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ
【技術分野】
【０００１】
（関連出願についてのクロス・リファレンス）
本出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下で、２００６年１２月１２日に出願の米国仮特許出願番号第６０／８６９，５８８号に対する優先権を主張する。上記の出願の全ての教示は、参照することによりここに援用する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、オリゴヌクレオチド合成、特にグアニン・モノマーの高い含有量を含むオリゴヌクレオチドの合成のための方法に関連する。更に詳細に、本発明は、オリゴヌクレオチド合成の間、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドに、ヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるための方法に関連する。本発明は更に、本発明の方法によって入手可能なオリゴヌクレオチドに関連する。
（発明の背景）
【０００３】
化学的に合成されたＤＮＡ及びＲＮＡ（「オリゴヌクレオチド」）及びそのアナログは、大部分の分子生物学的応用で用いられる。オリゴヌクレオチド合成の方法は３０年間以上利用可能であり（Agarwal et al., Nature, 227:27-34 (1970)を参照）、現在、オリゴヌクレオチド合成で最も一般的な方法は、ホスホロアミダイト化学（McBride et al., Tetrahedron Lett., 24:245-248 (1983)を参照）によるものである。
【０００４】
ホスホラミダイト合成は、通常、最も３’側(3'-most)のヌクレオチドから始り、最も５’側(5'-most)のヌクレオチドが付加されるまで、繰り返される４ステップから成る一連のサイクルによって進行する。しかしながら、適当な構造のヌクレオシド・ホスホラミダイト及び第一のヌクレオシドを選択することにより、５’−３’方向へのホスホラミダイト合成を確立することは当業者の通常の技量の範囲内である。ここに開示される方法は合成の両方向に適用でき、３’−５’方向の合成が一般的に好まれる。
【０００５】
４つのステップは、脱保護、カップリング、キャッピング及び安定化（一般に酸化又は硫化）である。１つの変型例では、脱保護ステップの間、適した溶媒（例えばジクロロメタン又はトルエン）中でレシピエント・ヌクレオチドのペントース糖の５’−炭素に付加しているトリチル基がトリクロロ酢酸（イソチオシアン酸テトラメチルローダミン）又はジクロロ酢酸（ドライバー制御域）によって取り除かれ、反応性水酸基が残る。次のホスホラミダイト・モノマーは、カップリングステップで付加される。テトラゾール（弱酸）のような活性化因子はカップリングヌクレオシド・ホスホラミダイトと反応させるために用いられ、テトラゾリル・ホスホラミダイト中間体を形成する。この中間体はレシピエントの水酸基と反応し、５’から３’の結合が形成される。テトラゾールが再構成され、プロセスは続く。カップリングの失敗は、この時点でも５’末端に反応性水酸基を有しているオリゴヌクレオチドにおいて起こる。次のサイクルでオリゴヌクレオチドが反応性であること（欠損ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを製造する）を防ぐために、それらは、アセチル化剤（例えば無水酢酸の混合液及びＮ−メチルイミダゾール）により不可逆的にキャッピングされることによって更なる合成からは取り除かれる。この試薬は、オリゴヌクレオチドをキャッピングするために、遊離ヒドロキシル基とだけ反応する。酸化工程において、通常、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）及び水中の軽度の酸化剤としてのヨウ素の存在下で、伸長オリゴヌクレオチド及び最も後に付加されたヌクレオチド間の亜リン酸エステル結合は安定する。水は酸素供与体として作用し、ヨウ素は亜リン酸結合を有する付加物を形成する。付加物は水によって分解され、安定したリン酸トリエステル結合となる。
【０００６】
合成時間を減らし、プロダクトのより高い収率をつくるために、ホスホラミダイト合成に対して多くの有意な改変が行われた。合成においても更なる改変を必要とする改変ホスホラミダイト・モノマーが開発された。しかしながら、特定のオリゴヌクレオチドの合成において、まだ問題は残っている。１つの問題は、グアニン（Ｇ）−リッチ(guanine (G)-rich)・オリゴマーの合成であった。Ｇが豊富な領域を有するオリゴヌクレオチドは、種々の応用のために非常に有望だった。Ｇ−リッチ・オリゴヌクレオチドは、一般的に分子生物学及び医薬における有用な応用を有する複雑な構造に折りたたまれる。密集した４本鎖構造（例えばトロンビン・アプタマー）に折りたたむ種々のアプタマーが選択された。核酸におけるＧが豊富な繰り返しは、種々の生物学的役割を伴う特定の一価又は二価の金属イオンの存在下でこれらの四重体を形成する（Deng et al., PNAS (2001), 98, 13665-13670; Jin et al., PNAS (1992), 89, 8832-8836及びLee, Nucleic Acids Research (1990), 18, 6057-6060を参照）。
【０００７】
ＤＮＡの場合、この種のＧが豊富な配列の精製は、ｐＨ１２での陰イオン交換精製によって最も達成され、そのためにチミン及びグアニン・アミド官能性はイオン化され、構造形成に関与することができない。しかしながら、質の高い合成は、隣接するグアニン残基の数に依存して困難であり、おそらくカップリングステップにおける活性化ホスホラミダイトが５’−水酸基に接近できないことによる。
【０００８】
特定の長さ又は塩基組成に達したあと、サポートに結合し、保護されたＧ−リッチ・オリゴマーは、凝集が起こる、又はアセトニトリルの溶解性の問題を有しており、５’−水酸基が接近しづらい原因となっている。さらに、これもまた、合成のために用いられる固相担体の性質に関連している。したがって、凝集を妨げる、又は溶解性の問題を解決する混合溶媒又は溶媒に対するニーズが存在する。
【０００９】
提唱された方法は、カップリングステップにおいてグアニン・モノマーが豊富なオリゴマーに関する溶解性又は凝集の問題を軽減する、代替溶媒、特に極性非プロトン溶媒を提供する。
【００１０】
（簡単な発明の要約）
提唱された方法は、カップリングステップにおいてグアニン・モノマーが豊富なオリゴマーに関する溶解性又は凝集の問題を軽減する、代替溶媒、特に極性非プロトン溶媒を提供する。溶媒は、オリゴマー、特にグアニン残基の高い含有量を有するオリゴマーに、より良好な溶解性もたらすために、アセトニトリルに添加することができる。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
提唱された方法は、カップリングステップにおいてグアニン・モノマーが豊富なオリゴマーに関する溶解性又は凝集の問題を軽減する、代替溶媒、特に極性非プロトン溶媒を提供する。ここに開示される極性非プロトン溶媒は、単独、各々と組み合わせて、好ましくはアセトニトリルと組み合わせて用いることができる。極性非プロトン溶媒は、オリゴマー、特にグアニン残基の高い含有量を有するオリゴマーにより良好な溶解性をもたらすために、アセトニトリルに添加することができる。さらにまた、ここに開示される溶媒及び混合溶媒は、カップリング溶液中のヌクレオシド・ホスホラミダイトの高い溶解性をもたらし、その溶解性は好ましくは少なくとも０．０３Ｍである。一実施形態において、溶媒は、カップリングステップの間、アセトニトリル、モノマー及び活性化因子の混合液に添加される。アセトニトリルに対する溶媒の比は、変更することができる。ホスホラミダイト・モノマーは、従来のモノマー、又は改変されたモノマーであってもよい。一実施形態において、グアニン・モノマーは、酸に不安定な保護基、又は最終的なｄＧのカップリングのための脂溶性５’−Ｏ−保護基を有する改変グアニン・モノマーであってもよい。一実施形態において、用いられるｄＧモノマーは、トリイソプロピルシリル保護基を有するＮ２−イソブチリル−２´−デオキシグアノシン３´−Ｏ−ホスホラミダイトである。
【００１２】
提唱された方法は、改変されたヌクレオシド・モノマーと同様に、既知のヌクレオシド・モノマーを含むオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。この方法は、ＤＮＡ合成、又はＲＮＡ合成において用い得る。提唱された方法は、従来の陰イオン交換ＨＰＬＣを基とする精製において通常利用可能なものよりも高いスケールでの生産をも可能にする。
【００１３】
「Ｇが豊富な(G-rich)」又は「グアニンが豊富な(guanine-rich)」という用語は、高い濃度のグアニン・モノマーを有するオリゴヌクレオチドを意味する。一実施形態において、グアニン残基の濃度はオリゴヌクレオチドの溶解性を妨げる、又は減少させるのに十分大きく、それによって、合成が困難になり、所望のプロダクト収率又は純度が減少する。
【００１４】
用語「オリゴヌクレオチド」は、合成されたＲＮＡ又はＤＮＡポリマー及びそのアナログを意味し、「オリゴマー」及び「核酸」と同様の意味として用いられる。
【００１５】
オリゴヌクレオチド合成の収率を決定するための方法及びオリゴヌクレオチドの純度を決定するための方法は、従来技術において一般に公知である。本発明の方法の収率について言及する場合、収率は、通常、好ましくは、基本的に実施例７に開示されるように決定される。同様に、オリゴヌクレオチドの純度に言及する場合、純度は、通常、好ましくは、基本的に実施例７に開示されるように決定される。
【００１６】
一つの態様では、本発明はオリゴヌクレオチドの合成の間、ヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるための方法を提供し、方法はカップリング混合液として一つ以上の極性非プロトン溶媒と活性化剤を組み合わせることを含む。好ましい実施態様において、極性非プロトン溶媒はスルホランである。更なる好ましい実施態様において、極性非プロトン溶媒は、１−メチルピロリジン−２−オン(1-methylpyrrolidin-2-one)である。更なる好ましい実施態様において、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドである。更なる好ましい実施態様において、極性非プロトン溶媒は、テトラメチル尿素である。更なる好ましい実施態様において、活性化剤及び極性非プロトン溶媒は、アセトニトリルと組み合わせられる。更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは３０％以上のグアニン・モノマーを含む。更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、５０％以上のグアニン・モノマーを含む。更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、６０％以上のグアニン・モノマーを含む。更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、グアニン・モノマーが３つ以上の連続する領域を含む。更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、グアニン・モノマーが４つ以上の連続する領域を含む。更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、グアニン・モノマーが５つ以上の連続する領域を含む。更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号：１０である。
【００１７】
ここに記載されるカップリング反応は、オリゴヌクレオチドの合成の間、ヌクレオシド・ホスホラミダイトのユニバーサル・サポートへの最初のカップリングに有用である。そのようなユニバーサル・サポートは、、従来技術として用いられており、通常、好ましくはスクシナート−リンカーを含む。さらにまた、ここに記載されるカップリング反応は、オリゴヌクレオチドの合成の間、第一のヌクレオシドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるために有用であり、第一のヌクレオシドは遊離している、又は、好ましくはサポートに固定されている。さらにまた、ここに記載されるカップリング反応は、オリゴヌクレオチドの合成の間、伸長オリゴヌクレオチドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるために有用である。
【００１８】
したがって、更なる態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドの合成の間、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるための方法に関連しており、以下のステップを含んでいる：（ｉ）カップリング溶液を作製するステップであって、カップリング溶液は（ａ）極性非プロトン溶媒であって、アセトニトリルでない少なくとも１つの第一の溶媒；（ｂ）活性化剤；及び（ｃ）前記ヌクレオシド・ホスホラミダイトを含み、カップリング溶液中のヌクレオシド・ホスホラミダイトの濃度は少なくとも０．０３Ｍであって；好ましくは、カップリング溶液中の活性化剤の濃度は少なくとも０．０５Ｍである；及び（ｉｉ）カップリング溶液を、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドと接触させるステップ。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの合成の間、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるための方法に関連しており、以下のステップを含んでいる：（ｉ）カップリング溶液を作製するステップであってカップリング溶液は（ａ）極性非プロトン溶媒であって、アセトニトリルでない少なくとも１つの第一の溶媒；（ｂ）活性化剤；及び（ｃ）ヌクレオシド・ホスホラミダイトを含み、カップリング溶液中のヌクレオシド・ホスホラミダイトの濃度は少なくとも０．０３Ｍであって；好ましくは、カップリング溶液中の活性化剤の濃度は少なくとも０．０５Ｍである；及び（ｉｉ）カップリング溶液を、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドと接触させるステップ。
【００１９】
好ましい実施態様において、第一の溶媒は、（ａ）スクシノニトリル、（ｂ）グルタロニトリル、（ｃ）アジポニトリル、（ｄ）ピメロニトリル、（ｅ）バレロニトリル、（ｆ）ベンゾニトリル、（ｇ）カプロニトリルからなるグループからは選択されない。別の好ましい実施例では第一の溶媒は、（ａ）ジニトリル、（ｂ）モノ・ニトリル、（ｃ）グライム、（ｄ）ダイグライム、（ｅ）三グライム、（ｆ）トリメチルホスフェート、（ｇ）ジクロロメタン、（ｈ）テトラヒドロフラン、（ｉ）ジメトキシエタン及び（ｊ）ニトロメタンからなるグループからは選択されない。更なる好ましい実施態様において、前記極性非プロトン溶媒は、双極性非プロトン溶媒である。
【００２０】
更なる態様において、本発明は、本発明は、オリゴヌクレオチドの合成の間、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるための方法に関連しており、以下のステップを含んでいる：（ｉ）カップリング溶液を作製するステップであってカップリング溶液は（ａ）極性非プロトン溶媒であって、アセトニトリルでない少なくとも１つの第一の溶媒；（ｂ）活性化剤；（ｃ）ヌクレオシド・ホスホラミダイト；（ｄ）第２の溶媒を含み、第２の溶媒は化学的に少なくとも１つの第一の溶媒のいずれとも異なり、好ましくはアセトニトリルであり、カップリング溶液中のヌクレオシド・ホスホラミダイトの濃度は少なくとも０．０３Ｍであって；好ましくは、カップリング溶液中の活性化剤の濃度は少なくとも０．０５Ｍである；及び（ｉｉ）カップリング溶液を、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドと接触させるステップ。
【００２１】
別の好ましい実施例では、少なくとも一つの第一の溶媒は、（ａ）スルホラン；（ｂ）１−メチルピロリジン−２−オン；（ｃ）Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド；（ｄ）テトラメチル尿素；及び（ｅ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなるグループから選択され、好ましくは、少なくとも一つの第一の溶媒は、（ａ）スルホラン；（ｂ）１−メチルピロリジン−２−オン；（ｃ）Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド；及び（ｄ）テトラメチル尿素からなるグループから選択される。極めて好ましい実施態様において、少なくとも一つの第一の溶媒は、スルホランである。
【００２２】
前の請求項のいずれかの方法におけるカップリング溶液中のヌクレオシド・ホスホラミダイトの濃度は０．０３〜０．３Ｍ、好ましくは０．０３〜０．２０Ｍ、最も好ましくは０．０５〜０．１５Ｍである。
【００２３】
別の好ましい実施例では、カップリング溶液の前記活性化剤の濃度は、０．０５から０．９０Ｍ、好ましくは０．２５〜０．５０Ｍ、最も好ましくは０．３０から０．５Ｍである。更なる好ましい実施態様において、カップリング溶液は、少なくともちょうど一つの第一の溶媒の一つを含む。
【００２４】
更なる好ましい実施態様において、カップリング溶液は、（ａ）少なくとも一つの第一の溶媒のちょうど一つ；（ｂ）活性化剤；及び（ｃ）ヌクレオシド・ホスホラミダイトからなる。
【００２５】
更なる好ましい実施態様において、カップリング溶液は、第二の溶媒を更に含み、好ましくは第二溶媒は弱塩基性の溶媒である。極めて好ましい実施態様において、第二の溶媒はアセトニトリルである。
【００２６】
本発明の基礎をなしている化学反応、特にユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドへのヌクレオシド・ホスホラミダイトのカップリングを促進するために、第一及び／又は第二溶媒が好ましくは水を含まない形態として提供されることは技術者にとっては明白である。
【００２７】
更に好ましい実施態様において、前記カップリング溶液は、（ａ）少なくとも一つの第一の溶媒のちょうど一つ；（ｂ）活性化剤；（ｃ）ヌクレオシド・ホスホラミダイト；及び（ｄ）好ましくはアセトニトリルである第２の溶媒を含むか、好ましくはそれらからなる。
【００２８】
更に好ましい実施態様において、第二の溶媒に対する少なくとも一つの第一の溶媒の比（ｖ／ｖ）は、５：１から１：２の間で、好ましくは４：１から１：２の間で、より好ましくは３：１から２：５の間で、さらに好ましくは２：１から２：５の間で、さらに好ましくは２：１から１：１の間である。
【００２９】
更なる好ましい実施態様において、第二の溶媒に対する少なくとも一つの第一の溶媒の比（ｖ／ｖ）は、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１又は１：２であり、好ましくは約１：１であり、最も好ましくは１：１である。
【００３０】
更なる好ましい実施態様において、第一のヌクレオシド及び／又は伸長オリゴヌクレオチドは、サポートに固定され、そのサポートは、好ましくは（ａ）ポリスチレンサポート；及び（ｂ）シリカサポートから選択され、好ましくは制御細孔ガラス（ＣＰＧ）サポートである。
【００３１】
更なる好ましい実施態様において、サポートはポリスチレンサポートであって、好ましくはポリスチレンサポートはジビニルベンゼンによって架橋結合されており、更に好ましくはポリスチレンサポートは機能的水酸基によって特徴づけられ、更に好ましくはポリスチレンサポートは約９０μｍの平均粒度を含む。
【００３２】
更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも７５％のグアニン・モノマーを含む。
【００３３】
別の好ましい実施例では活性化剤は、（ａ）４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）；（ｂ）５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）；（ｃ）５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＢＴＴ）；及び（ｄ）５−（３，５−ビス−トリフロロメチル）フェニル−１Ｈ−テトラゾール（活性化因子４２）からなるグループから選択される。極めて好ましい実施態様において、活性化剤は、４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）である。
【００３４】
更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、グアニン・モノマーが３以上、好ましくは４以上、最も好ましくは５以上連続する領域を含む。
【００３５】
更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、グアニン・モノマーが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０連続する第一の領域を含む。
【００３６】
更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、グアニン・モノマーが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０連続する第二の領域を含む。
【００３７】
更なる好ましい実施態様において、第一の領域はオリゴヌクレオチドの３’−末端に位置する、及び／又は第二の領域はオリゴヌクレオチドの５’−末端に位置する。
【００３８】
更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは１０から５０、好ましくは２０〜４０、最も好ましくは３０のヌクレオチド・モノマーを含む。
【００３９】
更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドはパリンドローム配列を含み、好ましくはパリンドローム配列はＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号：２）である。
【００４０】
更なる好ましい実施態様において、パリンドローム配列は、少なくとも４、多くても２０、好ましくは多くても１０のグアノシンによってその５’−末端に隣接している；及び／又はパリンドローム配列は、少なくとも６、多くても２０、好ましくは多くても１０のグアノシンによってその３’−末端に隣接している。
【００４１】
更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、（ａ）ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：３）；（ｂ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：４）；（ｃ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：５）；（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：６）；（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：７）；（ｆ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：８）；（ｇ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：９）；（ｈ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１０）；及び（ｉ）ＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１１）からなるグループから選択されるヌクレオチドを含むか、好ましくはそれらからなる。極めて好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号：１０を含むか、好ましくはそれからなる。
【００４２】
更なる好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドはデオキシヌクレオチドであり、好ましくはデオキシヌクレオチドはリン酸ジエステル結合モノマーのみからなる。
【００４３】
更なる態様において、本発明はオリゴヌクレオチドを製造するための方法に関連し、その方法は、オリゴヌクレオチドの合成の間、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるための、ここに記載される方法のいずれか一つを含む。
【００４４】
更なる態様において、本発明はオリゴヌクレオチドを製造するための方法に関連し、その方法は（ｉ）第一のヌクレオシドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるステップ（カップリングは、オリゴヌクレオチドの合成の間、ヌクレオシド・ホスホラミダイトを第一のヌクレオシドにカップリングさせるための、ここに記載される方法のいずれかを含む）；（ｉｉ）ステップ（ｉ）のプロダクトを酸化させることによって、伸長オリゴヌクレオチドを生成するステップ；（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のプロダクトに、ヌクレオシド・ホスホラミダイトを、通常及び好ましくは脱保護の後にカップリングさせるステップ（カップリングは、オリゴヌクレオチドの合成の間、ヌクレオシド・ホスホラミダイトを伸長オリゴヌクレオチドにカップリングさせるための、ここに記載される方法のいずれかを含む）；（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）のプロダクトを酸化させることによって、伸長オリゴヌクレオチドを生成するステップ；及び（ｖ）伸長オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの配列を含むまで、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）のステップを繰り返すステップ、を含む。
【００４５】
好ましい実施態様における方法は、変性条件の下でオリゴヌクレオチドを精製するステップをさらに含み、好ましくは変性条件は、ｐＨ１０から１４、好ましくはｐＨ１０から１３、より好ましくは約ｐＨ１２、最も好ましくはｐＨ１２として特徴づけられる。
【００４６】
更なる好ましい実施態様における方法は、ｐＨ１０から１４、好ましくはｐＨ１０から１３、より好ましくは約ｐＨ１２、最も好ましくはｐＨ１２でオリゴヌクレオチドを精製するステップをさらに含む。
【００４７】
更なる好ましい実施態様における精製は、陰イオン交換クロマトグラフィによって行われ、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィは四級アミン基で官能化された陰イオン−交換マトリックスを用いて行われ、より好ましくは陰イオン−交換マトリックスはポリスチレン及びポリメタクリレートから選択される材料からなり、更に好ましくは材料はポリメタクリレートである。
【００４８】
更なる好ましい実施態様におけるオリゴヌクレオチドは、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも３５％、最も好ましくは少なくとも４０％の第一のヌクレオシドに関するモル収率で製造される。
【００４９】
更なる好ましい実施態様におけるオリゴヌクレオチドの純度は、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％である。
【００５０】
更なる態様において、本発明は、ヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるための方法におけるカップリング溶液の使用に関するものであり、カップリング溶液は：（ａ）少なくとも極性非プロトン溶媒であってアセトニトリルでない一つの第一の溶媒；（ｂ）活性化剤；及び（ｃ）ヌクレオシド・ホスホラミダイトを含み、カップリング溶液中のヌクレオシド・ホスホラミダイトの濃度は少なくとも０．０３Ｍであり、カップリング溶液中の活性化剤の濃度は少なくとも０．０５Ｍである。好ましい実施態様における方法は、オリゴヌクレオチドの合成の間、第一のヌクレオシド又は伸長ヌクレオチドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるための、ここに記載される方法のいずれかの特性によって、更に特徴づけられる。
【００５１】
更なる態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドの合成の間、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるためのカップリング溶液に関連し、カップリング溶液は：（ａ）極性非プロトン溶媒であってアセトニトリルもしくはアジポニトリルではない少なくとも一つの第一の溶媒；（ｂ）活性化剤；及び（ｃ）ヌクレオシド・ホスホラミダイト；を含み、カップリング溶液中のヌクレオシド・ホスホラミダイトの濃度は少なくとも０．０３Ｍであり；カップリング溶液中の活性化剤の濃度は少なくとも０．０５Ｍである。好ましい実施態様における方法は、ここに開示される方法のいずれかの特性によって、更に特徴づけられる。好ましい実施態様において、カップリング溶液は、ここに開示されるいずれかの特性によって特徴づけられ、あらゆる組合せにより特徴づけられる。
【００５２】
極めて好ましい実施態様は、（ａ）ちょうど一つの第一の溶媒（極性非プロトン溶媒であって、（ｉ）スルホラン；（ｉｉ）１−メリルピロリジン−２−オン；（ｉｉｉ）Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド；（ｉｖ）テトラメチル尿素；及び（ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなるグループから選択され；好ましくは、第一の溶媒はスルホランである）；（ｂ）活性化剤；（ｃ）前記ヌクレオシド・ホスホラミダイト；及び（ｄ）第２の溶媒、を含むか、好ましくはそれからなり、第２の溶媒はアセトニトリルであり；カップリング溶液中のヌクレオシド・ホスホラミダイトの濃度は少なくとも０．０３Ｍであり；第２の溶媒に対する第一の溶媒の比（ｖ／ｖ）は、５：１から１：２の間であって、好ましくは、１：１である。
【００５３】
更なる態様において、本発明は、ここに開示されるいずれかの方法、特にここに開示されるオリゴヌクレオチドを製造するための方法のいずれかにより得られるオリゴヌクレオチドに関連する。
【００５４】
好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、（ａ）ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：３）；（ｂ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：４）；（ｃ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：５）；（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：６）；（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：７）；（ｆ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：８）；（ｇ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：９）；（ｈ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１０）；及び（ｉ）ＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１１）からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を含むか、好ましくはそれらからなる。極めて好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは配列番号：１０からなる。
【００５５】
更なる態様において、本発明は、（ａ）ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：３）；（ｂ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：４）；（ｃ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：５）；（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：６）；（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：７）；（ｆ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：８）；（ｇ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：９）；（ｈ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１０）；及び（ｉ）ＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１１）からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を含むか、好ましくはそれらからなるオリゴヌクレオチドに関連し、オリゴヌクレオチドの純度は、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％である。極めて好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは配列番号：１０からなる。
【００５６】
ここに開示される方法はオリゴヌクレオチド、例えば、ポリ−Ｇが隣接するメチル化されていないＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドなど、特にＧが豊富なオリゴヌクレオチドの大規模な合成に適している。この種の化合物は、薬学的応用において用いられる。例えば、それらは、既知の免疫系の刺激因子である。したがって、更なる態様において、本発明は、製薬及び／又はワクチンの製造における本発明のオリゴヌクレオチドの使用に関連する。
【００５７】
更なる態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドの合成の間、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるための方法に関連し：（ｉ）（ａ）極性非プロトン溶媒であってアセトニトリルでない少なくとも一つの第一の溶媒；（ｂ）活性化剤；及び（ｃ）ヌクレオシド・ホスホラミダイトを含むカップリング溶液を作製するステップであって、カップリング溶液中のヌクレオシド・ホスホラミダイトの濃度は少なくとも０．０３Ｍであり；カップリング溶液中の活性化剤の濃度は少なくとも０．０５Ｍである；及び（ｉｉ）ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドとカップリング溶液を接触させるステップ、を含む。好ましい実施態様において、第一の溶媒はアジポニトリルではない。
【００５８】
ここに記載される公報、特許出願及び特許を含む全ての文献は、それぞれの文献が単独で又は特異的に援用されたことが示され、その全てが説明されたかのようにここに引用されたものとする。
【００５９】
本発明の説明において（特に以下の請求項に関連して）、用語「a」及び「an」及び「the」及び類似した指示対象の使用は、特に明記しない限り、又は文脈により明らかに否定されない限り、単数及び複数を包含するように解釈される。用語「含む」、「有する」、「包含する」、及び「含有する」は、特に明記しない限り制限のない(open-ended)用語（すなわち、「含むがそれに限定されない」ことを意味する用語）として解釈される。ここにおける値の範囲の記載は、単に範囲内の個々の値を言及する簡便な方法として役割をなすことを目的とするものであり、特に明記しない限り、一つ一つが記載されるかのように、それぞれ個々の値は明細書に援用される。ここに記載される全ての方法は、特に明記しない限り、又は文脈により明らかに否定されない限り、あらゆる適切な順序で行われ得る。ここに提供されるあらゆる例及び全ての例、又は典型的な言語（例えば「のような」）の使用は、単に本発明をよりよく説明するためであり、請求されない限り、本発明の範囲を制限しない。明細書の文言は、クレームされていないエレメントが本発明を実施するために必須であることを示しているとは解釈されてはならない。
【００６０】
本発明の好ましい実施態様はここに記載されており、発明者の知る本発明を実施するための最良の形態を含む。それらの好ましい実施態様の変型例は、上述の記載を読むことにより当業者に明瞭となるであろう。発明者は、熟練した技術者が適切にこの種の変型例を使用し、特にここに記載される以外の別の方法で本発明が実施されると推測する。したがって、本発明は、適用法に認められるように、ここに追加される請求項において記載されるものの全ての改変物及び均等物を含む。さらに、その全てのあり得る変型例の上述のエレメントのあらゆる組合せは、特に明記しない限り、又は文脈によって明らかに否定されない限り、本発明に包含される。
【実施例】
【００６１】
以下の例は、本発明を更に説明するが、もちろんその範囲を制限するように解釈されてはならない。
【００６２】
（実施例1）
この実施例は、オリゴマー合成の互換性について試験された溶媒を記載する。以下の溶媒が試験された。
【００６３】
１−メチルピロリジン−２−オン（ＮＭＰ）−ＭＷ９９．１３；密度１．０３２ｇ／ｍｌ；粘性１．６７ｃＰ；双極子モーメント４．０９Ｄ。ペプチド合成グレードは、Flukaから得られた（カタログｎｏ．６９１１６；ロット及びフィリングコード１０５９１７８、２１５０４０５５）。ＧＣによる純度は９９．５％以上であり、含水量は０．０２％以下である。
【００６４】
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）−ＭＷ８７．１２；密度０．９４２ｇ／ｍｌ；２０℃における粘性１．０２ｃＰ；双極子モーメント３．７９Ｄ。ｐｕｒｉｓｓ．グレードは、Flukaから得られた（カタログｎｏ．３８８４０；ロット及びフィリングコード４５４９３６／１、４０５０４０５９）。ＧＣによる純度は、９９．５％以上である。
【００６５】
テトラメチル尿素（ＴＭＵ）−ＭＷ１１６．１６；密度０．９６８ｇ／ｍｌ。BioChemikaグレードは、Flukaから得られた（カタログｎｏ．８７８４９；ロット及びフィリングコード１０６３４０３、３０２０５０１０）。ＧＣによる純度は、９９．５％以上である。この材料は、使用前に４オングストロームのモレキュラーシーブ上で４８時間乾燥した。
【００６６】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）−ＭＷ７８．１３；密度１．１００ｇ／ｍｌ；２０℃における粘性１．９９６ｃＰ；双極子モーメント３．９６Ｄ。モレキュラーシーブの上のＰｕｒｉｓｓ．アブソルートは、Flukaから得られた（カタログｎｏ．４１６４７、ロット及びフィリングコード１０７３７２９、２２４０４４５６）。ＧＣによる純度は９９．５％以上であり、含水量は０．００５％以下である。
【００６７】
スルホラン−ＭＷ１２０．１７；密度１．２９３ｇ／ｍｌ；３０℃における粘性１０．３０ｃＰ；双極子モーメント４．８Ｄ。Ｐｕｒｉｓｓ．グレードは、Flukaから得られた（カタログｎｏ．８６１４８、ロット及びフィリング材コード１１８１０２５、４２３０６３３６）。ＧＣによる純度は、９９．５％以上である。この材料は、使用前に、最初に３５℃でオーブンにおいて液化され、４オングストローム・モレキュラーシーブ上で４８時間乾燥した。
【００６８】
１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）−ＭＷ１６８．０４；密度１．５９６ｇ／ｍｌ。ＵＶ分光学グレードは、Apollo Scientificから得られた（カタログｎｏ．ＰＣ ０８７７、ロットｎｏ．ＢＮＯ ＨＦＩＰ−０５−１４）。ＨＦＩＰは、ペプチドを可溶化するために頻繁に使用する極性のヒドロキシル溶媒であるので、コントロールとして含む。
【００６９】
（実施例２）
以下の実施例は、容積配合が１：１のアセトニトリル及び実施例１の溶媒中でのモノマー及び５−ベンジル・チオ・テトラゾール（ＢＴＴ）の溶解性を示す。
【００７０】
ＢＴＴ（ＭＷ１９２．２、含水量７５ｐｐｍ以下）は、emp Biotech GmbHによって供給された（カタログｎｏ．ＮＣ−０１０１−１Ｋ、チャージ／ロットｎｏ．０５０９０４）。ｄＴ（ＭＷ７４４．８３）、ｄＧｉｂｕ（ＭＷ８３９．９２）、ｄＡｂｚ（ＭＷ８５７．９３）、ｄＣｂｚ（ＭＷ８３３．９３）モノマーは、Proligoによって供給された。アセトニトリル（ＭｅＣＮ）は、２５℃において０．３４５ｃＰの粘性及び３．９２Ｄの双極子モーメントを有する。
【００７１】
ｄＴモノマー７４．５ｍｇ（１００μＭｏｌ）は、各々７つのねじふた式の１０ｍｌバイアルに計量された。ｄＧｉｂｕモノマーの８４ｍｇ（１００μｍｏｌ）は、各々７つのねじふた式の１０ｍｌバイアルに計量された。ｄＡｂｚモノマーの８６ｍｇ（１００μｍｏｌ）は、各々７つのねじふた式の１０ｍｌバイアルに計量された。ｄＣｂｚモノマーの８３ｍｇ（１００μｍｏｌ）は、各々７つのねじふた式の１０ｍｌバイアルに計量された。ＢＴＴの２２８ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）は、各々の７つのねじふた式の１０ｍｌバイアルに計量された。
【００７２】
６つの異なる溶媒混合物は、１０ｍｌの乾燥したアセトニトリルと上述した異なる６つのうち一つの溶媒１０ｍｌと、アルゴンの下で別々の乾燥した瓶中で混合することにより調製された。
【００７３】
異なる６つのうち一つの溶媒混合物、又は純粋なアセトニトリルの１ｍｌがＴモノマーの各別々のバイアルに添加された。バイアルは、直ちに閉じ、穏やかに攪拌された。これは、ｄＧ、ｄＡ及びｄＣモノマーのバイアルについて繰り返された。全てのモノマーは、標準シンセサイザー上での使用で必要とされるように、かなり迅速に０．１Ｍの濃度で７つ溶媒混合物中に溶解させた（１０分以内で、ＭｅＣＮ／スルホランの場合、溶解ははいくらか遅かった）。無色透明な溶液が得られた。
【００７４】
ＢＴＴの別々のバイアルのそれぞれに、６つのうち一つの溶媒混合物４ｍｌが添加された。ＨＦＩＰ／ＭｅＣＮ以外の全てのケースにおいて、溶解は、０．３Ｍでは（ＤＮＡ及びＲＮＡ合成のための典型的な標準濃度）ほぼ瞬間的であった。ＢＴＴは純粋なアセトニトリルに添加され、溶解は実施例１の６つの溶媒における溶解ほど早くなかった。穏やかな加温は、純粋なアセトニトリル中での迅速な溶解を達成するのに必要とされた。
【００７５】
全４つの標準保護されたＤＮＡモノマーは、アセトニトリル及びＮＭＰ、ＤＭＡ、ＴＭＵ、ＤＭＳＯ及びスルホランの１：１の混合物に０．１Ｍでは易溶性である。ＢＴＴは、０．３Ｍで５つの混合物の全てにおいて可溶性である。
【００７６】
（実施例３）
以下の実施例は、４８時間後の溶媒溶液のモノマー安定性を示す。様々な溶媒混合物のモノマーの安定性を確認するために、シリカゲルｔｌｃ分析は、室温で４８時間置いた後に、２８のモノマー溶液の１μｌアリコートそれぞれに対して行われた。明らかに、示される測定可能な不安定性は、その特定の溶媒の組合せが合成装置でのＤＮＡ合成に有用でないことを意味する。このために、選択される溶出剤は、３％トリエチルアミンを含有する酢酸エチル／１，２−ジクロロエタン（１：２ ｖ／ｖ）であった。ＭｅＣＮ／ＨＦＩＰ（これらは全ての淡黄色であり、脱トリチル及び分解によるものだろう）以外の全てのモノマー溶液は無色であった。２５４ｎｍ蛍光指示薬の、ｔｌｃのためのアルミニウム・カード上のシリカゲルは、Flukaから得られた（カタログｎｏ．６０７７８、ロットｎｏ．５０３０６６）。
【００７７】
６つの関連する溶媒混合物中の様々なモノマーについて、以下のスポットが観察された。０から０．２１のＲｆ値を有するｔｌｃ上の多数のスポットを伴って、主に予想されたように、溶媒混合物ＭｅＣＮ／ＨＦＩＰは全４つのモノマーの全分解に導いた。結果は、表１に記載された。
表１
【００７８】
ＴＭＵの場合、ｔｌｃスポットは、ＮＭＰ及びＤＭＡの値と比較して、わずかに増加したＲｆ値を有した。ＤＭＳＯにおいて、Ｒｆ値はやや減少していた。ほとんどの場合、両方のジアステレオアイソマーは観察された。ＮＭＰ、ＤＭＡ、ＴＭＵ及びＤＭＳＯのケースにおいて、非常にかすかな不純物スポットもまた観察され得た。スルホランの場合、Ｒｆ値０．２７のかすかな不純物スポットが、ｄＣｂｚモノマーについて観察された。
【００７９】
全４つの標準保護されたＤＮＡモノマーは、溶液してから室温で４８時間後では、ほとんど又は全く分解を示さない。全５つの混合物は、小規模でのオリゴ−ｄＧを含有する配列の合成を試みるために適しているようである。
【００８０】
（実施例４）
以下の例は、ＡＢＩ３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（Applied Biosystems）でのＧが豊富なオリゴヌクレオチド合成のカップリング・ステップで使われる場合の、実施例１の溶媒の有用性を示す。以下のグアニンが豊富なオリゴヌクレオチドが合成のために選択された。
配列番号：１ｄ［ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ］
【００８１】
純粋なアセトニトリルと比較した粘性の変化を参酌するための算出送達因子は、表２に記載される。
表２
【００８２】
ＡＢＩ３９４合成装置のサイクル・パラメータは調整された。１μモル・スケールの場合、関連したモノマー及びモノマー＋ｔｅｔの送達時間（秒）が下記の表に示されているＤＮＡ合成サイクルｎｏ．２０が用いられた。５つの異なる１：１の溶媒混合物についての修正された送達時間もまた表３に示されている。
表３
【００８３】
ＡＢＩ３９４−０８についての以下の合成パラメーターが用いられた。（ｄＧ）１０のトリチル−ｏｆｆ合成は、アセトニトリルとＮＭＰ、ＤＭＡ、ＴＭＵ、ＤＭＳＯ及びスルホラン各々の１：１混合物と、凝縮工程のための溶媒として純粋なアセトニトリルを用いて、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）及びポリスチレン（ＰＳ）サポート上の１μモル・スケールで行われた。ＤＮＡ合成サイクル２０は用いられ、以下の５つのステップを含んだ：（１）７５秒間の１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）中の５％ＤＣＡを用いた脱トリチル；（２）５分間の適切な混合溶媒中の０．１ＭｄＧモノマーを加えた０．５ＭＤＣＩを用いたカップリング；（３）１分間のｔａｃ無水物／ＭｅＣＮを用いたキャッピング；（４）１分間のピリジン／水（９：１ ｖ／ｖ）中の５０ｍＭＩ２を用いた酸化；及び（５）５秒間のキャッピング。「ｔｅｔ ｔｏ ｗａｓｔｅ」、「Ｂ ＋ ｔｅｔ ｔｏ ｃｏｌｕｍｎ」及び「ｔｅｔ ｔｏ ｃｏｌｕｍｎ」の送達時間は、様々な混合溶媒についての上述の表に従って調整された。
【００８４】
ＣＰＧ ｄｇ（ｔａｃ）５００Ａサポートは、SAFC Proligo（プロダクトｎｏ．Ｇ３０２００１、バルクｎｏ．５４５２、ロットｎｏ．２２３４６０）によって供給され、３５μｍｏｌ／ｇロードされた。したがって、２８．６ｍｇは、１μｍｏｌと当量である。７９μｍｏｌ／ｇでロードされるｄＧｉｂｕ ８０Ｓポリスチレンサポートは、GE Healthcare、オーダーｎｏ．１７−５２５２−８２、ロットｎｏ．１５０３０９５、ボトル１２から得られた。１２．７ｍｇは、１μｍｏｌと当量である。４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）は、SAFC Proligo（プロダクトｎｏ．Ｍ７００１００、ロットｎｏ．２３１２０６）から得られた。ＭＷは、１１８．１である。０．５Ｍ溶液は、アセトニトリル又は他の溶媒５０ｍｌ中に２．９５ｇの乾燥したＤＣＩである。ｄＧｉｂｕモノマーは、SAFC Proligo（プロダクトｎｏ．Ｇ１１１０１０−０１、ロットｎｏ．２３０３９４、ボトル１７）から得られた。ＭＷは、８３９．９２である。４２０ｍｇは、５ｍｌの０．１Ｍ溶液のために必要とされる。超乾燥(extra dry)１，２−ジクロロエタン（ＧＣによる９９．８％）は、Acros Organics（製品コード３２６８４ ００１０、ロットｎｏ．Ａ０２０８０１６）から得られた。酸化のための５０ｍＭヨード液は、Biosolve（カタログｎｏ．１５０７２４０２、バッチｎｏ．４５５００１）から得られた。ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）は、Fluka、カタログｎｏ．３５８１０、ロットｎｏ．Ｓ３６３１８ １２３０６Ｂ１２から得られた。Ｃａｐ Ｂ ＡＣＮは、SAFC Proligo（カタログｎｏ．ＬＢ５０２５０、バッチｎｏ．１６６７３）から得られた。Ｃａｐ ２ ＡＣＮは、SAFC Proligo（カタログｎｏ．ＬＲ５０２５０、バッチｎｏ．１６９５０）から得られた。
【００８５】
４２０ｍｇのｄＧｉｂｕモノマーは、それぞれ６つの別々のＡＢＩ１０ｍｌアミダイトボトルに入れられ、真空、オーバーナイトでＰ２Ｏ５及びＫＯＨペレットで乾燥させた。真空はアルゴンを放出され、各モノマーは溶媒混合物の一つで溶解させた。ＤＣＩ２．９５ｇアリコートは、６つの２５０ｍｌＡＢＩボトルに量り分け、真空中で乾燥させた。ＤＣＩの各部分は、６つの異なる溶媒（５つの混合物及び１つの純粋なアセトニトリル）の一つで溶解させた。
【００８６】
６つのＡＢＩスナップ・カラムは２８．６ｍｇのｄＧ（ｔａｃ）−ＣＰＧで満たされ、６つのカラムは１２．７ｍｇのｄＧｉｂｕ ８０Ｓポリスチレンサポートで満たされた。固相合成に用いる前に、ＰＳサポートはアセトニトリル中で１０分間膨張させた。
【００８７】
各合成が開始する前に、全ての送達経路は新しい試薬で満たされたことを確認するために、ＡＢＩ開始プロトコルが用いられた。トリチルの色は、成功したカップリングと一致していた。
【００８８】
全１２のサポートは、よく密封されたねじふた式のガラス・バイアルで、６５℃、２．５時間、３ｍｌの４０重量％メチルアミンを含む水（Aldrich、カタログｎｏ．４２，６４６−６、ロットｎｏ．Ｓ２３３２２−４０５）において脱保護された。冷却後、上清は、ファルコン・チューブに濾過され、サポートはそれぞれ３ｍｌの２０％水性エタノールで洗浄された。洗浄物は濾過され、対応する濾過液と組み合わせられた。試料は、Ｓｐｅｅｄｖａｃ中で２ｍｌまで真空濃縮された。各試料は、５ｍｌの総容積まで、純水で希釈された。
【００８９】
各試料の２６０ｎｍでの全光学密度を決定するために、各５０μｌアリコートは１Ｍトリス塩酸バッファｐＨ７．６（分子生物学のためのFluka Biochemika Ultra grade、カタログｎｏ．９３３１４、ロット及びフィリングコード１１８８９６０ ５４６０５２７５）で１ｍｌまで希釈された。各々の溶液について、光路が１ｃｍの使い捨てキュベット（Plastibrand、１．５ｍｌ ｓｅｍｉ−ｍｉｃｒｏ、カタログｎｏ．７５９１ ５０）でのＡ２６０ｎｍが測定された。各合成についての修正された初期光学密度／μｍｏｌを表４に示す。
表４
【００９０】
陰イオン交換ＨＰＬＣ分析は、それから全１２の粗合成について行われた。各粗合成０．５ｍｌを含む水５ｍｌは、０．５ｍｌのＨＰＬＣバッファＡ（５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＮａＯＨ及び０．２ｍＭＥＤＴＡを含む水）と混合された。１４×１ｍｌの試料は１．５ｍｌのショートスレッド・オートサンプラ・バイアル（VWR International（カタログ／技術ｎｏ．５４８−０１７７、バッチｎｏ．１９３１０／２００６０７６３））に入れられ、Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０ ＨＰＬＣシステム（GE Healthcare）に接続されるＡ−９００オートサンプラー（GE Healthcare）のトレイにロードされた。５０μｌの試料は、バイアルから注入され、１ｍｌ／分の流速で２５分間０から４０％ Ｂまでの勾配、及び２６０、２８０及び２９５ｎｍのＵＶ検出を用いて、５０℃でＤＮＡＰａｃ−１００カラム（Dionex）に分離された（Ｔｈｅｒｍａｓｐｈｅｒｅ ｃｏｌｕｍｎ ｈｅａｔｅｒ、 Phenomenex）。Ｂバッファーは、２．５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＮａＯＨ及び０．２ｍＭＥＤＴＡを含む水であった。各溶媒混合物及び各サポートについての完全長プロダクトのパーセンテージは、表５に示される。
表５
【００９１】
ＣＰＧでのＭｅＣＮについて、ＨＰＬＣの出力は、プロダクト・ピークの前で１２％の不純物及び３．５％のｎ＋物質を示した。ピークの高さは、８６３ｍＡＵであった。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ０２８。ＰＳでは、出力はプロダクト・ピークの前で１２％不純物及び３．３％のｎ＋物質を示した。ピークの高さは８１７ｍＡＵであった。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ００８。
【００９２】
ＣＰＧでのＤＭＳＯ／ＭｅＣＮについて、ＨＰＬＣの出力は、３４７ｍＡＵのプロダクト・ピークで主に不完全なカップリングを示した。ＰＳプロダクト・ピークの高さは、２１５ｍＡＵであった。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ００９。
【００９３】
ＣＰＧでのＤＭＡ／ＭｅＣＮについて、ＨＰＬＣの出力は、少量の不完全なカップリングのみが存在することを示した。８．１％の不純物が全て適度に均一の強度でメインピークの前に存在し、５．１％のｎ＋物質も存在した。プロダクト・ピークの高さは、７２５ｍＡＵであった。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ００３。ＰＳでは、１０．４％のみの不純物がプロダクト・ピークの前に存在し、０．４％のみのｎ＋物質だけが存在した。プロダクト・ピークの高さは、８０５ｍＡＵであった。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ０１０。
【００９４】
ＣＰＧでのスルホラン／ＭｅＣＮについて、ＨＰＬＣの出力は非常に小さい失敗のピーク（不完全なカップリング）、及びプロダクト・ピークの前に７．２％の不純物と４．６％のｎ＋物質を示した。プロダクト・ピークの高さは、８６７ｍＡＵであった。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ００４。ＰＳでは、０．８％のｎ＋物質だけであった。プロダクト・ピークの高さ６８３ｍＡＵ。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ０１１。
【００９５】
ＣＰＧでのＮＭＰ／ＭｅＣＮについて、ＨＰＬＣの出力は、メインピークの前で６．３％の失敗とほぼ等しいサイズの全ての失敗及び約４．８％のｎ＋物質を示した。プロダクト・ピークの高さは、６３９ｍＡＵであった。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ００５。ＰＳでは、更に２、３の顕著な失敗があったが、０．７％のｎ＋物質であった。プロダクト・ピークの高さは、７４８ｍＡＵであった。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ０１２。
【００９６】
ＣＧでのＴＭＵ／ＭｅＣＮについて、ＨＰＬＣの出力は、プロダクト・ピークの前の７％の失敗及び約７．５％の全ｎ＋物質を示した。プロダクト・ピークの高さは、５５１ｍＡＵであった。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ００７。ＰＳでは、プロダクト・ピークの前の約１１．８％の障害があり、純粋なＭｅＣＮを用いて得られた結果と非常に類似していた。全ｎ＋物質は、２．７％のみであった。プロダクト・ピークの高さは、７３５ｍＡＵであった。結果ファイルオートサンプラーＤＮＡＰａｃ０１４。
【００９７】
（実施例５）
以下の実施例は、濃縮ステップの溶媒として純粋なアセトニトリルを用いているＣＰＧ、ＧＥポリスチレン及びＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ支持体上の配列番号：１０ｄ［ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ］の１μモル・スケール合成、及びアセトニトリルと、ＤＭＡ、スルホラン、ＮＭＰ及びＴＭＵの各々１：１の混合物を証明する。
【００９８】
実施例４のサイクル及びパラメータは、以下の例外を除いて用いられた。合成は、SAFC ProligoのｄＡｂｚモノマー（プロダクトｎｏ．Ａ１１１０１０−０１、ロットｎｏ．２２８９９２；ＭＷ８５４．９３；２．５ｍｌの０．１Ｍ溶液のために２１５ｍｇが必要とされる）；SAFC ProligoのｄＣｔａｃモノマー（プロダクトｎｏ．Ｃ１１１０２０−０１、ロットｎｏ．２２９９３４）；ＭＷ９２０．０４；３．２５ｍｌの０．１Ｍ溶液のために２９９ｍｇが必要とされる）；及びSAFC ProligoのｄＴモノマー（プロダクトｎｏ．Ｔ１１１０１０−０１、ロットｎｏ．２３１０６２；ＭＷ７４４．８１；１２．５ｍｌの０．１Ｍ溶液のために８６ｍｇが必要とされる）を包含した。８４０ｍｇのｄＧｉｂｕモノマーは、それぞれ５つの別々のＡＢＩ１０ｍｌａｍｉｄｉｔｅボトルに入れられ、真空、オーバーナイトでＰ２Ｏ５及びＫＯＨペレットで乾燥させた。真空はアルゴンを放出され、各モノマーは溶媒混合物の一つで溶解された。ＤＣＩ５．９ｇのアリコートは、５つの１８０ｍｌＡＢＩボトルに量り分け、真空中で乾燥させた。ＤＣＩの各部分は、５つの異なる溶媒（４つの混合物及び１つの純粋なアセトニトリル）の一つで溶解させた。
【００９９】
５つのＡＢＩスナップ・カラムは２８．６ｍｇのｄＧ（ｔａｃ）−ＣＰＧで満たされ、５つのカラムは約１２．７ｍｇのｄＧｉｂｕ８０Ｓポリスチレンサポートで満たされ、５つのカラムは約１１．９ｍｇのＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ ｄＧｉｂｕサポートで満たされた。正確な量は、表６に記載されている。固相合成に用いる前に、ＰＳサポートはアセトニトリル中で１０分間膨張させた。
表６
【０１００】
各合成が開始する前に、全ての送達経路は新しい試薬で満たされたことを確認するために、ＡＢＩ開始プロトコルが用いられた。合成終了後、カートリッジは、アルゴンで乾燥させた。
【０１０１】
カートリッジは慎重に開かれ、サポートは４ｍｌのねじふた式ガラス・バイアルに移され、メチルアミンを４０重量％含む水３ｍｌ（Aldrich、カタログｎｏ．４２，６４６−６、ロットｎｏ．Ｓ２３３２２−４０５））で６５℃、２時間脱保護した。冷却後、上清は、ファルコン・チューブに濾過され、サポートはそれぞれ２×３ｍｌの２０％水性エタノールで洗浄された。洗浄物は濾過され、対応する濾過液と組み合わせられた。サンプル体積は、１０ｍｌに調整され、３５μｌアリコートの各々は陰イオン−交換ＨＰＬＣによる分析のために取り除いた（５２５μｌアリコートは、試料Ｇ４、Ｐ４、Ｎ４、Ｇ５、Ｐ５及びＮ５のために取り除かれ、４７５のμｌの水及び溶液と混合されたそれぞれはオートサンプラー・バイアルに入れられ、Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１０ＨＰＬＣシステムを結合させたオートサンプラーで実行した）。ＨＰＬＣ分析は、分析的ＤＮＡＰａｃ ＰＡ−１００カラム、４×２５０ｍｍ（Dionex、プロダクトｎｏ．０４３０１０、ロットｎｏ．００５−２１−０１７及びシリアルｎｏ．００５４０２））で行われた。直線濃度勾配は１ｍｌ／分の流速で４０分間、０−５０％Ｂから行われ、カラム廃水は２６０、２８０及び２９５ｎｍのＵＶによってモニターされた。バッファＡは５０ｍＭＮａＣｌ及び１０ｍＭＮａＯＨを含む水であり、バッファＢは２．５ＭＮａＣｌ及び１０ｍＭＮａＯＨを含む水であった。それぞれの全てのピークを集積することによって得られた完全長プロダクト％は、表７に示される。
【０１０２】
試料は、Ｓｐｅｅｄｖａｃ中で乾燥するまで真空濃縮された。各試料は、１０ｍｌの総体積まで純水で希釈された。各試料の２６０ｎｍでの全光学密度を決定するために、各３０μｌアリコートは１Ｍトリス塩酸バッファｐＨ７．６（分子生物学のためのFluka Biochemika Ultra grade、カタログｎｏ．９３３１４、ロット及びフィリングコード１１８８９６０ ５４６０５２７５）で１ｍｌまで希釈された。各々の溶液について、光路が１ｃｍの使い捨てキュベット（Plastibrand、１．５ｍｌ ｓｅｍｉ−ｍｉｃｒｏ、カタログｎｏ．７５９１ ５０）でのＡ２６０ｎｍが測定された。各合成についての修正された初期光学密度／μｍｏｌを表７に示す。
表７
【０１０３】
（実施例６）
以下の実施例は、グアニンが豊富なオリゴヌクレオチドＧ１０（配列番号：１０）の大規模な合成を示す。Ｇ１０は、ｄＧｉｂｕと共に１２０μｍｏｌ／ｇでロードされるＮｉｔｔｏＰｈａｓｅサポートで充填されるＯＰＩＩカラムを用いて、凝縮工程の溶媒として１：１ｖ／ｖのアセトニトリル／スルホラン混合液の縮合剤としてＤＣＩを用いて、ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ １００で合成された。
【０１０４】
合成
トリチル−ｏｆｆ合成は、１２０μｍｏｌ／ｇでロードされ、１３３ｍＬのカラム体積に調製されたＯＰＩＩカラム（内径６ｃｍ、GE Healthcareコードｎｏ．１８−１１０７−６０）にパックされた２０ｇのＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ ｄＧｉｂｕサポート（ロットｎｏ．１９５１３６）を用いて、Ａｋｔａ ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ １００合成装置で２．４ｍｍｏｌスケールで行われた。用いられるモノマー濃度（４倍の過剰）はアセトニトリル／スルホラン（１：１ｖ／ｖ）中で０．２７Ｍであり、アセトニトリル／スルホラン（１：１ｖ／ｖ）中で０．５ＭのＤＣＩは１０分間のカップリング時間でカップリング剤として用いられた。モノマー濃度は、以下の通りに算出された：リサイクル・ループ量は、５ｍＬであり、用いられるカラム体積は１２０ｍＬ（トルエンにおいて膨張される場合のサポートの体積であり、６．０ｍＬ／ｇに基づいている）であり、充填カラムにおいて利用可能なオープンボリュームは、８４ｍＬ、０．７×１２０＝８４ｍＬであるので、全オープンボリュームは８９ｍＬである。これは、カップリングのために添加されることができるａｍｉｄｉｔｅ溶液と活性化因子の最大容量を表す。カップリング混合液のモノマー溶液に対する活性化因子溶液の比が６０：４０ｖ／ｖであったので、添加されるモノマー溶液の量は３５．６ｍＬであり、これはモノマーの９．６ｍｍｏｌ（４倍の過剰）を含有する；したがって、モノマー濃度は０．２７Ｍである。カップリングのために添加される活性化因子溶液の量は、５３．４ｍｌであって、２６．７ｍｍｏｌに相当し、ＤＣＩ：モノマーの比は２．７８：１となる。サポートは、膨張され、トルエンに入れられ、合成を始める前にアセトニトリルで洗浄された。
【０１０５】
脱保護合成終了後、サポート結合オリゴヌクレオチドは、シアノエチル保護基を取り除くために乾燥したアセトニトリル中の２０％ジエチルアミン（ＤＥＡ）で処理された。
【０１０６】
粗収率及び粗純度：粗収率は１８７．８のＡ２６０単位／μｍｏｌと見いだされ、粗純度はＨＰＬＣにより７０．２５％と決定された。
【０１０７】
精製
次のステップは、Ｗａｔｅｒｓ ＡＰ−５、５０×２００ｍｍカラム（パートｎｏ．ＷＡＴ０２３３２２）上の４つの実行の粗Ｇ１０の準備の陰イオン交換ＨＰＬＣ精製であって、ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ ２０μｍを台高１８．９ｃｍに充填し、プレップを用いて８２．５分間、１０−５５％Ｂの直線濃度勾配で５０ｍＬ／分で溶出した。ＨＰＬＣバッファー組成物は、上述を同定した。
【０１０８】
粗Ｇ１０溶液のｐＨは、ロードする前に１２ちょうどに調整され、試料はもう一度濾過された。４０ｍＬの画分は、上述のように収集され、分析的陰イオン−交換ＨＰＬＣにより分析された。陰イオン−交換ＨＰＬＣで測定されるように、分析的純度を有する画分（８５％以上）だけがプールされた。全てのピークの画分は、分析の前に、直ちに酢酸でｐＨ６−８に中和された。
【０１０９】
脱塩
上記の純粋なＧ１０の合わせられた画分（総体積２７００ｍＬ）は、０．０９３ｍ２の表面積を伴うシングル１ｋＤａ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ Ｏｍｅｇａ、ミディアム・スクリーン・カセット（Ｐａｌｌ、パートｎｏ．ＯＳ００１Ｃ１２、シリアルｎｏ．３６３２４０５５Ｒ）に適合させたＰａｌｌ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ ５００Ｓｂｅｎｃｈｔｏｐタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）システム（パートｎｏ．ＣＭ５００ＳＥ、コミッションｎｏ．Ｃ５００Ｓ−２０１７）で３００ｍＬに濃縮された。純水に対する１３の連続ダイアフィルトレーション・サイクルが塩及びバッファを取り除くために行われた。濃縮物は、更に２００ｍＬ量まで濃縮された。
【０１１０】
（実施例７）
用いられるサポートの重量がローディングで増やされたように（例えば、２０ｇ×１２０μｍｏｌ／ｇ＝２．４ｍｍｏｌ）、実施例６において記載される合成の全プロセス収率は出発材料のモル量を算出することによって決定された。１００％収率はプロダクトの同じモル量であり、プロダクトのモル質量を考慮する（すなわち配列番号：１０については９６１２ｍｇ／ｍｍｏｌ）。プロダクト特異的吸光係数（配列番号：１０は１ｃｍの径路長で１ ＡＵ２６０−３４０＝２７．８μｇ、）を用いてＵＶ分光法により定量化されるように、収率は実際に製造される相対量である。実施例６において記載される合成の全プロセス収率は、３１．４％であった。
【０１１１】
生じるオリゴヌクレオチドの純度は、プロダクトの５から１００μＭ溶液の４０μｌが２５℃のオーブン温度でＤＮＡＰａｃ ＰＡ−１００カラムに注入するように実行されるＨＰＬＣ分析で測定される。カラムは、７５％バッファーＡ（２０ｍＭＮａＯＨ）及び２５％バッファーＢ（２０ｍＭＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌ、４０％メタノール）で平衡化された。０．７５ｍｌ／分の流速が用いられた。検出波長は２６０ｎｍであった。注射の１分後、勾配は開始し、４分以内にバッファＢの割合は４０％まで増大され、バッファＢの割合は次の３５分以内で５５％まで増大された。その時、バッファＢの割合を１分以内に１００％まで増大させて３分間保ち、その後バッファーＢの割合を３．９分以内で２５％まで低下させた。純度は、全てのクロマトグラムにわたる全ピーク面積のメインピークの相対ピーク面積である。谷から谷の積分が行われたように、積分限度が設定された。実施例６において記載される合成プロダクトの純度は、８７．７５％であった。
【０１１２】
（実施例８）
オリゴヌクレオチドＧ１０（配列番号：１０）の合成は、基本的に実施例５にて説明したように行われる。以下のＭｅＣＮを含む極性非プロトン溶媒の混合液は、試験され、ＭｅＣＮと比較した：１．）ＤＭＡ／ＭｅＣＮ、２．）サルホラン／ＭｅＣＮ、３）ＮＭＰ／ＭｅＣＮ及び４）ＴＭＵ／ＭｅＣＮ。実験は６回繰り返され、各繰り返しにおいてＭｅＣＮに対する溶媒の割合（ｖ／ｖ）は５：１、４：１、３：１、２：１、１：１から１：２へ変更した。記載及び比較されるように、プロダクトの収率及び純度が決定される。
【０１１３】
（配列表）
配列番号：１
ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
配列番号：２
ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ
配列番号：３
ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ
配列番号：４
ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ
配列番号：５
ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ
配列番号：６
ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ
配列番号：７
ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ
配列番号：８
ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ
配列番号：９
ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
配列番号：１０
ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
配列番号：１１
ＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオシド・ホスホラミダイトを、オリゴヌクレオチド合成の間、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオチド又は伸長オリゴヌクレオチドにカップリングさせるための方法であって、
（ｉ）カップリング溶液の作製するステップであって、前記カップリング溶液は、
（ａ）極性非プロトン溶媒であって、アセトニトリルでない少なくとも１つの第一の溶媒；
（ｂ）活性化剤；及び
（ｃ）ヌクレオシド・ホスホラミダイト；
前記カップリング溶液中の前記ヌクレオシド・ホスホラミダイトの濃度は少なくとも０．０３Ｍである；及び
（ｉｉ）カップリング溶液を、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドと接触させるステップ
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも１つの第一の溶媒が
（ａ）スルホラン；
（ｂ）１−メチルピロリジン−２−オン；
（ｃ）Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド；
（ｄ）テトラメチルウレア；及び
（ｅ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
からなるグループから選択される、方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの第一の溶媒がスルホランである、請求項１又は２の何れか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記カップリング溶液中の前記ヌクレオシド・ホスホラミダイトの濃度が０．０３から０．３０Ｍである、請求項１ないし３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記カップリング溶液中の前記活性化剤の濃度が０．０５から０．９０Ｍである、請求項１ないし４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記カップリング溶液がさらに第二の溶媒を含み、前記第二の溶媒がアセトニトリルである、請求項１ないし５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記カップリング溶液が
（ａ）前記少なくとも１つの第一の溶媒のちょうど一つ；
（ｂ）前記活性化剤；
（ｃ）前記ヌクレオシド・ホスホラミダイト；
（ｄ）アセトニトリルである第二の溶媒
を含む方法。
【請求項８】
請求項６又は７の何れか一項に記載の方法であって、前記第二の溶媒に対する前記少なくとも一つの第一の溶媒の割合（ｖ／ｖ）が５：１から１：２の間である方法。
【請求項９】
請求項６ないし７の何れか一項に記載の方法であって、前記第二の溶媒に対する前記少なくとも一つの第一の溶媒の割合（ｖ／ｖ）が１：１である方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９の何れか一項に記載の方法であって、前記第一のヌクレオシド及び／又は前記伸長ヌクレオチドがサポート上に固定されている方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０の何れか一項に記載の方法であって、前記サポートがジビニルベンゼンによって架橋結合しているポリスチレンサポートである方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１の何れか一項に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが少なくとも３０％のグアニン・モノマーを含む方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１２の何れか一項に記載の方法であって、前記活性化剤が
（ａ）４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）；
（ｂ）５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）；
（ｃ）５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＢＴＴ）；及び
（ｄ）５−（３，５−ビス−トリフロロメチル）フェニル−１Ｈ−テトラゾール（活性化因子４２）
からなるグループから選択される方法。
【請求項１４】
請求項１ないし１３の何れか一項に記載の方法であって、前記活性化剤が４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）である方法。
【請求項１５】
請求項１ないし１４の何れか一項に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドがグアニン・モノマーが３以上連続する領域を含む方法。
【請求項１６】
請求項１ないし１５の何れか一項に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドがグアニン・モノマーが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０連続する第一の領域を含む方法。
【請求項１７】
請求項１ないし１６の何れか一項に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドがグアニン・モノマーが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０連続する第二の領域を含む方法。
【請求項１８】
請求項１６又は１７の何れか一項に記載の方法であって、前記第一の領域が前記オリゴヌクレオチドの３’−末端に位置する、及び／又は前記第二の領域が前記オリゴヌクレオチドの５’−末端に位置する方法。
【請求項１９】
請求項１ないし１８の何れか一項に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが１０から５０のヌクレオチド・モノマーを含む方法。
【請求項２０】
請求項１ないし１９の何れか一項に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドがＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号：２）であるパリンドローム配列を含む方法。
【請求項２１】
請求項１ないし２０の何れか一項に記載の方法であって、前記パリンドローム配列が少なくとも４、多くても２０のグアノシンによってその５’−末端に隣接している；及び／又はパリンドローム配列が少なくとも６、多くても２０のグアノシンによってその３’−末端に隣接している方法。
【請求項２２】
請求項１ないし２１の何れか一項に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが
（ａ）ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：３）；
（ｂ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：４）；
（ｃ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：５）；
（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：６）；
（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：７）；
（ｆ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：８）；
（ｇ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：９）；
（ｈ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１０）；及び
（ｉ）ＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１１）
からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項２３】
請求項１ないし２２の何れか一項に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが配列番号：１０からなる方法。
【請求項２４】
オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、前記方法は請求項１ないし２３の何れか一項に記載の方法を含む方法。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチドを製造するための方法であって、前記方法が
（ｉ）請求項１ないし２３の何れか一項に記載の方法を含む、第一のヌクレオシドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるステップ；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のプロダクトを酸化させることによって、伸長オリゴヌクレオチドを生成するステップ；
（ｉｉｉ）請求項１ないし２３の何れか一項に記載の方法を含む、ステップ（ｉｉ）のプロダクトに、ヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるステップ；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）のプロダクトを酸化させることによって、伸長オリゴヌクレオチドを生成するステップ；及び
（ｖ）伸長オリゴヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドの配列を含むまで、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）のステップを繰り返すステップ
を含む方法。
【請求項２６】
請求項２４又は２５の何れか一項に記載の方法であって、前記方法がさらに前記オリゴヌクレオチドを変性条件の下で精製するステップを含み、前記変性条件がｐＨ１０から１４であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
前記精製が陰イオン交換クロマトグラフィーにより行われる請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２５ないし２７の何れか一項に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが少なくとも２０％の第一のヌクレオシドに関するモル収率で製造される方法。
【請求項２９】
請求項１ないし２８の何れか一項に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドの精製が少なくとも７５％である方法。
【請求項３０】
請求項２４ないし２８の何れか一項に記載の方法により得られるオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項３０に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが
（ａ）ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：３）；
（ｂ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：４）；
（ｃ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：５）；
（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：６）；
（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：７）；
（ｆ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：８）；
（ｇ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：９）；
（ｈ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１０）；及び
（ｉ）ＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１１）
からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号：１０からなる請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：３）；
（ｂ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：４）；
（ｃ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：５）；
（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：６）；
（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：７）；
（ｆ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：８）；
（ｇ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：９）；
（ｈ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１０）；及び
（ｉ）ＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１１）
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドの精製が少なくとも７５％であるオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号：１０からなる請求項３３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１】
ヌクレオシド・ホスホラミダイトを、オリゴヌクレオチド合成の間、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオチド又は伸長オリゴヌクレオチドにカップリングさせるための方法であって、
（ｉ）カップリング溶液の作製するステップであって、前記カップリング溶液は、
（ａ）極性非プロトン溶媒であって、アセトニトリルでない少なくとも１つの第一の溶媒；
（ｂ）活性化剤；及び
（ｃ）ヌクレオシド・ホスホラミダイト；
前記カップリング溶液中の前記ヌクレオシド・ホスホラミダイトの濃度は少なくとも０．０３Ｍである；及び
（ｉｉ）カップリング溶液を、ユニバーサル・サポート、第一のヌクレオシド又は伸長オリゴヌクレオチドと接触させるステップ
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも１つの第一の溶媒が
（ａ）スルホラン；
（ｂ）１−メチルピロリジン−２−オン；
（ｃ）Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド；
（ｄ）テトラメチルウレア；及び
（ｅ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
からなるグループから選択される、方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの第一の溶媒がスルホランである、請求項１又は２の何れか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記カップリング溶液中の前記ヌクレオシド・ホスホラミダイトの濃度が０．０３から０．３０Ｍである、請求項１ないし３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記カップリング溶液中の前記活性化剤の濃度が０．０５から０．９０Ｍである、請求項１ないし４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記カップリング溶液がさらに第二の溶媒を含み、前記第二の溶媒がアセトニトリルである、請求項１ないし５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記カップリング溶液が
（ａ）前記少なくとも１つの第一の溶媒のちょうど一つ；
（ｂ）前記活性化剤；
（ｃ）前記ヌクレオシド・ホスホラミダイト；
（ｄ）アセトニトリルである第二の溶媒
を含む方法。
【請求項８】
請求項６又は７の何れか一項に記載の方法であって、前記第二の溶媒に対する前記少なくとも一つの第一の溶媒の割合（ｖ／ｖ）が５：１から１：２の間である方法。
【請求項９】
請求項６ないし７の何れか一項に記載の方法であって、前記第二の溶媒に対する前記少なくとも一つの第一の溶媒の割合（ｖ／ｖ）が１：１である方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９の何れか一項に記載の方法であって、前記第一のヌクレオシド及び／又は前記伸長ヌクレオチドがサポート上に固定されている方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０の何れか一項に記載の方法であって、前記サポートがジビニルベンゼンによって架橋結合しているポリスチレンサポートである方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１の何れか一項に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが少なくとも３０％のグアニン・モノマーを含む方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１２の何れか一項に記載の方法であって、前記活性化剤が
（ａ）４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）；
（ｂ）５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）；
（ｃ）５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＢＴＴ）；及び
（ｄ）５−（３，５−ビス−トリフロロメチル）フェニル−１Ｈ−テトラゾール（活性化因子４２）
からなるグループから選択される方法。
【請求項１４】
請求項１ないし１３の何れか一項に記載の方法であって、前記活性化剤が４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）である方法。
【請求項１５】
請求項１ないし１４の何れか一項に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドがグアニン・モノマーが３以上連続する領域を含む方法。
【請求項１６】
請求項１ないし１５の何れか一項に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドがグアニン・モノマーが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０連続する第一の領域を含む方法。
【請求項１７】
請求項１ないし１６の何れか一項に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドがグアニン・モノマーが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０連続する第二の領域を含む方法。
【請求項１８】
請求項１６又は１７の何れか一項に記載の方法であって、前記第一の領域が前記オリゴヌクレオチドの３’−末端に位置する、及び／又は前記第二の領域が前記オリゴヌクレオチドの５’−末端に位置する方法。
【請求項１９】
請求項１ないし１８の何れか一項に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが１０から５０のヌクレオチド・モノマーを含む方法。
【請求項２０】
請求項１ないし１９の何れか一項に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドがＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号：２）であるパリンドローム配列を含む方法。
【請求項２１】
請求項１ないし２０の何れか一項に記載の方法であって、前記パリンドローム配列が少なくとも４、多くても２０のグアノシンによってその５’−末端に隣接している；及び／又はパリンドローム配列が少なくとも６、多くても２０のグアノシンによってその３’−末端に隣接している方法。
【請求項２２】
請求項１ないし２１の何れか一項に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが
（ａ）ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：３）；
（ｂ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：４）；
（ｃ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：５）；
（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：６）；
（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：７）；
（ｆ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：８）；
（ｇ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：９）；
（ｈ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１０）；及び
（ｉ）ＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１１）
からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項２３】
請求項１ないし２２の何れか一項に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが配列番号：１０からなる方法。
【請求項２４】
オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、前記方法は請求項１ないし２３の何れか一項に記載の方法を含む方法。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチドを製造するための方法であって、前記方法が
（ｉ）請求項１ないし２３の何れか一項に記載の方法を含む、第一のヌクレオシドにヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるステップ；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のプロダクトを酸化させることによって、伸長オリゴヌクレオチドを生成するステップ；
（ｉｉｉ）請求項１ないし２３の何れか一項に記載の方法を含む、ステップ（ｉｉ）のプロダクトに、ヌクレオシド・ホスホラミダイトをカップリングさせるステップ；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）のプロダクトを酸化させることによって、伸長オリゴヌクレオチドを生成するステップ；及び
（ｖ）伸長オリゴヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドの配列を含むまで、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）のステップを繰り返すステップ
を含む方法。
【請求項２６】
請求項２４又は２５の何れか一項に記載の方法であって、前記方法がさらに前記オリゴヌクレオチドを変性条件の下で精製するステップを含み、前記変性条件がｐＨ１０から１４であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
前記精製が陰イオン交換クロマトグラフィーにより行われる請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２５ないし２７の何れか一項に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが少なくとも２０％の第一のヌクレオシドに関するモル収率で製造される方法。
【請求項２９】
請求項１ないし２８の何れか一項に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドの精製が少なくとも７５％である方法。
【請求項３０】
請求項２４ないし２８の何れか一項に記載の方法により得られるオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項３０に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが
（ａ）ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：３）；
（ｂ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：４）；
（ｃ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：５）；
（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：６）；
（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：７）；
（ｆ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：８）；
（ｇ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：９）；
（ｈ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１０）；及び
（ｉ）ＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１１）
からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号：１０からなる請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：３）；
（ｂ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：４）；
（ｃ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：５）；
（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号：６）；
（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：７）；
（ｆ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：８）；
（ｇ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：９）；
（ｈ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１０）；及び
（ｉ）ＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：１１）
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドの精製が少なくとも７５％であるオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号：１０からなる請求項３３に記載のオリゴヌクレオチド。
【公表番号】特表２０１０−５１２１６９（Ｐ２０１０−５１２１６９Ａ）
【公表日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４１５４６（Ｐ２００９−５４１５４６）
【出願日】平成１９年１２月１２日（２００７．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８７１８３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７３９６０
【国際公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【出願人】（５０９１６６６１８）インテグレイテッド ディーエヌエー テクノロジーズ， インク． (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１２日（２００７．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８７１８３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７３９６０
【国際公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【出願人】（５０９１６６６１８）インテグレイテッド ディーエヌエー テクノロジーズ， インク． (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]