２’位にアルキル型保護基を有するリボ核酸の製造法
【課題】リボ核酸の３’位と５’位の水酸基が保護されていない状態、あるいは５’位水酸基のみが保護されている状態で、２’位水酸基に選択的にかつ効率良く短工程で２−シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）基などのアルキル型保護基を導入する方法を提供する。
【解決手段】リボ核酸をアリールボロン酸存在下で調製した式［Ｉ］で表されるリボ核酸のボロン酸エステル体を、ルイス塩基および銀化合物の存在下、式［ＩＩＩ］で表されるアルキル化剤と反応させ、式［ＩＩ］で表される２’位水酸基にアルキル型保護基が導入されたリボ核酸を製造する。
（式中、ＢＡＳＥは保護基を有していてもよい核酸塩基を示し、Ｒ１は水素原子または水酸基の保護基を示し、Ｒ２はアルキル基を示し、Ｘは脱離基示し、Ａｒはアリール基を示す。）
【解決手段】リボ核酸をアリールボロン酸存在下で調製した式［Ｉ］で表されるリボ核酸のボロン酸エステル体を、ルイス塩基および銀化合物の存在下、式［ＩＩＩ］で表されるアルキル化剤と反応させ、式［ＩＩ］で表される２’位水酸基にアルキル型保護基が導入されたリボ核酸を製造する。
（式中、ＢＡＳＥは保護基を有していてもよい核酸塩基を示し、Ｒ１は水素原子または水酸基の保護基を示し、Ｒ２はアルキル基を示し、Ｘは脱離基示し、Ａｒはアリール基を示す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リボース部分の２’および３’位の水酸基が保護されていないリボ核酸において、２’位水酸基にアルキル基を優先的に導入することが可能な方法により２’位水酸基にアルキル型保護基が導入されたリボ核酸の製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、オリゴリボ核酸（オリゴＲＮＡ）は、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アプタマーなどの医薬品素材となる機能性分子として注目され、世界中で医薬品としての開発が進められている。
【０００３】
しかしながら、これらＲＮＡ分子を医薬品として開発する上での重要な課題の１つに、オリゴＲＮＡの製造コストが挙げられ、大きな問題となっている。
【０００４】
オリゴＲＮＡの製造方法としては、ホスホロアミダイト法という固相合成法が広く知られている。かかるホスホロアミダイト法は、リボ核酸のリボース部分の３’位の水酸基がホスホロアミダイト化されたリボ核酸（いわゆるホスホロアミダイト化合物）を用いて、複数の核酸モノマーを縮合しオリゴマー化していく方法である。
【０００５】
ホスホロアミダイト法を用いたＲＮＡ合成において、２’位水酸基の保護基の構造は、縮合効率や合成されるＲＮＡの純度に大きく影響を与えることが知られており、近年、種々のアルキル型保護基が開発されている（非特許文献１〜９）。
【０００６】
これらを保護基としたホスホロアミダイト化合物は、従来、保護基として用いられているｔ−ブチルジメチルシリル基を有する化合物と比較して、その縮合反応において、高い反応性を示し、オリゴＲＮＡ合成のモノマー原料として有用であることが明らかとなっている。特に、２−シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）基を保護基として用いたホスホロアミダイト法によるＲＮＡ合成において、高い縮合効率で高純度な長鎖ＲＮＡを合成できることが明らかとなり（非特許文献３，１０）、ＲＮＡ医薬品の製造における有用な合成原料として期待されている。
【０００７】
一般に、ＣＥＭ基に代表されるアルキル型保護基のリボ核酸の２’位水酸基への導入法としては、３’位と５’位の水酸基がケイ素置換基で保護された状態で選択的にアルキル化を行うか（方法Ａ）、もしくは５’位の水酸基が保護されたリボ核酸を用い、これを２’位および３’位の水酸基がアルキルスタレンニル基で保護された２’，３’−Ｏ−ジアルキルスタニレン誘導体へ変換し、当該誘導体に対し、非選択的にアルキル化を行った後、目的外の異性体を分離する方法（方法Ｂ）が用いられている（非特許文献１−９，特許文献１）。
【０００８】
しかしながら、上記のようなリボ核酸の２’位水酸基への保護基の導入法において、方法Ａの場合には３’位および５’位の水酸基に保護基を導入するために高価な試薬を用い、さらに反応工程が長くなること、また方法Ｂの場合には人体に有害な有機スズ試薬を用いることや５’位水酸基を４，４’−ジメトキシトリチルのような脂溶性の高い保護基を用いて保護する必要があるため、異性体を分離するためにシリカゲルカラムクロマトグラフィーのような煩雑な分離精製手段を必要とすることなどの理由から、工業的な製法としては満足のいく方法ではなかった。このため、ＲＮＡ医薬品原料としての核酸モノマーの工業的製造法としては、より効率的な２’位水酸基への保護基導入法の開発が切望されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公報ＷＯ２００６／０２２３２３ Ａ１パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．３５，６８２７（１９９４）
【非特許文献２】Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．ｖｏｌ．８４，３７７３（２００１）
【非特許文献３】Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ，Ｖｏｌ．７，３４７７（２００５）
【非特許文献４】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１２８，１２３５６（２００６）
【非特許文献５】Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．８，３８６９（２００６）
【非特許文献６】Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５，３３３（２００７）
【非特許文献７】Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．９，６７１（２００７）
【非特許文献８】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．４５，９５２９（２００４）
【非特許文献９】Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，Ｖｏｌ．１４，９１３５（２００８）
【非特許文献１０】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３５，３２８７（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明は、３’位と５’位の水酸基が保護されていない状態、あるいは５’位のみが保護されている状態のリボ核酸を用い、２’位水酸基に選択的かつ効率良く、しかも短工程で２−シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）基などのアルキル型保護基を導入し、結晶化などの簡単な精製手段で目的のリボ核酸を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、実用的なリボ核酸の２’位水酸基への保護基導入法を確立すべく鋭意検討を重ねた結果、常法により調製できる式［Ｉ］で表されるリボ核酸のボロン酸エステル体を、ルイス塩基および銀化合物の存在下、式［ＩＩＩ］で表されるアルキル化剤と反応させるという簡便な方法で、式［ＩＩ］で表される２’位にアルキル型保護基が導入されたリボ核酸を選択的かつ効率的に取得できることを見出し、本発明を完成させた。したがって、本発明は以下の通りである。
【００１３】
（１）式［Ｉ］で表されるリボ核酸のボロン酸エステル体を、ルイス塩基および銀化合物の存在下、式［ＩＩＩ］で表されるアルキル化剤と反応させ、式［ＩＩ］で表される化合物を調製することを特徴とする２’位にアルキル型保護基を有するリボ核酸の製造法。
（式中、ＢＡＳＥは保護基を有していてもよい核酸塩基を示し、Ｒ１は水素原子または水酸基の保護基を示し、Ｒ２はアルキル基を示し、Ｘは脱離基を示し、Ａｒはアリール基を示す。）
【００１４】
（２）Ｒ２で表されるアルキル基が、メチル、エチル、アリル、２−シアノエチル、２−トリメチルシリルエチル、ベンジル、メトキシメチル、エトキシメチル、２−シアノエトキシメチル、ベンジルオキシメチル、ピバロイルオキシメチル、アセチルオキシメチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、またはトリイソプロピルシリルオキシメチルから選択されたアルキル基である、上記（１）記載の製造法。
【００１５】
（３）ルイス塩基が、３価リン試薬、ヨードアニオン、または３級アミン類である、請求項１記載の製造法。
（４）銀化合物が、酸化銀、炭酸銀、酢酸銀、または硝酸銀である、上記（１）記載の製造法。
（５）結晶化により式［ＩＩ］で表される化合物を単離する、上記（１）記載の製造法。
すなわち、上記式［Ｉ］で表されるリボ核酸のボロン酸エステル体を式［ＩＩＩ］で表されるアルキル化剤と反応させ、調製した式［ＩＩ］で表される化合物を含む反応物を結晶化して式［ＩＩ］で表される化合物を単離することを特徴とする（１）記載の製造方法である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明方法は、３’位および５’位の水酸基に保護基が導入されていないリボ核酸もしくは３’位水酸基に保護基が導入されていないリボ核酸であっても、リボースの２’位水酸基に、短工程で選択的にかつ効率よくアルキル型保護基を導入することができ、さらに得られた化合物は結晶化などを利用して容易に精製することができることから、オリゴＲＮＡの化学合成原料である２’−Ｏ−アルキルリボ核酸の効率的な製法として有用である。
【００１７】
特に、短工程で効率良く調製することが困難であった２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）リボヌクレオシドを、工業的スケールで簡便に製造することが初めて可能となり、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡ医薬品をより安価に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明方法は、上述したように、式［Ｉ］で表されるリボ核酸のボロン酸エステル体を、ルイス塩基および銀化合物の存在下、式［ＩＩＩ］で表されるアルキル化剤と反応させ、式［ＩＩ］で表される２’位にアルキル型保護基が導入されたリボ核酸を製造しようとするものである。
【００１９】
原料として利用する式［Ｉ］で表されるリボ核酸のボロン酸エステル体は、常法により調製可能である（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２３２５（１９６１），Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７０，８４００（２００５））。具体的には、原料リボ核酸である式［ＩＶ］で表される化合物と式［Ｖ］で表されるボロン酸試薬を共沸脱水することで、式［Ｉ］で表されるリボ核酸のボロン酸エステル体を容易に取得することができる。
【００２０】
式［ＩＶ］で示される化合物におけるＢＡＳＥは、核酸塩基を意味し、当該核酸塩基としては保護基を有していてもかまわない。具体的には、ウラシル、Ｎ６−アセチルアデニン、Ｎ６−ベンゾイルアデニン、Ｎ４−アセチルシトシン、Ｎ４−ベンゾイルシトシン、Ｎ２−フェノキシアセチルグアニン、Ｎ２−イソブチリルグアニンなどを例示することができる。
【００２１】
また、式［ＩＶ］で示される化合物におけるＲ１は、水素原子または水酸基の保護基を意味する。当該水酸基の保護基としては、アセチル、ベンゾイルなどのアシル基、トリチル、４−メトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル、ベンジルなどのアルキル基、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリルなどのシリル基を例示することができる。
【００２２】
式［Ｖ］で示されるボロン酸試薬におけるＡｒは、アリール基を意味し、具体的には、フェニル基もしくはアルキルやハロゲンなどの置換基を有するフェニル基などが例示され、置換基の位置や数は特に限定されない。
【００２３】
式［Ｉ］で示されるリボ核酸のボロン酸エステル体の調製法は、式［ＩＶ］で示される化合物１モルに対し、１モル以上の式［Ｖ］で示されるボロン酸試薬を用い、ピリジン、トルエン、１，４−ジオキサン、アセトニトリルなどの単独またはそれらの混合溶媒中で、１〜５回程度共沸脱水することで実施することができる。また、必要に応じて加熱還流などの加熱処理を行ってもかまわない。
【００２４】
このようにして得られた、式［Ｉ］で示されるリボ核酸のボロン酸エステル体は、溶媒を留去した後、そのまま本発明方法の原料として使用してもよく、必要に応じて、結晶化による精製を行った後に使用してもかまわない。
【００２５】
本発明方法で使用するアルキル化剤は式［ＩＩＩ］で表される化合物であり、Ｒ２のアルキル基としては、メチル、エチル、アリル、２−シアノエチル、２−トリメチルシリルエチル、ベンジル、メトキシメチル、エトキシメチル、２−シアノエトキシメチル、ベンジルオキシメチル、ピバロイルオキシメチル、アセチルオキシメチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、トリイソプロピルシリルオキシメチルなどのアルキル基を例示することができ、導入するアルキル基に応じて適宜選択すればよい。
【００２６】
また、アルキル化剤におけるＸの脱離基としては、クロロ、ブロモ、ヨードなどのハロゲン原子、アセテートなどのカルボキシレート基、メタンスルホネート基、ｐ−トルエンスルホネート基、トリフルオロメタンスルホネート基などを例示することができ、特にＸがハロゲン原子、好ましくはクロロであるアルキル化剤が選択性と収率の点で好適である。
【００２７】
銀化合物としては、酸化銀、炭酸銀、酢酸銀、硝酸銀などが例示でき、特に酸化銀（Ｉ）が好適である。銀化合物の使用量は、式［Ｉ］で示される化合物１モルに対して１〜１０モルが適当である。
【００２８】
ルイス塩基としては、ルイス塩基性を有するものであればよく、具体的にはトリアルキルホスファイトやトリアルキルホスフィンなどの３価リン試薬、テトラブチルアンモニウムヨージドやテトラエチルアンモニウムヨージドといったカウンターイオンとして４級アンモニウムなどを含むヨードアニオン、トリエチルアミン、トリブチルアミンなどの３級アミン類を用いることができ、その使用量は式［Ｉ］で示される化合物１モルに対して０．１〜１０モルが適当である。
【００２９】
このような試薬を用いる２’位水酸基へのアルキル化反応は、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トルエン、アセトン、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタンなどの単独または混合溶媒中、銀化合物およびルイス塩基の存在下、式［ＩＩＩ］で示されるアルキル化剤を式［Ｉ］で示される化合物１モルに対して０．５〜１０モル程度使用し、反応温度−７８℃〜１２０℃で１〜２４時間程度反応させることにより実施することができる。
【００３０】
また、必要に応じて、式［Ｉ］で示されるリボ核酸のボロン酸エステル体を、ビストリメチルシリルアセタミドなどのシリル化剤で処理することで５’位水酸基および塩基部をシリル化して、有機溶媒に対する溶解性を向上させた後、上記のアルキル化反応を実施することで、収率よく目的化合物を取得することが可能である。
【００３１】
このようにして合成された目的の式［ＩＩ］で示される化合物は、必要により通常のヌクレオシド誘導体の精製手段（有機溶媒−水による分配、各種クロマトグラフィー処理、結晶化）により単離精製することができるが、特に結晶化などの簡単な手段で単離できるのが特長である。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。
【００３３】
＜実施例１＞
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン（式［ＩＩ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル），Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル）の合成
【００３４】
実施例１では、式［ＩＶ］で示されるリボ核酸として５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（式［ＩＶ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル），Ｒ２＝Ｈ）を原料とし、式［ＩＩ］で示される化合物として５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンを合成した。具体的には、まず、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン１０９ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）とボロン酸試薬であるフェニルボロン酸（式［Ｖ］：Ａｒ＝Ｐｈ）２６ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を酢酸エチルに溶解し、減圧下で濃縮した後、残渣をトルエンで３回共沸脱水し、式［Ｉ］で示される化合物として５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル），Ａｒ＝Ｐｈ）を得た。これをトルエン（２ｍｌ）に溶解し、氷冷下で、銀化合物としての酸化銀（Ｉ）２３２ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）、アルキル化剤としての２−シアノエトキシメチルクロリド（式［ＩＩＩ］：Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）４８ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン５６μｌ（０．４ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（１ｍｌ）を加え、６０℃で１００分間攪拌した。反応液にメタノールおよび水を加え、減圧下で濃縮した。残渣をＨＰＬＣで分析し、目的物の合成収率を算出した（５２％）。
【００３５】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．４０（１Ｈ，ｂｒｓ），７．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．３９−７．２４（９Ｈ，ｍ），６．９１（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），５．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ），５．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），５．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），４．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），４．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），４．２８−４．２２（２Ｈ，ｍ），４．００−３．９７（１Ｈ，ｍ），３．７４−３．６６（８Ｈ，ｍ），３．３４−３．２２（２Ｈ，ｍ），２．８２−２．７３（２Ｈ，ｍ）
【００３６】
＜参考例１＞
２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）の合成
【００３７】
式［ＩＶ］で示されるリボ核酸としてウリジン（式［ＩＶ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝Ｈ）７３３ｍｇ（３．０ｍｍｏｌ）を用い、これとフェニルボロン酸（式［Ｖ］：Ａｒ＝Ｐｈ）３８５ｍｇ（３．０ｍｍｏｌ）をピリジンに溶解し、ピリジンで３回、１，４−ジオキサンで３回共沸脱水した。さらに１，４−ジオキサン（１５ｍｌ）に溶解し、１００℃で１時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。残渣にアセトニトリル（４ｍｌ）を加え、室温で５分間攪拌した。析出した結晶をろ過し、乾燥して式［Ｉ］で表される化合物である２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジンを目的物として８６６ｍｇ（８７％）、得た。
【００３８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．４６（１Ｈ，ｂｒｓ），７．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．７４（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２＆８．０Ｈｚ），７．５７−７．５３（１Ｈ，ｍ），７．４３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），５．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），５．６９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２＆８．０Ｈｚ）５．２８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．０＆７．５Ｈｚ），５．１１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．０４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．４＆７．５Ｈｚ），４．１３（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝４．７Ｈｚ），３．７２−３．６３（２Ｈ，ｍ）
【００３９】
＜実施例２＞
２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン（式［ＩＩ］：Ｂ＝ウラシル，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル）の合成
【００４０】
実施例２では、参考例１で合成した２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）を用い、目的物として式［ＩＩ］で示される化合物である２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンを合成した。具体的には、２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン３３ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）をトルエン（１．０ｍｌ）に懸濁し、ビストリメチルシリルアセタミド２７μｌ（０．１１ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で３０分間攪拌した。得られた溶液に、氷冷下で酸化銀（Ｉ）１１６ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、２−シアノエトキシメチルクロリド（式［ＩＩＩ］：Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）２４ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン２８μｌ（０．２ｍｍｏｌ）のトルエン（０．５ｍｌ）溶液を加え、６０℃で５時間攪拌した。反応液にメタノールおよび８０％酢酸水を加え、減圧下で濃縮した。残渣をＨＰＬＣで分析し、目的物の合成収率（２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジンに対する収率）を算出した（７３％）。
【００４１】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．３６（１Ｈ，ｂｒｓ），７．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），５．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），５．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），５．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．１７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），４．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．７７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．１７−４．１１（２Ｈ，ｍ），３．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．０＆７．５Ｈｚ），３．７２−３．５５（４Ｈ，ｍ），２．７８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝５．４，６．６＆１７．１Ｈｚ），２．７２（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝５．４，７．０＆１７．１Ｈｚ）
【００４２】
＜実施例３＞
２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン（式［ＩＩ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル）の合成
【００４３】
２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）３３０ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）をトルエン（１０ｍｌ）に懸濁し、ビストリメチルシリルアセタミド２７０μｌ（１．１ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で３０分間攪拌した。得られた溶液に、氷冷下で酸化銀（Ｉ）１．１６ｇ（５．０ｍｍｏｌ）、２−シアノエトキシメチルクロリド（式［ＩＩＩ］：Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）２４０ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン２８０μｌ（２．０ｍｍｏｌ）のトルエン（５ｍｌ）溶液を加え、６０℃で５時間攪拌した。反応液にメタノールおよび８０％酢酸水を加え、減圧下で濃縮した。残渣を逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィーに付して試薬残渣を除去した後、エタノールより結晶化することにより３’−異性体を分離し、目的物を得た。
【００４４】
＜参考例２＞
２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ４−アセチルシチジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ４−アセチルシトシン，Ｒ１＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）の合成
【００４５】
式［ＩＶ］で示されるリボ核酸としてＮ４−アセチルシチジン（式［ＩＶ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ４−アセチルシトシン，Ｒ１＝Ｈ）８５６ｍｇ（３．０ｍｍｏｌ）を用い、これとフェニルボロン酸（式［Ｖ］：Ａｒ＝Ｐｈ）３８５ｍｇ（３．０ｍｍｏｌ）をピリジンに溶解し、ピリジンで３回、１，４−ジオキサンで３回共沸脱水した。さらに１，４−ジオキサン（１５ｍｌ）に溶解し、１００℃で１時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。残渣にアセトニトリル（６ｍｌ）を加え、４℃で３０分間攪拌した。析出した結晶をろ過し、乾燥して式［Ｉ］で表される化合物である２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ４−アセチルシチジンを目的物として１．０ｇ（モノアセトニトリル含有結晶，８１％）、得た。
【００４６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．９８（１Ｈ，ｂｒｓ），８．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．７５（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２＆８．０Ｈｚ），７．５７−７．５４（１Ｈ，ｍ），７．４４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），５．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），５．３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．３＆７．３Ｈｚ），５．１２−５．０８（２Ｈ，ｍ），４．２５（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），３．７４（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．９＆１１．７Ｈｚ），３．６９−３．５７（１Ｈ，ｍ），２．１２（３Ｈ，ｓ）
【００４７】
＜実施例４＞
２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）−Ｎ４−アセチルシチジン（式［ＩＩ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ４−アセチルシトシン，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル）の合成
【００４８】
実施例４では、参考例２で合成した２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ４−アセチルシチジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ４−アセチルシチジン，Ｒ１＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）を用い、目的物として式［ＩＩ］で示される化合物である２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）−Ｎ４−アセチルシチジンを合成した。具体的には、２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ４−アセチルシチジン４１ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．０ｍｌ）に懸濁し、氷冷下で酸化銀（Ｉ）２３ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）、テトラエチルアンモニウムヨージド１３ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）、および２−シアノエトキシメチルクロリド（式［ＩＩＩ］：Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）１３ｍｇ（０．１１ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間攪拌した。反応液にメタノールおよび８０％酢酸水を加え、減圧下で濃縮した。残渣をＨＰＬＣで分析し、目的物の合成収率（２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ４−アセチルシチジンに対する収率）を算出した（６２％）。
【００４９】
また、もう少し大量に目的化合物を合成するため、２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ４−アセチルシチジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ４−アセチルシトシン，Ｒ１＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）４１２ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１４．０ｍｌ）に懸濁し、氷冷下で酸化銀（Ｉ）２３２ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）、テトラエチルアンモニウムヨージド１２９ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、および２−シアノエトキシメチルクロリド（式［ＩＩＩ］：Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）１３２ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）を加え、４℃で３．５時間攪拌した。反応液にメタノールおよび８０％酢酸水を加え、減圧下で濃縮した。残渣を逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィーに付して試薬残渣を除去した後、メタノールより結晶化することにより目的外の３’−異性体を分離し、目的物を得た。
【００５０】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．８８（１Ｈ，ｂｒｓ），８．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），５．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ），５．２４−５．１９（２Ｈ，ｍ），４．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．１２−４．０８（２Ｈ，ｍ），３．９４−３．９１（１Ｈ，ｍ），３．８１−３．６０（４Ｈ，ｍ），２．８０−２．７５（２Ｈ，ｍ），２．１０（３Ｈ，ｓ）
【００５１】
＜参考例３＞
２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ６−アセチルアデノシン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ６−アセチルアデニン，Ｒ１＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）の合成
【００５２】
式［ＩＶ］で示されるリボ核酸としてＮ６−アセチルアデノシン（式［ＩＶ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ６−アセチルアデニン，Ｒ１＝Ｈ）６００ｍｇ（１．９ｍｍｏｌ）を用い、これとフェニルボロン酸（式［Ｖ］：Ａｒ＝Ｐｈ）２４４ｍｇ（１．９ｍｍｏｌ）をピリジンに溶解し、ピリジンで３回、１，４−ジオキサンで３回共沸脱水した。さらに１，４−ジオキサン（１０ｍｌ）に溶解し、１００℃で１時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。残渣にアセトニトリル（３ｍｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した。析出した結晶をろ過し、乾燥して式［Ｉ］で表される化合物である２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ６−アセチルアデノシンを目的物として６７３ｍｇ（９０％）、得た。
【００５３】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．９８（１Ｈ，ｂｒｓ），８．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．７５（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２＆８．０Ｈｚ），７．５７−７．５４（１Ｈ，ｍ），７．４４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），５．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），５．３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．３＆７．３Ｈｚ），５．１２−５．０８（２Ｈ，ｍ），４．２５（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），３．７４（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．９＆１１．７Ｈｚ），３．６９−３．５７（１Ｈ，ｍ），２．１２（３Ｈ，ｓ）
【００５４】
＜実施例５＞
２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）−Ｎ６−アセチルアデノシン（式［ＩＩ］：Ｂ＝Ｎ６−アセチルアデニン，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル）の合成
【００５５】
実施例５では、参考例３で合成した２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ６−アセチルアデノシン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ６−アセチルアデニン，Ｒ１＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）を用い、目的物として式［ＩＩ］で示される化合物である２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）−Ｎ６−アセチルアデノシンを合成した。具体的には、２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ６−アセチルアデノシン４０ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン（１．５ｍｌ）に溶解し、室温で酸化銀（Ｉ）２３ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）、テトラエチルアンモニウムヨージド１３ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）、および２−シアノエトキシメチルクロリド（式［ＩＩＩ］：Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）１８ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）を加え、室温で７時間攪拌した。反応液にメタノールおよび８０％酢酸水を加え、減圧下で濃縮した。残渣をＨＰＬＣで分析し、目的物の合成収率（２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ６−アセチルアデノシンに対する収率）を算出した（４０％）。
【００５６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．６９（１Ｈ，ｂｒｓ），８．７２（１Ｈ，ｓ），８．６６（１Ｈ，ｓ），６．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），５．１７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），４．７８−４．７３（３Ｈ，ｍ），４．３７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０＆９．０Ｈｚ），４．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．８＆７．７Ｈｚ），３．７１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝４．２，５．０＆１２．０Ｈｚ），３．６３−３．５７（２Ｈ，ｍ），３．４６−３．４１（１Ｈ，ｍ），２．６３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝５．２，６．７＆１７．０Ｈｚ），２．５５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝５．３，７．３＆１７．１Ｈｚ），２．２６（３Ｈ，ｓ）
【００５７】
＜参考例４＞
２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ２−フェノキシアセチルグアノシン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ２−フェノキシアセチルグアニン，Ｒ１＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）の合成
【００５８】
式［ＩＶ］で示されるリボ核酸としてＮ２−フェノキシアセチルグアノシン（式［ＩＶ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ２−フェノキシアセチルグアニン，Ｒ１＝Ｈ）８３５ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）を用い、これとフェニルボロン酸（式［Ｖ］：Ａｒ＝Ｐｈ）２５７ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）をピリジンに溶解し、ピリジンで３回、１，４−ジオキサンで３回共沸脱水した。さらに１，４−ジオキサン（１０ｍｌ）に溶解し、１００℃で１時間攪拌した後、減圧下で濃縮し、未精製の目的物として式［Ｉ］で表される化合物である２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ２−フェノキシアセチルグアノシン１．１０ｇを得た。
【００５９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．８４（１Ｈ，ｂｒｓ），１１．７０（１Ｈ，ｂｒｓ），８．３０（１Ｈ，ｓ），７．８０−７．７５（２Ｈ，ｍ），７．５８−７．５４（１Ｈ，ｍ），７．４５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．３８−７．３０（２Ｈ，ｍ），７．００−６．９８（３Ｈ，ｍ），６．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ），５．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９＆７．３Ｈｚ），５．３３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．８＆７．２Ｈｚ），５．１４（１Ｈ，ｂｒｓ），４．９０（２Ｈ，ｓ），４．２８−４．２５（１Ｈ，ｍ），３．６７−３．６０（２Ｈ，ｍ）
【００６０】
＜実施例６＞
２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）−Ｎ２−フェノキシアセチルグアノシン（式［ＩＩ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ２−フェノキシアセチルグアニン，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル）の合成
【００６１】
実施例６では、参考例４で合成した粗２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ２−フェノキシアセチルグアノシン（式［Ｉ］：Ｂ＝Ｎ２−フェノキシアセチルグアニン，Ｒ１＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）を用い、目的物として式［ＩＩ］で示される化合物である２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）−Ｎ２−フェノキシアセチルグアノシンを合成した。具体的には、粗２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ２−フェノキシアセチルグアノシン５０ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．５ｍｌ）に溶解し、ビストリメチルシリルアセタミド１５μｌ（０．０６ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で３０分間攪拌した。氷冷下で酸化銀（Ｉ）２３ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）、テトラエチルアンモニウムヨージド１３ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）、および２−シアノエトキシメチルクロリド（式［ＩＩＩ］：Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）１４ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）を加え、４℃で３０分間攪拌した。反応液にアセトンおよび８０％酢酸水を加え、減圧下で濃縮した。残渣をＨＰＬＣで分析し、目的物の合成収率（参考例４で原料としたＮ２−フェノキシアセチルグアノシンに対する収率）を算出した（４９％）。
【００６２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．８０（１Ｈ，ｂｒｓ），１１．７８（１Ｈ，ｂｒｓ），８．３０（１Ｈ，ｓ），７．３４−７．３０（２Ｈ，ｍ），７．００−６．９７（３Ｈ，ｍ），５．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），５．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），５．０９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），４．８７（２Ｈ，ｓ），４．７７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０＆６．１Ｈｚ），４．３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．８＆８．１Ｈｚ），３．９７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．９＆７．４Ｈｚ），３．６８−３．５６（３Ｈ，ｍ），３．４６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝５．２，６．７＆１２．１Ｈｚ），２．６９−２．５６（２Ｈ，ｍ）
【００６３】
＜実施例７＞
本発明のアルキル化反応における２’位選択性を向上させるために反応条件を種々検討した。反応条件とアルキル化の選択性を以下の表１に示す。その結果、反応にはルイス塩基および銀化合物は必須であり、５’位水酸基に保護基（Ｒ１）を有していなくとも、２’位に選択的にアルキル型保護基を導入できることが明らかとなった。
【表１】
【００６４】
＜実施例８＞
２’−Ｏ−メトキシメチルウリジン（式ＩＩ：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝メトキシメチル）の合成
【００６５】
実施例８では、参考例１で合成した２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ1＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）を用い、目的物として式［ＩＩ］で示される化合物である２’−Ｏ−メトキシメチルウリジンを合成した。具体的には２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン３３ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）をトルエン（１．０ｍｌ）に懸濁し、ビストリメチルシリルアセタミド２７μｌ（０．１１ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で６０分間攪拌した。得られた溶液に、氷冷下で酸化銀（Ｉ）１１６ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、メトキシメチルクロリド（式ＩＩＩ：Ｒ２＝メトキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）１６ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン２８μｌ（０．２ｍｍｏｌ）のトルエン（０．５ｍｌ）溶液を加え、６０℃で５時間攪拌した。反応液にメタノールおよび８０％酢酸水を加え、減圧下で濃縮した。残渣をＨＰＬＣで分析し、目的物の合成収率（２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジンに対する収率）を算出した（７３％）。
【００６６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），５．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ），５．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），４．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），４．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），４．１４−４．１１（２Ｈ，ｍ），３．８９−３．８８（１Ｈ，ｍ），３．６４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９＆１２．２Ｈｚ），３．５８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８＆１２．１Ｈｚ），３．２２（３Ｈ，ｓ）
【００６７】
＜実施例９＞
２’−Ｏ−ベンジルオキシメチルウリジン（式ＩＩ：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝ベンジルオキシメチル）の合成
【００６８】
実施例９では、参考例１で合成した２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ1＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）を用い、目的物として式［ＩＩ］で示される化合物である２’−Ｏ−ベンジルオキシメチルウリジンを合成した。具体的には２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン３３ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）をトルエン（１．０ｍｌ）に懸濁し、ビストリメチルシリルアセタミド２７μｌ（０．１１ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で６０分間攪拌した。得られた溶液に、氷冷下で酸化銀（Ｉ）１１６ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、ベンジルオキシメチルクロリド（式ＩＩＩ：Ｒ２＝ベンジルオキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）３１ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン２８μｌ（０．２ｍｍｏｌ）のトルエン（０．５ｍｌ）溶液を加え、６０℃で５時間攪拌した。反応液にメタノールおよび８０％酢酸水を加え、減圧下で濃縮した。残渣をＨＰＬＣで分析し、目的物の合成収率（２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジンに対する収率）を算出した（７２％）。
【００６９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：δ８．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．９０−７．２３（５Ｈ，ｍ），６．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ），５．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），４．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ），４．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ），４．３５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），４．２８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），４．０４−４．０２（１Ｈ，ｍ），３．８５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．５＆１２．３Ｈｚ），３．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９＆１２．３Ｈｚ）
【００７０】
＜実施例１０＞
２’−Ｏ−ピバロイルオキシメチルウリジン（式ＩＩ：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝ピバロイルオキシメチル）の合成
【００７１】
実施例１０では、参考例１で合成した２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ1＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）を用い、目的物として式［ＩＩ］で示される化合物である２’−Ｏ−ピバロイルオキシメチルウリジンを合成した。具体的には２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン３３０ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）をトルエン（１０ｍｌ）に懸濁し、ビストリメチルシリルアセタミド２７０μｌ（１．１ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で６０分間攪拌した。得られた溶液に、氷冷下で酸化銀（Ｉ）１．１６ｇ（５．０ｍｍｏｌ）、ピバロイルオキシメチルクロリド（式ＩＩＩ：Ｒ２＝ピバロイルオキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）３０１ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン２８０μｌ（２．０ｍｍｏｌ）のトルエン（０．５ｍｌ）溶液を加え、６０℃で５時間攪拌した。反応液にメタノールおよび８０％酢酸水を加え、減圧下で濃縮した。残渣をＨＰＬＣで分析し、目的物の合成収率（２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジンに対する収率）を算出した（７２％）。
【００７２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．３５（１Ｈ，ｂｒｓ），７．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．２７（１Ｈ，ｂｒｓ），６．６７（１Ｈ，ｂｒｓ），５．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），５．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），５．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），５．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），４．２６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），４．１５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ），３．９０−３．８８（１Ｈ，ｍ），３．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８＆１２．２Ｈｚ），３．５７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９＆１２．１Ｈｚ），１．１１（９Ｈ，ｓ）
【００７３】
＜実施例１１＞
２’−Ｏ−メトキシメチル−Ｎ４−アセチルシチジン（式ＩＩ：ＢＡＳＥ＝Ｎ４−アセチルシトシン，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝メトキシメチル）の合成
【００７４】
実施例１１では、参考例２で合成した２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ４−アセチルシチジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ４−アセチルシトシン，Ｒ1＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）を用い、目的物として式［ＩＩ］で示される化合物である２’−Ｏ−メトキシメチル−Ｎ４−アセチルシチジンを合成した。具体的には２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ４−アセチルシチジン８２ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３．０ｍｌ）に懸濁し、氷冷下で酸化銀（Ｉ）４６ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）、テトラエチルアンモニウムヨージド３７ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）、およびメトキシメチルクロリド（式ＩＩＩ：Ｒ２＝メトキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）１８ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。さらにメトキシメチルクロリド（式ＩＩＩ：Ｒ２＝メトキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）１８ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間攪拌した。反応液にメタノールおよび８０％酢酸水を加え、減圧下で濃縮した。残渣をＨＰＬＣで分析し、目的物の合成収率（２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ４−アセチルシチジンに対する収率）を算出した（５６％）。
【００７５】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．９０（１Ｈ，ｂｒｓ），８．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），５．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），５．２４−５．２１（２Ｈ，ｍ），４．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），４．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），４．１０−４．０６（２Ｈ，ｍ），３．９４−３．９２（１Ｈ，ｍ），３．７９−３．７５（１Ｈ，ｍ），３．６４−３．６０（１Ｈ，ｍ），３．２９（３Ｈ，ｓ），２．５１（３Ｈ，ｓ）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リボース部分の２’および３’位の水酸基が保護されていないリボ核酸において、２’位水酸基にアルキル基を優先的に導入することが可能な方法により２’位水酸基にアルキル型保護基が導入されたリボ核酸の製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、オリゴリボ核酸（オリゴＲＮＡ）は、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アプタマーなどの医薬品素材となる機能性分子として注目され、世界中で医薬品としての開発が進められている。
【０００３】
しかしながら、これらＲＮＡ分子を医薬品として開発する上での重要な課題の１つに、オリゴＲＮＡの製造コストが挙げられ、大きな問題となっている。
【０００４】
オリゴＲＮＡの製造方法としては、ホスホロアミダイト法という固相合成法が広く知られている。かかるホスホロアミダイト法は、リボ核酸のリボース部分の３’位の水酸基がホスホロアミダイト化されたリボ核酸（いわゆるホスホロアミダイト化合物）を用いて、複数の核酸モノマーを縮合しオリゴマー化していく方法である。
【０００５】
ホスホロアミダイト法を用いたＲＮＡ合成において、２’位水酸基の保護基の構造は、縮合効率や合成されるＲＮＡの純度に大きく影響を与えることが知られており、近年、種々のアルキル型保護基が開発されている（非特許文献１〜９）。
【０００６】
これらを保護基としたホスホロアミダイト化合物は、従来、保護基として用いられているｔ−ブチルジメチルシリル基を有する化合物と比較して、その縮合反応において、高い反応性を示し、オリゴＲＮＡ合成のモノマー原料として有用であることが明らかとなっている。特に、２−シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）基を保護基として用いたホスホロアミダイト法によるＲＮＡ合成において、高い縮合効率で高純度な長鎖ＲＮＡを合成できることが明らかとなり（非特許文献３，１０）、ＲＮＡ医薬品の製造における有用な合成原料として期待されている。
【０００７】
一般に、ＣＥＭ基に代表されるアルキル型保護基のリボ核酸の２’位水酸基への導入法としては、３’位と５’位の水酸基がケイ素置換基で保護された状態で選択的にアルキル化を行うか（方法Ａ）、もしくは５’位の水酸基が保護されたリボ核酸を用い、これを２’位および３’位の水酸基がアルキルスタレンニル基で保護された２’，３’−Ｏ−ジアルキルスタニレン誘導体へ変換し、当該誘導体に対し、非選択的にアルキル化を行った後、目的外の異性体を分離する方法（方法Ｂ）が用いられている（非特許文献１−９，特許文献１）。
【０００８】
しかしながら、上記のようなリボ核酸の２’位水酸基への保護基の導入法において、方法Ａの場合には３’位および５’位の水酸基に保護基を導入するために高価な試薬を用い、さらに反応工程が長くなること、また方法Ｂの場合には人体に有害な有機スズ試薬を用いることや５’位水酸基を４，４’−ジメトキシトリチルのような脂溶性の高い保護基を用いて保護する必要があるため、異性体を分離するためにシリカゲルカラムクロマトグラフィーのような煩雑な分離精製手段を必要とすることなどの理由から、工業的な製法としては満足のいく方法ではなかった。このため、ＲＮＡ医薬品原料としての核酸モノマーの工業的製造法としては、より効率的な２’位水酸基への保護基導入法の開発が切望されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公報ＷＯ２００６／０２２３２３ Ａ１パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．３５，６８２７（１９９４）
【非特許文献２】Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．ｖｏｌ．８４，３７７３（２００１）
【非特許文献３】Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ，Ｖｏｌ．７，３４７７（２００５）
【非特許文献４】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１２８，１２３５６（２００６）
【非特許文献５】Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．８，３８６９（２００６）
【非特許文献６】Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５，３３３（２００７）
【非特許文献７】Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．９，６７１（２００７）
【非特許文献８】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．４５，９５２９（２００４）
【非特許文献９】Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，Ｖｏｌ．１４，９１３５（２００８）
【非特許文献１０】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３５，３２８７（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明は、３’位と５’位の水酸基が保護されていない状態、あるいは５’位のみが保護されている状態のリボ核酸を用い、２’位水酸基に選択的かつ効率良く、しかも短工程で２−シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）基などのアルキル型保護基を導入し、結晶化などの簡単な精製手段で目的のリボ核酸を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、実用的なリボ核酸の２’位水酸基への保護基導入法を確立すべく鋭意検討を重ねた結果、常法により調製できる式［Ｉ］で表されるリボ核酸のボロン酸エステル体を、ルイス塩基および銀化合物の存在下、式［ＩＩＩ］で表されるアルキル化剤と反応させるという簡便な方法で、式［ＩＩ］で表される２’位にアルキル型保護基が導入されたリボ核酸を選択的かつ効率的に取得できることを見出し、本発明を完成させた。したがって、本発明は以下の通りである。
【００１３】
（１）式［Ｉ］で表されるリボ核酸のボロン酸エステル体を、ルイス塩基および銀化合物の存在下、式［ＩＩＩ］で表されるアルキル化剤と反応させ、式［ＩＩ］で表される化合物を調製することを特徴とする２’位にアルキル型保護基を有するリボ核酸の製造法。
（式中、ＢＡＳＥは保護基を有していてもよい核酸塩基を示し、Ｒ１は水素原子または水酸基の保護基を示し、Ｒ２はアルキル基を示し、Ｘは脱離基を示し、Ａｒはアリール基を示す。）
【００１４】
（２）Ｒ２で表されるアルキル基が、メチル、エチル、アリル、２−シアノエチル、２−トリメチルシリルエチル、ベンジル、メトキシメチル、エトキシメチル、２−シアノエトキシメチル、ベンジルオキシメチル、ピバロイルオキシメチル、アセチルオキシメチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、またはトリイソプロピルシリルオキシメチルから選択されたアルキル基である、上記（１）記載の製造法。
【００１５】
（３）ルイス塩基が、３価リン試薬、ヨードアニオン、または３級アミン類である、請求項１記載の製造法。
（４）銀化合物が、酸化銀、炭酸銀、酢酸銀、または硝酸銀である、上記（１）記載の製造法。
（５）結晶化により式［ＩＩ］で表される化合物を単離する、上記（１）記載の製造法。
すなわち、上記式［Ｉ］で表されるリボ核酸のボロン酸エステル体を式［ＩＩＩ］で表されるアルキル化剤と反応させ、調製した式［ＩＩ］で表される化合物を含む反応物を結晶化して式［ＩＩ］で表される化合物を単離することを特徴とする（１）記載の製造方法である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明方法は、３’位および５’位の水酸基に保護基が導入されていないリボ核酸もしくは３’位水酸基に保護基が導入されていないリボ核酸であっても、リボースの２’位水酸基に、短工程で選択的にかつ効率よくアルキル型保護基を導入することができ、さらに得られた化合物は結晶化などを利用して容易に精製することができることから、オリゴＲＮＡの化学合成原料である２’−Ｏ−アルキルリボ核酸の効率的な製法として有用である。
【００１７】
特に、短工程で効率良く調製することが困難であった２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）リボヌクレオシドを、工業的スケールで簡便に製造することが初めて可能となり、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡ医薬品をより安価に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明方法は、上述したように、式［Ｉ］で表されるリボ核酸のボロン酸エステル体を、ルイス塩基および銀化合物の存在下、式［ＩＩＩ］で表されるアルキル化剤と反応させ、式［ＩＩ］で表される２’位にアルキル型保護基が導入されたリボ核酸を製造しようとするものである。
【００１９】
原料として利用する式［Ｉ］で表されるリボ核酸のボロン酸エステル体は、常法により調製可能である（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２３２５（１９６１），Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７０，８４００（２００５））。具体的には、原料リボ核酸である式［ＩＶ］で表される化合物と式［Ｖ］で表されるボロン酸試薬を共沸脱水することで、式［Ｉ］で表されるリボ核酸のボロン酸エステル体を容易に取得することができる。
【００２０】
式［ＩＶ］で示される化合物におけるＢＡＳＥは、核酸塩基を意味し、当該核酸塩基としては保護基を有していてもかまわない。具体的には、ウラシル、Ｎ６−アセチルアデニン、Ｎ６−ベンゾイルアデニン、Ｎ４−アセチルシトシン、Ｎ４−ベンゾイルシトシン、Ｎ２−フェノキシアセチルグアニン、Ｎ２−イソブチリルグアニンなどを例示することができる。
【００２１】
また、式［ＩＶ］で示される化合物におけるＲ１は、水素原子または水酸基の保護基を意味する。当該水酸基の保護基としては、アセチル、ベンゾイルなどのアシル基、トリチル、４−メトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル、ベンジルなどのアルキル基、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリルなどのシリル基を例示することができる。
【００２２】
式［Ｖ］で示されるボロン酸試薬におけるＡｒは、アリール基を意味し、具体的には、フェニル基もしくはアルキルやハロゲンなどの置換基を有するフェニル基などが例示され、置換基の位置や数は特に限定されない。
【００２３】
式［Ｉ］で示されるリボ核酸のボロン酸エステル体の調製法は、式［ＩＶ］で示される化合物１モルに対し、１モル以上の式［Ｖ］で示されるボロン酸試薬を用い、ピリジン、トルエン、１，４−ジオキサン、アセトニトリルなどの単独またはそれらの混合溶媒中で、１〜５回程度共沸脱水することで実施することができる。また、必要に応じて加熱還流などの加熱処理を行ってもかまわない。
【００２４】
このようにして得られた、式［Ｉ］で示されるリボ核酸のボロン酸エステル体は、溶媒を留去した後、そのまま本発明方法の原料として使用してもよく、必要に応じて、結晶化による精製を行った後に使用してもかまわない。
【００２５】
本発明方法で使用するアルキル化剤は式［ＩＩＩ］で表される化合物であり、Ｒ２のアルキル基としては、メチル、エチル、アリル、２−シアノエチル、２−トリメチルシリルエチル、ベンジル、メトキシメチル、エトキシメチル、２−シアノエトキシメチル、ベンジルオキシメチル、ピバロイルオキシメチル、アセチルオキシメチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、トリイソプロピルシリルオキシメチルなどのアルキル基を例示することができ、導入するアルキル基に応じて適宜選択すればよい。
【００２６】
また、アルキル化剤におけるＸの脱離基としては、クロロ、ブロモ、ヨードなどのハロゲン原子、アセテートなどのカルボキシレート基、メタンスルホネート基、ｐ−トルエンスルホネート基、トリフルオロメタンスルホネート基などを例示することができ、特にＸがハロゲン原子、好ましくはクロロであるアルキル化剤が選択性と収率の点で好適である。
【００２７】
銀化合物としては、酸化銀、炭酸銀、酢酸銀、硝酸銀などが例示でき、特に酸化銀（Ｉ）が好適である。銀化合物の使用量は、式［Ｉ］で示される化合物１モルに対して１〜１０モルが適当である。
【００２８】
ルイス塩基としては、ルイス塩基性を有するものであればよく、具体的にはトリアルキルホスファイトやトリアルキルホスフィンなどの３価リン試薬、テトラブチルアンモニウムヨージドやテトラエチルアンモニウムヨージドといったカウンターイオンとして４級アンモニウムなどを含むヨードアニオン、トリエチルアミン、トリブチルアミンなどの３級アミン類を用いることができ、その使用量は式［Ｉ］で示される化合物１モルに対して０．１〜１０モルが適当である。
【００２９】
このような試薬を用いる２’位水酸基へのアルキル化反応は、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トルエン、アセトン、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタンなどの単独または混合溶媒中、銀化合物およびルイス塩基の存在下、式［ＩＩＩ］で示されるアルキル化剤を式［Ｉ］で示される化合物１モルに対して０．５〜１０モル程度使用し、反応温度−７８℃〜１２０℃で１〜２４時間程度反応させることにより実施することができる。
【００３０】
また、必要に応じて、式［Ｉ］で示されるリボ核酸のボロン酸エステル体を、ビストリメチルシリルアセタミドなどのシリル化剤で処理することで５’位水酸基および塩基部をシリル化して、有機溶媒に対する溶解性を向上させた後、上記のアルキル化反応を実施することで、収率よく目的化合物を取得することが可能である。
【００３１】
このようにして合成された目的の式［ＩＩ］で示される化合物は、必要により通常のヌクレオシド誘導体の精製手段（有機溶媒−水による分配、各種クロマトグラフィー処理、結晶化）により単離精製することができるが、特に結晶化などの簡単な手段で単離できるのが特長である。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。
【００３３】
＜実施例１＞
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン（式［ＩＩ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル），Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル）の合成
【００３４】
実施例１では、式［ＩＶ］で示されるリボ核酸として５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（式［ＩＶ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル），Ｒ２＝Ｈ）を原料とし、式［ＩＩ］で示される化合物として５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンを合成した。具体的には、まず、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン１０９ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）とボロン酸試薬であるフェニルボロン酸（式［Ｖ］：Ａｒ＝Ｐｈ）２６ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を酢酸エチルに溶解し、減圧下で濃縮した後、残渣をトルエンで３回共沸脱水し、式［Ｉ］で示される化合物として５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル），Ａｒ＝Ｐｈ）を得た。これをトルエン（２ｍｌ）に溶解し、氷冷下で、銀化合物としての酸化銀（Ｉ）２３２ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）、アルキル化剤としての２−シアノエトキシメチルクロリド（式［ＩＩＩ］：Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）４８ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン５６μｌ（０．４ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（１ｍｌ）を加え、６０℃で１００分間攪拌した。反応液にメタノールおよび水を加え、減圧下で濃縮した。残渣をＨＰＬＣで分析し、目的物の合成収率を算出した（５２％）。
【００３５】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．４０（１Ｈ，ｂｒｓ），７．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．３９−７．２４（９Ｈ，ｍ），６．９１（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），５．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ），５．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），５．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），４．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），４．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），４．２８−４．２２（２Ｈ，ｍ），４．００−３．９７（１Ｈ，ｍ），３．７４−３．６６（８Ｈ，ｍ），３．３４−３．２２（２Ｈ，ｍ），２．８２−２．７３（２Ｈ，ｍ）
【００３６】
＜参考例１＞
２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）の合成
【００３７】
式［ＩＶ］で示されるリボ核酸としてウリジン（式［ＩＶ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝Ｈ）７３３ｍｇ（３．０ｍｍｏｌ）を用い、これとフェニルボロン酸（式［Ｖ］：Ａｒ＝Ｐｈ）３８５ｍｇ（３．０ｍｍｏｌ）をピリジンに溶解し、ピリジンで３回、１，４−ジオキサンで３回共沸脱水した。さらに１，４−ジオキサン（１５ｍｌ）に溶解し、１００℃で１時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。残渣にアセトニトリル（４ｍｌ）を加え、室温で５分間攪拌した。析出した結晶をろ過し、乾燥して式［Ｉ］で表される化合物である２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジンを目的物として８６６ｍｇ（８７％）、得た。
【００３８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．４６（１Ｈ，ｂｒｓ），７．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．７４（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２＆８．０Ｈｚ），７．５７−７．５３（１Ｈ，ｍ），７．４３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），５．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），５．６９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２＆８．０Ｈｚ）５．２８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．０＆７．５Ｈｚ），５．１１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．０４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．４＆７．５Ｈｚ），４．１３（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝４．７Ｈｚ），３．７２−３．６３（２Ｈ，ｍ）
【００３９】
＜実施例２＞
２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン（式［ＩＩ］：Ｂ＝ウラシル，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル）の合成
【００４０】
実施例２では、参考例１で合成した２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）を用い、目的物として式［ＩＩ］で示される化合物である２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンを合成した。具体的には、２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン３３ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）をトルエン（１．０ｍｌ）に懸濁し、ビストリメチルシリルアセタミド２７μｌ（０．１１ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で３０分間攪拌した。得られた溶液に、氷冷下で酸化銀（Ｉ）１１６ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、２−シアノエトキシメチルクロリド（式［ＩＩＩ］：Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）２４ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン２８μｌ（０．２ｍｍｏｌ）のトルエン（０．５ｍｌ）溶液を加え、６０℃で５時間攪拌した。反応液にメタノールおよび８０％酢酸水を加え、減圧下で濃縮した。残渣をＨＰＬＣで分析し、目的物の合成収率（２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジンに対する収率）を算出した（７３％）。
【００４１】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．３６（１Ｈ，ｂｒｓ），７．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），５．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），５．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），５．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．１７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），４．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．７７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．１７−４．１１（２Ｈ，ｍ），３．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．０＆７．５Ｈｚ），３．７２−３．５５（４Ｈ，ｍ），２．７８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝５．４，６．６＆１７．１Ｈｚ），２．７２（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝５．４，７．０＆１７．１Ｈｚ）
【００４２】
＜実施例３＞
２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン（式［ＩＩ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル）の合成
【００４３】
２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）３３０ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）をトルエン（１０ｍｌ）に懸濁し、ビストリメチルシリルアセタミド２７０μｌ（１．１ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で３０分間攪拌した。得られた溶液に、氷冷下で酸化銀（Ｉ）１．１６ｇ（５．０ｍｍｏｌ）、２−シアノエトキシメチルクロリド（式［ＩＩＩ］：Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）２４０ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン２８０μｌ（２．０ｍｍｏｌ）のトルエン（５ｍｌ）溶液を加え、６０℃で５時間攪拌した。反応液にメタノールおよび８０％酢酸水を加え、減圧下で濃縮した。残渣を逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィーに付して試薬残渣を除去した後、エタノールより結晶化することにより３’−異性体を分離し、目的物を得た。
【００４４】
＜参考例２＞
２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ４−アセチルシチジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ４−アセチルシトシン，Ｒ１＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）の合成
【００４５】
式［ＩＶ］で示されるリボ核酸としてＮ４−アセチルシチジン（式［ＩＶ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ４−アセチルシトシン，Ｒ１＝Ｈ）８５６ｍｇ（３．０ｍｍｏｌ）を用い、これとフェニルボロン酸（式［Ｖ］：Ａｒ＝Ｐｈ）３８５ｍｇ（３．０ｍｍｏｌ）をピリジンに溶解し、ピリジンで３回、１，４−ジオキサンで３回共沸脱水した。さらに１，４−ジオキサン（１５ｍｌ）に溶解し、１００℃で１時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。残渣にアセトニトリル（６ｍｌ）を加え、４℃で３０分間攪拌した。析出した結晶をろ過し、乾燥して式［Ｉ］で表される化合物である２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ４−アセチルシチジンを目的物として１．０ｇ（モノアセトニトリル含有結晶，８１％）、得た。
【００４６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．９８（１Ｈ，ｂｒｓ），８．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．７５（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２＆８．０Ｈｚ），７．５７−７．５４（１Ｈ，ｍ），７．４４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），５．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），５．３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．３＆７．３Ｈｚ），５．１２−５．０８（２Ｈ，ｍ），４．２５（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），３．７４（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．９＆１１．７Ｈｚ），３．６９−３．５７（１Ｈ，ｍ），２．１２（３Ｈ，ｓ）
【００４７】
＜実施例４＞
２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）−Ｎ４−アセチルシチジン（式［ＩＩ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ４−アセチルシトシン，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル）の合成
【００４８】
実施例４では、参考例２で合成した２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ４−アセチルシチジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ４−アセチルシチジン，Ｒ１＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）を用い、目的物として式［ＩＩ］で示される化合物である２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）−Ｎ４−アセチルシチジンを合成した。具体的には、２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ４−アセチルシチジン４１ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．０ｍｌ）に懸濁し、氷冷下で酸化銀（Ｉ）２３ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）、テトラエチルアンモニウムヨージド１３ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）、および２−シアノエトキシメチルクロリド（式［ＩＩＩ］：Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）１３ｍｇ（０．１１ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間攪拌した。反応液にメタノールおよび８０％酢酸水を加え、減圧下で濃縮した。残渣をＨＰＬＣで分析し、目的物の合成収率（２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ４−アセチルシチジンに対する収率）を算出した（６２％）。
【００４９】
また、もう少し大量に目的化合物を合成するため、２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ４−アセチルシチジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ４−アセチルシトシン，Ｒ１＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）４１２ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１４．０ｍｌ）に懸濁し、氷冷下で酸化銀（Ｉ）２３２ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）、テトラエチルアンモニウムヨージド１２９ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、および２−シアノエトキシメチルクロリド（式［ＩＩＩ］：Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）１３２ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）を加え、４℃で３．５時間攪拌した。反応液にメタノールおよび８０％酢酸水を加え、減圧下で濃縮した。残渣を逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィーに付して試薬残渣を除去した後、メタノールより結晶化することにより目的外の３’−異性体を分離し、目的物を得た。
【００５０】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．８８（１Ｈ，ｂｒｓ），８．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），５．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ），５．２４−５．１９（２Ｈ，ｍ），４．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．１２−４．０８（２Ｈ，ｍ），３．９４−３．９１（１Ｈ，ｍ），３．８１−３．６０（４Ｈ，ｍ），２．８０−２．７５（２Ｈ，ｍ），２．１０（３Ｈ，ｓ）
【００５１】
＜参考例３＞
２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ６−アセチルアデノシン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ６−アセチルアデニン，Ｒ１＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）の合成
【００５２】
式［ＩＶ］で示されるリボ核酸としてＮ６−アセチルアデノシン（式［ＩＶ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ６−アセチルアデニン，Ｒ１＝Ｈ）６００ｍｇ（１．９ｍｍｏｌ）を用い、これとフェニルボロン酸（式［Ｖ］：Ａｒ＝Ｐｈ）２４４ｍｇ（１．９ｍｍｏｌ）をピリジンに溶解し、ピリジンで３回、１，４−ジオキサンで３回共沸脱水した。さらに１，４−ジオキサン（１０ｍｌ）に溶解し、１００℃で１時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。残渣にアセトニトリル（３ｍｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した。析出した結晶をろ過し、乾燥して式［Ｉ］で表される化合物である２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ６−アセチルアデノシンを目的物として６７３ｍｇ（９０％）、得た。
【００５３】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．９８（１Ｈ，ｂｒｓ），８．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．７５（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２＆８．０Ｈｚ），７．５７−７．５４（１Ｈ，ｍ），７．４４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），５．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），５．３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．３＆７．３Ｈｚ），５．１２−５．０８（２Ｈ，ｍ），４．２５（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），３．７４（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．９＆１１．７Ｈｚ），３．６９−３．５７（１Ｈ，ｍ），２．１２（３Ｈ，ｓ）
【００５４】
＜実施例５＞
２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）−Ｎ６−アセチルアデノシン（式［ＩＩ］：Ｂ＝Ｎ６−アセチルアデニン，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル）の合成
【００５５】
実施例５では、参考例３で合成した２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ６−アセチルアデノシン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ６−アセチルアデニン，Ｒ１＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）を用い、目的物として式［ＩＩ］で示される化合物である２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）−Ｎ６−アセチルアデノシンを合成した。具体的には、２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ６−アセチルアデノシン４０ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン（１．５ｍｌ）に溶解し、室温で酸化銀（Ｉ）２３ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）、テトラエチルアンモニウムヨージド１３ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）、および２−シアノエトキシメチルクロリド（式［ＩＩＩ］：Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）１８ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）を加え、室温で７時間攪拌した。反応液にメタノールおよび８０％酢酸水を加え、減圧下で濃縮した。残渣をＨＰＬＣで分析し、目的物の合成収率（２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ６−アセチルアデノシンに対する収率）を算出した（４０％）。
【００５６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．６９（１Ｈ，ｂｒｓ），８．７２（１Ｈ，ｓ），８．６６（１Ｈ，ｓ），６．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），５．１７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），４．７８−４．７３（３Ｈ，ｍ），４．３７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０＆９．０Ｈｚ），４．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．８＆７．７Ｈｚ），３．７１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝４．２，５．０＆１２．０Ｈｚ），３．６３−３．５７（２Ｈ，ｍ），３．４６−３．４１（１Ｈ，ｍ），２．６３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝５．２，６．７＆１７．０Ｈｚ），２．５５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝５．３，７．３＆１７．１Ｈｚ），２．２６（３Ｈ，ｓ）
【００５７】
＜参考例４＞
２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ２−フェノキシアセチルグアノシン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ２−フェノキシアセチルグアニン，Ｒ１＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）の合成
【００５８】
式［ＩＶ］で示されるリボ核酸としてＮ２−フェノキシアセチルグアノシン（式［ＩＶ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ２−フェノキシアセチルグアニン，Ｒ１＝Ｈ）８３５ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）を用い、これとフェニルボロン酸（式［Ｖ］：Ａｒ＝Ｐｈ）２５７ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）をピリジンに溶解し、ピリジンで３回、１，４−ジオキサンで３回共沸脱水した。さらに１，４−ジオキサン（１０ｍｌ）に溶解し、１００℃で１時間攪拌した後、減圧下で濃縮し、未精製の目的物として式［Ｉ］で表される化合物である２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ２−フェノキシアセチルグアノシン１．１０ｇを得た。
【００５９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．８４（１Ｈ，ｂｒｓ），１１．７０（１Ｈ，ｂｒｓ），８．３０（１Ｈ，ｓ），７．８０−７．７５（２Ｈ，ｍ），７．５８−７．５４（１Ｈ，ｍ），７．４５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．３８−７．３０（２Ｈ，ｍ），７．００−６．９８（３Ｈ，ｍ），６．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ），５．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９＆７．３Ｈｚ），５．３３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．８＆７．２Ｈｚ），５．１４（１Ｈ，ｂｒｓ），４．９０（２Ｈ，ｓ），４．２８−４．２５（１Ｈ，ｍ），３．６７−３．６０（２Ｈ，ｍ）
【００６０】
＜実施例６＞
２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）−Ｎ２−フェノキシアセチルグアノシン（式［ＩＩ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ２−フェノキシアセチルグアニン，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル）の合成
【００６１】
実施例６では、参考例４で合成した粗２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ２−フェノキシアセチルグアノシン（式［Ｉ］：Ｂ＝Ｎ２−フェノキシアセチルグアニン，Ｒ１＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）を用い、目的物として式［ＩＩ］で示される化合物である２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）−Ｎ２−フェノキシアセチルグアノシンを合成した。具体的には、粗２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ２−フェノキシアセチルグアノシン５０ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．５ｍｌ）に溶解し、ビストリメチルシリルアセタミド１５μｌ（０．０６ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で３０分間攪拌した。氷冷下で酸化銀（Ｉ）２３ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）、テトラエチルアンモニウムヨージド１３ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）、および２−シアノエトキシメチルクロリド（式［ＩＩＩ］：Ｒ２＝２−シアノエトキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）１４ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）を加え、４℃で３０分間攪拌した。反応液にアセトンおよび８０％酢酸水を加え、減圧下で濃縮した。残渣をＨＰＬＣで分析し、目的物の合成収率（参考例４で原料としたＮ２−フェノキシアセチルグアノシンに対する収率）を算出した（４９％）。
【００６２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．８０（１Ｈ，ｂｒｓ），１１．７８（１Ｈ，ｂｒｓ），８．３０（１Ｈ，ｓ），７．３４−７．３０（２Ｈ，ｍ），７．００−６．９７（３Ｈ，ｍ），５．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），５．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），５．０９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），４．８７（２Ｈ，ｓ），４．７７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０＆６．１Ｈｚ），４．３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．８＆８．１Ｈｚ），３．９７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．９＆７．４Ｈｚ），３．６８−３．５６（３Ｈ，ｍ），３．４６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝５．２，６．７＆１２．１Ｈｚ），２．６９−２．５６（２Ｈ，ｍ）
【００６３】
＜実施例７＞
本発明のアルキル化反応における２’位選択性を向上させるために反応条件を種々検討した。反応条件とアルキル化の選択性を以下の表１に示す。その結果、反応にはルイス塩基および銀化合物は必須であり、５’位水酸基に保護基（Ｒ１）を有していなくとも、２’位に選択的にアルキル型保護基を導入できることが明らかとなった。
【表１】
【００６４】
＜実施例８＞
２’−Ｏ−メトキシメチルウリジン（式ＩＩ：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝メトキシメチル）の合成
【００６５】
実施例８では、参考例１で合成した２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ1＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）を用い、目的物として式［ＩＩ］で示される化合物である２’−Ｏ−メトキシメチルウリジンを合成した。具体的には２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン３３ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）をトルエン（１．０ｍｌ）に懸濁し、ビストリメチルシリルアセタミド２７μｌ（０．１１ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で６０分間攪拌した。得られた溶液に、氷冷下で酸化銀（Ｉ）１１６ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、メトキシメチルクロリド（式ＩＩＩ：Ｒ２＝メトキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）１６ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン２８μｌ（０．２ｍｍｏｌ）のトルエン（０．５ｍｌ）溶液を加え、６０℃で５時間攪拌した。反応液にメタノールおよび８０％酢酸水を加え、減圧下で濃縮した。残渣をＨＰＬＣで分析し、目的物の合成収率（２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジンに対する収率）を算出した（７３％）。
【００６６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），５．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ），５．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），４．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），４．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），４．１４−４．１１（２Ｈ，ｍ），３．８９−３．８８（１Ｈ，ｍ），３．６４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９＆１２．２Ｈｚ），３．５８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８＆１２．１Ｈｚ），３．２２（３Ｈ，ｓ）
【００６７】
＜実施例９＞
２’−Ｏ−ベンジルオキシメチルウリジン（式ＩＩ：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝ベンジルオキシメチル）の合成
【００６８】
実施例９では、参考例１で合成した２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ1＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）を用い、目的物として式［ＩＩ］で示される化合物である２’−Ｏ−ベンジルオキシメチルウリジンを合成した。具体的には２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン３３ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）をトルエン（１．０ｍｌ）に懸濁し、ビストリメチルシリルアセタミド２７μｌ（０．１１ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で６０分間攪拌した。得られた溶液に、氷冷下で酸化銀（Ｉ）１１６ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、ベンジルオキシメチルクロリド（式ＩＩＩ：Ｒ２＝ベンジルオキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）３１ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン２８μｌ（０．２ｍｍｏｌ）のトルエン（０．５ｍｌ）溶液を加え、６０℃で５時間攪拌した。反応液にメタノールおよび８０％酢酸水を加え、減圧下で濃縮した。残渣をＨＰＬＣで分析し、目的物の合成収率（２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジンに対する収率）を算出した（７２％）。
【００６９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：δ８．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．９０−７．２３（５Ｈ，ｍ），６．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ），５．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），４．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ），４．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ），４．３５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），４．２８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），４．０４−４．０２（１Ｈ，ｍ），３．８５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．５＆１２．３Ｈｚ），３．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９＆１２．３Ｈｚ）
【００７０】
＜実施例１０＞
２’−Ｏ−ピバロイルオキシメチルウリジン（式ＩＩ：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝ピバロイルオキシメチル）の合成
【００７１】
実施例１０では、参考例１で合成した２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝ウラシル，Ｒ1＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）を用い、目的物として式［ＩＩ］で示される化合物である２’−Ｏ−ピバロイルオキシメチルウリジンを合成した。具体的には２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジン３３０ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）をトルエン（１０ｍｌ）に懸濁し、ビストリメチルシリルアセタミド２７０μｌ（１．１ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で６０分間攪拌した。得られた溶液に、氷冷下で酸化銀（Ｉ）１．１６ｇ（５．０ｍｍｏｌ）、ピバロイルオキシメチルクロリド（式ＩＩＩ：Ｒ２＝ピバロイルオキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）３０１ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン２８０μｌ（２．０ｍｍｏｌ）のトルエン（０．５ｍｌ）溶液を加え、６０℃で５時間攪拌した。反応液にメタノールおよび８０％酢酸水を加え、減圧下で濃縮した。残渣をＨＰＬＣで分析し、目的物の合成収率（２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデンウリジンに対する収率）を算出した（７２％）。
【００７２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．３５（１Ｈ，ｂｒｓ），７．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．２７（１Ｈ，ｂｒｓ），６．６７（１Ｈ，ｂｒｓ），５．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），５．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），５．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），５．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），４．２６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），４．１５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ），３．９０−３．８８（１Ｈ，ｍ），３．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８＆１２．２Ｈｚ），３．５７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９＆１２．１Ｈｚ），１．１１（９Ｈ，ｓ）
【００７３】
＜実施例１１＞
２’−Ｏ−メトキシメチル−Ｎ４−アセチルシチジン（式ＩＩ：ＢＡＳＥ＝Ｎ４−アセチルシトシン，Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２＝メトキシメチル）の合成
【００７４】
実施例１１では、参考例２で合成した２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ４−アセチルシチジン（式［Ｉ］：ＢＡＳＥ＝Ｎ４−アセチルシトシン，Ｒ1＝Ｈ，Ａｒ＝Ｐｈ）を用い、目的物として式［ＩＩ］で示される化合物である２’−Ｏ−メトキシメチル−Ｎ４−アセチルシチジンを合成した。具体的には２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ４−アセチルシチジン８２ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３．０ｍｌ）に懸濁し、氷冷下で酸化銀（Ｉ）４６ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）、テトラエチルアンモニウムヨージド３７ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）、およびメトキシメチルクロリド（式ＩＩＩ：Ｒ２＝メトキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）１８ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。さらにメトキシメチルクロリド（式ＩＩＩ：Ｒ２＝メトキシメチル，Ｘ＝Ｃｌ）１８ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間攪拌した。反応液にメタノールおよび８０％酢酸水を加え、減圧下で濃縮した。残渣をＨＰＬＣで分析し、目的物の合成収率（２’，３’−Ｏ−フェニルボロニリデン−Ｎ４−アセチルシチジンに対する収率）を算出した（５６％）。
【００７５】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．９０（１Ｈ，ｂｒｓ），８．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），５．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），５．２４−５．２１（２Ｈ，ｍ），４．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），４．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），４．１０−４．０６（２Ｈ，ｍ），３．９４−３．９２（１Ｈ，ｍ），３．７９−３．７５（１Ｈ，ｍ），３．６４−３．６０（１Ｈ，ｍ），３．２９（３Ｈ，ｓ），２．５１（３Ｈ，ｓ）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式［Ｉ］で表されるリボ核酸のボロン酸エステル体を、ルイス塩基および銀化合物の存在下、式［ＩＩＩ］で表されるアルキル化剤と反応させ、式［ＩＩ］で表される化合物を調製することを特徴とする２’位にアルキル型保護基を有するリボ核酸の製造法。
（式中、ＢＡＳＥは保護基を有していてもよい核酸塩基を示し、Ｒ１は水素原子または水酸基の保護基を示し、Ｒ２はアルキル基を示し、Ｘは脱離基を示し、Ａｒはアリール基を示す。）
【請求項２】
Ｒ２で表されるアルキル基が、メチル、エチル、アリル、２−シアノエチル、２−トリメチルシリルエチル、ベンジル、メトキシメチル、エトキシメチル、２−シアノエトキシメチル、ベンジルオキシメチル、ピバロイルオキシメチル、アセチルオキシメチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、またはトリイソプロピルシリルオキシメチルから選択されたアルキル基である、請求項１記載の製造法。
【請求項３】
ルイス塩基が、３価リン試薬、ヨードアニオン、または３級アミン類である、請求項１記載の製造法。
【請求項４】
銀化合物が、酸化銀、炭酸銀、酢酸銀、または硝酸銀である、請求項１記載の製造法。
【請求項５】
結晶化により式［ＩＩ］で表される化合物を単離する、請求項１記載の製造法。
【請求項１】
式［Ｉ］で表されるリボ核酸のボロン酸エステル体を、ルイス塩基および銀化合物の存在下、式［ＩＩＩ］で表されるアルキル化剤と反応させ、式［ＩＩ］で表される化合物を調製することを特徴とする２’位にアルキル型保護基を有するリボ核酸の製造法。
（式中、ＢＡＳＥは保護基を有していてもよい核酸塩基を示し、Ｒ１は水素原子または水酸基の保護基を示し、Ｒ２はアルキル基を示し、Ｘは脱離基を示し、Ａｒはアリール基を示す。）
【請求項２】
Ｒ２で表されるアルキル基が、メチル、エチル、アリル、２−シアノエチル、２−トリメチルシリルエチル、ベンジル、メトキシメチル、エトキシメチル、２−シアノエトキシメチル、ベンジルオキシメチル、ピバロイルオキシメチル、アセチルオキシメチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、またはトリイソプロピルシリルオキシメチルから選択されたアルキル基である、請求項１記載の製造法。
【請求項３】
ルイス塩基が、３価リン試薬、ヨードアニオン、または３級アミン類である、請求項１記載の製造法。
【請求項４】
銀化合物が、酸化銀、炭酸銀、酢酸銀、または硝酸銀である、請求項１記載の製造法。
【請求項５】
結晶化により式［ＩＩ］で表される化合物を単離する、請求項１記載の製造法。
【公開番号】特開２００９−２５６３３５（Ｐ２００９−２５６３３５Ａ）
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−６７４６８（Ｐ２００９−６７４６８）
【出願日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１９年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、機能性ＲＮＡプロジェクト委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【出願人】（０００００６７７０）ヤマサ醤油株式会社 (56)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１９年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、機能性ＲＮＡプロジェクト委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【出願人】（０００００６７７０）ヤマサ醤油株式会社 (56)
【Ｆターム（参考）】
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