ＦｔｓＺの阻害剤およびそれらの用途
【課題】ＦｔｓＺ重合の阻害剤およびそれらの用途。
【解決手段】細菌の成長を阻止する方法を提供し、該方法は、以下の構造を有する１種またはそれ以上の化合物またはそれらの塩の有効量を細菌と接触させる工程を包含する：
ここで、（ａ）Ｘ１およびＸ２は、ＣＨまたはＮであり、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである。（ｂ）Ｓ１は、１個〜８個の炭素原子を含む有機ラジカルである。（ｃ）Ｓ２、Ｓ３およびＳ４は、別個に、水素、アミノ、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む１個またはそれ以上の有機ラジカルから選択される。
【解決手段】細菌の成長を阻止する方法を提供し、該方法は、以下の構造を有する１種またはそれ以上の化合物またはそれらの塩の有効量を細菌と接触させる工程を包含する：
ここで、（ａ）Ｘ１およびＸ２は、ＣＨまたはＮであり、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである。（ｂ）Ｓ１は、１個〜８個の炭素原子を含む有機ラジカルである。（ｃ）Ｓ２、Ｓ３およびＳ４は、別個に、水素、アミノ、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む１個またはそれ以上の有機ラジカルから選択される。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（謝辞）
本発明は、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈから授与された助成ＲＯｌ ＡＩ５０４７０下で、政府の支援により、行われた。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般に、抗菌剤およびそれらの用途（特に、ＦｔｓＺの阻害剤）の分野に関する。
【０００３】
（背景技術）
多くの抗菌剤の作用機構が実証されている。例えば、細菌の細胞壁合成阻害におけるペニシリンおよび他のβ−ラクタム薬物の作用機構は、よく研究されている。しかしながら、他の場合には、作用機構は理解されていない。抗菌化合物は、６つの一般的な作用に分類され、これらには、以下の阻害が挙げられる：１）細胞壁の合成；２）細胞分裂；３）細胞膜の作用；４）タンパク質の合成；５）核酸の合成；および６）中間代謝。
【０００４】
抗菌剤に対する耐性および／または抵抗性の進行は、疾患を治療する性能に対して、著しい脅威となっている。例えば、耐性種が認められることが増えていることには、多くの要因が寄与しており、これには、１）抗菌剤の乱用；２）抗菌剤の不適切な使用；３）多くの細菌が遺伝子物質を交換して耐性を与える能力；および４）多くの細菌で観察されている急速な変異速度（これにより、耐性株の選択が可能となる）が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一旦、生物体が特定の抗菌剤に対して耐性を発現すると、有効な代替物を発見することが重要となってくる。もし、生物体がこの第二抗菌剤に対して耐性を発現した場合、別の代替物が必要となる。結果として、新しい薬剤を連続して開発する必要がある。この薬剤は、生物体の生理機能を選択的に標的とするべきであるが、広範囲の生物体に対して作用できなければならない。それゆえ、当該技術分野では、単一および多剤耐性株に対する有効な代替薬物として働く抗菌剤が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明の目的に従って、本明細書中で具体化され広範に記述されているように、本発明は、１局面では、細菌の成長を阻止する方法に関し、該方法は、以下の構造を有する１種またはそれ以上の化合物またはそれらの塩の有効量を細菌と接触させる工程を包含する：
【０００７】
【化２０】
【０００８】
ここで、
（ａ）Ｘ１およびＸ２は、ＣＨまたはＮであり、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである；
（ｂ）Ｓ１は、有機ラジカルである；
（ｃ）Ｓ２、Ｓ３およびＳ４は、別個に、水素、アミノ、ハロゲン、または１個またはそれ以上の有機ラジカル、あるいは
（ｄ）その塩から選択される。
【０００９】
別の局面では、本発明は、細菌を殺す方法に関し、該方法は、本明細書中で開示した構造および種々の実施態様を有する１種以上の化合物の有効量を該細菌と接触させる工程を包含する。
【００１０】
さらに別の局面では、本発明は、細菌におけるＦｔｓＺ重合を阻止する方法に関し、該方法は、本明細書中で開示した構造および種々の実施態様を有する１種またはそれ以上の化合物の有効量を該細菌と接触させる工程を包含する。
【００１１】
さらなる局面では、本発明は、細菌の成長を阻止する方法に関し、該方法は、構造４−［（６−アミノ−２，３−ジフェニル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−８−イルアミノ）−メチル］−Ｎ，Ｎ−ジエチル−ベンゼンスルホンアミドを有する化合物の有効量を細菌と接触させる工程を包含する。
【００１２】
本発明はまた、細菌に感染した被験体を治療する方法に関し、該方法は、該被験体に、本明細書中で開示した構造および種々の実施態様を有する１種以上の化合物の有効量を投与する工程を包含する。
【００１３】
本発明のさらなる利点は、一部には、以下の記述で述べられており、また、一部には、その記述から明らかであるか、または、本発明を実行することにより、習得され得る。本発明の利点は、添付の請求の範囲で特に指摘された要素および組合せによって、実現され達成される。前述の一般的な記述および以下の詳細な記述の両方は、例示的で説明的であるにすぎず、請求した本発明を制限するものではない。
【００１４】
例えば、本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
細菌の成長を阻止する方法であって、該方法は、以下の構造を有する１種またはそれ以上の化合物またはそれらの塩の有効量を細菌と接触させる工程を包含する：
【００１５】
【化１】
【００１６】
ここで、
（ａ）Ｘ１およびＸ２は、ＣＨまたはＮであり、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである；
（ｂ）Ｓ１は、１個〜８個の炭素原子を含む有機ラジカルである；
（ｃ）Ｓ２、Ｓ３およびＳ４は、別個に、水素、アミノ、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む１個またはそれ以上の有機ラジカルから選択される、
方法。
（項目２）
前記細菌が、抗生物質に耐性である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細菌が、グラム陽性である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記グラム陽性菌が、以下からなる群から選択される、項目３に記載の方法：
【００１７】
【化２】
【００１８】
。
（項目５）
前記細菌が、グラム陰性菌である、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記グラム陰性菌が、以下からなる群から選択される、項目５に記載の方法：
【００１９】
【化３】
【００２０】
。
（項目７）
前記化合物が、浸透性賦活薬と併用され、ここで、該浸透性賦活薬が、該浸透性賦活薬により、該化合物が前記細菌の細胞エンベロープを通過できる、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記浸透性賦活薬が、ポリミキシンＢ、表面活性剤、デフェンシン、他の膜活性ペプチドおよびキレート化剤からなる群から選択される、項目７に記載の方法。
（項目９）
さらに、前記細菌を浸透性賦活薬と接触させる工程を包含する、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記浸透性賦活薬が、ポリミキシンＢ、表面活性剤、デフェンシン、他の膜活性ペプチドおよびキレート化剤からなる群から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記化合物が、約５００グラム／モル未満の分子量を有する、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記化合物が、以下の構造を有する、項目１に記載の方法：
【００２１】
【化４】
【００２２】
ここで、
ａ）Ｓ１は、１個〜４個の炭素原子を含むアルキル基である；
ｂ）Ｓ２は、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルであり、該有機ラジカルは、アルキル、アルコキシ、一置換アミノまたは二置換アミノから選択される；
ｃ）Ｓ２およびＳ３は、
（ｉ）別個に、置換基であり、該置換基は、別個に、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルから選択できるか、または
（ｉｉ）一緒になって、ヘテロアリールラジカルまたは複素環ラジカルを形成し、該ヘテロアリールラジカルまたは複素環ラジカルは、５個、６個または７個の環原子を含み、必要に応じて、１個、２個または３個の置換基で置換されており、該置換基は、ハロゲン、アミノ、または１個〜１２個の炭素原子を含む有機ラジカルから選択される、
方法。
（項目１３）
前記化合物が、以下の構造またはそれらの薬学的に受容可能な塩を有する、項目１に記載の方法：
【００２３】
【化５】
【００２４】
ここで、
ａ）Ｘ１およびＸ２は、ＣＨまたはＮであり、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである；
ｂ）Ｘ３は、ＣＨ、Ｎ、ＮＨ、ＯまたはＳである；
ｃ）Ｘ４は、ハロゲン、酸素、イオウまたはリン原子、アミノ、ＮＨ、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルである；
ｄ）Ｒ１は、１個〜４個の炭素原子を含むアルキルラジカルである；
ｅ）Ｒ２は、任意のラジカルであり、該任意のラジカルは、水素、アミノ、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む１個またはそれ以上の有機ラジカルから選択される；
ｆ）Ｒ３および任意のＲ３’ラジカル（存在または不在であり得る）は、別個に、水素、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルから選択される；
ｇ）Ｃｎは、１個または２個の任意の環炭素原子を含み、ここで、各任意の環炭素原子は、１個または２個の置換基ラジカルを有し、該置換基ラジカルは、別個に、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルから選択される、
方法。
（項目１４）
前記化合物が、以下の構造またはそれらの薬学的に受容可能な塩を有する、項目１に記載の方法：
【００２５】
【化６】
【００２６】
ここで、
ａ）Ｒ１は、１個〜４個の炭素原子を含むアルキル基である；
ｂ）Ｒ２−−Ｘ４は、アミノまたは一置換アミノラジカルであり、該アミノまたは一置換アミノラジカルは、１個〜２６個の炭素原子を含む；
ｃ）Ｒ３およびＲ４は、別個に、水素、ハロゲン、または１個〜１２個の炭素原子を含む有機ラジカルから選択される、
方法。
（項目１５）
Ｒ３およびＲ４が、別個に、水素、アルキルまたはアルコキシラジカル、アリールラジカルまたはヘテロアリールラジカルから選択され、該アルキルまたはアルコキシラジカルが、１個〜１８個の炭素原子を含み、該アリールラジカルが、６個〜１８個の炭素を含み、そして該ヘテロアリールラジカルが、１個〜１８個の環炭素を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１６）
前記化合物が、以下の構造またはそれらの薬学的に受容可能な塩を有する、項目１に記載の方法：
【００２７】
【化７】
【００２８】
ここで、
ａ）Ｘ１およびＸ２は、ＣＨまたはＮであり、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである；
ｂ）Ｘ３は、ＣＨ、Ｎ、ＮＨ、ＯまたはＳである；
ｃ）Ｘ４は、ハロゲン、酸素、イオウまたはリン原子、アミノ、ＮＨ、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルである；
ｄ）Ｒ１は、１個〜４個の炭素原子を含むアルキルラジカルである；
ｅ）Ｒ２は、水素、アミノ、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む１個またはそれ以上の有機ラジカルから選択される；
ｆ）Ｒ３、Ｒ４、Ｒ３’、Ｒ４’ラジカルは、別個に、水素、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルから選択される、
方法。
（項目１７）
前記化合物が、以下の構造またはそれらの薬学的に受容可能な塩を有する、項目１に記載の方法：
【００２９】
【化８】
【００３０】
ここで、
ａ）Ｘ１およびＸ２は、ＣＨまたはＮであり、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである；
ｂ）Ｘ３は、ＣＨ、Ｎ、ＮＨ、ＯまたはＳである；
ｃ）Ｘ４は、ハロゲン、酸素、イオウまたはリン原子、アミノ、ＮＨ、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルである；
ｄ）Ｒ１は、１個〜４個の炭素原子を含むアルキルラジカルである；
ｅ）Ｒ２は、水素、アミノ、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む１個またはそれ以上の有機ラジカルから選択される；
ｆ）Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、および任意のＲ３’Ｒ４’およびＲ５’ラジカルは、別個に、水素、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルから選択される、
方法。
（項目１８）
前記化合物が、以下の構造またはそれらの薬学的に受容可能な塩を有する、項目１に記載の方法：
【００３１】
【化９】
【００３２】
ここで、
ａ）Ｒ１は、１個〜４個の炭素原子を含むアルキルラジカルである；
ｂ）Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ４’およびＲ５’ラジカルは、別個に、水素、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルから選択される、
方法。
（項目１９）
前記化合物が、以下の構造またはそれらの薬学的に受容可能な塩を有する、項目１に記載の方法：
【００３３】
【化１０】
【００３４】
ここで、
ａ）Ｘ１およびＸ２は、ＣＨまたはＮであり、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである；
ｂ）Ｘ３は、ＣＨ、Ｎ、ＮＨ、ＯまたはＳである；
ｃ）Ｘ４は、ハロゲン、酸素、イオウまたはリン原子、アミノ、ＮＨ、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルである；
ｄ）Ｒ１は、１個〜４個の炭素原子を含むアルキルラジカルである；
ｅ）Ｒ２は、任意のラジカルであり、該任意のラジカルは、水素、アミノ、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む１個またはそれ以上の有機ラジカルから選択される；
ｆ）Ｃｎは、水素、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルである、
方法。
（項目２０）
前記化合物が、次式またはそれらの薬学的に受容可能な塩を有する、項目１に記載の方法：
ａ）［５，６−ジアミノ−４−（２−ヒドロキシ−１−メチル−３−フェノキシプロピルアミノ）−ピリジン−２−イル］−カルバミン酸エチルエステル；
ｂ）［８−（４−ジエチルアミノ−１−メチル−ブチルアミノ）−２，３−ジフェニル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−６−イル］−カルバミン酸エチルエステル；
ｃ）（１−アミノ−８−フェニル−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−２，５，９−トリアザベンゾシクロヘプテン−３−イル）−カルバミン酸エチルエステル；
ｄ）［２，３−ジフェニル−８−（４−スルファモイル−ベンジルアミノ）−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−６−イル］−カルバミン酸エチルエステル；
ｅ）（５−アミノ−３−ブチル−２−メチル−１，２−ジヒドロ−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−７−イル）−カルバミン酸エチルエステル；
ｆ）（５−アミノ−２，３−ジフェニル−２Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イル）−カルバミン酸エチルエステル；
ｇ）（５−エトキシ−２，３−ジフェニル−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−７−イル）−カルバミン酸エチルエステル；
ｈ）（５−アミノ−２，３−ジフェニル−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−７−イル）−カルバミン酸エチルエステル；
ｉ）（５−アミノ−３−｛［（４−メトキシ−フェニル）−メチル−アミノ］−メチル｝−１，２−ジヒドロ−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−７−イル）−カルバミン酸エチルエステル；または
ｊ）［５−アミノ−３−（４−ブチルカルバモイルオキシ−フェニル）−２−メチル−１，２−ジヒドロ−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−７−イル］−カルバミン酸エチルエステル。
（項目２１）
細菌を殺す方法であって、該方法は、以下の構造を有する１種またはそれ以上の化合物またはそれらの塩の有効量を該細菌と接触させる工程を包含する：
【００３５】
【化１１】
【００３６】
ここで、
ａ）Ｘ１およびＸ２は、ＣＨまたはＮであり、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである；
ｂ）Ｓ１は、１個〜８個の炭素原子を含む有機ラジカルである；
ｃ）Ｓ２、Ｓ３およびＳ４は、別個に、水素、アミノ、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む１個またはそれ以上の有機ラジカルから選択される、
方法。
（項目２２）
前記細菌感染が、グラム陽性菌感染である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記細菌感染が、以下からなる群から選択される、項目２２に記載の方法：
【００３７】
【化１２】
【００３８】
。
（項目２４）
前記感染が、グラム陰性菌感染である、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記細菌感染が、以下からなる群から選択される、項目２４に記載の方法：
【００３９】
【化１３】
【００４０】
。
（項目２６）
前記化合物が、チューブリンに影響を及ぼさない、項目２１に記載の方法。
（項目２７）
細菌におけるＦｔｓＺ重合を阻止する方法であって、該方法は、以下の構造を有する１種またはそれ以上の化合物またはそれらの塩の有効量と接触させる工程を包含する：
【００４１】
【化１４】
【００４２】
ここで、
ａ）Ｘ１およびＸ２は、ＣＨまたはＮであり、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである；
ｂ）Ｓ１は、１個〜８個の炭素原子を含む有機ラジカルである；
ｃ）Ｓ２、Ｓ３およびＳ４は、別個に、水素、アミノ、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む１個またはそれ以上の有機ラジカルから選択される、
方法。
（項目２８）
前記細菌が、グラム陽性である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記グラム陽性細菌が、以下からなる群から選択される、項目２８に記載の方法：
【００４３】
【化１５】
【００４４】
。
（項目３０）
前記細菌が、グラム陰性である、項目２７に記載の方法。
（項目３１）
前記グラム陰性細菌染が、以下からなる群から選択される、項目３０に記載の方法：
【００４５】
【化１６】
【００４６】
。
（項目３２）
前記化合物が、浸透性賦活薬に連結され、ここで、該浸透性賦活薬により、該化合物が前記細菌の細胞エンベロープを通過できる、項目２７に記載の方法。
（項目３３）
前記賦活薬が、ポリミキシンＢ、表面活性剤、デフェンシン、他の膜活性ペプチドおよびキレート化剤からなる群から選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
さらに、前記細菌を浸透性賦活薬と接触させる工程を包含する、項目２７に記載の方法。
（項目３５）
前記浸透性賦活薬が、ポリミキシンＢ、表面活性剤、デフェンシン、他の膜活性ペプチドおよびキレート化剤からなる群から選択される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
細菌の成長を阻止する方法であって、構造４−［（６−アミノ−２，３−ジフェニル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−８−イルアミノ）−メチル］−Ｎ，Ｎ−ジエチル−ベンゼンスルホンアミドを有する化合物の有効量を細菌と接触させる工程を包含する、方法。
（項目３７）
細菌に感染した被験体を治療する方法であって、該方法は、該被験体に、以下の構造を有する１種またはそれ以上の化合物またはそれらの薬学的に受容可能な塩の有効量を投与する工程を包含する：
【００４７】
【化１７】
【００４８】
ここで、
ａ）Ｘ１およびＸ２は、ＣＨまたはＮであり、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである；
ｂ）Ｓ１は、１個〜８個の炭素原子を含む有機ラジカルである；
ｃ）Ｓ２、Ｓ３およびＳ４は、別個に、水素、アミノ、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む１個またはそれ以上の有機ラジカルから選択される、
方法。
（項目３８）
前記細菌感染が、グラム陽性菌感染である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記細菌感染が、以下からなる群から選択される、項目３８に記載の方法：
【００４９】
【化１８】
【００５０】
。
（項目４０）
前記細菌感染が、グラム陰性菌感染である、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記細菌感染が、以下からなる群から選択される、項目４０に記載の方法：
【００５１】
【化１９】
【００５２】
。
（項目４２）
前記化合物が、チューブリン重合を阻害しない、項目３７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、種々の源由来のＦｔｓＺ配列の系統的樹形図を示す。
【図２】図２は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａに対するＳＲＩ−３０７２の殺菌活性を示す。２倍、４倍および８倍のＭＩＣ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）存在下のｃｆｕ／ｍｌを、薬物の存在下、インキュベーションの６日後に７Ｈ１１寒天上にプレーティングすることにより、決定した。
【図３】図３は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺポリマー化の阻害を示す。ＦｔｓＺ（１３μＭ）を、ポリマー化緩衝液中の異なる濃度のＳＲＩ−７６１４、ＳＲＩ−３０７２およびコルヒチンと共にインキュベートした。ポリマー化を、４０μＭのＧＴＰの付加により開始し、蛍光における増大を、９０°光散乱アッセイを使用して測定した。挿入図はＩＤ５０値の決定を例示する。最大光散乱を、ＧＴＰ加算の前に、ピーク値からベースライン値を引くことにより計算した。
【図４】図４は、ＧＴＰ加水分解の阻害を例示する。ＦｔｓＺを、ポリマー化アッセイに記載される同じ条件の下でアッセイした。種々の時点で、２５μｌのアリコートを回収し、３２Ｐの放出についてアッセイした。ＧＴＰ加水分解に対する時間経過を、１００μＭコルヒチン、ＳＲＩ−７６１４およびＳＲＩ−３０７２の存在下で測定し、コントロールと比較した。
【図５】図５は、チューブリンポリマー化の阻害を例示する。チューブリン（２０μＭ）を、ポリマー緩衝液中１００Ｍコルヒチン、ＳＲＩ−７６１４、ＳＲＩ−３０７２でインキュベートし、コントロールと比較した。ポリマー化を、１ｍＭのＧＴＰの添加により開始し、蛍光における増大を、９０°光散乱アッセイを使用して測定した。
【図６】図６は、３−デアザプテリジン化合物の合成についての１つの合成スキームを示す。
【図７】図７は、ピリドジアゼピン化合物の合成についての１つの合成スキームを示す。
【図８】図８は、３−デアザプテリジンおよびピリドジアゼピン化合物のアザアナログの合成についての重要な中間体の合成についての１つの合成スキームを示す。
【図９】図９は、細胞長におけるＳＲＩ−３０７２の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
（好ましい実施態様の説明）
本発明は、本発明の好ましい実施態様の以下の詳細な説明およびそこに含まれる実施例ならびに図面および先の記述および以下の記述を参照することにより、さらに容易に理解できる。
【００５５】
本発明の化合物、組成物、製品、装置および／または方法を開示し記述する前に、本発明は、特定の合成方法、特定の変異体または特定のスクリーニング方法には限定されず、それ自体、もちろん、変え得ることが理解できるはずである。また、本明細書中で使用する専門用語は、特定の実施態様を記述する目的のためのみであり、限定するとは解釈されないことが理解できるはずである。
【００５６】
本明細書および添付の請求の範囲で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他に文脈で明らかに指示がなければ、複数の指示物を含む。それゆえ、例えば、「細菌（ａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）」の対象物は、複数の細菌の培養物および集団を含み、また、「細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）」の対象物は、２種以上の細菌を含むなどである。
【００５７】
範囲は、本明細書中にて、「約」ある特定の値からおよび／または「約」別の特定の値までとして表わされ得る。このような範囲が表わされる場合、別の実施態様は、ある特定の値からおよび／または他の特定の値までを包含する。同様に、値が、先行詞である「約」を使用することにより、概算値として表わされる場合、その特定の値は、別の実施態様をなすことが理解できる。さらに、これらの範囲の各々の終点は、他の終点に関連して、また、他の終点とは無関係に、重要であることが理解できる。
【００５８】
以下の本明細書および請求の範囲では、多数の用語を参照するが、これらは、以下の意味を有するように定義される：
「任意の」または「必要に応じて」とは、引き続いて記述された事象または状況が起こり得るかまたは起こり得ないこと、およびこの記述が、該事象または該状況が起こる場合および該事象が起こらない場合を含むことを意味する。
【００５９】
本開示において、細菌細胞増殖およびＦｔｓＺ活性の阻害剤としての化合物の使用が、記載される。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、用語「ＦｔｓＺ」は、Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびその誘導体由来の寄託番号Ｏ０８３７８の下でＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｓｅに列挙されるポリペプチドをいう。
【００６０】
ＦｔｓＺの「誘導体」は、ＦｔｓＺの生物学的活性に実質的に類似する生物学的活性（機能的または構造的のいずれか）を有するポリペプチドに関し、そして「フラグメント」、「改変体」、「アナログ」、「ホモログ」および「化学的変化」を含む。好ましくは、誘導体は、重合化する能力を保持する。
【００６１】
用語「フラグメント」は、ＦｔｓＺの３以上の連続的または隣接するアミノ酸を組み込むＦｔｓＺアミノ酸配列の任意のポリペプチドサブセットをいうことを意味する。用語「改変体」は、アミノ酸構造において全ＦｔｓＺ分子、またはそのフラグメントのいずれかと実質的に類似の分子をいうことを意味する。用語「アナログ」は、機能において全ＦｔｓＺ分子またはそのフラグメントのいずれかと実質的に類似の分子をいう。用語「ホモログ」は、種々の細菌において、対応するＦｔｓＺの対応物、またはその誘導体をいうことを意味し、この細菌としては、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方を含むが、これらに限定されない。用語「化学的変化」は、同じ様式で構造的に修飾されたＦｔｓＺの誘導体を意味するが、これは、ＦｔｓＺと類似の様式で機能する。化学的変化は、ＦｔｓＺ遺伝子をコードするヌクレオチド配列の修飾により（例えば、置換、付加、欠失などにより）作製され得、あるいは化学的手段、ｍＲＮＡのインビトロ翻訳、当業者に公知の任意の他の等価な方法、またはＦｔｓＺへの化学的部分の付加を介してのような、インビトロでのポリペプチドの合成により生成される。天然に存在する、ｆｔｓｚ遺伝子、またはそのタンパク質への変異がまた、含まれる。
【００６２】
両方の分子が、その各々のアミノ酸配列の間で、５０％より高い同一性または５０％より高い類似性（６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を含めて）を有する場合、構造に関して、または両方の分子がアミノ酸配列の類似性または同一性に関わらず類似の生物学的活性を有する場合、機能に関して、分子は、ＦｔｓＺと「実質的に類似」または「相同な」である。当業者は、いかにして２つのタンパク質の相同性を決定するかを容易に理解する。
【００６３】
用語「改変体」は、核酸またはペプチド分子のいずれかの配列における変異をいう。改変体といわれる場合、改変体は記述される特定の置換に依存する特定の性質を表すが、改変体が開示された活性を保持する場合、特に記述された位置以外の位置における他の置換、欠失、および／または挿入、例えば、保護的置換、挿入および／または欠失がまた、企図される。
【００６４】
ほとんどのＦｔｓＺアミノ酸配列は、化学種間の配列保護をほとんど示さない短いＮ末端セグメントおよび短い〜長いＣ末端セグメントを有する。しかし、化学種の至る所で保護される保護されたコア配列が存在する。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、保護されたコアは、アミノ酸１０〜３１６に延び、次の配列（ＤＡＶＩＫ（配列番号２）−ＶＡＴＧＩＧ（配列番号３））で始まり、そして終わる。保護されたコアが、比較のために使用される場合、ＦｔｓＺ配列は、４０％〜６０％の同一性を示す。保護されたＦｔｓＺ配列を有する細菌の代表的な列挙は、図１に示される。ＦｔｓＺコア配列は、広範な生物にわたる注目すべき程度の類似性を共有する。
【００６５】
本明細書中で議論されるように、公知であり、本明細書中で企図されるＦｔｓＺ分子の多くの改変体が、存在する。公知の機能性株改変体に加えて、開示された方法および組成物においても機能するＦｔｓＺタンパク質の誘導体が、存在する。タンパク質改変体および誘導体は、当業者に十分理解され、アミノ酸配列改変を含み得る。例えば、アミノ酸配列改変は、代表的に、以下の３つのクラスの１つ以上に入る：置換改変体、挿入改変体、または欠失改変体。挿入は、アミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合ならびに単一のまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入は、もともと、例えば、およそ１〜４の残基の、アミノ末端融合またはカルボキシル末端融合の挿入よりも小さな挿入である。欠失は、タンパク質配列からの１つ以上のアミノ酸残基の除去により特徴付けられる。代表的に、約２〜６以下の残基が、タンパク質分子中の任意の１つの部位で欠失される。これらの改変体は、通常タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発により調製され、これにより、改変体をコードするＤＮＡを産生し、そしてその後、組換え細胞培養物中でＤＮＡを発現する。既知の配列を有するＤＮＡ中の所定の部位で置換変異を行うための技術が、周知である（例えば、Ｍ１３プライマー突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発）。置換改変体は、少なくとも１つの残基が除去され、そして異なる残基がその場所に挿入される改変体である。このような置換は、一般的に、以下の表１および表２に従って行われ、保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）と呼ばれる。
【００６６】
【表１−１】
【００６７】
【表１−２】
【００６８】
【表２】
【００６９】
機能における実質的な変化が、表２における置換よりもあまり保存的でない置換を選択すること（すなわち、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造（例えばシート構造またはヘリックス構造のような）、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さを維持する効果においてより有意に異なる残基を選択すること）により行われる。一般に、タンパク質特性において最も大きな変化を作るよう予測される置換は、（ａ）親水性残基（例えば、セリン残基またはトレオニン残基）が、疎水性残基（例えば、ロイシン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、バリン残基、またはアラニン残基）の代わりに置換され；（ｂ）システインまたはプロリンが、任意の他の残基の代わりに（または任意の他の残基により）置換され；（ｃ）電気陽性側鎖を有する残基（例えば、リジン残基、アルギニン残基、またはヒスチジン残基）が、電気陰性残基（例えば、グルタミン残基またはアスパラギン残基）の代わりに（または電気陰性残基により）置換されるか、または；（ｄ）嵩高い側鎖（例えば、フェニルアラニン）を有する残基が、側鎖（例えば、この場合グリシン）を有さない残基の代わりに置換される、（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化のための部位の数を増加することによる置換である。
【００７０】
例えば、１つのアミノ酸残基の、生物学的および／または化学的に類似の別のアミノ酸残基との置換は、保存的置換として当業者に公知である。例えば、保存的置換は、１つの疎水性残基を別の疎水性残基で置換するか、または１つの極性残基を別の極性残基で置換することである。これらの置換としては、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ，Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒのような組み合わせが挙げられる。各々の明確に開示された配列のこのような保存的に置換された改変体は、本明細書中に提供されるモザイクポリペプチド中に含まれる。
【００７１】
アミノ酸置換は、代表的に単一の残基の置換であるが、多くの異なる位置で同時に起こり得る；挿入は、通常、およそ約１〜１０のアミノ酸残基であり；そして欠失は、約１０〜３０残基にわたる。欠失または挿入が、好ましくは、隣接する対（すなわち、２残基の欠失または２残基の挿入）において作製される。置換、欠失、挿入またはこれらの任意の組み合わせが、組み合わされて最終構築物に到達し得る。突然変異誘発は、配列をリーディングフレームの外に配置してはならず、そして好ましくは、第２のｍＲＮＡ構造を生成し得る相補的領域を作製しない。
【００７２】
置換突然変異誘発または欠失突然変異誘発が利用されて、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）のための部位を挿入し得る。システインまたは他の不安定残基の欠失がまた、所望され得る。可能性のあるタンパク質分解部位（例えば、Ａｒｇ）の欠失または置換が、例えば塩基性残基の１つの欠失またはグルタミン残基もしくはヒスチジン残基による塩基性残基の１つの置換により、達成される。
【００７３】
ある翻訳後の誘導体は、発現されたポリペプチド上の組換え宿主細胞のいくらかの型の作用の結果である。グルタミン残基およびアスパラギン残基は、しばしば、翻訳後に対応するグルタミン酸残基およびアスパラギン酸残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。他の翻訳後の修飾としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリン残基またはスレオニン残基のヒドロキシル基のホスホリル化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｐｐ７９−８６［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化、および、ある場合は、Ｃ末端カルボキシルのアミド化が挙げられる。
【００７４】
本明細書が種々のタンパク質およびタンパク質配列を議論するので、これらのタンパク質配列をコードし得る核酸もまた開示されることが理解される。これは、特定のタンパク質配列に関連する全ての縮重配列（すなわち、１つの特定のタンパク質配列をコードする配列を有する全ての核酸ならびにタンパク質配列の開示された改変体および誘導体をコードする全ての核酸（縮重核酸を含む））を含む。従って、各特定の核酸配列が本明細書中に書き記され得ないものの、各全ての配列が、開示されたタンパク質配列によって、本明細書に、実際に開示され、そして記載されることが理解される。
【００７５】
ＦｔｓＺ分子に組み込まれ得る多くのアミノ酸およびペプチドアナログが存在することが理解される。例えば、多くのＤアミノ酸、または表１および表２に示されるアミノ酸とは異なる官能性置換基を有するアミノ酸が存在する。天然に存在するペプチドの反対の立体異性体、ならびにペプチドアナログの立体異性体が開示される。これらのアミノ酸は、ｔＲＮＡ分子を選択したアミノ酸で荷電すること、および部位特異的方法でペプチド鎖内にアナログアミノ酸を挿入するために例えばアンバーコドンを利用する遺伝子構築物を操作することによってポリペプチド鎖内に容易に組み込まれ得る（Ｔｈｏｒｓｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．７７：４３−７３（１９９１），Ｚｏｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：３４８−３５４（１９９２）；Ｉｂｂａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｒｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ １３：１９７−２１６（１９９５），Ｃａｈｉｌｌら、ＴＩＢＳ，１４（１０）：４００−４０３（１９８９）；Ｂｅｎｎｅｒ，ＴＩＢ Ｔｅｃｈ，１２：１５８−１６３（１９９４）；ＩｂｂａおよびＨｅｎｎｅｃｋｅ，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：６７８−６８２（１９９４）（これらは全て、少なくともアミノ酸アナログに関連する材料について、本明細書中において参考として援用される））。
【００７６】
本明細書中で考察されるように、相同性および同一性という用語の使用が、類似性と同じことを意味することが理解される。従って、例えば、相同性という言葉の使用が２つの非天然の配列の間で使用される場合、これは、これら２つの配列間の進化的関係を必ずしも示さず、むしろ、それらの核酸配列またはアミノ酸配列間の類似性または関係性を見ていることが理解される。２つの進化的に関連する分子間の相同性を決定するための方法の多くが、それらが進化的に関連するか否かに関わらず、配列類似性を測定する目的で、任意の２つ以上の核酸またはタンパク質に慣用的に適用される。
【００７７】
保存的変異および相同性についての記載が、任意の組み合わせで一緒に組み合わされ得（例えば、特定の配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する実施形態）、この改変体が保存的アミノ酸置換を含むことが理解される。
【００７８】
一般的に、本明細書中に開示される遺伝子およびタンパク質の任意の公知の改変体および誘導体または生じ得る改変体および誘導体を規定するための１つの方法は、特定の公知の配列に対する相同性の点で改変体および誘導体を規定することによることが理解される。本明細書中に開示される特定の配列のこの同一性はまた、本明細書中で他で考察される。一般的に、本明細書中で代表的に開示される遺伝子およびタンパク質の改変体は、示された配列またはネイティブな配列と少なくとも約４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する。当業者は、２つのタンパク質または核酸（例えば、遺伝子）の相同性を決定する方法を容易に理解する。例えば、相同性がその最も高いレベルであるように、２つの配列を整列した後に、相同性が計算され得る。
【００７９】
相同性を計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムによって実行され得る。比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性方法についての検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｌｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって実行され得る。
【００８０】
同じタイプの相同性は、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６−７７１０，１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．ｌ８３：２８ｌ−３０６，１９８９（少なくとも核酸配列に関連する材料について、本明細書中において、参考として援用される）に開示されるアルゴリズムによって、核酸について得られ得る。代表的に、任意の方法が使用され得、そして特定の場合において、これらの種々の方法の結果が異なり得ることが理解されるが、当業者は、これらの方法のうちの少なくとも１つで同一性が見出される場合、これらの配列は、示された同一性を有すると言われ、本明細書中に開示されることを理解する。
【００８１】
例えば、本明細書中で使用される場合、別の配列に対して特定のパーセントの相同性を有するとして示された配列は、上記計算方法の任意の１つ以上によって計算される、示された相同性を有する配列をいう。例えば、たとえ第１配列が任意の他の計算方法によって計算された場合に第２配列に対して８０％の相同性を有さないとしても、第１配列が第２配列に対してＺｕｋｅｒ計算法を使用して８０％の相同性を有すると計算される場合、本明細書中に規定される場合、第１配列は、第２配列に対して８０％の相同性を有する。別の例として、たとえ第１配列がＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ計算法、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ計算法、Ｊａｅｇｅｒ計算法、または任意の他の計算方法によって計算された場合に第２配列に対して８０％の相同性を有さないとしても、第１配列が第２配列に対してＺｕｋｅｒ計算法およびＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ計算法の両方を使用して８０％の相同性を有すると計算される場合、本明細書中に規定される場合、第１配列は、第２配列に対して８０％の相同性を有する。なお別の例として、第１配列が第２配列に対して任意の計算法を使用して８０％の相同性を有すると計算される場合、本明細書中に規定される場合、第１配列は、第２配列に対して８０％の相同性を有すると計算される（もっとも、実際には、異なる計算方法は、しばしば、異なる計算された相同性％を生じる）。
【００８２】
「薬学的に受容可能な」とは、生物学的またはそれ以外で有害ではない物質、すなわち、臨床的に許容できない生体効果を生じたりせず、また、それが含有される医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用せずに、関連した活性化合物と共に個体に投与できる物質を意味する。
【００８３】
「アルキル」との用語は、炭化水素基または残基であって、非環式アルカンからの１つの水素原子の除去および置換（従って、非水素基または残基の置換）により変性した非環式アルカン化合物と構造的に類似しているものを意味する。アルキルは、非環式で飽和の直鎖または分枝鎖炭化水素残基を包含し、これは、１個〜１２個の炭素、１個〜８個の炭素または１個〜６個の炭素を有する。このようなアルキルラジカルの例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、n−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、アミ
ル、ｔ−アミル、ｎ−ペンチルなどのラジカルが挙げられる。低級アルキルは、１個〜４個の炭素原子を有する非環式で飽和の直鎖または分枝鎖炭化水素残基を包含する。
【００８４】
本明細書中で使用する「アルコキシ」との用語は、上で定義したアルキル残基であって、酸素原子に結合してエーテルラジカルを形成するものを意味し、ここで、この酸素原子はまた、他のラジカルに結合される。例には、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、イソ−ブトキシなどが挙げられる。
【００８５】
「一置換アミノ」との用語は、そのＲラジカルが有機ラジカルであるアミノ（−ＮＨＲ）ラジカルを意味する。適当な有機ラジカルには、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシまたはアシルが挙げられるが、これらに限定されず、ここで、この用語は、本明細書中で見られる定義を有する。一置換アミノ基の例には、メチルアミノ（−ＮＨ−ＣＨ３）；エチルアミノ（−ＮＨＣＨ２ＣＨ３）、ヒドロキシエチルアミノ（−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、メトキシエチルアミノ（−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）などが挙げられる。
【００８６】
「二置換アミノ」との用語は、二置換アミノラジカル（−ＮＲ１Ｒ２）を意味し、ここで、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なり得る有機ラジカルである。適当な有機ラジカルには、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシまたはアシルが挙げられるが、これらに限定されず、ここで、この用語は、本明細書中で見られる定義を有する。一部の例には、ジメチルアミノ、メチルエチルアミノ、ジエチルアミノ、ジヒドロキシエチルアミノ、および類似のラジカルが挙げられる。
【００８７】
「ハロアルキル」との用語は、そのアルキルラジカル上の１個またはそれ以上の水素を１個またはそれ以上のハロゲンで置き換えたアルキル残基（これは、上で定義した）を意味する。ある実施態様では、これらのハロゲンは、フルオロラジカルである。例には、クロロメチル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチルなどが挙げられる。
【００８８】
「ハロアルコキシ」との用語は、酸素に直接結合してハロアルキル置換基ラジカル有するエーテルラジカルを形成するハロアルキル残基（これは、上で定義した）を意味する。例には、トリフルオロメトキシ、ペンタフルオロエトキシなどが挙げられる。
【００８９】
「アシル」との用語は、そのＲラジカルが水素であるかまたはカルボニル炭素に結合した有機ラジカルの炭素を有するＲ−Ｃ（Ｏ）−を意味する。例には、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブタノイル、イソ−ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、ベンゾイルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
「アシルオキシ」との用語は、酸素と直接結合してＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ラジカルを形成するアシルラジカル（これは、上で定義した）を意味する。例には、アシルオキシ、プロピオニルオキシ、ブタノイルオキシ、イソ−ブタノイルオキシ、ベンゾイルオキシ、および類似のラジカルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
「アリール」との用語は、６個〜１８個の炭素、好ましくは、６個〜１２個の炭素を含有する炭化水素環ラジカルであって、その中に、少なくとも１個の６員芳香族「ベンゼン」環を含むものを意味する。このようなアリールラジカルの例には、フェニル、ビフェニルおよびナフチルが挙げられる。「置換アリール」との用語は、上で定義したアリール環ラジカルであって、１個またはそれ以上、または好ましくは、１個、２個または３個の有機環、ラジカルまたは無機置換基でさらに置換したものを意味し、これらには、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシル、シクロアルキル、アミノ、一置換アミノ、二置換アミノ、アシルオキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルボアルコキシ、アルキルカルボキサミド、置換アルキルカルボキサミド、ジアルキルカルボキサミド、置換ジアルキルカルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、チオアルキル、チオハロアルキル、アルコキシ、置換アルコキシまたはハロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、複素環、置換複素環（ここで、これらの用語は、本明細書中で定義されている）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの有機置換基は、１個〜１２個の炭素原子、または１個〜６個の炭素原子、または１個〜４個の炭素原子を含有できる。
【００９２】
「ヘテロアリール」との用語は、芳香環ラジカル（これは、１個〜１８個の環炭素、または２個〜１５個の環炭素、または３個〜１２個の環炭素、または４個〜１０個の環炭素、または５個〜８個の環炭素を含有する）であって、その中の芳香環の少なくとも１個の原子をヘテロ原子で置き換えたものを意味し、このヘテロ原子には、窒素原子、酸素原子およびイオウ原子が挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリールは、１個、２個、３個、４個、５個または６個の別個に選択された環ヘテロ原子を有し得る。ヘテロアリール残基の例には、ピリジル、ビピリジル、フラニルおよびチオフラニル残基が挙げられる。置換「ヘテロアリール」残基は、１個またはそれ以上の有機ラジカルまたは無機置換基、または好ましくは、１個、２個または３個のこのような基を有し得、これらは、この上で言及したように、そのヘテロ芳香環の炭素原子に結合されている。これらの有機置換基は、１個〜１２個の炭素原子、または１個〜６個の炭素原子、または１個〜４個の炭素原子を含有できる。
【００９３】
「ハロ」または「ハロゲン」との用語は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードラジカルをいう。
【００９４】
「チオアルキル」との用語は、アルキルラジカルに結合したスルフィド原子（直鎖または分枝）を意味する。例には、メチルスルフィド、エチルスルフィド、イソプロピルスルフィドなどが挙げられる。
【００９５】
「チオハロアルキル」との用語は、１個またはそれ以上の水素をハロゲン原子で置き換えたチオアルキルラジカルを意味する。例には、トリフルオロメチルチオ、１，１−ジフルオロメチルチオ、２，２，２−トリフルオロエチルチオなどが挙げられる。
【００９６】
「シクロアルキル」との用語は、炭化水素基であって、環式アルカンからの水素原子の除去（従って、非水素基または残基の置換）により修飾した環式アルカン化合物と構造的に類似している。シクロアルキル基または残基ラジカルは、３個〜１８個の炭素、好ましくは、４個〜１２個の炭素、または５個〜８個の炭素を有する。例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、デカヒドロナフチル、アダマンチルなどの残基が挙げられる。
【００９７】
「置換シクロアルキル」との用語は、上で定義したシクロアルキル残基であって、１個、２個またはそれ以上の追加の有機ラジカルまたは無機置換基でさらに置換したものを意味し、これらには、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、置換アルコキシ、カルボキシ、カルボアルコキシ、アルキルカルボキサミド、置換アルキルカルボキサミド、ジアルキルカルボキサミド、置換ジアルキルカルボキサミド、アミノ、一置換アミノまたは二置換アミノを挙げることができるが、これらに限定されない。このシクロアルキルが１個またはそれ以上の置換基で置換されているとき、それらは、同一または異なり得る。これらの有機置換基は、１個〜１２個の炭素原子、または１個〜６個の炭素原子、または１個〜４個の炭素原子を含有できる。
【００９８】
「シクロアルケニル」との用語は、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含有する、上で定義したシクロアルキル残基を意味する。例には、シクロプロペニル、１−シクロブテニル、２−シクロブテニル、１−シクロペンテニル、２−シクロペンテニル、３−シクロペンテニル、１−シクロヘキシル、２−シクロヘキシル、３−シクロヘキシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。「置換シクロアルケニル」との用語は、上で定義したシクロアルケニルであって、１個またはそれ以上の有機ラジカルまたは無機置換基でさらに置換したものを意味する。適当な置換基ラジカルには、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、置換アルコキシ、ハロアルコキシ、カルボキシ、カルボアルコキシ、アルキルカルボキサミド、ジアルキルカルボキサミド、アミノ、一置換アミノまたは二置換アミノラジカルが挙げられるが、これらに限定されない。このシクロアルケニルが１個またはそれ以上の基で置換されているとき、それらは、同一または異なり得る。これらの有機置換基は、１個〜１２個の炭素原子、または１個〜６個の炭素原子、または１個〜４個の炭素原子を含有できる。
【００９９】
本明細書中で定義し使用する「有機ラジカル」は、１個またはそれ以上の炭素原子を含有する。例えば、有機ラジカルは、１個〜２６個の炭素原子、１個〜１８個の炭素原子、１個〜１２個の炭素原子、１個〜８個の炭素原子、または１個〜４個の炭素原子を有し得る。有機ラジカルは、しばしば、その有機ラジカルの炭素原子の少なくとも一部に結合した水素を有する。無機原子を含有しない有機ラジカルの一例には、５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチルラジカルがある。ある実施態様では、有機ラジカルは、そこに結合した１個〜１０個の無機ヘテロ原子を含有でき、これらには、ハロゲン、酸素、イオウ、窒素、リンなどが挙げられる。有機ラジカルの例には、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、一置換アミノ、二置換アミノ、アシルオキシ、シアノ、カルボキシ、カルボアルコキシ、アルキルカルボキサミド、置換アルキルカルボキサミド、ジアルキルカルボキサミド、置換ジアルキルカルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、チオアルキル、チオハロアルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、複素環または置換複素環ラジカルが挙げられるが、これらに限定されず、ここで、これらの用語は、本明細書中の他の箇所で定義されている。ヘテロ原子を含有する有機ラジカルの少数の非限定的な例には、アルコキシラジカル、トリフルオロメトキシラジカル、アセトキシラジカル、ジメチルアミノラジカルなどが挙げられる。
【０１００】
「プロドラッグ」との表現は、薬剤前駆体である化合物を意味し、これは、投与に続いて、化学的または生理学的プロセスによりインビボで薬剤を放出する（例えば、プロドラッグは、生理学的ｐＨにされるか酵素作用により、所望の薬剤形状に変換される）。代表的なプロドラッグは、開裂すると、対応する遊離酸を放出し、式（Ｉ）の化合物のこのような加水分解可能エステル形成残基には、カルボキシル部分を有するものが挙げられるが、これらに限定されず、ここで、その遊離水素は、以下で置き換えられている：（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ７）アルカノイルオキシメチル、１−（アルカノイルオキシ）エチル（これは、４個〜９個の炭素原子を有する）、１−メチル−１−（アルカノイルオキシ）−エチル（これは、５個〜１０個の炭素原子を有する）、アルコキシカルボニルオキシメチル（これは、３個〜６個の炭素原子を有する）、１−（アルコキシカルボニルオキシ）エチル（これは、４個〜７個の炭素原子を有する）、１−メチル−１−（アルコキシカルボニルオキシ）エチル（これは、５個〜８個の炭素原子を有する）、Ｎ−（アルコキシカルボニル）アミノメチル（これは、３個〜９個の炭素原子を有する）、１−（Ｎ−（アルコキシカルボニル）アミノ）エチル（これは、４個〜１０個の炭素原子を有する）、３−フタリジル、４−クロトノールアクトリル、γ−ブチロールオクトン−４−イル、ジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ２〜Ｃ３）アルキル（例えば、ｂ−ジメチルアミノエチル）、カルバモイル−（Ｃ１〜Ｃ２）アルキル、Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１〜Ｃ２）アルキルカルバモイル−（Ｃ１〜Ｃ２）アルキルおよびピペリジノ−、ピロリジノ−またはモルホリノ（Ｃ２〜Ｃ３）アルキル。
【０１０１】
（本発明の方法）
本発明は、インビボおよびインビトロ抗菌方法を提供する。「抗菌」とは、細菌の成長を阻止または防止するか、細菌を殺すか、または細菌の数を減らすことを意味する。それゆえ、本発明は、細菌の成長を阻止または防止する方法を提供し、該方法は、以下の構造を有する１種またはそれ以上の化合物の有効量を細菌と接触させる工程を包含する：
【０１０２】
【化２１】
【０１０３】
本発明の化合物のさらに別の構造は、本明細書中で提供されている。
【０１０４】
また、本発明は、細菌の成長を阻止または防止する方法を提供し、該方法は、式４−［（６−アミノ−２，３−ジフェニル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−８−イルアミノ）−メチル］−Ｎ，Ｎ−ジエチル−ベンゼンスルホンアミドを有する１種またはそれ以上の化合物の有効量を細菌と接触させる工程を包含する。
【０１０５】
「細菌の成長を阻止する」とは、単一の細菌が娘細胞に分裂する能力を低下させるか細菌の集団が娘細胞に分裂する能力を低下させることとして、定義される。細菌が再生する能力は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または１００％またはそれ以上、低下できる。
【０１０６】
本発明はまた、細菌または細菌の集団を殺す方法を提供し、該方法は、本明細書中で開示し記述した１種またはそれ以上の化合物を該細菌と接触させる工程を包含する。
【０１０７】
「細菌を殺す」とは、単一の細菌の死を引き起こすこと、または複数の細菌（例えば、コロニー中のもの）の数を減らすこととして、定義される。細菌が複数形状であるとき、「細菌を殺す」とは、所定細菌集団の１０％の割合、その集団の２０％の割合、その集団の３０％の割合、その集団の４０％の割合、その集団の５０％の割合、その集団の６０％の割合、その集団の７０％の割合、その集団の８０％の割合、その集団の９０％の割合、またはその集団の１００％に等しいかそれ未満の割合での集団の細胞死として、定義される。
【０１０８】
本発明のＦｔｓｚインヒビターは、インビトロまたはインビボで抗菌活性を有する。一連の化合物が表３および表８に示される。これらの化合物を、１２．５ｇ／ｍｌの濃度でＭ．ｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖに対する潜在的な抗菌活性についてスクリーニングした。細菌増殖の少なくとも９０％阻害を示す化合物を、さらなる研究のために選択した。
【０１０９】
表３および表８に示されるように、いくつかの化合物が、最初のスクリーニングにおいて、Ｍ．ｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖに対して活性を示した。これらは、ＳＲＩ−７４０５、ＳＲＩ−３０７２、ＳＲＩ−７６１４、ＳＲＩ７４６２、４４２７−０２６−１５、４４２７−１４３、ＣＡＯ−０４０、３４９１−２３および３３０２−９８Ｆを含んだ。これらの化合物のいくつかが、以下に記載されるように、Ｍ．ｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖに対してより低濃度で試験され、最小阻害濃度（ＭＩＣ９９）（ＢＡＣＴＥＣアッセイ）を決定し、哺乳動物Ｖｅｒｏ細胞に対して試験して、ＩＣ５０（ＭＴＳアッセイ）を決定した。ＭＩＣ９９値およびＩＣ５０値を使用して、これらの化合物についての選択性指数（ＳＩ、ＩＣ５０／ＭＩＣ９９として規定される）を決定した。ＳＲＩ−７６１４は、６．２５ｍｇ／Ｌ（１９μＭ）のＭＩＣ９９を有し、＞２００μｇ／ｍｌのＩＣ５０を有した。ＳＲＩ−７６１４についての得られたＳＩは、＞３２であった。ＳＲＩ−３０７２は、０．１５μｇ／ｍｌ（０．２８μＭ）のＭＩＣ９９および６．３μｇ／ｍｌのＩＣ５０を有した。ＳＲＩ−３０７２についての得られたＳＩは、４２．０であった。さらなる結果を、表３に示す。これらの結果は、本発明の化合物について幅広い範囲の抗菌活性を示す。
【０１１０】
イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、カナマイシン、ピラジナミド、チアセタゾン（ｔｈｉａｃｅｔａｚｏｎｅ）、またはサイクロセリンのいずれかに対して単独で耐性であったＭ．ｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓの株は、ＳＲＩ−７６１４およびＳＲＩ−３０７２に対して一様に感受性であり、野生型株の値と類似したＭＩＣ９９値を有する（表５）。従って、本発明の化合物は、抗生物質耐性細菌に対して有用である。
【０１１１】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７ＲａについてのＳＲＩ−３０７２のＭＩＣおよびＭＢＣは、０．２５ｍｇ／Ｌ（０．４７μＭ）および１〜２ｍｇ／ｌ（１．９〜３．８μＭ）であった（図２）。０．９５μＭ、１．９μＭおよび３．８μＭの薬物の存在下での対数減少（ｃｆｕ／ｍＬ）は、それぞれ、０．９８±０．１１、１．７±０．０６および２．０±０．１２であった。薬物を用いない生存度コントロールでの増殖は、インキュベーションの６日後に、≧１−ｌｏｇ１０ｃｆｕ／ｍＬ増加したことを推定した（実施例１を参照のこと）。
【０１１２】
好ましい実施形態において、ＭＩＣに対するＭＢＣの殺菌比は、約４以下である。ＳＲＩ−３０７２について、この比は、１．９μＭのＭＢＣについての値を使用して、４であった。
【０１１３】
ＳＲＩ−３０７２は、感染したマウス骨髄マクロファージにおいて、Ｍ．ｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓの増殖を阻害した。７日後のミコバクテリア増殖における９０％減少および９９％減少をもたらす濃度は、それぞれ、０．２３μＭ（０．１２μｇ／ｍｌ、ＥＣ９０）および２．７μＭ（１．４２μｇ／ｍｌ、ＥＣ９９）であった。ＥＣ９０は、Ｈ３７Ｒｖ、Ｈ３７Ｒａ、Ｅｒｄｍａｎおよび薬物耐性株についてのＭＩＣ値と類似し、これは、マクロファージ内へのＳＲＩ−３０７２の適切な透過性を示す。
【０１１４】
さらに、ＳＲＩ−３０７２を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（それぞれ、グラム陰性杆体およびグラム陽性球菌を代表する）に対してアッセイした（表７）。次いで、薬物をグラム陽性杆体および球菌の拡大したパネルに対して試験し、これは、メチシリン耐性ブドウ球菌、多剤耐性ブドウ球菌およびバンコマイシン耐性腸球菌を含んだ。これらの生物に対するＭＩＣは、試験した単一のグラム陽性杆体（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）について、１６μｇ／ｍＬのＭＩＣで阻害したことを除いて、３２〜６４μｇ／ｍＬの範囲であった。結論として、ＳＲＩ−３０７２は、いくつかのグラム陽性細菌（薬物耐性株を含む）に対して中程度の活性を示した（実施例８）。
【０１１５】
本発明の化合物は、いくつかの異なるタイプの細菌の阻害によって実証されるように、抗菌活性を示した。ＳＲＩ−３０７２はまた、感染したマウス骨マクロファージにおいて、Ｍ．ｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓ Ｅｒｄｍａｎの増殖を阻害することを示した。
【０１１６】
本発明はまた、細菌に感染した被験体を治療する方法を提供し、該方法は、該被験体に、本発明の化合物の治療有効量を投与する工程を包含する。
【０１１７】
本明細書中で提供した化合物の「治療有効量」との用語は、その化合物が１つまたはそれ以上の症状の所望の減少をもたらす非毒性であるが十分な量を意味する。以下で指摘するように、必要な化合物の正確な量は、被験体の種、年齢および一般的な健康状態、治療する疾患の重症度、使用する特定の化合物、その投与様式などに依存して、被験体ごとに変わる。それゆえ、正確な「有効量」を特定することは不可能である。しかしながら、適当な有効量は、常套的な実験方法を使用するだけで、当業者により決定され得る。
【０１１８】
本発明の化合物は、当該技術分野で公知の技術を使用して、調製される。これらの化合物は、個々にまたは共同で、被験体に投与する薬学的に受容可能な担体またはビヒクルと混ぜ合わせられる。「薬学的に受容可能な担体」または「薬学的に受容可能なビヒクル」とは、好ましくない生理学的応答を引き起こすことなく、また、有害な様式でその組成物の他の成分と相互作用することなく、生きている動物またはヒトの組織と接触して使用するのに適当な任意の組成物または化合物を意味するように本明細書中で使用され、これらには、水または生理食塩水、ゲル、軟膏、溶媒、希釈液、液体軟膏基剤、リポソーム、ミセル、巨大ミセルなどが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版を参照。これは、典型的な担体およびそれらの薬剤の処方製剤と併用され得る医薬組成物を調製する通常の方法を開示しており、その内容は、本明細書中で参考として援用されている。
【０１１９】
これらの化合物は、経口的、非経口的（例えば、静脈内）、筋肉内、腹腔内、局所的、経皮的、局所的、全身的、脳室内、脳内的、硬膜下、関節内またはくも膜下腔内、鼻腔内的または挿管で、投与され得る。その薬剤および投与様式に依存して、薬剤が血液脳関門を横断するのを促進するために、特別な規定が必要であり得る。当業者は、投与様式、薬理学的担体、または血液脳関門がもたらす制約を回避する他のパラメータを改良することを知っている。投与する活性化合物の量は、もちろん、治療する被験体、被験体の体重、投与様式、および処方する内科医、獣医師または栄養士の判断に依存している。
【０１２０】
意図した投与様式に依存して、これらの医薬組成物は、固形、半固形または液状の剤形（例えば、錠剤、座剤、丸薬、カプセル剤、粉剤、液体、懸濁液、ローション、クリーム、ゲルなど）、好ましくは、正確な投薬量を１回投与するのに適当な単位剤形であり得る。これらの組成物は、上記のように、薬学的に受容可能な担体と組み合わせて、選択した薬剤の有効量を含有し、さらに、他の医薬、薬剤、担体、アジュバント、希釈剤などを含有し得る。
【０１２１】
本発明はまた、式（Ｉ）または本明細書中で提供した他の式の化合物のプロドラッグを含有する医薬組成物を包含する。本発明はまた、ＦｔｓＺの阻害により治療または予防できる障害を治療または予防する方法を包含し、該方法は、式（Ｉ）または本明細書中で提供した他の式の化合物のプロドラッグを投与する工程を包含する。遊離のアミン基、アミド基、水酸基、スルホンアミド基またはカルボン酸基を有する式（Ｉ）の化合物は、プロドラッグに変換できる。プロドラッグには、アミノ酸残基、または２種またはそれ以上（例えば、２種、３種または４種）のアミノ酸残基（これらは、ペプチドを介して共有結合されている）のポリペプチド鎖は、式（Ｉ）または本明細書中で提供した他の式の化合物の遊離のアミド基、アミノ基、水酸基またはカルボン酸機に結合した化合物が挙げられる。これらのアミノ酸残基には、３つの文字記号により一般に指定された２０種の天然に生じるアミノ酸が挙げられ、また、４−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、デモシン、イソデモシン、３−メチルヒスチジン、ノルバリン、β−フラニン、γ−アミノ酪酸、シトルリン、ホモシステイン、ホモセリン、オルニチンおよびメチオニンスルホンが挙げられる。プロドラッグには、また、カーボネート、カーバメート、アミドおよびアルキルエステルがカルボニル炭素プロドラッグ側鎖を介して式（Ｉ）の上記置換基に共有結合した化合物が挙げられる。
【０１２２】
固形組成物について、通常の非毒性固形担体には、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、滑石、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。液状の薬学的に投与可能な組成物は、例えば、本明細書中で記述した活性化合物および任意の医薬アジュバントを賦形剤（例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセリン、エタノールなど）に溶解、分散などして、それにより、溶液または懸濁液を形成することにより、調製できる。もし望ましいなら、投与する医薬組成物はまた、少量の非毒性の補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など（例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレイン酸塩など））を含有し得る。このような剤形の実際の調製方法は、公知であるか、または当業者に明らかである；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（上で引用）を参照。
【０１２３】
経口投与用の微粉末または顆粒は、希釈剤、分散剤および／または表面活性剤を含有し得、そして水またはシロップ、カプセルまたは香粉（乾燥状態）、または非水性の溶液または懸濁液（ここで、懸濁液が含有され得る）、錠剤（ここで、結合剤および潤滑剤が含有され得る）、または懸濁液（水中またはシロップ中）に存在し得る。望ましいか必要な場合、香料、防腐剤、懸濁液、増粘剤または乳化剤が含有され得る。錠剤および顆粒は、好ましい経口投与形状であり、これらは、被覆され得る。
【０１２４】
非経口投与は、もし使用するなら、一般に、注射を特徴とする。注射可能物は、通常の形態（溶液または懸濁液、注射前の液体中の溶液または懸濁液に適当な固形物形状、または乳濁液のいずれか）で、調製できる。非経口投与のための最も最近修正されたアプローチには、遅延放出または徐放システムの使用が関与しており、その結果、一定投薬レベルが維持される。例えば、米国特許第３，７１０，７０５号（その内容は、本明細書中で参考として援用されている）を参照。
【０１２５】
本発明の治療組成物はまた、リポソーム送達系（例えば、小ユニラメラベシクル、大ユニラメラベシクルおよびマルチラメラベシクル、微小球体またはナノ球体および他の遅延放出組成物）の形態で、投与できる。リポソームは、種々のリン脂質（例えば、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリン）から形成できる。
【０１２６】
本発明の治療組成物はまた、その化合物分子がカップリングする個々の担体としてモノクローナル抗体を使用することにより、送達され得る。本開示の治療組成物はまた、標的可能薬剤担体として、溶解性重合体とカップリングされ得る。このような重合体には、ポリビニルピロリドン、ピラン共重合体、ポリヒドロキシプロピル−メタクリル−アミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルとアミドフェノールまたはポリエチレンオキシドポリリシンが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本開示の治療組成物は、薬剤を制御して放出する際に有用な生物分解性重合体（例えば、ポリ乳酸、ポリε−カプロラクタム、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロ−ピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロック共重合体）にカップリングされ得る。
【０１２７】
局所投与用の液体、懸濁液、ローション、クリーム、ゲルなどは、その活性化合物が皮膚の表面に送達できる限り、使用され得る。
【０１２８】
好ましくは、この化合物の投与により、細菌感染が、少なくとも約３％、さらに好ましくは、約１０％、さらに好ましくは、約２０％、さらに好ましくは、約３０％、さらに好ましくは、約５０％、さらに好ましくは、７５％、さらにより好ましくは、約１００％少なくなる。この感染の減少は、白血球数の減少、発熱の低下、炎症の減少、細菌数の減少または細菌感染の他の指標の低下のようなパラメータにより、決定される。細菌感染の低下を高めるために、その投薬量は、被験体に対して非毒性のままとどまる最も有効なレベルまで高めることができる。
【０１２９】
本明細書全体を通じて使用される「被験体」とは、個体を意味する。好ましくは、被験体は、哺乳動物（例えば、霊長類）、さらに好ましくは、ヒトである。「被験体」は、ペット（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）および魚類を含めることができる。
【０１３０】
「細菌感染」とは、被験体または試料における細菌の存在として、定義される。このような細菌は、被験体または試料内またはその上での天然に生じる細菌の外生であり得、または外来生物体の侵入により得る。
【０１３１】
本発明の化合物は、抗生物質と同じ様式で、使用できる。抗生物質の使用は、当該技術分野で周知である。それらの使用の一例には、動物の治療が挙げられる。必要なとき、本発明の化合物は、通常、獣医師または栄養士の専門的な指針と共に、注射により、または食物または水を介して、投与できる。それらは、疾患の重症度および動物の種のような状況に依存して、個々に、または群として、いずれかで送達される。もし、全ての動物が類似の免疫状態であり、また、全てが同じ疾患を引き起こす微生物に晒されているなら、群全体の治療および看護が必要であり得る。
【０１３２】
これらの化合物を使用する他の例には、水生動物の微生物感染を減らすことが挙げられ、これは、微生物感染に罹った水生動物を選択する工程、本発明の化合物、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＴＲＩＥＮＥ）を含有する抗菌溶液を提供する工程、この溶液にｐＨ緩衝剤を加える工程、およびそれらのｐＨを約７．０と約９．０の間の値に調節する工程、この溶液に水生動物を浸漬する工程、およびその中の水生動物をその動物の微生物負荷を減らすのに有効な期間にわたって放置する工程を包含する。ＥＤＴＡ、本発明の化合物およびＴＲＩＥＮＥおよびｐＨ緩衝剤を含有する溶液への水生動物の浸漬は、その動物の微生物負荷がなくなるまで、繰り返される（米国特許第６，５１８，２５２号）。
【０１３３】
本発明の化合物の他の用途には、歯科治療および水の精製（これには、例えば、市の上水道、下水処理システム、飲用および非飲用の給水、および孵化場を挙げることができる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
上記方法の１つの実施形態は、ＦｔｓＺ重合を阻害する化合物が、チューブリンの重合を阻害しないことである。チューブリンは、微小管（生細胞の骨格系として役立つ中空繊維）を形成する長鎖またはフィラメントへと重合するタンパク質である。微小管は、細胞が有糸分裂を起こし得るかまたは細胞内輸送を調節し得る種々の形成を介して移動する能力を有する。
【０１３５】
「チューブリンの重合を阻害する」は、コントロールと比較して、重合したチューブリンの量を減少させる（すなわち、重合体のサイズおよび／または数の減少）として規定される。好ましくは、このような阻害は、１００％以下のチューブリンの重合を阻害すること、９０％以下のチューブリンの重合を阻害すること、または８０％以下のチューブリンの重合を阻害すること、または７０％以下のチューブリンの重合を阻害すること、または６０％以下のチューブリンの重合を阻害すること、または５０％以下のチューブリンの重合を阻害すること、または４０％以下のチューブリンの重合を阻害すること、または３０％以下のチューブリンの重合を阻害すること、または２０％以下のチューブリンの重合を阻害すること、または１０％以下のチューブリンの重合を阻害すること、または５０％以下のチューブリンの重合を阻害することを包含する。
【０１３６】
今回、本発明の化合物のいくつかの高い活性の抗菌化合物は、抗新生物／チューブリン阻害活性を示す２−ＡＣＰクラスのメンバーによって示される関係とは有意に異なる構造−活性関係（ＳＡＲ）を示した。従って、ヒトチューブリンと細菌ＦｔｓＺタンパク質との間には違いが存在する。さらに、ＦｔｓＺとチューブリンの両方がチューブリン−同一性モチーフ（ＧＧＧＴＧＳ／ＴＧ）（配列番号１）を共有するものの、ＦｔｓＺとチューブリンとの全体的なアミノ酸配列類似性は、低い（＜２０％同一性）。それにもかかわらず、ＦｔｓＺおよびチューブリンは、類似した３次元の折り畳みを有することが見出され、そしてＦｔｓＺは、チューブリンの細菌ホモログであるようである。
【０１３７】
本発明はまた、細菌においてＦｔｓＺ重合体化を阻害する方法を提供し、該方法は、細菌を本発明の化合物と接触させる工程を包含する。
【０１３８】
ＦｔｓＺは、多くの細菌細胞の細胞分裂プロセスにおいて重要な役割を果たす。ＦｔｓＺは、４０ｋＤａのタンパク質であり、これは、細菌内でほぼ偏在している。ＦｔｓＺは、葉緑体の中にも存在する。ＦｔｓＺは、ＧＴＰ依存性様式で重合体化し、そして細菌チューブリンホモログであることが示されている。ＦｔｓＺおよびチューブリンは、まず直鎖状のプロトフィラメントを形成し、次いで、これらのプロトフィラメントは、シートおよびチューブのようなより大きな構造内に結合する。しかし、上で考察したように、ＦｔｓＺおよびチューブリンの配列類似性は、全体的には低いが（＜２０％同一性）、ＦｔｓＺおよびチューブリンの両方は、チューブリン同一性モチーフとして公知の一続きのアミノ酸（ＧＧＧＴＧＳ／ＴＧ）（配列番号１）を共有するし、このアミノ酸は、ＧＴＰに結合し、加水分解するように作用する。Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のＦｔｓＺは、チューブリンと類似の３次元折りたたみを有することが示された。細胞分裂プロセスにおいて、細菌は、通常はＭｉｎ Ｃタンパク質、Ｍｉｎ Ｄタンパク質、およびＭｉｎ Ｅタンパク質の助けによってまず細胞分裂に適切な部位（壁（ｓｅｐｔｕｍ）が形成する位置）を選択する。ＦｔｓＺは、壁（ｓｅｐｔｕｍ）に現れる第１の非調節エレメントであり、そして壁（ｓｅｐｔｕｍ）の作用は、正しいＦｔｓＺ作用に依存することが示されている。ＦｔｓＺ作用の阻害は、種々の型の細菌および葉緑体における細胞分裂の欠損に関わっている。実際、ＦｔｓＺのチューブリン同一性モチーフにおける１つのアミノ酸置換は、壁（ｓｅｐｔｕｍ）形成を開始することの不全をもたらす。細胞分裂または分離のプロセスの間、ＦｔｓＺ環の直径は小さくなり、環乳する細胞壁の先端を残すようになる。従って、ＦｔｓＺは、細菌細胞分裂の中枢的な役割を果たすため、新規の抗菌剤にとって非常に見込みのある標的である。
【０１３９】
「ＦｔｓＺ重合体化の阻害」は、コントロールと比較して、１つの細菌または細菌集団の中で生じ、ＦｔｓＺ重合体化の量を低減させるか、または阻害する（大きさおよび／またはポリマーの数のどちらかにおいて）と定義される。全体を通して使用されるように、「コントロール」は、無処理細菌または無処理細菌集団である。無処理細菌または無処理細菌集団は、前処理または後処理された細菌であり得るか、または独特の細菌集団であり得る。
【０１４０】
ＦｔｓＺ重合体化は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％未満、または１００％以下に低減される。
【０１４１】
この化合物を、ＦｔｓＺおよびチューブリンの重合体化およびＦｔｓＺ ＧＴＰ加水分解の阻害について試験した。チューブリンインヒビターとして公知であるコルヒチンもまた、参照化合物として含まれる。ＳＲＩ−３０７２、ＳＲＩ−７６１４、およびコルヒチンは、それぞれ５２±１２、６０±０．０、および１０４±２．０μＭのＩＤ５０値を有する容量依存性様式でＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺの重合体化を阻害した（表６）。ＦｔｓＺによるＧＴＰ加水分解は、ＦｔｓＺの重合体化が進行するために必要とされ、各化合物を、ＧＴＰ加水分解の阻害について試験した。ＳＲＩ ３０７２、ＳＲＩ
７６１４、およびコルヒチンで阻害されたＧＴＰ加水分解は、それぞれ２０％、２５％、および３０％、である。
【０１４２】
また、ＳＲＩ−３０７２、ＳＲＩ−７６１４およびコルヒチンを、チューブリン重合体化のインヒビターとして評価した（表５）。予測したように、コルヒチンは、ＦｔｓＺのインヒビターとしてよりも、チューブリンのインヒビターとしてより効果的であった。ＳＲＩ−３０７２は、ＦｔｓＺに特異的である；チューブリンの阻害は示されなかった。コルヒチンのように、ＳＲＩ−７６１４は、両タンパク質の重合体化を阻害した（ＩＤ５０＝６０μＭ ＦｔｓＺ、ＩＤ５０＝４μＭチューブリン)。上記で考察し、表６で示した
ように、ＳＲＩ ３０７２およびＳＲＩ−７６１４は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの有効かつ特異的なインヒビターである。また、実施例８において考察したように、ＳＲＩ−３０７２はまた、他の型の細菌についても有効かつ特異的である。
【０１４３】
従って、１つの実施形態において、この化合物は、チューブリン重合体化を阻害することなく、ＦｔｓＺ重合体化を阻害する。チューブリン重合体化の阻害の非存在は、アッセイのバックグラウンドの１．５倍未満の任意の阻害、または実質的な有意性を欠く任意の阻害を含む。選択された化合物（ＳＲＩ−３０７２およびＳＲＩ−７６１４によって説明される）の抗細菌活性とＦｔｓＺ重合体化とＧＴＰ加水分解との間には、相関関係が存在する。
【０１４４】
（化合物の構造）
本発明の方法は、置換２−アルコキシカルボニルアミノピリミジンまたは２−アルコキシカルボニルアミノ−ピリジン（「２−ＡＣＰ」）化合物に関するか、またはそれを利用する。本発明の種々の方法で使用される化合物の化学構造は、式（Ｉ）の化合物により、例示される：
【０１４５】
【化２２】
【０１４６】
ここで、Ｘ１およびＸ２は、ＮまたはＣＨラジカルであり得るが、但し、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである。もし、Ｘ１およびＸ２の両方がＮなら、この化合物は、以下で示す構造（Ｉａ）を有する置換ピリミジン化合物である。もし、Ｘ１およびＸ２の１個だけがＮであるなら、この化合物は、以下で示す式（Ｉｂ）または（Ｉｃ）の置換ピリジン化合物である。
【０１４７】
【化２３】
【０１４８】
Ｓ１は、有機ラジカルであり、これには、アルキル基または低級アルキル基が挙げられるが、これらに限定されない。この２−ＡＣＰ核には、数回の置換を行うことができ、従って、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４は、別個に、水素、アミノ、ハロゲン、または１個またはそれ以上の有機ラジカルであり得、これは、その用語が本明細書中の他の箇所でさらに定義されているように、以下でさらに述べるように、その中にＮ、Ｏ、Ｓおよびハロゲンヘテロ原子を有する有機ラジカルを含む。Ｓ１がアルキル基であるとき、アルコキシカルボニルアミノラジカル（すなわち、カーバメートラジカル、カルバミン酸のエステル）が得られ、これは、ヘテロ芳香族ピリミジン環またはピリジン環の「２」位置で、その炭素に結合されており、それゆえ、「２−ＡＣＰ」との術語を使用する。しかしながら、この「２−ＡＣＰ」との術語は、必ずしも、可能なＳ１ラジカルの素性または組成をアルキルのみに限定するものではない。
【０１４９】
多くの実施態様では、本発明の方法に関連した２−ＡＣＰ化合物は、以下で示すように、式（ＩＩ）のヘテロ芳香族化合物である：
【０１５０】
【化２４】
【０１５１】
式（ＩＩ）の化合物では、「Ａ」環は、６員芳香族複素環（すなわち、ヘテロアリール）であり、これは、ピリミジン（Ｘ１およびＸ２の両方がＮである）またはピリジン（Ｘ１およびＸ２の一方がＮであり、そして他方がＣＨである）のいずれかである。Ｘ４は、水素、ハロゲン、有機ラジカル（これには、これには、アルキル基またはメチレン基が挙げられるが、これらに限定されない）、酸素原子、イオウ原子、リン原子またはハロゲン原子であり得るが、多くの実施態様では、窒素ベースラジカル（例えば、アミノ、一置換アミノまたは二置換アミノラジカル）である。
【０１５２】
「Ｂ」環の性質は、変えることができる。Ｘ３ラジカルは、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、またはＮＨラジカルであり得る。「Ｂ」環は、芳香族であり得るか、または部分的または完全に飽和であり得る。「Ｂ」環は、図面で示すように、少なくとも１個のＮ原子またはＮＨラジカル、および少なくとも１個のＸ３ラジカルを含有する。このＮ原子とＸ３ラジカルとの架橋は、少なくとも１個の炭素ベースラジカル（これは、少なくとも１個のＲ３置換基および任意のＲ３置換基を有する）であり、その結果、「Ｂ」環は、少なくとも５個の環原子を有する。
【０１５３】
（ＩＩ）の化合物はまた、６員または７員「Ｂ」環を含有し得、これらは、０個、１個または２個の追加「Ｃｎ」架橋炭素ラジカル（すなわち、ｎは、０、１または２であり得る）に対応している。これらのＣｎ架橋した炭素ベースのラジカルは、Ｒ４またはＲ５置換基を有し、必要に応じて、追加Ｒ４またはＲ５置換基を有し得る。もし、ｎ＝０なら、上述のように、追加Ｃｎラジカルは存在せず、そして５員「Ｂ」環が得られる。もし、ｎ＝１なら、「Ｂ」環には、ＣＲ４架橋ラジカルが存在し、これは、必要に応じて、追加Ｒ４置換基を有し得、それは、Ｒ４と同一または異なり得、６員環「Ｂ」環が得られる。もし、ｎ＝２なら、追加ＣＲ５架橋ラジカル（また、必要に応じて、追加Ｒ５置換基）も存在し、７員「Ｂ」環の複素環が形成される。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５置換基は、水素、ハロゲン、酸素（これは、カルボニル基を形成する）、アミノ、ヒドロキシ、または任意の有機ラジカル（この用語は、本明細書中の他の箇所で定義されている）であり得る。Ｒ２は、任意の置換基である。
【０１５４】
式（ＩＩ）の化合物の多くの実施形態では、Ｘ３は、Ｎであり、Ｒ１は、低級アルキル基（例えば、メチルまたはエチル）である；Ｒ２は、アミノ、一置換アミノまたは二置換アミノラジカルであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ３’、Ｒ４’またはＲ５’は、水素である。関連した実施形態では、Ｒ２〜Ｒ５は、フェニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、Ｘ−Ｐｈ、Ｘ−ＰｈＣＨ２、ＨｅｔＡｒＣＨ２、Ｍｅ２ＮＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、ＭｅＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎなどであり得る。Ｃｎ炭素原子の１個が２個の異なるＲｘ基を有する多くの場合、得られる化合物は、キラルである可能性があり得ることに注目すべきである。
【０１５５】
ある実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、芳香族「Ｂ」環を有する。例えば、もし、ｎ＝１であり、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３が、Ｎであるなら、この環は、Ｒ３およびＲ４置換基が存在しないように、芳香族であり、式（ＩＩａ）の「プテリジン」属の化合物が得られる。もし、ｎ＝１であり、そしてＸ１およびＸ２の一方が、ＣＨであるなら、他方は、Ｎてあり、Ｘ３は、Ｎであり、そして「Ｂ」環は、式（ＩＩｂ）および（ＩＩｂ’）の芳香族「デアザ−プテリジン」化合物が得られる。
【０１５６】
【化２５】
【０１５７】
本発明の化合物の一部の実施形態では、Ｒ１が低級アルキル基（メチルまたはエチルを含めて）であることが好ましい。他の実施形態では、細菌の対する活性は、時には、それより大きい有機置換基（例えば、アリール、ヘテロアリールまたはそれより大きいアルキル）を使用することにより、高めることができる。
【０１５８】
一部の実施形態では、Ｒ３およびＲ４は、ベンゼンラジカルである。一部の実施形態では、Ｒ２−Ｘ４ラジカルは、アミノまたは一置換アミノラジカルである。
【０１５９】
式（ＩＩｂ）の数種の例は、以下の表３で示し、これらには、化合物「ＳＲＩ−３０７２」が挙げられ、これは、本発明の方法で使用したとき、特に有効であることが明らかとなっている。
【０１６０】
【化２６】
【０１６１】
ＳＲＩ−３０７２＝［８−（４−ジエチルアミノ−１−メチル−ブチルアミノ）−２，３−ジフェニル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−６−イル］−カルバミン酸エチルエステル
「Ｂ」環は、以下の式（ＩＩｃ）および（ＩＩｄ）の化合物により示されるように、芳香族である必要はなく、Ｒ３’および／またはＲ４’置換基ラジカルが存在している結果として、部分的または完全に飽和であり得る：
【０１６２】
【化２７】
【０１６３】
還元した非芳香族「Ｂ」環を有するデアザ−プテリジン化合物の具体的な例には、以下で示すような化合物ＳＲＩ−５７１３およびＳＲＩ−２０１５８がある。
【０１６４】
【化２８】
【０１６５】
ＳＲＩ−２０１５８＝［５−アミノ−３−（４−ブチルカルバモイルオキシ−フェニル）−２−メチル−１，２−ジヒドロ−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−７−イル］−カルバミン酸エチルエステル
【０１６６】
【化２９】
【０１６７】
ＳＲＩ−５７１３＝（５−アミノ−３−｛［（４−メトキシ−フェニル）−メチル−アミノ］−メチル｝−１，２−ジヒドロ−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−７−イル）−カルバミン酸エチルエステル
芳香族「Ｂ」環を有する他の属の化合物では、もし、ｎ＝０であり、Ｘ１が、ＣＨであり、Ｘ２が、Ｎであり、そしてＸ３が、ＮＨなら、式（ＩＩｅ）を有する２−カーバメート置換プリン属の化合物が得られる：
【０１６８】
【化３０】
【０１６９】
さらに他の属の化合物では、もし、ｎ＝２であり、そしてＸ３が、ＮＨであるなら、式（ＩＩｆ）を有する２−置換ジアゼピン属の化合物が得られる：
【０１７０】
【化３１】
【０１７１】
本発明の方法の一部の実施形態では、以下で示す属のジアゼピン化合物（ＩＩｇ）は、特に重要である：
【０１７２】
【化３２】
【０１７３】
上記属に由来の特定のピリド−ジアゼピン化合物であるＳＲＩ−７６１４は、本発明の方法で重要であることが発見されている。
【０１７４】
【化３３】
【０１７５】
ＳＲＩ−７６１４＝（１−アミノ−８−フェニル−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−２，５，９−トリアザ−ベンゾシクロヘプタン−３−イル）−カルバミン酸エチルエステル
式（Ｉ）の２−ＡＣＰ化合物のさらに他の実施形態では、化合物は、「Ｂ」環を全く有しない。このような式（ＩＩＩ）を有する単環式化合物の亜属は、以下で示す。
【０１７６】
【化３４】
【０１７７】
式（ＩＩＩ）の化合物に関連した本発明の種々の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物についてこの上で記述した意味のいずれかを有し得る。これらの実施形態では、Ｃｎは、水素、または本明細書中の他の箇所で定義した任意の有機ラジカルであり得る。表３で示したこの属の種には、ＳＲＩ−７４０５があり、その構造は、以下で示す；
【０１７８】
【化３５】
【０１７９】
ＳＲＩ−７４０５＝［５，６−ジアミノ−４−（２−ヒドロキシ−１−メチル−３−フェノキシ−プロピルアミノ）−ピリジン−２−イル］−カルバミン酸エチルエステル
本発明の化合物の例には、以下の表３で示した化合物が挙げられるが、これらに限定されず、これらの化合物には、ＳＲＩ−７４０５、ＳＲＩ−３０７２、ＳＲＩ−７６１４、ＳＲＩ−７４６２、４４２７−０２６−１５、４４２７−１４３、ＣＡＯ−０４０、３４９１−２３および３３０２−８９Ｆ、ＳＲＩ−５７１３、およびＳＲＩ−２０１５８が挙げられる。追加例は、表８にある。
【０１８０】
（表３：２−ＡＣＰ化合物の抗菌活性）
【０１８１】
【表３−１】
【０１８２】
【表３−２】
【０１８３】
【表３−３】
【０１８４】
【表３−４】
【０１８５】
（ＰＩ＝１２．５％μｇ／ｍｌでの成長阻害％）。
【０１８６】
（化合物の構造活性関係）
上記開示は、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３での一定範囲の置換およびＲ１〜Ｒ５基での複数の置換基を想定している。理論および実験に基づいた関係のいずれかに束縛されることを望まないものの、予備的には、式（Ｉ）の化合物の置換パターンと、本発明の方法の少なくとも一部で認められる活性との間には、特定の実験に基づいた関係が認められている。
【０１８７】
例えば、式（ＩＩ）（式（ＩＩａ）および式（ＩＩｂ）を含めて）の芳香族化合物（ここで、Ｃｎ＝１であり、そしてＲ３およびＲ４は、両方とも、比較的に大きくかつ立体的に嵩張った基（例えば、フェニル基）である）の場合、これらのフェニル基の互いの相互作用は、そのプテリジン構造の芳香族性を弱め、そして側鎖基（この場合、フェニル基）を芳香環構造の平面から伸長させることができる。これにより、Ｒ３およびＲ４のフェニル基の１個がＦｔｓＺの活性部位で相互作用できる立体配座が生じ得る。
【０１８８】
式（ＩＩｆ）の化合物（ここで、Ｃｎ＝２である）の場合、その７員環は、平面ではなく、Ｒ３〜Ｒ５の側鎖基をそれらがＦｔｓＺの活性部位と相互作用し得る位置に置く。これらの化合物の作用の他の機構が存在し得、出願人は、他の作用機構を本開示の範囲からはずすつもりはない。
【０１８９】
上述の置換パターンにより、これらの化合物は、チューブリン阻害よりもＦｔｓＺ阻害に対して選択的にされる。表４は、代表的な種類として３−デアザプテリジンを使用するＦｔｓＺの選択的阻害に関する化合物の間の一般的な構造活性関係を要約している。他の化合物（ピリドジアゼピン化合物を含めて）の類似の構造−活性関係は、予想され得る。
【０１９０】
（表４：２−ＡＣＰ化合物の構造−活性関係）
【０１９１】
【表４】
【０１９２】
表４の化合物の命名法および／または置換基標識化は、上で示した式（ＩＩａ〜ｇ）の化合物に付けたものとは異なるが、しかしながら、式（ＩＩａ〜ｇ）の構造における同様の位置での置換基は、同等であり得ることが認められる。
【０１９３】
例えば、表４で示した領域Ｄで置換された化合物は、著しい抗結核活性を維持できる（表３、エントリー２、４、６および８を参照）。典型的な抗癌剤である７，８−ジヒドロ−１−デアザプテリジンにおけるこの「Ｄ」位置での置換は、チューブリンの結合および抗癌活性を大きく減少させるかなくす。実際、ＳＲＩ−３０７２（表３、エントリー２）は、ＦｔｓＺ重合およびＧＴＰ加水分解における阻害剤として良好な活性を有するが（表５）、１００μＭでウシチューブリンの重合に対する効果はない。明らかに、これらの化合物間での領域Ｄにおける可変性（表６）は、それらの化合物の選択性および活性に影響を与える。
【０１９４】
領域Ａでは、抗癌活性に最適なＲ１基は、メチル基またはエチル基である；それらより大きいアルキル基は、チューブリン結合活性を大きく削減し得る。対照的に、それらより大きいＲ１アルキル基（例えば、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ベンジル）を有する種々の化合物は、著しい抗菌活性を示し（１２．５μｇ／ｍＬでの細菌成長の＞９５％の阻止）、このことは、これらの化合物がまた、ＦｔｓＺ重合も阻害できることを示唆している。それゆえ、領域ＡのＲ１基における変化もまた、これらの化合物の選択性および活性に影響を与え得る。
【０１９５】
領域ＢおよびＣでは、そのカーバメート（領域Ｃ）は、このデアザプテリジン環系の２位置でのＨＮ−官能基（領域Ｂ）と同様に、最適な抗新生物活性に絶対的に必要である。対照的に、このカーバメートを有しない３−デアザプテリジン類の化合物は、著しい抗菌活性を維持できる（表３の４４２７−１４３を参照）。従って、この領域での変化もまた、これらの２−ＡＣＰ化合物の選択性および活性に影響を与え得る。
【０１９６】
領域Ｇ（これは、小領域ＥおよびＦから構成される）は、この１−デアザ−７，８−ジヒドロプテリジンのチューブリン結合および抗癌活性の重要な決定因子である。領域Ｅ（１−デアザプテリジン環の８位置）では、そのヘテロ原子置換は、ＮＨでなければならず、そうでなければ、活性が失われる。対照的に、Ｏ−およびＳ−の両方で置換した化合物（例えば、化合物ＣＡＯ−０４０、表３のエントリー７）は、著しい抗菌活性を保持すると思われる。領域ＥでのＳＡＲプロフィールのこの変化は、他の重要な点に相当し、この場合、他のヘテロ原子での置換は、抗菌活性およびＦｔｓＺ阻害に対する選択性を押し進め得る。
【０１９７】
さらに、このピリドピリダジンまたは１−デアザ−７，８−ジヒドロプテリジン環系の「Ｂ」環の還元形状は、最適な抗新生物活性に絶対的に必要である。完全に芳香族性の「Ｂ」環系を有する化合物（例えば、ＳＲＩ−３０７２）なら、表６で示すように、チューブリンを阻害するとは予想されない。最後に、これらの２−ＡＣＰ化合物の領域Ｆにおける置換は、活性および選択性に決定的に影響を与え得る。一般に、Ｒ３およびＲ４には、小さい基が最適である（典型的には、チューブリン結合および抗新生物活性には、Ｈ−またはＭｅ−置換）。より大きい基（例えば、ＳＲＩ−３０７２における７−フェニル置換）は、チューブリン結合および抗新生物活性には許容されない。それにもかかわらず、ＳＲＩ−３０７２のような化合物は、著しい抗菌活性を示し、それらのＳＡＲは、哺乳動物のチューブリン重合を阻止する化合物とは異なる。さらに、これらの化合物のいくつか（例えば、ＳＲＩ−３０７２）は、印象的な選択性指数を有する。
【０１９８】
さらに、本発明の化合物の分子量が約５００グラム／モル未満、好ましくは、約４５０または４００グラム／モル未満であるとき、しばしば、改良された生体活性が得られることが発見されている。
【０１９９】
（代表的な化合物の合成）
合成的には、式（Ｉ）、（ＩＩａ〜ｇ）および（ＩＩＩ）の化合物の多くは、２つの重要な中間体のうちの１つによりアクセス可能であり、それらの構造は、以下で示す。
【０２００】
【化３６】
【０２０１】
式（Ｉｂ）および式（Ｉｃ）の多くのピリド２−ＡＣＰ化合物に適当な出発物質は、構造３を有し、これらはまた、図６で示され、そして当該技術分野で概説された方法（Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３１：１８９０−１８９４，１９６６；Ｔｅｍｐｌｅら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３０：１７４６−１７５１，１９８７；Ｌｉｓｔｅｒ，Ｊ．Ｈ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｒｏｍ Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ＩＩ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；（Ｔａｙｌｏｒ，Ｅ．Ｃ．；著），１９９６，ｐａｓ ２１− ５９；Ｂａｒｒｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．，５９：２２１ −２３１，２０００；Ｓｈｏｒｔｎａｃｙ，Ａ．Ｔ．ら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，８（５＆６）：９１１−９１３，１９９６）により、ケリダミン酸（ｃｈｅｌｉｄａｍｉｃ ａｃｉｄ）（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｕ．Ｓ．Ａ．）から、１４％の全収率で、８工程で入手できる。これらの参考文献の内容は、これらの方法について、本明細書中でその全体が援用されている。この調製は、大量の化合物３を得るために、規模が拡大されている。式（Ｉａ）のピリミジン化合物の調製に必要な同様に重要な出発化合物１１の調製は、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４６：５４０５−５４０７（１９８１）（その内容は、これらの方法について、本明細書中でその全体が援用されている））で開示されているように、高収率で、ずっと安価な出発物質から、ずっと容易である（図６を参照）。
【０２０２】
図６で示すように、式１の３−デアザプテリジン化合物（例えば、ＳＲＩ−３０７２）は、化合物３の４−クロロ基を置換第一級または第二級アミンで置き換えて化合物４を形成し、続いて、化学量論的な水素化物源（例えば、ＮａＢＨ４）との種々の公知反応のいずれかまたは種々の触媒による触媒水素化によって５−ニトロ基を選択的に還元してオルトジアミン化合物５を形成することにより、容易に得ることができ、これは、１，２−ジケトンまたはベンジル誘導体（Ｇａｂｒｉｅｌ Ｃｏｌｍａｎ型の調製）と縮合でき、最終標的クラス１が得られる（Ｆｒｙｅｒ，Ｒ．Ｉ．；ら、Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；（Ｔａｙｌｏｒ，Ｅ．Ｃ．；編），ｐｇｓ ２０９−４２０，１９９１；Ｈａｄｄａｄ，Ｍ．ら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．３８（３４），５９８１−５９８４，１９９７；Ｅｎｇｌｉｓｈ，Ｊ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７８，４０５７−４０６０，１９５６；Ｈｏｒｎｅｒ，Ｊ．Ｋ Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１０，３８７−３９１，１９６７；Ｓｔｏｉｌｏｖａ，Ｖ．ら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１０５−１０６，１９９７）。この反応は、同じＲ３およびＲ４ラジカルを有する対称化合物を調製するのに非常に有用であり、種々の適当なジケトンが利用可能である（Ｍａｔｙｕｓ，ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７，１０７−１１４，１９９７；Ｃｕｒｒａｎ，Ｄ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０４，４０２４−４０２６，１９８２；Ｍｕｋａｉｙａｍａ，Ｔ．Ｐｕｒｅ ＆ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５５（１１），１７４９−１７５８，１９８３ Ｍｕｋａｉｙａｍａ，Ｔ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９６：２４，７５０３−７５０９，１９７４；Ｌｅ Ｒｏｕｘ，Ｃ．；Ｇａｓｐａｒｄら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８，１８３５−１８３９，１９９３；Ｋｕｗａｊｉｍａ，Ｉ．ら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２１，１８１７−１８２０，１９７６；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９，３５９０−３５９６，１９９４；Ｏｉｓｈｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０，８２７１−８２７２，１９９８；Ｎｏｙｏｒｉ，Ｒ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３，２１０６−２１０８，１９８１）。この反応手順で非対称ケトンを使用するとき、Ｒ３およびＲ４での異性体の混合物が得られ得る。得られる生成物の割合は、これらのケトンの反応性の差だけでなく、そのジアミンの反応性（その環窒素に対してメタ位置であるニトロ基の還元により誘導されるアミンは、最も反応性が高い）により、制御できる。ある場合には、容易に分離可能な混合物が調製された。
【０２０３】
時には、Ｒ３およびＲ４に関して明確なレギオ化学作用を与える反応が利用できる。例えば、プテリジンのＴｉｍｍｉｓ型調製では、容易に入手できるハロカルボニル化合物は、レギオ特異的に反応でき、７，８−ジヒドロデアザプテリジンが得られ、これは、容易に空気酸化でき、完全な芳香族系が得られる。この状況には、５，６−ジアミノ−ピリミジンの興味深い有用な反応もまた適用できる（Ｂｏｄｎａｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：４７３７−４７４５，１９９７）。この反応では、反応性がより高い５−アミノ基が、まず、アルデヒドと反応され、続いて、その６−アミノ基がオルトエステルと反応される。加熱すると、閉環が開始し、６，７−二置換プテリジンが得られる。この状況は、反応性が高いメタアミノ基が反応性イミンを形成できること、また、閉環が残りの６−アミノ基とオルトエステルとの反応および加熱により実行できること以外は、類似している。他の代替物（例えば、ヒドロキシおよびアミノケトン）もまた、有用であることが証明できる（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５０（２），３３５−３４６，１９９４；Ｍａｒｋｓ，Ｍ．Ｊ．；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４７：５２−５６，１９８２；Ｓｔｅｒｇｉａｄｅｓ，Ｉ．Ａ．；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，７５４７−７５５１，１９９９；Ｂｒｏｗｎ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．；４０，７８７５−７８７７，１９９９；Ｋｏｋｕｂｏ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２，４５６４−４５６５，１９９７；Ｍｏｒｉｈａｔａ，Ｋ．ら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．６（３１），５５５５−５５５８，１９９５；Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｄ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３６：２８１８−２８２３，１９７１；Ｔｅｍｐｌｅ，Ｃ．，Ｊｒ．ら、Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．７：４５１−４５４，１９７０）。この１−デアザプテリジン環系では、レギオ化学作用が容易に制御できること、完全に芳香族性の６，７−二置換デアザプテリジンが重要であり得ることに注目すべきである。最後に、適当に置換した３−デアザプテリジンを得るために、ピリドジアゼピン標的（２）について述べたものと類似のいくつかの代替的なアプローチが使用できる。
【０２０４】
式（ＩＩｆ）の二環式ジアゼピン（例えば、図７で示した化合物２）は、典型的には、ｏ−アリーレンジアミンを、α，β−不飽和アルデヒド、α，β−不飽和ケトン、β−ハロケトン、β−アミノケトンまたはβ−ヒドロキシケトンと反応させるこことにより、調製される。もし、このジアミンまたはカルボニル官能基のいずれかが非対称であるなら、混合物が生じ得る。これらのピリドジアゼピンの場合、レギオ選択性は、３の反応性の４−クロロ基と３−アミノプロパノールとを反応させることにより、制御できる（Ｔｅｍｐｌｅら、Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．７：４５１−４５４，１９７０）。広範囲の置換３−アミノプロパノールが合成的に利用可能である（Ｔｅｍｐｌｅ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．７：１１９５−１２０２，１９７０；Ｔｅｍｐｌｅ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：８５３−８５７，１９７０；Ｗａｒｉｎｇ，Ａ．Ｊ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．（Ｓｔｏｄｄａｒｔ，Ｊ．Ｒ．；Ｅｄ．），Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ｐｇｓ．１０１７−１０９５；１９７９；Ｂｕｌｍａｎ−Ｐａｇｅ，Ｐ．Ｃ．ら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．４８（３５）：７２６５−７２７４，１９９２；Ｏｌａｈ，Ｇ．Ａ．ら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１１７７−１１７９，１９９１）。例えば、多様な３−アミノプロパノールは、３−ヒドロキシケトンを還元的にアミノ化することにより調製でき、これらのケトンは、順に、典型的には、Ｍｕｋａｉｙａｍａ−Ａｌｄｏｌ反応だけでなく、他の方法により、調製される（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔｅｒｓ３４（２３）：３６８３−３６８６，１９９３；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．；ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４８：１９０９−１９１２，１９８３；Ｓｈｉ，Ｚ．ら、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１１（９），７５７−７６０，２０００；Ｊｉａｎｇ，Ｊ．−Ｌ．ら、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２８（２），４１３７−４１４２，１９９８；Ｋａｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．ら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．３８（３８），６７１７−６７２０，１９９７；Ｖｅｒｌｈａｃ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２６（４９）：６０７５−６０７８，１９８５；Ｙｏｎｅｄａ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｉ，１３３６−１３３９；Ｔｅｍｐｌｅ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３４：３１７６−３１８１，１９８１；Ｓｅｙｆｅｒｔｈ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４８：１１４４−１１４６，１９４８．）。
【０２０５】
図８で示すように、この３−アミノプロパノールのアミノ基は、化合物３の芳香環の塩化物置換基を置き換えて化合物６が得られるように反応できる。化合物６と類似の他の化合物は、化合物３のアミノ基を種々の有機および無機求電子試薬（例えば、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アシル、エポキシドなど）と反応させることにより、調製できる。化合物６およびその類似物のニトロ基は、還元でき、アミン化合物６’が得られる。化合物６’およびその類似物は、上で開示した式（ＩＩＩ）を有する化合物の属の構成要素である。
【０２０６】
化合物６の水酸基の酸化により、ニトロ−ケトン７が得られ、その芳香環の５−ニトロ基を還元カップリングに続いて内部環化すると、このジアゼピン環が形成される。強力な化合物であるＳＲＩ−７６１４は、構造８（Ｒ１＝Ｅｔ、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６＝Ｈ）を有するジアゼピン化合物の属の良好な例である。この反応スキームにより、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６で著しい多様性を有する種々の化合物を調製することが可能となる。位置Ｒ４、Ｒ５およびＲ６での変化は、この３−デアザプテリジン環系（これらは、生体活性および選択性に著しい影響があると思われる）での類似の効果の点から、生体活性に影響を及ぼし得、これらの３−デアザプテリジンの類似のアミノ基での置換もまた、生体活性および選択性を著しく変え得る（ＳＲＩ−３０７２および４４２７−０２６−１５）。
【０２０７】
図８で示した化合物８に至る反応では、このピリジン環の４−アミノ基での変化が容易にでき得ない。このアミノ基での置換を変えるために、ジアゾ化を介する化合物８のアミノ基の加水分解に続いて得られた水酸基のクロロ脱水酸化により、化合物１０のクロロ基が得られ、これは、次いで、この位置での多様性を得るために、種々のアミンで置き換えることができる。ピリジンでのクロロ基は、典型的には、電子供与性官能基で置換されている。求核性が低いアミンは、苛酷な条件が必要であり得る。この位置での一部の多様性は、８でジアゼピン環系を作成するように進める前に、３の初期還元アミノ化により、誘導できる。興味深いことに、構造８の種々のアミンでの還元アミノ化もまた使用できるが、還元し過ぎたテトラヒドロジアゼピンが得られる。
【０２０８】
この４−クロロ基の存在下にて、この６−クロロを選択的に置き換えることにより、８〜１０により例示した一連の反応を介して、図８（３）の６−アミノ基を６−クロロ基に変えることも可能であり得る。最後に、重要な６−アミノ基で多様性を生じる代替経路として、Ｔｅｍｐｌｅら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１７４６−１７５１，１９８７）で詳述された一連の反応に従って、他のピリジンカルボン酸、シトラジン酸で開始することが可能であり得る。シトラジン酸からピリドジアゼピン系を形成する一連の工程は、完全に酸化した１，５−ジアゼピン、または２，３−ジヒドロ−またはテトラヒドロ−１，５−ジアゼピンを生成するのに使用できる。ＳＲＩ−７６１４は、２，３−ジヒドロジアゼピンである。
【０２０９】
式（Ｉａ）のピリミジン化合物もまた、合成できる。第一に、類似の重要な中間体の調製は、ずっと安価な出発物質から、ずっと容易である（図８の３と１１とを比較して）（Ｋｕｅｂｒｉｃｋら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９３：１２１４−１２２０，１９７１）。これらのアザ類似物の少数は、出願人の機関で調製し、そしてチューブリンに対する活性についてスクリーンした。これらのピリミジン類似物は、対応するデアザ類似物よりもずっと毒性が低く、活性および毒性の点で、これらのピリドジアゼピンと同様に作用することが発見された（図８の構造２）。
【０２１０】
１で表わされる化合物の調製は、上で概説したアプローチと直接類似している。２のアザ類似物の調製には、このジクロロ類似物を窒化して１個のクロロ基を３−アミノプロパノール類似物で置き換えることが必要であり得る。残りのクロロ基は、置換アミンで置き換えることができるか、または一組の反応は、このジアゼピンの閉環を生じ得、続いて、そのクロロ基を種々のアミンで置き換える。
【０２１１】
薬学および合成有機化学の当業者が理解するように、本発明の化合物の殆どまたは全部は、塩基性窒素原子を含有し、それにより、これらの化合物は、極性有機担体または水性担体に容易に溶解できる所望の塩を形成するために、これらの窒素含有化合物を酸（例えば、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、乳酸、コハク酸など）と反応させることにより、それらの化合物の塩（薬学的に受容可能な塩を含めて）を容易に調製するのに適当にする。
【０２１２】
合成有機化学の当業者が理解するように、本明細書中で使用する種々の合成戦略、有機反応および／または官能基の変換は、上で明白に記述したもの以外の多数の戦略、反応または手順により、実行できる。本明細書中で開示した化合物に至る合成工程に利用できる他の合成手順の参照は、例えば、Ｍａｒｃｈ，Ｊ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４版、Ｗｅｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）；またはＬａｒｏｃｋ，Ｒ．Ｃ．，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．（１９８９）で見られ、両方の内容は、本明細書中で参考として援用されている。
【０２１３】
（細菌）
本発明の方法によって標的化された細菌は、グラム陽性菌またはグラム陰性菌であり得る。グラム陽性菌は、以下からなる群から選択され得る：
【０２１４】
【化３７】
【０２１５】
。
【０２１６】
グラム陰性菌は、以下からなる群から選択され得る：
【０２１７】
【化３８】
【０２１８】
。
【０２１９】
グラム陽性菌およびグラム陰性菌の上記の例は、限定を意図せず、全てのグラム陽性菌およびグラム陰性菌、ならびに非グラム試験反応性細菌（ｎｏｎ−ｇｒａｍ ｔｅｓｔ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）を含むより大きな集団の代表例であることを意図する。細菌の他の種の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
【０２２０】
【化３９】
【０２２１】
。
【０２２２】
（浸透性賦活薬）
１つの実施形態において、化合物は、改変されるか、または、他の薬剤と合わせられ、標的細菌の浸透性を促進する。賦活化された浸透性を可能にするプロドラッグが設計され得る。化合物は、必要に応じて、浸透性賦活薬と連結され得、ここで、浸透性賦活薬は、化合物が細菌の細胞壁を通過することを可能にする。「連結される」とは、式（Ｉ）の化合物と化学的に結合もしくは結合体化されるか、または、式（Ｉ）の化合物の部分の一部となることを意味する。浸透性賦活薬は、例えば、式（Ｉ）の化合物のＳ１、Ｓ２、Ｓ３またはＳ４ラジカルのうちの１つに化学的に連結され得る。グラム陰性細菌の場合、細胞エンベロープの主要な成分は、リポ多糖（ＬＰＳ）である。あるいは、本発明の化合物と浸透性賦活薬とを含む組成物が使用され得る。ＬＰＳの表面層は、グラム陰性細菌のいくつかの株において、いくつかの複素環化合物に対する浸透性バリアとして機能し得る。しかし、これらの化合物に対して浸透性バリアを有さないグラム陰性細菌の株が存在する。例としては、深部ラフ変異（ｒｆａ）を含む細菌の株（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ（Ａｌｌｅｎら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０（１）：３５−４０，１９９８））が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２２３】
「浸透性賦活薬」は、本発明の化合物の、細菌の細胞エンベロープを通る通過を増強し得る任意の物質または化合物として定義される。浸透性は、賦活前の細胞またはコントロールと比較して、１％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、２倍以上、１０倍以上、１００倍以上または１０００倍以上の細胞の浸透性により増強され得る。１つの実施形態において、浸透性のレベルは、浸透性賦活薬への曝露後に、細菌集団のＭＩＣを測定することによって試験され得る。
【０２２４】
浸透性賦活薬の例としては、ポリミキシンＢ、カチオン性ステロイド抗生物質、表面活性剤、デフェンシン、他の膜活性ペプチド（Ｅｖａｎｓら、Ｖｅｔ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ ２４（４）：１０９−１１６，１９９５）およびキレート剤（Ｓｕｌｉｎｇら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．８：３３４−３４３，１９７５）が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書中に規定されるような、式（Ｉ）の化合物のプロドラッグ形態のいくつか（例えば、プロドラッグの膜活性ペプチド型）が、浸透性賦活薬として機能し得る。ポリミキシンＢは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａから単離された、天然に存在する環状ドカペプチドである（Ｔｓｕｂｅｒｙら、Ｍｏｌ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６２（５）：１０３６−４２，２００２）。カチオン性ステロイド抗体は、細胞エンベロープに選択的に作用して、エンベロープの浸透性を高める（Ｑｕｎｙｉｎｇ Ｇｕａｎら、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２：２８３７−２８４０，２０００；Ｃｈｕｎｈｏｎｇ Ｌｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：２９６１−２９６２，１９９７）。
【０２２５】
１つの実施形態に置いて、浸透性賦活薬は、本発明の化合物と連結されることなく、本発明の化合物と共に使用される。
【０２２６】
以下の実施例は、本明細書中で特許請求される化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法が、いかにして作製され、評価されるかについての完全な開示および説明を、当業者に提供するために示され、本発明の純粋な例示として意図され、発明者らが発明者らの発明としてみなす範囲を制限することは意図されない。数（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証するための努力がなされたが、いくつかの誤りおよび逸脱が考慮されるべきである。他に示されない限り、部は重量部であり、温度は摂氏（℃）であるか、または、大気温度であり、そして、圧力は大気圧であるか、または、大気圧付近である。
【実施例】
【０２２７】
（実施例１）
（抗結核アッセイ）
ほとんどの抗結核アッセイを、ＢＡＣＴＥＣ ４６０ラジオメトリックシステムを使用して、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ（ＡＴＣＣ ２７２９４；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に対して、ＮＩＨ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ａｎｔｉ−ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＴＡＡＣＦ）のスクリーニング設備により実施し、最低限の抑制性濃度（ＭＩＣ９９）を決定した。リファンピンがポジティブコントロールであった。ＭＩＣ９９はまた、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、カナマイシン、ピラジナミド、チアセタゾンまたはシクロセリンに耐性であるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株に対して、ＳＲＩ−７６１４およびＳＲＩ−３０７２についても決定した（表５）。ＭＩＣ９９の決定と同時に、化合物を、Ｖｅｒｏ細胞において、細胞毒性（ＩＣ５０）について試験した。７２時間の曝露の後、生存率を、Ｐｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎアッセイを使用して、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（ＭＴＳ）のホルマザン生成物への細胞内変換に基づいて評価した。化合物の選択性の指標（ＳＩ）を、ＩＣ５０：ＭＩＣ９９の比として定義する。
【０２２８】
（表５：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの単剤耐性株に対するＳＲＩ７６１４およびＳＲＩ−３０７２の活性）
【０２２９】
【表５】
【０２３０】
ＷＴ＝野生型（Ｈ３７Ｒｖ）、ＩＮＨ−Ｒ＝イソニアジド耐性、ＲＭＰ−Ｒ＝リファンピン耐性、ＥＭＢ−Ｒ＝エタンブトール耐性、ＫＭ−Ｒ＝カナマイシン耐性、ＰＺＡ−Ｒ＝ピラジナミド耐性、ＴＡＣ−Ｒ＝チアセタゾン耐性、ＣＳ−Ｒ＝シクロセリン耐性。
【０２３１】
（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７ＲａについてのＳＲＩ−３０７２のＭＩＣ／ＭＢＣ）
ＳＲＩ−３０７２のＭＩＣを、他の場所（Ｓｕｌｉｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４２，８１１−８１５，１９９８；Ｓｕｌｉｎｇら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４４，２７８４−２７９３，２０００）に記載されるように、比色（アラマーブルー）微量希釈ブロスアッセイを使用して、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒａ（ＡＴＣＣ ２５１７７）について決定した。化合物をＤＭＳＯに溶解し、ＡＤＣ富化し、０．２％グリセロールを補充した７Ｈ９ブロス（アッセイ培地）中に２倍増分で段階希釈した。各希釈におけるＤＭＳＯの最終量は、１．３％であった。ＳＲＩ−３０７２を、４連でアッセイした。培地、薬物および生存率コントロールをこのアッセイに組み込んだ。エタンブトールは、ポジティブコントロールであり、２μｇ／ｍｌのＭＩＣを有した。ＳＲＩ−３０７２の殺菌活性を、インキュベーションの６日後に、プレートにレドックス色素を添加する直前に決定した。この時点で、プレートを視覚的に試験した。可視的な増殖が見られない各ウェルを、マイクロピペッターで注意深く液体を出し入れすることによって混合し、７Ｈ１１寒天上に播いた（１０μＬ）。プレートを３６〜３７℃にて、ポリエチレンバッグ中で２１日間インキュベートし、解剖顕微鏡での補助によりコロニーを計数した。計数を最初の種菌の計数と比較し、生存百分率および生存のｌｏｇ１０減少を算出した。ＭＢＣを、２−ｌｏｇ１０±ＳＤ（Ｎ＝４）によりｃｆｕを減少した最低薬物濃度として定義した。
【０２３２】
（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染したマクロファージにおけるＳＲＩ−３０７２の活性）
ＳＲＩ−３０７２を、以前に記載されたように（Ｋｅｌｌｙら、Ａｎｔｉ．Ａｇｅｎｔｓ＆Ｃｈｅｍｏ．４４：２７８４−２７９３，１９９４）、マウス骨髄マクロファージの単層において、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｅｒｄｍａｎ（ＡＴＣＣ３５８０１）に対する活性についてＴＡＡＣＦによるＭＩＣ（０．２μｇ／ｍｌ）の０．２５倍、１倍、４倍および１６倍においてアッセイした。活性を、薬物を含まないコントロールと比較して、７日後のｃｆｕにおいて、９０％の減少を得る最低薬物濃度（ＥＣ９０）および９９％の減少を得る最低薬物濃度（ＥＣ９９）として報告した。毒性を、視覚的な検査により決定した。
【０２３３】
（実施例２）
（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからのＦｔｓＺの精製および特徴づけ）
ＦｔｓＺの精製を、以前に記載されたように行った（Ｗｈｉｔｅら、Ｊ．Ｂａｃｔ．１８２：４０２８−４０３４，２０００）。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺをコードする配列を、ｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｃｏＩ部位にサブクローニングした。このプラスミドｐＪＤ１６９を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳを形質転換した。細胞を、３２℃にて、０．４％グルコースを含有するＬＢ培地中で１時間インキュベートした。５００μｌの形質転換細胞を、０．４％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する２５０ｍｌの新しいＬＢ培地に添加し、３２℃にて一晩インキュベートした。これらの細胞を、室温で遠心分離によってペレット状にした。これらの細胞を、０．２％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する、４リットルの予め温めておいたＬＢ培地中に再懸濁し；培養物を、３２℃にて、良好に通気しながら振盪した。培養物が、約０．４のＡ６００に達したときに、１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシドを用いてＦｔｓＺの発現を誘導した。３時間後に細胞を回収し、急速に冷蔵（８〜１０℃）し、遠心分離し、氷冷リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、再びペレット状にし、そして、−８０℃にて保存した。
【０２３４】
以下の手順を４℃にて実施した。１リットルのＥ．ｃｏｌｉ培養物からの凍結した細胞ペレットを、３０ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．８）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＰＭＳＦ、４μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、４μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭベンズアミジン、および２０μｇ／ｍｌダイズトリプシンインヒビター）中に再懸濁し、短時間超音波処理して、ゴム様ペレットをなくした。細胞懸濁物を３０分間、１ｍｇのＤＮＡｓｅで消化し、次いで、１５，０００〜２０，０００ｌｂ／ｉｎ２にてＦｒｅｎｃｈプレスを２回通過させることによって抽出した。この溶液を２７，０００ｇにて２０分間の遠心分離により浄化し、次いで、１０ｍＭイミダゾール、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ ７．８）で平衡化したＮｉ２＋−アガロースカートリッジ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライした。カラムを１００ｍＭイミダゾールを含有する平衡緩衝液（１５ｍｌ）で洗浄した。組み換え型ＦｔｓＺを、２５０ｍＭイミダゾールを含有する平衡緩衝液（５ｍｌ）で溶出した。溶出液を、即座に、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ ７．２）、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴおよび１０％グリセロールで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（ＰＤ−１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通した。ＦｔｓＺ １ｍｌあたり０．５単位のトロンビン（Ｓｉｇｍａ）で氷上にて２時間消化することにより、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグを取り除いた。サンプルを、脱塩緩衝液で平衡化したベンズアミジン−アガロースカラム（Ｓｉｇｍａ、流速約１ｍｌ／分）を通過させることによりトロンビンを除去した。ＦｔｓＺを、安定なポリマーを得る条件（すなわち、塩なし、１ｍＭ ＧＴＰ）の下で重合し、１００，０００ｇにて遠心分離して、ポリマーを沈殿させ、ペレットを、１５０ｍＭ ＫＣｌを含有する緩衝液中に再懸濁することによって脱重合し、最後に高速にて２回遠心分離して、いかなる凝集物も除去した。プロテアーゼインヒビター（２ｍＭ １，１０−フェナントロリン、２０μｇ／ｍｌダイズトリプシンインヒビター、４μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、１０μｇ／ｍｌ ＡＰＭＳＦ、５０μｇ／ｍｌアプロチニン、２ｍＭ ＰＭＳＦ、４μｇ／ｍｌロイペプチン、４０μｇ／ｍｌ ＴＬＣＫおよび１ｍＭベンズアミジン）を、プールした画分に添加した。サンプルを、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ ７．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴおよび１０％グリセロールで平衡化したゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００調製用グレード）にアプライした。吸光度を２８０ｎｍにてモニタリングした。プロテアーゼカクテルを、プールした画分に添加した。２０ｍｇ／ｍｌまで濃縮（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＢｉｏＭａｘ １５−１０００）した後、サンプルを２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ ７．２）、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０％グリセロールに対して透析した。プロテアーゼカクテルを、３回添加し、タンパク質を−８０℃にて保存した。
【０２３５】
９５，５００ダルトンの分子量に対応する単一のピークで、大半のＦｔｓＺがカラムから溶出した。このピークからの画分をプールし、濃縮し、１０％グリセロールを含有する緩衝液に対して透析し、そして、等分して−８０℃にて保存した。これらの条件下で、タンパク質は数ヶ月間安定であった。全てのＥ．ｃｏｌｉ培養物からの代表的な収量は、３０ｍｇのＦｔｓＺであった。
【０２３６】
１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定したＦｔｓＺの分子量は、４５，７００ダルトンであった。質量分光測定分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、これが正しい質量（実測値、３９，０６４．３０；理論値、３９，０３６．４５；質量は、トロンビン消化後に残るＮ末端のＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓを含む）を有したことを確認した。Ｎ末端の配列決定は、ＧＳＨＭＴＰＰＨＮＹの除かれた配列を確認した。ＦｔｓＺを、約２，０００，０００Ｄａ（空隙容量）から９５，５００Ｄａ（主要なピーク）までの分子量の減少した一連の凝集物としてゲル濾過カラムから溶出した。サブユニットの分子量が３９，０３６Ｄａなので、９５，０００Ｄａのピークは、おそらくＦｔｓＺの二量体である。類似の状態（ヌクレオチドもＭｇ２＋もなし）下で、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺは、分析用超遠心分離および化学的架橋により、約７０％が二量体、１５％が三量体、そして、１５％が単量体の混合物として存在することを示した。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＦｔｓＺがまた、オリゴマーとして存在すると報告されている。
【０２３７】
精製したＦｔｓＺ（５μＭ）がＧＴＰａｓｅ活性を有し、１時間あたり、ＦｔｓＺ １ｍｇあたり６．９ｎｍｏｌのＧＴＰをＧＤＰに変換した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺとは異なり、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺを加熱しても、ＧＴＰａｓｅ活性は増加しなかった。ＧＤＰは、ＧＤＰ／モルＦｔｓＺが１：１のモル比（Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺについて見られる比とおよそ同じ比）で結合した。ＧＤＰａｓｅ活性は協調性であるため、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺの刊行された比活性と６．９ｎｍｏｌ／ｍｇ／ｈｒというＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺについての本発明者らの比活性との間で直接比較することは困難である。しかし、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺ（３０μｍｏｌ／ｍｇ／ｈｒのＶｍａｘを有すると報告されている）よりもかなりゆっくりとした速度でＧＴＰを加水分解することが明らかである。
【０２３８】
（実施例３）
（ＦｔｓＺ重合についての光散乱アッセイ）
精製したＦｔｓＺの重合および脱重合の後に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺについてのＭｕｋｈｅｒｊｅｅおよびＬｕｔｋｅｎｈａｕｓにより記載された方法（Ｊ．Ｂａｃｔ．１８１：８２３−８３２，１９９９）を行った。光散乱を、０．５ｍｌの石英キュベット（セル ２×１０ｍｍ、Ｈｅｌｌｍａ）を使用するサーモスタット制御（３０℃）Ａｍｉｎｃｏ−Ｂｏｗｍａｎシリーズ２ルミネセンス分光光度計で測定した。励起波長および放射波長は、２ｎｍのスリット幅で４００ｎｍであった。ゲインは、代表的には、５４０Ｖに設定したが、必要な場合は、約８の最大応答を与えるように増加させた。ＦｔｓＺ（５００μｇ／ｍｌ；１３μＭ）を、５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ ６．５）、１００ｍＭ
ＫＣｌおよび５ｍＭ ＭｇＣｌ２中でインキュベートして、ベースラインを確立した。ＧＴＰ（４０μＭ）を添加し（最終容量３００μｌ）、光散乱の増分をさらに５０〜６０分間測定した。特定の実験についての成分の濃度変化を、文字または図の凡例に示す。
【０２３９】
（実施例４）
（光散乱アッセイを用いるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺの特徴づけ）
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺの重合を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺについて記載された条件下で測定した。ＦｔｓＺ（１０μＭ）を、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および２５ｍＭ ＫＣｌを含有する５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ ６．５）中で、３０℃にてインキュベートした。１ｍＭ ＧＴＰを添加すると、光散乱が即座に増加し、約１０分でプラトーに達した。光散乱は、非常に安定であり、５時間で＜１０％減少した。一旦重合が起こると、温度が４５℃まで上昇しても、１℃まで低下しても、脱重合を誘導しなかった（データ示さず）。しかし、２０ｍＭ ＥＤＴＡの添加により、光散乱は、即座にベースラインまで戻った。ＦｔｓＺは、光散乱の増加により測定されるように、反応に２５ｍＭ ＭｇＣｌ２を添加することにより、再重合し得る。
【０２４０】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺの重合および脱重合は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺの重合および脱重合よりも明らかにずっと遅い。重合は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺについて非常に迅速に（３０秒未満）生じ、安定な相は、約１５分間持続し、続いてさらに１０分間のうちに完全に脱重合した。同一条件下では、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺは、最大重合に達するまでに約１０分間かかり、続いて安定な相が少なくとも５時間持続し、反応速度は、哺乳動物のチューブリンにより類似している。しかし、チューブリンとは異なり、ＦｔｓＺは、１℃への温度シフトによって脱重合できなかった。これにより、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺと比較してより遅い、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺの動力学が、そのより低いＧＴＰａｓｅ活性に関連するとの推測が導かれる。おそらく、ＦｔｓＺの重合速度および脱重合速度は、生物体の増殖速度と比例する。細胞分裂時間がずっと速い、Ｅ．ｃｏｌｉは、より遅く増殖するＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓよりも多くの動的な細胞分裂タンパク質を必要とし得る。重合および脱重合は、この反応を開始するために用いられたＧＴＰの濃度に依存した。５ｍＭ ＭｇＣｌ２を用いると、０．２ｍＭ〜１ｍＭ ＧＴＰは、光散乱における増加を開始し、この増加は、添加２５分後に依然として増加していた。より低い濃度のＧＴＰ（０．０５ｍＭ〜０．１ｍＭ）は、重合および脱重合の両方を２５分以内にもたらした。１ｍＭのＧＤＰまたは５’−グアニリルイミド二リン酸（ＧＭＰ−ＰＮＰ）（非加水分解性ＧＴＰアナログ）のいずれかでＧＴＰを置き換えた場合、光散乱における増加は見られなかった。
【０２４１】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺによるＧＴＰ加水分解の速度は、ＫＣｌ濃度によって影響を受ける（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１０５３−１０５７，１９９３）ので、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺの重合に対するＫＣｌの影響を調べた。１０ｍＭまたは５０ｍＭのＫＣｌを用いると、ＧＴＰの添加は、光散乱における増加を開始し、これは、１時間にわたって持続した。ＫＣｌを用いないと、重合は、低ＫＣｌを用いてよりも遅かったが、１時間の終わりにおいても依然として持続した。より高い濃度のＫＣｌ（１００ｍＭおよび２００ｍＭ）は、光散乱における増加、続いて減少をもたらした。光散乱の最大量は、ＫＣｌ濃度が上昇するにつれて減少した。ＫＣｌによる脱重合に対する影響は、特異的であるようである。なぜなら、１００ｍＭまたは２００ｍＭのＮａＣｌの存在下では、重合は、１時間の時点で依然として増加していたからである。Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺ ＧＴＰａｓｅ活性は、ＫＣｌによって刺激され得るが、ＮａＣｌによっては刺激され得ず、そしてＫＣｌ濃度の増加は、重合の定常状態相の短縮と関連する。
【０２４２】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺは、他のＧＴＰａｓｅと同様に、ＧＴＰからＧＤＰへの加水分解のためにＭｇ２＋を必要とする。ＭｇＣｌ２が１ｍＭから５ｍＭへと増加するにつれて、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺの最大重合が増強され、続いてベースラインに戻った。５ｍＭより高いＭｇＣｌ２では、重合のみが観察された。ＦｔｓＺは、ＭｇＣｌ２の非存在下では重合しなかった。これは、ＭｇＣｌ２の非存在下でのＧＴＰの添加が、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を用いて得られたレベルの約３分の１の、光散乱における増加を生じたＥ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺと対照的である。
【０２４３】
ＦｔｓＺ濃度の関数として光散乱を調べることにより、重合に必要なタンパク質最小濃度の決定が可能になった。種々の濃度でのＦｔｓＺを、１００ｍＭ ＫＣｌおよび５ｍＭ
ＭｇＣｌ２を含む重合緩衝液中でインキュベートした。０．０５ｍＭ ＧＴＰの添加後、最大量の光散乱を測定し、そしてＦｔｓＺ濃度に対してプロットした。重合に必要な臨界濃度についての値は、３Ｍ（１２０ｇ／ｍｌ）であった。これは、沈降によって１．５Ｍであると決定されたＥ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺについての臨界濃度よりもわずかに高いが、光散乱アッセイから得られた２．５Ｍの値に類似する。
【０２４４】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺ重合は、中性ｐＨまたはアルカリ性ｐＨにおいて顕著に減少した。ＧＴＰ依存性重合は、その範囲にわたって一定のイオン強度を維持した緩衝系（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＭＥＳ、１００ｍＭエタノールアミン）において、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０およびｐＨ７．４の順であった。ｐＨ７．０における最大光散乱は、ｐＨ６．５における最大光散乱の４分の１未満であった。重合はｐＨ７．５において見られなかった。Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺは、ｐＨ変化に対して、より耐性であるようである。
【０２４５】
（実施例５）
（インヒビター研究）
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺの重合および脱重合に対する異なる化合物の影響（表６）を、上記の光散乱アッセイを用いてモニタリングした。化合物を反応物に添加し、そしてベースラインを確立した。ＧＴＰを添加して重合を開始し、そして光散乱データをさらに５０分間〜６０分間収集した。最大光散乱を、ＧＴＰ前のベースライン値をピーク値から差し引くことにより算出した。コントロール活性％を、化合物なしのアッセイとの比較により算出した。ＤＭＳＯを溶媒として用いた場合、このコントロールはまた、同じ量のＤＭＳＯ（２％）を含んでいた。化合物を、１００μＭにおいて最初に評価した。阻害が観察されたならば、この化合物をいくつかの濃度で再度試験した。化合物濃度に対するコントロール活性％の半対数プロットを用いて、５０％阻害濃度を算出した。３つの独立した曲線を、各化合物について描いた。コルヒチンを、Ｓｉｇｍａから購入した。精製したウシチューブリンチューブリン（Ｓｉｇｍａ）のＧＴＰ開始重合に続いて、光散乱アッセイを行った。ウシチューブリン（１ｍｇ／ｍＬ；２０Ｍ）を、１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１００μＭ ＥＤＴＡ、２Ｍグリセロールおよび０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２＋インヒビターまたは溶媒中でインキュベートして、ベースラインを確立した。ＧＴＰ（１ｍＭ）を添加し（最終体積５００Ｌ）、そして光散乱における増加をさらに５０分間〜６０分間にわたって測定した。最大光散乱を、ベースライン値を、ピーク値から差し引くことにより算出した。ＤＭＳＯを溶媒として用いた場合、このコントロールはまた、同じ量のＤＭＳＯ（２％）を含んでいた。化合物を、１００μＭにおいて最初に評価した。阻害が観察されたならば、この化合物を、いくつかの濃度で再試験した。ＩＤ５０値および阻害パーセントを、上記の通りに算出した。
【０２４６】
【表６】
【０２４７】
（実施例６）
（質量分析法およびアミノ酸配列決定）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを、遅延抽出技術（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＶｏｙａｇｅｒ Ｅｌｉｔｅ質量分析計（ポジティブモード）について得た。加速電圧を２５ｋＶに設定し、そして１０〜５０のレーザーショットを合計した。このマトリクスは、ＣＨ３ＣＮ−０．１％ ＣＦ３ＣＯ２Ｈ（１：１）中に溶解したシナピン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）であった。分光計を、アポミオグロビンを用いて較正した。サンプルをマトリクスで１：１０希釈し、その後、１μｌを平滑なプレート上にピペッティングした。Ｎ末端配列決定を、気相微量配列決定系（Ｍｏｄｅｌ Ｐｌ ２０９０Ｅ，Ｂｅｃｋｍａｎ）において自動化エドマン分解によって行った。所定のサイクルにおいて遊離されたアミノ酸残基を、異なるクロマトグラム（以前のサイクルとの比較）から同定した。
【０２４８】
（実施例７）
（細菌のパネルに対する抗細菌活性）
微量希釈ブロスアッセイを用いて、ＭＩＣを決定した。ＳＲＩ−３０７２をＤＭＳＯ中に溶解し、次いでアッセイ培地（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス）中に２倍希釈で連続希釈した。この培地における最終ＤＭＳＯ量は１．３％であり、そして生物体のパネルの増殖に対して影響を有さなかった（表７）。薬物希釈物（５０μｌ）を、９６ウェル（Ｕ字型）プレートの適切なウェルに添加した。試験生物体の接種物を、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロスに新鮮なスラント培養物からの増殖物を接種し、続いて３７℃にて５時間〜６時間（この時点で、増殖物を濁度計測定により測定した）にわたってインキュベートすることにより調製した。次いで、各培養物を、約１×１０６ＣＦＵ／ｍｌ相当の濁度になるように培地中に希釈し、そして接種物として用いた（５０μＬ／ウェル）。このアッセイプレートはまた、生存率コントロール、ならびに非接種培地および薬物コントロールを含んでいた。トリメトプリムを、ポジティブ薬物コントロールとして用い、そしてトリメトプリム耐性株について０．１３〜＞１６μｇ／ｍｌの範囲のＭＩＣを有していた。このプレートを、１８時間〜２０時間にわたってインキュベートし、そしてウェルを、増殖について視覚試験した。ＭＩＣを、可視の増殖がもたらされない最大薬物希釈と定義した。ＳＲＩ−３０７２を、それぞれ、グラム陰性桿菌およびグラム陽性球菌を代表する、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに対してアッセイした。この薬物は、Ｅ．ｃｏｌｉに対しては活性ではなく、そして２つの球菌に対しては中程度の活性（３２μｇ／ｍＬのＭＩＣ）を有した。次いで、この薬物を、グラム陽性桿菌およびグラム陽性球菌の拡大パネルに対して試験した。この拡大パネルは、メチシリン耐性ブドウ球菌、多剤耐性ブドウ球菌およびバンコマイシン耐性腸球菌を含んでいた。これらの生物体に対するＭＩＣは、試験した単一のグラム陽性桿菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓを除いて、３２〜６４μｇ／ｍＬの範囲で一様であった。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓは、１６μｇ／ｍＬのＭＩＣにおいて阻害された。この薬物はＥ．ｃｏｌｉに対して活性ではなかったので、別のグラム陰性桿菌であるＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを試験した。この特定の株のＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍは、細胞エンベロープのＬＰＳ成分の多糖類側鎖におけるディープラフ（ｄｅｅｐ ｒｏｕｇｈ）（ｒｆａ）変異を含んでいた。このような株は、複素環式化合物に対して増加した透過性を保有する。ＳＲＩ−３０７２は、このグラム陰性変異体に対して活性であった。結論として、ＳＲＩ−３０７２は、単一のグラム陰性細菌の代表に対して活性ではなかったが、薬物耐性株を含めたいくつかのグラム陽性細菌に対して中程度の活性を有した。また、ディープラフ変異体は、ＳＲＩ−３０７２に対して感受性であった。このことは、Ｅ．ｃｏｌｉの活性の欠如が、Ｅ．ｃｏｌｉに対する影響の欠如というよりも透過性に起因したことを示す。
【０２４９】
【表７】
【０２５０】
（実施例８）
（細胞機構に対する化合物の影響）
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ（ＢＣＧ）の細胞分裂機構に対するＳＲＩ ３０７２の影響を調べた（図９）。ＢＣＧは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓについての優れた代用品である。なぜなら、それらのゲノムは、ほぼ９５％同一だからである。緑色蛍光タンパク質を発現するＢＣＧを、０．３μｇ／ｍｌ ＳＲＩ ３０７２（ＭＩＣ未満の濃度）とともに５日間インキュベートし、そして細胞長さについてアッセイした。細胞をスピンダウンし、ＰＢＳ中で洗浄し、次いでポリ−１−リジンコーティングカバーガラス上で風乾した。５０％グリセロール中のＤＡＰＩ（３μｇ／ｍｌ）をカバーガラス上にピペッティングし、そしてこのスライド上に反転させた。このスライドを、ＤＸＭ １２００色ＣＣＤを備えたＮｉｋｏｎエクリプス顕微鏡で観察した。画像を、Ｌｕｃｉａ Ｇソフトウェアバージョン４を用いて取り込んだ。蛍光を用いた位相差画像を得た。コントロール細胞は、２〜３μｍ付近に集まった、やや細い細胞長さを有する。一方、ＳＲＩ ３０７２で処理した細胞は、ずっと長く、分岐している。コントロール細胞とは異なり、ＳＲＩ ３０７２処理細胞におけるＤＮＡは、異常な細胞全体に分散する。ＳＲＩ ３０７２は、細胞分裂機構を破壊する。さらに、培養細胞を洗浄してＳＲＩ ３０７２を培地から除去する場合、これらは回復しない。
【０２５１】
（実施例９）
ＦｔｓＺを含むサンプル２５μｌのＧＴＰａｓｅ活性を、Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１０５３−１０５７，１９９３）に記載される方法を用いてモニタリングした。手短に述べると、ＦｔｓＺを、４０μＭ［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ（２５０〜４００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）、１００ ｍＭ ＫＣｌ、および５ｍＭ ＭｇＣｌ２とともに３０℃で６０分間インキュベートした（最終体積５０μｌ）。放射性無機リン酸を、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４を含む０．１Ｍ ＨＣｌＯ４を用いて抽出し、続いてモリブデン酸ナトリウムおよび酢酸イソプロピルを添加した。有機相のアリコートを、液体シンチレーションカウンター中で測定した。断続的ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアルキルアミドゲル電気泳動（１５％ゲル）を用いて、精製をモニタリングし、そしてサブユニット分子量を決定した。タンパク質濃度を、ウシガンマグロブリンを標準として使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄ手順によって決定した。このタンパク質（５０μＭ ＦｔｓＺ）に結合したヌクレオチドの量を、３％過塩素酸抽出物（Ｓｏｓｓｏｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３８：１４８４３−５０，１９９０）を用いて決定した。上清を２５７ｎｍにおいて読み取り、そして濃度をＧＤＰ（５〜２００μＭ）の標準曲線から算出した。強アニオン交換ＨＰＬＣを用いて、ヌクレオチドを同定した。
【０２５２】
引用したいずれの文献の開示内容も、本発明が属する技術の状況を十分に記述するために、その全体が本明細書中で参考として援用されている。
【０２５３】
本発明の範囲および精神を逸脱することなく、本発明において、種々の改良および変更を行うことができることは、当業者に明らかである。本発明の他の実施態様は、本明細書および本明細書中で開示された発明の実施の要件から、当業者に明らかとなる。本明細書および実施例は、代表的なものと見なされるにすぎず、本発明の真の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲で示されると解釈される。
【０２５４】
（実施例１０）
以下の化合物（表８）は、本発明の化合物の例、およびそれらの阻害濃度である。
【０２５５】
（表８）
【０２５６】
【表８−１】
【０２５７】
【表８−２】
【０２５８】
【表８−３】
【０２５９】
【表８−４】
【０２６０】
【表８−５】
【０２６１】
【表８−６】
【０２６２】
【表８−７】
【０２６３】
【表８−８】
【０２６４】
【表８−９】
【０２６５】
【表８−１０】
【０２６６】
【表８−１１】
【０２６７】
【表８−１２】
【０２６８】
【表８−１３】
【０２６９】
【表８−１４】
【０２７０】
【表８−１５】
【０２７１】
【表８−１６】
【０２７２】
【表８−１７】
【０２７３】
【表８−１８】
【０２７４】
【表８−１９】
【０２７５】
【表８−２０】
【０２７６】
【表８−２１】
【０２７７】
【表８−２２】
【０２７８】
【表８−２３】
【０２７９】
【表８−２４】
【０２８０】
【表８−２５】
【０２８１】
【表８−２６】
【０２８２】
【表８−２７】
【０２８３】
【表８−２８】
【０２８４】
【表８−２９】
【０２８５】
【表８−３０】
【０２８６】
【表８−３１】
【０２８７】
【表８−３２】
【０２８８】
【表８−３３】
【背景技術】
【０００１】
（謝辞）
本発明は、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈから授与された助成ＲＯｌ ＡＩ５０４７０下で、政府の支援により、行われた。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般に、抗菌剤およびそれらの用途（特に、ＦｔｓＺの阻害剤）の分野に関する。
【０００３】
（背景技術）
多くの抗菌剤の作用機構が実証されている。例えば、細菌の細胞壁合成阻害におけるペニシリンおよび他のβ−ラクタム薬物の作用機構は、よく研究されている。しかしながら、他の場合には、作用機構は理解されていない。抗菌化合物は、６つの一般的な作用に分類され、これらには、以下の阻害が挙げられる：１）細胞壁の合成；２）細胞分裂；３）細胞膜の作用；４）タンパク質の合成；５）核酸の合成；および６）中間代謝。
【０００４】
抗菌剤に対する耐性および／または抵抗性の進行は、疾患を治療する性能に対して、著しい脅威となっている。例えば、耐性種が認められることが増えていることには、多くの要因が寄与しており、これには、１）抗菌剤の乱用；２）抗菌剤の不適切な使用；３）多くの細菌が遺伝子物質を交換して耐性を与える能力；および４）多くの細菌で観察されている急速な変異速度（これにより、耐性株の選択が可能となる）が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一旦、生物体が特定の抗菌剤に対して耐性を発現すると、有効な代替物を発見することが重要となってくる。もし、生物体がこの第二抗菌剤に対して耐性を発現した場合、別の代替物が必要となる。結果として、新しい薬剤を連続して開発する必要がある。この薬剤は、生物体の生理機能を選択的に標的とするべきであるが、広範囲の生物体に対して作用できなければならない。それゆえ、当該技術分野では、単一および多剤耐性株に対する有効な代替薬物として働く抗菌剤が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明の目的に従って、本明細書中で具体化され広範に記述されているように、本発明は、１局面では、細菌の成長を阻止する方法に関し、該方法は、以下の構造を有する１種またはそれ以上の化合物またはそれらの塩の有効量を細菌と接触させる工程を包含する：
【０００７】
【化２０】
【０００８】
ここで、
（ａ）Ｘ１およびＸ２は、ＣＨまたはＮであり、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである；
（ｂ）Ｓ１は、有機ラジカルである；
（ｃ）Ｓ２、Ｓ３およびＳ４は、別個に、水素、アミノ、ハロゲン、または１個またはそれ以上の有機ラジカル、あるいは
（ｄ）その塩から選択される。
【０００９】
別の局面では、本発明は、細菌を殺す方法に関し、該方法は、本明細書中で開示した構造および種々の実施態様を有する１種以上の化合物の有効量を該細菌と接触させる工程を包含する。
【００１０】
さらに別の局面では、本発明は、細菌におけるＦｔｓＺ重合を阻止する方法に関し、該方法は、本明細書中で開示した構造および種々の実施態様を有する１種またはそれ以上の化合物の有効量を該細菌と接触させる工程を包含する。
【００１１】
さらなる局面では、本発明は、細菌の成長を阻止する方法に関し、該方法は、構造４−［（６−アミノ−２，３−ジフェニル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−８−イルアミノ）−メチル］−Ｎ，Ｎ−ジエチル−ベンゼンスルホンアミドを有する化合物の有効量を細菌と接触させる工程を包含する。
【００１２】
本発明はまた、細菌に感染した被験体を治療する方法に関し、該方法は、該被験体に、本明細書中で開示した構造および種々の実施態様を有する１種以上の化合物の有効量を投与する工程を包含する。
【００１３】
本発明のさらなる利点は、一部には、以下の記述で述べられており、また、一部には、その記述から明らかであるか、または、本発明を実行することにより、習得され得る。本発明の利点は、添付の請求の範囲で特に指摘された要素および組合せによって、実現され達成される。前述の一般的な記述および以下の詳細な記述の両方は、例示的で説明的であるにすぎず、請求した本発明を制限するものではない。
【００１４】
例えば、本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
細菌の成長を阻止する方法であって、該方法は、以下の構造を有する１種またはそれ以上の化合物またはそれらの塩の有効量を細菌と接触させる工程を包含する：
【００１５】
【化１】
【００１６】
ここで、
（ａ）Ｘ１およびＸ２は、ＣＨまたはＮであり、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである；
（ｂ）Ｓ１は、１個〜８個の炭素原子を含む有機ラジカルである；
（ｃ）Ｓ２、Ｓ３およびＳ４は、別個に、水素、アミノ、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む１個またはそれ以上の有機ラジカルから選択される、
方法。
（項目２）
前記細菌が、抗生物質に耐性である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細菌が、グラム陽性である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記グラム陽性菌が、以下からなる群から選択される、項目３に記載の方法：
【００１７】
【化２】
【００１８】
。
（項目５）
前記細菌が、グラム陰性菌である、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記グラム陰性菌が、以下からなる群から選択される、項目５に記載の方法：
【００１９】
【化３】
【００２０】
。
（項目７）
前記化合物が、浸透性賦活薬と併用され、ここで、該浸透性賦活薬が、該浸透性賦活薬により、該化合物が前記細菌の細胞エンベロープを通過できる、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記浸透性賦活薬が、ポリミキシンＢ、表面活性剤、デフェンシン、他の膜活性ペプチドおよびキレート化剤からなる群から選択される、項目７に記載の方法。
（項目９）
さらに、前記細菌を浸透性賦活薬と接触させる工程を包含する、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記浸透性賦活薬が、ポリミキシンＢ、表面活性剤、デフェンシン、他の膜活性ペプチドおよびキレート化剤からなる群から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記化合物が、約５００グラム／モル未満の分子量を有する、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記化合物が、以下の構造を有する、項目１に記載の方法：
【００２１】
【化４】
【００２２】
ここで、
ａ）Ｓ１は、１個〜４個の炭素原子を含むアルキル基である；
ｂ）Ｓ２は、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルであり、該有機ラジカルは、アルキル、アルコキシ、一置換アミノまたは二置換アミノから選択される；
ｃ）Ｓ２およびＳ３は、
（ｉ）別個に、置換基であり、該置換基は、別個に、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルから選択できるか、または
（ｉｉ）一緒になって、ヘテロアリールラジカルまたは複素環ラジカルを形成し、該ヘテロアリールラジカルまたは複素環ラジカルは、５個、６個または７個の環原子を含み、必要に応じて、１個、２個または３個の置換基で置換されており、該置換基は、ハロゲン、アミノ、または１個〜１２個の炭素原子を含む有機ラジカルから選択される、
方法。
（項目１３）
前記化合物が、以下の構造またはそれらの薬学的に受容可能な塩を有する、項目１に記載の方法：
【００２３】
【化５】
【００２４】
ここで、
ａ）Ｘ１およびＸ２は、ＣＨまたはＮであり、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである；
ｂ）Ｘ３は、ＣＨ、Ｎ、ＮＨ、ＯまたはＳである；
ｃ）Ｘ４は、ハロゲン、酸素、イオウまたはリン原子、アミノ、ＮＨ、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルである；
ｄ）Ｒ１は、１個〜４個の炭素原子を含むアルキルラジカルである；
ｅ）Ｒ２は、任意のラジカルであり、該任意のラジカルは、水素、アミノ、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む１個またはそれ以上の有機ラジカルから選択される；
ｆ）Ｒ３および任意のＲ３’ラジカル（存在または不在であり得る）は、別個に、水素、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルから選択される；
ｇ）Ｃｎは、１個または２個の任意の環炭素原子を含み、ここで、各任意の環炭素原子は、１個または２個の置換基ラジカルを有し、該置換基ラジカルは、別個に、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルから選択される、
方法。
（項目１４）
前記化合物が、以下の構造またはそれらの薬学的に受容可能な塩を有する、項目１に記載の方法：
【００２５】
【化６】
【００２６】
ここで、
ａ）Ｒ１は、１個〜４個の炭素原子を含むアルキル基である；
ｂ）Ｒ２−−Ｘ４は、アミノまたは一置換アミノラジカルであり、該アミノまたは一置換アミノラジカルは、１個〜２６個の炭素原子を含む；
ｃ）Ｒ３およびＲ４は、別個に、水素、ハロゲン、または１個〜１２個の炭素原子を含む有機ラジカルから選択される、
方法。
（項目１５）
Ｒ３およびＲ４が、別個に、水素、アルキルまたはアルコキシラジカル、アリールラジカルまたはヘテロアリールラジカルから選択され、該アルキルまたはアルコキシラジカルが、１個〜１８個の炭素原子を含み、該アリールラジカルが、６個〜１８個の炭素を含み、そして該ヘテロアリールラジカルが、１個〜１８個の環炭素を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１６）
前記化合物が、以下の構造またはそれらの薬学的に受容可能な塩を有する、項目１に記載の方法：
【００２７】
【化７】
【００２８】
ここで、
ａ）Ｘ１およびＸ２は、ＣＨまたはＮであり、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである；
ｂ）Ｘ３は、ＣＨ、Ｎ、ＮＨ、ＯまたはＳである；
ｃ）Ｘ４は、ハロゲン、酸素、イオウまたはリン原子、アミノ、ＮＨ、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルである；
ｄ）Ｒ１は、１個〜４個の炭素原子を含むアルキルラジカルである；
ｅ）Ｒ２は、水素、アミノ、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む１個またはそれ以上の有機ラジカルから選択される；
ｆ）Ｒ３、Ｒ４、Ｒ３’、Ｒ４’ラジカルは、別個に、水素、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルから選択される、
方法。
（項目１７）
前記化合物が、以下の構造またはそれらの薬学的に受容可能な塩を有する、項目１に記載の方法：
【００２９】
【化８】
【００３０】
ここで、
ａ）Ｘ１およびＸ２は、ＣＨまたはＮであり、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである；
ｂ）Ｘ３は、ＣＨ、Ｎ、ＮＨ、ＯまたはＳである；
ｃ）Ｘ４は、ハロゲン、酸素、イオウまたはリン原子、アミノ、ＮＨ、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルである；
ｄ）Ｒ１は、１個〜４個の炭素原子を含むアルキルラジカルである；
ｅ）Ｒ２は、水素、アミノ、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む１個またはそれ以上の有機ラジカルから選択される；
ｆ）Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、および任意のＲ３’Ｒ４’およびＲ５’ラジカルは、別個に、水素、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルから選択される、
方法。
（項目１８）
前記化合物が、以下の構造またはそれらの薬学的に受容可能な塩を有する、項目１に記載の方法：
【００３１】
【化９】
【００３２】
ここで、
ａ）Ｒ１は、１個〜４個の炭素原子を含むアルキルラジカルである；
ｂ）Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ４’およびＲ５’ラジカルは、別個に、水素、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルから選択される、
方法。
（項目１９）
前記化合物が、以下の構造またはそれらの薬学的に受容可能な塩を有する、項目１に記載の方法：
【００３３】
【化１０】
【００３４】
ここで、
ａ）Ｘ１およびＸ２は、ＣＨまたはＮであり、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである；
ｂ）Ｘ３は、ＣＨ、Ｎ、ＮＨ、ＯまたはＳである；
ｃ）Ｘ４は、ハロゲン、酸素、イオウまたはリン原子、アミノ、ＮＨ、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルである；
ｄ）Ｒ１は、１個〜４個の炭素原子を含むアルキルラジカルである；
ｅ）Ｒ２は、任意のラジカルであり、該任意のラジカルは、水素、アミノ、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む１個またはそれ以上の有機ラジカルから選択される；
ｆ）Ｃｎは、水素、または１個〜２６個の炭素原子を含む有機ラジカルである、
方法。
（項目２０）
前記化合物が、次式またはそれらの薬学的に受容可能な塩を有する、項目１に記載の方法：
ａ）［５，６−ジアミノ−４−（２−ヒドロキシ−１−メチル−３−フェノキシプロピルアミノ）−ピリジン−２−イル］−カルバミン酸エチルエステル；
ｂ）［８−（４−ジエチルアミノ−１−メチル−ブチルアミノ）−２，３−ジフェニル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−６−イル］−カルバミン酸エチルエステル；
ｃ）（１−アミノ−８−フェニル−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−２，５，９−トリアザベンゾシクロヘプテン−３−イル）−カルバミン酸エチルエステル；
ｄ）［２，３−ジフェニル−８−（４−スルファモイル−ベンジルアミノ）−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−６−イル］−カルバミン酸エチルエステル；
ｅ）（５−アミノ−３−ブチル−２−メチル−１，２−ジヒドロ−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−７−イル）−カルバミン酸エチルエステル；
ｆ）（５−アミノ−２，３−ジフェニル−２Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］［１，４］オキサジン−７−イル）−カルバミン酸エチルエステル；
ｇ）（５−エトキシ−２，３−ジフェニル−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−７−イル）−カルバミン酸エチルエステル；
ｈ）（５−アミノ−２，３−ジフェニル−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−７−イル）−カルバミン酸エチルエステル；
ｉ）（５−アミノ−３−｛［（４−メトキシ−フェニル）−メチル−アミノ］−メチル｝−１，２−ジヒドロ−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−７−イル）−カルバミン酸エチルエステル；または
ｊ）［５−アミノ−３−（４−ブチルカルバモイルオキシ−フェニル）−２−メチル−１，２−ジヒドロ−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−７−イル］−カルバミン酸エチルエステル。
（項目２１）
細菌を殺す方法であって、該方法は、以下の構造を有する１種またはそれ以上の化合物またはそれらの塩の有効量を該細菌と接触させる工程を包含する：
【００３５】
【化１１】
【００３６】
ここで、
ａ）Ｘ１およびＸ２は、ＣＨまたはＮであり、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである；
ｂ）Ｓ１は、１個〜８個の炭素原子を含む有機ラジカルである；
ｃ）Ｓ２、Ｓ３およびＳ４は、別個に、水素、アミノ、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む１個またはそれ以上の有機ラジカルから選択される、
方法。
（項目２２）
前記細菌感染が、グラム陽性菌感染である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記細菌感染が、以下からなる群から選択される、項目２２に記載の方法：
【００３７】
【化１２】
【００３８】
。
（項目２４）
前記感染が、グラム陰性菌感染である、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記細菌感染が、以下からなる群から選択される、項目２４に記載の方法：
【００３９】
【化１３】
【００４０】
。
（項目２６）
前記化合物が、チューブリンに影響を及ぼさない、項目２１に記載の方法。
（項目２７）
細菌におけるＦｔｓＺ重合を阻止する方法であって、該方法は、以下の構造を有する１種またはそれ以上の化合物またはそれらの塩の有効量と接触させる工程を包含する：
【００４１】
【化１４】
【００４２】
ここで、
ａ）Ｘ１およびＸ２は、ＣＨまたはＮであり、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである；
ｂ）Ｓ１は、１個〜８個の炭素原子を含む有機ラジカルである；
ｃ）Ｓ２、Ｓ３およびＳ４は、別個に、水素、アミノ、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む１個またはそれ以上の有機ラジカルから選択される、
方法。
（項目２８）
前記細菌が、グラム陽性である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記グラム陽性細菌が、以下からなる群から選択される、項目２８に記載の方法：
【００４３】
【化１５】
【００４４】
。
（項目３０）
前記細菌が、グラム陰性である、項目２７に記載の方法。
（項目３１）
前記グラム陰性細菌染が、以下からなる群から選択される、項目３０に記載の方法：
【００４５】
【化１６】
【００４６】
。
（項目３２）
前記化合物が、浸透性賦活薬に連結され、ここで、該浸透性賦活薬により、該化合物が前記細菌の細胞エンベロープを通過できる、項目２７に記載の方法。
（項目３３）
前記賦活薬が、ポリミキシンＢ、表面活性剤、デフェンシン、他の膜活性ペプチドおよびキレート化剤からなる群から選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
さらに、前記細菌を浸透性賦活薬と接触させる工程を包含する、項目２７に記載の方法。
（項目３５）
前記浸透性賦活薬が、ポリミキシンＢ、表面活性剤、デフェンシン、他の膜活性ペプチドおよびキレート化剤からなる群から選択される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
細菌の成長を阻止する方法であって、構造４−［（６−アミノ−２，３−ジフェニル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−８−イルアミノ）−メチル］−Ｎ，Ｎ−ジエチル−ベンゼンスルホンアミドを有する化合物の有効量を細菌と接触させる工程を包含する、方法。
（項目３７）
細菌に感染した被験体を治療する方法であって、該方法は、該被験体に、以下の構造を有する１種またはそれ以上の化合物またはそれらの薬学的に受容可能な塩の有効量を投与する工程を包含する：
【００４７】
【化１７】
【００４８】
ここで、
ａ）Ｘ１およびＸ２は、ＣＨまたはＮであり、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである；
ｂ）Ｓ１は、１個〜８個の炭素原子を含む有機ラジカルである；
ｃ）Ｓ２、Ｓ３およびＳ４は、別個に、水素、アミノ、ハロゲン、または１個〜２６個の炭素原子を含む１個またはそれ以上の有機ラジカルから選択される、
方法。
（項目３８）
前記細菌感染が、グラム陽性菌感染である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記細菌感染が、以下からなる群から選択される、項目３８に記載の方法：
【００４９】
【化１８】
【００５０】
。
（項目４０）
前記細菌感染が、グラム陰性菌感染である、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記細菌感染が、以下からなる群から選択される、項目４０に記載の方法：
【００５１】
【化１９】
【００５２】
。
（項目４２）
前記化合物が、チューブリン重合を阻害しない、項目３７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、種々の源由来のＦｔｓＺ配列の系統的樹形図を示す。
【図２】図２は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａに対するＳＲＩ−３０７２の殺菌活性を示す。２倍、４倍および８倍のＭＩＣ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）存在下のｃｆｕ／ｍｌを、薬物の存在下、インキュベーションの６日後に７Ｈ１１寒天上にプレーティングすることにより、決定した。
【図３】図３は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺポリマー化の阻害を示す。ＦｔｓＺ（１３μＭ）を、ポリマー化緩衝液中の異なる濃度のＳＲＩ−７６１４、ＳＲＩ−３０７２およびコルヒチンと共にインキュベートした。ポリマー化を、４０μＭのＧＴＰの付加により開始し、蛍光における増大を、９０°光散乱アッセイを使用して測定した。挿入図はＩＤ５０値の決定を例示する。最大光散乱を、ＧＴＰ加算の前に、ピーク値からベースライン値を引くことにより計算した。
【図４】図４は、ＧＴＰ加水分解の阻害を例示する。ＦｔｓＺを、ポリマー化アッセイに記載される同じ条件の下でアッセイした。種々の時点で、２５μｌのアリコートを回収し、３２Ｐの放出についてアッセイした。ＧＴＰ加水分解に対する時間経過を、１００μＭコルヒチン、ＳＲＩ−７６１４およびＳＲＩ−３０７２の存在下で測定し、コントロールと比較した。
【図５】図５は、チューブリンポリマー化の阻害を例示する。チューブリン（２０μＭ）を、ポリマー緩衝液中１００Ｍコルヒチン、ＳＲＩ−７６１４、ＳＲＩ−３０７２でインキュベートし、コントロールと比較した。ポリマー化を、１ｍＭのＧＴＰの添加により開始し、蛍光における増大を、９０°光散乱アッセイを使用して測定した。
【図６】図６は、３−デアザプテリジン化合物の合成についての１つの合成スキームを示す。
【図７】図７は、ピリドジアゼピン化合物の合成についての１つの合成スキームを示す。
【図８】図８は、３−デアザプテリジンおよびピリドジアゼピン化合物のアザアナログの合成についての重要な中間体の合成についての１つの合成スキームを示す。
【図９】図９は、細胞長におけるＳＲＩ−３０７２の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
（好ましい実施態様の説明）
本発明は、本発明の好ましい実施態様の以下の詳細な説明およびそこに含まれる実施例ならびに図面および先の記述および以下の記述を参照することにより、さらに容易に理解できる。
【００５５】
本発明の化合物、組成物、製品、装置および／または方法を開示し記述する前に、本発明は、特定の合成方法、特定の変異体または特定のスクリーニング方法には限定されず、それ自体、もちろん、変え得ることが理解できるはずである。また、本明細書中で使用する専門用語は、特定の実施態様を記述する目的のためのみであり、限定するとは解釈されないことが理解できるはずである。
【００５６】
本明細書および添付の請求の範囲で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他に文脈で明らかに指示がなければ、複数の指示物を含む。それゆえ、例えば、「細菌（ａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）」の対象物は、複数の細菌の培養物および集団を含み、また、「細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）」の対象物は、２種以上の細菌を含むなどである。
【００５７】
範囲は、本明細書中にて、「約」ある特定の値からおよび／または「約」別の特定の値までとして表わされ得る。このような範囲が表わされる場合、別の実施態様は、ある特定の値からおよび／または他の特定の値までを包含する。同様に、値が、先行詞である「約」を使用することにより、概算値として表わされる場合、その特定の値は、別の実施態様をなすことが理解できる。さらに、これらの範囲の各々の終点は、他の終点に関連して、また、他の終点とは無関係に、重要であることが理解できる。
【００５８】
以下の本明細書および請求の範囲では、多数の用語を参照するが、これらは、以下の意味を有するように定義される：
「任意の」または「必要に応じて」とは、引き続いて記述された事象または状況が起こり得るかまたは起こり得ないこと、およびこの記述が、該事象または該状況が起こる場合および該事象が起こらない場合を含むことを意味する。
【００５９】
本開示において、細菌細胞増殖およびＦｔｓＺ活性の阻害剤としての化合物の使用が、記載される。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、用語「ＦｔｓＺ」は、Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびその誘導体由来の寄託番号Ｏ０８３７８の下でＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｓｅに列挙されるポリペプチドをいう。
【００６０】
ＦｔｓＺの「誘導体」は、ＦｔｓＺの生物学的活性に実質的に類似する生物学的活性（機能的または構造的のいずれか）を有するポリペプチドに関し、そして「フラグメント」、「改変体」、「アナログ」、「ホモログ」および「化学的変化」を含む。好ましくは、誘導体は、重合化する能力を保持する。
【００６１】
用語「フラグメント」は、ＦｔｓＺの３以上の連続的または隣接するアミノ酸を組み込むＦｔｓＺアミノ酸配列の任意のポリペプチドサブセットをいうことを意味する。用語「改変体」は、アミノ酸構造において全ＦｔｓＺ分子、またはそのフラグメントのいずれかと実質的に類似の分子をいうことを意味する。用語「アナログ」は、機能において全ＦｔｓＺ分子またはそのフラグメントのいずれかと実質的に類似の分子をいう。用語「ホモログ」は、種々の細菌において、対応するＦｔｓＺの対応物、またはその誘導体をいうことを意味し、この細菌としては、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方を含むが、これらに限定されない。用語「化学的変化」は、同じ様式で構造的に修飾されたＦｔｓＺの誘導体を意味するが、これは、ＦｔｓＺと類似の様式で機能する。化学的変化は、ＦｔｓＺ遺伝子をコードするヌクレオチド配列の修飾により（例えば、置換、付加、欠失などにより）作製され得、あるいは化学的手段、ｍＲＮＡのインビトロ翻訳、当業者に公知の任意の他の等価な方法、またはＦｔｓＺへの化学的部分の付加を介してのような、インビトロでのポリペプチドの合成により生成される。天然に存在する、ｆｔｓｚ遺伝子、またはそのタンパク質への変異がまた、含まれる。
【００６２】
両方の分子が、その各々のアミノ酸配列の間で、５０％より高い同一性または５０％より高い類似性（６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を含めて）を有する場合、構造に関して、または両方の分子がアミノ酸配列の類似性または同一性に関わらず類似の生物学的活性を有する場合、機能に関して、分子は、ＦｔｓＺと「実質的に類似」または「相同な」である。当業者は、いかにして２つのタンパク質の相同性を決定するかを容易に理解する。
【００６３】
用語「改変体」は、核酸またはペプチド分子のいずれかの配列における変異をいう。改変体といわれる場合、改変体は記述される特定の置換に依存する特定の性質を表すが、改変体が開示された活性を保持する場合、特に記述された位置以外の位置における他の置換、欠失、および／または挿入、例えば、保護的置換、挿入および／または欠失がまた、企図される。
【００６４】
ほとんどのＦｔｓＺアミノ酸配列は、化学種間の配列保護をほとんど示さない短いＮ末端セグメントおよび短い〜長いＣ末端セグメントを有する。しかし、化学種の至る所で保護される保護されたコア配列が存在する。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、保護されたコアは、アミノ酸１０〜３１６に延び、次の配列（ＤＡＶＩＫ（配列番号２）−ＶＡＴＧＩＧ（配列番号３））で始まり、そして終わる。保護されたコアが、比較のために使用される場合、ＦｔｓＺ配列は、４０％〜６０％の同一性を示す。保護されたＦｔｓＺ配列を有する細菌の代表的な列挙は、図１に示される。ＦｔｓＺコア配列は、広範な生物にわたる注目すべき程度の類似性を共有する。
【００６５】
本明細書中で議論されるように、公知であり、本明細書中で企図されるＦｔｓＺ分子の多くの改変体が、存在する。公知の機能性株改変体に加えて、開示された方法および組成物においても機能するＦｔｓＺタンパク質の誘導体が、存在する。タンパク質改変体および誘導体は、当業者に十分理解され、アミノ酸配列改変を含み得る。例えば、アミノ酸配列改変は、代表的に、以下の３つのクラスの１つ以上に入る：置換改変体、挿入改変体、または欠失改変体。挿入は、アミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合ならびに単一のまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入は、もともと、例えば、およそ１〜４の残基の、アミノ末端融合またはカルボキシル末端融合の挿入よりも小さな挿入である。欠失は、タンパク質配列からの１つ以上のアミノ酸残基の除去により特徴付けられる。代表的に、約２〜６以下の残基が、タンパク質分子中の任意の１つの部位で欠失される。これらの改変体は、通常タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発により調製され、これにより、改変体をコードするＤＮＡを産生し、そしてその後、組換え細胞培養物中でＤＮＡを発現する。既知の配列を有するＤＮＡ中の所定の部位で置換変異を行うための技術が、周知である（例えば、Ｍ１３プライマー突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発）。置換改変体は、少なくとも１つの残基が除去され、そして異なる残基がその場所に挿入される改変体である。このような置換は、一般的に、以下の表１および表２に従って行われ、保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）と呼ばれる。
【００６６】
【表１−１】
【００６７】
【表１−２】
【００６８】
【表２】
【００６９】
機能における実質的な変化が、表２における置換よりもあまり保存的でない置換を選択すること（すなわち、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造（例えばシート構造またはヘリックス構造のような）、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さを維持する効果においてより有意に異なる残基を選択すること）により行われる。一般に、タンパク質特性において最も大きな変化を作るよう予測される置換は、（ａ）親水性残基（例えば、セリン残基またはトレオニン残基）が、疎水性残基（例えば、ロイシン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、バリン残基、またはアラニン残基）の代わりに置換され；（ｂ）システインまたはプロリンが、任意の他の残基の代わりに（または任意の他の残基により）置換され；（ｃ）電気陽性側鎖を有する残基（例えば、リジン残基、アルギニン残基、またはヒスチジン残基）が、電気陰性残基（例えば、グルタミン残基またはアスパラギン残基）の代わりに（または電気陰性残基により）置換されるか、または；（ｄ）嵩高い側鎖（例えば、フェニルアラニン）を有する残基が、側鎖（例えば、この場合グリシン）を有さない残基の代わりに置換される、（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化のための部位の数を増加することによる置換である。
【００７０】
例えば、１つのアミノ酸残基の、生物学的および／または化学的に類似の別のアミノ酸残基との置換は、保存的置換として当業者に公知である。例えば、保存的置換は、１つの疎水性残基を別の疎水性残基で置換するか、または１つの極性残基を別の極性残基で置換することである。これらの置換としては、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ，Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒのような組み合わせが挙げられる。各々の明確に開示された配列のこのような保存的に置換された改変体は、本明細書中に提供されるモザイクポリペプチド中に含まれる。
【００７１】
アミノ酸置換は、代表的に単一の残基の置換であるが、多くの異なる位置で同時に起こり得る；挿入は、通常、およそ約１〜１０のアミノ酸残基であり；そして欠失は、約１０〜３０残基にわたる。欠失または挿入が、好ましくは、隣接する対（すなわち、２残基の欠失または２残基の挿入）において作製される。置換、欠失、挿入またはこれらの任意の組み合わせが、組み合わされて最終構築物に到達し得る。突然変異誘発は、配列をリーディングフレームの外に配置してはならず、そして好ましくは、第２のｍＲＮＡ構造を生成し得る相補的領域を作製しない。
【００７２】
置換突然変異誘発または欠失突然変異誘発が利用されて、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）のための部位を挿入し得る。システインまたは他の不安定残基の欠失がまた、所望され得る。可能性のあるタンパク質分解部位（例えば、Ａｒｇ）の欠失または置換が、例えば塩基性残基の１つの欠失またはグルタミン残基もしくはヒスチジン残基による塩基性残基の１つの置換により、達成される。
【００７３】
ある翻訳後の誘導体は、発現されたポリペプチド上の組換え宿主細胞のいくらかの型の作用の結果である。グルタミン残基およびアスパラギン残基は、しばしば、翻訳後に対応するグルタミン酸残基およびアスパラギン酸残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。他の翻訳後の修飾としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリン残基またはスレオニン残基のヒドロキシル基のホスホリル化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｐｐ７９−８６［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化、および、ある場合は、Ｃ末端カルボキシルのアミド化が挙げられる。
【００７４】
本明細書が種々のタンパク質およびタンパク質配列を議論するので、これらのタンパク質配列をコードし得る核酸もまた開示されることが理解される。これは、特定のタンパク質配列に関連する全ての縮重配列（すなわち、１つの特定のタンパク質配列をコードする配列を有する全ての核酸ならびにタンパク質配列の開示された改変体および誘導体をコードする全ての核酸（縮重核酸を含む））を含む。従って、各特定の核酸配列が本明細書中に書き記され得ないものの、各全ての配列が、開示されたタンパク質配列によって、本明細書に、実際に開示され、そして記載されることが理解される。
【００７５】
ＦｔｓＺ分子に組み込まれ得る多くのアミノ酸およびペプチドアナログが存在することが理解される。例えば、多くのＤアミノ酸、または表１および表２に示されるアミノ酸とは異なる官能性置換基を有するアミノ酸が存在する。天然に存在するペプチドの反対の立体異性体、ならびにペプチドアナログの立体異性体が開示される。これらのアミノ酸は、ｔＲＮＡ分子を選択したアミノ酸で荷電すること、および部位特異的方法でペプチド鎖内にアナログアミノ酸を挿入するために例えばアンバーコドンを利用する遺伝子構築物を操作することによってポリペプチド鎖内に容易に組み込まれ得る（Ｔｈｏｒｓｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．７７：４３−７３（１９９１），Ｚｏｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：３４８−３５４（１９９２）；Ｉｂｂａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｒｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ １３：１９７−２１６（１９９５），Ｃａｈｉｌｌら、ＴＩＢＳ，１４（１０）：４００−４０３（１９８９）；Ｂｅｎｎｅｒ，ＴＩＢ Ｔｅｃｈ，１２：１５８−１６３（１９９４）；ＩｂｂａおよびＨｅｎｎｅｃｋｅ，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：６７８−６８２（１９９４）（これらは全て、少なくともアミノ酸アナログに関連する材料について、本明細書中において参考として援用される））。
【００７６】
本明細書中で考察されるように、相同性および同一性という用語の使用が、類似性と同じことを意味することが理解される。従って、例えば、相同性という言葉の使用が２つの非天然の配列の間で使用される場合、これは、これら２つの配列間の進化的関係を必ずしも示さず、むしろ、それらの核酸配列またはアミノ酸配列間の類似性または関係性を見ていることが理解される。２つの進化的に関連する分子間の相同性を決定するための方法の多くが、それらが進化的に関連するか否かに関わらず、配列類似性を測定する目的で、任意の２つ以上の核酸またはタンパク質に慣用的に適用される。
【００７７】
保存的変異および相同性についての記載が、任意の組み合わせで一緒に組み合わされ得（例えば、特定の配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する実施形態）、この改変体が保存的アミノ酸置換を含むことが理解される。
【００７８】
一般的に、本明細書中に開示される遺伝子およびタンパク質の任意の公知の改変体および誘導体または生じ得る改変体および誘導体を規定するための１つの方法は、特定の公知の配列に対する相同性の点で改変体および誘導体を規定することによることが理解される。本明細書中に開示される特定の配列のこの同一性はまた、本明細書中で他で考察される。一般的に、本明細書中で代表的に開示される遺伝子およびタンパク質の改変体は、示された配列またはネイティブな配列と少なくとも約４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する。当業者は、２つのタンパク質または核酸（例えば、遺伝子）の相同性を決定する方法を容易に理解する。例えば、相同性がその最も高いレベルであるように、２つの配列を整列した後に、相同性が計算され得る。
【００７９】
相同性を計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムによって実行され得る。比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性方法についての検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｌｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって実行され得る。
【００８０】
同じタイプの相同性は、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６−７７１０，１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．ｌ８３：２８ｌ−３０６，１９８９（少なくとも核酸配列に関連する材料について、本明細書中において、参考として援用される）に開示されるアルゴリズムによって、核酸について得られ得る。代表的に、任意の方法が使用され得、そして特定の場合において、これらの種々の方法の結果が異なり得ることが理解されるが、当業者は、これらの方法のうちの少なくとも１つで同一性が見出される場合、これらの配列は、示された同一性を有すると言われ、本明細書中に開示されることを理解する。
【００８１】
例えば、本明細書中で使用される場合、別の配列に対して特定のパーセントの相同性を有するとして示された配列は、上記計算方法の任意の１つ以上によって計算される、示された相同性を有する配列をいう。例えば、たとえ第１配列が任意の他の計算方法によって計算された場合に第２配列に対して８０％の相同性を有さないとしても、第１配列が第２配列に対してＺｕｋｅｒ計算法を使用して８０％の相同性を有すると計算される場合、本明細書中に規定される場合、第１配列は、第２配列に対して８０％の相同性を有する。別の例として、たとえ第１配列がＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ計算法、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ計算法、Ｊａｅｇｅｒ計算法、または任意の他の計算方法によって計算された場合に第２配列に対して８０％の相同性を有さないとしても、第１配列が第２配列に対してＺｕｋｅｒ計算法およびＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ計算法の両方を使用して８０％の相同性を有すると計算される場合、本明細書中に規定される場合、第１配列は、第２配列に対して８０％の相同性を有する。なお別の例として、第１配列が第２配列に対して任意の計算法を使用して８０％の相同性を有すると計算される場合、本明細書中に規定される場合、第１配列は、第２配列に対して８０％の相同性を有すると計算される（もっとも、実際には、異なる計算方法は、しばしば、異なる計算された相同性％を生じる）。
【００８２】
「薬学的に受容可能な」とは、生物学的またはそれ以外で有害ではない物質、すなわち、臨床的に許容できない生体効果を生じたりせず、また、それが含有される医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用せずに、関連した活性化合物と共に個体に投与できる物質を意味する。
【００８３】
「アルキル」との用語は、炭化水素基または残基であって、非環式アルカンからの１つの水素原子の除去および置換（従って、非水素基または残基の置換）により変性した非環式アルカン化合物と構造的に類似しているものを意味する。アルキルは、非環式で飽和の直鎖または分枝鎖炭化水素残基を包含し、これは、１個〜１２個の炭素、１個〜８個の炭素または１個〜６個の炭素を有する。このようなアルキルラジカルの例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、n−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、アミ
ル、ｔ−アミル、ｎ−ペンチルなどのラジカルが挙げられる。低級アルキルは、１個〜４個の炭素原子を有する非環式で飽和の直鎖または分枝鎖炭化水素残基を包含する。
【００８４】
本明細書中で使用する「アルコキシ」との用語は、上で定義したアルキル残基であって、酸素原子に結合してエーテルラジカルを形成するものを意味し、ここで、この酸素原子はまた、他のラジカルに結合される。例には、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、イソ−ブトキシなどが挙げられる。
【００８５】
「一置換アミノ」との用語は、そのＲラジカルが有機ラジカルであるアミノ（−ＮＨＲ）ラジカルを意味する。適当な有機ラジカルには、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシまたはアシルが挙げられるが、これらに限定されず、ここで、この用語は、本明細書中で見られる定義を有する。一置換アミノ基の例には、メチルアミノ（−ＮＨ−ＣＨ３）；エチルアミノ（−ＮＨＣＨ２ＣＨ３）、ヒドロキシエチルアミノ（−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、メトキシエチルアミノ（−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）などが挙げられる。
【００８６】
「二置換アミノ」との用語は、二置換アミノラジカル（−ＮＲ１Ｒ２）を意味し、ここで、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なり得る有機ラジカルである。適当な有機ラジカルには、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシまたはアシルが挙げられるが、これらに限定されず、ここで、この用語は、本明細書中で見られる定義を有する。一部の例には、ジメチルアミノ、メチルエチルアミノ、ジエチルアミノ、ジヒドロキシエチルアミノ、および類似のラジカルが挙げられる。
【００８７】
「ハロアルキル」との用語は、そのアルキルラジカル上の１個またはそれ以上の水素を１個またはそれ以上のハロゲンで置き換えたアルキル残基（これは、上で定義した）を意味する。ある実施態様では、これらのハロゲンは、フルオロラジカルである。例には、クロロメチル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチルなどが挙げられる。
【００８８】
「ハロアルコキシ」との用語は、酸素に直接結合してハロアルキル置換基ラジカル有するエーテルラジカルを形成するハロアルキル残基（これは、上で定義した）を意味する。例には、トリフルオロメトキシ、ペンタフルオロエトキシなどが挙げられる。
【００８９】
「アシル」との用語は、そのＲラジカルが水素であるかまたはカルボニル炭素に結合した有機ラジカルの炭素を有するＲ−Ｃ（Ｏ）−を意味する。例には、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブタノイル、イソ−ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、ベンゾイルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
「アシルオキシ」との用語は、酸素と直接結合してＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ラジカルを形成するアシルラジカル（これは、上で定義した）を意味する。例には、アシルオキシ、プロピオニルオキシ、ブタノイルオキシ、イソ−ブタノイルオキシ、ベンゾイルオキシ、および類似のラジカルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
「アリール」との用語は、６個〜１８個の炭素、好ましくは、６個〜１２個の炭素を含有する炭化水素環ラジカルであって、その中に、少なくとも１個の６員芳香族「ベンゼン」環を含むものを意味する。このようなアリールラジカルの例には、フェニル、ビフェニルおよびナフチルが挙げられる。「置換アリール」との用語は、上で定義したアリール環ラジカルであって、１個またはそれ以上、または好ましくは、１個、２個または３個の有機環、ラジカルまたは無機置換基でさらに置換したものを意味し、これらには、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシル、シクロアルキル、アミノ、一置換アミノ、二置換アミノ、アシルオキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルボアルコキシ、アルキルカルボキサミド、置換アルキルカルボキサミド、ジアルキルカルボキサミド、置換ジアルキルカルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、チオアルキル、チオハロアルキル、アルコキシ、置換アルコキシまたはハロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、複素環、置換複素環（ここで、これらの用語は、本明細書中で定義されている）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの有機置換基は、１個〜１２個の炭素原子、または１個〜６個の炭素原子、または１個〜４個の炭素原子を含有できる。
【００９２】
「ヘテロアリール」との用語は、芳香環ラジカル（これは、１個〜１８個の環炭素、または２個〜１５個の環炭素、または３個〜１２個の環炭素、または４個〜１０個の環炭素、または５個〜８個の環炭素を含有する）であって、その中の芳香環の少なくとも１個の原子をヘテロ原子で置き換えたものを意味し、このヘテロ原子には、窒素原子、酸素原子およびイオウ原子が挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリールは、１個、２個、３個、４個、５個または６個の別個に選択された環ヘテロ原子を有し得る。ヘテロアリール残基の例には、ピリジル、ビピリジル、フラニルおよびチオフラニル残基が挙げられる。置換「ヘテロアリール」残基は、１個またはそれ以上の有機ラジカルまたは無機置換基、または好ましくは、１個、２個または３個のこのような基を有し得、これらは、この上で言及したように、そのヘテロ芳香環の炭素原子に結合されている。これらの有機置換基は、１個〜１２個の炭素原子、または１個〜６個の炭素原子、または１個〜４個の炭素原子を含有できる。
【００９３】
「ハロ」または「ハロゲン」との用語は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードラジカルをいう。
【００９４】
「チオアルキル」との用語は、アルキルラジカルに結合したスルフィド原子（直鎖または分枝）を意味する。例には、メチルスルフィド、エチルスルフィド、イソプロピルスルフィドなどが挙げられる。
【００９５】
「チオハロアルキル」との用語は、１個またはそれ以上の水素をハロゲン原子で置き換えたチオアルキルラジカルを意味する。例には、トリフルオロメチルチオ、１，１−ジフルオロメチルチオ、２，２，２−トリフルオロエチルチオなどが挙げられる。
【００９６】
「シクロアルキル」との用語は、炭化水素基であって、環式アルカンからの水素原子の除去（従って、非水素基または残基の置換）により修飾した環式アルカン化合物と構造的に類似している。シクロアルキル基または残基ラジカルは、３個〜１８個の炭素、好ましくは、４個〜１２個の炭素、または５個〜８個の炭素を有する。例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、デカヒドロナフチル、アダマンチルなどの残基が挙げられる。
【００９７】
「置換シクロアルキル」との用語は、上で定義したシクロアルキル残基であって、１個、２個またはそれ以上の追加の有機ラジカルまたは無機置換基でさらに置換したものを意味し、これらには、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、置換アルコキシ、カルボキシ、カルボアルコキシ、アルキルカルボキサミド、置換アルキルカルボキサミド、ジアルキルカルボキサミド、置換ジアルキルカルボキサミド、アミノ、一置換アミノまたは二置換アミノを挙げることができるが、これらに限定されない。このシクロアルキルが１個またはそれ以上の置換基で置換されているとき、それらは、同一または異なり得る。これらの有機置換基は、１個〜１２個の炭素原子、または１個〜６個の炭素原子、または１個〜４個の炭素原子を含有できる。
【００９８】
「シクロアルケニル」との用語は、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含有する、上で定義したシクロアルキル残基を意味する。例には、シクロプロペニル、１−シクロブテニル、２−シクロブテニル、１−シクロペンテニル、２−シクロペンテニル、３−シクロペンテニル、１−シクロヘキシル、２−シクロヘキシル、３−シクロヘキシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。「置換シクロアルケニル」との用語は、上で定義したシクロアルケニルであって、１個またはそれ以上の有機ラジカルまたは無機置換基でさらに置換したものを意味する。適当な置換基ラジカルには、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、置換アルコキシ、ハロアルコキシ、カルボキシ、カルボアルコキシ、アルキルカルボキサミド、ジアルキルカルボキサミド、アミノ、一置換アミノまたは二置換アミノラジカルが挙げられるが、これらに限定されない。このシクロアルケニルが１個またはそれ以上の基で置換されているとき、それらは、同一または異なり得る。これらの有機置換基は、１個〜１２個の炭素原子、または１個〜６個の炭素原子、または１個〜４個の炭素原子を含有できる。
【００９９】
本明細書中で定義し使用する「有機ラジカル」は、１個またはそれ以上の炭素原子を含有する。例えば、有機ラジカルは、１個〜２６個の炭素原子、１個〜１８個の炭素原子、１個〜１２個の炭素原子、１個〜８個の炭素原子、または１個〜４個の炭素原子を有し得る。有機ラジカルは、しばしば、その有機ラジカルの炭素原子の少なくとも一部に結合した水素を有する。無機原子を含有しない有機ラジカルの一例には、５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチルラジカルがある。ある実施態様では、有機ラジカルは、そこに結合した１個〜１０個の無機ヘテロ原子を含有でき、これらには、ハロゲン、酸素、イオウ、窒素、リンなどが挙げられる。有機ラジカルの例には、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、一置換アミノ、二置換アミノ、アシルオキシ、シアノ、カルボキシ、カルボアルコキシ、アルキルカルボキサミド、置換アルキルカルボキサミド、ジアルキルカルボキサミド、置換ジアルキルカルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、チオアルキル、チオハロアルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、複素環または置換複素環ラジカルが挙げられるが、これらに限定されず、ここで、これらの用語は、本明細書中の他の箇所で定義されている。ヘテロ原子を含有する有機ラジカルの少数の非限定的な例には、アルコキシラジカル、トリフルオロメトキシラジカル、アセトキシラジカル、ジメチルアミノラジカルなどが挙げられる。
【０１００】
「プロドラッグ」との表現は、薬剤前駆体である化合物を意味し、これは、投与に続いて、化学的または生理学的プロセスによりインビボで薬剤を放出する（例えば、プロドラッグは、生理学的ｐＨにされるか酵素作用により、所望の薬剤形状に変換される）。代表的なプロドラッグは、開裂すると、対応する遊離酸を放出し、式（Ｉ）の化合物のこのような加水分解可能エステル形成残基には、カルボキシル部分を有するものが挙げられるが、これらに限定されず、ここで、その遊離水素は、以下で置き換えられている：（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ７）アルカノイルオキシメチル、１−（アルカノイルオキシ）エチル（これは、４個〜９個の炭素原子を有する）、１−メチル−１−（アルカノイルオキシ）−エチル（これは、５個〜１０個の炭素原子を有する）、アルコキシカルボニルオキシメチル（これは、３個〜６個の炭素原子を有する）、１−（アルコキシカルボニルオキシ）エチル（これは、４個〜７個の炭素原子を有する）、１−メチル−１−（アルコキシカルボニルオキシ）エチル（これは、５個〜８個の炭素原子を有する）、Ｎ−（アルコキシカルボニル）アミノメチル（これは、３個〜９個の炭素原子を有する）、１−（Ｎ−（アルコキシカルボニル）アミノ）エチル（これは、４個〜１０個の炭素原子を有する）、３−フタリジル、４−クロトノールアクトリル、γ−ブチロールオクトン−４−イル、ジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ２〜Ｃ３）アルキル（例えば、ｂ−ジメチルアミノエチル）、カルバモイル−（Ｃ１〜Ｃ２）アルキル、Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１〜Ｃ２）アルキルカルバモイル−（Ｃ１〜Ｃ２）アルキルおよびピペリジノ−、ピロリジノ−またはモルホリノ（Ｃ２〜Ｃ３）アルキル。
【０１０１】
（本発明の方法）
本発明は、インビボおよびインビトロ抗菌方法を提供する。「抗菌」とは、細菌の成長を阻止または防止するか、細菌を殺すか、または細菌の数を減らすことを意味する。それゆえ、本発明は、細菌の成長を阻止または防止する方法を提供し、該方法は、以下の構造を有する１種またはそれ以上の化合物の有効量を細菌と接触させる工程を包含する：
【０１０２】
【化２１】
【０１０３】
本発明の化合物のさらに別の構造は、本明細書中で提供されている。
【０１０４】
また、本発明は、細菌の成長を阻止または防止する方法を提供し、該方法は、式４−［（６−アミノ−２，３−ジフェニル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−８−イルアミノ）−メチル］−Ｎ，Ｎ−ジエチル−ベンゼンスルホンアミドを有する１種またはそれ以上の化合物の有効量を細菌と接触させる工程を包含する。
【０１０５】
「細菌の成長を阻止する」とは、単一の細菌が娘細胞に分裂する能力を低下させるか細菌の集団が娘細胞に分裂する能力を低下させることとして、定義される。細菌が再生する能力は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または１００％またはそれ以上、低下できる。
【０１０６】
本発明はまた、細菌または細菌の集団を殺す方法を提供し、該方法は、本明細書中で開示し記述した１種またはそれ以上の化合物を該細菌と接触させる工程を包含する。
【０１０７】
「細菌を殺す」とは、単一の細菌の死を引き起こすこと、または複数の細菌（例えば、コロニー中のもの）の数を減らすこととして、定義される。細菌が複数形状であるとき、「細菌を殺す」とは、所定細菌集団の１０％の割合、その集団の２０％の割合、その集団の３０％の割合、その集団の４０％の割合、その集団の５０％の割合、その集団の６０％の割合、その集団の７０％の割合、その集団の８０％の割合、その集団の９０％の割合、またはその集団の１００％に等しいかそれ未満の割合での集団の細胞死として、定義される。
【０１０８】
本発明のＦｔｓｚインヒビターは、インビトロまたはインビボで抗菌活性を有する。一連の化合物が表３および表８に示される。これらの化合物を、１２．５ｇ／ｍｌの濃度でＭ．ｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖに対する潜在的な抗菌活性についてスクリーニングした。細菌増殖の少なくとも９０％阻害を示す化合物を、さらなる研究のために選択した。
【０１０９】
表３および表８に示されるように、いくつかの化合物が、最初のスクリーニングにおいて、Ｍ．ｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖに対して活性を示した。これらは、ＳＲＩ−７４０５、ＳＲＩ−３０７２、ＳＲＩ−７６１４、ＳＲＩ７４６２、４４２７−０２６−１５、４４２７−１４３、ＣＡＯ−０４０、３４９１−２３および３３０２−９８Ｆを含んだ。これらの化合物のいくつかが、以下に記載されるように、Ｍ．ｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖに対してより低濃度で試験され、最小阻害濃度（ＭＩＣ９９）（ＢＡＣＴＥＣアッセイ）を決定し、哺乳動物Ｖｅｒｏ細胞に対して試験して、ＩＣ５０（ＭＴＳアッセイ）を決定した。ＭＩＣ９９値およびＩＣ５０値を使用して、これらの化合物についての選択性指数（ＳＩ、ＩＣ５０／ＭＩＣ９９として規定される）を決定した。ＳＲＩ−７６１４は、６．２５ｍｇ／Ｌ（１９μＭ）のＭＩＣ９９を有し、＞２００μｇ／ｍｌのＩＣ５０を有した。ＳＲＩ−７６１４についての得られたＳＩは、＞３２であった。ＳＲＩ−３０７２は、０．１５μｇ／ｍｌ（０．２８μＭ）のＭＩＣ９９および６．３μｇ／ｍｌのＩＣ５０を有した。ＳＲＩ−３０７２についての得られたＳＩは、４２．０であった。さらなる結果を、表３に示す。これらの結果は、本発明の化合物について幅広い範囲の抗菌活性を示す。
【０１１０】
イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、カナマイシン、ピラジナミド、チアセタゾン（ｔｈｉａｃｅｔａｚｏｎｅ）、またはサイクロセリンのいずれかに対して単独で耐性であったＭ．ｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓの株は、ＳＲＩ−７６１４およびＳＲＩ−３０７２に対して一様に感受性であり、野生型株の値と類似したＭＩＣ９９値を有する（表５）。従って、本発明の化合物は、抗生物質耐性細菌に対して有用である。
【０１１１】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７ＲａについてのＳＲＩ−３０７２のＭＩＣおよびＭＢＣは、０．２５ｍｇ／Ｌ（０．４７μＭ）および１〜２ｍｇ／ｌ（１．９〜３．８μＭ）であった（図２）。０．９５μＭ、１．９μＭおよび３．８μＭの薬物の存在下での対数減少（ｃｆｕ／ｍＬ）は、それぞれ、０．９８±０．１１、１．７±０．０６および２．０±０．１２であった。薬物を用いない生存度コントロールでの増殖は、インキュベーションの６日後に、≧１−ｌｏｇ１０ｃｆｕ／ｍＬ増加したことを推定した（実施例１を参照のこと）。
【０１１２】
好ましい実施形態において、ＭＩＣに対するＭＢＣの殺菌比は、約４以下である。ＳＲＩ−３０７２について、この比は、１．９μＭのＭＢＣについての値を使用して、４であった。
【０１１３】
ＳＲＩ−３０７２は、感染したマウス骨髄マクロファージにおいて、Ｍ．ｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓの増殖を阻害した。７日後のミコバクテリア増殖における９０％減少および９９％減少をもたらす濃度は、それぞれ、０．２３μＭ（０．１２μｇ／ｍｌ、ＥＣ９０）および２．７μＭ（１．４２μｇ／ｍｌ、ＥＣ９９）であった。ＥＣ９０は、Ｈ３７Ｒｖ、Ｈ３７Ｒａ、Ｅｒｄｍａｎおよび薬物耐性株についてのＭＩＣ値と類似し、これは、マクロファージ内へのＳＲＩ−３０７２の適切な透過性を示す。
【０１１４】
さらに、ＳＲＩ−３０７２を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（それぞれ、グラム陰性杆体およびグラム陽性球菌を代表する）に対してアッセイした（表７）。次いで、薬物をグラム陽性杆体および球菌の拡大したパネルに対して試験し、これは、メチシリン耐性ブドウ球菌、多剤耐性ブドウ球菌およびバンコマイシン耐性腸球菌を含んだ。これらの生物に対するＭＩＣは、試験した単一のグラム陽性杆体（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）について、１６μｇ／ｍＬのＭＩＣで阻害したことを除いて、３２〜６４μｇ／ｍＬの範囲であった。結論として、ＳＲＩ−３０７２は、いくつかのグラム陽性細菌（薬物耐性株を含む）に対して中程度の活性を示した（実施例８）。
【０１１５】
本発明の化合物は、いくつかの異なるタイプの細菌の阻害によって実証されるように、抗菌活性を示した。ＳＲＩ−３０７２はまた、感染したマウス骨マクロファージにおいて、Ｍ．ｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓ Ｅｒｄｍａｎの増殖を阻害することを示した。
【０１１６】
本発明はまた、細菌に感染した被験体を治療する方法を提供し、該方法は、該被験体に、本発明の化合物の治療有効量を投与する工程を包含する。
【０１１７】
本明細書中で提供した化合物の「治療有効量」との用語は、その化合物が１つまたはそれ以上の症状の所望の減少をもたらす非毒性であるが十分な量を意味する。以下で指摘するように、必要な化合物の正確な量は、被験体の種、年齢および一般的な健康状態、治療する疾患の重症度、使用する特定の化合物、その投与様式などに依存して、被験体ごとに変わる。それゆえ、正確な「有効量」を特定することは不可能である。しかしながら、適当な有効量は、常套的な実験方法を使用するだけで、当業者により決定され得る。
【０１１８】
本発明の化合物は、当該技術分野で公知の技術を使用して、調製される。これらの化合物は、個々にまたは共同で、被験体に投与する薬学的に受容可能な担体またはビヒクルと混ぜ合わせられる。「薬学的に受容可能な担体」または「薬学的に受容可能なビヒクル」とは、好ましくない生理学的応答を引き起こすことなく、また、有害な様式でその組成物の他の成分と相互作用することなく、生きている動物またはヒトの組織と接触して使用するのに適当な任意の組成物または化合物を意味するように本明細書中で使用され、これらには、水または生理食塩水、ゲル、軟膏、溶媒、希釈液、液体軟膏基剤、リポソーム、ミセル、巨大ミセルなどが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版を参照。これは、典型的な担体およびそれらの薬剤の処方製剤と併用され得る医薬組成物を調製する通常の方法を開示しており、その内容は、本明細書中で参考として援用されている。
【０１１９】
これらの化合物は、経口的、非経口的（例えば、静脈内）、筋肉内、腹腔内、局所的、経皮的、局所的、全身的、脳室内、脳内的、硬膜下、関節内またはくも膜下腔内、鼻腔内的または挿管で、投与され得る。その薬剤および投与様式に依存して、薬剤が血液脳関門を横断するのを促進するために、特別な規定が必要であり得る。当業者は、投与様式、薬理学的担体、または血液脳関門がもたらす制約を回避する他のパラメータを改良することを知っている。投与する活性化合物の量は、もちろん、治療する被験体、被験体の体重、投与様式、および処方する内科医、獣医師または栄養士の判断に依存している。
【０１２０】
意図した投与様式に依存して、これらの医薬組成物は、固形、半固形または液状の剤形（例えば、錠剤、座剤、丸薬、カプセル剤、粉剤、液体、懸濁液、ローション、クリーム、ゲルなど）、好ましくは、正確な投薬量を１回投与するのに適当な単位剤形であり得る。これらの組成物は、上記のように、薬学的に受容可能な担体と組み合わせて、選択した薬剤の有効量を含有し、さらに、他の医薬、薬剤、担体、アジュバント、希釈剤などを含有し得る。
【０１２１】
本発明はまた、式（Ｉ）または本明細書中で提供した他の式の化合物のプロドラッグを含有する医薬組成物を包含する。本発明はまた、ＦｔｓＺの阻害により治療または予防できる障害を治療または予防する方法を包含し、該方法は、式（Ｉ）または本明細書中で提供した他の式の化合物のプロドラッグを投与する工程を包含する。遊離のアミン基、アミド基、水酸基、スルホンアミド基またはカルボン酸基を有する式（Ｉ）の化合物は、プロドラッグに変換できる。プロドラッグには、アミノ酸残基、または２種またはそれ以上（例えば、２種、３種または４種）のアミノ酸残基（これらは、ペプチドを介して共有結合されている）のポリペプチド鎖は、式（Ｉ）または本明細書中で提供した他の式の化合物の遊離のアミド基、アミノ基、水酸基またはカルボン酸機に結合した化合物が挙げられる。これらのアミノ酸残基には、３つの文字記号により一般に指定された２０種の天然に生じるアミノ酸が挙げられ、また、４−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、デモシン、イソデモシン、３−メチルヒスチジン、ノルバリン、β−フラニン、γ−アミノ酪酸、シトルリン、ホモシステイン、ホモセリン、オルニチンおよびメチオニンスルホンが挙げられる。プロドラッグには、また、カーボネート、カーバメート、アミドおよびアルキルエステルがカルボニル炭素プロドラッグ側鎖を介して式（Ｉ）の上記置換基に共有結合した化合物が挙げられる。
【０１２２】
固形組成物について、通常の非毒性固形担体には、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、滑石、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。液状の薬学的に投与可能な組成物は、例えば、本明細書中で記述した活性化合物および任意の医薬アジュバントを賦形剤（例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセリン、エタノールなど）に溶解、分散などして、それにより、溶液または懸濁液を形成することにより、調製できる。もし望ましいなら、投与する医薬組成物はまた、少量の非毒性の補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など（例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレイン酸塩など））を含有し得る。このような剤形の実際の調製方法は、公知であるか、または当業者に明らかである；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（上で引用）を参照。
【０１２３】
経口投与用の微粉末または顆粒は、希釈剤、分散剤および／または表面活性剤を含有し得、そして水またはシロップ、カプセルまたは香粉（乾燥状態）、または非水性の溶液または懸濁液（ここで、懸濁液が含有され得る）、錠剤（ここで、結合剤および潤滑剤が含有され得る）、または懸濁液（水中またはシロップ中）に存在し得る。望ましいか必要な場合、香料、防腐剤、懸濁液、増粘剤または乳化剤が含有され得る。錠剤および顆粒は、好ましい経口投与形状であり、これらは、被覆され得る。
【０１２４】
非経口投与は、もし使用するなら、一般に、注射を特徴とする。注射可能物は、通常の形態（溶液または懸濁液、注射前の液体中の溶液または懸濁液に適当な固形物形状、または乳濁液のいずれか）で、調製できる。非経口投与のための最も最近修正されたアプローチには、遅延放出または徐放システムの使用が関与しており、その結果、一定投薬レベルが維持される。例えば、米国特許第３，７１０，７０５号（その内容は、本明細書中で参考として援用されている）を参照。
【０１２５】
本発明の治療組成物はまた、リポソーム送達系（例えば、小ユニラメラベシクル、大ユニラメラベシクルおよびマルチラメラベシクル、微小球体またはナノ球体および他の遅延放出組成物）の形態で、投与できる。リポソームは、種々のリン脂質（例えば、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリン）から形成できる。
【０１２６】
本発明の治療組成物はまた、その化合物分子がカップリングする個々の担体としてモノクローナル抗体を使用することにより、送達され得る。本開示の治療組成物はまた、標的可能薬剤担体として、溶解性重合体とカップリングされ得る。このような重合体には、ポリビニルピロリドン、ピラン共重合体、ポリヒドロキシプロピル−メタクリル−アミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルとアミドフェノールまたはポリエチレンオキシドポリリシンが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本開示の治療組成物は、薬剤を制御して放出する際に有用な生物分解性重合体（例えば、ポリ乳酸、ポリε−カプロラクタム、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロ−ピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロック共重合体）にカップリングされ得る。
【０１２７】
局所投与用の液体、懸濁液、ローション、クリーム、ゲルなどは、その活性化合物が皮膚の表面に送達できる限り、使用され得る。
【０１２８】
好ましくは、この化合物の投与により、細菌感染が、少なくとも約３％、さらに好ましくは、約１０％、さらに好ましくは、約２０％、さらに好ましくは、約３０％、さらに好ましくは、約５０％、さらに好ましくは、７５％、さらにより好ましくは、約１００％少なくなる。この感染の減少は、白血球数の減少、発熱の低下、炎症の減少、細菌数の減少または細菌感染の他の指標の低下のようなパラメータにより、決定される。細菌感染の低下を高めるために、その投薬量は、被験体に対して非毒性のままとどまる最も有効なレベルまで高めることができる。
【０１２９】
本明細書全体を通じて使用される「被験体」とは、個体を意味する。好ましくは、被験体は、哺乳動物（例えば、霊長類）、さらに好ましくは、ヒトである。「被験体」は、ペット（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）および魚類を含めることができる。
【０１３０】
「細菌感染」とは、被験体または試料における細菌の存在として、定義される。このような細菌は、被験体または試料内またはその上での天然に生じる細菌の外生であり得、または外来生物体の侵入により得る。
【０１３１】
本発明の化合物は、抗生物質と同じ様式で、使用できる。抗生物質の使用は、当該技術分野で周知である。それらの使用の一例には、動物の治療が挙げられる。必要なとき、本発明の化合物は、通常、獣医師または栄養士の専門的な指針と共に、注射により、または食物または水を介して、投与できる。それらは、疾患の重症度および動物の種のような状況に依存して、個々に、または群として、いずれかで送達される。もし、全ての動物が類似の免疫状態であり、また、全てが同じ疾患を引き起こす微生物に晒されているなら、群全体の治療および看護が必要であり得る。
【０１３２】
これらの化合物を使用する他の例には、水生動物の微生物感染を減らすことが挙げられ、これは、微生物感染に罹った水生動物を選択する工程、本発明の化合物、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＴＲＩＥＮＥ）を含有する抗菌溶液を提供する工程、この溶液にｐＨ緩衝剤を加える工程、およびそれらのｐＨを約７．０と約９．０の間の値に調節する工程、この溶液に水生動物を浸漬する工程、およびその中の水生動物をその動物の微生物負荷を減らすのに有効な期間にわたって放置する工程を包含する。ＥＤＴＡ、本発明の化合物およびＴＲＩＥＮＥおよびｐＨ緩衝剤を含有する溶液への水生動物の浸漬は、その動物の微生物負荷がなくなるまで、繰り返される（米国特許第６，５１８，２５２号）。
【０１３３】
本発明の化合物の他の用途には、歯科治療および水の精製（これには、例えば、市の上水道、下水処理システム、飲用および非飲用の給水、および孵化場を挙げることができる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
上記方法の１つの実施形態は、ＦｔｓＺ重合を阻害する化合物が、チューブリンの重合を阻害しないことである。チューブリンは、微小管（生細胞の骨格系として役立つ中空繊維）を形成する長鎖またはフィラメントへと重合するタンパク質である。微小管は、細胞が有糸分裂を起こし得るかまたは細胞内輸送を調節し得る種々の形成を介して移動する能力を有する。
【０１３５】
「チューブリンの重合を阻害する」は、コントロールと比較して、重合したチューブリンの量を減少させる（すなわち、重合体のサイズおよび／または数の減少）として規定される。好ましくは、このような阻害は、１００％以下のチューブリンの重合を阻害すること、９０％以下のチューブリンの重合を阻害すること、または８０％以下のチューブリンの重合を阻害すること、または７０％以下のチューブリンの重合を阻害すること、または６０％以下のチューブリンの重合を阻害すること、または５０％以下のチューブリンの重合を阻害すること、または４０％以下のチューブリンの重合を阻害すること、または３０％以下のチューブリンの重合を阻害すること、または２０％以下のチューブリンの重合を阻害すること、または１０％以下のチューブリンの重合を阻害すること、または５０％以下のチューブリンの重合を阻害することを包含する。
【０１３６】
今回、本発明の化合物のいくつかの高い活性の抗菌化合物は、抗新生物／チューブリン阻害活性を示す２−ＡＣＰクラスのメンバーによって示される関係とは有意に異なる構造−活性関係（ＳＡＲ）を示した。従って、ヒトチューブリンと細菌ＦｔｓＺタンパク質との間には違いが存在する。さらに、ＦｔｓＺとチューブリンの両方がチューブリン−同一性モチーフ（ＧＧＧＴＧＳ／ＴＧ）（配列番号１）を共有するものの、ＦｔｓＺとチューブリンとの全体的なアミノ酸配列類似性は、低い（＜２０％同一性）。それにもかかわらず、ＦｔｓＺおよびチューブリンは、類似した３次元の折り畳みを有することが見出され、そしてＦｔｓＺは、チューブリンの細菌ホモログであるようである。
【０１３７】
本発明はまた、細菌においてＦｔｓＺ重合体化を阻害する方法を提供し、該方法は、細菌を本発明の化合物と接触させる工程を包含する。
【０１３８】
ＦｔｓＺは、多くの細菌細胞の細胞分裂プロセスにおいて重要な役割を果たす。ＦｔｓＺは、４０ｋＤａのタンパク質であり、これは、細菌内でほぼ偏在している。ＦｔｓＺは、葉緑体の中にも存在する。ＦｔｓＺは、ＧＴＰ依存性様式で重合体化し、そして細菌チューブリンホモログであることが示されている。ＦｔｓＺおよびチューブリンは、まず直鎖状のプロトフィラメントを形成し、次いで、これらのプロトフィラメントは、シートおよびチューブのようなより大きな構造内に結合する。しかし、上で考察したように、ＦｔｓＺおよびチューブリンの配列類似性は、全体的には低いが（＜２０％同一性）、ＦｔｓＺおよびチューブリンの両方は、チューブリン同一性モチーフとして公知の一続きのアミノ酸（ＧＧＧＴＧＳ／ＴＧ）（配列番号１）を共有するし、このアミノ酸は、ＧＴＰに結合し、加水分解するように作用する。Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のＦｔｓＺは、チューブリンと類似の３次元折りたたみを有することが示された。細胞分裂プロセスにおいて、細菌は、通常はＭｉｎ Ｃタンパク質、Ｍｉｎ Ｄタンパク質、およびＭｉｎ Ｅタンパク質の助けによってまず細胞分裂に適切な部位（壁（ｓｅｐｔｕｍ）が形成する位置）を選択する。ＦｔｓＺは、壁（ｓｅｐｔｕｍ）に現れる第１の非調節エレメントであり、そして壁（ｓｅｐｔｕｍ）の作用は、正しいＦｔｓＺ作用に依存することが示されている。ＦｔｓＺ作用の阻害は、種々の型の細菌および葉緑体における細胞分裂の欠損に関わっている。実際、ＦｔｓＺのチューブリン同一性モチーフにおける１つのアミノ酸置換は、壁（ｓｅｐｔｕｍ）形成を開始することの不全をもたらす。細胞分裂または分離のプロセスの間、ＦｔｓＺ環の直径は小さくなり、環乳する細胞壁の先端を残すようになる。従って、ＦｔｓＺは、細菌細胞分裂の中枢的な役割を果たすため、新規の抗菌剤にとって非常に見込みのある標的である。
【０１３９】
「ＦｔｓＺ重合体化の阻害」は、コントロールと比較して、１つの細菌または細菌集団の中で生じ、ＦｔｓＺ重合体化の量を低減させるか、または阻害する（大きさおよび／またはポリマーの数のどちらかにおいて）と定義される。全体を通して使用されるように、「コントロール」は、無処理細菌または無処理細菌集団である。無処理細菌または無処理細菌集団は、前処理または後処理された細菌であり得るか、または独特の細菌集団であり得る。
【０１４０】
ＦｔｓＺ重合体化は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％未満、または１００％以下に低減される。
【０１４１】
この化合物を、ＦｔｓＺおよびチューブリンの重合体化およびＦｔｓＺ ＧＴＰ加水分解の阻害について試験した。チューブリンインヒビターとして公知であるコルヒチンもまた、参照化合物として含まれる。ＳＲＩ−３０７２、ＳＲＩ−７６１４、およびコルヒチンは、それぞれ５２±１２、６０±０．０、および１０４±２．０μＭのＩＤ５０値を有する容量依存性様式でＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺの重合体化を阻害した（表６）。ＦｔｓＺによるＧＴＰ加水分解は、ＦｔｓＺの重合体化が進行するために必要とされ、各化合物を、ＧＴＰ加水分解の阻害について試験した。ＳＲＩ ３０７２、ＳＲＩ
７６１４、およびコルヒチンで阻害されたＧＴＰ加水分解は、それぞれ２０％、２５％、および３０％、である。
【０１４２】
また、ＳＲＩ−３０７２、ＳＲＩ−７６１４およびコルヒチンを、チューブリン重合体化のインヒビターとして評価した（表５）。予測したように、コルヒチンは、ＦｔｓＺのインヒビターとしてよりも、チューブリンのインヒビターとしてより効果的であった。ＳＲＩ−３０７２は、ＦｔｓＺに特異的である；チューブリンの阻害は示されなかった。コルヒチンのように、ＳＲＩ−７６１４は、両タンパク質の重合体化を阻害した（ＩＤ５０＝６０μＭ ＦｔｓＺ、ＩＤ５０＝４μＭチューブリン)。上記で考察し、表６で示した
ように、ＳＲＩ ３０７２およびＳＲＩ−７６１４は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの有効かつ特異的なインヒビターである。また、実施例８において考察したように、ＳＲＩ−３０７２はまた、他の型の細菌についても有効かつ特異的である。
【０１４３】
従って、１つの実施形態において、この化合物は、チューブリン重合体化を阻害することなく、ＦｔｓＺ重合体化を阻害する。チューブリン重合体化の阻害の非存在は、アッセイのバックグラウンドの１．５倍未満の任意の阻害、または実質的な有意性を欠く任意の阻害を含む。選択された化合物（ＳＲＩ−３０７２およびＳＲＩ−７６１４によって説明される）の抗細菌活性とＦｔｓＺ重合体化とＧＴＰ加水分解との間には、相関関係が存在する。
【０１４４】
（化合物の構造）
本発明の方法は、置換２−アルコキシカルボニルアミノピリミジンまたは２−アルコキシカルボニルアミノ−ピリジン（「２−ＡＣＰ」）化合物に関するか、またはそれを利用する。本発明の種々の方法で使用される化合物の化学構造は、式（Ｉ）の化合物により、例示される：
【０１４５】
【化２２】
【０１４６】
ここで、Ｘ１およびＸ２は、ＮまたはＣＨラジカルであり得るが、但し、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１個は、Ｎである。もし、Ｘ１およびＸ２の両方がＮなら、この化合物は、以下で示す構造（Ｉａ）を有する置換ピリミジン化合物である。もし、Ｘ１およびＸ２の１個だけがＮであるなら、この化合物は、以下で示す式（Ｉｂ）または（Ｉｃ）の置換ピリジン化合物である。
【０１４７】
【化２３】
【０１４８】
Ｓ１は、有機ラジカルであり、これには、アルキル基または低級アルキル基が挙げられるが、これらに限定されない。この２−ＡＣＰ核には、数回の置換を行うことができ、従って、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４は、別個に、水素、アミノ、ハロゲン、または１個またはそれ以上の有機ラジカルであり得、これは、その用語が本明細書中の他の箇所でさらに定義されているように、以下でさらに述べるように、その中にＮ、Ｏ、Ｓおよびハロゲンヘテロ原子を有する有機ラジカルを含む。Ｓ１がアルキル基であるとき、アルコキシカルボニルアミノラジカル（すなわち、カーバメートラジカル、カルバミン酸のエステル）が得られ、これは、ヘテロ芳香族ピリミジン環またはピリジン環の「２」位置で、その炭素に結合されており、それゆえ、「２−ＡＣＰ」との術語を使用する。しかしながら、この「２−ＡＣＰ」との術語は、必ずしも、可能なＳ１ラジカルの素性または組成をアルキルのみに限定するものではない。
【０１４９】
多くの実施態様では、本発明の方法に関連した２−ＡＣＰ化合物は、以下で示すように、式（ＩＩ）のヘテロ芳香族化合物である：
【０１５０】
【化２４】
【０１５１】
式（ＩＩ）の化合物では、「Ａ」環は、６員芳香族複素環（すなわち、ヘテロアリール）であり、これは、ピリミジン（Ｘ１およびＸ２の両方がＮである）またはピリジン（Ｘ１およびＸ２の一方がＮであり、そして他方がＣＨである）のいずれかである。Ｘ４は、水素、ハロゲン、有機ラジカル（これには、これには、アルキル基またはメチレン基が挙げられるが、これらに限定されない）、酸素原子、イオウ原子、リン原子またはハロゲン原子であり得るが、多くの実施態様では、窒素ベースラジカル（例えば、アミノ、一置換アミノまたは二置換アミノラジカル）である。
【０１５２】
「Ｂ」環の性質は、変えることができる。Ｘ３ラジカルは、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、またはＮＨラジカルであり得る。「Ｂ」環は、芳香族であり得るか、または部分的または完全に飽和であり得る。「Ｂ」環は、図面で示すように、少なくとも１個のＮ原子またはＮＨラジカル、および少なくとも１個のＸ３ラジカルを含有する。このＮ原子とＸ３ラジカルとの架橋は、少なくとも１個の炭素ベースラジカル（これは、少なくとも１個のＲ３置換基および任意のＲ３置換基を有する）であり、その結果、「Ｂ」環は、少なくとも５個の環原子を有する。
【０１５３】
（ＩＩ）の化合物はまた、６員または７員「Ｂ」環を含有し得、これらは、０個、１個または２個の追加「Ｃｎ」架橋炭素ラジカル（すなわち、ｎは、０、１または２であり得る）に対応している。これらのＣｎ架橋した炭素ベースのラジカルは、Ｒ４またはＲ５置換基を有し、必要に応じて、追加Ｒ４またはＲ５置換基を有し得る。もし、ｎ＝０なら、上述のように、追加Ｃｎラジカルは存在せず、そして５員「Ｂ」環が得られる。もし、ｎ＝１なら、「Ｂ」環には、ＣＲ４架橋ラジカルが存在し、これは、必要に応じて、追加Ｒ４置換基を有し得、それは、Ｒ４と同一または異なり得、６員環「Ｂ」環が得られる。もし、ｎ＝２なら、追加ＣＲ５架橋ラジカル（また、必要に応じて、追加Ｒ５置換基）も存在し、７員「Ｂ」環の複素環が形成される。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５置換基は、水素、ハロゲン、酸素（これは、カルボニル基を形成する）、アミノ、ヒドロキシ、または任意の有機ラジカル（この用語は、本明細書中の他の箇所で定義されている）であり得る。Ｒ２は、任意の置換基である。
【０１５４】
式（ＩＩ）の化合物の多くの実施形態では、Ｘ３は、Ｎであり、Ｒ１は、低級アルキル基（例えば、メチルまたはエチル）である；Ｒ２は、アミノ、一置換アミノまたは二置換アミノラジカルであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ３’、Ｒ４’またはＲ５’は、水素である。関連した実施形態では、Ｒ２〜Ｒ５は、フェニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、Ｘ−Ｐｈ、Ｘ−ＰｈＣＨ２、ＨｅｔＡｒＣＨ２、Ｍｅ２ＮＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、ＭｅＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎなどであり得る。Ｃｎ炭素原子の１個が２個の異なるＲｘ基を有する多くの場合、得られる化合物は、キラルである可能性があり得ることに注目すべきである。
【０１５５】
ある実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、芳香族「Ｂ」環を有する。例えば、もし、ｎ＝１であり、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３が、Ｎであるなら、この環は、Ｒ３およびＲ４置換基が存在しないように、芳香族であり、式（ＩＩａ）の「プテリジン」属の化合物が得られる。もし、ｎ＝１であり、そしてＸ１およびＸ２の一方が、ＣＨであるなら、他方は、Ｎてあり、Ｘ３は、Ｎであり、そして「Ｂ」環は、式（ＩＩｂ）および（ＩＩｂ’）の芳香族「デアザ−プテリジン」化合物が得られる。
【０１５６】
【化２５】
【０１５７】
本発明の化合物の一部の実施形態では、Ｒ１が低級アルキル基（メチルまたはエチルを含めて）であることが好ましい。他の実施形態では、細菌の対する活性は、時には、それより大きい有機置換基（例えば、アリール、ヘテロアリールまたはそれより大きいアルキル）を使用することにより、高めることができる。
【０１５８】
一部の実施形態では、Ｒ３およびＲ４は、ベンゼンラジカルである。一部の実施形態では、Ｒ２−Ｘ４ラジカルは、アミノまたは一置換アミノラジカルである。
【０１５９】
式（ＩＩｂ）の数種の例は、以下の表３で示し、これらには、化合物「ＳＲＩ−３０７２」が挙げられ、これは、本発明の方法で使用したとき、特に有効であることが明らかとなっている。
【０１６０】
【化２６】
【０１６１】
ＳＲＩ−３０７２＝［８−（４−ジエチルアミノ−１−メチル−ブチルアミノ）−２，３−ジフェニル−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−６−イル］−カルバミン酸エチルエステル
「Ｂ」環は、以下の式（ＩＩｃ）および（ＩＩｄ）の化合物により示されるように、芳香族である必要はなく、Ｒ３’および／またはＲ４’置換基ラジカルが存在している結果として、部分的または完全に飽和であり得る：
【０１６２】
【化２７】
【０１６３】
還元した非芳香族「Ｂ」環を有するデアザ−プテリジン化合物の具体的な例には、以下で示すような化合物ＳＲＩ−５７１３およびＳＲＩ−２０１５８がある。
【０１６４】
【化２８】
【０１６５】
ＳＲＩ−２０１５８＝［５−アミノ−３−（４−ブチルカルバモイルオキシ−フェニル）−２−メチル−１，２−ジヒドロ−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−７−イル］−カルバミン酸エチルエステル
【０１６６】
【化２９】
【０１６７】
ＳＲＩ−５７１３＝（５−アミノ−３−｛［（４−メトキシ−フェニル）−メチル−アミノ］−メチル｝−１，２−ジヒドロ−ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−７−イル）−カルバミン酸エチルエステル
芳香族「Ｂ」環を有する他の属の化合物では、もし、ｎ＝０であり、Ｘ１が、ＣＨであり、Ｘ２が、Ｎであり、そしてＸ３が、ＮＨなら、式（ＩＩｅ）を有する２−カーバメート置換プリン属の化合物が得られる：
【０１６８】
【化３０】
【０１６９】
さらに他の属の化合物では、もし、ｎ＝２であり、そしてＸ３が、ＮＨであるなら、式（ＩＩｆ）を有する２−置換ジアゼピン属の化合物が得られる：
【０１７０】
【化３１】
【０１７１】
本発明の方法の一部の実施形態では、以下で示す属のジアゼピン化合物（ＩＩｇ）は、特に重要である：
【０１７２】
【化３２】
【０１７３】
上記属に由来の特定のピリド−ジアゼピン化合物であるＳＲＩ−７６１４は、本発明の方法で重要であることが発見されている。
【０１７４】
【化３３】
【０１７５】
ＳＲＩ−７６１４＝（１−アミノ−８−フェニル−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−２，５，９−トリアザ−ベンゾシクロヘプタン−３−イル）−カルバミン酸エチルエステル
式（Ｉ）の２−ＡＣＰ化合物のさらに他の実施形態では、化合物は、「Ｂ」環を全く有しない。このような式（ＩＩＩ）を有する単環式化合物の亜属は、以下で示す。
【０１７６】
【化３４】
【０１７７】
式（ＩＩＩ）の化合物に関連した本発明の種々の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物についてこの上で記述した意味のいずれかを有し得る。これらの実施形態では、Ｃｎは、水素、または本明細書中の他の箇所で定義した任意の有機ラジカルであり得る。表３で示したこの属の種には、ＳＲＩ−７４０５があり、その構造は、以下で示す；
【０１７８】
【化３５】
【０１７９】
ＳＲＩ−７４０５＝［５，６−ジアミノ−４−（２−ヒドロキシ−１−メチル−３−フェノキシ−プロピルアミノ）−ピリジン−２−イル］−カルバミン酸エチルエステル
本発明の化合物の例には、以下の表３で示した化合物が挙げられるが、これらに限定されず、これらの化合物には、ＳＲＩ−７４０５、ＳＲＩ−３０７２、ＳＲＩ−７６１４、ＳＲＩ−７４６２、４４２７−０２６−１５、４４２７−１４３、ＣＡＯ−０４０、３４９１−２３および３３０２−８９Ｆ、ＳＲＩ−５７１３、およびＳＲＩ−２０１５８が挙げられる。追加例は、表８にある。
【０１８０】
（表３：２−ＡＣＰ化合物の抗菌活性）
【０１８１】
【表３−１】
【０１８２】
【表３−２】
【０１８３】
【表３−３】
【０１８４】
【表３−４】
【０１８５】
（ＰＩ＝１２．５％μｇ／ｍｌでの成長阻害％）。
【０１８６】
（化合物の構造活性関係）
上記開示は、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３での一定範囲の置換およびＲ１〜Ｒ５基での複数の置換基を想定している。理論および実験に基づいた関係のいずれかに束縛されることを望まないものの、予備的には、式（Ｉ）の化合物の置換パターンと、本発明の方法の少なくとも一部で認められる活性との間には、特定の実験に基づいた関係が認められている。
【０１８７】
例えば、式（ＩＩ）（式（ＩＩａ）および式（ＩＩｂ）を含めて）の芳香族化合物（ここで、Ｃｎ＝１であり、そしてＲ３およびＲ４は、両方とも、比較的に大きくかつ立体的に嵩張った基（例えば、フェニル基）である）の場合、これらのフェニル基の互いの相互作用は、そのプテリジン構造の芳香族性を弱め、そして側鎖基（この場合、フェニル基）を芳香環構造の平面から伸長させることができる。これにより、Ｒ３およびＲ４のフェニル基の１個がＦｔｓＺの活性部位で相互作用できる立体配座が生じ得る。
【０１８８】
式（ＩＩｆ）の化合物（ここで、Ｃｎ＝２である）の場合、その７員環は、平面ではなく、Ｒ３〜Ｒ５の側鎖基をそれらがＦｔｓＺの活性部位と相互作用し得る位置に置く。これらの化合物の作用の他の機構が存在し得、出願人は、他の作用機構を本開示の範囲からはずすつもりはない。
【０１８９】
上述の置換パターンにより、これらの化合物は、チューブリン阻害よりもＦｔｓＺ阻害に対して選択的にされる。表４は、代表的な種類として３−デアザプテリジンを使用するＦｔｓＺの選択的阻害に関する化合物の間の一般的な構造活性関係を要約している。他の化合物（ピリドジアゼピン化合物を含めて）の類似の構造−活性関係は、予想され得る。
【０１９０】
（表４：２−ＡＣＰ化合物の構造−活性関係）
【０１９１】
【表４】
【０１９２】
表４の化合物の命名法および／または置換基標識化は、上で示した式（ＩＩａ〜ｇ）の化合物に付けたものとは異なるが、しかしながら、式（ＩＩａ〜ｇ）の構造における同様の位置での置換基は、同等であり得ることが認められる。
【０１９３】
例えば、表４で示した領域Ｄで置換された化合物は、著しい抗結核活性を維持できる（表３、エントリー２、４、６および８を参照）。典型的な抗癌剤である７，８−ジヒドロ−１−デアザプテリジンにおけるこの「Ｄ」位置での置換は、チューブリンの結合および抗癌活性を大きく減少させるかなくす。実際、ＳＲＩ−３０７２（表３、エントリー２）は、ＦｔｓＺ重合およびＧＴＰ加水分解における阻害剤として良好な活性を有するが（表５）、１００μＭでウシチューブリンの重合に対する効果はない。明らかに、これらの化合物間での領域Ｄにおける可変性（表６）は、それらの化合物の選択性および活性に影響を与える。
【０１９４】
領域Ａでは、抗癌活性に最適なＲ１基は、メチル基またはエチル基である；それらより大きいアルキル基は、チューブリン結合活性を大きく削減し得る。対照的に、それらより大きいＲ１アルキル基（例えば、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ベンジル）を有する種々の化合物は、著しい抗菌活性を示し（１２．５μｇ／ｍＬでの細菌成長の＞９５％の阻止）、このことは、これらの化合物がまた、ＦｔｓＺ重合も阻害できることを示唆している。それゆえ、領域ＡのＲ１基における変化もまた、これらの化合物の選択性および活性に影響を与え得る。
【０１９５】
領域ＢおよびＣでは、そのカーバメート（領域Ｃ）は、このデアザプテリジン環系の２位置でのＨＮ−官能基（領域Ｂ）と同様に、最適な抗新生物活性に絶対的に必要である。対照的に、このカーバメートを有しない３−デアザプテリジン類の化合物は、著しい抗菌活性を維持できる（表３の４４２７−１４３を参照）。従って、この領域での変化もまた、これらの２−ＡＣＰ化合物の選択性および活性に影響を与え得る。
【０１９６】
領域Ｇ（これは、小領域ＥおよびＦから構成される）は、この１−デアザ−７，８−ジヒドロプテリジンのチューブリン結合および抗癌活性の重要な決定因子である。領域Ｅ（１−デアザプテリジン環の８位置）では、そのヘテロ原子置換は、ＮＨでなければならず、そうでなければ、活性が失われる。対照的に、Ｏ−およびＳ−の両方で置換した化合物（例えば、化合物ＣＡＯ−０４０、表３のエントリー７）は、著しい抗菌活性を保持すると思われる。領域ＥでのＳＡＲプロフィールのこの変化は、他の重要な点に相当し、この場合、他のヘテロ原子での置換は、抗菌活性およびＦｔｓＺ阻害に対する選択性を押し進め得る。
【０１９７】
さらに、このピリドピリダジンまたは１−デアザ−７，８−ジヒドロプテリジン環系の「Ｂ」環の還元形状は、最適な抗新生物活性に絶対的に必要である。完全に芳香族性の「Ｂ」環系を有する化合物（例えば、ＳＲＩ−３０７２）なら、表６で示すように、チューブリンを阻害するとは予想されない。最後に、これらの２−ＡＣＰ化合物の領域Ｆにおける置換は、活性および選択性に決定的に影響を与え得る。一般に、Ｒ３およびＲ４には、小さい基が最適である（典型的には、チューブリン結合および抗新生物活性には、Ｈ−またはＭｅ−置換）。より大きい基（例えば、ＳＲＩ−３０７２における７−フェニル置換）は、チューブリン結合および抗新生物活性には許容されない。それにもかかわらず、ＳＲＩ−３０７２のような化合物は、著しい抗菌活性を示し、それらのＳＡＲは、哺乳動物のチューブリン重合を阻止する化合物とは異なる。さらに、これらの化合物のいくつか（例えば、ＳＲＩ−３０７２）は、印象的な選択性指数を有する。
【０１９８】
さらに、本発明の化合物の分子量が約５００グラム／モル未満、好ましくは、約４５０または４００グラム／モル未満であるとき、しばしば、改良された生体活性が得られることが発見されている。
【０１９９】
（代表的な化合物の合成）
合成的には、式（Ｉ）、（ＩＩａ〜ｇ）および（ＩＩＩ）の化合物の多くは、２つの重要な中間体のうちの１つによりアクセス可能であり、それらの構造は、以下で示す。
【０２００】
【化３６】
【０２０１】
式（Ｉｂ）および式（Ｉｃ）の多くのピリド２−ＡＣＰ化合物に適当な出発物質は、構造３を有し、これらはまた、図６で示され、そして当該技術分野で概説された方法（Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３１：１８９０−１８９４，１９６６；Ｔｅｍｐｌｅら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３０：１７４６−１７５１，１９８７；Ｌｉｓｔｅｒ，Ｊ．Ｈ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｒｏｍ Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ＩＩ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；（Ｔａｙｌｏｒ，Ｅ．Ｃ．；著），１９９６，ｐａｓ ２１− ５９；Ｂａｒｒｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．，５９：２２１ −２３１，２０００；Ｓｈｏｒｔｎａｃｙ，Ａ．Ｔ．ら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，８（５＆６）：９１１−９１３，１９９６）により、ケリダミン酸（ｃｈｅｌｉｄａｍｉｃ ａｃｉｄ）（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｕ．Ｓ．Ａ．）から、１４％の全収率で、８工程で入手できる。これらの参考文献の内容は、これらの方法について、本明細書中でその全体が援用されている。この調製は、大量の化合物３を得るために、規模が拡大されている。式（Ｉａ）のピリミジン化合物の調製に必要な同様に重要な出発化合物１１の調製は、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４６：５４０５−５４０７（１９８１）（その内容は、これらの方法について、本明細書中でその全体が援用されている））で開示されているように、高収率で、ずっと安価な出発物質から、ずっと容易である（図６を参照）。
【０２０２】
図６で示すように、式１の３−デアザプテリジン化合物（例えば、ＳＲＩ−３０７２）は、化合物３の４−クロロ基を置換第一級または第二級アミンで置き換えて化合物４を形成し、続いて、化学量論的な水素化物源（例えば、ＮａＢＨ４）との種々の公知反応のいずれかまたは種々の触媒による触媒水素化によって５−ニトロ基を選択的に還元してオルトジアミン化合物５を形成することにより、容易に得ることができ、これは、１，２−ジケトンまたはベンジル誘導体（Ｇａｂｒｉｅｌ Ｃｏｌｍａｎ型の調製）と縮合でき、最終標的クラス１が得られる（Ｆｒｙｅｒ，Ｒ．Ｉ．；ら、Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；（Ｔａｙｌｏｒ，Ｅ．Ｃ．；編），ｐｇｓ ２０９−４２０，１９９１；Ｈａｄｄａｄ，Ｍ．ら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．３８（３４），５９８１−５９８４，１９９７；Ｅｎｇｌｉｓｈ，Ｊ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７８，４０５７−４０６０，１９５６；Ｈｏｒｎｅｒ，Ｊ．Ｋ Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１０，３８７−３９１，１９６７；Ｓｔｏｉｌｏｖａ，Ｖ．ら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１０５−１０６，１９９７）。この反応は、同じＲ３およびＲ４ラジカルを有する対称化合物を調製するのに非常に有用であり、種々の適当なジケトンが利用可能である（Ｍａｔｙｕｓ，ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７，１０７−１１４，１９９７；Ｃｕｒｒａｎ，Ｄ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０４，４０２４−４０２６，１９８２；Ｍｕｋａｉｙａｍａ，Ｔ．Ｐｕｒｅ ＆ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５５（１１），１７４９−１７５８，１９８３ Ｍｕｋａｉｙａｍａ，Ｔ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９６：２４，７５０３−７５０９，１９７４；Ｌｅ Ｒｏｕｘ，Ｃ．；Ｇａｓｐａｒｄら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８，１８３５−１８３９，１９９３；Ｋｕｗａｊｉｍａ，Ｉ．ら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２１，１８１７−１８２０，１９７６；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９，３５９０−３５９６，１９９４；Ｏｉｓｈｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０，８２７１−８２７２，１９９８；Ｎｏｙｏｒｉ，Ｒ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３，２１０６−２１０８，１９８１）。この反応手順で非対称ケトンを使用するとき、Ｒ３およびＲ４での異性体の混合物が得られ得る。得られる生成物の割合は、これらのケトンの反応性の差だけでなく、そのジアミンの反応性（その環窒素に対してメタ位置であるニトロ基の還元により誘導されるアミンは、最も反応性が高い）により、制御できる。ある場合には、容易に分離可能な混合物が調製された。
【０２０３】
時には、Ｒ３およびＲ４に関して明確なレギオ化学作用を与える反応が利用できる。例えば、プテリジンのＴｉｍｍｉｓ型調製では、容易に入手できるハロカルボニル化合物は、レギオ特異的に反応でき、７，８−ジヒドロデアザプテリジンが得られ、これは、容易に空気酸化でき、完全な芳香族系が得られる。この状況には、５，６−ジアミノ−ピリミジンの興味深い有用な反応もまた適用できる（Ｂｏｄｎａｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：４７３７−４７４５，１９９７）。この反応では、反応性がより高い５−アミノ基が、まず、アルデヒドと反応され、続いて、その６−アミノ基がオルトエステルと反応される。加熱すると、閉環が開始し、６，７−二置換プテリジンが得られる。この状況は、反応性が高いメタアミノ基が反応性イミンを形成できること、また、閉環が残りの６−アミノ基とオルトエステルとの反応および加熱により実行できること以外は、類似している。他の代替物（例えば、ヒドロキシおよびアミノケトン）もまた、有用であることが証明できる（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５０（２），３３５−３４６，１９９４；Ｍａｒｋｓ，Ｍ．Ｊ．；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４７：５２−５６，１９８２；Ｓｔｅｒｇｉａｄｅｓ，Ｉ．Ａ．；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，７５４７−７５５１，１９９９；Ｂｒｏｗｎ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．；４０，７８７５−７８７７，１９９９；Ｋｏｋｕｂｏ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２，４５６４−４５６５，１９９７；Ｍｏｒｉｈａｔａ，Ｋ．ら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．６（３１），５５５５−５５５８，１９９５；Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｄ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３６：２８１８−２８２３，１９７１；Ｔｅｍｐｌｅ，Ｃ．，Ｊｒ．ら、Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．７：４５１−４５４，１９７０）。この１−デアザプテリジン環系では、レギオ化学作用が容易に制御できること、完全に芳香族性の６，７−二置換デアザプテリジンが重要であり得ることに注目すべきである。最後に、適当に置換した３−デアザプテリジンを得るために、ピリドジアゼピン標的（２）について述べたものと類似のいくつかの代替的なアプローチが使用できる。
【０２０４】
式（ＩＩｆ）の二環式ジアゼピン（例えば、図７で示した化合物２）は、典型的には、ｏ−アリーレンジアミンを、α，β−不飽和アルデヒド、α，β−不飽和ケトン、β−ハロケトン、β−アミノケトンまたはβ−ヒドロキシケトンと反応させるこことにより、調製される。もし、このジアミンまたはカルボニル官能基のいずれかが非対称であるなら、混合物が生じ得る。これらのピリドジアゼピンの場合、レギオ選択性は、３の反応性の４−クロロ基と３−アミノプロパノールとを反応させることにより、制御できる（Ｔｅｍｐｌｅら、Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．７：４５１−４５４，１９７０）。広範囲の置換３−アミノプロパノールが合成的に利用可能である（Ｔｅｍｐｌｅ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．７：１１９５−１２０２，１９７０；Ｔｅｍｐｌｅ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：８５３−８５７，１９７０；Ｗａｒｉｎｇ，Ａ．Ｊ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．（Ｓｔｏｄｄａｒｔ，Ｊ．Ｒ．；Ｅｄ．），Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ｐｇｓ．１０１７−１０９５；１９７９；Ｂｕｌｍａｎ−Ｐａｇｅ，Ｐ．Ｃ．ら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．４８（３５）：７２６５−７２７４，１９９２；Ｏｌａｈ，Ｇ．Ａ．ら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１１７７−１１７９，１９９１）。例えば、多様な３−アミノプロパノールは、３−ヒドロキシケトンを還元的にアミノ化することにより調製でき、これらのケトンは、順に、典型的には、Ｍｕｋａｉｙａｍａ−Ａｌｄｏｌ反応だけでなく、他の方法により、調製される（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔｅｒｓ３４（２３）：３６８３−３６８６，１９９３；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．；ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４８：１９０９−１９１２，１９８３；Ｓｈｉ，Ｚ．ら、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１１（９），７５７−７６０，２０００；Ｊｉａｎｇ，Ｊ．−Ｌ．ら、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２８（２），４１３７−４１４２，１９９８；Ｋａｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．ら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．３８（３８），６７１７−６７２０，１９９７；Ｖｅｒｌｈａｃ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２６（４９）：６０７５−６０７８，１９８５；Ｙｏｎｅｄａ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｉ，１３３６−１３３９；Ｔｅｍｐｌｅ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３４：３１７６−３１８１，１９８１；Ｓｅｙｆｅｒｔｈ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４８：１１４４−１１４６，１９４８．）。
【０２０５】
図８で示すように、この３−アミノプロパノールのアミノ基は、化合物３の芳香環の塩化物置換基を置き換えて化合物６が得られるように反応できる。化合物６と類似の他の化合物は、化合物３のアミノ基を種々の有機および無機求電子試薬（例えば、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アシル、エポキシドなど）と反応させることにより、調製できる。化合物６およびその類似物のニトロ基は、還元でき、アミン化合物６’が得られる。化合物６’およびその類似物は、上で開示した式（ＩＩＩ）を有する化合物の属の構成要素である。
【０２０６】
化合物６の水酸基の酸化により、ニトロ−ケトン７が得られ、その芳香環の５−ニトロ基を還元カップリングに続いて内部環化すると、このジアゼピン環が形成される。強力な化合物であるＳＲＩ−７６１４は、構造８（Ｒ１＝Ｅｔ、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６＝Ｈ）を有するジアゼピン化合物の属の良好な例である。この反応スキームにより、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６で著しい多様性を有する種々の化合物を調製することが可能となる。位置Ｒ４、Ｒ５およびＲ６での変化は、この３−デアザプテリジン環系（これらは、生体活性および選択性に著しい影響があると思われる）での類似の効果の点から、生体活性に影響を及ぼし得、これらの３−デアザプテリジンの類似のアミノ基での置換もまた、生体活性および選択性を著しく変え得る（ＳＲＩ−３０７２および４４２７−０２６−１５）。
【０２０７】
図８で示した化合物８に至る反応では、このピリジン環の４−アミノ基での変化が容易にでき得ない。このアミノ基での置換を変えるために、ジアゾ化を介する化合物８のアミノ基の加水分解に続いて得られた水酸基のクロロ脱水酸化により、化合物１０のクロロ基が得られ、これは、次いで、この位置での多様性を得るために、種々のアミンで置き換えることができる。ピリジンでのクロロ基は、典型的には、電子供与性官能基で置換されている。求核性が低いアミンは、苛酷な条件が必要であり得る。この位置での一部の多様性は、８でジアゼピン環系を作成するように進める前に、３の初期還元アミノ化により、誘導できる。興味深いことに、構造８の種々のアミンでの還元アミノ化もまた使用できるが、還元し過ぎたテトラヒドロジアゼピンが得られる。
【０２０８】
この４−クロロ基の存在下にて、この６−クロロを選択的に置き換えることにより、８〜１０により例示した一連の反応を介して、図８（３）の６−アミノ基を６−クロロ基に変えることも可能であり得る。最後に、重要な６−アミノ基で多様性を生じる代替経路として、Ｔｅｍｐｌｅら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１７４６−１７５１，１９８７）で詳述された一連の反応に従って、他のピリジンカルボン酸、シトラジン酸で開始することが可能であり得る。シトラジン酸からピリドジアゼピン系を形成する一連の工程は、完全に酸化した１，５−ジアゼピン、または２，３−ジヒドロ−またはテトラヒドロ−１，５−ジアゼピンを生成するのに使用できる。ＳＲＩ−７６１４は、２，３−ジヒドロジアゼピンである。
【０２０９】
式（Ｉａ）のピリミジン化合物もまた、合成できる。第一に、類似の重要な中間体の調製は、ずっと安価な出発物質から、ずっと容易である（図８の３と１１とを比較して）（Ｋｕｅｂｒｉｃｋら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９３：１２１４−１２２０，１９７１）。これらのアザ類似物の少数は、出願人の機関で調製し、そしてチューブリンに対する活性についてスクリーンした。これらのピリミジン類似物は、対応するデアザ類似物よりもずっと毒性が低く、活性および毒性の点で、これらのピリドジアゼピンと同様に作用することが発見された（図８の構造２）。
【０２１０】
１で表わされる化合物の調製は、上で概説したアプローチと直接類似している。２のアザ類似物の調製には、このジクロロ類似物を窒化して１個のクロロ基を３−アミノプロパノール類似物で置き換えることが必要であり得る。残りのクロロ基は、置換アミンで置き換えることができるか、または一組の反応は、このジアゼピンの閉環を生じ得、続いて、そのクロロ基を種々のアミンで置き換える。
【０２１１】
薬学および合成有機化学の当業者が理解するように、本発明の化合物の殆どまたは全部は、塩基性窒素原子を含有し、それにより、これらの化合物は、極性有機担体または水性担体に容易に溶解できる所望の塩を形成するために、これらの窒素含有化合物を酸（例えば、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、乳酸、コハク酸など）と反応させることにより、それらの化合物の塩（薬学的に受容可能な塩を含めて）を容易に調製するのに適当にする。
【０２１２】
合成有機化学の当業者が理解するように、本明細書中で使用する種々の合成戦略、有機反応および／または官能基の変換は、上で明白に記述したもの以外の多数の戦略、反応または手順により、実行できる。本明細書中で開示した化合物に至る合成工程に利用できる他の合成手順の参照は、例えば、Ｍａｒｃｈ，Ｊ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４版、Ｗｅｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）；またはＬａｒｏｃｋ，Ｒ．Ｃ．，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．（１９８９）で見られ、両方の内容は、本明細書中で参考として援用されている。
【０２１３】
（細菌）
本発明の方法によって標的化された細菌は、グラム陽性菌またはグラム陰性菌であり得る。グラム陽性菌は、以下からなる群から選択され得る：
【０２１４】
【化３７】
【０２１５】
。
【０２１６】
グラム陰性菌は、以下からなる群から選択され得る：
【０２１７】
【化３８】
【０２１８】
。
【０２１９】
グラム陽性菌およびグラム陰性菌の上記の例は、限定を意図せず、全てのグラム陽性菌およびグラム陰性菌、ならびに非グラム試験反応性細菌（ｎｏｎ−ｇｒａｍ ｔｅｓｔ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）を含むより大きな集団の代表例であることを意図する。細菌の他の種の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
【０２２０】
【化３９】
【０２２１】
。
【０２２２】
（浸透性賦活薬）
１つの実施形態において、化合物は、改変されるか、または、他の薬剤と合わせられ、標的細菌の浸透性を促進する。賦活化された浸透性を可能にするプロドラッグが設計され得る。化合物は、必要に応じて、浸透性賦活薬と連結され得、ここで、浸透性賦活薬は、化合物が細菌の細胞壁を通過することを可能にする。「連結される」とは、式（Ｉ）の化合物と化学的に結合もしくは結合体化されるか、または、式（Ｉ）の化合物の部分の一部となることを意味する。浸透性賦活薬は、例えば、式（Ｉ）の化合物のＳ１、Ｓ２、Ｓ３またはＳ４ラジカルのうちの１つに化学的に連結され得る。グラム陰性細菌の場合、細胞エンベロープの主要な成分は、リポ多糖（ＬＰＳ）である。あるいは、本発明の化合物と浸透性賦活薬とを含む組成物が使用され得る。ＬＰＳの表面層は、グラム陰性細菌のいくつかの株において、いくつかの複素環化合物に対する浸透性バリアとして機能し得る。しかし、これらの化合物に対して浸透性バリアを有さないグラム陰性細菌の株が存在する。例としては、深部ラフ変異（ｒｆａ）を含む細菌の株（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ（Ａｌｌｅｎら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０（１）：３５−４０，１９９８））が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２２３】
「浸透性賦活薬」は、本発明の化合物の、細菌の細胞エンベロープを通る通過を増強し得る任意の物質または化合物として定義される。浸透性は、賦活前の細胞またはコントロールと比較して、１％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、２倍以上、１０倍以上、１００倍以上または１０００倍以上の細胞の浸透性により増強され得る。１つの実施形態において、浸透性のレベルは、浸透性賦活薬への曝露後に、細菌集団のＭＩＣを測定することによって試験され得る。
【０２２４】
浸透性賦活薬の例としては、ポリミキシンＢ、カチオン性ステロイド抗生物質、表面活性剤、デフェンシン、他の膜活性ペプチド（Ｅｖａｎｓら、Ｖｅｔ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ ２４（４）：１０９−１１６，１９９５）およびキレート剤（Ｓｕｌｉｎｇら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．８：３３４−３４３，１９７５）が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書中に規定されるような、式（Ｉ）の化合物のプロドラッグ形態のいくつか（例えば、プロドラッグの膜活性ペプチド型）が、浸透性賦活薬として機能し得る。ポリミキシンＢは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａから単離された、天然に存在する環状ドカペプチドである（Ｔｓｕｂｅｒｙら、Ｍｏｌ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６２（５）：１０３６−４２，２００２）。カチオン性ステロイド抗体は、細胞エンベロープに選択的に作用して、エンベロープの浸透性を高める（Ｑｕｎｙｉｎｇ Ｇｕａｎら、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２：２８３７−２８４０，２０００；Ｃｈｕｎｈｏｎｇ Ｌｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：２９６１−２９６２，１９９７）。
【０２２５】
１つの実施形態に置いて、浸透性賦活薬は、本発明の化合物と連結されることなく、本発明の化合物と共に使用される。
【０２２６】
以下の実施例は、本明細書中で特許請求される化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法が、いかにして作製され、評価されるかについての完全な開示および説明を、当業者に提供するために示され、本発明の純粋な例示として意図され、発明者らが発明者らの発明としてみなす範囲を制限することは意図されない。数（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証するための努力がなされたが、いくつかの誤りおよび逸脱が考慮されるべきである。他に示されない限り、部は重量部であり、温度は摂氏（℃）であるか、または、大気温度であり、そして、圧力は大気圧であるか、または、大気圧付近である。
【実施例】
【０２２７】
（実施例１）
（抗結核アッセイ）
ほとんどの抗結核アッセイを、ＢＡＣＴＥＣ ４６０ラジオメトリックシステムを使用して、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ（ＡＴＣＣ ２７２９４；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に対して、ＮＩＨ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ａｎｔｉ−ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＴＡＡＣＦ）のスクリーニング設備により実施し、最低限の抑制性濃度（ＭＩＣ９９）を決定した。リファンピンがポジティブコントロールであった。ＭＩＣ９９はまた、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、カナマイシン、ピラジナミド、チアセタゾンまたはシクロセリンに耐性であるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株に対して、ＳＲＩ−７６１４およびＳＲＩ−３０７２についても決定した（表５）。ＭＩＣ９９の決定と同時に、化合物を、Ｖｅｒｏ細胞において、細胞毒性（ＩＣ５０）について試験した。７２時間の曝露の後、生存率を、Ｐｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎアッセイを使用して、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（ＭＴＳ）のホルマザン生成物への細胞内変換に基づいて評価した。化合物の選択性の指標（ＳＩ）を、ＩＣ５０：ＭＩＣ９９の比として定義する。
【０２２８】
（表５：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの単剤耐性株に対するＳＲＩ７６１４およびＳＲＩ−３０７２の活性）
【０２２９】
【表５】
【０２３０】
ＷＴ＝野生型（Ｈ３７Ｒｖ）、ＩＮＨ−Ｒ＝イソニアジド耐性、ＲＭＰ−Ｒ＝リファンピン耐性、ＥＭＢ−Ｒ＝エタンブトール耐性、ＫＭ−Ｒ＝カナマイシン耐性、ＰＺＡ−Ｒ＝ピラジナミド耐性、ＴＡＣ−Ｒ＝チアセタゾン耐性、ＣＳ−Ｒ＝シクロセリン耐性。
【０２３１】
（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７ＲａについてのＳＲＩ−３０７２のＭＩＣ／ＭＢＣ）
ＳＲＩ−３０７２のＭＩＣを、他の場所（Ｓｕｌｉｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４２，８１１−８１５，１９９８；Ｓｕｌｉｎｇら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４４，２７８４−２７９３，２０００）に記載されるように、比色（アラマーブルー）微量希釈ブロスアッセイを使用して、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒａ（ＡＴＣＣ ２５１７７）について決定した。化合物をＤＭＳＯに溶解し、ＡＤＣ富化し、０．２％グリセロールを補充した７Ｈ９ブロス（アッセイ培地）中に２倍増分で段階希釈した。各希釈におけるＤＭＳＯの最終量は、１．３％であった。ＳＲＩ−３０７２を、４連でアッセイした。培地、薬物および生存率コントロールをこのアッセイに組み込んだ。エタンブトールは、ポジティブコントロールであり、２μｇ／ｍｌのＭＩＣを有した。ＳＲＩ−３０７２の殺菌活性を、インキュベーションの６日後に、プレートにレドックス色素を添加する直前に決定した。この時点で、プレートを視覚的に試験した。可視的な増殖が見られない各ウェルを、マイクロピペッターで注意深く液体を出し入れすることによって混合し、７Ｈ１１寒天上に播いた（１０μＬ）。プレートを３６〜３７℃にて、ポリエチレンバッグ中で２１日間インキュベートし、解剖顕微鏡での補助によりコロニーを計数した。計数を最初の種菌の計数と比較し、生存百分率および生存のｌｏｇ１０減少を算出した。ＭＢＣを、２−ｌｏｇ１０±ＳＤ（Ｎ＝４）によりｃｆｕを減少した最低薬物濃度として定義した。
【０２３２】
（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染したマクロファージにおけるＳＲＩ−３０７２の活性）
ＳＲＩ−３０７２を、以前に記載されたように（Ｋｅｌｌｙら、Ａｎｔｉ．Ａｇｅｎｔｓ＆Ｃｈｅｍｏ．４４：２７８４−２７９３，１９９４）、マウス骨髄マクロファージの単層において、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｅｒｄｍａｎ（ＡＴＣＣ３５８０１）に対する活性についてＴＡＡＣＦによるＭＩＣ（０．２μｇ／ｍｌ）の０．２５倍、１倍、４倍および１６倍においてアッセイした。活性を、薬物を含まないコントロールと比較して、７日後のｃｆｕにおいて、９０％の減少を得る最低薬物濃度（ＥＣ９０）および９９％の減少を得る最低薬物濃度（ＥＣ９９）として報告した。毒性を、視覚的な検査により決定した。
【０２３３】
（実施例２）
（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからのＦｔｓＺの精製および特徴づけ）
ＦｔｓＺの精製を、以前に記載されたように行った（Ｗｈｉｔｅら、Ｊ．Ｂａｃｔ．１８２：４０２８−４０３４，２０００）。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺをコードする配列を、ｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｃｏＩ部位にサブクローニングした。このプラスミドｐＪＤ１６９を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳを形質転換した。細胞を、３２℃にて、０．４％グルコースを含有するＬＢ培地中で１時間インキュベートした。５００μｌの形質転換細胞を、０．４％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する２５０ｍｌの新しいＬＢ培地に添加し、３２℃にて一晩インキュベートした。これらの細胞を、室温で遠心分離によってペレット状にした。これらの細胞を、０．２％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する、４リットルの予め温めておいたＬＢ培地中に再懸濁し；培養物を、３２℃にて、良好に通気しながら振盪した。培養物が、約０．４のＡ６００に達したときに、１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシドを用いてＦｔｓＺの発現を誘導した。３時間後に細胞を回収し、急速に冷蔵（８〜１０℃）し、遠心分離し、氷冷リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、再びペレット状にし、そして、−８０℃にて保存した。
【０２３４】
以下の手順を４℃にて実施した。１リットルのＥ．ｃｏｌｉ培養物からの凍結した細胞ペレットを、３０ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．８）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＰＭＳＦ、４μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、４μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭベンズアミジン、および２０μｇ／ｍｌダイズトリプシンインヒビター）中に再懸濁し、短時間超音波処理して、ゴム様ペレットをなくした。細胞懸濁物を３０分間、１ｍｇのＤＮＡｓｅで消化し、次いで、１５，０００〜２０，０００ｌｂ／ｉｎ２にてＦｒｅｎｃｈプレスを２回通過させることによって抽出した。この溶液を２７，０００ｇにて２０分間の遠心分離により浄化し、次いで、１０ｍＭイミダゾール、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ ７．８）で平衡化したＮｉ２＋−アガロースカートリッジ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライした。カラムを１００ｍＭイミダゾールを含有する平衡緩衝液（１５ｍｌ）で洗浄した。組み換え型ＦｔｓＺを、２５０ｍＭイミダゾールを含有する平衡緩衝液（５ｍｌ）で溶出した。溶出液を、即座に、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ ７．２）、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴおよび１０％グリセロールで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（ＰＤ−１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通した。ＦｔｓＺ １ｍｌあたり０．５単位のトロンビン（Ｓｉｇｍａ）で氷上にて２時間消化することにより、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグを取り除いた。サンプルを、脱塩緩衝液で平衡化したベンズアミジン−アガロースカラム（Ｓｉｇｍａ、流速約１ｍｌ／分）を通過させることによりトロンビンを除去した。ＦｔｓＺを、安定なポリマーを得る条件（すなわち、塩なし、１ｍＭ ＧＴＰ）の下で重合し、１００，０００ｇにて遠心分離して、ポリマーを沈殿させ、ペレットを、１５０ｍＭ ＫＣｌを含有する緩衝液中に再懸濁することによって脱重合し、最後に高速にて２回遠心分離して、いかなる凝集物も除去した。プロテアーゼインヒビター（２ｍＭ １，１０−フェナントロリン、２０μｇ／ｍｌダイズトリプシンインヒビター、４μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、１０μｇ／ｍｌ ＡＰＭＳＦ、５０μｇ／ｍｌアプロチニン、２ｍＭ ＰＭＳＦ、４μｇ／ｍｌロイペプチン、４０μｇ／ｍｌ ＴＬＣＫおよび１ｍＭベンズアミジン）を、プールした画分に添加した。サンプルを、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ ７．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴおよび１０％グリセロールで平衡化したゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００調製用グレード）にアプライした。吸光度を２８０ｎｍにてモニタリングした。プロテアーゼカクテルを、プールした画分に添加した。２０ｍｇ／ｍｌまで濃縮（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＢｉｏＭａｘ １５−１０００）した後、サンプルを２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ ７．２）、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０％グリセロールに対して透析した。プロテアーゼカクテルを、３回添加し、タンパク質を−８０℃にて保存した。
【０２３５】
９５，５００ダルトンの分子量に対応する単一のピークで、大半のＦｔｓＺがカラムから溶出した。このピークからの画分をプールし、濃縮し、１０％グリセロールを含有する緩衝液に対して透析し、そして、等分して−８０℃にて保存した。これらの条件下で、タンパク質は数ヶ月間安定であった。全てのＥ．ｃｏｌｉ培養物からの代表的な収量は、３０ｍｇのＦｔｓＺであった。
【０２３６】
１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定したＦｔｓＺの分子量は、４５，７００ダルトンであった。質量分光測定分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、これが正しい質量（実測値、３９，０６４．３０；理論値、３９，０３６．４５；質量は、トロンビン消化後に残るＮ末端のＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓを含む）を有したことを確認した。Ｎ末端の配列決定は、ＧＳＨＭＴＰＰＨＮＹの除かれた配列を確認した。ＦｔｓＺを、約２，０００，０００Ｄａ（空隙容量）から９５，５００Ｄａ（主要なピーク）までの分子量の減少した一連の凝集物としてゲル濾過カラムから溶出した。サブユニットの分子量が３９，０３６Ｄａなので、９５，０００Ｄａのピークは、おそらくＦｔｓＺの二量体である。類似の状態（ヌクレオチドもＭｇ２＋もなし）下で、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺは、分析用超遠心分離および化学的架橋により、約７０％が二量体、１５％が三量体、そして、１５％が単量体の混合物として存在することを示した。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＦｔｓＺがまた、オリゴマーとして存在すると報告されている。
【０２３７】
精製したＦｔｓＺ（５μＭ）がＧＴＰａｓｅ活性を有し、１時間あたり、ＦｔｓＺ １ｍｇあたり６．９ｎｍｏｌのＧＴＰをＧＤＰに変換した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺとは異なり、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺを加熱しても、ＧＴＰａｓｅ活性は増加しなかった。ＧＤＰは、ＧＤＰ／モルＦｔｓＺが１：１のモル比（Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺについて見られる比とおよそ同じ比）で結合した。ＧＤＰａｓｅ活性は協調性であるため、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺの刊行された比活性と６．９ｎｍｏｌ／ｍｇ／ｈｒというＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺについての本発明者らの比活性との間で直接比較することは困難である。しかし、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺ（３０μｍｏｌ／ｍｇ／ｈｒのＶｍａｘを有すると報告されている）よりもかなりゆっくりとした速度でＧＴＰを加水分解することが明らかである。
【０２３８】
（実施例３）
（ＦｔｓＺ重合についての光散乱アッセイ）
精製したＦｔｓＺの重合および脱重合の後に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺについてのＭｕｋｈｅｒｊｅｅおよびＬｕｔｋｅｎｈａｕｓにより記載された方法（Ｊ．Ｂａｃｔ．１８１：８２３−８３２，１９９９）を行った。光散乱を、０．５ｍｌの石英キュベット（セル ２×１０ｍｍ、Ｈｅｌｌｍａ）を使用するサーモスタット制御（３０℃）Ａｍｉｎｃｏ−Ｂｏｗｍａｎシリーズ２ルミネセンス分光光度計で測定した。励起波長および放射波長は、２ｎｍのスリット幅で４００ｎｍであった。ゲインは、代表的には、５４０Ｖに設定したが、必要な場合は、約８の最大応答を与えるように増加させた。ＦｔｓＺ（５００μｇ／ｍｌ；１３μＭ）を、５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ ６．５）、１００ｍＭ
ＫＣｌおよび５ｍＭ ＭｇＣｌ２中でインキュベートして、ベースラインを確立した。ＧＴＰ（４０μＭ）を添加し（最終容量３００μｌ）、光散乱の増分をさらに５０〜６０分間測定した。特定の実験についての成分の濃度変化を、文字または図の凡例に示す。
【０２３９】
（実施例４）
（光散乱アッセイを用いるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺの特徴づけ）
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺの重合を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺについて記載された条件下で測定した。ＦｔｓＺ（１０μＭ）を、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および２５ｍＭ ＫＣｌを含有する５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ ６．５）中で、３０℃にてインキュベートした。１ｍＭ ＧＴＰを添加すると、光散乱が即座に増加し、約１０分でプラトーに達した。光散乱は、非常に安定であり、５時間で＜１０％減少した。一旦重合が起こると、温度が４５℃まで上昇しても、１℃まで低下しても、脱重合を誘導しなかった（データ示さず）。しかし、２０ｍＭ ＥＤＴＡの添加により、光散乱は、即座にベースラインまで戻った。ＦｔｓＺは、光散乱の増加により測定されるように、反応に２５ｍＭ ＭｇＣｌ２を添加することにより、再重合し得る。
【０２４０】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺの重合および脱重合は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺの重合および脱重合よりも明らかにずっと遅い。重合は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺについて非常に迅速に（３０秒未満）生じ、安定な相は、約１５分間持続し、続いてさらに１０分間のうちに完全に脱重合した。同一条件下では、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺは、最大重合に達するまでに約１０分間かかり、続いて安定な相が少なくとも５時間持続し、反応速度は、哺乳動物のチューブリンにより類似している。しかし、チューブリンとは異なり、ＦｔｓＺは、１℃への温度シフトによって脱重合できなかった。これにより、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺと比較してより遅い、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺの動力学が、そのより低いＧＴＰａｓｅ活性に関連するとの推測が導かれる。おそらく、ＦｔｓＺの重合速度および脱重合速度は、生物体の増殖速度と比例する。細胞分裂時間がずっと速い、Ｅ．ｃｏｌｉは、より遅く増殖するＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓよりも多くの動的な細胞分裂タンパク質を必要とし得る。重合および脱重合は、この反応を開始するために用いられたＧＴＰの濃度に依存した。５ｍＭ ＭｇＣｌ２を用いると、０．２ｍＭ〜１ｍＭ ＧＴＰは、光散乱における増加を開始し、この増加は、添加２５分後に依然として増加していた。より低い濃度のＧＴＰ（０．０５ｍＭ〜０．１ｍＭ）は、重合および脱重合の両方を２５分以内にもたらした。１ｍＭのＧＤＰまたは５’−グアニリルイミド二リン酸（ＧＭＰ−ＰＮＰ）（非加水分解性ＧＴＰアナログ）のいずれかでＧＴＰを置き換えた場合、光散乱における増加は見られなかった。
【０２４１】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺによるＧＴＰ加水分解の速度は、ＫＣｌ濃度によって影響を受ける（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１０５３−１０５７，１９９３）ので、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺの重合に対するＫＣｌの影響を調べた。１０ｍＭまたは５０ｍＭのＫＣｌを用いると、ＧＴＰの添加は、光散乱における増加を開始し、これは、１時間にわたって持続した。ＫＣｌを用いないと、重合は、低ＫＣｌを用いてよりも遅かったが、１時間の終わりにおいても依然として持続した。より高い濃度のＫＣｌ（１００ｍＭおよび２００ｍＭ）は、光散乱における増加、続いて減少をもたらした。光散乱の最大量は、ＫＣｌ濃度が上昇するにつれて減少した。ＫＣｌによる脱重合に対する影響は、特異的であるようである。なぜなら、１００ｍＭまたは２００ｍＭのＮａＣｌの存在下では、重合は、１時間の時点で依然として増加していたからである。Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺ ＧＴＰａｓｅ活性は、ＫＣｌによって刺激され得るが、ＮａＣｌによっては刺激され得ず、そしてＫＣｌ濃度の増加は、重合の定常状態相の短縮と関連する。
【０２４２】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺは、他のＧＴＰａｓｅと同様に、ＧＴＰからＧＤＰへの加水分解のためにＭｇ２＋を必要とする。ＭｇＣｌ２が１ｍＭから５ｍＭへと増加するにつれて、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺの最大重合が増強され、続いてベースラインに戻った。５ｍＭより高いＭｇＣｌ２では、重合のみが観察された。ＦｔｓＺは、ＭｇＣｌ２の非存在下では重合しなかった。これは、ＭｇＣｌ２の非存在下でのＧＴＰの添加が、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を用いて得られたレベルの約３分の１の、光散乱における増加を生じたＥ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺと対照的である。
【０２４３】
ＦｔｓＺ濃度の関数として光散乱を調べることにより、重合に必要なタンパク質最小濃度の決定が可能になった。種々の濃度でのＦｔｓＺを、１００ｍＭ ＫＣｌおよび５ｍＭ
ＭｇＣｌ２を含む重合緩衝液中でインキュベートした。０．０５ｍＭ ＧＴＰの添加後、最大量の光散乱を測定し、そしてＦｔｓＺ濃度に対してプロットした。重合に必要な臨界濃度についての値は、３Ｍ（１２０ｇ／ｍｌ）であった。これは、沈降によって１．５Ｍであると決定されたＥ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺについての臨界濃度よりもわずかに高いが、光散乱アッセイから得られた２．５Ｍの値に類似する。
【０２４４】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺ重合は、中性ｐＨまたはアルカリ性ｐＨにおいて顕著に減少した。ＧＴＰ依存性重合は、その範囲にわたって一定のイオン強度を維持した緩衝系（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＭＥＳ、１００ｍＭエタノールアミン）において、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０およびｐＨ７．４の順であった。ｐＨ７．０における最大光散乱は、ｐＨ６．５における最大光散乱の４分の１未満であった。重合はｐＨ７．５において見られなかった。Ｅ．ｃｏｌｉ ＦｔｓＺは、ｐＨ変化に対して、より耐性であるようである。
【０２４５】
（実施例５）
（インヒビター研究）
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＦｔｓＺの重合および脱重合に対する異なる化合物の影響（表６）を、上記の光散乱アッセイを用いてモニタリングした。化合物を反応物に添加し、そしてベースラインを確立した。ＧＴＰを添加して重合を開始し、そして光散乱データをさらに５０分間〜６０分間収集した。最大光散乱を、ＧＴＰ前のベースライン値をピーク値から差し引くことにより算出した。コントロール活性％を、化合物なしのアッセイとの比較により算出した。ＤＭＳＯを溶媒として用いた場合、このコントロールはまた、同じ量のＤＭＳＯ（２％）を含んでいた。化合物を、１００μＭにおいて最初に評価した。阻害が観察されたならば、この化合物をいくつかの濃度で再度試験した。化合物濃度に対するコントロール活性％の半対数プロットを用いて、５０％阻害濃度を算出した。３つの独立した曲線を、各化合物について描いた。コルヒチンを、Ｓｉｇｍａから購入した。精製したウシチューブリンチューブリン（Ｓｉｇｍａ）のＧＴＰ開始重合に続いて、光散乱アッセイを行った。ウシチューブリン（１ｍｇ／ｍＬ；２０Ｍ）を、１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１００μＭ ＥＤＴＡ、２Ｍグリセロールおよび０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２＋インヒビターまたは溶媒中でインキュベートして、ベースラインを確立した。ＧＴＰ（１ｍＭ）を添加し（最終体積５００Ｌ）、そして光散乱における増加をさらに５０分間〜６０分間にわたって測定した。最大光散乱を、ベースライン値を、ピーク値から差し引くことにより算出した。ＤＭＳＯを溶媒として用いた場合、このコントロールはまた、同じ量のＤＭＳＯ（２％）を含んでいた。化合物を、１００μＭにおいて最初に評価した。阻害が観察されたならば、この化合物を、いくつかの濃度で再試験した。ＩＤ５０値および阻害パーセントを、上記の通りに算出した。
【０２４６】
【表６】
【０２４７】
（実施例６）
（質量分析法およびアミノ酸配列決定）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを、遅延抽出技術（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＶｏｙａｇｅｒ Ｅｌｉｔｅ質量分析計（ポジティブモード）について得た。加速電圧を２５ｋＶに設定し、そして１０〜５０のレーザーショットを合計した。このマトリクスは、ＣＨ３ＣＮ−０．１％ ＣＦ３ＣＯ２Ｈ（１：１）中に溶解したシナピン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）であった。分光計を、アポミオグロビンを用いて較正した。サンプルをマトリクスで１：１０希釈し、その後、１μｌを平滑なプレート上にピペッティングした。Ｎ末端配列決定を、気相微量配列決定系（Ｍｏｄｅｌ Ｐｌ ２０９０Ｅ，Ｂｅｃｋｍａｎ）において自動化エドマン分解によって行った。所定のサイクルにおいて遊離されたアミノ酸残基を、異なるクロマトグラム（以前のサイクルとの比較）から同定した。
【０２４８】
（実施例７）
（細菌のパネルに対する抗細菌活性）
微量希釈ブロスアッセイを用いて、ＭＩＣを決定した。ＳＲＩ−３０７２をＤＭＳＯ中に溶解し、次いでアッセイ培地（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス）中に２倍希釈で連続希釈した。この培地における最終ＤＭＳＯ量は１．３％であり、そして生物体のパネルの増殖に対して影響を有さなかった（表７）。薬物希釈物（５０μｌ）を、９６ウェル（Ｕ字型）プレートの適切なウェルに添加した。試験生物体の接種物を、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロスに新鮮なスラント培養物からの増殖物を接種し、続いて３７℃にて５時間〜６時間（この時点で、増殖物を濁度計測定により測定した）にわたってインキュベートすることにより調製した。次いで、各培養物を、約１×１０６ＣＦＵ／ｍｌ相当の濁度になるように培地中に希釈し、そして接種物として用いた（５０μＬ／ウェル）。このアッセイプレートはまた、生存率コントロール、ならびに非接種培地および薬物コントロールを含んでいた。トリメトプリムを、ポジティブ薬物コントロールとして用い、そしてトリメトプリム耐性株について０．１３〜＞１６μｇ／ｍｌの範囲のＭＩＣを有していた。このプレートを、１８時間〜２０時間にわたってインキュベートし、そしてウェルを、増殖について視覚試験した。ＭＩＣを、可視の増殖がもたらされない最大薬物希釈と定義した。ＳＲＩ−３０７２を、それぞれ、グラム陰性桿菌およびグラム陽性球菌を代表する、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに対してアッセイした。この薬物は、Ｅ．ｃｏｌｉに対しては活性ではなく、そして２つの球菌に対しては中程度の活性（３２μｇ／ｍＬのＭＩＣ）を有した。次いで、この薬物を、グラム陽性桿菌およびグラム陽性球菌の拡大パネルに対して試験した。この拡大パネルは、メチシリン耐性ブドウ球菌、多剤耐性ブドウ球菌およびバンコマイシン耐性腸球菌を含んでいた。これらの生物体に対するＭＩＣは、試験した単一のグラム陽性桿菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓを除いて、３２〜６４μｇ／ｍＬの範囲で一様であった。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓは、１６μｇ／ｍＬのＭＩＣにおいて阻害された。この薬物はＥ．ｃｏｌｉに対して活性ではなかったので、別のグラム陰性桿菌であるＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを試験した。この特定の株のＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍは、細胞エンベロープのＬＰＳ成分の多糖類側鎖におけるディープラフ（ｄｅｅｐ ｒｏｕｇｈ）（ｒｆａ）変異を含んでいた。このような株は、複素環式化合物に対して増加した透過性を保有する。ＳＲＩ−３０７２は、このグラム陰性変異体に対して活性であった。結論として、ＳＲＩ−３０７２は、単一のグラム陰性細菌の代表に対して活性ではなかったが、薬物耐性株を含めたいくつかのグラム陽性細菌に対して中程度の活性を有した。また、ディープラフ変異体は、ＳＲＩ−３０７２に対して感受性であった。このことは、Ｅ．ｃｏｌｉの活性の欠如が、Ｅ．ｃｏｌｉに対する影響の欠如というよりも透過性に起因したことを示す。
【０２４９】
【表７】
【０２５０】
（実施例８）
（細胞機構に対する化合物の影響）
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ（ＢＣＧ）の細胞分裂機構に対するＳＲＩ ３０７２の影響を調べた（図９）。ＢＣＧは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓについての優れた代用品である。なぜなら、それらのゲノムは、ほぼ９５％同一だからである。緑色蛍光タンパク質を発現するＢＣＧを、０．３μｇ／ｍｌ ＳＲＩ ３０７２（ＭＩＣ未満の濃度）とともに５日間インキュベートし、そして細胞長さについてアッセイした。細胞をスピンダウンし、ＰＢＳ中で洗浄し、次いでポリ−１−リジンコーティングカバーガラス上で風乾した。５０％グリセロール中のＤＡＰＩ（３μｇ／ｍｌ）をカバーガラス上にピペッティングし、そしてこのスライド上に反転させた。このスライドを、ＤＸＭ １２００色ＣＣＤを備えたＮｉｋｏｎエクリプス顕微鏡で観察した。画像を、Ｌｕｃｉａ Ｇソフトウェアバージョン４を用いて取り込んだ。蛍光を用いた位相差画像を得た。コントロール細胞は、２〜３μｍ付近に集まった、やや細い細胞長さを有する。一方、ＳＲＩ ３０７２で処理した細胞は、ずっと長く、分岐している。コントロール細胞とは異なり、ＳＲＩ ３０７２処理細胞におけるＤＮＡは、異常な細胞全体に分散する。ＳＲＩ ３０７２は、細胞分裂機構を破壊する。さらに、培養細胞を洗浄してＳＲＩ ３０７２を培地から除去する場合、これらは回復しない。
【０２５１】
（実施例９）
ＦｔｓＺを含むサンプル２５μｌのＧＴＰａｓｅ活性を、Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１０５３−１０５７，１９９３）に記載される方法を用いてモニタリングした。手短に述べると、ＦｔｓＺを、４０μＭ［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ（２５０〜４００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）、１００ ｍＭ ＫＣｌ、および５ｍＭ ＭｇＣｌ２とともに３０℃で６０分間インキュベートした（最終体積５０μｌ）。放射性無機リン酸を、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４を含む０．１Ｍ ＨＣｌＯ４を用いて抽出し、続いてモリブデン酸ナトリウムおよび酢酸イソプロピルを添加した。有機相のアリコートを、液体シンチレーションカウンター中で測定した。断続的ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアルキルアミドゲル電気泳動（１５％ゲル）を用いて、精製をモニタリングし、そしてサブユニット分子量を決定した。タンパク質濃度を、ウシガンマグロブリンを標準として使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄ手順によって決定した。このタンパク質（５０μＭ ＦｔｓＺ）に結合したヌクレオチドの量を、３％過塩素酸抽出物（Ｓｏｓｓｏｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３８：１４８４３−５０，１９９０）を用いて決定した。上清を２５７ｎｍにおいて読み取り、そして濃度をＧＤＰ（５〜２００μＭ）の標準曲線から算出した。強アニオン交換ＨＰＬＣを用いて、ヌクレオチドを同定した。
【０２５２】
引用したいずれの文献の開示内容も、本発明が属する技術の状況を十分に記述するために、その全体が本明細書中で参考として援用されている。
【０２５３】
本発明の範囲および精神を逸脱することなく、本発明において、種々の改良および変更を行うことができることは、当業者に明らかである。本発明の他の実施態様は、本明細書および本明細書中で開示された発明の実施の要件から、当業者に明らかとなる。本明細書および実施例は、代表的なものと見なされるにすぎず、本発明の真の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲で示されると解釈される。
【０２５４】
（実施例１０）
以下の化合物（表８）は、本発明の化合物の例、およびそれらの阻害濃度である。
【０２５５】
（表８）
【０２５６】
【表８−１】
【０２５７】
【表８−２】
【０２５８】
【表８−３】
【０２５９】
【表８−４】
【０２６０】
【表８−５】
【０２６１】
【表８−６】
【０２６２】
【表８−７】
【０２６３】
【表８−８】
【０２６４】
【表８−９】
【０２６５】
【表８−１０】
【０２６６】
【表８−１１】
【０２６７】
【表８−１２】
【０２６８】
【表８−１３】
【０２６９】
【表８−１４】
【０２７０】
【表８−１５】
【０２７１】
【表８−１６】
【０２７２】
【表８−１７】
【０２７３】
【表８−１８】
【０２７４】
【表８−１９】
【０２７５】
【表８−２０】
【０２７６】
【表８−２１】
【０２７７】
【表８−２２】
【０２７８】
【表８−２３】
【０２７９】
【表８−２４】
【０２８０】
【表８−２５】
【０２８１】
【表８−２６】
【０２８２】
【表８−２７】
【０２８３】
【表８−２８】
【０２８４】
【表８−２９】
【０２８５】
【表８−３０】
【０２８６】
【表８−３１】
【０２８７】
【表８−３２】
【０２８８】
【表８−３３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１１−１０５７３１（Ｐ２０１１−１０５７３１Ａ）
【公開日】平成２３年６月２日（２０１１．６．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２８８９５７（Ｐ２０１０−２８８９５７）
【出願日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【分割の表示】特願２００４−５１９８４３（Ｐ２００４−５１９８４３）の分割
【原出願日】平成１５年７月２日（２００３．７．２）
【出願人】（５０５００２４８４）サザン リサーチ インスティチュート (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月２日（２０１１．６．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【分割の表示】特願２００４−５１９８４３（Ｐ２００４−５１９８４３）の分割
【原出願日】平成１５年７月２日（２００３．７．２）
【出願人】（５０５００２４８４）サザン リサーチ インスティチュート (1)
【Ｆターム（参考）】
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