アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法
【課題】 本発明は、新規のアグロバクテリウムによる形質転換植物の作成方法を提供することを目的とする。
【解決手段】 本発明の作成方法は、
（ｉ）アグロバクテリウムを接種した植物材料を、共存培地で培養する共存工程、及び
(ｉｉ）（ｉ）で得られた組織を、カルス増殖培養を行わず、あるいはカルス増殖培養を行った後に、再分化培地で培養し植物体を再分化させる工程
を含む、アグロバクテリウムを用いた形質転換植物の製造方法であって
１）形質転換向上処理を行うこと、及び
２）共存から再分化までのいずれの工程においても、アグロバクテリウムにより導入される核酸の特性を利用した形質転換細胞の選抜を行なわないこと
を特徴とする。
【解決手段】 本発明の作成方法は、
（ｉ）アグロバクテリウムを接種した植物材料を、共存培地で培養する共存工程、及び
(ｉｉ）（ｉ）で得られた組織を、カルス増殖培養を行わず、あるいはカルス増殖培養を行った後に、再分化培地で培養し植物体を再分化させる工程
を含む、アグロバクテリウムを用いた形質転換植物の製造方法であって
１）形質転換向上処理を行うこと、及び
２）共存から再分化までのいずれの工程においても、アグロバクテリウムにより導入される核酸の特性を利用した形質転換細胞の選抜を行なわないこと
を特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のアグロバクテリウムによる形質転換植物の作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
主要穀類であるトウモロコシ、イネなどの単子葉植物の形質転換方法としては、従来より、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などが知られている。しかし、これらの物理的遺伝子導入方法は多コピーの遺伝子が導入されてしまう、遺伝子の挿入がインタクトな形でなされない、形質転換植物に奇形や不稔が多くみられるなどの問題を有している。
【０００３】
アグロバクテリウム属細菌を用いた遺伝子導入法は、双子葉植物の形質転換法として普遍的に用いられている。アグロバクテリウム属細菌の宿主は双子葉植物のみに限られ、単子葉植物には寄生しないとされている（Ｄｅ Ｃｌｅｅｎｅ ａｎｄ Ｄｅ Ｌｅｙ １９７６）が、アグロバクテリウムにより単子葉植物を形質転換する試みがなされている。
【０００４】
Ｇｒｉｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．はアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡの中にトウモロコシストリークウイルス（Ｍａｉｚｅ ｓｔｒｅａｋ ｖｉｒｕｓ）のＤＮＡを挿入したものをトウモロコシ生長点に接種したところ、トウモロコシストリークウイルスの感染を確認したことを報告している。トウモロコシストリークウイルスのＤＮＡを接種しただけでは、このような感染症状が認められないことから、上の観察はアグロバクテリウムがトウモロコシにＤＮＡを導入することができることを示すものと解釈している（Ｇｒｉｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ． １９８７）。しかし、ウイルスは核ゲノムに組み込まれなくても増殖する可能性があるので、この結果はＴ−ＤＮＡが核に組み込まれたものを示しているとはいえない。Ｇｒｉｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．はさらに感染効率はトウモロコシの茎頂の生長点に接種したときが最も高く（Ｇｒｉｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ． １９８８）、感染にはアグロバクテリウムのプラスミドのＶｉｒ Ｃ遺伝子が必須であることを示した（Ｇｒｉｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ． １９８９）。
【０００５】
Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．はトウモロコシの生長点に針で傷を付けた後、カナマイシン抵抗性遺伝子とＧＵＳ遺伝子を持った強病原性アグロバクテリウムＥＨＡ１を接種し、処理後の生長点をカナマイシンで選抜したところ、抵抗性を示す植物を得た。この後代の種子が導入した遺伝子を持つことを確認するためサザン分析を行ったところ、一部の種子で導入遺伝子が確認された（Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ． １９９１）。このことは、アグロバクテリウム処理された生長点からカナマイシン選抜により得られた植物体には形質転換細胞と非形質転換細胞が混在していたことを示す（キメラ現象）。
【０００６】
Ｍｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．は、アグロバクテリウムを用いてコムギの胚にカナマイシン抵抗性遺伝子の導入を試みた。まず、胚を酵素で処理することにより、細胞壁に傷を付け、その後アグロバクテリウムを接種した。処理したカルスのうち極めて少数のカナマイシン抵抗性と思われるカルスが増殖したが、このカルスから植物体の再生はできなかった。また、カナマイシン抵抗性遺伝子の存在をサザン分析で確認したところ、全ての抵抗性カルスで導入遺伝子の構造変異がみられた（Ｍｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ． １９９１）。
Ｒａｉｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．はイネの胚盤に傷を付けた後、強病原性のアグロバクテリウムＡ２８１ （ｐＴｉＢｏ５４２）をイネの８品種に処理したところ、日本晴、藤坂５号の２品種で腫瘍状の組織の増殖がみられた。さらに、Ｔ−ＤＮＡからホルモン合成遺伝子を除いたＴｉプラスミドにカナマイシン抵抗性遺伝子とＧＵＳ遺伝子を挿入したプラスミドを持つアグロバクテリウムをイネの胚に接種したところカナマイシン抵抗性カルスの増殖がみられた。この抵抗性カルスでは、ＧＵＳ遺伝子の発現が認められたが、形質転換植物を得ることはできなかった。これらのことから、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡがイネの細胞に導入されたと解釈している（Ｒａｉｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ． １９９０）。
【０００７】
このように、イネ、トウモロコシ、コムギ等のイネ科の作物でもアグロバクテリウムによる遺伝子導入が可能であることを示唆する研究報告がなされていたが、何れも再現性に問題があるほか、導入した遺伝子の確認についても不完全で、説得できる結果が示されていなかった（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ １９９０）。
【０００８】
Ｃｈａｎ ａｔ ｌ．は２，４−Ｄ共存下で２日間培養したイネ未熟胚に付傷後、ジャガイモ懸濁培養細胞を含む培地中でｎｐｔ ＩＩ遺伝子とＧＵＳ遺伝子を持ったアグロバクテリウムを接種した。処理した未熟胚をＧ４１８添加培地上で培養したところ、誘導されたカルスから再分化植物体が得られた。再分化植物体およびその後代の植物体でのＧＵＳ遺伝子の所在をサザン分析で確認したところ、再分化当代、後代いずれの植物体でも導入遺伝子の存在が認められたことを報告している（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ． １９９３）。この結果は、アグロバクテリウムによるイネの形質転換を支持するものであるが、形質転換効率は１．６％と非常に低く、供試した未熟胚数２５０に対し、正常な生長を示した再生植物体は１個体にすぎなかった。イネの未熟胚を摘出するには多大な労力を要するため、このように低い形質転換効率では実用的なレベルにあるとは言い難い。
【０００９】
近年、強病原性アグロバクテリウムの病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクターの利用により、イネ、トウモロコシなどの単子葉植物においても、安定して、高効率で形質転換のなされることが報告された（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ． １９９４， Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． １９９６）。これらの報告では、アグロバクテリウムによる形質転換は、安定して、高効率で形質転換がなされる他に、得られた形質転換植物に変異が少なく、導入された遺伝子はコピー数が少なく、かつインタクトな形のものが多いという利点をもつとしている。イネ、トウモロコシでの成功に続いて、主要な穀類であるコムギ（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９７）、オオムギ（Ｔｉｎｇａｙ ｅｔ ａｌ． １９９７）およびソルガム（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ２０００）でのアグロバクテリウムによる形質転換の報告がなされた。
【００１０】
アグロバクテリウムによるトウモロコシ形質転換の効率を改善する試みとしては、上記以外にも、Ｎ６基本培地での形質転換細胞の選抜（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ２００１）、培地へのＡｇＮＯ３およびカルベニシリンの添加（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ２００１、Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． ２００３）、共存培地へのシステインの添加（Ｆｒａｍｅ ｅｔ ａｌ． ２００２）などがなされてきた。このように培地組成や選抜マーカー遺伝子の改変により、アグロバクテリウムによるイネやトウモロコシの形質転換においても効率の向上がなされている。
【００１１】
これまでに報告されているアグロバクテリウムによるイネ・トウモロコシの形質転換方法では、そのほとんどが、アグロバクテリウムを接種した胚盤由来カルス、あるいはアグロバクテリウムを接種した未熟胚から誘導されたカルスについて、除草剤の成分や抗生物質を含む培地で形質転換カルスを選択的に増殖させ、得られた形質転換細胞塊を再分化培地に置床して再分化させる、という工程を経て形質転換植物を得ている（Ｄｅｊｉ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｎｅｇｒｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０００ａ； Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０００ｂ； Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｆｒａｍｅ ｅｔ ａｌ．， ２００２； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｆｒａｍｅ ｅｔ ａｌ． ２００６）。
【００１２】
植物の形質転換方法においては、形質転換細胞の選抜は形質転換植物の作出に不可欠であり、この工程がなければ植物の形質転換は成功しないとされてきた（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｅｒｉｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｊｏｅｒｓｂｏ ｅｔ ａｌ．， ２００１）。形質転換細胞の選抜は多くの場合、非形質転換細胞の増殖を阻害する薬剤に対して抵抗性を示す遺伝子を植物材料に導入する操作を行い、この薬剤を含む培地で植物材料を培養することにより、薬剤抵抗性遺伝子が植物細胞のゲノムに組み込まれ発現する形質転換細胞のみを選択的に増殖させる方法により行われる。
【００１３】
形質転換細胞の選抜に用いられる遺伝子（選抜マーカー遺伝子）のうち、最も一般的に使用される遺伝子は除草剤あるいは抗生物質に対する抵抗性を付与するものである（Ｋｕｉｐｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００１）。除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子としてはｂａｒ遺伝子やＥＰＳＰ遺伝子（Ｄｅ Ｂｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９８７； Ｃｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．， １９８５）、抗生物質に対する抵抗性を付与する遺伝子としてはＮＰＴＩＩ遺伝子やＨＰＴ遺伝子（Ｂｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８３； Ｗａｌｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８５）が植物の形質転換の選抜マーカー遺伝子として使用されることが多い。また近年、特定の糖の代謝能を利用したＰＭＩ遺伝子やＸｙｌＡ遺伝子（Ｊｏｅｒｓｂｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｈａｌｄｒｕｐ ｅｔ ａｌ．， １９９８）なども選抜マーカー遺伝子として有効であることが報告されている。形質転換された細胞を選択的に増殖させる機構を利用した選抜マーカー遺伝子としては、上述したものの他にも数多くの遺伝子が報告されている。そして、これらの遺伝子を用いた形質転換法では形質転換細胞を選択的に増殖させる選抜工程は必須であると考えられている。
【００１４】
花芽組織に減圧浸潤法を用いて形質転換を行うインプランタ形質転換法では、形質転換された種子は選抜工程を経ずに得られる（Ｂｅｎｔ， ２０００）。しかし、非形質転換種子が多数混在した種子の中から目的とする形質転換種子を得るためには抗生物質抵抗性遺伝子などを利用した選抜工程が必要となる。
【００１５】
ＧＦＰ遺伝子を導入し、紫外線照射下で蛍光を発する細胞を指標に可視的に形質転換部位を選抜し、形質転換植物を得る方法が報告されている（Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。この方法では、形質転換細胞は増殖の違いにより非形質転換細胞と混在した中からは選抜されることはないが、ＧＦＰ遺伝子の発現の有無により、形質転換細胞と非形質転換細胞を区別し、より分ける選抜工程が必要である。
【００１６】
選抜マーカー遺伝子を形質転換植物から除く技術として、コ・トランスフォーメーションシステム（Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６）、ＭＡＴベクターシステム（Ｅｂｉｎｕｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９７）およびＣｒｅＬｏｘシステム（Ｇｌｅａｖｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００３）が報告されている。これらのシステムを用いることにより、選抜マーカー遺伝子を含まない形質転換植物を得ることができる。しかし、選抜マーカーフリーの形質転換植物を作出する過程では、従来より用いられている薬剤耐性遺伝子や植物ホルモン合成遺伝子などを使用し、形質転換細胞と非形質転換細胞を区別し選抜する工程が必要である。
【００１７】
このように、植物の形質転換においてこれまでになされている方法では、形質転換細胞と非形質転換細胞を選り分ける選抜工程が不可欠であった。この選抜工程には、上記のように、目的とする遺伝子（ＧＯＩ遺伝子）の他に選抜を行うための選抜マーカー遺伝子が必要である。この選抜マーカー遺伝子が発現することにより産生されるタンパク質や酵素の働きにより生ずる反応、例えば除草剤抵抗性、抗生物質抵抗性や蛍光の発光などを利用し、多数の非形質転換細胞の中のごく一部の形質転換細胞を区別して増殖させ形質転換植物が得られる。しかし、選抜マーカー遺伝子は作出された形質転換植物には不要なものであり、さらに選抜マーカー遺伝子が形質転換植物に含まれたままでは、除草剤抵抗性遺伝子や抗生物質抵抗性遺伝子が形質転換体を介して一般の非組換え植物に伝播する危険は皆無とはいえないとして、形質転換植物の利用に不安を抱く一般消費者も多い。また、選抜マーカー遺伝子は多くの種類が報告されているものの、植物の種により適応できる選抜マーカー遺伝子は限定され、複数の遺伝子を分けて導入するときには問題となる。さらに形質転換体から選抜マーカー遺伝子を除く技術も報告されているが、これらの方法は通常の形質転換法よりも長い培養期間や後代植物での選抜マーカーフリー個体の選抜など、多大な労力を要する。
【００１８】
以上のように、これまでに形質転換植物の作出に関する報告が数多くなされているが、形質転換された細胞、組織、器官あるいは個体を、形質転換されていない細胞、組織、器官あるいは個体からより分ける選抜工程を経ずに形質転換体を得る方法は報告されていない。すなわち、ＧＯＩ（Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）遺伝子のみを導入して形質転換植物を得ることは現在まで不可能であったといえる。
【特許文献１】ＷＯ９８／５４９６１
【特許文献２】ＷＯ０２／１２５２０
【特許文献３】ＷＯ０２／１２５２１
【特許文献４】ＷＯ２００５／０１７１６９
【特許文献５】ＷＯ２００５／０１７１５２
【特許文献６】ＷＯ２００７／０６９６４３
【非特許文献１】Ｄｅ Ｃｌｅｅｎｅ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅ Ｌｅｙ， Ｊ． （１９７６） Ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｃｒｏｗｎ ｇａｌｌ． Ｂｏｔ． Ｒｅｖ． ４２：３８９−４６６．
【非特許文献２】Ｇｒｉｍｓｌｅｙ， Ｎ．， Ｈｏｒｎ， Ｔ．， Ｄａｖｉｓ， Ｊ．Ｗ． ａｎｄ Ｈｏｒｎ， Ｂ． （１９８７） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｍａｉｚｅ ｓｔｒｅａｋ ｖｉｒｕｓ ｉｎｔｏ ｍａｉｚｅ ｐｌａｎｔｓ． Ｎａｔｕｒｅ ３２５：１７７−１７９．
【非特許文献３】Ｇｒｉｍｓｌｅｙ， Ｎ．Ｈ．， Ｒａｍｏｓ， Ｃ．， Ｈｅｉｎ， Ｔ． ａｎｄ Ｈｏｒｎ， Ｂ． （１９８８） Ｍｅｒｉｓｔｅｍａｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｐｌａｎｔｓ ａｒｅ ｍｏｓｔ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ Ａｇｒｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍａｉｚｅ ｓｔｒｅａｋ ｖｉｒｕｓ． Ｂｉｏ／ｔｅｃｎｏｌｏｇｙ ６：１８５−１８９．
【非特許文献４】Ｇｒｉｍｓｌｅｙ， Ｎ．， Ｈｏｒｎ， Ｂ．， Ｒａｍｏｓ， Ｃ．， Ｋａｄｏ， Ｃ． ａｎｄ Ｒｏｇｏｗｓｋｙ， Ｐ． （１９８９） ＤＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｒｏｍ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｏ Ｚｅａ ｍａｙｓ ｏｒ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｂｙ ａｇｒｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２１７：３０９−３１６．
【非特許文献５】Ｇｏｕｌｄ， Ｊ．， Ｄｅｖｅｙ， Ｍ．， Ｈａｓｅｇａｗａ， Ｏ．， Ｕｌｉａｎ， Ｅ．Ｃ．， Ｐｅｔｅｒｓｏｎ， Ｇ． ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｒ．Ｈ． （１９９１） Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ． ｕｓｉｎｇ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ａｎｄ ｓｈｏｏｔ ａｐｅｘ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９５：４２６−４３４．
【非特許文献６】Ｍｏｏｎｅｙ， Ｐ．Ａ．， Ｇｏｏｄｗｉｎ， Ｐ．Ｂ．， Ｄｅｎｎｉｓ， Ｅ．Ｓ． ａｎｄ Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ， Ｄ．Ｊ． （１９９１） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｗｈｅａｔ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ２５：２０９−２１８．
【非特許文献７】Ｒａｉｎｅｒｉ， Ｄ．Ｍ．， Ｂｏｔｔｉｎｏ， Ｐ．， Ｇｏｒｄｏｎ， Ｍ．Ｐ． ａｎｄ Ｎｅｓｔｅｒ， Ｅ．Ｗ． （１９９０） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）． Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：３３−３８．
【非特許文献８】Ｐｏｔｒｙｃｕｓ， Ｉ （１９９０） Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｃｅｒｅａｌｓ： ａｎ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ． Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：５３５−５４２．
【非特許文献９】Ｃｈａｎ， Ｍ−Ｔ．， Ｃｈａｎｇ， Ｈ−Ｈ．， Ｈｏ， Ｓ−Ｌ．， Ｔｏｎｇ， Ｗ−Ｆ． ａｎｄ Ｙｕ， Ｓ−Ｍ． （１９９３） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ α−ａｍｙｌａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ／ β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｇｅｎｅ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２：４９１−５０６．
【非特許文献１０】Ｈｉｅｉ， Ｙ．， Ｏｈｔａ， Ｓ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． ａｎｄ Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ， Ｔ． （１９９４） Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ−ＤＮＡ． Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６：２７１−２８２．
【非特許文献１１】Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， Ｓａｉｔｏ， Ｈ．， Ｏｈｔａ， Ｓ．， Ｈｉｅｉ， Ｙ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． ａｎｄ Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ， Ｔ． （１９９６） Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ （Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．） ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：７４５−７５０．
【非特許文献１２】Ｃｈｅｎｇ， Ｍ．， Ｆｒｙ， Ｊ． Ｅ．， Ｐａｎｇ， Ｓ．， Ｚｈｏｕ， Ｈ．， Ｈｉｒｏｎａｋａ， Ｃ． Ｍ．， Ｄｕｎｃａｎ， Ｄ． Ｒ．， Ｃｏｎｎｅｒ， Ｔ． Ｗ．， Ｗａｎ， Ｙ． （１９９７） Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１５： ９７１−９８０．
【非特許文献１３】Ｔｉｎｇａｙ， Ｓ．， ＭｃＥｌｒｏｙ， Ｄ．， Ｋａｌｌａ， Ｒ．， Ｆｉｅｇ， Ｓ．， Ｗａｎｇ， Ｍ．， Ｔｈｏｒｎｔｏｎ， Ｓ．， Ｂｒｅｔｔｅｌｌ， Ｒ． （１９９７） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂａｒｌｅｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． １１： １３６９−１３７６．
【非特許文献１４】Ｚｈａｏ， Ｚ．−Ｙ．， Ｃａｉ， Ｔ．， Ｔａｇｌｉａｎｉ， Ｌ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｍ．， Ｗａｎｇ， Ｎ．， Ｐｅｎｇ， Ｈ．， Ｒｕｄｅｒｔ， Ｍ．， Ｓｃｈｏｅｄｅｒ， Ｓ．， Ｈｏｎｄｒｅｄ， Ｄ．， Ｓｅｌｔｚｅｒ， Ｊ．， Ｐｉｅｒｃｅ， Ｄ． （２０００） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｏｒｇｈｕｍ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４４： ７８９−７９８．
【非特許文献１５】Ｄｅｊｉ， Ａ．， Ｓａｋａｋｉｂａｒａ， Ｈ．， Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， Ｙａｍａｄａ， Ｓ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ．， Ｋｕｂｏ， Ｔ．， Ｓｕｇｉｙａｍａ， Ｔ． （２０００） Ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ ＺｍＲＲ１ ａｎｄ ＺｍＲＲ２ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４９２： ２１６−２２０．
【非特許文献１６】Ｎｅｇｒｏｔｔｏ， Ｄ．， Ｊｏｌｌｅｙ， Ｍ．， Ｂｅｅｒ， Ｓ．， Ｗｅｎｃｋ， Ａ． Ｒ．， Ｈａｎｓｅｎ， Ｇ． （２０００） Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅ−ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ａｓ ａ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ ｔｏ ｒｅｃｏｖｅｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍａｉｚｅ ｐｌａｎｔｓ （Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．） ｖｉａ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９： ７９８−８０３．
【非特許文献１７】Ｎｏｍｕｒａ， Ｍ．， Ｓｅｎｔｏｋｕ， Ｎ．， Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， Ａ．， Ｌｉｎ， Ｊ−Ｈ．， Ｈｏｎｄａ， Ｃ．， Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｍ．， Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， Ｏｈｔａ， Ｓ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ．， Ｍｉｙａｏ−Ｔｏｋｕｍｏｒｉ， Ｍ．， Ｋｏｎｏ−Ｍｕｒａｋａｍｉ， Ｙ．， Ｔａｊｉｍａ， Ｓ．， Ｋｕ， Ｍ． Ｓ． Ｂ．， Ｍａｔｓｕｏｋａ， Ｍ． （２０００ａ） Ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ４ ｐｌａｎｔｓ： ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ Ｃ４−ｔｙｐｅ ｐｙｒｕｖａｔｅ， ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２２： ２１１−２２１．
【非特許文献１８】Ｎｏｍｕｒａ， Ｍ．， Ｋａｔａｙａｍａ， Ｋ．， Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， Ａ．， Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， Ｏｈｔａ， Ｓ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ．， Ｍｉｙａｏ−Ｔｏｋｕｔｏｍｉ， Ｍ．， Ｔａｊｉｍａ， Ｓ．， Ｍａｔｓｕｏｋａ， Ｍ． （２０００ｂ） Ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ｒｂｃＳ ｉｎ ａ Ｃ３ ｐｌａｎｔ （ｒｉｃｅ） ｄｉｒｅｃｔｓ ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ， ｌｉｇｈｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ Ｃ４ ｐｌａｎｔ （ｍａｉｚｅ）， ｂｕｔ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｃｏｎｆｅｒ ｂｕｎｄｌｅ ｓｈｅａｔｈ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４４： ９９−１０６．
【非特許文献１９】Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｍ．， Ｉｚａｗａ， Ｋ．， Ｋｕ， Ｍ． Ｓ． Ｂ．， Ｌｉｎ， Ｊ−Ｈ．， Ｓａｉｔｏ， Ｈ．， Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， Ｏｈｔａ， Ｓ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ．， Ｍａｔｓｕｏｋａ， Ｍ．， Ｓｕｇｉｙａｍａ， Ｔ． （２０００） Ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｉｚｅ Ｃ４ ｐｙｒｕｖａｔｅ， ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｄｉｒｅｃｔｓ ｃｅｌｌ− ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍａｉｚｅ ｐｌａｎｔｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ４１： ４２−４８．
【非特許文献２０】Ｚｈａｏ， Ｚ．−Ｙ．， Ｇｕ， Ｗ．， Ｃａｉ， Ｔ．， Ｔａｇｌｉａｎｉ， Ｌ．， Ｈｏｎｄｒｅｄ， Ｄ．， Ｂｏｎｄ， Ｄ．， Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ， Ｓ．， Ｒｕｄｅｒｔ， Ｍ．， Ｐｉｅｒｃｅ， Ｄ． （２００１） Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｉｎ ｍａｉｚｅ． Ｍｏｌ． Ｂｒｅｅｄ． ８： ３２３−３３３．
【非特許文献２１】Ｆｒａｍｅ， Ｂ．Ｒ．， Ｓｈｏｕ， Ｈ．， Ｃｈｉｋｗａｍｂａ， Ｒ．Ｋ．， Ｚｈａｎｇ， Ｚ．， Ｘｉａｎｇ， Ｃ．， Ｆｏｎｇｅｒ， Ｔ．Ｍ．， Ｐｅｇｇ， Ｓ．Ｅ．Ｋ．， Ｌｉ， Ｂ．， Ｎｅｔｔｌｅｔｏｎ， Ｄ．Ｓ．， Ｐｅｉ， Ｄ．， Ｗａｎｇ， Ｋ． （２００２） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｔａｎｄａｒｄ ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２９： １３−２２．
【非特許文献２２】Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， Ｓａｉｔｏ， Ｈ．， Ｈｉｅｉ， Ｙ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． （２００３） Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ （Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．） ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：５７−６６．
【非特許文献２３】Ｚｈａｎｇ， Ｗ．， Ｓｕｂｂａｒａｏ， Ｓ．， Ａｄｄａｅ， Ｐ．， Ｓｈｅｎ， Ａ．， Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ， Ｃ．， Ｐｅｓｃｈｋｅ， Ｖ．， Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎ， Ｌ． （２００３） Ｃｒｅ／ｌｏｘ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍａｉｚｅ （Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．） ｐｌａｎｔｓ． Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １０７： １１５７−１１６８．
【非特許文献２４】Ｆｒａｍｅ， Ｂ．Ｒ．， ＭｃＭｕｒｒａｙ， Ｊ．Ｍ．， Ｆｏｎｇｅｒ， Ｔ．Ｍ．， Ｍａｉｎ， Ｍ．Ｌ．， Ｔａｙｌｏｒ， Ｋ．Ｗ．， Ｔｏｒｎｅｙ， Ｆ．Ｊ．， Ｐａｚ， Ｍ．Ｍ．， Ｗａｎｇ， Ｋ． （２００６） Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｍａｉｚｅ ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ＭＳ ｓａｌｔｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ２５： １０２４−１０３４．
【非特許文献２５】Ｈｉｅｉ， Ｙ．， Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， Ｋａｓａｏｋａ， Ｋ． ＆ Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ ａｎｄ ｍａｉｚｅ ｂｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｗｉｔｈ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｅａｔ ｐｒｉｏｒ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ８７， ２３３−２４３ （２００６）．
【非特許文献２６】Ｈｉｅｉ， Ｙ． ＆ Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｉｃａ ｒｉｃｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ８５， ２７１−２８３ （２００６）．
【非特許文献２７】Ｈｉｅｉ， Ｙ．， Ｏｈｔａ， Ｓ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． ＆ Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ， Ｔ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ−ＤＮＡ． Ｐｌａｎｔ Ｊ ６， ２７１−８２ （１９９４）．
【非特許文献２８】Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｎｉｎｅ ｐｌａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． ６０， ２２３−２２９ （１９８９）．
【非特許文献２９】Ｂｅｎｔ， Ａ．Ｆ． （２０００） Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｉｎ ｐｌａｎｔａ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｕｓｅｓ， ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ， ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １２４：１５４０−１５４７．
【非特許文献３０】Ｂｅｖａｎ， Ｍ．Ｗ．， Ｆｌａｖｅｌｌ， Ｒ．Ｂ．， Ｃｈｉｌｔｏｎ， Ｍ．−Ｄ． （１９８３） Ａ ｃｈｉｍａｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ａｓ ａ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｐｌａｎｔｓ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ， ３０４：１８４−１８７．
【非特許文献３１】Ｃｏｍａｉ， Ｌ．， Ｆａｃｃｉｏｔｔｉ， Ｄ．， Ｈｉａｔｔ， Ｗ．Ｒ．， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｇ．， Ｒｏｓｅ， Ｒ．Ｅ．， Ｓｔａｌｋｅｒ， Ｄ．Ｍ． （１９８５） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ ａｒｏＡ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｃｏｎｆｅｒｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ． Ｎａｔｕｒｅ， ３１７：７４１−７４４．
【非特許文献３２】Ｄｅ Ｂｌｏｃｋ， Ｍ．， Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ， Ｊ．， Ｖａｎｄｅｗｉｅｌｅ， Ｍ．， Ｄｏｃｋｘ， Ｊ．， Ｔｈｏｅｎ， Ｃ．， Ｇｏｓｓｅｌe， Ｖ．， Ｍｏｖｖａ， Ｎ．Ｒ．， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｃ．， Ｖａｎ Ｍｏｎｔａｇｕ， Ｍ．， Ｌｅｅｍａｎｓ， Ｊ． （１９８７） Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｅｔｏｘｉｆｙｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ． ＥＭＢＯ Ｊ．， ６：２５１３−２５１８．
【非特許文献３３】Ｅｂｉｎｕｍａ， Ｈ．， Ｓｕｇｉｔａ， Ｋ．， Ｍａｔｓｕｎａｇａ， Ｅ．， Ｙａｍａｋａｄｏ， Ｍ． （１９９７） Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ ａｓ ａ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ．， ９４：２１１７−２１２１．
【非特許文献３４】Ｅｌｌｉｏｔｔ， Ａ．Ｒ．， Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｊ．Ａ．， Ｂｒｅｔｔｅｌｌ Ｒ．Ｉ．Ｓ．， Ｇｒｏｆ， Ｃ．Ｐ．Ｌ． （１９９８） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｕｓｉｎｇ ＧＦＰ ａｓ ａ ｓｃｒｅｅｎａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ． Ａｕｓｔ． Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２５：７３９−７４３．
【非特許文献３５】Ｅｒｉｋｓｏｎ， Ｏ．Ｓ．， Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇ， Ｍ．， Ｎaｓｈｏｌｍ， Ｔ． （２００５） Ｔｈｅ ｄｓｄＡ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ５７：４２５−４３３．
【非特許文献３６】Ｇｌｅａｖｅ， Ａ．Ｐ．， Ｍｉｔｒａ， Ｄ．Ｓ．， Ｍｕｄｇｅ， Ｓ．Ｒ．， Ｍｏｒｒｉｓ， Ｂ．Ａ．Ｍ． （１９９９） Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｓｅｘｕａｌ ｃｒｏｓｓｉｎｇ： ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｌｅｔｈａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｇｅｎｅ． Ｐｌａｎｔ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４０：２２３−２３５．
【非特許文献３７】Ｈａｌｄｒｕｐ， Ａ．， Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｓ．Ｇ．， Ｏｋｋｅｌｓ， Ｆ．Ｔ． （１９９８） Ｔｈｅ ｘｙｌｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏｇｅｎｅｓ ａｌｌｏｗｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ Ｄ−ｘｙｌｏｓｅ ａｓ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ３７：２８７−２９６．
【非特許文献３８】Ｈｉｅｉ， Ｙ． ａｎｄ Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． （２００６） Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｉｃａ ｒｉｃｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ， ８５：２７１−２８３．
【非特許文献３９】Ｈｉｅｉ， Ｙ．， Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， Ｋａｓａｏｋａ， Ｋ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． （２００６） Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ ａｎｄ ｍａｉｚｅ ｂｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｗｉｔｈ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｅａｔ ｐｒｉｏｒ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ， ８７：２３３−２４３．
【非特許文献４０】Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， Ｓａｉｔｏ， Ｈ．， Ｏｈｔａ， Ｓ．， Ｈｉｅｉ， Ｙ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． ａｎｄ Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ， Ｔ． （１９９６） Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ （Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．） ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １４：７４５−７５０．
【非特許文献４１】Ｊｏｅｒｓｂｏ， Ｍ．， Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ， Ｉ．， Ｋｒｅｉｂｅｒｇ， Ｊ．， Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｓ．Ｇ．， Ｂｒｕｎｓｔｅｄｔ， Ｊ．， Ｏｋｋｅｌｓ， Ｆ．Ｔ． （１９９８） Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍａｎｎｏｓｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｇａｒ ｂｅｅｔ． Ｍｏｌ． Ｂｒｅｅｄ．， ４：１１１−１１７．
【非特許文献４２】Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ．， Ｈｉｅｉ， Ｙ．， Ｓａｉｔｏ， Ｙ．， Ｍｕｒａｉ， Ｎ．， Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ， Ｔ． （１９９６） Ｖｅｃｔｏｒｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｗｏ ｓｅｐａｒａｔｅ Ｔ−ＤＮＡｓ ｆｏｒ ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ａｎｄ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｆｒｅｅ ｆｒｏｍ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒｓ． Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， １０：１６５−１７４．
【非特許文献４３】Ｋｕｉｐｅｒ， Ｈ．Ａ．， Ｋｌｅｔｅｒ， Ｇ．Ａ．， Ｎｏｔｅｂｏｒｎ， Ｈ．Ｐ．Ｊ．Ｍ．， Ｋｏｋ， Ｅ．Ｊ． （２００１） Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｏｄ ｓａｆｅｔｙ ｉｓｓｕｅｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｆｏｏｄ． Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２７：５０３−５２８．
【非特許文献４４】Ｐｏｔｒｙｋｕｓ， Ｉ．， Ｂｉｌａｎｇ， Ｒ．， Ｆuｔｔｅｒｅｒ Ｊ．， Ｓａｕｔｔｅｒ， Ｃ．， Ｓｃｈｒｏｔｔ， Ｍ． （１９９８） Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｃｒｏｐ ｐｌａｎｔｓ． Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｅｒ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． １１９−１５９．
【非特許文献４５】竹松哲夫 （１９８２） 除草剤研究総覧 博友社 ７９−１５４．
【非特許文献４６】Ｗａｌｄｒｏｎ， Ｃ．， Ｍｕｒｐｈｙ， Ｅ．Ｂ．， Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｊ．Ｌ．， Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ， Ｇ．Ｄ．， Ａｒｍｏｕｒ， Ｓ．Ｌ．， Ｍａｌｃｏｌｍ， Ｓ．Ｋ． （１９８５） Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ： Ａ ｎｅｗ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ５：１０２−１０８．
【非特許文献４７】Ｚｈｕ， Ｙ．Ｊ．， Ａｓｂａｙａｎｉ， Ｒ．， Ｍｏｏｒｅ， Ｐ．Ｈ． （２００４） Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ａ ｖｉｓｕａｌ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｐａｐａｙａ （Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ Ｌ．） ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．， ２２：６６０−６６７．
【非特許文献４８】Ｃｈｕ， Ｃ．−Ｃ． （１９７８） Ｔｈｅ Ｎ６ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ａｎｔｈｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｃｅｒｅａｌ ｃｒｏｐｓ． Ｉｎ Ｐｒｏｃ． Ｓｙｍｐ． Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｐｅｋｉｎｇ： Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． ４３−５０．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
従来のアグロバクテリウム属細菌を介した単子葉植物への遺伝子導入方法において、選抜マーカー遺伝子導入を利用した、形質転換細胞、組織、器官あるいは個体の選抜工程は不可欠であった。本発明はこのような選抜工程を経ずに形質転換植物を得ることのできる方法を開発し、提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは上記課題解決のため鋭意研究に努めた結果、単子葉植物について形質転換効率向上処理を行うことにより、選抜マーカー遺伝子を導入することなく、実用的な効率で形質転換植物を得られることを見出した。
【００２１】
具体的には、本発明者らは、一般に、植物の形質転換工程では、外来遺伝子の組み込まれる植物細胞の数が非常に少ないことに着目し、形質転換の効率を大幅に向上させて、非形質転換細胞中に占める形質転換細胞の割合を高めてやり、それを植物体再分化まで維持することができれば、選抜マーカー遺伝子を利用した選抜工程を経ることなく形質転換植物を得られるのではないかと考えた。鋭意研究の結果、形質転換向上処理を適切に行うことにより十分実用的な効率で形質転換植物を得られることを見出し、本発明を想到した。
【００２２】
限定されるわけではないが本発明は、好ましい態様として下記の態様を含む。
［態様１］
（ｉ）アグロバクテリウムを接種した植物材料を、共存培地で培養する共存工程、及び
(ｉｉ）（ｉ）で得られた組織を、カルス増殖培養を行わず、あるいはカルス増殖培養を行った後に、再分化培地で培養し植物体を再分化させる工程
を含む、アグロバクテリウムを用いた形質転換植物の製造方法であって
１）形質転換向上処理を行うこと、及び
２）共存から再分化までのいずれの工程においても選抜薬剤を用いた形質転換細胞の選抜を行わないこと
を特徴とする、前記形質転換植物の作成方法。
［態様２］
３）共存培養後の組織をカルス増殖培地で培養する工程を、共存工程と再分化工程の間に含まないこと、をさらに特徴として有する、態様１に記載の形質転換植物の作成方法。
［態様３］
アグロバクテリウム菌により導入される核酸が選抜薬剤に対する耐性遺伝子を含まない、態様１又は２に記載の形質転換植物の作成方法。
［態様４］
１）形質転換向上処理が、目的遺伝子の植物細胞への導入効率を向上させる処理、未熟胚などからのカルス誘導率を向上させる処理、あるいは、形質転換カルスからの再分化効率を向上させる処理である、態様１ないし３のいずれか１項に記載の形質転換植物の作成方法。
［態様５］
１）形質転換向上処理が以下からなるグループから選択される、態様１ないし４のいずれか１項に記載の形質転換植物の作成方法。
【００２３】
熱処理；
遠心処理；
熱及び遠心処理；
加圧処理；
硝酸銀および／または硫酸銅の共存培地への添加；
粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理；
共存工程後の、カルス増殖及び／または再分化工程における培地へのカルベニシリン添加
カルス増殖培地にＮ６無機塩を添加する処理；ならびに
共存培地にシステインを添加する処理
［態様６］
共存工程において、ベンゾイック系除草剤に属する化合物を添加することを含む、態様１ないし５に記載の形質転換植物の作成方法。
［態様７］
ベンゾイック系除草剤に属する化合物が、安息香酸型、サリチル酸型またはピコリン酸型のいずれかである、態様６に記載の形質転換植物の作成方法。
［態様８］
ベンゾイック系除草剤に属する化合物が、３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸、または４−アミノ−３，５，６−トリクロロピコリン酸である、態様６または７に記載の形質転換植物の作成方法。
［態様９］
植物が単子葉植物である、態様１ないし８に記載の形質転換植物の作成方法。
［態様１０］
植物がトウモロコシ又はイネである、態様１ないし９に記載の形質転換植物の作成方法。
【００２４】
［本発明の実施するための好ましい態様］
本発明は、アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法を提供する。本発明は、アグロバクテリウム属細菌を介して植物への遺伝子導入を行う方法であって、形質転換効率向上処理を行うことにより、選抜マーカー遺伝子の導入が不要になる、という発見に基づく。本発明の方法は、
（ｉ）アグロバクテリウムを接種した植物材料を、共存培地で培養する共存工程、及び
(ｉｉ）（ｉ）で得られた組織を、カルス増殖培養を行わず、あるいはカルス増殖培養を行った後に、再分化培地で培養し植物体を再分化させる工程
を含む、アグロバクテリウムを用いた形質転換植物の製造方法であって
１）形質転換向上処理を行うこと、及び
２）共存から再分化までの全ての工程で選抜薬剤を用いた形質転換細胞の選抜を行わないこと
を特徴とする。
【００２５】
形質転換向上処理
本発明は、形質転換向上処理を行うことを特徴の１つとする。本発明の方法において、「形質転換向上処理」とは、当該処理を行うことにより、得られる形質転換植物の割合が向上する処理をいう。限定されるわけではないが、具体的には、目的遺伝子の植物細胞への導入効率を向上させる処理、未熟胚などからのカルス誘導率を向上させる処理、形質転換カルスからの再分化効率を向上させる処理などが挙げられる。このような形質転換向上処理としては、限定されるものではないが、例えば以下のようなものあるいはこれらの組み合わせが含まれる。
【００２６】
熱処理（参照：ＷＯ９８／５４９６１）、
遠心処理（参照：ＷＯ０２／１２５２０）、
熱及び遠心処理（参照：ＷＯ０２／１２５２１）、
加圧処理（参照：ＷＯ２００５／０１７１６９）、
硝酸銀および／または硫酸銅の共存培地への添加（参照：ＡｇＮＯ３（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ２００１、Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． ２００３；ＣｕＳＯ４（ＷＯ２００５／０１７１５２）、
粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理（参照：ＷＯ２００７／０６９６４３）、
共存工程後の、カルス増殖及び／または再分化工程における培地へのカルベニシリン添加（参照：Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ２００１、Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． ２００３）、
カルス増殖培地にＮ６無機塩（Ｃｈｕ １９７８）を添加する処理（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ２００１）、ならびに
共存培地にシステインを添加する処理（Ｆｒａｍｅ ｅｔ ａｌ． ２００２）。
【００２７】
このうち、熱処理、遠心処理、熱及び遠心処理、加圧処理、粉体の添加はいずれも遺伝子導入効率を向上させる処理であり、硝酸銀、硫酸銅、カルベニシリンの添加はカルス誘導率を向上させる効果がある。また、再分化培地への硫酸銅の添加は再分化効率を向上させる。
【００２８】
限定されるわけではないが、熱処理は例えばＷＯ９８／５４９６１に記載の方法を用いて行うことができる。例えば、植物材料をアグロバクテリウム菌と接触させる前に、３３℃ないし６０℃、好ましくは３７℃ないし５２℃で、５秒間ないし２４時間、好ましくは１分間ないし２４時間、処理する。
【００２９】
遠心処理は、例えばＷＯ０２／１２５２０に記載の方法を用いて行うことができる。例えば、植物材料をアグロバクテリウム菌と接触させる前に、１００Gないし２５万G、好ましくは、５００Gないし２０万G、更に好ましくは１０００Gないし１５万Gの遠心加速度で、１秒間ないし４時間、更に好ましくは１秒間ないし２時間処理する。
【００３０】
熱及び遠心処理は例えばＷＯ０２／１２５２１に記載の方法を用いて行うことができる。熱処理及び遠心処理の条件は、例えば上述した条件を採用しうる。
加圧処理は、例えばＷＯ２００５／０１７１６９に記載の方法を用いて行うことができる。加圧処理は、限定されるわけではないが、好ましくは１．７気圧ないし１０気圧の範囲、より好ましくは２．４気圧ないし８気圧の範囲で行われる。
【００３１】
硝酸銀および／または硫酸銅の共存培地への添加は、例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ２００１、Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． ２００３、ＷＯ２００５／０１７１５２に記載されている。硝酸銀および／または硫酸銅は、例えば、１μＭないし５０μＭ、好ましくは１μＭないし１０μＭの濃度で、共存培地に添加しうる。
【００３２】
粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理は、例えばＷＯ２００７／０６９６４３に記載の方法を用いて行うことができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウム懸濁液と粉体を混合して植物材料に接種する、あるいは、植物と粉体を混合してこれにアグロバクテリウムを接種する、といった方法で行う。粉体は、限定されるものではないが、多孔質の粉体、グラスウールまたは活性炭であり、好ましくは多孔性セラミックス、グラスウールまたは活性炭、さらに好ましくはハイドロキシアパタイト、シリカゲル、グラスウールである。
【００３３】
カルス増殖培地にＮ６無機塩を添加する処理（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ２００１）では、カルス増殖培地にＮ６無機塩（Ｃｈｕ １９７８）を添加することにより行う。
共存培地にシステインを添加する処理では、システインを１０ｍｇ／ｌないし１ｇ／ｌ、好ましくは５０ｍｇ／ｌないし７５０ｍｇ／ｌ、より好ましくは１００ｍｇ／ｌないし５００ｍｇ／ｌで、共存培地に添加しうる。
【００３４】
共存工程後の、カルス増殖及び／または再分化工程における培地へのカルベニシリン添加は、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ２００１、またはＩｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． ２００３に記載の方法を用いて行うことができる。カルベニシリンは、カルス増殖用培地、及び／または再分化工程に例えば、５０ｍｇ／ｌないし５００ｍｇ／ｌ、好ましくは１００ｍｇ／ｌないし３００ｍｇ／ｌの濃度で添加しうる。なお、カルベニシリンは抗生物質であるが、植物に対してほとんど毒性がなく、培地中の微生物の増殖を防ぐ目的で利用することができる。
【００３５】
当業者は、これらの処理を適切なタイミング・条件で行うことができる。また、これらを適宜組み合わせることは、形質転換効率向上のために一層好ましい。例えば、またトウモロコシであれば、熱及び遠心処理、粉体処理、共存培地へのＡｇＮＯ３及び／又はＣｕＳＯ４の添加処理、カルス増殖培地および／または再分化培地中の抗生物質としてカルベニシリン添加処理のうち２つ以上を組み合わせることが望ましい。イネでは、熱処理および／または遠心処理を含むことが好ましく、カルス増殖培地および／または再分化培地中の抗生物質としてカルベニシリン添加処理を組み合わせることが最も好ましい。
【００３６】
従って、好ましい形質転換向上処理は、熱処理、遠心処理、熱及び遠心処理、加圧処理、共存培地にＡｇＮＯ３および／またはＣｕＳＯ４を添加する処理、あるいは粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理、カルス増殖培地および／または再分化培地中の抗生物質をカルベニシリンにする処理、またはこれらの組み合わせである。
【００３７】
本発明者らは、これらの処理を行うことで、最終的に得られる再分化個体中の形質転換個体の数を十分に増加させることに成功し、形質転換細胞の選抜処理を行わなくても十分な形質転換個体が得られることを見出し、実用に足る無選抜形質転換方法を確立した。
【００３８】
これらの形質転換個体は、導入遺伝子の有無をＰＣＲなどの手法で確認することにより、また後代個体であれば導入遺伝子の表現型を確認することにより、容易に選抜することができる。
【００３９】
形質転換細胞の選抜
本発明は、共存から再分化までの植物形質転換のためのいずれの工程でも、アグロバクテリウムにより導入される核酸の特性を利用した形質転換細胞の選抜を行わないことを特徴とする。
【００４０】
アグロバクテリウムにより導入される核酸の特性を利用した形質転換細胞の選抜の例として、選抜薬剤に対する耐性遺伝子と選抜薬剤を用いた形質転換細胞の選抜が挙げられる。
【００４１】
「選抜薬剤に対する耐性遺伝子と選抜薬剤を用いた形質転換細胞の選抜」とは、共存から再分化までの植物形質転換のためのいずれの工程において、形質転換植物を選抜するための薬剤を添加した培地での培養を行い、選抜薬剤に対する耐性の有無により形質転換された細胞を選抜することを意味する。本発明はこのような工程を全く含まない。
【００４２】
従来の技術で使用されてきた選抜薬剤の例は、抗生物質および／または除草剤である。抗生物質としては、植物に対して毒性を有するもの、例えば、ハイグロマイシン、カナマイシン、またはブラストサイジンＳ等が、除草剤としては、例えば、フォスフィノスライシン、ビアラフォス、またはグリホセート等が使用されてきた。
【００４３】
本工程のために、アグロバクテリウム中のＴ−ＤＮＡ中に挿入したＤＮＡは、植物に発現させることを意図する遺伝子のみならず、選抜薬剤に対する耐性遺伝子を含むことが必要であった。このような選抜薬剤に対する耐性遺伝子は当該技術分野においては公知である。例えばハイグロマイシンを選抜薬剤として含む再分化培地において再分化工程が行われる場合、植物にはアグロバクテリウムからハイグロマイシン耐性遺伝子が導入されていることが必要である。
【００４４】
本発明では、薬剤を用いた選抜工程を行わないため、選抜薬剤に対する耐性遺伝子、即ち、選抜マーカー遺伝子をアグロバクテリウムにより導入される核酸が有する必要がない。よって、限定されるわけではないが、好ましい態様において、本発明ではこのような核酸を含まない。
【００４５】
あるいは、従来法として、形質転換植物の選抜は、植物細胞の「栄養要求性選抜」、例えば「糖要求性」に基づいて行われることもある。
糖要求性の場合、植物細胞が利用できる糖はシュークロース、グルコースなどがあるが、マンノースは利用できないことが知られている。したがって、マンノースのみを炭素源とする培地で植物組織を培養すると、利用できる糖がないために植物組織は枯死する。糖要求性に基づく選抜はこの原理を利用するものである。糖要求性に基づき形質転換植物の選抜を行う場合には、植物組織には、アグロバクテリウムから通常植物細胞が利用できない糖類を利用可能にする遺伝子が導入されている。このような遺伝子は当該技術分野において公知であり、例えば、ＰＭＩ遺伝子、キシロースイソメラーゼ遺伝子等が使用可能である。本発明では、導入される核酸がこのような遺伝子を含む必要がない。
【００４６】
あるいは、従来法として、容易に検出可能な遺伝子をスクリーニングの指標として導入し、当該遺伝子の発現の有無により選抜することがある。このようなスクリーニングの指標となる遺伝子としては、ＧＦＰ遺伝子等があげられる。本発明では、導入される核酸がこのような遺伝子を含む必要がない。
【００４７】
本発明の方法において、選抜マーカー遺伝子とは、多数の非形質転換細胞の中にある形質転換細胞を選抜することを目的として、形質転換しようとする目的遺伝子（ＧＯＩ遺伝子）の他に、植物に導入する遺伝子を意味する。限定されるものではないが、この選抜マーカー遺伝子の例として、除草剤抵抗性遺伝子、抗生物質抵抗性遺伝子、蛍光遺伝子などが挙げられる。
【００４８】
形質転換植物の作成方法
アグロバクテリウムによる形質転換植物の作成方法は、一般に以下のＩ〜Ｖの工程の全部又は一部を含む。
【００４９】
Ｉ．植物材料の調製工程
ＩＩ．アグロバクテリウムの調製および接種工程
ＩＩＩ．共存工程
ＩＶ．カルス培養工程
Ｖ．再分化工程
Ｉ．植物材料の調製工程
本発明の対照となる植物はアグロバクテリウムを用いた形質転換導入方法が適用可能な植物である。好ましくは単子葉植物である。本発明の方法に供される単子葉植物には、好ましくはイネ科植物であり、イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、ソルガムその他が含まれるがこれらに限定されるものではない。本発明の方法に供される最も好ましい植物は、イネまたはトウモロコシである。
【００５０】
本発明の方法において、「植物材料」とは、アグロバクテリウム法による植物の形質転換に供試するための当該植物の細胞、葉、根、茎、芽、花（雄蕊、雌蕊等含む）、実、種子、発芽種子もしくはその他いずれかの部位の植物組織、成長点、外植片、未熟胚、カルスもしくは不定胚様組織（以下、本明細書においてカルス等、または単にカルスという）、または完全な植物体、などの植物のあらゆる態様を包含する。
【００５１】
本発明の方法に用いる植物材料の形態として好ましいのは未熟胚またはカルスであり、最も好ましいのは未熟胚である。本明細書において、植物の細胞、組織、完全な植物体という表現は、技術分野において一般的に用いられる意味で用いられる。本明細書において、未熟胚とは、受粉後の登熟過程にある未熟種子の胚および胚盤をいう。また、本発明の方法に供される未熟胚のステージ（熟期）は特に限定されるものではなく、受粉後いかなる時期に採取されたものであってもよい。もっとも、受粉後２日以降のものが好ましい。後述の形質転換後、後述の方法により、増殖し、正常な個体を再生する能力を有するカルスを誘導できる未熟胚胚盤を用いることが好ましい。また、未熟胚はインブレッド、インブレッド間のＦ１、インブレッドと自然受粉品種間のＦ１、市販Ｆ１品種の未熟胚であることが好ましい。本明細書において、カルスとは、無秩序に増殖する未分化状態の細胞塊をいう。カルスを得るためには、植物組織の分化した細胞をオーキシン（例えば、２，４−Ｄ）またはサイトカイニン等の植物成長調節物質を含む培地（脱分化培地という）において培養して得ることができる。このカルスを得るための処理を脱分化処理といい、またこの過程を脱分化過程という。
【００５２】
本工程において、必要に応じ、植物組織、未熟胚などを植物体、種子などから取り出し、形質転換に好適な植物材料を調製する。植物材料の調製は公知の方法によって行うことができる。また、所望により植物材料をアグロバクテリウムに感染させる前に培養してもよい。
【００５３】
ＩＩ．アグロバクテリウムの調製および接種工程
本発明において使用される植物材料はアグロバクテリウムを接種される。本明細書で使用する「接種する」とは、アグロバクテリウムを植物材料に接触することをいい、当該技術分野においては種々のアグロバクテリウムを接種する方法が公知である。当該方法としては、例えば、アグロバクテリウムを液体培地に懸濁した懸濁液に植物材料を加える方法、共存培地上の植物材料にアグロバクテリウムの懸濁液を直接滴下する方法、植物材料中にアグロバクテリウム菌懸濁液を注入する方法およびアグロバクテリウム懸濁液中に植物材料を浸漬し減圧する方法があげられる。しかしながら、本発明において使用されるアグロバクテリウムを接種された植物材料は、これらの方法によりアグロバクテリウムを接種された植物材料に限定されない。
【００５４】
当該アグロバクテリウムの接種工程においては、アグロバクテリウムによる形質転換効率を改善するために、例えば、アセトシリンゴン、界面活性剤、多孔性セラミックス等の種々の添加剤をアグロバクテリウムの懸濁液中に含ませることが可能である。
【００５５】
本発明に使用可能なアグロバクテリウムは公知のいずれのアグロバクテリウム属細菌であってよいが、好ましくはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓである。本発明の好ましい態様において、アグロバクテリウムは、例えば、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１およびＡＧＬ１、Ｃ５８Ｃ１等であるが、これに限定はされない。
【００５６】
土壌細菌アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）が多くの双子葉植物に根頭癌腫病（ｃｒｏｗｎ ｇａｌｌ ｄｉｓｅａｓｅ）を引き起こすことは古くから知られており、１９７０年代には、Ｔｉプラスミドが病原性に関与すること、さらにＴｉプラスミドの一部であるＴ−ＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれることが発見された。その後このＴ−ＤＮＡには癌腫の誘発に必要なホルモン（サイトカイニンとオーキシン）の合成に関与する遺伝子が存在し、細菌遺伝子でありながら植物中で発現することが明らかにされた。Ｔ−ＤＮＡの切り出しと植物への伝達にはＴｉプラスミド上のヴィルレンス領域（ｖｉｒ領域）に存在する遺伝子群が必要であり、またＴ−ＤＮＡが切り出されるためにはＴ−ＤＮＡの両端に存在するボーダー配列が必要である。他のアグロバクテリウム属細菌であるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓもＲｉプラスミドによる同様なシステムを有している（例えば、特開２０００−３４２２５６の図３および図４）。
【００５７】
アグロバクテリウムの感染によってＴ−ＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれるので、Ｔ−ＤＮＡ上に所望の遺伝子を挿入するとこの遺伝子も植物ゲノムに組み込まれることが期待された。しかしながら、Ｔｉプラスミドは１９０ｋｂ以上と巨大であるため、標準的な遺伝子工学的手法ではプラスミド上のＴ−ＤＮＡ上に遺伝子を挿入することは困難であった。そのため、Ｔ−ＤＮＡ上に外来遺伝子を挿入するための方法が開発された。
【００５８】
まず、腫瘍性のＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡからホルモン合成遺伝子が除去されたディスアーム型の菌系（ｄｉｓａｒｍｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ）であるＬＢＡ４４０４（Ｈｏｅｋｅｍａ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， （１９８３）， Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ．３０３， ｐ．１７９−１８０参照）、Ｃ５８Ｃ１（ｐＧＶ３８５０）、ＧＶ３Ｔｉ１１ＳＥなどが作製された。これらを用いることにより、所望の遺伝子をアグロバクテリウムのＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ中に、あるいは所望の遺伝子を有するＴ−ＤＮＡをアグロバクテリウムに導入する２種類の方法が開発された。このうちの一つは、遺伝子操作が容易で所望の遺伝子の挿入が可能であり、大腸菌で複製ができる中間ベクターを、アグロバクテリウムのディスアーム型ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域中に、三系交雑法（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ ｍａｔｉｎｇ）を介して相同組換えにより導入する方法であり、中間ベクター法と呼ばれる。
【００５９】
もう一つは、バイナリーベクター（ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ）法とよばれるもので、Ｔ−ＤＮＡの植物への組み込みにｖｉｒ領域が必要であるが、機能するために同じプラスミド上に存在する必要はないという結果に基づいている。このｖｉｒ領域にはｖｉｒＡ、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＣ、ｖｉｒＤ、ｖｉｒＥおよびｖｉｒＧが存在し、（植物バイオテクノロジー事典（エンタプライズ株式会社発行（１９８９）））、ｖｉｒ領域とはこのｖｉｒＡ、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＣ、ｖｉｒＤ、ｖｉｒＥおよびｖｉｒＧの全てを含むものをいう。バイナリーベクターは、Ｔ−ＤＮＡをアグロバクテリウムと大腸菌の両方で複製可能な小さなプラスミドに組み込んだものであり、これをディスアーム型Ｔｉプラスミドを有するアグロバクテリウムに導入して用いる。
【００６０】
アグロバクテリウムへのバイナリーベクターの導入は、エレクトロポレーション法や三系交雑法などの、公知の方法により行うことができる。バイナリーベクターには、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２などがあり、これらをもとに数多くの新たなバイナリーベクターが構築され、形質転換に用いられている。また、Ｒｉプラスミドのシステムにおいても、同様なベクターが構築され形質転換に用いられている。
【００６１】
アグロバクテリウムＡ２８１は、強病原性（ｓｕｐｅｒ−ｖｉｒｕｌｅｎｔ）の菌系であり、その宿主範囲は広く、形質転換効率も他の菌系より高い。この特性は、Ａ２８１が有するＴｉプラスミドのｐＴｉＢｏ５４２によるものである。ｐＴｉＢｏ５４２を用いて、これまでに２つの新しいシステムが開発されている。一つはｐＴｉＢｏ５４２のディスアーム型のＴｉプラスミドを有する菌系ＥＨＡ１０１およびＥＨＡ１０５を用いたものであり、これらを上述のバイナリーベクターシステムに適用することにより、形質転換能力の高いシステムとして種々の植物の形質転換に利用されている。
【００６２】
もう一つは、スーパーバイナリーベクターシステムである。スーパーバイナリーベクター（’ｓｕｐｅｒ−ｂｉｎａｒｙ’ ｖｅｃｔｏｒ）については、例えば本明細書中に援用される以下の文献に記載されている。
【００６３】
Ｈｉｅｉ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９４）， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， Ｖｏｌ．６， ｐ．２７１−２８２；
Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９６）， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．４， ｐ．７４５−７５０；
Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． ａｎｄ Ｋｕｂｏ Ｔ．， （１９９９）， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ： Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｉｎ Ｖａｓｉｌ， Ｉ． Ｋ． （ｅｄ．） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｒｅａｌ ｃｒｏｐｓ．， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ， ｐ．４３−８２；および
国際公開第９５／０６７２２号パンフレット
スーパーバイナリーベクターシステムについては、例えば特開２０００−３４２２５６の図４に記載されている。
【００６４】
このシステムは、ｖｉｒ領域（ｖｉｒＡ、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＣ、ｖｉｒＤ、ｖｉｒＥおよびｖｉｒＧ（以下、これらをそれぞれ「ｖｉｒ断片領域」ということもある。））を持つディスアーム型のＴｉプラスミドおよびＴ−ＤＮＡを有するプラスミドからなることから、バイナリーベクターシステムの一種である。しかしながら、Ｔ−ＤＮＡを有する側のプラスミド、即ちバイナリーベクターにｖｉｒ断片領域のうち、少なくとも一つのｖｉｒ断片領域を実質的に取除いたｖｉｒ領域の断片（このうち好ましくは少なくともｖｉｒＢまたはｖｉｒＧを含む断片、さらに好ましくはｖｉｒＢおよびｖｉｒＧを含む断片）を組み込んだスーパーバイナリーベクターを用いる点で異なる。なお、スーパーバイナリーベクターを有するアグロバクテリウムに、所望の遺伝子を組み込んだＴ−ＤＮＡ領域を導入するには、三系交雑法を介した相同組換えが容易な手法として利用できる。
【００６５】
本発明の方法においては、宿主となるアグロバクテリウム属細菌としては、特に限定されないが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（例えば上述のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４（Ｈｏｅｋｅｍａ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， （１９８３）， Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ．３０３， ｐ．１７９−１８０を参照）およびＥＨＡ１０１）を好ましく用いることができる。
【００６６】
本発明の方法によれば、アグロバクテリウム属細菌における病原性（ｖｉｒ）領域の遺伝子群の発現に基づく遺伝子導入系であれば、特に限定されることなく本発明の効果を得ることができる。
【００６７】
例えば、上述した中間ベクター、バイナリーベクター、強病原性のバイナリーベクター、スーパーバイナリーベクターなどいずれのベクターシステムに対しても用いることができ、本発明による効果を得ることができるが、強病原性のバイナリーベクター、スーパーバイナリーベクターが、形質転換効率がより向上するため、好ましい。（特に導入先植物がトウモロコシの場合には、スーパーバイナリーベクターを使用することが好ましい）。これらのベクター類を改変した、異なるベクターシステムを用いた場合においても同様である（例えば、アグロバクテリウム属細菌のｖｉｒ領域の一部または全部を切り出し付加的にプラスミド中に組み込む、ｖｉｒ領域の一部または全部を切り出し新たなプラスミドの一部としてアグロバクテリウムに導入するなど）。
【００６８】
植物に導入しようとする所望の遺伝子は、上記プラスミドのＴ−ＤＮＡ領域中の制限酵素部位に常法により組み込むことができる。大型で多数の制限部位を持つものは、通常のサブクローニングの手法では所望のＤＮＡをＴ−ＤＮＡ領域内に導入することが必ずしも容易でないことがある。このような場合には、三系交雑法により、アグロバクテリウム属細菌の細胞内での相同組換えを利用することで目的のＤＮＡを導入することができる。限定されるわけではないが、導入される遺伝子の大きさは好ましくは約１００ｂｐないし２００ｋｂｐである。
【００６９】
また、プラスミドをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ等のアグロバクテリウム属細菌に導入する操作は従来法により行うことができ、例としては、上記した三系交雑法やエレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法などが含まれる。
【００７０】
植物に導入しようとする遺伝子は、従来の技術と同様に基本的にはＴ−ＤＮＡの左右境界配列の間に配置されるものである。しかし、プラスミドが環状であるため、境界配列の数は１つでもよく、複数の遺伝子を異なる部位に配置しようとする場合には、境界配列が３個以上あってもよい。また、アグロバクテリウム属細菌中で、ＴｉまたはＲｉプラスミド上に配置されてもよく、または他のプラスミド上に配置されてもよい。さらには、複数の種類のプラスミド上に配置されてもよい。
【００７１】
アグロバクテリウム属細菌を植物材料に接種することは、例えば、植物材料をアグロバクテリウム属細菌と単に接触させることによって行ってもよい。接種は、通常接種により行ってもよく、また、滴下接種により行ってもよい。
【００７２】
通常接種は、植物材料とアグロバクテリウム属細菌懸濁液（接種源）を混合して植物材料を当該懸濁液に浸漬し、浸漬した植物材料を取り出して、培地上に着床させて共存培養を行うことにより接種を行う方法である。例えば、１０６〜１０１１ｃｆｕ／ｍｌ程度の細胞濃度のアグロバクテリウム属細菌懸濁液を調製し、この懸濁液中に植物材料を３〜１０分間程度浸漬後、固体培地上で数日間共存培養することにより行うことができる。滴下接種は、培地上に着床させた植物材料上にアグロバクテリウム属細菌懸濁液を滴下し、滴下した懸濁液が乾いた後、植物材料を培地の別の場所あるいは別の培地上に着床させて共存培養を行うことにより接種を行う方法である。
【００７３】
ＩＩＩ．共存工程
本工程は、上記のようにアグロバクテリウムを接種した植物細胞を、アグロバクテリウムの共存下にて、オーキシン類を含む培地で培養することにより、植物細胞へのアグロバクテリウムからＤＮＡの導入を確実にする工程である。好ましくは、植物材料をアグロバクテリウムに感染させると同時に、あるいは感染後、アグロバクテリウムを除去する前に、植物材料をアグロバクテリウムと共存培養させる。
【００７４】
本工程で使用される培地は、本明細書中では「共存培地」という。共存培養には公知の培地を使用できる。例えば、ＬＳ−ＡＳ培地、ｎＮ６−ＡＳ培地、あるいはその他、Ｎ６Ｓ３−ＡＳ培地、２Ｎ６−ＡＳ培地（Ｈｉｅｉ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９４）， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， Ｖｏｌ．６， ｐ．２７１−２８２を参照）等の培地が知られている。
【００７５】
本発明において好ましくは、共存培地中にオーキシン類を添加する。オーキシン類は一般に植物材料を脱分化させる作用を有するために、本工程において、ほとんどの植物材料は一部または全部が脱分化組織（カルス）となる。オーキシン類としては、例えば、３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸（ダイカンバ）、４−アミノ−３，５，６−トリクロロピコリン酸（ピクロラム）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−D）、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５−T）、および／またはトリヨード安息香酸 (ＴＩＢＡ)が挙げられる。本発明の好ましい態様においては、共存培地中にダイカンバ、ピクロラム、２，４−Ｄ、２，４，５−Ｔ以外のオーキシン類は含まない。
【００７６】
限定されるわけではないが、ダイカンバ、ピクロラム、２，４Ｄ、２，４，５−Ｔなどのオーキシン類の共存培地中における総量は、好ましくは、０．１−５．０ｍｇ／ｌ、さらに好ましくは、０．５−３．０ｍｇ／ｌ、より好ましくは、１．０−２．０ｍｇ／ｌ、最も好ましくは、１．５ｍｇ／ｌである。
【００７７】
本発明者らは、植物材料がトウモロコシの場合、オーキシン類の中でも特にベンゾイック系除草剤に属するオーキシン活性を示す物質を共存培地に添加することにより、形質転換効率が一層向上し、選抜マーカー遺伝子を導入することなく、形質転換植物を得られることを見出した。
【００７８】
ベンゾイック系除草剤はその基本構造から、（ｉ）安息香酸型、（ｉｉ）サリチル酸型、（ｉｉｉ）ピコリン酸型、（ｉｖ）テレフタール酸型に分けられる（Ｔａｋｅｍａｔｓｕ、１９８２）。しかしながら、（ｉｖ）テレフタール酸型はオーキシン活性を示さないため、（ｉ）安息香酸型、（ｉｉ）サリチル酸型、（ｉｉｉ）ピコリン酸型のいずれかに属する除草剤が好ましく、より好ましくは（ｉｉ）サリチル酸型、（ｉｉｉ）ピコリン酸型のいずれかである。さらに好ましくは、ダイカンバ（Ｄｉｃａｍｂａ）（３，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｏ−ａｎｉｓｉｃ ａｃｉｄ）あるいはピクロラム（Ｐｉｃｌｏｒａｍ）（４−ａｍｉｎｏ−３，５，６−ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｉｃｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）である。従って、トウモロコシの場合には、共存培地にベンゾイック系除草剤に属するオーキシン活性を示す物質を添加することが最も好ましい。
【００７９】
あるいは、植物材料がイネの場合は、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−D）を添加することが好ましい。
本工程における「培養」とは、固化した共存培地の上または液体状の共存培地の中に植物材料を置床し、適切な温度、明暗条件および期間で生育させることをいう。共存培地の固化は、当該技術分野において公知の固化剤を添加することにより行うことができ、そのような固化剤としては、例えばアガロース等が知られている。本工程における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは２０℃−３５℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、本工程の培養は好ましくは暗所で行われるが、これに限定されない。本工程の培養期間もまた適宜選択可能であり、好ましくは１日−１０日、より好ましくは７日である。
【００８０】
ＩＶ．カルス培養工程
アグロバクテリウムによる植物の形質転換方法においては、一般にはカルス培養工程は必要と考えられてきた。
【００８１】
カルス増殖培地上に移し、カルス増殖させることにより、「形質転換した細胞の集団を含む細胞塊」を得ることができる。カルス増殖培地とは「脱分化状態の細胞を分裂、増殖するのに適当な植物ホルモンおよび栄養素を含む培地であり、一般的な形質転換試験では、形質転換していない細胞の増殖を阻害する薬剤（選抜圧）を添加し形質転換細胞を選択的に増殖させる“選抜培地”としても用いられる。よって本カルス増殖工程は、一般には上記共存工程を経た植物材料を、オーキシン類を含む培地で培養し、形質転換体を遺伝子の導入の有無により選抜する工程である。本工程で使用される培地は、本明細書中では「選抜培地」といい、遺伝子の導入の有無により選抜するために選抜薬剤等を含んでいる。
【００８２】
本工程は、従来法においては、培地の成分組成を変更して、複数回繰り返して行われている。例えば、複数回の選抜工程では、選抜薬剤の濃度を各選抜工程で上昇させることにより、薬剤選抜の確実性が増し、形質転換をした植物体を得られる可能性を上昇させることが可能となる。本選抜工程は、好ましくは少なくとも２回、より好ましくは３回行われる。複数回本工程が行われる場合、本工程は１回につき１０日−３週間程度の期間を要し、複数回の選抜工程全体で５−１０週間程度を要する。よって、アグロバクテリウムによる植物の形質転換方法において、本工程は最も時間を要する工程である。
【００８３】
従来のアグロバクテリウムによる植物の形質転換方法においては、本工程は必須の工程であると考えられてきた。しかしながら、本発明者らは「形質転換向上処理」により、カルス培養工程中を含む、共存から再分化までのいずれの工程においても選抜薬剤を用いた形質転換細胞の選抜を行わなくても形質転換が上手くいくことを初めて見いだし、本願発明を想到した。よって、本発明においては、好ましくは本工程を省略できる。即ち、共存培養後の組織をカルス増殖培地で培養する工程を、共存工程と再分化工程の間に含まない。これにより、作業効率が一層向上し、また形質転換工程をより短期間で行なえるため、より効率的に形質転換植物を得られることを見出した。本明細書中の実施例１−４では特にトウモロコシの場合に、カルス増殖工程を省略し植物形質転換に成功した例が記載されている。
【００８４】
あるいは、カルス増殖培地に選抜薬剤を添加せずに、カルス増殖工程を行ってもよい。この場合、カルス増殖は生じるが形質転換体の「選抜」は行われなない。
Ｖ．再分化工程
得られた細胞塊の再分化を行い、再分化個体を生育させ、そして、所望により完全な植物体を得る工程である。得られた形質転換細胞から完全な植物体を再生するには、公知の方法（例えば、Ｈｉｅｉ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９４）， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， Ｖｏｌ．６， ｐ．２７１−２８２； および、Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９６）， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１４， ｐ．７４５−７５０）により行うことができる。
【００８５】
本工程は、従来法および本発明のいずれにおいても必須の工程である。従来、再分化工程においても選抜薬剤による形質転換体の選抜が必須と考えられてきた。形質転換植物の選抜は、選抜薬剤を含む再分化培地で、共存工程を経た植物材料を培養し、選抜薬剤に対する耐性の有無により行われる。しかしながら、本発明は、共存から再分化までの植物形質転換のためのいずれの工程でも、選抜薬剤を用いた形質転換細胞の選抜を行わないことを特徴とする。よって、本発明においては、再分化工程においても選抜薬剤を用いた選抜を行わない。
【００８６】
本工程で使用される培地は、本明細書中では「再分化培地」といい、その特徴としてオーキシン類を含まないことが挙げられる。再分化培地として使用可能な培地は、例えば、ＬＳ無機塩類やＮ６無機塩類を基本とする培地、例えば具体的にはＬＳＺ培地等が使用可能である。しかしながら「再分化培地」は、選抜薬剤を含まない。
【００８７】
本発明における「再分化」とは、全部または一部が脱分化していた植物材料が、再び元の植物材料または植物体の性質を獲得することをいう。再分化工程に供することにより、脱分化組織が再分化し、完全な形質転換植物体を得ることが可能となる。植物が再分化したか否かは植物の形態を観察することにより容易に決定可能である。例えば、脱分化組織から茎や葉のような特定の分化した植物器官が現れるか否かにより決定することが可能である。
【００８８】
本明細書において、「ビガー」とは、再分化した植物の生育の旺盛さをいう。植物のビガーは当該技術分野で行われる公知の測定方法を用いて測定することが可能である。例えば、トウモロコシの場合は、再分化工程後に、再分化の見られなかった形質転換植物組織を０点、再分化した茎葉の最大長が５ｍｍ未満の形質転換植物組織を１点、再分化した茎葉の最大長が５ｍｍ以上２ｃｍ未満の形質転換植物組織を２点、そして再分化した茎葉の最大長が２ｃｍ以上の形質転換植物組織を３点、とスコアリングしすべての形質転換植物組織の平均値を計算することにより求めることが可能である。ビガーの評価方法はこれに限定されることなく評価対象等に依存して、適当な修正を周知の方法に加えることも可能である。
【００８９】
本工程における「培養」とは、固化した再分化培地の上または液体状の再分化培地の中に植物組織を置床し、適切な温度、明暗条件および期間にて生育させることをいう。再分化培地の固化は、上記のように例えば寒天等により行うことが可能である。本工程における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは２０℃−３５℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、本工程の培養は好ましくは１６−２４時間／日の照明下で行われるが、これに限定されない。本工程の培養期間もまた適宜選択可能であり、好ましくは７日−２１日、より好ましくは１４日である。
【００９０】
本工程の後においては、当該技術分野において公知の方法を用いることにより容易に完全な形質転換植物体を得ることが可能である。得られた再分化個体について、導入遺伝子の有無を確認し、形質転換個体を特定する工程である。限定するものではないが、ＰＣＲやサザン分析などを好ましく用いることができる。また導入遺伝子の表現型を確認することにより、容易に選択することができる。
【発明の効果】
【００９１】
本発明により、単子葉植物の形質転換方法において、所望の植物に、植物選抜マーカー遺伝子を導入することなく、安定で効率的な形質転換を行うことができる。
【実施例】
【００９２】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１ 通常法で接種したトウモロコシ未熟胚から無選抜で再分化した植物体での遺伝子発現
１．材料および方法
受粉後７から１４日目のトウモロコシ（品種：Ａ１８８）の未熟胚（大きさ１．０−１．５ｍｍ）を無菌的に採取し、ＬＳ−ｉｎｆ液体培地（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９６）で１回洗浄した。形質転換向上処理として遺伝子導入効率を高めるための前処理（４６℃、３分間の熱処理および２０，０００ｘｇ、１０分間の遠心処理）を行った（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。１００μＭアセトシリンゴンを含むＬＳ−ｉｎｆ液体培地に約１．０ｘ１０９ ｃｆｕ／ｍｌでアグロバクテリウム菌系ＬＢＡ４４０４ （ｐＳＢ１３４）（Ｈｉｅｉ ａｎｄ Ｋｏｍａｒｉ， ２００６）を懸濁し接種源とした。
【００９３】
熱・遠心処理した未熟胚に接種源を加え、３０秒間撹拌した後、５分間室温で静置した。２，４−Ｄ（２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ−ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を除き、５μＭ ＡｇＮＯ３および５μＭ ＣｕＳＯ４を含むＬＳ−ＡＳ培地（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． １９９６、固化剤は８ｇ／ｌアガロース）に１．５ｍｇ／ｌの濃度でダイカンバ（Ｄｉｃａｍｂａ）（３，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｏ−ａｎｉｓｉｃ ａｃｉｄ）を添加した共存培地にアグロバクテリウムを接種した未熟胚を胚盤が上になるように置床した。
【００９４】
２５℃、暗黒下で７日間培養した未熟胚を１０μＭ ＣｕＳＯ４を含むＬＳＺ培地（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． １９９６）に置床し、２５℃、照明下で約２週間培養した。再分化のみられた植物体の葉の一部を切り取り０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に浸漬し、３７℃で１時間静置した。リン酸緩衝液を除いた後、１．０ｍＭ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ｇｌｕｃ）および２０％メタノールを含むリン酸緩衝液を添加した。３７℃で２４時間処理した後、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。
【００９５】
以下に、実施例１の条件をまとめた。
材料： トウモロコシ 未熟胚
方法： 通常法でアグロバクテリウム接種
形質転換向上処理： 熱及び遠心処理、培地にＡｇ＋、Ｃｕ２＋イオンを添加する処理
共存培地へのオーキシンの添加： ダイカンバ
共存培養後、カルス増殖工程を経ず、直接再分化工程へ。
【００９６】
ベクター： ｐＳＢ１３４ ＧＵＳ遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子（選抜マーカー遺伝子）を有し、かつ強病原性菌株の病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクター
選抜処理： 全工程においてなし
２．結果
ＬＳＺ培地に置床した１６の未熟胚の全てから植物体の再分化がみられた。４から１３枚の葉片を各未熟胚から再分化した植物より採取し、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。
【００９７】
２つの未熟胚由来の葉片は全てがＧＵＳ陰性であった。残りの１４の未熟胚から採取した葉片では少なくとも１枚の葉片でＧＵＳ遺伝子の発現がみられた。ドット状の発現を示す葉片は５つの未熟胚でみられた。ストライプ状にＧＵＳ遺伝子を発現する葉片は６つの未熟胚でみられた。ドット状、ストライプ状に発現する葉片を両方有した未熟胚は２つみられた。ここで、ストライプ状に発現したものは、形質転換細胞と非形質転換細胞のキメラであること、ドット状に発現したものは、一部の形質転換細胞でジーンサイレンシングが起こっていることが推測される。切り口が一様に青く染色されるＧＵＳ陽性の葉片は１つの未熟胚から得られた。
【００９８】
本実施例の結果は、共存から再分化までのいずれの工程においても、抗生物質などを用いた選抜工程を全く行わない条件でＧＵＳ遺伝子の形質転換されたトウモロコシ植物が得られたことを示す。
【００９９】
実施例２ 滴下法で接種したトウモロコシ未熟胚から無選抜で再分化した植物体での遺伝子発現
１．材料および方法
実施例１と同様の方法で調整したアグロバクテリウム菌系ＬＢＡ４４０４ （ｐＳＢ１３４）の接種源１ｍｌに約８０ｍｇのハイドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を添加した。形質転換向上処理として遺伝子導入効率を高めるための前処理（４６℃、３分間の熱処理および２０，０００ｘｇ、１０分間の遠心処理）を行った。
【０１００】
上記処理後未熟胚（品種Ａ１８８）を２，４−Ｄを除き、５μＭ ＡｇＮＯ３および５ μＭ ＣｕＳＯ４を含むＬＳ−ＡＳ培地（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． １９９６、固化剤は８ｇ／ｌアガロース）に１．５ｍｇ／ｌの濃度でダイカンバを添加した共存培地に胚盤が上になるように置床した。
【０１０１】
接種源中のハイドロキシアパタイトが均等に分散するようにボルテックスミキサーで撹拌した後、５μｌの接種源を未熟胚上に滴下した。滴下した接種源が乾いた後、未熟胚を同培地上の別の場所に移動した。培養器をシールした後、２５℃、暗黒下で７日間共存培養を行った。共存培養後の未熟胚を実施例１と同様の方法で培養し、再分化植物を得るとともに再分化植物の葉でのＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。
【０１０２】
以下に実施例２の条件をまとめた。
材料： トウモロコシ 未熟胚
方法： 滴下法でアグロバクテリウム接種
形質転換向上処理： 粉体処理、熱及び遠心処理、培地にＡｇ＋、Ｃｕ２＋イオンを添加する処理
共存工程へのオーキシン添加： ダイカンバ
共存培養後、カルス増殖工程を経ず、直接再分化工程へ。
【０１０３】
ベクター： ｐＳＢ１３４ ＧＵＳ遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子（選抜マーカー遺伝子）を有し、かつ強病原性菌株の病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクター
選抜処理： 全工程においてなし
２．結果
ＬＳＺ培地に置床した１２の未熟胚の全てから植物体の再分化がみられた。３から１７枚の葉片を各未熟胚から再分化した植物より採取し、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。３つの未熟胚由来の葉片は全てがＧＵＳ陰性であった。残りの９の未熟胚から採取した葉片では少なくとも１枚の葉片でＧＵＳ遺伝子の発現がみられた。ドット状の発現を示す葉片は３つの未熟胚でみられた。ドット状、ストライプ状に発現する葉片を両方有した未熟胚は４つみられた。切り口が一様に青く染色されるＧＵＳ陽性の葉片は２つの未熟胚から得られた。
【０１０４】
本実施例の結果は、共存から再分化までのいずれの工程においても、抗生物質などを用いた選抜工程を全く行わない条件でＧＵＳ遺伝子の形質転換されたトウモロコシ植物が得られたことを示す。
【０１０５】
実施例３ 共存培地中のオーキシンがトウモロコシ未熟胚から無選抜で再分化した植物体での遺伝子発現に及ぼす効果
１．材料及び方法
受粉後７から１４日目のトウモロコシ（品種：Ａ１８８）の未熟胚（大きさ１．０−１．５ｍｍ）を無菌的に採取し、ＬＳ−ｉｎｆ液体培地で１回洗浄した。形質転換向上処理として遺伝子導入効率を高めるための前処理（４６℃、３分間の熱処理）を行った。１００μＭアセトシリンゴンを含むＬＳ−ｉｎｆ液体培地にアグロバクテリウム菌系ＬＢＡ４４０４ （ｐＳＢ１２４）（Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６）を懸濁し接種源とした。
【０１０６】
熱処理した未熟胚に接種源を加え、３０秒間撹拌した後、５分間室温で静置した。２，４−Ｄ（２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ−ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を除き、５μＭ ＡｇＮＯ３および５μＭ ＣｕＳＯ４を含むＬＳ−ＡＳ培地（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． １９９６、固化剤は８ｇ／ｌアガロース）に６．８μＭの濃度でダイカンバ（３，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｏ−ａｎｉｓｉｃ ａｃｉｄ）あるいはピクロラム（Ｐｉｃｌｏｒａｍ）（４−ａｍｉｎｏ−３，５，６−ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｉｃｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）を添加した共存培地にアグロバクテリウムを接種した未熟胚を胚盤が上になるように、２４個の未熟胚を置床した。
【０１０７】
一方、５μＭ ＡｇＮＯ３および５μＭ ＣｕＳＯ４を含むＬＳ−ＡＳ培地に対し、オーキシンとして１．５ｍｇ／ｌ（６．８μＭ）の２，４−Ｄを含ませたものも実験した。２４個の未熟胚を置床した。
【０１０８】
２５℃、暗黒下で７日間培養した未熟胚を１０μＭ ＣｕＳＯ４を含むＬＳＺ培地（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． １９９６）に置床し、２５℃、照明下で約２週間培養した。再分化のみられた植物体の葉の一部を切り取り０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む０．１ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に浸漬し、３７℃で１時間静置した。リン酸緩衝液を除いた後、１．０ｍＭ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ｇｌｕｃ）および２０％メタノール含むリン酸緩衝液を添加した。３７℃で２４時間処理した後、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。
【０１０９】
以下に、実施例３の条件をまとめた。
材料： トウモロコシ 未熟胚
方法： 通常法でアグロバクテリウム接種
形質転換向上処理： 熱処理、培地にＡｇ＋、Ｃｕ２＋イオンを添加する処理
共存培地へのオーキシンの添加： ダイカンバ、ピクロラム又は２，４−Ｄ
共存培養後、カルス増殖工程を経ず、直接再分化工程へ。
【０１１０】
ベクター： ｐＳＢ１２４ ＧＵＳ遺伝子を有するが、選抜マーカー遺伝子を有しない、かつ強病原性菌株の病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクター
選抜処理： 全工程においてなし
２．結果
ダイカンバを含む共存培地で培養した未熟胚はＬＳＺ培地上で置床した２４の未熟胚の全てから植物体の再分化がみられた。各未熟胚から再分化した植物より葉を採取し、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。１３個の未熟胚由来の葉片は全てがＧＵＳ陰性であった。残りの１１の未熟胚から採取した葉片では少なくとも１枚の葉片でＧＵＳ遺伝子の発現がみられた。ドット状の発現やストライプ状の発現など、不完全な発現をした個体も数えた。
【０１１１】
ピクロラムを含む共存培地で培養した未熟胚もすべてがＬＳＺ培地上で植物体の再分化がみられた。１５個の未熟胚由来の葉片は全てがＧＵＳ陰性であった。残りの９つの未熟胚から採取した葉片では少なくとも１枚の葉片でＧＵＳ遺伝子の発現がみられた。
【０１１２】
２，４−Ｄを含む培地で共存培養を行った２４の未熟胚のうち、３つの未熟胚はＬＳＺ培地上で植物の再分化はみられなかった。再分化のみられた２１の未熟胚のうち、少なくとも１枚の葉片でＧＵＳ遺伝子の発現がみられたのは４未熟胚であった。
【０１１３】
このように、特にダイカンバおよびピクロラムを含む培地で共存培養を行った未熟胚では高い効率で植物体の再分化がみられ、かつ得られた再分化植物が導入遺伝子の発現を示す割合も高かった。２，４−Ｄを含む培地で共存培養を行った未熟胚でも導入遺伝子の発現が観察されたがやや低かった。
【０１１４】
本実施例の結果は、共存から再分化までのいずれの工程においても、抗生物質などを用いた選抜工程を全く行わない条件でＧＵＳ遺伝子の形質転換されたトウモロコシ植物が得られたことを示す。２，４−Ｄ、ダイカンバおよびピクロラムはいずれも除草活性を有する有機化合物のうちオーキシン活性を示す物質である。２，４−Ｄはフェノキシ系除草剤に属し、ダイカンバおよびピクロラムはベンゾイック系除草剤に属する点で異なる（竹松、１９８２）。このことは、トウモロコシでは、未熟胚から無選抜で効率よく形質転換植物を得るには、アグロバクテリウムを接種した未熟胚を共存培養する培地に含まれるオーキシンが、フェノキシ系除草剤に属する物質よりもベンゾイック系除草剤に属する物質の方が適していることを示す。
【０１１５】
実施例４ トウモロコシ未熟胚への熱及び遠心処理が無選抜で再分化した植物体での遺伝子発現に及ぼす効果
１．材料および方法
受粉後７から１４日目のトウモロコシ（品種：Ａ１８８）の未熟胚（大きさ１．０−１．５ｍｍ）を無菌的に採取し、ＬＳ−ｉｎｆ液体培地で１回洗浄した。形質転換向上処理として遺伝子導入効率を高めるための前処理（４６℃、３分間の熱処理および２０，０００ｘｇ、４℃、１０分間の遠心処理）を行った。対照としてこれらの前処理を行わない未熟胚を供した。１００μＭアセトシリンゴンを含むＬＳ−ｉｎｆ液体培地にアグロバクテリウム菌系ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１２４）を懸濁し接種源とした。
【０１１６】
熱および遠心の前処理をした未熟胚と対照の前処理を行わない未熟胚にそれぞれ接種源を加え、３０秒間撹拌した後、５分間室温で静置した。２，４−Ｄ（２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ−ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を除き、５μＭ ＡｇＮＯ３および５μＭ ＣｕＳＯ４を含むＬＳ−ＡＳ培地（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． １９９６、固化剤は８ ｇ／ｌアガロース）に６．８μＭの濃度でダイカンバ（３，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｏ−ａｎｉｓｉｃ ａｃｉｄ）を添加した共存培地にアグロバクテリウムを接種した未熟胚を胚盤が上になるように置床した。前処理を行った未熟胚、行わない未熟胚をそれぞれ７５個を供試した。試験は２回行った。
【０１１７】
２５℃、暗黒下で７日間培養した未熟胚を１０μＭ ＣｕＳＯ４を含むＬＳＺ培地（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． １９９６）に置床し、２５℃、照明下で約２週間培養した。再分化のみられた植物体の葉の一部を切り取り０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に浸漬し、３７℃で１時間静置した。リン酸緩衝液を除いた後、１．０ｍＭ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ｇｌｕｃ）および２０％メタノール含むリン酸緩衝液を添加した。３７℃で２４時間処理した後、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。
【０１１８】
以下に、実施例４の条件をまとめた。
材料： トウモロコシ 未熟胚
方法： 通常法でアグロバクテリウム接種
形質転換向上処理：
（１）熱及び遠心処理、培地にＡｇ＋、Ｃｕ２＋イオンを添加する処理
（２）熱及び遠心処理なし、培地にＡｇ＋、Ｃｕ２＋イオンを添加する処理はあり
共存培地へのオーキシンの添加： ダイカンバ
共存培養後、カルス増殖工程を経ず、直接再分化工程へ。
【０１１９】
ベクター： ｐＳＢ１２４ ＧＵＳ遺伝子を有するが、選抜マーカー遺伝子を有しない、かつ強病原性菌株の病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクター
選抜処理： 全工程においてなし
２．結果
１回目の試験では、熱及び遠心処理を行った７５の未熟胚から２９６のシュートが再分化した。このうち、葉の組織全体でＧＵＳ遺伝子の発現を示したのは５個体であった。これに対し、前処理を行わない７５の未熟胚から再分化のみられた２９１のシュートのうち、葉の組織全体でＧＵＳ遺伝子の発現を示した個体は０であった。２回目の試験では、熱・遠心処理を行った未熟胚から２４３のシュートが再分化し、葉の組織全体でＧＵＳ遺伝子の発現を示すＧＵＳ陽性の個体が４個体得られた。
【０１２０】
熱・遠心処理の前処理を行わない未熟胚では再分化のみられた２６６のシュートのうち、葉の組織全体でＧＵＳ遺伝子の発現を示したＧＵＳ陽性の個体は１個体であった。これらの結果から、特に熱・遠心の処理をアグロバクテリウムを接種する前の未熟胚に行うことにより、無選抜により再分化した植物の組織全体で導入遺伝子を発現する個体が効率よく得られることが示された。ただし、１個体のみ遺伝子導入の結果が得られたのは、硝酸銀及び硫酸銅の共存培地への添加の効果と思われる。
【０１２１】
実施例５ イネの無選抜形質転換
１．材料および方法
開花後８ないし１２日のイネ（品種：ゆきひかり）未熟種子を脱頴し、７０％エタノールで数秒、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を１滴含む１％次亜塩素酸ナトリウムで５分間処理した。未熟種子を滅菌水で数回洗浄し、１．３−１．８ｍｍの長さの未熟胚を採取した。ついで、形質転換向上処理として未熟胚に、遺伝子導入効率を高めるため、２０，０００ｘｇで１０分間の遠心処理を行った（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。１００μＭアセトシリンゴンを含むＡＡ−ｉｎｆ液体培地（Ｈｉｅｉ ａｎｄ Ｋｏｍａｒｉ， ２００６）に約１．０ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度でアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１３４）（Ｈｉｅｉ ａｎｄ Ｋｏｍａｒｉ， ２００６）を懸濁し接種源とした。遠心処理をした未熟胚をｎＮ６−Ａｓ培地（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６）上に胚盤側を上向きにして置床した。各未熟胚に接種源を５μｌずつ滴下し、２５℃暗黒下で、７日間共存培養を行った。
【０１２２】
共存培養後、各々の未熟胚をメスで４ないし５分割した。分割した未熟胚を２５０ｍｇ／ｌセフォタキシムと１００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含むｎＮ６培地（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６）へ胚盤側を上向きにして置床し、３０℃ 明条件下で約１０日間培養した。主に胚盤細胞の増殖により肥大した切片の各々をさらに４ないし５分割した。この段階で未熟胚あたり１８−２５個の切片を得た。切片を２５０ｍｇ／ｌセフォタキシムと１００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含むｎＮ６培地（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６）へ胚盤側を上向きにして置床し、３０℃明条件下で約２週間培養した。
【０１２３】
共存培養後、２回の培養を行うことによりカルス増殖させ、胚盤の個々の細胞はおよそ１４０倍に増殖し、切片はカルスで覆われた。なお、細胞の増殖比率は、各切片の大きさから推定された。切片に形成されたカルスの中から、切片毎に１カルスのみ（０．５−１ｍｍ大）を取り出し、Ｎ６Ｒ再分化培地（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６）へ置床し、３０℃明条件下で２週間培養した。各切片から１カルスのみを再分化培地へ置床したのは、ランダムかつ独立な細胞に由来する植物体を得るためである。各カルスから再分化した苗条塊（ｓｈｏｏｔ ｃｌｕｍｐ）をＮ６Ｆ発根培地（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６）に移植し、３０℃ 明条件下で約１０日間培養し、完全な再分化植物体を得た。なお上述した培地には、ハイグロマイシン、ビアラホスなどの選抜薬剤は一切含まれていない。
【０１２４】
得られた植物体の葉の一部を切り取り０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（登録商標）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に浸漬し、３７℃で１時間静置した。リン酸緩衝液を除いた後、１．０ｍＭ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ｇｌｕｃ）および２０％ メタノールを含むリン酸緩衝液を添加した。３７℃で２４時間処理した後、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。なお、ＧＵＳ遺伝子の発現の調査は、１切片につき最大で１植物体からの１枚の葉において実施した。形質転換効率は、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した植物数に対するＧＵＳ陽性（ＧＵＳを一様に発現）を示した植物体数の割合で評価した。
【０１２５】
また、再分化植物体のゲノムに導入遺伝子が組み込まれているかどうかを確認するため、以下の方法により、サザンブロット解析を行った。再分化植物体の葉からＫｏｍａｒｉ（１９８９）の方法によりＤＮＡを抽出し、各植物体につき７μｇのＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化したＤＮＡは、０．７％ アガロースゲル電気泳動（１．５Ｖ／ｃｍ、１５時間）に供した。サザンハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）の方法によって実施した。なお、プローブには、ＧＵＳ遺伝子断片であるｐＧＬ２−ＩＧ（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．， １９９４）のＳａｌＩ−ＳａｃＩ（１．９ｋｂ）断片を用いた。
【０１２６】
以下に実施例５の条件をまとめた。
材料： イネ 未熟胚
方法： 通常法でアグロバクテリウム接種
形質転換向上処理： 遠心処理、培地にセファタキシム、カルベニシリンを添加する処理
共存工程へのオーキシン添加： ２，４−Ｄ
共存培養後、カルス増殖工程を経て、直接再分化工程へ。
【０１２７】
ベクター： ｐＳＢ１３４ ＧＵＳ遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子（選抜マーカー遺伝子）を有し、かつ強病原性菌株の病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクター
選抜処理： 全工程においてなし
２．結果
試験は２回行った（試験１及び２）。試験１の結果を表１に示す。試験１では、５個の未熟胚より１００個の分割切片を得、それぞれから１００個のカルスを再分化培地に置床したところ、９２の植物体を得た。このうち７３の植物体について１枚ずつの葉でＧＵＳ遺伝子の発現を調査したところ、９個の植物体が、葉の組織全体でＧＵＳを一様に発現する（ＧＵＳ陽性）形質転換体であった。形質転換効率は、再分化植物体当たり１２．３％であった。
【０１２８】
試験２の結果を表２に示す。試験２では、５個の未熟胚より１０７個の分割切片を得、それぞれから１０７個のカルスを再分化培地に置床したところ、１００の植物体を得た。このうち９５の植物体について１枚ずつの葉でＧＵＳ遺伝子の発現を調査したところ、１６個の植物体がＧＵＳを一様に発現する形質転換体であった。その形質転換効率は、再分化植物体当たり１６．８％であった。以上のように選抜工程を全く経ることなく、再分化植物体当たり１０％以上という非常に高い効率で形質転換体が得られた。
【０１２９】
試験１および試験２ともにいくつかの植物体の葉片でＧＵＳ遺伝子の発現がドット状を呈した（表１および表２）。この異常な発現は、ジーンサイレンシングによるものと推測される。なお、このドット状の発現を示した植物体は形質転換体とは見なさなかった。
【０１３０】
サザンブロット解析の結果を、図１に示した。ＧＵＳ遺伝子の発現で陽性を示した再分化植物体は、調査した１１個体すべてにおいて導入ＧＵＳ遺伝子の存在が確認された（図１）。ＧＵＳ遺伝子の発現がドット状を示した再分化植物体においても、調査した６個体すべてでＧＵＳ遺伝子の存在が確認されたが、いずれの個体においても導入された遺伝子のコピー数が多い傾向があった（図１）。また、ＧＵＳ遺伝子の発現が陰性であった再分化植物体についても、サザンブロット解析を実施したが、供試した７植物体いずれにおいてもＧＵＳプローブとハイブリダイズするバンドは検出されなかった。
【０１３１】
本実施例では、遺伝子導入した未熟胚の胚盤細胞を増殖させ、その中からランダムに抽出したカルスより再分化植物体を得た。このうち１０％以上が形質転換した植物体であった。このことは、アグロバクテリウム感染により未熟胚の胚盤細胞の１０％以上が
形質転換されていることを示している。
【０１３２】
【表１】
【０１３３】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１は、無選抜形質転換により得られたゆきひかり再分化植物体のサザンブロット解析の結果を示す。 アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１３４）で形質転換し、無選抜得た再分化植物体よりゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に供したのち、ＧＵＳプローブとハイブリダイゼーションした。種子由来ゆきひかり（対照）（レーンＣ）、ＧＵＳ陽性発現（ＧＵＳを一様に発現）再分化植物体（レーン１−１１）、ＧＵＳドット状発現再分化植物体（レーン１２−１７）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のアグロバクテリウムによる形質転換植物の作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
主要穀類であるトウモロコシ、イネなどの単子葉植物の形質転換方法としては、従来より、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などが知られている。しかし、これらの物理的遺伝子導入方法は多コピーの遺伝子が導入されてしまう、遺伝子の挿入がインタクトな形でなされない、形質転換植物に奇形や不稔が多くみられるなどの問題を有している。
【０００３】
アグロバクテリウム属細菌を用いた遺伝子導入法は、双子葉植物の形質転換法として普遍的に用いられている。アグロバクテリウム属細菌の宿主は双子葉植物のみに限られ、単子葉植物には寄生しないとされている（Ｄｅ Ｃｌｅｅｎｅ ａｎｄ Ｄｅ Ｌｅｙ １９７６）が、アグロバクテリウムにより単子葉植物を形質転換する試みがなされている。
【０００４】
Ｇｒｉｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．はアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡの中にトウモロコシストリークウイルス（Ｍａｉｚｅ ｓｔｒｅａｋ ｖｉｒｕｓ）のＤＮＡを挿入したものをトウモロコシ生長点に接種したところ、トウモロコシストリークウイルスの感染を確認したことを報告している。トウモロコシストリークウイルスのＤＮＡを接種しただけでは、このような感染症状が認められないことから、上の観察はアグロバクテリウムがトウモロコシにＤＮＡを導入することができることを示すものと解釈している（Ｇｒｉｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ． １９８７）。しかし、ウイルスは核ゲノムに組み込まれなくても増殖する可能性があるので、この結果はＴ−ＤＮＡが核に組み込まれたものを示しているとはいえない。Ｇｒｉｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．はさらに感染効率はトウモロコシの茎頂の生長点に接種したときが最も高く（Ｇｒｉｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ． １９８８）、感染にはアグロバクテリウムのプラスミドのＶｉｒ Ｃ遺伝子が必須であることを示した（Ｇｒｉｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ． １９８９）。
【０００５】
Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．はトウモロコシの生長点に針で傷を付けた後、カナマイシン抵抗性遺伝子とＧＵＳ遺伝子を持った強病原性アグロバクテリウムＥＨＡ１を接種し、処理後の生長点をカナマイシンで選抜したところ、抵抗性を示す植物を得た。この後代の種子が導入した遺伝子を持つことを確認するためサザン分析を行ったところ、一部の種子で導入遺伝子が確認された（Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ． １９９１）。このことは、アグロバクテリウム処理された生長点からカナマイシン選抜により得られた植物体には形質転換細胞と非形質転換細胞が混在していたことを示す（キメラ現象）。
【０００６】
Ｍｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．は、アグロバクテリウムを用いてコムギの胚にカナマイシン抵抗性遺伝子の導入を試みた。まず、胚を酵素で処理することにより、細胞壁に傷を付け、その後アグロバクテリウムを接種した。処理したカルスのうち極めて少数のカナマイシン抵抗性と思われるカルスが増殖したが、このカルスから植物体の再生はできなかった。また、カナマイシン抵抗性遺伝子の存在をサザン分析で確認したところ、全ての抵抗性カルスで導入遺伝子の構造変異がみられた（Ｍｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ． １９９１）。
Ｒａｉｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．はイネの胚盤に傷を付けた後、強病原性のアグロバクテリウムＡ２８１ （ｐＴｉＢｏ５４２）をイネの８品種に処理したところ、日本晴、藤坂５号の２品種で腫瘍状の組織の増殖がみられた。さらに、Ｔ−ＤＮＡからホルモン合成遺伝子を除いたＴｉプラスミドにカナマイシン抵抗性遺伝子とＧＵＳ遺伝子を挿入したプラスミドを持つアグロバクテリウムをイネの胚に接種したところカナマイシン抵抗性カルスの増殖がみられた。この抵抗性カルスでは、ＧＵＳ遺伝子の発現が認められたが、形質転換植物を得ることはできなかった。これらのことから、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡがイネの細胞に導入されたと解釈している（Ｒａｉｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ． １９９０）。
【０００７】
このように、イネ、トウモロコシ、コムギ等のイネ科の作物でもアグロバクテリウムによる遺伝子導入が可能であることを示唆する研究報告がなされていたが、何れも再現性に問題があるほか、導入した遺伝子の確認についても不完全で、説得できる結果が示されていなかった（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ １９９０）。
【０００８】
Ｃｈａｎ ａｔ ｌ．は２，４−Ｄ共存下で２日間培養したイネ未熟胚に付傷後、ジャガイモ懸濁培養細胞を含む培地中でｎｐｔ ＩＩ遺伝子とＧＵＳ遺伝子を持ったアグロバクテリウムを接種した。処理した未熟胚をＧ４１８添加培地上で培養したところ、誘導されたカルスから再分化植物体が得られた。再分化植物体およびその後代の植物体でのＧＵＳ遺伝子の所在をサザン分析で確認したところ、再分化当代、後代いずれの植物体でも導入遺伝子の存在が認められたことを報告している（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ． １９９３）。この結果は、アグロバクテリウムによるイネの形質転換を支持するものであるが、形質転換効率は１．６％と非常に低く、供試した未熟胚数２５０に対し、正常な生長を示した再生植物体は１個体にすぎなかった。イネの未熟胚を摘出するには多大な労力を要するため、このように低い形質転換効率では実用的なレベルにあるとは言い難い。
【０００９】
近年、強病原性アグロバクテリウムの病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクターの利用により、イネ、トウモロコシなどの単子葉植物においても、安定して、高効率で形質転換のなされることが報告された（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ． １９９４， Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． １９９６）。これらの報告では、アグロバクテリウムによる形質転換は、安定して、高効率で形質転換がなされる他に、得られた形質転換植物に変異が少なく、導入された遺伝子はコピー数が少なく、かつインタクトな形のものが多いという利点をもつとしている。イネ、トウモロコシでの成功に続いて、主要な穀類であるコムギ（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９７）、オオムギ（Ｔｉｎｇａｙ ｅｔ ａｌ． １９９７）およびソルガム（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ２０００）でのアグロバクテリウムによる形質転換の報告がなされた。
【００１０】
アグロバクテリウムによるトウモロコシ形質転換の効率を改善する試みとしては、上記以外にも、Ｎ６基本培地での形質転換細胞の選抜（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ２００１）、培地へのＡｇＮＯ３およびカルベニシリンの添加（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ２００１、Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． ２００３）、共存培地へのシステインの添加（Ｆｒａｍｅ ｅｔ ａｌ． ２００２）などがなされてきた。このように培地組成や選抜マーカー遺伝子の改変により、アグロバクテリウムによるイネやトウモロコシの形質転換においても効率の向上がなされている。
【００１１】
これまでに報告されているアグロバクテリウムによるイネ・トウモロコシの形質転換方法では、そのほとんどが、アグロバクテリウムを接種した胚盤由来カルス、あるいはアグロバクテリウムを接種した未熟胚から誘導されたカルスについて、除草剤の成分や抗生物質を含む培地で形質転換カルスを選択的に増殖させ、得られた形質転換細胞塊を再分化培地に置床して再分化させる、という工程を経て形質転換植物を得ている（Ｄｅｊｉ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｎｅｇｒｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０００ａ； Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０００ｂ； Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｆｒａｍｅ ｅｔ ａｌ．， ２００２； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｆｒａｍｅ ｅｔ ａｌ． ２００６）。
【００１２】
植物の形質転換方法においては、形質転換細胞の選抜は形質転換植物の作出に不可欠であり、この工程がなければ植物の形質転換は成功しないとされてきた（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｅｒｉｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｊｏｅｒｓｂｏ ｅｔ ａｌ．， ２００１）。形質転換細胞の選抜は多くの場合、非形質転換細胞の増殖を阻害する薬剤に対して抵抗性を示す遺伝子を植物材料に導入する操作を行い、この薬剤を含む培地で植物材料を培養することにより、薬剤抵抗性遺伝子が植物細胞のゲノムに組み込まれ発現する形質転換細胞のみを選択的に増殖させる方法により行われる。
【００１３】
形質転換細胞の選抜に用いられる遺伝子（選抜マーカー遺伝子）のうち、最も一般的に使用される遺伝子は除草剤あるいは抗生物質に対する抵抗性を付与するものである（Ｋｕｉｐｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００１）。除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子としてはｂａｒ遺伝子やＥＰＳＰ遺伝子（Ｄｅ Ｂｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９８７； Ｃｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．， １９８５）、抗生物質に対する抵抗性を付与する遺伝子としてはＮＰＴＩＩ遺伝子やＨＰＴ遺伝子（Ｂｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８３； Ｗａｌｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８５）が植物の形質転換の選抜マーカー遺伝子として使用されることが多い。また近年、特定の糖の代謝能を利用したＰＭＩ遺伝子やＸｙｌＡ遺伝子（Ｊｏｅｒｓｂｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｈａｌｄｒｕｐ ｅｔ ａｌ．， １９９８）なども選抜マーカー遺伝子として有効であることが報告されている。形質転換された細胞を選択的に増殖させる機構を利用した選抜マーカー遺伝子としては、上述したものの他にも数多くの遺伝子が報告されている。そして、これらの遺伝子を用いた形質転換法では形質転換細胞を選択的に増殖させる選抜工程は必須であると考えられている。
【００１４】
花芽組織に減圧浸潤法を用いて形質転換を行うインプランタ形質転換法では、形質転換された種子は選抜工程を経ずに得られる（Ｂｅｎｔ， ２０００）。しかし、非形質転換種子が多数混在した種子の中から目的とする形質転換種子を得るためには抗生物質抵抗性遺伝子などを利用した選抜工程が必要となる。
【００１５】
ＧＦＰ遺伝子を導入し、紫外線照射下で蛍光を発する細胞を指標に可視的に形質転換部位を選抜し、形質転換植物を得る方法が報告されている（Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。この方法では、形質転換細胞は増殖の違いにより非形質転換細胞と混在した中からは選抜されることはないが、ＧＦＰ遺伝子の発現の有無により、形質転換細胞と非形質転換細胞を区別し、より分ける選抜工程が必要である。
【００１６】
選抜マーカー遺伝子を形質転換植物から除く技術として、コ・トランスフォーメーションシステム（Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６）、ＭＡＴベクターシステム（Ｅｂｉｎｕｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９７）およびＣｒｅＬｏｘシステム（Ｇｌｅａｖｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００３）が報告されている。これらのシステムを用いることにより、選抜マーカー遺伝子を含まない形質転換植物を得ることができる。しかし、選抜マーカーフリーの形質転換植物を作出する過程では、従来より用いられている薬剤耐性遺伝子や植物ホルモン合成遺伝子などを使用し、形質転換細胞と非形質転換細胞を区別し選抜する工程が必要である。
【００１７】
このように、植物の形質転換においてこれまでになされている方法では、形質転換細胞と非形質転換細胞を選り分ける選抜工程が不可欠であった。この選抜工程には、上記のように、目的とする遺伝子（ＧＯＩ遺伝子）の他に選抜を行うための選抜マーカー遺伝子が必要である。この選抜マーカー遺伝子が発現することにより産生されるタンパク質や酵素の働きにより生ずる反応、例えば除草剤抵抗性、抗生物質抵抗性や蛍光の発光などを利用し、多数の非形質転換細胞の中のごく一部の形質転換細胞を区別して増殖させ形質転換植物が得られる。しかし、選抜マーカー遺伝子は作出された形質転換植物には不要なものであり、さらに選抜マーカー遺伝子が形質転換植物に含まれたままでは、除草剤抵抗性遺伝子や抗生物質抵抗性遺伝子が形質転換体を介して一般の非組換え植物に伝播する危険は皆無とはいえないとして、形質転換植物の利用に不安を抱く一般消費者も多い。また、選抜マーカー遺伝子は多くの種類が報告されているものの、植物の種により適応できる選抜マーカー遺伝子は限定され、複数の遺伝子を分けて導入するときには問題となる。さらに形質転換体から選抜マーカー遺伝子を除く技術も報告されているが、これらの方法は通常の形質転換法よりも長い培養期間や後代植物での選抜マーカーフリー個体の選抜など、多大な労力を要する。
【００１８】
以上のように、これまでに形質転換植物の作出に関する報告が数多くなされているが、形質転換された細胞、組織、器官あるいは個体を、形質転換されていない細胞、組織、器官あるいは個体からより分ける選抜工程を経ずに形質転換体を得る方法は報告されていない。すなわち、ＧＯＩ（Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）遺伝子のみを導入して形質転換植物を得ることは現在まで不可能であったといえる。
【特許文献１】ＷＯ９８／５４９６１
【特許文献２】ＷＯ０２／１２５２０
【特許文献３】ＷＯ０２／１２５２１
【特許文献４】ＷＯ２００５／０１７１６９
【特許文献５】ＷＯ２００５／０１７１５２
【特許文献６】ＷＯ２００７／０６９６４３
【非特許文献１】Ｄｅ Ｃｌｅｅｎｅ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅ Ｌｅｙ， Ｊ． （１９７６） Ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｃｒｏｗｎ ｇａｌｌ． Ｂｏｔ． Ｒｅｖ． ４２：３８９−４６６．
【非特許文献２】Ｇｒｉｍｓｌｅｙ， Ｎ．， Ｈｏｒｎ， Ｔ．， Ｄａｖｉｓ， Ｊ．Ｗ． ａｎｄ Ｈｏｒｎ， Ｂ． （１９８７） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｍａｉｚｅ ｓｔｒｅａｋ ｖｉｒｕｓ ｉｎｔｏ ｍａｉｚｅ ｐｌａｎｔｓ． Ｎａｔｕｒｅ ３２５：１７７−１７９．
【非特許文献３】Ｇｒｉｍｓｌｅｙ， Ｎ．Ｈ．， Ｒａｍｏｓ， Ｃ．， Ｈｅｉｎ， Ｔ． ａｎｄ Ｈｏｒｎ， Ｂ． （１９８８） Ｍｅｒｉｓｔｅｍａｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｐｌａｎｔｓ ａｒｅ ｍｏｓｔ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ Ａｇｒｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍａｉｚｅ ｓｔｒｅａｋ ｖｉｒｕｓ． Ｂｉｏ／ｔｅｃｎｏｌｏｇｙ ６：１８５−１８９．
【非特許文献４】Ｇｒｉｍｓｌｅｙ， Ｎ．， Ｈｏｒｎ， Ｂ．， Ｒａｍｏｓ， Ｃ．， Ｋａｄｏ， Ｃ． ａｎｄ Ｒｏｇｏｗｓｋｙ， Ｐ． （１９８９） ＤＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｒｏｍ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｏ Ｚｅａ ｍａｙｓ ｏｒ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｂｙ ａｇｒｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２１７：３０９−３１６．
【非特許文献５】Ｇｏｕｌｄ， Ｊ．， Ｄｅｖｅｙ， Ｍ．， Ｈａｓｅｇａｗａ， Ｏ．， Ｕｌｉａｎ， Ｅ．Ｃ．， Ｐｅｔｅｒｓｏｎ， Ｇ． ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｒ．Ｈ． （１９９１） Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ． ｕｓｉｎｇ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ａｎｄ ｓｈｏｏｔ ａｐｅｘ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９５：４２６−４３４．
【非特許文献６】Ｍｏｏｎｅｙ， Ｐ．Ａ．， Ｇｏｏｄｗｉｎ， Ｐ．Ｂ．， Ｄｅｎｎｉｓ， Ｅ．Ｓ． ａｎｄ Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ， Ｄ．Ｊ． （１９９１） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｗｈｅａｔ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ２５：２０９−２１８．
【非特許文献７】Ｒａｉｎｅｒｉ， Ｄ．Ｍ．， Ｂｏｔｔｉｎｏ， Ｐ．， Ｇｏｒｄｏｎ， Ｍ．Ｐ． ａｎｄ Ｎｅｓｔｅｒ， Ｅ．Ｗ． （１９９０） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）． Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：３３−３８．
【非特許文献８】Ｐｏｔｒｙｃｕｓ， Ｉ （１９９０） Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｃｅｒｅａｌｓ： ａｎ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ． Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：５３５−５４２．
【非特許文献９】Ｃｈａｎ， Ｍ−Ｔ．， Ｃｈａｎｇ， Ｈ−Ｈ．， Ｈｏ， Ｓ−Ｌ．， Ｔｏｎｇ， Ｗ−Ｆ． ａｎｄ Ｙｕ， Ｓ−Ｍ． （１９９３） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ α−ａｍｙｌａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ／ β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｇｅｎｅ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２：４９１−５０６．
【非特許文献１０】Ｈｉｅｉ， Ｙ．， Ｏｈｔａ， Ｓ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． ａｎｄ Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ， Ｔ． （１９９４） Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ−ＤＮＡ． Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６：２７１−２８２．
【非特許文献１１】Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， Ｓａｉｔｏ， Ｈ．， Ｏｈｔａ， Ｓ．， Ｈｉｅｉ， Ｙ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． ａｎｄ Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ， Ｔ． （１９９６） Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ （Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．） ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：７４５−７５０．
【非特許文献１２】Ｃｈｅｎｇ， Ｍ．， Ｆｒｙ， Ｊ． Ｅ．， Ｐａｎｇ， Ｓ．， Ｚｈｏｕ， Ｈ．， Ｈｉｒｏｎａｋａ， Ｃ． Ｍ．， Ｄｕｎｃａｎ， Ｄ． Ｒ．， Ｃｏｎｎｅｒ， Ｔ． Ｗ．， Ｗａｎ， Ｙ． （１９９７） Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１５： ９７１−９８０．
【非特許文献１３】Ｔｉｎｇａｙ， Ｓ．， ＭｃＥｌｒｏｙ， Ｄ．， Ｋａｌｌａ， Ｒ．， Ｆｉｅｇ， Ｓ．， Ｗａｎｇ， Ｍ．， Ｔｈｏｒｎｔｏｎ， Ｓ．， Ｂｒｅｔｔｅｌｌ， Ｒ． （１９９７） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂａｒｌｅｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． １１： １３６９−１３７６．
【非特許文献１４】Ｚｈａｏ， Ｚ．−Ｙ．， Ｃａｉ， Ｔ．， Ｔａｇｌｉａｎｉ， Ｌ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｍ．， Ｗａｎｇ， Ｎ．， Ｐｅｎｇ， Ｈ．， Ｒｕｄｅｒｔ， Ｍ．， Ｓｃｈｏｅｄｅｒ， Ｓ．， Ｈｏｎｄｒｅｄ， Ｄ．， Ｓｅｌｔｚｅｒ， Ｊ．， Ｐｉｅｒｃｅ， Ｄ． （２０００） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｏｒｇｈｕｍ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４４： ７８９−７９８．
【非特許文献１５】Ｄｅｊｉ， Ａ．， Ｓａｋａｋｉｂａｒａ， Ｈ．， Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， Ｙａｍａｄａ， Ｓ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ．， Ｋｕｂｏ， Ｔ．， Ｓｕｇｉｙａｍａ， Ｔ． （２０００） Ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ ＺｍＲＲ１ ａｎｄ ＺｍＲＲ２ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４９２： ２１６−２２０．
【非特許文献１６】Ｎｅｇｒｏｔｔｏ， Ｄ．， Ｊｏｌｌｅｙ， Ｍ．， Ｂｅｅｒ， Ｓ．， Ｗｅｎｃｋ， Ａ． Ｒ．， Ｈａｎｓｅｎ， Ｇ． （２０００） Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅ−ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ａｓ ａ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ ｔｏ ｒｅｃｏｖｅｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍａｉｚｅ ｐｌａｎｔｓ （Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．） ｖｉａ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９： ７９８−８０３．
【非特許文献１７】Ｎｏｍｕｒａ， Ｍ．， Ｓｅｎｔｏｋｕ， Ｎ．， Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， Ａ．， Ｌｉｎ， Ｊ−Ｈ．， Ｈｏｎｄａ， Ｃ．， Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｍ．， Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， Ｏｈｔａ， Ｓ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ．， Ｍｉｙａｏ−Ｔｏｋｕｍｏｒｉ， Ｍ．， Ｋｏｎｏ−Ｍｕｒａｋａｍｉ， Ｙ．， Ｔａｊｉｍａ， Ｓ．， Ｋｕ， Ｍ． Ｓ． Ｂ．， Ｍａｔｓｕｏｋａ， Ｍ． （２０００ａ） Ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ４ ｐｌａｎｔｓ： ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ Ｃ４−ｔｙｐｅ ｐｙｒｕｖａｔｅ， ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２２： ２１１−２２１．
【非特許文献１８】Ｎｏｍｕｒａ， Ｍ．， Ｋａｔａｙａｍａ， Ｋ．， Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， Ａ．， Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， Ｏｈｔａ， Ｓ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ．， Ｍｉｙａｏ−Ｔｏｋｕｔｏｍｉ， Ｍ．， Ｔａｊｉｍａ， Ｓ．， Ｍａｔｓｕｏｋａ， Ｍ． （２０００ｂ） Ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ｒｂｃＳ ｉｎ ａ Ｃ３ ｐｌａｎｔ （ｒｉｃｅ） ｄｉｒｅｃｔｓ ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ， ｌｉｇｈｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ Ｃ４ ｐｌａｎｔ （ｍａｉｚｅ）， ｂｕｔ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｃｏｎｆｅｒ ｂｕｎｄｌｅ ｓｈｅａｔｈ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４４： ９９−１０６．
【非特許文献１９】Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｍ．， Ｉｚａｗａ， Ｋ．， Ｋｕ， Ｍ． Ｓ． Ｂ．， Ｌｉｎ， Ｊ−Ｈ．， Ｓａｉｔｏ， Ｈ．， Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， Ｏｈｔａ， Ｓ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ．， Ｍａｔｓｕｏｋａ， Ｍ．， Ｓｕｇｉｙａｍａ， Ｔ． （２０００） Ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｉｚｅ Ｃ４ ｐｙｒｕｖａｔｅ， ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｄｉｒｅｃｔｓ ｃｅｌｌ− ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍａｉｚｅ ｐｌａｎｔｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ４１： ４２−４８．
【非特許文献２０】Ｚｈａｏ， Ｚ．−Ｙ．， Ｇｕ， Ｗ．， Ｃａｉ， Ｔ．， Ｔａｇｌｉａｎｉ， Ｌ．， Ｈｏｎｄｒｅｄ， Ｄ．， Ｂｏｎｄ， Ｄ．， Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ， Ｓ．， Ｒｕｄｅｒｔ， Ｍ．， Ｐｉｅｒｃｅ， Ｄ． （２００１） Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｉｎ ｍａｉｚｅ． Ｍｏｌ． Ｂｒｅｅｄ． ８： ３２３−３３３．
【非特許文献２１】Ｆｒａｍｅ， Ｂ．Ｒ．， Ｓｈｏｕ， Ｈ．， Ｃｈｉｋｗａｍｂａ， Ｒ．Ｋ．， Ｚｈａｎｇ， Ｚ．， Ｘｉａｎｇ， Ｃ．， Ｆｏｎｇｅｒ， Ｔ．Ｍ．， Ｐｅｇｇ， Ｓ．Ｅ．Ｋ．， Ｌｉ， Ｂ．， Ｎｅｔｔｌｅｔｏｎ， Ｄ．Ｓ．， Ｐｅｉ， Ｄ．， Ｗａｎｇ， Ｋ． （２００２） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｔａｎｄａｒｄ ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２９： １３−２２．
【非特許文献２２】Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， Ｓａｉｔｏ， Ｈ．， Ｈｉｅｉ， Ｙ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． （２００３） Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ （Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．） ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：５７−６６．
【非特許文献２３】Ｚｈａｎｇ， Ｗ．， Ｓｕｂｂａｒａｏ， Ｓ．， Ａｄｄａｅ， Ｐ．， Ｓｈｅｎ， Ａ．， Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ， Ｃ．， Ｐｅｓｃｈｋｅ， Ｖ．， Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎ， Ｌ． （２００３） Ｃｒｅ／ｌｏｘ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍａｉｚｅ （Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．） ｐｌａｎｔｓ． Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １０７： １１５７−１１６８．
【非特許文献２４】Ｆｒａｍｅ， Ｂ．Ｒ．， ＭｃＭｕｒｒａｙ， Ｊ．Ｍ．， Ｆｏｎｇｅｒ， Ｔ．Ｍ．， Ｍａｉｎ， Ｍ．Ｌ．， Ｔａｙｌｏｒ， Ｋ．Ｗ．， Ｔｏｒｎｅｙ， Ｆ．Ｊ．， Ｐａｚ， Ｍ．Ｍ．， Ｗａｎｇ， Ｋ． （２００６） Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｍａｉｚｅ ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ＭＳ ｓａｌｔｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ２５： １０２４−１０３４．
【非特許文献２５】Ｈｉｅｉ， Ｙ．， Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， Ｋａｓａｏｋａ， Ｋ． ＆ Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ ａｎｄ ｍａｉｚｅ ｂｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｗｉｔｈ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｅａｔ ｐｒｉｏｒ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ８７， ２３３−２４３ （２００６）．
【非特許文献２６】Ｈｉｅｉ， Ｙ． ＆ Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｉｃａ ｒｉｃｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ８５， ２７１−２８３ （２００６）．
【非特許文献２７】Ｈｉｅｉ， Ｙ．， Ｏｈｔａ， Ｓ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． ＆ Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ， Ｔ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ−ＤＮＡ． Ｐｌａｎｔ Ｊ ６， ２７１−８２ （１９９４）．
【非特許文献２８】Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｎｉｎｅ ｐｌａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． ６０， ２２３−２２９ （１９８９）．
【非特許文献２９】Ｂｅｎｔ， Ａ．Ｆ． （２０００） Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｉｎ ｐｌａｎｔａ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｕｓｅｓ， ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ， ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １２４：１５４０−１５４７．
【非特許文献３０】Ｂｅｖａｎ， Ｍ．Ｗ．， Ｆｌａｖｅｌｌ， Ｒ．Ｂ．， Ｃｈｉｌｔｏｎ， Ｍ．−Ｄ． （１９８３） Ａ ｃｈｉｍａｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ａｓ ａ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｐｌａｎｔｓ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ， ３０４：１８４−１８７．
【非特許文献３１】Ｃｏｍａｉ， Ｌ．， Ｆａｃｃｉｏｔｔｉ， Ｄ．， Ｈｉａｔｔ， Ｗ．Ｒ．， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｇ．， Ｒｏｓｅ， Ｒ．Ｅ．， Ｓｔａｌｋｅｒ， Ｄ．Ｍ． （１９８５） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ ａｒｏＡ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｃｏｎｆｅｒｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ． Ｎａｔｕｒｅ， ３１７：７４１−７４４．
【非特許文献３２】Ｄｅ Ｂｌｏｃｋ， Ｍ．， Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ， Ｊ．， Ｖａｎｄｅｗｉｅｌｅ， Ｍ．， Ｄｏｃｋｘ， Ｊ．， Ｔｈｏｅｎ， Ｃ．， Ｇｏｓｓｅｌe， Ｖ．， Ｍｏｖｖａ， Ｎ．Ｒ．， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｃ．， Ｖａｎ Ｍｏｎｔａｇｕ， Ｍ．， Ｌｅｅｍａｎｓ， Ｊ． （１９８７） Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｅｔｏｘｉｆｙｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ． ＥＭＢＯ Ｊ．， ６：２５１３−２５１８．
【非特許文献３３】Ｅｂｉｎｕｍａ， Ｈ．， Ｓｕｇｉｔａ， Ｋ．， Ｍａｔｓｕｎａｇａ， Ｅ．， Ｙａｍａｋａｄｏ， Ｍ． （１９９７） Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ ａｓ ａ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ．， ９４：２１１７−２１２１．
【非特許文献３４】Ｅｌｌｉｏｔｔ， Ａ．Ｒ．， Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｊ．Ａ．， Ｂｒｅｔｔｅｌｌ Ｒ．Ｉ．Ｓ．， Ｇｒｏｆ， Ｃ．Ｐ．Ｌ． （１９９８） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｕｓｉｎｇ ＧＦＰ ａｓ ａ ｓｃｒｅｅｎａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ． Ａｕｓｔ． Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２５：７３９−７４３．
【非特許文献３５】Ｅｒｉｋｓｏｎ， Ｏ．Ｓ．， Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇ， Ｍ．， Ｎaｓｈｏｌｍ， Ｔ． （２００５） Ｔｈｅ ｄｓｄＡ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ５７：４２５−４３３．
【非特許文献３６】Ｇｌｅａｖｅ， Ａ．Ｐ．， Ｍｉｔｒａ， Ｄ．Ｓ．， Ｍｕｄｇｅ， Ｓ．Ｒ．， Ｍｏｒｒｉｓ， Ｂ．Ａ．Ｍ． （１９９９） Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｓｅｘｕａｌ ｃｒｏｓｓｉｎｇ： ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｌｅｔｈａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｇｅｎｅ． Ｐｌａｎｔ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４０：２２３−２３５．
【非特許文献３７】Ｈａｌｄｒｕｐ， Ａ．， Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｓ．Ｇ．， Ｏｋｋｅｌｓ， Ｆ．Ｔ． （１９９８） Ｔｈｅ ｘｙｌｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏｇｅｎｅｓ ａｌｌｏｗｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ Ｄ−ｘｙｌｏｓｅ ａｓ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ３７：２８７−２９６．
【非特許文献３８】Ｈｉｅｉ， Ｙ． ａｎｄ Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． （２００６） Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｉｃａ ｒｉｃｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ， ８５：２７１−２８３．
【非特許文献３９】Ｈｉｅｉ， Ｙ．， Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， Ｋａｓａｏｋａ， Ｋ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． （２００６） Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ ａｎｄ ｍａｉｚｅ ｂｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｗｉｔｈ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｅａｔ ｐｒｉｏｒ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ， ８７：２３３−２４３．
【非特許文献４０】Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， Ｓａｉｔｏ， Ｈ．， Ｏｈｔａ， Ｓ．， Ｈｉｅｉ， Ｙ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． ａｎｄ Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ， Ｔ． （１９９６） Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ （Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．） ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １４：７４５−７５０．
【非特許文献４１】Ｊｏｅｒｓｂｏ， Ｍ．， Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ， Ｉ．， Ｋｒｅｉｂｅｒｇ， Ｊ．， Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｓ．Ｇ．， Ｂｒｕｎｓｔｅｄｔ， Ｊ．， Ｏｋｋｅｌｓ， Ｆ．Ｔ． （１９９８） Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍａｎｎｏｓｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｇａｒ ｂｅｅｔ． Ｍｏｌ． Ｂｒｅｅｄ．， ４：１１１−１１７．
【非特許文献４２】Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ．， Ｈｉｅｉ， Ｙ．， Ｓａｉｔｏ， Ｙ．， Ｍｕｒａｉ， Ｎ．， Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ， Ｔ． （１９９６） Ｖｅｃｔｏｒｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｗｏ ｓｅｐａｒａｔｅ Ｔ−ＤＮＡｓ ｆｏｒ ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ａｎｄ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｆｒｅｅ ｆｒｏｍ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒｓ． Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， １０：１６５−１７４．
【非特許文献４３】Ｋｕｉｐｅｒ， Ｈ．Ａ．， Ｋｌｅｔｅｒ， Ｇ．Ａ．， Ｎｏｔｅｂｏｒｎ， Ｈ．Ｐ．Ｊ．Ｍ．， Ｋｏｋ， Ｅ．Ｊ． （２００１） Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｏｄ ｓａｆｅｔｙ ｉｓｓｕｅｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｆｏｏｄ． Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２７：５０３−５２８．
【非特許文献４４】Ｐｏｔｒｙｋｕｓ， Ｉ．， Ｂｉｌａｎｇ， Ｒ．， Ｆuｔｔｅｒｅｒ Ｊ．， Ｓａｕｔｔｅｒ， Ｃ．， Ｓｃｈｒｏｔｔ， Ｍ． （１９９８） Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｃｒｏｐ ｐｌａｎｔｓ． Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｅｒ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． １１９−１５９．
【非特許文献４５】竹松哲夫 （１９８２） 除草剤研究総覧 博友社 ７９−１５４．
【非特許文献４６】Ｗａｌｄｒｏｎ， Ｃ．， Ｍｕｒｐｈｙ， Ｅ．Ｂ．， Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｊ．Ｌ．， Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ， Ｇ．Ｄ．， Ａｒｍｏｕｒ， Ｓ．Ｌ．， Ｍａｌｃｏｌｍ， Ｓ．Ｋ． （１９８５） Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ： Ａ ｎｅｗ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ５：１０２−１０８．
【非特許文献４７】Ｚｈｕ， Ｙ．Ｊ．， Ａｓｂａｙａｎｉ， Ｒ．， Ｍｏｏｒｅ， Ｐ．Ｈ． （２００４） Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ａ ｖｉｓｕａｌ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｐａｐａｙａ （Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ Ｌ．） ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．， ２２：６６０−６６７．
【非特許文献４８】Ｃｈｕ， Ｃ．−Ｃ． （１９７８） Ｔｈｅ Ｎ６ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ａｎｔｈｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｃｅｒｅａｌ ｃｒｏｐｓ． Ｉｎ Ｐｒｏｃ． Ｓｙｍｐ． Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｐｅｋｉｎｇ： Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． ４３−５０．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
従来のアグロバクテリウム属細菌を介した単子葉植物への遺伝子導入方法において、選抜マーカー遺伝子導入を利用した、形質転換細胞、組織、器官あるいは個体の選抜工程は不可欠であった。本発明はこのような選抜工程を経ずに形質転換植物を得ることのできる方法を開発し、提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは上記課題解決のため鋭意研究に努めた結果、単子葉植物について形質転換効率向上処理を行うことにより、選抜マーカー遺伝子を導入することなく、実用的な効率で形質転換植物を得られることを見出した。
【００２１】
具体的には、本発明者らは、一般に、植物の形質転換工程では、外来遺伝子の組み込まれる植物細胞の数が非常に少ないことに着目し、形質転換の効率を大幅に向上させて、非形質転換細胞中に占める形質転換細胞の割合を高めてやり、それを植物体再分化まで維持することができれば、選抜マーカー遺伝子を利用した選抜工程を経ることなく形質転換植物を得られるのではないかと考えた。鋭意研究の結果、形質転換向上処理を適切に行うことにより十分実用的な効率で形質転換植物を得られることを見出し、本発明を想到した。
【００２２】
限定されるわけではないが本発明は、好ましい態様として下記の態様を含む。
［態様１］
（ｉ）アグロバクテリウムを接種した植物材料を、共存培地で培養する共存工程、及び
(ｉｉ）（ｉ）で得られた組織を、カルス増殖培養を行わず、あるいはカルス増殖培養を行った後に、再分化培地で培養し植物体を再分化させる工程
を含む、アグロバクテリウムを用いた形質転換植物の製造方法であって
１）形質転換向上処理を行うこと、及び
２）共存から再分化までのいずれの工程においても選抜薬剤を用いた形質転換細胞の選抜を行わないこと
を特徴とする、前記形質転換植物の作成方法。
［態様２］
３）共存培養後の組織をカルス増殖培地で培養する工程を、共存工程と再分化工程の間に含まないこと、をさらに特徴として有する、態様１に記載の形質転換植物の作成方法。
［態様３］
アグロバクテリウム菌により導入される核酸が選抜薬剤に対する耐性遺伝子を含まない、態様１又は２に記載の形質転換植物の作成方法。
［態様４］
１）形質転換向上処理が、目的遺伝子の植物細胞への導入効率を向上させる処理、未熟胚などからのカルス誘導率を向上させる処理、あるいは、形質転換カルスからの再分化効率を向上させる処理である、態様１ないし３のいずれか１項に記載の形質転換植物の作成方法。
［態様５］
１）形質転換向上処理が以下からなるグループから選択される、態様１ないし４のいずれか１項に記載の形質転換植物の作成方法。
【００２３】
熱処理；
遠心処理；
熱及び遠心処理；
加圧処理；
硝酸銀および／または硫酸銅の共存培地への添加；
粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理；
共存工程後の、カルス増殖及び／または再分化工程における培地へのカルベニシリン添加
カルス増殖培地にＮ６無機塩を添加する処理；ならびに
共存培地にシステインを添加する処理
［態様６］
共存工程において、ベンゾイック系除草剤に属する化合物を添加することを含む、態様１ないし５に記載の形質転換植物の作成方法。
［態様７］
ベンゾイック系除草剤に属する化合物が、安息香酸型、サリチル酸型またはピコリン酸型のいずれかである、態様６に記載の形質転換植物の作成方法。
［態様８］
ベンゾイック系除草剤に属する化合物が、３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸、または４−アミノ−３，５，６−トリクロロピコリン酸である、態様６または７に記載の形質転換植物の作成方法。
［態様９］
植物が単子葉植物である、態様１ないし８に記載の形質転換植物の作成方法。
［態様１０］
植物がトウモロコシ又はイネである、態様１ないし９に記載の形質転換植物の作成方法。
【００２４】
［本発明の実施するための好ましい態様］
本発明は、アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法を提供する。本発明は、アグロバクテリウム属細菌を介して植物への遺伝子導入を行う方法であって、形質転換効率向上処理を行うことにより、選抜マーカー遺伝子の導入が不要になる、という発見に基づく。本発明の方法は、
（ｉ）アグロバクテリウムを接種した植物材料を、共存培地で培養する共存工程、及び
(ｉｉ）（ｉ）で得られた組織を、カルス増殖培養を行わず、あるいはカルス増殖培養を行った後に、再分化培地で培養し植物体を再分化させる工程
を含む、アグロバクテリウムを用いた形質転換植物の製造方法であって
１）形質転換向上処理を行うこと、及び
２）共存から再分化までの全ての工程で選抜薬剤を用いた形質転換細胞の選抜を行わないこと
を特徴とする。
【００２５】
形質転換向上処理
本発明は、形質転換向上処理を行うことを特徴の１つとする。本発明の方法において、「形質転換向上処理」とは、当該処理を行うことにより、得られる形質転換植物の割合が向上する処理をいう。限定されるわけではないが、具体的には、目的遺伝子の植物細胞への導入効率を向上させる処理、未熟胚などからのカルス誘導率を向上させる処理、形質転換カルスからの再分化効率を向上させる処理などが挙げられる。このような形質転換向上処理としては、限定されるものではないが、例えば以下のようなものあるいはこれらの組み合わせが含まれる。
【００２６】
熱処理（参照：ＷＯ９８／５４９６１）、
遠心処理（参照：ＷＯ０２／１２５２０）、
熱及び遠心処理（参照：ＷＯ０２／１２５２１）、
加圧処理（参照：ＷＯ２００５／０１７１６９）、
硝酸銀および／または硫酸銅の共存培地への添加（参照：ＡｇＮＯ３（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ２００１、Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． ２００３；ＣｕＳＯ４（ＷＯ２００５／０１７１５２）、
粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理（参照：ＷＯ２００７／０６９６４３）、
共存工程後の、カルス増殖及び／または再分化工程における培地へのカルベニシリン添加（参照：Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ２００１、Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． ２００３）、
カルス増殖培地にＮ６無機塩（Ｃｈｕ １９７８）を添加する処理（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ２００１）、ならびに
共存培地にシステインを添加する処理（Ｆｒａｍｅ ｅｔ ａｌ． ２００２）。
【００２７】
このうち、熱処理、遠心処理、熱及び遠心処理、加圧処理、粉体の添加はいずれも遺伝子導入効率を向上させる処理であり、硝酸銀、硫酸銅、カルベニシリンの添加はカルス誘導率を向上させる効果がある。また、再分化培地への硫酸銅の添加は再分化効率を向上させる。
【００２８】
限定されるわけではないが、熱処理は例えばＷＯ９８／５４９６１に記載の方法を用いて行うことができる。例えば、植物材料をアグロバクテリウム菌と接触させる前に、３３℃ないし６０℃、好ましくは３７℃ないし５２℃で、５秒間ないし２４時間、好ましくは１分間ないし２４時間、処理する。
【００２９】
遠心処理は、例えばＷＯ０２／１２５２０に記載の方法を用いて行うことができる。例えば、植物材料をアグロバクテリウム菌と接触させる前に、１００Gないし２５万G、好ましくは、５００Gないし２０万G、更に好ましくは１０００Gないし１５万Gの遠心加速度で、１秒間ないし４時間、更に好ましくは１秒間ないし２時間処理する。
【００３０】
熱及び遠心処理は例えばＷＯ０２／１２５２１に記載の方法を用いて行うことができる。熱処理及び遠心処理の条件は、例えば上述した条件を採用しうる。
加圧処理は、例えばＷＯ２００５／０１７１６９に記載の方法を用いて行うことができる。加圧処理は、限定されるわけではないが、好ましくは１．７気圧ないし１０気圧の範囲、より好ましくは２．４気圧ないし８気圧の範囲で行われる。
【００３１】
硝酸銀および／または硫酸銅の共存培地への添加は、例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ２００１、Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． ２００３、ＷＯ２００５／０１７１５２に記載されている。硝酸銀および／または硫酸銅は、例えば、１μＭないし５０μＭ、好ましくは１μＭないし１０μＭの濃度で、共存培地に添加しうる。
【００３２】
粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理は、例えばＷＯ２００７／０６９６４３に記載の方法を用いて行うことができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウム懸濁液と粉体を混合して植物材料に接種する、あるいは、植物と粉体を混合してこれにアグロバクテリウムを接種する、といった方法で行う。粉体は、限定されるものではないが、多孔質の粉体、グラスウールまたは活性炭であり、好ましくは多孔性セラミックス、グラスウールまたは活性炭、さらに好ましくはハイドロキシアパタイト、シリカゲル、グラスウールである。
【００３３】
カルス増殖培地にＮ６無機塩を添加する処理（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ２００１）では、カルス増殖培地にＮ６無機塩（Ｃｈｕ １９７８）を添加することにより行う。
共存培地にシステインを添加する処理では、システインを１０ｍｇ／ｌないし１ｇ／ｌ、好ましくは５０ｍｇ／ｌないし７５０ｍｇ／ｌ、より好ましくは１００ｍｇ／ｌないし５００ｍｇ／ｌで、共存培地に添加しうる。
【００３４】
共存工程後の、カルス増殖及び／または再分化工程における培地へのカルベニシリン添加は、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ２００１、またはＩｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． ２００３に記載の方法を用いて行うことができる。カルベニシリンは、カルス増殖用培地、及び／または再分化工程に例えば、５０ｍｇ／ｌないし５００ｍｇ／ｌ、好ましくは１００ｍｇ／ｌないし３００ｍｇ／ｌの濃度で添加しうる。なお、カルベニシリンは抗生物質であるが、植物に対してほとんど毒性がなく、培地中の微生物の増殖を防ぐ目的で利用することができる。
【００３５】
当業者は、これらの処理を適切なタイミング・条件で行うことができる。また、これらを適宜組み合わせることは、形質転換効率向上のために一層好ましい。例えば、またトウモロコシであれば、熱及び遠心処理、粉体処理、共存培地へのＡｇＮＯ３及び／又はＣｕＳＯ４の添加処理、カルス増殖培地および／または再分化培地中の抗生物質としてカルベニシリン添加処理のうち２つ以上を組み合わせることが望ましい。イネでは、熱処理および／または遠心処理を含むことが好ましく、カルス増殖培地および／または再分化培地中の抗生物質としてカルベニシリン添加処理を組み合わせることが最も好ましい。
【００３６】
従って、好ましい形質転換向上処理は、熱処理、遠心処理、熱及び遠心処理、加圧処理、共存培地にＡｇＮＯ３および／またはＣｕＳＯ４を添加する処理、あるいは粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理、カルス増殖培地および／または再分化培地中の抗生物質をカルベニシリンにする処理、またはこれらの組み合わせである。
【００３７】
本発明者らは、これらの処理を行うことで、最終的に得られる再分化個体中の形質転換個体の数を十分に増加させることに成功し、形質転換細胞の選抜処理を行わなくても十分な形質転換個体が得られることを見出し、実用に足る無選抜形質転換方法を確立した。
【００３８】
これらの形質転換個体は、導入遺伝子の有無をＰＣＲなどの手法で確認することにより、また後代個体であれば導入遺伝子の表現型を確認することにより、容易に選抜することができる。
【００３９】
形質転換細胞の選抜
本発明は、共存から再分化までの植物形質転換のためのいずれの工程でも、アグロバクテリウムにより導入される核酸の特性を利用した形質転換細胞の選抜を行わないことを特徴とする。
【００４０】
アグロバクテリウムにより導入される核酸の特性を利用した形質転換細胞の選抜の例として、選抜薬剤に対する耐性遺伝子と選抜薬剤を用いた形質転換細胞の選抜が挙げられる。
【００４１】
「選抜薬剤に対する耐性遺伝子と選抜薬剤を用いた形質転換細胞の選抜」とは、共存から再分化までの植物形質転換のためのいずれの工程において、形質転換植物を選抜するための薬剤を添加した培地での培養を行い、選抜薬剤に対する耐性の有無により形質転換された細胞を選抜することを意味する。本発明はこのような工程を全く含まない。
【００４２】
従来の技術で使用されてきた選抜薬剤の例は、抗生物質および／または除草剤である。抗生物質としては、植物に対して毒性を有するもの、例えば、ハイグロマイシン、カナマイシン、またはブラストサイジンＳ等が、除草剤としては、例えば、フォスフィノスライシン、ビアラフォス、またはグリホセート等が使用されてきた。
【００４３】
本工程のために、アグロバクテリウム中のＴ−ＤＮＡ中に挿入したＤＮＡは、植物に発現させることを意図する遺伝子のみならず、選抜薬剤に対する耐性遺伝子を含むことが必要であった。このような選抜薬剤に対する耐性遺伝子は当該技術分野においては公知である。例えばハイグロマイシンを選抜薬剤として含む再分化培地において再分化工程が行われる場合、植物にはアグロバクテリウムからハイグロマイシン耐性遺伝子が導入されていることが必要である。
【００４４】
本発明では、薬剤を用いた選抜工程を行わないため、選抜薬剤に対する耐性遺伝子、即ち、選抜マーカー遺伝子をアグロバクテリウムにより導入される核酸が有する必要がない。よって、限定されるわけではないが、好ましい態様において、本発明ではこのような核酸を含まない。
【００４５】
あるいは、従来法として、形質転換植物の選抜は、植物細胞の「栄養要求性選抜」、例えば「糖要求性」に基づいて行われることもある。
糖要求性の場合、植物細胞が利用できる糖はシュークロース、グルコースなどがあるが、マンノースは利用できないことが知られている。したがって、マンノースのみを炭素源とする培地で植物組織を培養すると、利用できる糖がないために植物組織は枯死する。糖要求性に基づく選抜はこの原理を利用するものである。糖要求性に基づき形質転換植物の選抜を行う場合には、植物組織には、アグロバクテリウムから通常植物細胞が利用できない糖類を利用可能にする遺伝子が導入されている。このような遺伝子は当該技術分野において公知であり、例えば、ＰＭＩ遺伝子、キシロースイソメラーゼ遺伝子等が使用可能である。本発明では、導入される核酸がこのような遺伝子を含む必要がない。
【００４６】
あるいは、従来法として、容易に検出可能な遺伝子をスクリーニングの指標として導入し、当該遺伝子の発現の有無により選抜することがある。このようなスクリーニングの指標となる遺伝子としては、ＧＦＰ遺伝子等があげられる。本発明では、導入される核酸がこのような遺伝子を含む必要がない。
【００４７】
本発明の方法において、選抜マーカー遺伝子とは、多数の非形質転換細胞の中にある形質転換細胞を選抜することを目的として、形質転換しようとする目的遺伝子（ＧＯＩ遺伝子）の他に、植物に導入する遺伝子を意味する。限定されるものではないが、この選抜マーカー遺伝子の例として、除草剤抵抗性遺伝子、抗生物質抵抗性遺伝子、蛍光遺伝子などが挙げられる。
【００４８】
形質転換植物の作成方法
アグロバクテリウムによる形質転換植物の作成方法は、一般に以下のＩ〜Ｖの工程の全部又は一部を含む。
【００４９】
Ｉ．植物材料の調製工程
ＩＩ．アグロバクテリウムの調製および接種工程
ＩＩＩ．共存工程
ＩＶ．カルス培養工程
Ｖ．再分化工程
Ｉ．植物材料の調製工程
本発明の対照となる植物はアグロバクテリウムを用いた形質転換導入方法が適用可能な植物である。好ましくは単子葉植物である。本発明の方法に供される単子葉植物には、好ましくはイネ科植物であり、イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、ソルガムその他が含まれるがこれらに限定されるものではない。本発明の方法に供される最も好ましい植物は、イネまたはトウモロコシである。
【００５０】
本発明の方法において、「植物材料」とは、アグロバクテリウム法による植物の形質転換に供試するための当該植物の細胞、葉、根、茎、芽、花（雄蕊、雌蕊等含む）、実、種子、発芽種子もしくはその他いずれかの部位の植物組織、成長点、外植片、未熟胚、カルスもしくは不定胚様組織（以下、本明細書においてカルス等、または単にカルスという）、または完全な植物体、などの植物のあらゆる態様を包含する。
【００５１】
本発明の方法に用いる植物材料の形態として好ましいのは未熟胚またはカルスであり、最も好ましいのは未熟胚である。本明細書において、植物の細胞、組織、完全な植物体という表現は、技術分野において一般的に用いられる意味で用いられる。本明細書において、未熟胚とは、受粉後の登熟過程にある未熟種子の胚および胚盤をいう。また、本発明の方法に供される未熟胚のステージ（熟期）は特に限定されるものではなく、受粉後いかなる時期に採取されたものであってもよい。もっとも、受粉後２日以降のものが好ましい。後述の形質転換後、後述の方法により、増殖し、正常な個体を再生する能力を有するカルスを誘導できる未熟胚胚盤を用いることが好ましい。また、未熟胚はインブレッド、インブレッド間のＦ１、インブレッドと自然受粉品種間のＦ１、市販Ｆ１品種の未熟胚であることが好ましい。本明細書において、カルスとは、無秩序に増殖する未分化状態の細胞塊をいう。カルスを得るためには、植物組織の分化した細胞をオーキシン（例えば、２，４−Ｄ）またはサイトカイニン等の植物成長調節物質を含む培地（脱分化培地という）において培養して得ることができる。このカルスを得るための処理を脱分化処理といい、またこの過程を脱分化過程という。
【００５２】
本工程において、必要に応じ、植物組織、未熟胚などを植物体、種子などから取り出し、形質転換に好適な植物材料を調製する。植物材料の調製は公知の方法によって行うことができる。また、所望により植物材料をアグロバクテリウムに感染させる前に培養してもよい。
【００５３】
ＩＩ．アグロバクテリウムの調製および接種工程
本発明において使用される植物材料はアグロバクテリウムを接種される。本明細書で使用する「接種する」とは、アグロバクテリウムを植物材料に接触することをいい、当該技術分野においては種々のアグロバクテリウムを接種する方法が公知である。当該方法としては、例えば、アグロバクテリウムを液体培地に懸濁した懸濁液に植物材料を加える方法、共存培地上の植物材料にアグロバクテリウムの懸濁液を直接滴下する方法、植物材料中にアグロバクテリウム菌懸濁液を注入する方法およびアグロバクテリウム懸濁液中に植物材料を浸漬し減圧する方法があげられる。しかしながら、本発明において使用されるアグロバクテリウムを接種された植物材料は、これらの方法によりアグロバクテリウムを接種された植物材料に限定されない。
【００５４】
当該アグロバクテリウムの接種工程においては、アグロバクテリウムによる形質転換効率を改善するために、例えば、アセトシリンゴン、界面活性剤、多孔性セラミックス等の種々の添加剤をアグロバクテリウムの懸濁液中に含ませることが可能である。
【００５５】
本発明に使用可能なアグロバクテリウムは公知のいずれのアグロバクテリウム属細菌であってよいが、好ましくはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓである。本発明の好ましい態様において、アグロバクテリウムは、例えば、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１およびＡＧＬ１、Ｃ５８Ｃ１等であるが、これに限定はされない。
【００５６】
土壌細菌アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）が多くの双子葉植物に根頭癌腫病（ｃｒｏｗｎ ｇａｌｌ ｄｉｓｅａｓｅ）を引き起こすことは古くから知られており、１９７０年代には、Ｔｉプラスミドが病原性に関与すること、さらにＴｉプラスミドの一部であるＴ−ＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれることが発見された。その後このＴ−ＤＮＡには癌腫の誘発に必要なホルモン（サイトカイニンとオーキシン）の合成に関与する遺伝子が存在し、細菌遺伝子でありながら植物中で発現することが明らかにされた。Ｔ−ＤＮＡの切り出しと植物への伝達にはＴｉプラスミド上のヴィルレンス領域（ｖｉｒ領域）に存在する遺伝子群が必要であり、またＴ−ＤＮＡが切り出されるためにはＴ−ＤＮＡの両端に存在するボーダー配列が必要である。他のアグロバクテリウム属細菌であるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓもＲｉプラスミドによる同様なシステムを有している（例えば、特開２０００−３４２２５６の図３および図４）。
【００５７】
アグロバクテリウムの感染によってＴ−ＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれるので、Ｔ−ＤＮＡ上に所望の遺伝子を挿入するとこの遺伝子も植物ゲノムに組み込まれることが期待された。しかしながら、Ｔｉプラスミドは１９０ｋｂ以上と巨大であるため、標準的な遺伝子工学的手法ではプラスミド上のＴ−ＤＮＡ上に遺伝子を挿入することは困難であった。そのため、Ｔ−ＤＮＡ上に外来遺伝子を挿入するための方法が開発された。
【００５８】
まず、腫瘍性のＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡからホルモン合成遺伝子が除去されたディスアーム型の菌系（ｄｉｓａｒｍｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ）であるＬＢＡ４４０４（Ｈｏｅｋｅｍａ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， （１９８３）， Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ．３０３， ｐ．１７９−１８０参照）、Ｃ５８Ｃ１（ｐＧＶ３８５０）、ＧＶ３Ｔｉ１１ＳＥなどが作製された。これらを用いることにより、所望の遺伝子をアグロバクテリウムのＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ中に、あるいは所望の遺伝子を有するＴ−ＤＮＡをアグロバクテリウムに導入する２種類の方法が開発された。このうちの一つは、遺伝子操作が容易で所望の遺伝子の挿入が可能であり、大腸菌で複製ができる中間ベクターを、アグロバクテリウムのディスアーム型ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域中に、三系交雑法（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ ｍａｔｉｎｇ）を介して相同組換えにより導入する方法であり、中間ベクター法と呼ばれる。
【００５９】
もう一つは、バイナリーベクター（ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ）法とよばれるもので、Ｔ−ＤＮＡの植物への組み込みにｖｉｒ領域が必要であるが、機能するために同じプラスミド上に存在する必要はないという結果に基づいている。このｖｉｒ領域にはｖｉｒＡ、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＣ、ｖｉｒＤ、ｖｉｒＥおよびｖｉｒＧが存在し、（植物バイオテクノロジー事典（エンタプライズ株式会社発行（１９８９）））、ｖｉｒ領域とはこのｖｉｒＡ、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＣ、ｖｉｒＤ、ｖｉｒＥおよびｖｉｒＧの全てを含むものをいう。バイナリーベクターは、Ｔ−ＤＮＡをアグロバクテリウムと大腸菌の両方で複製可能な小さなプラスミドに組み込んだものであり、これをディスアーム型Ｔｉプラスミドを有するアグロバクテリウムに導入して用いる。
【００６０】
アグロバクテリウムへのバイナリーベクターの導入は、エレクトロポレーション法や三系交雑法などの、公知の方法により行うことができる。バイナリーベクターには、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２などがあり、これらをもとに数多くの新たなバイナリーベクターが構築され、形質転換に用いられている。また、Ｒｉプラスミドのシステムにおいても、同様なベクターが構築され形質転換に用いられている。
【００６１】
アグロバクテリウムＡ２８１は、強病原性（ｓｕｐｅｒ−ｖｉｒｕｌｅｎｔ）の菌系であり、その宿主範囲は広く、形質転換効率も他の菌系より高い。この特性は、Ａ２８１が有するＴｉプラスミドのｐＴｉＢｏ５４２によるものである。ｐＴｉＢｏ５４２を用いて、これまでに２つの新しいシステムが開発されている。一つはｐＴｉＢｏ５４２のディスアーム型のＴｉプラスミドを有する菌系ＥＨＡ１０１およびＥＨＡ１０５を用いたものであり、これらを上述のバイナリーベクターシステムに適用することにより、形質転換能力の高いシステムとして種々の植物の形質転換に利用されている。
【００６２】
もう一つは、スーパーバイナリーベクターシステムである。スーパーバイナリーベクター（’ｓｕｐｅｒ−ｂｉｎａｒｙ’ ｖｅｃｔｏｒ）については、例えば本明細書中に援用される以下の文献に記載されている。
【００６３】
Ｈｉｅｉ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９４）， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， Ｖｏｌ．６， ｐ．２７１−２８２；
Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９６）， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．４， ｐ．７４５−７５０；
Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． ａｎｄ Ｋｕｂｏ Ｔ．， （１９９９）， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ： Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｉｎ Ｖａｓｉｌ， Ｉ． Ｋ． （ｅｄ．） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｒｅａｌ ｃｒｏｐｓ．， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ， ｐ．４３−８２；および
国際公開第９５／０６７２２号パンフレット
スーパーバイナリーベクターシステムについては、例えば特開２０００−３４２２５６の図４に記載されている。
【００６４】
このシステムは、ｖｉｒ領域（ｖｉｒＡ、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＣ、ｖｉｒＤ、ｖｉｒＥおよびｖｉｒＧ（以下、これらをそれぞれ「ｖｉｒ断片領域」ということもある。））を持つディスアーム型のＴｉプラスミドおよびＴ−ＤＮＡを有するプラスミドからなることから、バイナリーベクターシステムの一種である。しかしながら、Ｔ−ＤＮＡを有する側のプラスミド、即ちバイナリーベクターにｖｉｒ断片領域のうち、少なくとも一つのｖｉｒ断片領域を実質的に取除いたｖｉｒ領域の断片（このうち好ましくは少なくともｖｉｒＢまたはｖｉｒＧを含む断片、さらに好ましくはｖｉｒＢおよびｖｉｒＧを含む断片）を組み込んだスーパーバイナリーベクターを用いる点で異なる。なお、スーパーバイナリーベクターを有するアグロバクテリウムに、所望の遺伝子を組み込んだＴ−ＤＮＡ領域を導入するには、三系交雑法を介した相同組換えが容易な手法として利用できる。
【００６５】
本発明の方法においては、宿主となるアグロバクテリウム属細菌としては、特に限定されないが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（例えば上述のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４（Ｈｏｅｋｅｍａ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， （１９８３）， Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ．３０３， ｐ．１７９−１８０を参照）およびＥＨＡ１０１）を好ましく用いることができる。
【００６６】
本発明の方法によれば、アグロバクテリウム属細菌における病原性（ｖｉｒ）領域の遺伝子群の発現に基づく遺伝子導入系であれば、特に限定されることなく本発明の効果を得ることができる。
【００６７】
例えば、上述した中間ベクター、バイナリーベクター、強病原性のバイナリーベクター、スーパーバイナリーベクターなどいずれのベクターシステムに対しても用いることができ、本発明による効果を得ることができるが、強病原性のバイナリーベクター、スーパーバイナリーベクターが、形質転換効率がより向上するため、好ましい。（特に導入先植物がトウモロコシの場合には、スーパーバイナリーベクターを使用することが好ましい）。これらのベクター類を改変した、異なるベクターシステムを用いた場合においても同様である（例えば、アグロバクテリウム属細菌のｖｉｒ領域の一部または全部を切り出し付加的にプラスミド中に組み込む、ｖｉｒ領域の一部または全部を切り出し新たなプラスミドの一部としてアグロバクテリウムに導入するなど）。
【００６８】
植物に導入しようとする所望の遺伝子は、上記プラスミドのＴ−ＤＮＡ領域中の制限酵素部位に常法により組み込むことができる。大型で多数の制限部位を持つものは、通常のサブクローニングの手法では所望のＤＮＡをＴ−ＤＮＡ領域内に導入することが必ずしも容易でないことがある。このような場合には、三系交雑法により、アグロバクテリウム属細菌の細胞内での相同組換えを利用することで目的のＤＮＡを導入することができる。限定されるわけではないが、導入される遺伝子の大きさは好ましくは約１００ｂｐないし２００ｋｂｐである。
【００６９】
また、プラスミドをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ等のアグロバクテリウム属細菌に導入する操作は従来法により行うことができ、例としては、上記した三系交雑法やエレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法などが含まれる。
【００７０】
植物に導入しようとする遺伝子は、従来の技術と同様に基本的にはＴ−ＤＮＡの左右境界配列の間に配置されるものである。しかし、プラスミドが環状であるため、境界配列の数は１つでもよく、複数の遺伝子を異なる部位に配置しようとする場合には、境界配列が３個以上あってもよい。また、アグロバクテリウム属細菌中で、ＴｉまたはＲｉプラスミド上に配置されてもよく、または他のプラスミド上に配置されてもよい。さらには、複数の種類のプラスミド上に配置されてもよい。
【００７１】
アグロバクテリウム属細菌を植物材料に接種することは、例えば、植物材料をアグロバクテリウム属細菌と単に接触させることによって行ってもよい。接種は、通常接種により行ってもよく、また、滴下接種により行ってもよい。
【００７２】
通常接種は、植物材料とアグロバクテリウム属細菌懸濁液（接種源）を混合して植物材料を当該懸濁液に浸漬し、浸漬した植物材料を取り出して、培地上に着床させて共存培養を行うことにより接種を行う方法である。例えば、１０６〜１０１１ｃｆｕ／ｍｌ程度の細胞濃度のアグロバクテリウム属細菌懸濁液を調製し、この懸濁液中に植物材料を３〜１０分間程度浸漬後、固体培地上で数日間共存培養することにより行うことができる。滴下接種は、培地上に着床させた植物材料上にアグロバクテリウム属細菌懸濁液を滴下し、滴下した懸濁液が乾いた後、植物材料を培地の別の場所あるいは別の培地上に着床させて共存培養を行うことにより接種を行う方法である。
【００７３】
ＩＩＩ．共存工程
本工程は、上記のようにアグロバクテリウムを接種した植物細胞を、アグロバクテリウムの共存下にて、オーキシン類を含む培地で培養することにより、植物細胞へのアグロバクテリウムからＤＮＡの導入を確実にする工程である。好ましくは、植物材料をアグロバクテリウムに感染させると同時に、あるいは感染後、アグロバクテリウムを除去する前に、植物材料をアグロバクテリウムと共存培養させる。
【００７４】
本工程で使用される培地は、本明細書中では「共存培地」という。共存培養には公知の培地を使用できる。例えば、ＬＳ−ＡＳ培地、ｎＮ６−ＡＳ培地、あるいはその他、Ｎ６Ｓ３−ＡＳ培地、２Ｎ６−ＡＳ培地（Ｈｉｅｉ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９４）， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， Ｖｏｌ．６， ｐ．２７１−２８２を参照）等の培地が知られている。
【００７５】
本発明において好ましくは、共存培地中にオーキシン類を添加する。オーキシン類は一般に植物材料を脱分化させる作用を有するために、本工程において、ほとんどの植物材料は一部または全部が脱分化組織（カルス）となる。オーキシン類としては、例えば、３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸（ダイカンバ）、４−アミノ−３，５，６−トリクロロピコリン酸（ピクロラム）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−D）、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５−T）、および／またはトリヨード安息香酸 (ＴＩＢＡ)が挙げられる。本発明の好ましい態様においては、共存培地中にダイカンバ、ピクロラム、２，４−Ｄ、２，４，５−Ｔ以外のオーキシン類は含まない。
【００７６】
限定されるわけではないが、ダイカンバ、ピクロラム、２，４Ｄ、２，４，５−Ｔなどのオーキシン類の共存培地中における総量は、好ましくは、０．１−５．０ｍｇ／ｌ、さらに好ましくは、０．５−３．０ｍｇ／ｌ、より好ましくは、１．０−２．０ｍｇ／ｌ、最も好ましくは、１．５ｍｇ／ｌである。
【００７７】
本発明者らは、植物材料がトウモロコシの場合、オーキシン類の中でも特にベンゾイック系除草剤に属するオーキシン活性を示す物質を共存培地に添加することにより、形質転換効率が一層向上し、選抜マーカー遺伝子を導入することなく、形質転換植物を得られることを見出した。
【００７８】
ベンゾイック系除草剤はその基本構造から、（ｉ）安息香酸型、（ｉｉ）サリチル酸型、（ｉｉｉ）ピコリン酸型、（ｉｖ）テレフタール酸型に分けられる（Ｔａｋｅｍａｔｓｕ、１９８２）。しかしながら、（ｉｖ）テレフタール酸型はオーキシン活性を示さないため、（ｉ）安息香酸型、（ｉｉ）サリチル酸型、（ｉｉｉ）ピコリン酸型のいずれかに属する除草剤が好ましく、より好ましくは（ｉｉ）サリチル酸型、（ｉｉｉ）ピコリン酸型のいずれかである。さらに好ましくは、ダイカンバ（Ｄｉｃａｍｂａ）（３，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｏ−ａｎｉｓｉｃ ａｃｉｄ）あるいはピクロラム（Ｐｉｃｌｏｒａｍ）（４−ａｍｉｎｏ−３，５，６−ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｉｃｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）である。従って、トウモロコシの場合には、共存培地にベンゾイック系除草剤に属するオーキシン活性を示す物質を添加することが最も好ましい。
【００７９】
あるいは、植物材料がイネの場合は、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−D）を添加することが好ましい。
本工程における「培養」とは、固化した共存培地の上または液体状の共存培地の中に植物材料を置床し、適切な温度、明暗条件および期間で生育させることをいう。共存培地の固化は、当該技術分野において公知の固化剤を添加することにより行うことができ、そのような固化剤としては、例えばアガロース等が知られている。本工程における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは２０℃−３５℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、本工程の培養は好ましくは暗所で行われるが、これに限定されない。本工程の培養期間もまた適宜選択可能であり、好ましくは１日−１０日、より好ましくは７日である。
【００８０】
ＩＶ．カルス培養工程
アグロバクテリウムによる植物の形質転換方法においては、一般にはカルス培養工程は必要と考えられてきた。
【００８１】
カルス増殖培地上に移し、カルス増殖させることにより、「形質転換した細胞の集団を含む細胞塊」を得ることができる。カルス増殖培地とは「脱分化状態の細胞を分裂、増殖するのに適当な植物ホルモンおよび栄養素を含む培地であり、一般的な形質転換試験では、形質転換していない細胞の増殖を阻害する薬剤（選抜圧）を添加し形質転換細胞を選択的に増殖させる“選抜培地”としても用いられる。よって本カルス増殖工程は、一般には上記共存工程を経た植物材料を、オーキシン類を含む培地で培養し、形質転換体を遺伝子の導入の有無により選抜する工程である。本工程で使用される培地は、本明細書中では「選抜培地」といい、遺伝子の導入の有無により選抜するために選抜薬剤等を含んでいる。
【００８２】
本工程は、従来法においては、培地の成分組成を変更して、複数回繰り返して行われている。例えば、複数回の選抜工程では、選抜薬剤の濃度を各選抜工程で上昇させることにより、薬剤選抜の確実性が増し、形質転換をした植物体を得られる可能性を上昇させることが可能となる。本選抜工程は、好ましくは少なくとも２回、より好ましくは３回行われる。複数回本工程が行われる場合、本工程は１回につき１０日−３週間程度の期間を要し、複数回の選抜工程全体で５−１０週間程度を要する。よって、アグロバクテリウムによる植物の形質転換方法において、本工程は最も時間を要する工程である。
【００８３】
従来のアグロバクテリウムによる植物の形質転換方法においては、本工程は必須の工程であると考えられてきた。しかしながら、本発明者らは「形質転換向上処理」により、カルス培養工程中を含む、共存から再分化までのいずれの工程においても選抜薬剤を用いた形質転換細胞の選抜を行わなくても形質転換が上手くいくことを初めて見いだし、本願発明を想到した。よって、本発明においては、好ましくは本工程を省略できる。即ち、共存培養後の組織をカルス増殖培地で培養する工程を、共存工程と再分化工程の間に含まない。これにより、作業効率が一層向上し、また形質転換工程をより短期間で行なえるため、より効率的に形質転換植物を得られることを見出した。本明細書中の実施例１−４では特にトウモロコシの場合に、カルス増殖工程を省略し植物形質転換に成功した例が記載されている。
【００８４】
あるいは、カルス増殖培地に選抜薬剤を添加せずに、カルス増殖工程を行ってもよい。この場合、カルス増殖は生じるが形質転換体の「選抜」は行われなない。
Ｖ．再分化工程
得られた細胞塊の再分化を行い、再分化個体を生育させ、そして、所望により完全な植物体を得る工程である。得られた形質転換細胞から完全な植物体を再生するには、公知の方法（例えば、Ｈｉｅｉ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９４）， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， Ｖｏｌ．６， ｐ．２７１−２８２； および、Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９６）， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１４， ｐ．７４５−７５０）により行うことができる。
【００８５】
本工程は、従来法および本発明のいずれにおいても必須の工程である。従来、再分化工程においても選抜薬剤による形質転換体の選抜が必須と考えられてきた。形質転換植物の選抜は、選抜薬剤を含む再分化培地で、共存工程を経た植物材料を培養し、選抜薬剤に対する耐性の有無により行われる。しかしながら、本発明は、共存から再分化までの植物形質転換のためのいずれの工程でも、選抜薬剤を用いた形質転換細胞の選抜を行わないことを特徴とする。よって、本発明においては、再分化工程においても選抜薬剤を用いた選抜を行わない。
【００８６】
本工程で使用される培地は、本明細書中では「再分化培地」といい、その特徴としてオーキシン類を含まないことが挙げられる。再分化培地として使用可能な培地は、例えば、ＬＳ無機塩類やＮ６無機塩類を基本とする培地、例えば具体的にはＬＳＺ培地等が使用可能である。しかしながら「再分化培地」は、選抜薬剤を含まない。
【００８７】
本発明における「再分化」とは、全部または一部が脱分化していた植物材料が、再び元の植物材料または植物体の性質を獲得することをいう。再分化工程に供することにより、脱分化組織が再分化し、完全な形質転換植物体を得ることが可能となる。植物が再分化したか否かは植物の形態を観察することにより容易に決定可能である。例えば、脱分化組織から茎や葉のような特定の分化した植物器官が現れるか否かにより決定することが可能である。
【００８８】
本明細書において、「ビガー」とは、再分化した植物の生育の旺盛さをいう。植物のビガーは当該技術分野で行われる公知の測定方法を用いて測定することが可能である。例えば、トウモロコシの場合は、再分化工程後に、再分化の見られなかった形質転換植物組織を０点、再分化した茎葉の最大長が５ｍｍ未満の形質転換植物組織を１点、再分化した茎葉の最大長が５ｍｍ以上２ｃｍ未満の形質転換植物組織を２点、そして再分化した茎葉の最大長が２ｃｍ以上の形質転換植物組織を３点、とスコアリングしすべての形質転換植物組織の平均値を計算することにより求めることが可能である。ビガーの評価方法はこれに限定されることなく評価対象等に依存して、適当な修正を周知の方法に加えることも可能である。
【００８９】
本工程における「培養」とは、固化した再分化培地の上または液体状の再分化培地の中に植物組織を置床し、適切な温度、明暗条件および期間にて生育させることをいう。再分化培地の固化は、上記のように例えば寒天等により行うことが可能である。本工程における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは２０℃−３５℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、本工程の培養は好ましくは１６−２４時間／日の照明下で行われるが、これに限定されない。本工程の培養期間もまた適宜選択可能であり、好ましくは７日−２１日、より好ましくは１４日である。
【００９０】
本工程の後においては、当該技術分野において公知の方法を用いることにより容易に完全な形質転換植物体を得ることが可能である。得られた再分化個体について、導入遺伝子の有無を確認し、形質転換個体を特定する工程である。限定するものではないが、ＰＣＲやサザン分析などを好ましく用いることができる。また導入遺伝子の表現型を確認することにより、容易に選択することができる。
【発明の効果】
【００９１】
本発明により、単子葉植物の形質転換方法において、所望の植物に、植物選抜マーカー遺伝子を導入することなく、安定で効率的な形質転換を行うことができる。
【実施例】
【００９２】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１ 通常法で接種したトウモロコシ未熟胚から無選抜で再分化した植物体での遺伝子発現
１．材料および方法
受粉後７から１４日目のトウモロコシ（品種：Ａ１８８）の未熟胚（大きさ１．０−１．５ｍｍ）を無菌的に採取し、ＬＳ−ｉｎｆ液体培地（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９６）で１回洗浄した。形質転換向上処理として遺伝子導入効率を高めるための前処理（４６℃、３分間の熱処理および２０，０００ｘｇ、１０分間の遠心処理）を行った（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。１００μＭアセトシリンゴンを含むＬＳ−ｉｎｆ液体培地に約１．０ｘ１０９ ｃｆｕ／ｍｌでアグロバクテリウム菌系ＬＢＡ４４０４ （ｐＳＢ１３４）（Ｈｉｅｉ ａｎｄ Ｋｏｍａｒｉ， ２００６）を懸濁し接種源とした。
【００９３】
熱・遠心処理した未熟胚に接種源を加え、３０秒間撹拌した後、５分間室温で静置した。２，４−Ｄ（２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ−ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を除き、５μＭ ＡｇＮＯ３および５μＭ ＣｕＳＯ４を含むＬＳ−ＡＳ培地（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． １９９６、固化剤は８ｇ／ｌアガロース）に１．５ｍｇ／ｌの濃度でダイカンバ（Ｄｉｃａｍｂａ）（３，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｏ−ａｎｉｓｉｃ ａｃｉｄ）を添加した共存培地にアグロバクテリウムを接種した未熟胚を胚盤が上になるように置床した。
【００９４】
２５℃、暗黒下で７日間培養した未熟胚を１０μＭ ＣｕＳＯ４を含むＬＳＺ培地（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． １９９６）に置床し、２５℃、照明下で約２週間培養した。再分化のみられた植物体の葉の一部を切り取り０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に浸漬し、３７℃で１時間静置した。リン酸緩衝液を除いた後、１．０ｍＭ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ｇｌｕｃ）および２０％メタノールを含むリン酸緩衝液を添加した。３７℃で２４時間処理した後、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。
【００９５】
以下に、実施例１の条件をまとめた。
材料： トウモロコシ 未熟胚
方法： 通常法でアグロバクテリウム接種
形質転換向上処理： 熱及び遠心処理、培地にＡｇ＋、Ｃｕ２＋イオンを添加する処理
共存培地へのオーキシンの添加： ダイカンバ
共存培養後、カルス増殖工程を経ず、直接再分化工程へ。
【００９６】
ベクター： ｐＳＢ１３４ ＧＵＳ遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子（選抜マーカー遺伝子）を有し、かつ強病原性菌株の病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクター
選抜処理： 全工程においてなし
２．結果
ＬＳＺ培地に置床した１６の未熟胚の全てから植物体の再分化がみられた。４から１３枚の葉片を各未熟胚から再分化した植物より採取し、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。
【００９７】
２つの未熟胚由来の葉片は全てがＧＵＳ陰性であった。残りの１４の未熟胚から採取した葉片では少なくとも１枚の葉片でＧＵＳ遺伝子の発現がみられた。ドット状の発現を示す葉片は５つの未熟胚でみられた。ストライプ状にＧＵＳ遺伝子を発現する葉片は６つの未熟胚でみられた。ドット状、ストライプ状に発現する葉片を両方有した未熟胚は２つみられた。ここで、ストライプ状に発現したものは、形質転換細胞と非形質転換細胞のキメラであること、ドット状に発現したものは、一部の形質転換細胞でジーンサイレンシングが起こっていることが推測される。切り口が一様に青く染色されるＧＵＳ陽性の葉片は１つの未熟胚から得られた。
【００９８】
本実施例の結果は、共存から再分化までのいずれの工程においても、抗生物質などを用いた選抜工程を全く行わない条件でＧＵＳ遺伝子の形質転換されたトウモロコシ植物が得られたことを示す。
【００９９】
実施例２ 滴下法で接種したトウモロコシ未熟胚から無選抜で再分化した植物体での遺伝子発現
１．材料および方法
実施例１と同様の方法で調整したアグロバクテリウム菌系ＬＢＡ４４０４ （ｐＳＢ１３４）の接種源１ｍｌに約８０ｍｇのハイドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を添加した。形質転換向上処理として遺伝子導入効率を高めるための前処理（４６℃、３分間の熱処理および２０，０００ｘｇ、１０分間の遠心処理）を行った。
【０１００】
上記処理後未熟胚（品種Ａ１８８）を２，４−Ｄを除き、５μＭ ＡｇＮＯ３および５ μＭ ＣｕＳＯ４を含むＬＳ−ＡＳ培地（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． １９９６、固化剤は８ｇ／ｌアガロース）に１．５ｍｇ／ｌの濃度でダイカンバを添加した共存培地に胚盤が上になるように置床した。
【０１０１】
接種源中のハイドロキシアパタイトが均等に分散するようにボルテックスミキサーで撹拌した後、５μｌの接種源を未熟胚上に滴下した。滴下した接種源が乾いた後、未熟胚を同培地上の別の場所に移動した。培養器をシールした後、２５℃、暗黒下で７日間共存培養を行った。共存培養後の未熟胚を実施例１と同様の方法で培養し、再分化植物を得るとともに再分化植物の葉でのＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。
【０１０２】
以下に実施例２の条件をまとめた。
材料： トウモロコシ 未熟胚
方法： 滴下法でアグロバクテリウム接種
形質転換向上処理： 粉体処理、熱及び遠心処理、培地にＡｇ＋、Ｃｕ２＋イオンを添加する処理
共存工程へのオーキシン添加： ダイカンバ
共存培養後、カルス増殖工程を経ず、直接再分化工程へ。
【０１０３】
ベクター： ｐＳＢ１３４ ＧＵＳ遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子（選抜マーカー遺伝子）を有し、かつ強病原性菌株の病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクター
選抜処理： 全工程においてなし
２．結果
ＬＳＺ培地に置床した１２の未熟胚の全てから植物体の再分化がみられた。３から１７枚の葉片を各未熟胚から再分化した植物より採取し、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。３つの未熟胚由来の葉片は全てがＧＵＳ陰性であった。残りの９の未熟胚から採取した葉片では少なくとも１枚の葉片でＧＵＳ遺伝子の発現がみられた。ドット状の発現を示す葉片は３つの未熟胚でみられた。ドット状、ストライプ状に発現する葉片を両方有した未熟胚は４つみられた。切り口が一様に青く染色されるＧＵＳ陽性の葉片は２つの未熟胚から得られた。
【０１０４】
本実施例の結果は、共存から再分化までのいずれの工程においても、抗生物質などを用いた選抜工程を全く行わない条件でＧＵＳ遺伝子の形質転換されたトウモロコシ植物が得られたことを示す。
【０１０５】
実施例３ 共存培地中のオーキシンがトウモロコシ未熟胚から無選抜で再分化した植物体での遺伝子発現に及ぼす効果
１．材料及び方法
受粉後７から１４日目のトウモロコシ（品種：Ａ１８８）の未熟胚（大きさ１．０−１．５ｍｍ）を無菌的に採取し、ＬＳ−ｉｎｆ液体培地で１回洗浄した。形質転換向上処理として遺伝子導入効率を高めるための前処理（４６℃、３分間の熱処理）を行った。１００μＭアセトシリンゴンを含むＬＳ−ｉｎｆ液体培地にアグロバクテリウム菌系ＬＢＡ４４０４ （ｐＳＢ１２４）（Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６）を懸濁し接種源とした。
【０１０６】
熱処理した未熟胚に接種源を加え、３０秒間撹拌した後、５分間室温で静置した。２，４−Ｄ（２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ−ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を除き、５μＭ ＡｇＮＯ３および５μＭ ＣｕＳＯ４を含むＬＳ−ＡＳ培地（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． １９９６、固化剤は８ｇ／ｌアガロース）に６．８μＭの濃度でダイカンバ（３，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｏ−ａｎｉｓｉｃ ａｃｉｄ）あるいはピクロラム（Ｐｉｃｌｏｒａｍ）（４−ａｍｉｎｏ−３，５，６−ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｉｃｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）を添加した共存培地にアグロバクテリウムを接種した未熟胚を胚盤が上になるように、２４個の未熟胚を置床した。
【０１０７】
一方、５μＭ ＡｇＮＯ３および５μＭ ＣｕＳＯ４を含むＬＳ−ＡＳ培地に対し、オーキシンとして１．５ｍｇ／ｌ（６．８μＭ）の２，４−Ｄを含ませたものも実験した。２４個の未熟胚を置床した。
【０１０８】
２５℃、暗黒下で７日間培養した未熟胚を１０μＭ ＣｕＳＯ４を含むＬＳＺ培地（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． １９９６）に置床し、２５℃、照明下で約２週間培養した。再分化のみられた植物体の葉の一部を切り取り０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む０．１ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に浸漬し、３７℃で１時間静置した。リン酸緩衝液を除いた後、１．０ｍＭ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ｇｌｕｃ）および２０％メタノール含むリン酸緩衝液を添加した。３７℃で２４時間処理した後、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。
【０１０９】
以下に、実施例３の条件をまとめた。
材料： トウモロコシ 未熟胚
方法： 通常法でアグロバクテリウム接種
形質転換向上処理： 熱処理、培地にＡｇ＋、Ｃｕ２＋イオンを添加する処理
共存培地へのオーキシンの添加： ダイカンバ、ピクロラム又は２，４−Ｄ
共存培養後、カルス増殖工程を経ず、直接再分化工程へ。
【０１１０】
ベクター： ｐＳＢ１２４ ＧＵＳ遺伝子を有するが、選抜マーカー遺伝子を有しない、かつ強病原性菌株の病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクター
選抜処理： 全工程においてなし
２．結果
ダイカンバを含む共存培地で培養した未熟胚はＬＳＺ培地上で置床した２４の未熟胚の全てから植物体の再分化がみられた。各未熟胚から再分化した植物より葉を採取し、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。１３個の未熟胚由来の葉片は全てがＧＵＳ陰性であった。残りの１１の未熟胚から採取した葉片では少なくとも１枚の葉片でＧＵＳ遺伝子の発現がみられた。ドット状の発現やストライプ状の発現など、不完全な発現をした個体も数えた。
【０１１１】
ピクロラムを含む共存培地で培養した未熟胚もすべてがＬＳＺ培地上で植物体の再分化がみられた。１５個の未熟胚由来の葉片は全てがＧＵＳ陰性であった。残りの９つの未熟胚から採取した葉片では少なくとも１枚の葉片でＧＵＳ遺伝子の発現がみられた。
【０１１２】
２，４−Ｄを含む培地で共存培養を行った２４の未熟胚のうち、３つの未熟胚はＬＳＺ培地上で植物の再分化はみられなかった。再分化のみられた２１の未熟胚のうち、少なくとも１枚の葉片でＧＵＳ遺伝子の発現がみられたのは４未熟胚であった。
【０１１３】
このように、特にダイカンバおよびピクロラムを含む培地で共存培養を行った未熟胚では高い効率で植物体の再分化がみられ、かつ得られた再分化植物が導入遺伝子の発現を示す割合も高かった。２，４−Ｄを含む培地で共存培養を行った未熟胚でも導入遺伝子の発現が観察されたがやや低かった。
【０１１４】
本実施例の結果は、共存から再分化までのいずれの工程においても、抗生物質などを用いた選抜工程を全く行わない条件でＧＵＳ遺伝子の形質転換されたトウモロコシ植物が得られたことを示す。２，４−Ｄ、ダイカンバおよびピクロラムはいずれも除草活性を有する有機化合物のうちオーキシン活性を示す物質である。２，４−Ｄはフェノキシ系除草剤に属し、ダイカンバおよびピクロラムはベンゾイック系除草剤に属する点で異なる（竹松、１９８２）。このことは、トウモロコシでは、未熟胚から無選抜で効率よく形質転換植物を得るには、アグロバクテリウムを接種した未熟胚を共存培養する培地に含まれるオーキシンが、フェノキシ系除草剤に属する物質よりもベンゾイック系除草剤に属する物質の方が適していることを示す。
【０１１５】
実施例４ トウモロコシ未熟胚への熱及び遠心処理が無選抜で再分化した植物体での遺伝子発現に及ぼす効果
１．材料および方法
受粉後７から１４日目のトウモロコシ（品種：Ａ１８８）の未熟胚（大きさ１．０−１．５ｍｍ）を無菌的に採取し、ＬＳ−ｉｎｆ液体培地で１回洗浄した。形質転換向上処理として遺伝子導入効率を高めるための前処理（４６℃、３分間の熱処理および２０，０００ｘｇ、４℃、１０分間の遠心処理）を行った。対照としてこれらの前処理を行わない未熟胚を供した。１００μＭアセトシリンゴンを含むＬＳ−ｉｎｆ液体培地にアグロバクテリウム菌系ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１２４）を懸濁し接種源とした。
【０１１６】
熱および遠心の前処理をした未熟胚と対照の前処理を行わない未熟胚にそれぞれ接種源を加え、３０秒間撹拌した後、５分間室温で静置した。２，４−Ｄ（２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ−ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を除き、５μＭ ＡｇＮＯ３および５μＭ ＣｕＳＯ４を含むＬＳ−ＡＳ培地（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． １９９６、固化剤は８ ｇ／ｌアガロース）に６．８μＭの濃度でダイカンバ（３，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｏ−ａｎｉｓｉｃ ａｃｉｄ）を添加した共存培地にアグロバクテリウムを接種した未熟胚を胚盤が上になるように置床した。前処理を行った未熟胚、行わない未熟胚をそれぞれ７５個を供試した。試験は２回行った。
【０１１７】
２５℃、暗黒下で７日間培養した未熟胚を１０μＭ ＣｕＳＯ４を含むＬＳＺ培地（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． １９９６）に置床し、２５℃、照明下で約２週間培養した。再分化のみられた植物体の葉の一部を切り取り０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に浸漬し、３７℃で１時間静置した。リン酸緩衝液を除いた後、１．０ｍＭ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ｇｌｕｃ）および２０％メタノール含むリン酸緩衝液を添加した。３７℃で２４時間処理した後、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。
【０１１８】
以下に、実施例４の条件をまとめた。
材料： トウモロコシ 未熟胚
方法： 通常法でアグロバクテリウム接種
形質転換向上処理：
（１）熱及び遠心処理、培地にＡｇ＋、Ｃｕ２＋イオンを添加する処理
（２）熱及び遠心処理なし、培地にＡｇ＋、Ｃｕ２＋イオンを添加する処理はあり
共存培地へのオーキシンの添加： ダイカンバ
共存培養後、カルス増殖工程を経ず、直接再分化工程へ。
【０１１９】
ベクター： ｐＳＢ１２４ ＧＵＳ遺伝子を有するが、選抜マーカー遺伝子を有しない、かつ強病原性菌株の病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクター
選抜処理： 全工程においてなし
２．結果
１回目の試験では、熱及び遠心処理を行った７５の未熟胚から２９６のシュートが再分化した。このうち、葉の組織全体でＧＵＳ遺伝子の発現を示したのは５個体であった。これに対し、前処理を行わない７５の未熟胚から再分化のみられた２９１のシュートのうち、葉の組織全体でＧＵＳ遺伝子の発現を示した個体は０であった。２回目の試験では、熱・遠心処理を行った未熟胚から２４３のシュートが再分化し、葉の組織全体でＧＵＳ遺伝子の発現を示すＧＵＳ陽性の個体が４個体得られた。
【０１２０】
熱・遠心処理の前処理を行わない未熟胚では再分化のみられた２６６のシュートのうち、葉の組織全体でＧＵＳ遺伝子の発現を示したＧＵＳ陽性の個体は１個体であった。これらの結果から、特に熱・遠心の処理をアグロバクテリウムを接種する前の未熟胚に行うことにより、無選抜により再分化した植物の組織全体で導入遺伝子を発現する個体が効率よく得られることが示された。ただし、１個体のみ遺伝子導入の結果が得られたのは、硝酸銀及び硫酸銅の共存培地への添加の効果と思われる。
【０１２１】
実施例５ イネの無選抜形質転換
１．材料および方法
開花後８ないし１２日のイネ（品種：ゆきひかり）未熟種子を脱頴し、７０％エタノールで数秒、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を１滴含む１％次亜塩素酸ナトリウムで５分間処理した。未熟種子を滅菌水で数回洗浄し、１．３−１．８ｍｍの長さの未熟胚を採取した。ついで、形質転換向上処理として未熟胚に、遺伝子導入効率を高めるため、２０，０００ｘｇで１０分間の遠心処理を行った（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。１００μＭアセトシリンゴンを含むＡＡ−ｉｎｆ液体培地（Ｈｉｅｉ ａｎｄ Ｋｏｍａｒｉ， ２００６）に約１．０ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度でアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１３４）（Ｈｉｅｉ ａｎｄ Ｋｏｍａｒｉ， ２００６）を懸濁し接種源とした。遠心処理をした未熟胚をｎＮ６−Ａｓ培地（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６）上に胚盤側を上向きにして置床した。各未熟胚に接種源を５μｌずつ滴下し、２５℃暗黒下で、７日間共存培養を行った。
【０１２２】
共存培養後、各々の未熟胚をメスで４ないし５分割した。分割した未熟胚を２５０ｍｇ／ｌセフォタキシムと１００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含むｎＮ６培地（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６）へ胚盤側を上向きにして置床し、３０℃ 明条件下で約１０日間培養した。主に胚盤細胞の増殖により肥大した切片の各々をさらに４ないし５分割した。この段階で未熟胚あたり１８−２５個の切片を得た。切片を２５０ｍｇ／ｌセフォタキシムと１００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含むｎＮ６培地（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６）へ胚盤側を上向きにして置床し、３０℃明条件下で約２週間培養した。
【０１２３】
共存培養後、２回の培養を行うことによりカルス増殖させ、胚盤の個々の細胞はおよそ１４０倍に増殖し、切片はカルスで覆われた。なお、細胞の増殖比率は、各切片の大きさから推定された。切片に形成されたカルスの中から、切片毎に１カルスのみ（０．５−１ｍｍ大）を取り出し、Ｎ６Ｒ再分化培地（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６）へ置床し、３０℃明条件下で２週間培養した。各切片から１カルスのみを再分化培地へ置床したのは、ランダムかつ独立な細胞に由来する植物体を得るためである。各カルスから再分化した苗条塊（ｓｈｏｏｔ ｃｌｕｍｐ）をＮ６Ｆ発根培地（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６）に移植し、３０℃ 明条件下で約１０日間培養し、完全な再分化植物体を得た。なお上述した培地には、ハイグロマイシン、ビアラホスなどの選抜薬剤は一切含まれていない。
【０１２４】
得られた植物体の葉の一部を切り取り０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（登録商標）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に浸漬し、３７℃で１時間静置した。リン酸緩衝液を除いた後、１．０ｍＭ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ｇｌｕｃ）および２０％ メタノールを含むリン酸緩衝液を添加した。３７℃で２４時間処理した後、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。なお、ＧＵＳ遺伝子の発現の調査は、１切片につき最大で１植物体からの１枚の葉において実施した。形質転換効率は、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した植物数に対するＧＵＳ陽性（ＧＵＳを一様に発現）を示した植物体数の割合で評価した。
【０１２５】
また、再分化植物体のゲノムに導入遺伝子が組み込まれているかどうかを確認するため、以下の方法により、サザンブロット解析を行った。再分化植物体の葉からＫｏｍａｒｉ（１９８９）の方法によりＤＮＡを抽出し、各植物体につき７μｇのＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化したＤＮＡは、０．７％ アガロースゲル電気泳動（１．５Ｖ／ｃｍ、１５時間）に供した。サザンハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）の方法によって実施した。なお、プローブには、ＧＵＳ遺伝子断片であるｐＧＬ２−ＩＧ（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．， １９９４）のＳａｌＩ−ＳａｃＩ（１．９ｋｂ）断片を用いた。
【０１２６】
以下に実施例５の条件をまとめた。
材料： イネ 未熟胚
方法： 通常法でアグロバクテリウム接種
形質転換向上処理： 遠心処理、培地にセファタキシム、カルベニシリンを添加する処理
共存工程へのオーキシン添加： ２，４−Ｄ
共存培養後、カルス増殖工程を経て、直接再分化工程へ。
【０１２７】
ベクター： ｐＳＢ１３４ ＧＵＳ遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子（選抜マーカー遺伝子）を有し、かつ強病原性菌株の病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクター
選抜処理： 全工程においてなし
２．結果
試験は２回行った（試験１及び２）。試験１の結果を表１に示す。試験１では、５個の未熟胚より１００個の分割切片を得、それぞれから１００個のカルスを再分化培地に置床したところ、９２の植物体を得た。このうち７３の植物体について１枚ずつの葉でＧＵＳ遺伝子の発現を調査したところ、９個の植物体が、葉の組織全体でＧＵＳを一様に発現する（ＧＵＳ陽性）形質転換体であった。形質転換効率は、再分化植物体当たり１２．３％であった。
【０１２８】
試験２の結果を表２に示す。試験２では、５個の未熟胚より１０７個の分割切片を得、それぞれから１０７個のカルスを再分化培地に置床したところ、１００の植物体を得た。このうち９５の植物体について１枚ずつの葉でＧＵＳ遺伝子の発現を調査したところ、１６個の植物体がＧＵＳを一様に発現する形質転換体であった。その形質転換効率は、再分化植物体当たり１６．８％であった。以上のように選抜工程を全く経ることなく、再分化植物体当たり１０％以上という非常に高い効率で形質転換体が得られた。
【０１２９】
試験１および試験２ともにいくつかの植物体の葉片でＧＵＳ遺伝子の発現がドット状を呈した（表１および表２）。この異常な発現は、ジーンサイレンシングによるものと推測される。なお、このドット状の発現を示した植物体は形質転換体とは見なさなかった。
【０１３０】
サザンブロット解析の結果を、図１に示した。ＧＵＳ遺伝子の発現で陽性を示した再分化植物体は、調査した１１個体すべてにおいて導入ＧＵＳ遺伝子の存在が確認された（図１）。ＧＵＳ遺伝子の発現がドット状を示した再分化植物体においても、調査した６個体すべてでＧＵＳ遺伝子の存在が確認されたが、いずれの個体においても導入された遺伝子のコピー数が多い傾向があった（図１）。また、ＧＵＳ遺伝子の発現が陰性であった再分化植物体についても、サザンブロット解析を実施したが、供試した７植物体いずれにおいてもＧＵＳプローブとハイブリダイズするバンドは検出されなかった。
【０１３１】
本実施例では、遺伝子導入した未熟胚の胚盤細胞を増殖させ、その中からランダムに抽出したカルスより再分化植物体を得た。このうち１０％以上が形質転換した植物体であった。このことは、アグロバクテリウム感染により未熟胚の胚盤細胞の１０％以上が
形質転換されていることを示している。
【０１３２】
【表１】
【０１３３】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１は、無選抜形質転換により得られたゆきひかり再分化植物体のサザンブロット解析の結果を示す。 アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１３４）で形質転換し、無選抜得た再分化植物体よりゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に供したのち、ＧＵＳプローブとハイブリダイゼーションした。種子由来ゆきひかり（対照）（レーンＣ）、ＧＵＳ陽性発現（ＧＵＳを一様に発現）再分化植物体（レーン１−１１）、ＧＵＳドット状発現再分化植物体（レーン１２−１７）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）アグロバクテリウムを接種した植物材料を、共存培地で培養する共存工程、及び
(ｉｉ）（ｉ）で得られた組織を、カルス増殖培養を行わず、あるいはカルス増殖培養を行った後に、再分化培地で培養し植物体を再分化させる工程
を含む、アグロバクテリウムを用いた形質転換植物の製造方法であって
１）形質転換向上処理を行うこと、及び
２）共存から再分化までのいずれの工程においても、アグロバクテリウムにより導入される核酸の特性を利用した形質転換細胞の選抜を行なわないことを特徴とする、前記形質転換植物の作成方法。
【請求項２】
３）共存培養後の組織をカルス増殖培地で培養する工程を、共存工程と再分化工程の間に含まないこと、をさらに特徴として有する、請求項１に記載の形質転換植物の作成方法。
【請求項３】
アグロバクテリウムにより導入される核酸の特性を利用した形質転換細胞の選抜が、選抜薬剤に対する耐性遺伝子と選抜薬剤を用いた選抜である、請求項１又は２に記載の形質転換植物の作成方法。
【請求項４】
１）形質転換向上処理が、目的遺伝子の植物細胞への導入効率を向上させる処理、未熟胚などからのカルス誘導率を向上させる処理、あるいは、形質転換カルスからの再分化効率を向上させる処理である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の形質転換植物の作成方法。
【請求項５】
１）形質転換向上処理が以下からなるグループから選択される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の形質転換植物の作成方法。
熱処理；
遠心処理；
熱及び遠心処理；
加圧処理；
硝酸銀および／または硫酸銅の共存培地への添加；
粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理；
共存工程後の、カルス増殖及び／または再分化工程における培地へのカルベニシリン添加；
カルス増殖培地にＮ６無機塩を添加する処理；ならびに
共存培地にシステインを添加する処理
【請求項６】
共存工程において、ベンゾイック系除草剤に属する化合物を添加することを含む、請求項１ないし５に記載の形質転換植物の作成方法。
【請求項７】
ベンゾイック系除草剤に属する化合物が、安息香酸型、サリチル酸型またはピコリン酸型のいずれかである、請求項６に記載の形質転換植物の作成方法。
【請求項８】
ベンゾイック系除草剤に属する化合物が、３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸、または４−アミノ−３，５，６−トリクロロピコリン酸である、請求項６または７に記載の形質転換植物の作成方法。
【請求項９】
植物が単子葉植物である、請求項１ないし８に記載の形質転換植物の作成方法。
【請求項１０】
植物がトウモロコシ又はイネである、請求項１ないし９に記載の形質転換植物の作成方法。
【請求項１】
（ｉ）アグロバクテリウムを接種した植物材料を、共存培地で培養する共存工程、及び
(ｉｉ）（ｉ）で得られた組織を、カルス増殖培養を行わず、あるいはカルス増殖培養を行った後に、再分化培地で培養し植物体を再分化させる工程
を含む、アグロバクテリウムを用いた形質転換植物の製造方法であって
１）形質転換向上処理を行うこと、及び
２）共存から再分化までのいずれの工程においても、アグロバクテリウムにより導入される核酸の特性を利用した形質転換細胞の選抜を行なわないことを特徴とする、前記形質転換植物の作成方法。
【請求項２】
３）共存培養後の組織をカルス増殖培地で培養する工程を、共存工程と再分化工程の間に含まないこと、をさらに特徴として有する、請求項１に記載の形質転換植物の作成方法。
【請求項３】
アグロバクテリウムにより導入される核酸の特性を利用した形質転換細胞の選抜が、選抜薬剤に対する耐性遺伝子と選抜薬剤を用いた選抜である、請求項１又は２に記載の形質転換植物の作成方法。
【請求項４】
１）形質転換向上処理が、目的遺伝子の植物細胞への導入効率を向上させる処理、未熟胚などからのカルス誘導率を向上させる処理、あるいは、形質転換カルスからの再分化効率を向上させる処理である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の形質転換植物の作成方法。
【請求項５】
１）形質転換向上処理が以下からなるグループから選択される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の形質転換植物の作成方法。
熱処理；
遠心処理；
熱及び遠心処理；
加圧処理；
硝酸銀および／または硫酸銅の共存培地への添加；
粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理；
共存工程後の、カルス増殖及び／または再分化工程における培地へのカルベニシリン添加；
カルス増殖培地にＮ６無機塩を添加する処理；ならびに
共存培地にシステインを添加する処理
【請求項６】
共存工程において、ベンゾイック系除草剤に属する化合物を添加することを含む、請求項１ないし５に記載の形質転換植物の作成方法。
【請求項７】
ベンゾイック系除草剤に属する化合物が、安息香酸型、サリチル酸型またはピコリン酸型のいずれかである、請求項６に記載の形質転換植物の作成方法。
【請求項８】
ベンゾイック系除草剤に属する化合物が、３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸、または４−アミノ−３，５，６−トリクロロピコリン酸である、請求項６または７に記載の形質転換植物の作成方法。
【請求項９】
植物が単子葉植物である、請求項１ないし８に記載の形質転換植物の作成方法。
【請求項１０】
植物がトウモロコシ又はイネである、請求項１ないし９に記載の形質転換植物の作成方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−１２０４７８（Ｐ２０１１−１２０４７８Ａ）
【公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−９４０４９（Ｐ２００８−９４０４９）
【出願日】平成２０年３月３１日（２００８．３．３１）
【出願人】（０００００４５６９）日本たばこ産業株式会社 (406)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月３１日（２００８．３．３１）
【出願人】（０００００４５６９）日本たばこ産業株式会社 (406)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]