アフィニティー粒子及びアフィニティー分離方法
【課題】有機粒子を利用したアフィニティー粒子により、簡便かつ高精度に目的物質を分離することが可能なアフィニティー分離方法を提供すること。
【解決手段】下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドを有機粒子の表面に共有結合又は吸着で有することを特徴とするアフィニティー粒子である。
（１）
【解決手段】下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドを有機粒子の表面に共有結合又は吸着で有することを特徴とするアフィニティー粒子である。
（１）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアフィニティー粒子及びアフィニティー分離方法に関する。さらに詳しくは、有機粒子を利用したアフィニティー粒子及び目的物質を高精度にかつ容易に分離することが可能なアフィニティー分離方法に関する。本発明のアフィニティー粒子は、目的物質を高感度かつ容易に検出可能な免疫沈降法、ラテックス凝集法等を始めとする各種の分離、精製、検査方法に対して極めて有用に活用される。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体物質の分離精製にはカラムクロマトグラフィーが用いられてきた。しかしながら、カラム分離には、下記（１）〜（３）に示す致命的な問題点があった。
（１）目的物質を得るまでに多種のカラムを用いなければならず、精製効率が悪い。
（２）分画成分中に目的物質が含まれているかどうかの確認試験を行う必要があることから、精製に多大な時間を要する。
（３）精製時のロスも大きいため多量のサンプルが必要となる。
【０００３】
これに対して、目的物質の分離精製には、リガンドが担持されたアフィニティーカラムやアフィニティー粒子が使用されている（特許文献１、特許文献２）。
【０００４】
しかしながら、アフィニティーカラムによる分離精製には下記の問題点があった。
（１）所望の目的物質が選択的に分離されない。すなわち、リガンドに捕捉される目的物質の他に、希望しない物質もカラムに吸着されてしまう。
（２）捕捉効率が低く、多量の液体試料が必要となる。
【０００５】
また、アフィニティー粒子を液体試料中に分散させて分離するアフィニティー分離方法には、アガロースなどが使用されているが（非特許文献１）、所望の目的物質が選択的に分離されないという問題点があった。すなわち、リガンドに捕捉される目的物質の他に、希望しない物質もアフィニティー粒子に吸着されてしまう。
【０００６】
有機粒子からなるアフィニティー粒子は、上記の致命的な問題点の他にも、高い塩濃度の試料中では、有機粒子の凝集が起こりやすくなる問題点があった。そのため、試料を希釈して測定を行う必要があった。
【０００７】
【特許文献１】特公平８−２６０７６号公報
【特許文献２】特表平２００２−５１１１４１号公報
【非特許文献１】Bioconjugate Chem.； 2002; 13(2); 163-166
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上述の課題の解決を目的とするもので、各種の分離、精製、検査方法等に使用される有機粒子からなるアフィニティー粒子を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明は、下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有することを特徴とするアフィニティー粒子を提供するものである。
【化４】
（１）
【００１０】
また、本発明は、下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドと結合可能な反応基又は吸着基を有機粒子の表面に共有結合又は吸着で有することを特徴とするアフィニティー粒子を提供するものである。
【化５】
（１）
【００１１】
さらに、本発明は、下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドを有機粒子の表面に共有結合又は吸着で有することを特徴とするアフィニティー粒子を提供するものである。
【化６】
（１）
【００１２】
また、本発明は、前記有機粒子が、スチレン、メタクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸、Ｎ−アルキルアクリルアミド、（メタ）アクリル酸アルキルのうち１種または２種以上のモノマー単位を重合体中に含む合成粒子、又は、アガロース若しくはセファロースからなる多糖類であって、その平均粒子径が２０ｎｍ〜５００μｍであることを特徴とする上記のアフィニティー粒子を提供するものである。
【００１３】
さらに、本発明は、前記リガンドが、各種抗体、抗原、酵素、基質、レセプター、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、ビオチン、キレート化合物、各種金属イオンからなる群から選ばれた一種又は二種以上のリガンドであることを特徴とする上記のアフィニティー粒子を提供するものである。
【００１４】
また、本発明は、（１）請求項１又は２に記載のアフィニティー粒子に任意のリガンドを結合させる第１工程、（２）第１工程で製造したアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む液体試料に分散させる第２工程、（３）アフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収する第３工程を含むことを特徴とする有機粒子による目的物質のアフィニティー分離方法を提供するものである。
【００１５】
さらに、本発明は、（１）請求項３記載のアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む液体試料に分散させる第１工程、（２）アフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収する第２工程を含むことを特徴とする有機粒子による目的物質のアフィニティー分離方法を提供するものである。
なお、本発明のアフィニティー粒子を、免疫沈降法やラテックス凝集法等の抗体や蛋白の検出に用いる場合には、（２）の回収工程は不要であり、その分散状態の変化により目視で容易に確認できる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のアフィニティー粒子は、ある目的物質（分離を希望する目的の物質）のみをリガンドにより捕捉し、その他の物質が粒子に吸着するのを抑制するため、分離選択性が極めて高い。そして、その優れた分散性と、血清中のよう各種の塩が存在する試料中でも、凝集が起こらずに、簡便かつ高精度に目的物質を分離することが可能となる。
【００１７】
すなわち、本発明の目的物質の分離方法は、分離を目的とする目的物質を短時間に効率良く、かつ簡便に分離することが出来る。通常、物質は異物に対して吸着する性質を有しているため、従来のアフィニティー粒子では目的物質のみを効率良く単離するのは困難であるが、粒子表面をホスホリルコリン基で修飾することにより、目的物質のアフィニティー粒子に対する非特異的吸着を極めて効率良く防止でき、精製効率を高めることが可能である。
【００１８】
また、ホスホリルコリン基は極めて高い親水性を有しており、水を含む液体試料中にて、アフィニティー粒子の分散性を向上させる機能も有する。
【００１９】
さらに、通常の粒子は塩により凝集する傾向があるため、例えば、血清から目的物を単離したい場合、血清中の各種の塩により凝集し精製効率が低下するが、本発明のアフィニティー粒子は塩の存在下でも凝集が少なく、効率的に目的物を回収できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００２１】
「有機粒子」
本発明において、アフィニティー粒子を構成する有機粒子は特に限定されない。有機粒子とは一般に平均粒径２０ｎｍ〜５００μｍ程度の有機の物体を意味する。具体的な粒子としては、スチレン、メタクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸、Ｎ−アルキルアクリルアミド、（メタ）アクリル酸アルキル、（メタ）アクリル酸アミノアルキル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキルのうち１種または２種以上のモノマー単位を重合体の中に含むような合成粒子、或いはアガロース、セファロース等の有機粒子が挙げられる。また外層に有機の物体、内側に無機粒子を含むコア−シェル構造のハイブリッド粒子も含まれる。
【００２２】
特に好ましい粒子は、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−メタクリル酸グリシジル−ジビニルベンゼン共重合体、アクリル酸−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチレンビスアクリルアミド共重合体、２−ヒドロキシメタクリレート−スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、２−アミノエチルメタクリレート−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチレンビスアクリルアミド共重合体など、乳化重合、懸濁重合などにより容易に合成可能な粒子である。
【００２３】
上記（１）式のホスホリルコリン基と、リガンドが結合可能な反応基又は吸着基とが、粒子表面に共有結合によって導入させるため、その表面にアミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基などの反応基を有する粒子が好ましい。
【００２４】
また、有機粒子の平均粒子径が２０ｎｍ〜５００μmであるアフィニティー粒子が好ましい。
例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−メタクリル酸グリシジル−ジビニルベンゼン共重合体、アクリル酸−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチレンビスアクリルアミド共重合体、２−ヒドロキシメタクリレート−スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、２−アミノエチルメタクリレート−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチレンビスアクリルアミド共重合体などである。
【００２５】
「リガンドが結合可能な反応基又は吸着基」
リガンドが結合できる限り限定されない。例えば、共有結合形態では、アミド、エステル、ウレタン、エーテル、２級アミン、尿素結合、ジスルフィド結合などが好ましい。従って、リガンドがこれらの共有結合形態となり得る反応基が好ましく、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、チオール基等が好ましい。また吸着形態は、アビジン−ビオチン、金属−キレート化合物などが好ましい。従って、リガンドがこれらの吸着形態となり得る吸着基が好ましく、アビジン、ビオチン、キレート化合物等が好ましい。
【００２６】
「リガンド」
本発明において、リガンドとは、ある目的物質と特異的に結合する物質であり、各種抗体、抗原、酵素、基質、レセプター、リガンド、ペプチド、アプタマー、プロテインA、プロテインG、アビジン、ビオチン、キレート化合物、各種金属イオンなどである。例えば、各種抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ、多糖類、酵素はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、基質はグルタチオン、レセプターはホルモンレセプター、サイトカインレセプター、リガンドはレクチン、キレート化合物はニトリロ三酢酸、各種金属イオンはNi2+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+である。
【００２７】
「本発明のアフィニティー粒子の製造方法」
式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドと結合可能な反応基又は吸着基を有機粒子の表面に共有結合又は吸着とを有機粒子の表面に直接的に存在していることが本発明の本質であるので、その製造方法は限定されず、いかなる方法により結合させてもよい。
但し、上述したように、ホスホリルコリン基及びリガンドが結合可能な反応基又は吸着基をあらかじめ有する重合体を用い、化学結合することなく粒子表面を単に被覆する態様は含まない。被覆された重合体が剥れてしまったり、被覆重合体による影響が生じたりするからである。
【００２８】
本発明のアフィニティー粒子は下記方法等によって製造できる。
ステップ１：粒子に下記式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドが結合可能な反応基又は吸着基を導入する。反応基又は吸着基は限定されないが、アミノ基や水酸基、カルボキシル基、チオール基などである。
ステップ２：粒子に導入した反応基又は吸着基に対して、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドとを結合させる。なお、ホスホリルコリン基又はリガンドと反応基又は吸着基の間に存在する化学構造（スペーサー）は任意である。例えば、任意なスペーサーとして、メチレン鎖、オキシエチレン鎖などの他、アミノ基を１つまたは複数含むアルキレン鎖でも良い。
【００２９】
「粒子表面に存在している反応基又は吸着基がアミノ基の場合」
ステップ１：任意の粒子に、公知の方法若しくは今後開発される方法にてアミノ基を導入する。アミノ基は粒子表面に直接的に導入される。アミノ基は一級アミン若しくは二級アミンである。
ステップ２：アミノ基を有する粒子に対し、グリセロホスホリルコリンの酸化的開裂反応により得られたアルデヒド体又はハイドレート体を、還元的アミノ化反応によって、ホスホリルコリン基を粒子表面に直接的に付加させる。
すべてのアミノ基に対してホスホリルコリン基を結合させずに（反応量を調節する）、残存するアミノ基が、リガンドが結合可能な置換基となる。
または、アミノ基を有する粒子に対し、グリセロホスホリルコリンの酸化的開裂により得られたカルボキシル体を、アミド化反応によってホスホリルコリン基を粒子表面に直接的に付加させる。全てのアミノ基に対してホスホリルコリン基を結合させずに（反応量を調節する）、残存するアミノ基が、リガンドが結合可能な置換基となる。
【００３０】
「粒子表面へのアミノ基の導入方法」
粒子にアミノ基を導入する公知の方法（ステップ１）としては、下記が挙げられる。
１．プラズマ処理の表面反応によるアミノ基の導入
窒素ガス雰囲気下で低温プラズマにより粒子表面にアミノ基を導入する。具体的には粒子をプラズマ反応容器内に収容し、反応容器内を真空ポンプで真空にした後、窒素ガスと水素ガスを導入する。続いてグロー放電により、粒子表面にアミノ基を導入できる。プラズマ処理した有機材料を機械的に粒子化することも可能である。プラズマ処理に関する文献を下記に示す。
1. M. Muller, C. oehr
Plasma aminofunctionalisation of PVDF microfiltration membranes: comparison of the in plasma modifications with a grafting method using ESCA and an amino-selective fluorescent probe
Surface and Coatings Technology 116-119 (1999) 802-807
2. Lidija Tusek, Mirko Nitschke, Carsten Werner, Karin Stana-Kleinschek, Volker Ribitsch
Surface characterization of NH3 plasma treated polyamide 6 foils
Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 195 (2001) 81-95
3. Fabienne Poncin-Epaillard, Jean-Claude Brosse, Thierry Falher
Reactivity of surface groups formed onto a plasma treated poly (propylene) film
Macromol. Chem. Phys. 200. 989-996 (1999)
【００３１】
２．表面改質剤によるアミノ基の導入
アミノ基を有するアルコキシシラン、クロロシラン、シラザンなどの表面改質剤を用いて、アルコキシシリル基含有粒子等の有機粒子表面を処理する。
例えば、１級アミノ基を有する３−アミノプロピルトリメトキシシランにより、アルコキシシリル基含有粒子を処理してアミノ基を導入する。具体的には、３−トリメトキシシリルプロピル１−メタクリレート−メタクリル酸メチル−ジビニルベンゼン共重合粒子を水−２−プロパノール混合液中に浸し、３−アミノプロピルトリメトキシシランを添加後、５０℃に加熱し６時間反応させる。室温に冷却後、上記重合体をメタノールで洗浄し、乾燥してアミノ基が上記共重合粒子表面に直接導入された粒子が得られる。
【００３２】
３．シリコーン気相処理によるアミノ基の導入（特公平１−５４３７９号公報、特公平１−５４３８０号公報、特公平１−５４３８１号公報参照）
粒子表面をまず１．３．５．７−テトラメチルシクロテトラシロキサンにより処理し、表面に導入されたＳｉ−Ｈ基と、アミノ基を有するモノマーを反応させてアミノ化された表面を得る。例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合粒子と１．３．５．７−テトラメチルシクロテトラシロキサンをデシケーター中に入れ、アスピレーターで脱気する。８０℃で１６時間反応させた後、上記粒子を取り出し、５０℃で乾燥させる。得られた粒子をエタノール中に分散し、アリルアミンを添加、続いて塩化白金酸のエタノール溶液を添加し、６０℃で２時間攪拌する。反応終了後、濾過、エタノール洗浄、減圧乾燥してアミノ化有機粒子を得る。
本法に用いるモノマーは、アミン系モノマーを用いることが出来る。アミン系モノマーとは、アリルアミンに限られず、アミノ基及び重合可能なビニル、アクリル等の反応性部位を有していれば良い。アミノ基は、ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基などにより保護されていても良い。
また、アミン系モノマーでなくても、エポキシ基のように、例えばジアミンとの反応により簡単にアミノ基を導入可能な官能基を有するモノマーでも良い。
【００３３】
「アミノ基を有する粒子にホスホリルコリン基を導入する方法」
次に、アミノ化された粒子表面にホスホリルコリン基を導入する方法（ステップ２）を以下に示す。
粒子をメタノール中に漬し、ホスファチジルグリセロアルデヒドを添加し、室温で６時間放置する。そして、シアノホウ素酸ナトリウムを０℃で添加、一晩加熱攪拌し、アミノ基にホスホリルコリン基を付加させる。粒子をメタノールで洗浄後、乾燥し、ホスホリルコリン基を表面に直接有する粒子が得られる。反応溶媒はメタノール以外にも水、エタノール、２−プロパノール等プロトン性溶媒であれば使用可能であるが、メタノールを用いた場合の導入率が高い傾向にある。
または、粒子をジメチルスルホキシド−水混合溶液に分散し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩およびカルボキシメチルホスホリルコリンを溶解したジメチルスルホキシド−水混合溶液を添加する。室温で６時間攪拌し、粒子を水で充分洗浄後、乾燥し、ホスホリルコリン基を表面に直接有する粒子が得られる。反応溶媒は上記以外にもＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、アセトニトリルなど非プロトン性溶媒が好ましく用いられる。或いは、カルボキシメチルホスホリルコリンと塩化チオニルを反応させて酸塩化物とし、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド、アセトニトリルなどを溶媒とした無水条件下で粒子と反応させて粒子を水で充分洗浄後、乾燥し、ホスホリルコリン基を表面に直接有する粒子が得られる。この方法は表面の水酸基とも効率良く反応を行わせることができ、粒子がアガロース、セファロースなど多糖類の場合や２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレートの場合に有効である。
【００３４】
表面改質剤に３−アミノプロピルトリメトキシシランを用いてアミノ基を、アルコキシシリル基を有する有機粒子に導入し、次にホスホリルコリン基（ＰＣと略す）を導入する方法のスキームを下記に示す。
【化７】
【００３５】
上記で説明したように、アミノ基を有する粒子を調製し、グリセロホスホリルコリンの酸化的開裂反応により得られたアルデヒド体又はハイドレート体との還元的アミノ化反応によりホスホリルコリン基が粒子表面に直接付加した粒子を製造することができる。
この方法は、ホスホリルコリン基の導入率が高く、また、様々な有機粒子の表面を修飾できるという大きな利点がある。
【００３６】
上記の方法は、グリセロホスホリルコリンの酸化的開裂反応により得られるアルデヒド体を含有する化合物が、公知のグリセロホスホリルコリン基を、公知の方法により酸化的開裂を行わせるもので、極めて簡単なステップである。この反応は、１，２−ジオールを過ヨウ素酸、或いは過ヨウ素酸塩を用いて酸化することにより結合を開裂させ、２つのアルデヒド体を得るものであり、本法の場合、ホスホリルコリンアルデヒド体とホルムアルデヒドを生成する。反応は通常水中または水を含む有機溶媒中で行われる。反応温度は０度から室温である。アルデヒド体は水中で平衡反応を経てハイドレートとなることもあるが、続くアミンとの反応には影響しない。下記にホスホリルコリン基を含有する一官能のアルデヒド体を調製するスキームを示す。
【化８】
【００３７】
グリセロホスホリルコリンの酸化的開裂反応により得られるアルデヒド体(若しくはハイドレート体)を粒子のアミノ基に結合させる還元的アミノ化反応は、両者を溶媒中にて攪拌することにより容易に行うことが出来る。この反応は両者を水或いはアルコール中に溶解または分散し（第三成分の有機溶媒を混合しても良い）、イミンを形成させた後、これを還元剤により還元して２級アミンを得るものである。還元剤としてはシアノホウ素酸ナトリウム等マイルドな還元剤が好ましいが、ホスホリルコリンが安定な限り、他の還元剤を用いることも可能である。反応は通常０度から室温で行われるが、場合により加熱することもある。
【００３８】
また、上記アミノ基には、式（２）で示される化合物を任意の量だけ常法により反応させて、残存するアミノ基をリガンドが結合可能な反応基又は吸着基としても良い。
【化９】
（２）
ｎ＝１〜１２までの整数
【００３９】
「リガンドが結合可能な反応基又は吸着基について」
上記反応においては、すべてのアミノ基に対してホスホリルコリン基を結合させずに（反応量を調節する）、残存するアミノ基が、リガンドが結合可能な反応基又は吸着基となる。この粒子が請求項２記載のアフィニティー粒子であり、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドが結合可能な反応基又は吸着基とが有機粒子の表面に直接的に存在する粒子となる。そして、この残存するアミノ基にリガンドを結合させたものが、請求項３記載のアフィニティー粒子となり、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドとが有機粒子の表面に直接的に存在する粒子となる。
請求項２記載のアフィニティー粒子は、捕捉したい物質（目的物質）に応じて使用者が任意のリガンドを結合させることが可能となる製品態様である。請求項３記載のアフィニティー粒子はあらかじめリガンドを結合させた製品態様である。なお、請求項１記載のアフィニティー粒子は、少なくとも式（１）のホスホリルコリン基が粒子表面に存在しているアフィニティー粒子であり、リガンドやこれを結合できる反応基又は吸着基の有無に限らず、捕捉したい物質（目的物質）に応じて使用者が任意のリガンドを結合させることが出来る製品態様である。また、少なくとも式（１）のホスホリルコリン基が粒子表面に存在している限り、いかなる態様のアフィニティー粒子を含むものであり、例えば請求項２及び請求項３の態様も含むものである。
【００４０】
上記の反応において、リガンドが結合可能な反応基又は吸着基としてアミノ基を残存させておくには、３−アミノプロピルトリメトキシシランとホスホリルコリン基を導入した３−アミノプロピルトリメトキシシランとを競合反応させる方法又は反応量を調節するなどにより行うことが出来る。
なお、このアミノ基に任意の官能基を有する化合物を反応させて、その官能基をリガンドが結合可能な反応基又は吸着基としても良い。例えば、グルタルアルデヒド、アルキルジイミデート、アシルアジド類、イソシアネート類などが考えられる。
【００４１】
なお、上記の表面改質剤に３−アミノプロピルトリメトキシシランを使用した場合のスキームにおいて、表面改質剤の反応量を調整して、粒子表面に存在する水酸基（ＯＨ）を残しておき、残存するＯＨ基を、リガンドが結合可能な反応基又は吸着基として利用することも出来る。
【００４２】
「アミノ基を持つ粒子へのリガンドの結合方法について」
リガンドが蛋白質の場合、有機粒子上のアミノ基にグルタルアルデヒドの片方のアルデヒド基を反応させ、もう一方のアルデヒド基に蛋白質中のアミノ基を反応させ、蛋白質を結合させる。
【００４３】
「粒子表面に存在している反応基又は吸着基が水酸基の場合」
有機粒子に水酸基が存在する場合は、上記のアミノ基のようなリガンドが結合可能な反応基又は吸着基を新たに導入することなく、粒子表面に存在する水酸基（ＯＨ）をそのまま利用して、ホスホリルコリン基及びリガンド又はリガンドが結合可能な反応基又は吸着基を導入する。本発明のアフィニティー粒子はこの方法により製造することが好ましい。
【００４４】
「水酸基を有する粒子にホスホリルコリン基を導入する方法」
粒子表面の水酸基と、下記式（３）または（４）の化合物のＳｉ−ＯＭｅから脱水によって化学結合を形成させる。この化学反応はほとんどの有機溶媒中で、加熱・還流を行うことで極めて容易に定量的に進行する。この脱水反応によって化学的、物理的に極めて安定なホスホリルコリン基を導入することが出来るので好ましい。なお、下記式（３）または（４）で示されるホスホリルコリン基含有化合物は新規化合物である。
【化１０】
（３）
【化１１】
（４）
式中、ｍは２〜６、ｎは１〜４である。ＯＭｅは、ＯＥｔ、Ｃｌであってもよい。またＳｉと結合するＯＭｅまたはＯＥｔまたはＣｌの内、２つまではメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基でも良い。
【００４５】
「式（３）のホスホリルコリン基含有化合物の製造方法」
下記式（５）に示したホスホリルコリン誘導体を蒸留水に溶解させる。下記式（５）のホスホリルコリン誘導体は公知の化合物であり市販品を入手できる。
【化１２】
（５）
【００４６】
式（５）の化合物の水溶液を氷水浴中で冷却し、過ヨウ素酸ナトリウムを添加し、５時間攪拌した。反応液を減圧濃縮、減圧乾燥し、メタノールにより下記式（６）に示すアルデヒド基を有するホスホリルコリン誘導体を抽出する。
【化１３】
（６）
【００４７】
次に、式（６）のメタノール溶液に３−アミノプロピルトリメトキシシランを０．５当量添加する。この混合溶液を室温で所定時間撹拌したのち、氷冷し、シアノヒドロホウ素化ナトリウムを適量添加し、室温に戻して１６時間撹拌する。この間も反応容器には乾燥窒素を流し続ける。沈殿をろ過した後、式（３）のメタノール溶液を得る。
【００４８】
上記の手順は、式（３）に示した化合物中のｍ、ｎが変わっても全く同様に行うことができる。ここで示した手順はｍ＝３、ｎ＝２の場合である。反応溶媒は特に限定されず、上述したメタノール以外にも水や、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール、ＤＭＦやＤＭＳＯなどの非プロトン性溶媒を用いることができる。ただし、反応中の重合を防ぐためには脱水溶媒が好ましく、なかでも脱水メタノールが好適である。
また、（３）中のメトキシ基（ＯＭｅ）がエトキシ基（ＯＥｔ）の場合はメタノールをエタノールに変えて反応を行い、Ｃｌの場合はジメチルホルムアミドやジメチルスルホキシドに変更するだけでよい。
さらには、Ｓｉと結合するＯＭｅまたはＯＥｔまたはＣｌの内、２つまたは１つがメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基のいずれかで置換されている場合も上記の手法と全く同様に製造することができる。
「式（４）のホスホリルコリン基含有化合物の製造方法」
式（５）の化合物の水溶液を氷水浴中で冷却し、過ヨウ素酸ナトリウム及び触媒量の三塩化ルテニウムを添加し、３時間攪拌する。反応液を減圧濃縮、減圧乾燥し、メタノールにより下記式に示すカルボキシル基を有するホスホリルコリン誘導体（７）を抽出する。
【化１４】
（７）
次に、式（７）のアセトニトリル或いはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド分散液に塩化チオニル１．２当量を添加し、３０分間攪拌した溶液に３−アミノプロピルトリメトキシシランを０．９当量添加する。この混合溶液を室温で４時間撹拌し、式（８）の化合物が得られる。
【化１５】
（８）
また、上記縮合反応に用いる試薬は、塩化チオニル以外にも、五塩化リン、オキシ塩化リン、三臭化リン、オキザリルクロライドなど、一般的にカルボン酸ハロゲン化物を生成するものであれば問題なく使用できる。
また、式（８）のシランカップラーを用いる以外にも、式（７）の化合物を直接水酸基と反応させることが可能である。例えば、セファロースビーズを無水アセトニトリル中に分散し、式（７）の化合物及び１．２当量の塩化チオニルを混合して一晩攪拌したアセトニトリル溶液を添加、３時間攪拌して表面にホスホリルコリン化合物が導入された粒子を得る。
【００４９】
「リガンドが結合可能な反応基又は吸着基について」
上記反応においては、すべての水酸基に対してホスホリルコリン基を結合させずに（反応量を調節する）、残存する水酸基が、リガンドが結合可能な反応基又は吸着基となる。この粒子が請求項２記載のアフィニティー粒子であり、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドが結合可能な反応基又は吸着基とが有機粒子の表面に直接的に存在する粒子となる。そして、この残存する水酸基にリガンドを結合させたものが、請求項３記載のアフィニティー粒子となり、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドとが有機粒子の表面に直接的に存在する粒子となる。
請求項２記載のアフィニティー粒子は、捕捉したい物質（目的物質）に応じて使用者が任意のリガンドを結合させることが可能となる製品態様である。請求項３記載のアフィニティー粒子はあらかじめリガンドを結合させた製品態様である。なお、請求項１記載のアフィニティー粒子は、少なくとも式（１）のホスホリルコリン基が粒子表面に存在しているアフィニティー粒子であり、リガンドやリガンドが結合可能な反応基又は吸着基の有無に限らず、捕捉したい物質（目的物質）に応じて使用者が任意のリガンドを結合させることが出来る製品態様である。また、少なくとも式（１）のホスホリルコリン基が粒子表面に存在している限り、いかなる態様のアフィニティー粒子を含むものであり、例えば請求項２及び請求項３の態様も含むものである。
【００５０】
「水酸基を持つ粒子へのリガンドの結合方法について」
リガンドが蛋白質の場合、粒子上の水酸基を臭化シアンを用いて活性化する。ここに蛋白質中のアミノ基を反応させ、蛋白質を結合させる。
なお、この水酸基に、任意の官能基を有する化合物を反応させて、その官能基を蛋白質が結合可能な反応基又は吸着基としても良い。
【００５１】
「粒子に導入した反応基又は吸着基がカルボキシル基の場合」
ステップ１：任意の粒子に、公知の方法若しくは今後開発される方法にてカルボキシル基を導入する。カルボキシル基は粒子表面に直接的に導入される。
ステップ２：カルボキシル基を有する粒子に対し、下記式（９）で示されるホスホリルコリン含有化合物を常法により反応させて、ホスホリルコリン基を酸アミド結合させ、残存するカルボキシル基をリガンドが結合可能な反応基又は吸着基としても良い。
すべてのカルボキシル基に対してホスホリルコリン基を結合させずに（反応量を調節する）、残存するカルボキシル基が、リガンドが結合可能な反応基又は吸着基となる。
【化１６】
（９）
【００５２】
「粒子表面へのカルボキシル基の導入方法」
粒子にカルボキシル基を導入する公知の方法（ステップ１）としては、下記が挙げられる。
１．表面改質剤によるカルボキシル基の導入
カルボキシル基を有するアルコキシシラン、クロロシラン、シラザンなどの表面改質剤を用いて、アルコキシシリル含有粒子等の有機粒子表面を処理する。
例えば、トリエトキシシリルプロピル無水コハク酸により、アルコキシシリル基を有する有機粒子を処理してカルボキシル基を導入する。具体的には、トリエトキシシリルプロピル無水コハク酸をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解させ、蒸留水と４−ジメチルアミノピリジンを添加し、１６時間室温で撹拌し、カルボン酸を有するシランカップリング剤を得る。本反応は無水コハク酸の４−ジメチルアミノピリジンによる加水分解反応である。
カルボン酸を有するシランカップリング剤により、アルコキシシリル基を有する有機粒子を水−２−プロパノール混合液中に浸し、カルボン酸を有するシランカップリング剤を添加後、５０℃に加熱し６時間反応させる。室温に冷却後、有機粒子をメタノールで洗浄し、乾燥してカルボキシル基が有機粒子表面に直接導入された粒子が得られる。
【００５３】
２．シリコーン気相処理によるカルボキシル基の導入（特公平１−５４３７９号公報、特公平１−５４３８０号公報、特公平１−５４３８１号公報参照）
粒子表面をまず１．３．５．７−テトラメチルシクロテトラシロキサンにより処理し、表面に導入されたＳｉ−Ｈ基と、カルボキシル基を有するモノマーを反応させてカルボキシル化された表面を得る。
本法に用いるモノマーは、カルボキシル系モノマーを用いることが出来る。カルボキシル系モノマーとは、カルボキシル基及び重合可能なビニル、アクリル等の反応性部位を有していれば良い。
【００５４】
「カルボキシル基を有する粒子にホスホリルコリン基を導入する方法」
次に、カルボキシル化された粒子表面にホスホリルコリン基を導入する方法（ステップ２）を以下に示す。
カルボキシル基が表面にある粒子をＮ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドの溶液に浸すと、粒子の表面が活性エステル基で覆われる。ここに式（９）に示すアミノ基を有するホスホリルコリン誘導体溶液を入れ、ホスホリルコリン基を導入する。
【００５５】
「リガンドが結合可能な反応基又は吸着基について」
上記反応においては、すべてのカルボキシル基に対してホスホリルコリン基を結合させずに（反応量を調節する）、残存するカルボキシル基が、リガンドが結合可能な反応基又は吸着基となる。この粒子が請求項２記載のアフィニティー粒子であり、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドが結合可能な反応基又は吸着基とが有機粒子の表面に直接的に存在する粒子となる。そして、このリガンドが結合可能な反応基又は吸着基にリガンドを結合させたものが、請求項３記載のアフィニティー粒子となり、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドとが有機粒子の表面に直接的に存在する粒子となる。
請求項２記載のアフィニティー粒子は、捕捉したい物質（目的物質）に応じて使用者が任意のリガンドを結合させることが可能となる製品態様である。請求項３記載のアフィニティー粒子はあらかじめリガンドを結合させた製品態様である。なお、請求項１記載のアフィニティー粒子は、少なくとも式（１）のホスホリルコリン基が粒子表面に存在しているアフィニティー粒子であり、リガンドやリガンドが結合可能な反応基又は吸着基の有無に限らず、捕捉したい物質（目的物質）に応じて使用者が任意のリガンドを結合させることが出来る製品態様である。また、少なくとも式（１）のホスホリルコリン基が粒子表面に存在している限り、いかなる態様のアフィニティー粒子をも含むものであり、例えば請求項２及び請求項３の態様も含むものである。
【００５６】
上記の反応において、カルボキシル基をリガンドが結合可能な反応基又は吸着基として残存させておくには、ホスホリルコリン基を導入したカルボン酸を有するシランカップリング剤の反応量を調節するなどにより行うことが出来る。
なお、このカルボキシル基に、任意の官能基を有する化合物を反応させて、その官能基をリガンドが結合可能な反応基又は吸着基としても良い。
【００５７】
「カルボキシル基を持つ粒子へのリガンドの結合方法について」
リガンドが蛋白質の場合、有機粒子上のカルボキシル基にＮ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドの溶液に浸し、粒子の表面を活性エステル化する。ここに蛋白質中のアミノ基を反応させ、蛋白質を結合させる。なお、この水酸基に、任意の官能基を有する化合物を反応させて、その官能基を蛋白質が結合可能な反応基又は吸着基としても良い。
【００５８】
「目的物質のアフィニティー分離方法」
上記で得られる本発明のアフィニティー粒子を用いて、本発明の目的物質のアフィニティー分離方法が行われる。
本発明の方法は、有機粒子を利用して、高精度な分離が簡便に行われるという点で画期的な目的物質の分離方法である。
本発明の方法は、下記の３つの工程を含むものである。なお、あらかじめリガンドが結合されているアフィニティー粒子の場合は（請求項２）、第１工程はすでに行われているので省略される。
１．式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有するアフィニティー粒子又は式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドを有機粒子の表面に共有結合又は吸着で有することを特徴とするアフィニティー粒子に、任意のリガンドを化学結合させる第１工程。
例えば、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドが結合可能な反応基又は吸着基とを有機粒子の表面に、前者は共有結合で後者は共有結合又は吸着で有するアフィニティー粒子と任意のリガンドのＰＢＳ溶液１ｍｌを２ｍｌエッペンチューブに入れて、３０分間４℃で緩やかに振る。１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心し、上清を捨てる。洗浄のため、ＰＢＳ溶液１ｍｌを加えて、緩やかに振り、１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心して、上清を捨てる。この洗浄操作を３回繰り返す。
２．第１工程で製造したアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む液体試料に分散させる第２工程。
例えば、第１工程で製造したアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む液体試料に分散させ、３０分間４℃で緩やかに振る。１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心し、上清を捨てる。洗浄のため、ＰＢＳ溶液１ｍｌを加えて、緩やかに振り、１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心して、上清を捨てる。この洗浄操作を３回繰り返す。
３．分離したアフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収する第３工程。
例えば、アフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収するため、溶出バッファー１ｍｌを加え、３０分間４℃で緩やかに振り、粒子から目的物質を溶出させ、上清を回収する。溶出バッファー１ｍｌを加えて、緩やかに振り、１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心して、上清を回収する。この操作を２回繰り返す。
図１は、本発明のアフィニティー粒子と従来のアフィニティー粒子による目的物質捕捉の選択性の違いを示す模式図である。
【実施例】
【００５９】
次に、本発明を実施例に基づきさらに詳しく説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。粒子表面に導入されたホスホリルコリン基は以下の方法により確認されて定量出来る。
＜定量方法＞
得られた粒子を、過塩素酸に浸し、180℃に加熱して分解した。得られた溶液を水で希釈し、そこに七モリブデン酸六アンモニウム四水和物とＬアスコルビン酸を入れ、95℃にて5分間発色させた後、710nmの吸光度測定して、導入量を求めた。検量線にはリン酸二水素ナトリウム水溶液を用いた。
【００６０】
「合成例１」
「ホスホリルコリン基を含有するアルデヒド化合物」
１−α−グリセロホスホリルコリン（６．２９ｇ）を蒸留水２１０ｍｌに溶解し、氷水浴中で冷却した。過ヨウ素酸ナトリウム（１０．２３ｇ）を添加し、５時間攪拌した。反応液を減圧濃縮、減圧乾燥し、メタノールにより目的物を抽出した。下記に化合物（６）に構造を示す。
式（６）の化合物の重水中での１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図２に示す。式（６）の化合物は水中において式（１０）と平衡状態なので、実際のスペクトルは式（６）と式（１０）の双方を反映したものとなる。
【化１７】
（６）
【化１８】
（１０）
【００６１】
「合成例２」
「ホスホリルコリン基を含有するカルボン酸化合物」
１−α−グリセロホスホリルコリン５ｇを水７０ｍｌ−アセトニトリル３０ｍｌに溶解した。氷冷下、過ヨウ素酸ナトリウム１７ｇと三塩化ルテニウム８０ｍｇを添加し、一晩攪拌した。沈殿物をろ過し、減圧濃縮、メタノール抽出により化学式（７）に示す目的とするカルボキシメチルホスホリルコリンを得た。
式（７）の化合物の重水中での１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図３に示す。
【化１９】
（７）
【００６２】
「参考例１」
「スチレン−グリシジルメタクリレート粒子」
グリシジルメタクリレート３．６ｇ、スチレン２．４ｇ、ジビニルベンゼン０．０８ｇを窒素置換により充分に脱気した精製水２２０ｍｌに添加した。重合開始剤V-60 ０．１２ｇを添加し、７０℃で１時間攪拌した。更にグリシジルメタクリレート０．６ｇを添加し、７０℃で一晩攪拌した。室温まで冷却し、遠心分離（15000rpm x 30分 ３回）により精製し、目的とする粒子を得た。
【００６３】
「アミノ基導入スチレン−グリシジルメタクリレート粒子」
スチレン−グリシジルメタクリレート粒子１ｇを精製水８０ｍｌに分散し、２５％アンモニア水溶液２０ｍｌを添加し、７０℃で一晩過熱攪拌した。室温に冷却し、遠心分離（17000rpm x 60分 ３回）により精製した。
【００６４】
「ホスホリルコリン修飾粒子（ＰＣ粒子（Ａ））」
アミノ基を導入したスチレン−グリシジルメタクリレート粒子０．５ｇをメタノール１０ｍｌに分散し、合成例１のアルデヒド体０．５gを添加し、一晩攪拌した。シアノホウ素酸ナトリウム１４０ｍｇを氷水浴中で添加し、６時間攪拌後、遠心分離（17000rpm x 60分 ３回）により精製して、ＰＣ粒子（Ａ）を得た。
【００６５】
「塩による凝集」
図４、５に参考例１で作製したスチレン−グリシジルメタクリレート粒子とＰＣ粒子（Ａ）の水中及び食塩水（０．１Ｍ水溶液）における粒度分布を示す。
図４から、アフィニティー粒子を使用したラテックス凝集法に一般的に用いられるスチレン−グリシジルメタクリレート粒子は、水中での粒度分布のサイズに比較して、ＮａＣｌ水溶液中での粒度分布のサイズは大幅に大きくなっており、凝集が起こっていることを示している。一方、図５から、ＰＣ粒子（Ａ）の食塩水溶液中での粒度分布の変化は、図４の場合と比較して小さくなっており、塩による凝集が起こりにくいことを示している。以上から、ＰＣ粒子（Ａ）は式（１）のホスホリルコリンによる修飾により、塩などの妨害物質の影響を低減し、測定制度を高めることができる。
【００６６】
「蛋白質非特異吸着抑制評価」
参考例１で作製したスチレン−グリシジルメタクリレート粒子とＰＣ粒子（Ａ）をそれぞれ２５mｇずつとり、蒸留水１ｍｌ加えて超音波処理を１分間行った。遠心で蒸留水を取り除き、アルブミン（１００μｇ／ｍＬ）或いはリゾチーム（１００μｇ／ｍＬ）を１ｍＬ加えて室温で１時間反応させ、遠心（５０００ｇ）後の上清をＭＩＣＲＯ ＢＣＡ法で定量した。その結果を図６に示す。スチレン−グリシジルメタクリレート粒子に比べホスホリルコリン基で処理されているＰＣ粒子（Ａ）はアルブミン、リゾチームともに吸着がかなり抑制されていることが分かった。これから、式（１）のホスホリルコリンによる修飾により、蛋白質の吸着量は大幅に減少していることがわかる。粒子同士の凝集と同時に、粒子に対する各種蛋白質の非特異的吸着も測定精度低下の大きな要因となるので、本発明のアフィニティー粒子は、リガンドにより選択的に目的蛋白質のみを捕捉する精度に優れている。
【００６７】
「参考例２」
「２−アミノエチルメタクリレート−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチレンビスアクリルアミド粒子」
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１．３５ｇとメチレンビスアクリルアミド５８ｍｇを窒素置換により充分に脱気した精製水２００ｍｌ中に添加した。重合開始剤Ｖ−５０ ７ｍｇを添加し、７０℃で３０分攪拌した。２−アミノエチルメタクリレート１００ｍｇを添加し、更に４時間７０℃で攪拌し、室温まで冷却した後、水中で透析、凍結乾燥により目的とする粒子を得た。
【００６８】
「ホスホリルコリン修飾粒子（ＰＣ粒子（Ｂ））」
得られた２−アミノエチルメタクリレート−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチレンビスアクリルアミド粒子０．１ｇをメタノール２０ｍｌに分散し、合成例１のアルデヒド体２５ｍｇを添加し、一晩攪拌した。シアノホウ素酸ナトリウム６ｍｇを氷水浴中で添加し、６時間攪拌後、水中で透析により精製して、ＰＣ粒子（Ｂ）を得た。
【００６９】
「ホスホリルコリン修飾粒子（ＰＣ粒子（Ｃ））」
得られた２−アミノエチルメタクリレート−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチレンビスアクリルアミド粒子０．１ｇをジメチルスルホキシド８ｍｌ−水２ｍｌに分散し、合成例２のカルボキシル体２５ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド２０ｍｇ、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩２３mgを溶解した水１ｍｌを添加、一晩攪拌した。水中で透析により精製して、ＰＣ粒子（Ｃ）を得た。
【００７０】
「蛋白質非特異吸着抑制評価」
参考例１で作製したスチレン−グリシジルメタクリレート粒子と参考例２で作製したＰＣ粒子（Ｂ）、（Ｃ）をそれぞれ２５mｇずつとり、蒸留水１ｍｌ加えて超音波処理を１分間行った。遠心で蒸留水を取り除き、アルブミン（１００μｇ／ｍＬ）或いはリゾチーム（１００μｇ／ｍＬ）を１ｍＬ加えて室温で１時間反応させ、遠心（５０００ｇ）後の上清をＭＩＣＲＯ ＢＣＡ法で定量した。その結果を図７に示す。スチレン−グリシジルメタクリレート粒子に比べホスホリルコリン基で処理されているＰＣ粒子（Ｂ）、（Ｃ）はアルブミン、リゾチームともに吸着がかなり抑制されていることが分かった。これから、式（１）のホスホリルコリンによる修飾により、蛋白質の吸着量は大幅に減少していることがわかる。粒子同士の凝集と同時に、粒子に対する各種蛋白質の非特異的吸着も測定精度低下の大きな要因となるので、本発明のアフィニティー粒子は、リガンドにより選択的に目的蛋白質のみを捕捉する精度に優れている。
【００７１】
「参考例３」
「ホスホリルコリン修飾粒子（ＰＣ粒子（Ｄ））」
アガローズビーズ（架橋率６％）１００ｍｇを無水Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド１０ｍｌに分散、合成例２のカルボキシル体５０ｍｇと塩化チオニル２５ｍｇを無水Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド１ｍｌに溶解、反応させた溶液を添加し、室温で３時間攪拌した。Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド、アセトニトリルで順次遠心分離により精製して、ＰＣ粒子（Ｄ）を得た。
【００７２】
「蛋白質非特異吸着抑制評価」
参考例１で作製したスチレン−グリシジルメタクリレート粒子と参考例３で作製したＰＣ粒子（Ｄ）をそれぞれ２５mｇずつとり、蒸留水１ｍｌ加えて超音波処理を１分間行った。遠心で蒸留水を取り除き、アルブミン（１００μｇ／ｍＬ）或いはリゾチーム（１００μｇ／ｍＬ）を１ｍＬ加えて室温で１時間反応させ、遠心（５０００ｇ）後の上清をＭＩＣＲＯ ＢＣＡ法で定量した。その結果を図８に示す。アガロースビーズに比べホスホリルコリン基で処理されているＰＣ粒子（Ｄ）はアルブミン、リゾチームともに吸着がかなり抑制されていることが分かった。これから、式（１）のホスホリルコリンによる修飾により、蛋白質の吸着量は大幅に減少していることがわかる。粒子同士の凝集と同時に、粒子に対する各種蛋白質の非特異的吸着も測定精度低下の大きな要因となるので、本発明のアフィニティー粒子は、リガンドにより選択的に目的蛋白質のみを捕捉する精度に優れている。
【００７３】
「実施例１」
「アフィニティー粒子」
次に、請求項６で示すアフィニティー分離法を示す。参考例２で得られた２−アミノエチルメタクリレート−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチレンビスアクリルアミド粒子０．１ｇに合成例１のアルデヒド体１０ｍｇを添加し、一晩攪拌した後、シアノホウ素酸ナトリウム３ｍｇを氷水浴中で添加し、６時間攪拌後、水中で透析により精製して製造した。このアフィニティー粒子２５mgにグルタルアルデヒド溶液（８％）１ｍＬとシッフ塩基の安定化のためシアノトリヒドロホウ酸ナトリウム１０ｍｇを加えて室温で５時間反応させ、ＰＢＳで遠心・精製（５０００ｇ）５回で洗浄した。グルタルアルデヒドがリガンドが結合可能な反応基又は吸着基である請求項２のアフィニティー粒子を得た。次にウシアルブミン（１ｍｇ／ｍＬ）或いはヒトヘモグロビン（１ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬとトリヒドロホウ酸ナトリウム１０ｍｇを加えて室温で１日反応させ、ＰＢＳで遠心・精製（５０００ｇ）を４回行った。このウシアルブミン或いはヒトヘモグロビンがリガンドである。ここから、請求項７で示すアフィニティー分離法である。残っているグルタルアルデヒド基を不活性化するためエタノ−ルアミン塩酸塩（０．５Ｍ、ｐＨ７．１）１ｍＬとトリヒドロホウ酸ナトリウム１０ｍｇを加えて室温で１時間反応させ、ＰＢＳで遠心・精製（５０００ｇ）を４回行い、請求項３のアフィニティー粒子を得た。次にＨＲＰ標識抗ウシアルブミン抗体（１０μｇ／ｍＬ）或いはＨＲＰ標識抗ヒトヘモグロビン抗体（１０μｇ／ｍＬ）を１ｍＬ加えて、室温で１時間反応させ、ＰＢＳで遠心・精製（５０００ｇ）を５回行った。さらにＰＢＳを１ｍＬ加えて攪拌し、１０μｌを９６穴ウェルプレートに移して基質ＴＭＢＺを用いて発色試験を行い、４５０nmで測定を行った。その結果を図９に示す。どちらのリガンドを用いた場合でも、高選択的に目的抗体を捕捉していることが分かった。
【００７４】
「比較例１」
参考例２で得られた２−アミノエチルメタクリレート−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチレンビスアクリルアミド粒子０．１ｇにホスホリルコリンによる修飾をしないで実施例と同じ操作を行った場合の結果を図１０に示す。実施例１に比べどちらのリガンドを用いた場合でも、選択性が低いことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明のアフィニティー粒子は、分離を希望する目的物質のみを捕捉するため、選択性が極めて高い。そして、その優れた分散性と、液体試料からの分離が極めて容易である。また、塩による凝集も少ないので、簡便かつ高精度に目的物質を分離することが可能である。また、免疫沈降法、ラテックス凝集法などの試薬としても、塩の影響を受けることなく、感度良く検出が可能であることから、目的物質の高精度分離、検出が要求される生体関連の産業に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明のアフィニティー粒子と従来のアフィニティー粒子による蛋白質捕捉の選択性の違いを示す模式図である。
【図２】合成例１で製造した化合物の構造式及びＮＭＲスペクトルである。
【図３】合成例２で製造した化合物の構造式及びＮＭＲスペクトルである。
【図４】従来のアフィニティー粒子の水中及び食塩水での粒度分布を示すグラフである。
【図５】本発明のアフィニティー粒子の水中及び食塩水での粒度分布を示すグラフである。
【図６】参考例１で作製したスチレン−グリシジルメタクリレート粒子とＰＣ粒子（Ａ）に対する蛋白質吸着量を比較するグラフである。
【図７】参考例２で作製したスチレン−グリシジルメタクリレート粒子とＰＣ粒子（Ｂ）、（Ｃ）に対する蛋白質吸着量を比較するグラフである。
【図８】参考例３で作製したアガロースビーズとＰＣ粒子（Ｄ）に対する蛋白質吸着量を比較するグラフである。
【図９】実施例１のアフィニティー粒子の抗体選択性を比較するグラフである。
【図１０】比較例１のアフィニティー粒子の抗体選択性を比較するグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明はアフィニティー粒子及びアフィニティー分離方法に関する。さらに詳しくは、有機粒子を利用したアフィニティー粒子及び目的物質を高精度にかつ容易に分離することが可能なアフィニティー分離方法に関する。本発明のアフィニティー粒子は、目的物質を高感度かつ容易に検出可能な免疫沈降法、ラテックス凝集法等を始めとする各種の分離、精製、検査方法に対して極めて有用に活用される。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体物質の分離精製にはカラムクロマトグラフィーが用いられてきた。しかしながら、カラム分離には、下記（１）〜（３）に示す致命的な問題点があった。
（１）目的物質を得るまでに多種のカラムを用いなければならず、精製効率が悪い。
（２）分画成分中に目的物質が含まれているかどうかの確認試験を行う必要があることから、精製に多大な時間を要する。
（３）精製時のロスも大きいため多量のサンプルが必要となる。
【０００３】
これに対して、目的物質の分離精製には、リガンドが担持されたアフィニティーカラムやアフィニティー粒子が使用されている（特許文献１、特許文献２）。
【０００４】
しかしながら、アフィニティーカラムによる分離精製には下記の問題点があった。
（１）所望の目的物質が選択的に分離されない。すなわち、リガンドに捕捉される目的物質の他に、希望しない物質もカラムに吸着されてしまう。
（２）捕捉効率が低く、多量の液体試料が必要となる。
【０００５】
また、アフィニティー粒子を液体試料中に分散させて分離するアフィニティー分離方法には、アガロースなどが使用されているが（非特許文献１）、所望の目的物質が選択的に分離されないという問題点があった。すなわち、リガンドに捕捉される目的物質の他に、希望しない物質もアフィニティー粒子に吸着されてしまう。
【０００６】
有機粒子からなるアフィニティー粒子は、上記の致命的な問題点の他にも、高い塩濃度の試料中では、有機粒子の凝集が起こりやすくなる問題点があった。そのため、試料を希釈して測定を行う必要があった。
【０００７】
【特許文献１】特公平８−２６０７６号公報
【特許文献２】特表平２００２−５１１１４１号公報
【非特許文献１】Bioconjugate Chem.； 2002; 13(2); 163-166
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上述の課題の解決を目的とするもので、各種の分離、精製、検査方法等に使用される有機粒子からなるアフィニティー粒子を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明は、下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有することを特徴とするアフィニティー粒子を提供するものである。
【化４】
（１）
【００１０】
また、本発明は、下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドと結合可能な反応基又は吸着基を有機粒子の表面に共有結合又は吸着で有することを特徴とするアフィニティー粒子を提供するものである。
【化５】
（１）
【００１１】
さらに、本発明は、下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドを有機粒子の表面に共有結合又は吸着で有することを特徴とするアフィニティー粒子を提供するものである。
【化６】
（１）
【００１２】
また、本発明は、前記有機粒子が、スチレン、メタクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸、Ｎ−アルキルアクリルアミド、（メタ）アクリル酸アルキルのうち１種または２種以上のモノマー単位を重合体中に含む合成粒子、又は、アガロース若しくはセファロースからなる多糖類であって、その平均粒子径が２０ｎｍ〜５００μｍであることを特徴とする上記のアフィニティー粒子を提供するものである。
【００１３】
さらに、本発明は、前記リガンドが、各種抗体、抗原、酵素、基質、レセプター、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、ビオチン、キレート化合物、各種金属イオンからなる群から選ばれた一種又は二種以上のリガンドであることを特徴とする上記のアフィニティー粒子を提供するものである。
【００１４】
また、本発明は、（１）請求項１又は２に記載のアフィニティー粒子に任意のリガンドを結合させる第１工程、（２）第１工程で製造したアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む液体試料に分散させる第２工程、（３）アフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収する第３工程を含むことを特徴とする有機粒子による目的物質のアフィニティー分離方法を提供するものである。
【００１５】
さらに、本発明は、（１）請求項３記載のアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む液体試料に分散させる第１工程、（２）アフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収する第２工程を含むことを特徴とする有機粒子による目的物質のアフィニティー分離方法を提供するものである。
なお、本発明のアフィニティー粒子を、免疫沈降法やラテックス凝集法等の抗体や蛋白の検出に用いる場合には、（２）の回収工程は不要であり、その分散状態の変化により目視で容易に確認できる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のアフィニティー粒子は、ある目的物質（分離を希望する目的の物質）のみをリガンドにより捕捉し、その他の物質が粒子に吸着するのを抑制するため、分離選択性が極めて高い。そして、その優れた分散性と、血清中のよう各種の塩が存在する試料中でも、凝集が起こらずに、簡便かつ高精度に目的物質を分離することが可能となる。
【００１７】
すなわち、本発明の目的物質の分離方法は、分離を目的とする目的物質を短時間に効率良く、かつ簡便に分離することが出来る。通常、物質は異物に対して吸着する性質を有しているため、従来のアフィニティー粒子では目的物質のみを効率良く単離するのは困難であるが、粒子表面をホスホリルコリン基で修飾することにより、目的物質のアフィニティー粒子に対する非特異的吸着を極めて効率良く防止でき、精製効率を高めることが可能である。
【００１８】
また、ホスホリルコリン基は極めて高い親水性を有しており、水を含む液体試料中にて、アフィニティー粒子の分散性を向上させる機能も有する。
【００１９】
さらに、通常の粒子は塩により凝集する傾向があるため、例えば、血清から目的物を単離したい場合、血清中の各種の塩により凝集し精製効率が低下するが、本発明のアフィニティー粒子は塩の存在下でも凝集が少なく、効率的に目的物を回収できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００２１】
「有機粒子」
本発明において、アフィニティー粒子を構成する有機粒子は特に限定されない。有機粒子とは一般に平均粒径２０ｎｍ〜５００μｍ程度の有機の物体を意味する。具体的な粒子としては、スチレン、メタクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸、Ｎ−アルキルアクリルアミド、（メタ）アクリル酸アルキル、（メタ）アクリル酸アミノアルキル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキルのうち１種または２種以上のモノマー単位を重合体の中に含むような合成粒子、或いはアガロース、セファロース等の有機粒子が挙げられる。また外層に有機の物体、内側に無機粒子を含むコア−シェル構造のハイブリッド粒子も含まれる。
【００２２】
特に好ましい粒子は、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−メタクリル酸グリシジル−ジビニルベンゼン共重合体、アクリル酸−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチレンビスアクリルアミド共重合体、２−ヒドロキシメタクリレート−スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、２−アミノエチルメタクリレート−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチレンビスアクリルアミド共重合体など、乳化重合、懸濁重合などにより容易に合成可能な粒子である。
【００２３】
上記（１）式のホスホリルコリン基と、リガンドが結合可能な反応基又は吸着基とが、粒子表面に共有結合によって導入させるため、その表面にアミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基などの反応基を有する粒子が好ましい。
【００２４】
また、有機粒子の平均粒子径が２０ｎｍ〜５００μmであるアフィニティー粒子が好ましい。
例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−メタクリル酸グリシジル−ジビニルベンゼン共重合体、アクリル酸−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチレンビスアクリルアミド共重合体、２−ヒドロキシメタクリレート−スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、２−アミノエチルメタクリレート−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチレンビスアクリルアミド共重合体などである。
【００２５】
「リガンドが結合可能な反応基又は吸着基」
リガンドが結合できる限り限定されない。例えば、共有結合形態では、アミド、エステル、ウレタン、エーテル、２級アミン、尿素結合、ジスルフィド結合などが好ましい。従って、リガンドがこれらの共有結合形態となり得る反応基が好ましく、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、チオール基等が好ましい。また吸着形態は、アビジン−ビオチン、金属−キレート化合物などが好ましい。従って、リガンドがこれらの吸着形態となり得る吸着基が好ましく、アビジン、ビオチン、キレート化合物等が好ましい。
【００２６】
「リガンド」
本発明において、リガンドとは、ある目的物質と特異的に結合する物質であり、各種抗体、抗原、酵素、基質、レセプター、リガンド、ペプチド、アプタマー、プロテインA、プロテインG、アビジン、ビオチン、キレート化合物、各種金属イオンなどである。例えば、各種抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ、多糖類、酵素はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、基質はグルタチオン、レセプターはホルモンレセプター、サイトカインレセプター、リガンドはレクチン、キレート化合物はニトリロ三酢酸、各種金属イオンはNi2+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+である。
【００２７】
「本発明のアフィニティー粒子の製造方法」
式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドと結合可能な反応基又は吸着基を有機粒子の表面に共有結合又は吸着とを有機粒子の表面に直接的に存在していることが本発明の本質であるので、その製造方法は限定されず、いかなる方法により結合させてもよい。
但し、上述したように、ホスホリルコリン基及びリガンドが結合可能な反応基又は吸着基をあらかじめ有する重合体を用い、化学結合することなく粒子表面を単に被覆する態様は含まない。被覆された重合体が剥れてしまったり、被覆重合体による影響が生じたりするからである。
【００２８】
本発明のアフィニティー粒子は下記方法等によって製造できる。
ステップ１：粒子に下記式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドが結合可能な反応基又は吸着基を導入する。反応基又は吸着基は限定されないが、アミノ基や水酸基、カルボキシル基、チオール基などである。
ステップ２：粒子に導入した反応基又は吸着基に対して、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドとを結合させる。なお、ホスホリルコリン基又はリガンドと反応基又は吸着基の間に存在する化学構造（スペーサー）は任意である。例えば、任意なスペーサーとして、メチレン鎖、オキシエチレン鎖などの他、アミノ基を１つまたは複数含むアルキレン鎖でも良い。
【００２９】
「粒子表面に存在している反応基又は吸着基がアミノ基の場合」
ステップ１：任意の粒子に、公知の方法若しくは今後開発される方法にてアミノ基を導入する。アミノ基は粒子表面に直接的に導入される。アミノ基は一級アミン若しくは二級アミンである。
ステップ２：アミノ基を有する粒子に対し、グリセロホスホリルコリンの酸化的開裂反応により得られたアルデヒド体又はハイドレート体を、還元的アミノ化反応によって、ホスホリルコリン基を粒子表面に直接的に付加させる。
すべてのアミノ基に対してホスホリルコリン基を結合させずに（反応量を調節する）、残存するアミノ基が、リガンドが結合可能な置換基となる。
または、アミノ基を有する粒子に対し、グリセロホスホリルコリンの酸化的開裂により得られたカルボキシル体を、アミド化反応によってホスホリルコリン基を粒子表面に直接的に付加させる。全てのアミノ基に対してホスホリルコリン基を結合させずに（反応量を調節する）、残存するアミノ基が、リガンドが結合可能な置換基となる。
【００３０】
「粒子表面へのアミノ基の導入方法」
粒子にアミノ基を導入する公知の方法（ステップ１）としては、下記が挙げられる。
１．プラズマ処理の表面反応によるアミノ基の導入
窒素ガス雰囲気下で低温プラズマにより粒子表面にアミノ基を導入する。具体的には粒子をプラズマ反応容器内に収容し、反応容器内を真空ポンプで真空にした後、窒素ガスと水素ガスを導入する。続いてグロー放電により、粒子表面にアミノ基を導入できる。プラズマ処理した有機材料を機械的に粒子化することも可能である。プラズマ処理に関する文献を下記に示す。
1. M. Muller, C. oehr
Plasma aminofunctionalisation of PVDF microfiltration membranes: comparison of the in plasma modifications with a grafting method using ESCA and an amino-selective fluorescent probe
Surface and Coatings Technology 116-119 (1999) 802-807
2. Lidija Tusek, Mirko Nitschke, Carsten Werner, Karin Stana-Kleinschek, Volker Ribitsch
Surface characterization of NH3 plasma treated polyamide 6 foils
Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 195 (2001) 81-95
3. Fabienne Poncin-Epaillard, Jean-Claude Brosse, Thierry Falher
Reactivity of surface groups formed onto a plasma treated poly (propylene) film
Macromol. Chem. Phys. 200. 989-996 (1999)
【００３１】
２．表面改質剤によるアミノ基の導入
アミノ基を有するアルコキシシラン、クロロシラン、シラザンなどの表面改質剤を用いて、アルコキシシリル基含有粒子等の有機粒子表面を処理する。
例えば、１級アミノ基を有する３−アミノプロピルトリメトキシシランにより、アルコキシシリル基含有粒子を処理してアミノ基を導入する。具体的には、３−トリメトキシシリルプロピル１−メタクリレート−メタクリル酸メチル−ジビニルベンゼン共重合粒子を水−２−プロパノール混合液中に浸し、３−アミノプロピルトリメトキシシランを添加後、５０℃に加熱し６時間反応させる。室温に冷却後、上記重合体をメタノールで洗浄し、乾燥してアミノ基が上記共重合粒子表面に直接導入された粒子が得られる。
【００３２】
３．シリコーン気相処理によるアミノ基の導入（特公平１−５４３７９号公報、特公平１−５４３８０号公報、特公平１−５４３８１号公報参照）
粒子表面をまず１．３．５．７−テトラメチルシクロテトラシロキサンにより処理し、表面に導入されたＳｉ−Ｈ基と、アミノ基を有するモノマーを反応させてアミノ化された表面を得る。例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合粒子と１．３．５．７−テトラメチルシクロテトラシロキサンをデシケーター中に入れ、アスピレーターで脱気する。８０℃で１６時間反応させた後、上記粒子を取り出し、５０℃で乾燥させる。得られた粒子をエタノール中に分散し、アリルアミンを添加、続いて塩化白金酸のエタノール溶液を添加し、６０℃で２時間攪拌する。反応終了後、濾過、エタノール洗浄、減圧乾燥してアミノ化有機粒子を得る。
本法に用いるモノマーは、アミン系モノマーを用いることが出来る。アミン系モノマーとは、アリルアミンに限られず、アミノ基及び重合可能なビニル、アクリル等の反応性部位を有していれば良い。アミノ基は、ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基などにより保護されていても良い。
また、アミン系モノマーでなくても、エポキシ基のように、例えばジアミンとの反応により簡単にアミノ基を導入可能な官能基を有するモノマーでも良い。
【００３３】
「アミノ基を有する粒子にホスホリルコリン基を導入する方法」
次に、アミノ化された粒子表面にホスホリルコリン基を導入する方法（ステップ２）を以下に示す。
粒子をメタノール中に漬し、ホスファチジルグリセロアルデヒドを添加し、室温で６時間放置する。そして、シアノホウ素酸ナトリウムを０℃で添加、一晩加熱攪拌し、アミノ基にホスホリルコリン基を付加させる。粒子をメタノールで洗浄後、乾燥し、ホスホリルコリン基を表面に直接有する粒子が得られる。反応溶媒はメタノール以外にも水、エタノール、２−プロパノール等プロトン性溶媒であれば使用可能であるが、メタノールを用いた場合の導入率が高い傾向にある。
または、粒子をジメチルスルホキシド−水混合溶液に分散し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩およびカルボキシメチルホスホリルコリンを溶解したジメチルスルホキシド−水混合溶液を添加する。室温で６時間攪拌し、粒子を水で充分洗浄後、乾燥し、ホスホリルコリン基を表面に直接有する粒子が得られる。反応溶媒は上記以外にもＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、アセトニトリルなど非プロトン性溶媒が好ましく用いられる。或いは、カルボキシメチルホスホリルコリンと塩化チオニルを反応させて酸塩化物とし、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド、アセトニトリルなどを溶媒とした無水条件下で粒子と反応させて粒子を水で充分洗浄後、乾燥し、ホスホリルコリン基を表面に直接有する粒子が得られる。この方法は表面の水酸基とも効率良く反応を行わせることができ、粒子がアガロース、セファロースなど多糖類の場合や２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレートの場合に有効である。
【００３４】
表面改質剤に３−アミノプロピルトリメトキシシランを用いてアミノ基を、アルコキシシリル基を有する有機粒子に導入し、次にホスホリルコリン基（ＰＣと略す）を導入する方法のスキームを下記に示す。
【化７】
【００３５】
上記で説明したように、アミノ基を有する粒子を調製し、グリセロホスホリルコリンの酸化的開裂反応により得られたアルデヒド体又はハイドレート体との還元的アミノ化反応によりホスホリルコリン基が粒子表面に直接付加した粒子を製造することができる。
この方法は、ホスホリルコリン基の導入率が高く、また、様々な有機粒子の表面を修飾できるという大きな利点がある。
【００３６】
上記の方法は、グリセロホスホリルコリンの酸化的開裂反応により得られるアルデヒド体を含有する化合物が、公知のグリセロホスホリルコリン基を、公知の方法により酸化的開裂を行わせるもので、極めて簡単なステップである。この反応は、１，２−ジオールを過ヨウ素酸、或いは過ヨウ素酸塩を用いて酸化することにより結合を開裂させ、２つのアルデヒド体を得るものであり、本法の場合、ホスホリルコリンアルデヒド体とホルムアルデヒドを生成する。反応は通常水中または水を含む有機溶媒中で行われる。反応温度は０度から室温である。アルデヒド体は水中で平衡反応を経てハイドレートとなることもあるが、続くアミンとの反応には影響しない。下記にホスホリルコリン基を含有する一官能のアルデヒド体を調製するスキームを示す。
【化８】
【００３７】
グリセロホスホリルコリンの酸化的開裂反応により得られるアルデヒド体(若しくはハイドレート体)を粒子のアミノ基に結合させる還元的アミノ化反応は、両者を溶媒中にて攪拌することにより容易に行うことが出来る。この反応は両者を水或いはアルコール中に溶解または分散し（第三成分の有機溶媒を混合しても良い）、イミンを形成させた後、これを還元剤により還元して２級アミンを得るものである。還元剤としてはシアノホウ素酸ナトリウム等マイルドな還元剤が好ましいが、ホスホリルコリンが安定な限り、他の還元剤を用いることも可能である。反応は通常０度から室温で行われるが、場合により加熱することもある。
【００３８】
また、上記アミノ基には、式（２）で示される化合物を任意の量だけ常法により反応させて、残存するアミノ基をリガンドが結合可能な反応基又は吸着基としても良い。
【化９】
（２）
ｎ＝１〜１２までの整数
【００３９】
「リガンドが結合可能な反応基又は吸着基について」
上記反応においては、すべてのアミノ基に対してホスホリルコリン基を結合させずに（反応量を調節する）、残存するアミノ基が、リガンドが結合可能な反応基又は吸着基となる。この粒子が請求項２記載のアフィニティー粒子であり、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドが結合可能な反応基又は吸着基とが有機粒子の表面に直接的に存在する粒子となる。そして、この残存するアミノ基にリガンドを結合させたものが、請求項３記載のアフィニティー粒子となり、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドとが有機粒子の表面に直接的に存在する粒子となる。
請求項２記載のアフィニティー粒子は、捕捉したい物質（目的物質）に応じて使用者が任意のリガンドを結合させることが可能となる製品態様である。請求項３記載のアフィニティー粒子はあらかじめリガンドを結合させた製品態様である。なお、請求項１記載のアフィニティー粒子は、少なくとも式（１）のホスホリルコリン基が粒子表面に存在しているアフィニティー粒子であり、リガンドやこれを結合できる反応基又は吸着基の有無に限らず、捕捉したい物質（目的物質）に応じて使用者が任意のリガンドを結合させることが出来る製品態様である。また、少なくとも式（１）のホスホリルコリン基が粒子表面に存在している限り、いかなる態様のアフィニティー粒子を含むものであり、例えば請求項２及び請求項３の態様も含むものである。
【００４０】
上記の反応において、リガンドが結合可能な反応基又は吸着基としてアミノ基を残存させておくには、３−アミノプロピルトリメトキシシランとホスホリルコリン基を導入した３−アミノプロピルトリメトキシシランとを競合反応させる方法又は反応量を調節するなどにより行うことが出来る。
なお、このアミノ基に任意の官能基を有する化合物を反応させて、その官能基をリガンドが結合可能な反応基又は吸着基としても良い。例えば、グルタルアルデヒド、アルキルジイミデート、アシルアジド類、イソシアネート類などが考えられる。
【００４１】
なお、上記の表面改質剤に３−アミノプロピルトリメトキシシランを使用した場合のスキームにおいて、表面改質剤の反応量を調整して、粒子表面に存在する水酸基（ＯＨ）を残しておき、残存するＯＨ基を、リガンドが結合可能な反応基又は吸着基として利用することも出来る。
【００４２】
「アミノ基を持つ粒子へのリガンドの結合方法について」
リガンドが蛋白質の場合、有機粒子上のアミノ基にグルタルアルデヒドの片方のアルデヒド基を反応させ、もう一方のアルデヒド基に蛋白質中のアミノ基を反応させ、蛋白質を結合させる。
【００４３】
「粒子表面に存在している反応基又は吸着基が水酸基の場合」
有機粒子に水酸基が存在する場合は、上記のアミノ基のようなリガンドが結合可能な反応基又は吸着基を新たに導入することなく、粒子表面に存在する水酸基（ＯＨ）をそのまま利用して、ホスホリルコリン基及びリガンド又はリガンドが結合可能な反応基又は吸着基を導入する。本発明のアフィニティー粒子はこの方法により製造することが好ましい。
【００４４】
「水酸基を有する粒子にホスホリルコリン基を導入する方法」
粒子表面の水酸基と、下記式（３）または（４）の化合物のＳｉ−ＯＭｅから脱水によって化学結合を形成させる。この化学反応はほとんどの有機溶媒中で、加熱・還流を行うことで極めて容易に定量的に進行する。この脱水反応によって化学的、物理的に極めて安定なホスホリルコリン基を導入することが出来るので好ましい。なお、下記式（３）または（４）で示されるホスホリルコリン基含有化合物は新規化合物である。
【化１０】
（３）
【化１１】
（４）
式中、ｍは２〜６、ｎは１〜４である。ＯＭｅは、ＯＥｔ、Ｃｌであってもよい。またＳｉと結合するＯＭｅまたはＯＥｔまたはＣｌの内、２つまではメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基でも良い。
【００４５】
「式（３）のホスホリルコリン基含有化合物の製造方法」
下記式（５）に示したホスホリルコリン誘導体を蒸留水に溶解させる。下記式（５）のホスホリルコリン誘導体は公知の化合物であり市販品を入手できる。
【化１２】
（５）
【００４６】
式（５）の化合物の水溶液を氷水浴中で冷却し、過ヨウ素酸ナトリウムを添加し、５時間攪拌した。反応液を減圧濃縮、減圧乾燥し、メタノールにより下記式（６）に示すアルデヒド基を有するホスホリルコリン誘導体を抽出する。
【化１３】
（６）
【００４７】
次に、式（６）のメタノール溶液に３−アミノプロピルトリメトキシシランを０．５当量添加する。この混合溶液を室温で所定時間撹拌したのち、氷冷し、シアノヒドロホウ素化ナトリウムを適量添加し、室温に戻して１６時間撹拌する。この間も反応容器には乾燥窒素を流し続ける。沈殿をろ過した後、式（３）のメタノール溶液を得る。
【００４８】
上記の手順は、式（３）に示した化合物中のｍ、ｎが変わっても全く同様に行うことができる。ここで示した手順はｍ＝３、ｎ＝２の場合である。反応溶媒は特に限定されず、上述したメタノール以外にも水や、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール、ＤＭＦやＤＭＳＯなどの非プロトン性溶媒を用いることができる。ただし、反応中の重合を防ぐためには脱水溶媒が好ましく、なかでも脱水メタノールが好適である。
また、（３）中のメトキシ基（ＯＭｅ）がエトキシ基（ＯＥｔ）の場合はメタノールをエタノールに変えて反応を行い、Ｃｌの場合はジメチルホルムアミドやジメチルスルホキシドに変更するだけでよい。
さらには、Ｓｉと結合するＯＭｅまたはＯＥｔまたはＣｌの内、２つまたは１つがメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基のいずれかで置換されている場合も上記の手法と全く同様に製造することができる。
「式（４）のホスホリルコリン基含有化合物の製造方法」
式（５）の化合物の水溶液を氷水浴中で冷却し、過ヨウ素酸ナトリウム及び触媒量の三塩化ルテニウムを添加し、３時間攪拌する。反応液を減圧濃縮、減圧乾燥し、メタノールにより下記式に示すカルボキシル基を有するホスホリルコリン誘導体（７）を抽出する。
【化１４】
（７）
次に、式（７）のアセトニトリル或いはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド分散液に塩化チオニル１．２当量を添加し、３０分間攪拌した溶液に３−アミノプロピルトリメトキシシランを０．９当量添加する。この混合溶液を室温で４時間撹拌し、式（８）の化合物が得られる。
【化１５】
（８）
また、上記縮合反応に用いる試薬は、塩化チオニル以外にも、五塩化リン、オキシ塩化リン、三臭化リン、オキザリルクロライドなど、一般的にカルボン酸ハロゲン化物を生成するものであれば問題なく使用できる。
また、式（８）のシランカップラーを用いる以外にも、式（７）の化合物を直接水酸基と反応させることが可能である。例えば、セファロースビーズを無水アセトニトリル中に分散し、式（７）の化合物及び１．２当量の塩化チオニルを混合して一晩攪拌したアセトニトリル溶液を添加、３時間攪拌して表面にホスホリルコリン化合物が導入された粒子を得る。
【００４９】
「リガンドが結合可能な反応基又は吸着基について」
上記反応においては、すべての水酸基に対してホスホリルコリン基を結合させずに（反応量を調節する）、残存する水酸基が、リガンドが結合可能な反応基又は吸着基となる。この粒子が請求項２記載のアフィニティー粒子であり、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドが結合可能な反応基又は吸着基とが有機粒子の表面に直接的に存在する粒子となる。そして、この残存する水酸基にリガンドを結合させたものが、請求項３記載のアフィニティー粒子となり、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドとが有機粒子の表面に直接的に存在する粒子となる。
請求項２記載のアフィニティー粒子は、捕捉したい物質（目的物質）に応じて使用者が任意のリガンドを結合させることが可能となる製品態様である。請求項３記載のアフィニティー粒子はあらかじめリガンドを結合させた製品態様である。なお、請求項１記載のアフィニティー粒子は、少なくとも式（１）のホスホリルコリン基が粒子表面に存在しているアフィニティー粒子であり、リガンドやリガンドが結合可能な反応基又は吸着基の有無に限らず、捕捉したい物質（目的物質）に応じて使用者が任意のリガンドを結合させることが出来る製品態様である。また、少なくとも式（１）のホスホリルコリン基が粒子表面に存在している限り、いかなる態様のアフィニティー粒子を含むものであり、例えば請求項２及び請求項３の態様も含むものである。
【００５０】
「水酸基を持つ粒子へのリガンドの結合方法について」
リガンドが蛋白質の場合、粒子上の水酸基を臭化シアンを用いて活性化する。ここに蛋白質中のアミノ基を反応させ、蛋白質を結合させる。
なお、この水酸基に、任意の官能基を有する化合物を反応させて、その官能基を蛋白質が結合可能な反応基又は吸着基としても良い。
【００５１】
「粒子に導入した反応基又は吸着基がカルボキシル基の場合」
ステップ１：任意の粒子に、公知の方法若しくは今後開発される方法にてカルボキシル基を導入する。カルボキシル基は粒子表面に直接的に導入される。
ステップ２：カルボキシル基を有する粒子に対し、下記式（９）で示されるホスホリルコリン含有化合物を常法により反応させて、ホスホリルコリン基を酸アミド結合させ、残存するカルボキシル基をリガンドが結合可能な反応基又は吸着基としても良い。
すべてのカルボキシル基に対してホスホリルコリン基を結合させずに（反応量を調節する）、残存するカルボキシル基が、リガンドが結合可能な反応基又は吸着基となる。
【化１６】
（９）
【００５２】
「粒子表面へのカルボキシル基の導入方法」
粒子にカルボキシル基を導入する公知の方法（ステップ１）としては、下記が挙げられる。
１．表面改質剤によるカルボキシル基の導入
カルボキシル基を有するアルコキシシラン、クロロシラン、シラザンなどの表面改質剤を用いて、アルコキシシリル含有粒子等の有機粒子表面を処理する。
例えば、トリエトキシシリルプロピル無水コハク酸により、アルコキシシリル基を有する有機粒子を処理してカルボキシル基を導入する。具体的には、トリエトキシシリルプロピル無水コハク酸をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解させ、蒸留水と４−ジメチルアミノピリジンを添加し、１６時間室温で撹拌し、カルボン酸を有するシランカップリング剤を得る。本反応は無水コハク酸の４−ジメチルアミノピリジンによる加水分解反応である。
カルボン酸を有するシランカップリング剤により、アルコキシシリル基を有する有機粒子を水−２−プロパノール混合液中に浸し、カルボン酸を有するシランカップリング剤を添加後、５０℃に加熱し６時間反応させる。室温に冷却後、有機粒子をメタノールで洗浄し、乾燥してカルボキシル基が有機粒子表面に直接導入された粒子が得られる。
【００５３】
２．シリコーン気相処理によるカルボキシル基の導入（特公平１−５４３７９号公報、特公平１−５４３８０号公報、特公平１−５４３８１号公報参照）
粒子表面をまず１．３．５．７−テトラメチルシクロテトラシロキサンにより処理し、表面に導入されたＳｉ−Ｈ基と、カルボキシル基を有するモノマーを反応させてカルボキシル化された表面を得る。
本法に用いるモノマーは、カルボキシル系モノマーを用いることが出来る。カルボキシル系モノマーとは、カルボキシル基及び重合可能なビニル、アクリル等の反応性部位を有していれば良い。
【００５４】
「カルボキシル基を有する粒子にホスホリルコリン基を導入する方法」
次に、カルボキシル化された粒子表面にホスホリルコリン基を導入する方法（ステップ２）を以下に示す。
カルボキシル基が表面にある粒子をＮ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドの溶液に浸すと、粒子の表面が活性エステル基で覆われる。ここに式（９）に示すアミノ基を有するホスホリルコリン誘導体溶液を入れ、ホスホリルコリン基を導入する。
【００５５】
「リガンドが結合可能な反応基又は吸着基について」
上記反応においては、すべてのカルボキシル基に対してホスホリルコリン基を結合させずに（反応量を調節する）、残存するカルボキシル基が、リガンドが結合可能な反応基又は吸着基となる。この粒子が請求項２記載のアフィニティー粒子であり、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドが結合可能な反応基又は吸着基とが有機粒子の表面に直接的に存在する粒子となる。そして、このリガンドが結合可能な反応基又は吸着基にリガンドを結合させたものが、請求項３記載のアフィニティー粒子となり、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドとが有機粒子の表面に直接的に存在する粒子となる。
請求項２記載のアフィニティー粒子は、捕捉したい物質（目的物質）に応じて使用者が任意のリガンドを結合させることが可能となる製品態様である。請求項３記載のアフィニティー粒子はあらかじめリガンドを結合させた製品態様である。なお、請求項１記載のアフィニティー粒子は、少なくとも式（１）のホスホリルコリン基が粒子表面に存在しているアフィニティー粒子であり、リガンドやリガンドが結合可能な反応基又は吸着基の有無に限らず、捕捉したい物質（目的物質）に応じて使用者が任意のリガンドを結合させることが出来る製品態様である。また、少なくとも式（１）のホスホリルコリン基が粒子表面に存在している限り、いかなる態様のアフィニティー粒子をも含むものであり、例えば請求項２及び請求項３の態様も含むものである。
【００５６】
上記の反応において、カルボキシル基をリガンドが結合可能な反応基又は吸着基として残存させておくには、ホスホリルコリン基を導入したカルボン酸を有するシランカップリング剤の反応量を調節するなどにより行うことが出来る。
なお、このカルボキシル基に、任意の官能基を有する化合物を反応させて、その官能基をリガンドが結合可能な反応基又は吸着基としても良い。
【００５７】
「カルボキシル基を持つ粒子へのリガンドの結合方法について」
リガンドが蛋白質の場合、有機粒子上のカルボキシル基にＮ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドの溶液に浸し、粒子の表面を活性エステル化する。ここに蛋白質中のアミノ基を反応させ、蛋白質を結合させる。なお、この水酸基に、任意の官能基を有する化合物を反応させて、その官能基を蛋白質が結合可能な反応基又は吸着基としても良い。
【００５８】
「目的物質のアフィニティー分離方法」
上記で得られる本発明のアフィニティー粒子を用いて、本発明の目的物質のアフィニティー分離方法が行われる。
本発明の方法は、有機粒子を利用して、高精度な分離が簡便に行われるという点で画期的な目的物質の分離方法である。
本発明の方法は、下記の３つの工程を含むものである。なお、あらかじめリガンドが結合されているアフィニティー粒子の場合は（請求項２）、第１工程はすでに行われているので省略される。
１．式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有するアフィニティー粒子又は式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドを有機粒子の表面に共有結合又は吸着で有することを特徴とするアフィニティー粒子に、任意のリガンドを化学結合させる第１工程。
例えば、式（１）で示されるホスホリルコリン基とリガンドが結合可能な反応基又は吸着基とを有機粒子の表面に、前者は共有結合で後者は共有結合又は吸着で有するアフィニティー粒子と任意のリガンドのＰＢＳ溶液１ｍｌを２ｍｌエッペンチューブに入れて、３０分間４℃で緩やかに振る。１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心し、上清を捨てる。洗浄のため、ＰＢＳ溶液１ｍｌを加えて、緩やかに振り、１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心して、上清を捨てる。この洗浄操作を３回繰り返す。
２．第１工程で製造したアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む液体試料に分散させる第２工程。
例えば、第１工程で製造したアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む液体試料に分散させ、３０分間４℃で緩やかに振る。１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心し、上清を捨てる。洗浄のため、ＰＢＳ溶液１ｍｌを加えて、緩やかに振り、１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心して、上清を捨てる。この洗浄操作を３回繰り返す。
３．分離したアフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収する第３工程。
例えば、アフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収するため、溶出バッファー１ｍｌを加え、３０分間４℃で緩やかに振り、粒子から目的物質を溶出させ、上清を回収する。溶出バッファー１ｍｌを加えて、緩やかに振り、１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心して、上清を回収する。この操作を２回繰り返す。
図１は、本発明のアフィニティー粒子と従来のアフィニティー粒子による目的物質捕捉の選択性の違いを示す模式図である。
【実施例】
【００５９】
次に、本発明を実施例に基づきさらに詳しく説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。粒子表面に導入されたホスホリルコリン基は以下の方法により確認されて定量出来る。
＜定量方法＞
得られた粒子を、過塩素酸に浸し、180℃に加熱して分解した。得られた溶液を水で希釈し、そこに七モリブデン酸六アンモニウム四水和物とＬアスコルビン酸を入れ、95℃にて5分間発色させた後、710nmの吸光度測定して、導入量を求めた。検量線にはリン酸二水素ナトリウム水溶液を用いた。
【００６０】
「合成例１」
「ホスホリルコリン基を含有するアルデヒド化合物」
１−α−グリセロホスホリルコリン（６．２９ｇ）を蒸留水２１０ｍｌに溶解し、氷水浴中で冷却した。過ヨウ素酸ナトリウム（１０．２３ｇ）を添加し、５時間攪拌した。反応液を減圧濃縮、減圧乾燥し、メタノールにより目的物を抽出した。下記に化合物（６）に構造を示す。
式（６）の化合物の重水中での１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図２に示す。式（６）の化合物は水中において式（１０）と平衡状態なので、実際のスペクトルは式（６）と式（１０）の双方を反映したものとなる。
【化１７】
（６）
【化１８】
（１０）
【００６１】
「合成例２」
「ホスホリルコリン基を含有するカルボン酸化合物」
１−α−グリセロホスホリルコリン５ｇを水７０ｍｌ−アセトニトリル３０ｍｌに溶解した。氷冷下、過ヨウ素酸ナトリウム１７ｇと三塩化ルテニウム８０ｍｇを添加し、一晩攪拌した。沈殿物をろ過し、減圧濃縮、メタノール抽出により化学式（７）に示す目的とするカルボキシメチルホスホリルコリンを得た。
式（７）の化合物の重水中での１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図３に示す。
【化１９】
（７）
【００６２】
「参考例１」
「スチレン−グリシジルメタクリレート粒子」
グリシジルメタクリレート３．６ｇ、スチレン２．４ｇ、ジビニルベンゼン０．０８ｇを窒素置換により充分に脱気した精製水２２０ｍｌに添加した。重合開始剤V-60 ０．１２ｇを添加し、７０℃で１時間攪拌した。更にグリシジルメタクリレート０．６ｇを添加し、７０℃で一晩攪拌した。室温まで冷却し、遠心分離（15000rpm x 30分 ３回）により精製し、目的とする粒子を得た。
【００６３】
「アミノ基導入スチレン−グリシジルメタクリレート粒子」
スチレン−グリシジルメタクリレート粒子１ｇを精製水８０ｍｌに分散し、２５％アンモニア水溶液２０ｍｌを添加し、７０℃で一晩過熱攪拌した。室温に冷却し、遠心分離（17000rpm x 60分 ３回）により精製した。
【００６４】
「ホスホリルコリン修飾粒子（ＰＣ粒子（Ａ））」
アミノ基を導入したスチレン−グリシジルメタクリレート粒子０．５ｇをメタノール１０ｍｌに分散し、合成例１のアルデヒド体０．５gを添加し、一晩攪拌した。シアノホウ素酸ナトリウム１４０ｍｇを氷水浴中で添加し、６時間攪拌後、遠心分離（17000rpm x 60分 ３回）により精製して、ＰＣ粒子（Ａ）を得た。
【００６５】
「塩による凝集」
図４、５に参考例１で作製したスチレン−グリシジルメタクリレート粒子とＰＣ粒子（Ａ）の水中及び食塩水（０．１Ｍ水溶液）における粒度分布を示す。
図４から、アフィニティー粒子を使用したラテックス凝集法に一般的に用いられるスチレン−グリシジルメタクリレート粒子は、水中での粒度分布のサイズに比較して、ＮａＣｌ水溶液中での粒度分布のサイズは大幅に大きくなっており、凝集が起こっていることを示している。一方、図５から、ＰＣ粒子（Ａ）の食塩水溶液中での粒度分布の変化は、図４の場合と比較して小さくなっており、塩による凝集が起こりにくいことを示している。以上から、ＰＣ粒子（Ａ）は式（１）のホスホリルコリンによる修飾により、塩などの妨害物質の影響を低減し、測定制度を高めることができる。
【００６６】
「蛋白質非特異吸着抑制評価」
参考例１で作製したスチレン−グリシジルメタクリレート粒子とＰＣ粒子（Ａ）をそれぞれ２５mｇずつとり、蒸留水１ｍｌ加えて超音波処理を１分間行った。遠心で蒸留水を取り除き、アルブミン（１００μｇ／ｍＬ）或いはリゾチーム（１００μｇ／ｍＬ）を１ｍＬ加えて室温で１時間反応させ、遠心（５０００ｇ）後の上清をＭＩＣＲＯ ＢＣＡ法で定量した。その結果を図６に示す。スチレン−グリシジルメタクリレート粒子に比べホスホリルコリン基で処理されているＰＣ粒子（Ａ）はアルブミン、リゾチームともに吸着がかなり抑制されていることが分かった。これから、式（１）のホスホリルコリンによる修飾により、蛋白質の吸着量は大幅に減少していることがわかる。粒子同士の凝集と同時に、粒子に対する各種蛋白質の非特異的吸着も測定精度低下の大きな要因となるので、本発明のアフィニティー粒子は、リガンドにより選択的に目的蛋白質のみを捕捉する精度に優れている。
【００６７】
「参考例２」
「２−アミノエチルメタクリレート−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチレンビスアクリルアミド粒子」
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１．３５ｇとメチレンビスアクリルアミド５８ｍｇを窒素置換により充分に脱気した精製水２００ｍｌ中に添加した。重合開始剤Ｖ−５０ ７ｍｇを添加し、７０℃で３０分攪拌した。２−アミノエチルメタクリレート１００ｍｇを添加し、更に４時間７０℃で攪拌し、室温まで冷却した後、水中で透析、凍結乾燥により目的とする粒子を得た。
【００６８】
「ホスホリルコリン修飾粒子（ＰＣ粒子（Ｂ））」
得られた２−アミノエチルメタクリレート−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチレンビスアクリルアミド粒子０．１ｇをメタノール２０ｍｌに分散し、合成例１のアルデヒド体２５ｍｇを添加し、一晩攪拌した。シアノホウ素酸ナトリウム６ｍｇを氷水浴中で添加し、６時間攪拌後、水中で透析により精製して、ＰＣ粒子（Ｂ）を得た。
【００６９】
「ホスホリルコリン修飾粒子（ＰＣ粒子（Ｃ））」
得られた２−アミノエチルメタクリレート−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチレンビスアクリルアミド粒子０．１ｇをジメチルスルホキシド８ｍｌ−水２ｍｌに分散し、合成例２のカルボキシル体２５ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド２０ｍｇ、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩２３mgを溶解した水１ｍｌを添加、一晩攪拌した。水中で透析により精製して、ＰＣ粒子（Ｃ）を得た。
【００７０】
「蛋白質非特異吸着抑制評価」
参考例１で作製したスチレン−グリシジルメタクリレート粒子と参考例２で作製したＰＣ粒子（Ｂ）、（Ｃ）をそれぞれ２５mｇずつとり、蒸留水１ｍｌ加えて超音波処理を１分間行った。遠心で蒸留水を取り除き、アルブミン（１００μｇ／ｍＬ）或いはリゾチーム（１００μｇ／ｍＬ）を１ｍＬ加えて室温で１時間反応させ、遠心（５０００ｇ）後の上清をＭＩＣＲＯ ＢＣＡ法で定量した。その結果を図７に示す。スチレン−グリシジルメタクリレート粒子に比べホスホリルコリン基で処理されているＰＣ粒子（Ｂ）、（Ｃ）はアルブミン、リゾチームともに吸着がかなり抑制されていることが分かった。これから、式（１）のホスホリルコリンによる修飾により、蛋白質の吸着量は大幅に減少していることがわかる。粒子同士の凝集と同時に、粒子に対する各種蛋白質の非特異的吸着も測定精度低下の大きな要因となるので、本発明のアフィニティー粒子は、リガンドにより選択的に目的蛋白質のみを捕捉する精度に優れている。
【００７１】
「参考例３」
「ホスホリルコリン修飾粒子（ＰＣ粒子（Ｄ））」
アガローズビーズ（架橋率６％）１００ｍｇを無水Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド１０ｍｌに分散、合成例２のカルボキシル体５０ｍｇと塩化チオニル２５ｍｇを無水Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド１ｍｌに溶解、反応させた溶液を添加し、室温で３時間攪拌した。Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド、アセトニトリルで順次遠心分離により精製して、ＰＣ粒子（Ｄ）を得た。
【００７２】
「蛋白質非特異吸着抑制評価」
参考例１で作製したスチレン−グリシジルメタクリレート粒子と参考例３で作製したＰＣ粒子（Ｄ）をそれぞれ２５mｇずつとり、蒸留水１ｍｌ加えて超音波処理を１分間行った。遠心で蒸留水を取り除き、アルブミン（１００μｇ／ｍＬ）或いはリゾチーム（１００μｇ／ｍＬ）を１ｍＬ加えて室温で１時間反応させ、遠心（５０００ｇ）後の上清をＭＩＣＲＯ ＢＣＡ法で定量した。その結果を図８に示す。アガロースビーズに比べホスホリルコリン基で処理されているＰＣ粒子（Ｄ）はアルブミン、リゾチームともに吸着がかなり抑制されていることが分かった。これから、式（１）のホスホリルコリンによる修飾により、蛋白質の吸着量は大幅に減少していることがわかる。粒子同士の凝集と同時に、粒子に対する各種蛋白質の非特異的吸着も測定精度低下の大きな要因となるので、本発明のアフィニティー粒子は、リガンドにより選択的に目的蛋白質のみを捕捉する精度に優れている。
【００７３】
「実施例１」
「アフィニティー粒子」
次に、請求項６で示すアフィニティー分離法を示す。参考例２で得られた２−アミノエチルメタクリレート−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチレンビスアクリルアミド粒子０．１ｇに合成例１のアルデヒド体１０ｍｇを添加し、一晩攪拌した後、シアノホウ素酸ナトリウム３ｍｇを氷水浴中で添加し、６時間攪拌後、水中で透析により精製して製造した。このアフィニティー粒子２５mgにグルタルアルデヒド溶液（８％）１ｍＬとシッフ塩基の安定化のためシアノトリヒドロホウ酸ナトリウム１０ｍｇを加えて室温で５時間反応させ、ＰＢＳで遠心・精製（５０００ｇ）５回で洗浄した。グルタルアルデヒドがリガンドが結合可能な反応基又は吸着基である請求項２のアフィニティー粒子を得た。次にウシアルブミン（１ｍｇ／ｍＬ）或いはヒトヘモグロビン（１ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬとトリヒドロホウ酸ナトリウム１０ｍｇを加えて室温で１日反応させ、ＰＢＳで遠心・精製（５０００ｇ）を４回行った。このウシアルブミン或いはヒトヘモグロビンがリガンドである。ここから、請求項７で示すアフィニティー分離法である。残っているグルタルアルデヒド基を不活性化するためエタノ−ルアミン塩酸塩（０．５Ｍ、ｐＨ７．１）１ｍＬとトリヒドロホウ酸ナトリウム１０ｍｇを加えて室温で１時間反応させ、ＰＢＳで遠心・精製（５０００ｇ）を４回行い、請求項３のアフィニティー粒子を得た。次にＨＲＰ標識抗ウシアルブミン抗体（１０μｇ／ｍＬ）或いはＨＲＰ標識抗ヒトヘモグロビン抗体（１０μｇ／ｍＬ）を１ｍＬ加えて、室温で１時間反応させ、ＰＢＳで遠心・精製（５０００ｇ）を５回行った。さらにＰＢＳを１ｍＬ加えて攪拌し、１０μｌを９６穴ウェルプレートに移して基質ＴＭＢＺを用いて発色試験を行い、４５０nmで測定を行った。その結果を図９に示す。どちらのリガンドを用いた場合でも、高選択的に目的抗体を捕捉していることが分かった。
【００７４】
「比較例１」
参考例２で得られた２−アミノエチルメタクリレート−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチレンビスアクリルアミド粒子０．１ｇにホスホリルコリンによる修飾をしないで実施例と同じ操作を行った場合の結果を図１０に示す。実施例１に比べどちらのリガンドを用いた場合でも、選択性が低いことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明のアフィニティー粒子は、分離を希望する目的物質のみを捕捉するため、選択性が極めて高い。そして、その優れた分散性と、液体試料からの分離が極めて容易である。また、塩による凝集も少ないので、簡便かつ高精度に目的物質を分離することが可能である。また、免疫沈降法、ラテックス凝集法などの試薬としても、塩の影響を受けることなく、感度良く検出が可能であることから、目的物質の高精度分離、検出が要求される生体関連の産業に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明のアフィニティー粒子と従来のアフィニティー粒子による蛋白質捕捉の選択性の違いを示す模式図である。
【図２】合成例１で製造した化合物の構造式及びＮＭＲスペクトルである。
【図３】合成例２で製造した化合物の構造式及びＮＭＲスペクトルである。
【図４】従来のアフィニティー粒子の水中及び食塩水での粒度分布を示すグラフである。
【図５】本発明のアフィニティー粒子の水中及び食塩水での粒度分布を示すグラフである。
【図６】参考例１で作製したスチレン−グリシジルメタクリレート粒子とＰＣ粒子（Ａ）に対する蛋白質吸着量を比較するグラフである。
【図７】参考例２で作製したスチレン−グリシジルメタクリレート粒子とＰＣ粒子（Ｂ）、（Ｃ）に対する蛋白質吸着量を比較するグラフである。
【図８】参考例３で作製したアガロースビーズとＰＣ粒子（Ｄ）に対する蛋白質吸着量を比較するグラフである。
【図９】実施例１のアフィニティー粒子の抗体選択性を比較するグラフである。
【図１０】比較例１のアフィニティー粒子の抗体選択性を比較するグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有することを特徴とするアフィニティー粒子。
【化１】
（１）
【請求項２】
下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドと結合可能な反応基又は吸着基を有機粒子の表面に共有結合又は吸着で有することを特徴とするアフィニティー粒子。
【化２】
（１）
【請求項３】
下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドを有機粒子の表面に共有結合又は吸着で有することを特徴とするアフィニティー粒子。
【化３】
（１）
【請求項４】
前記有機粒子が、スチレン、メタクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸、Ｎ−アルキルアクリルアミド、（メタ）アクリル酸アルキルのうち１種または２種以上のモノマー単位を重合体中に含む合成粒子、又は、アガロース若しくはセファロースからなる多糖類であって、その平均粒子径が２０ｎｍ〜５００μｍであることを特徴とする請求項１〜３記載のアフィニティー粒子。
【請求項５】
前記リガンドが、各種抗体、抗原、酵素、基質、レセプター、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、ビオチン、キレート化合物、各種金属イオンからなる群から選ばれた一種又は二種以上のリガンドであることを特徴とする請求項１〜４記載のアフィニティー粒子。
【請求項６】
（１）請求項１又は２記載のアフィニティー粒子に任意のリガンドを結合させる第１工程、（２）第１工程で製造したアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む液体試料に分散させる第２工程、（３）アフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収する第３工程を含むことを特徴とする、有機粒子による目的物質のアフィニティー分離方法。
【請求項７】
（１）請求項３記載のアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む液体試料に分散させる第１工程、（２）アフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収する第２工程を含むことを特徴とする、有機粒子による目的物質のアフィニティー分離方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドと結合可能な反応基又は吸着基を有機粒子の表面に共有結合又は吸着で有することを特徴とするアフィニティー粒子であって、前記有機粒子が、スチレン、メタクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸、Ｎ−アルキルアクリルアミド、（メタ）アクリル酸アルキルのうち１種または２種以上のモノマー単位を重合体中に含む合成粒子、又は、アガロース若しくはセファロースからなる多糖類であり、その平均粒子径が２０ｎｍ〜５００μｍであることを特徴とするアフィニティー粒子。
【化２】
（１）
【請求項２】
下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドを有機粒子の表面に共有結合又は吸着で有することを特徴とするアフィニティー粒子であって、前記有機粒子が、スチレン、メタクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸、Ｎ−アルキルアクリルアミド、（メタ）アクリル酸アルキルのうち１種または２種以上のモノマー単位を重合体中に含む合成粒子、又は、アガロース若しくはセファロースからなる多糖類であり、その平均粒子径が２０ｎｍ〜５００μｍであることを特徴とするアフィニティー粒子。
【化３】
（１）
【請求項３】
前記リガンドが、各種抗体、抗原、酵素、基質、レセプター、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、ビオチン、キレート化合物、各種金属イオンからなる群から選ばれた一種又は二種以上のリガンドであることを特徴とする請求項１または２記載のアフィニティー粒子。
【請求項４】
前記有機粒子の表面にアミノ基を直接的に導入し、アミノ基を有する粒子に対し、グリセロホスホリルコリンの酸化的開裂反応により得られたアルデヒド体又はハイドレート体を、還元的アミノ化反応によって、前記式（１）のホスホリルコリン基を粒子表面に直接的に付加させるか、または、上記アミノ基に下記式（２）で示される化合物を反応させた
ことを特徴とする請求項１、２または３記載のアフィニティー粒子。
【化９−１】
（２）
【請求項５】
前記有機粒子の粒子表面に存在する水酸基と、下記式（３）または（４）の化合物のＳｉ−ＯＭｅから脱水によって化学結合を形成させることによって、前記式（１）のホスホリルコリン基を粒子表面に直接的に付加させたことを特徴とする請求項１、２または３記載のアフィニティー粒子。
【化１０−１】
（３）
【化１１−１】
（４）
式中、ｍは２〜６、ｎは１〜４である。ＯＭｅは、ＯＥｔ、Ｃｌであってもよい。またＳｉと結合するＯＭｅまたはＯＥｔまたはＣｌの内、２つまではメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基でも良い。
【請求項６】
前記有機粒子の粒子表面に存在する水酸基と、下記式（２）の化合物を反応させたことを特徴とする請求項１、２または３記載のアフィニティー粒子。
【化９−２】
（２）
【請求項７】
前記有機粒子の表面にカルボキシル基を直接的に導入し、カルボキシル基を有する粒子に対し、下記式（９）で示されるホスホリルコリン含有化合物を常法により反応させて、ホスホリルコリン基を酸アミド結合させて、前記式（１）のホスホリルコリン基を粒子表面に直接的に付加させたことを特徴とする請求項１、２または３記載のアフィニティー粒子。
【化１６−１】
（９）
【請求項８】
（１）請求項１記載のアフィニティー粒子に任意のリガンドを結合させる第１工程、（２）第１工程で製造したアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む液体試料に分散させる第２工程、（３）アフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収する第３工程を含むことを特徴とする、有機粒子による目的物質の選択的なアフィニティー分離方法。
【請求項９】
（１）請求項２記載のアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む液体試料に分散させる第１工程、（２）アフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収する第２工程を含むことを特徴とする、有機粒子による目的物質の選択的なアフィニティー分離方法。
【請求項１】
下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有することを特徴とするアフィニティー粒子。
【化１】
（１）
【請求項２】
下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドと結合可能な反応基又は吸着基を有機粒子の表面に共有結合又は吸着で有することを特徴とするアフィニティー粒子。
【化２】
（１）
【請求項３】
下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドを有機粒子の表面に共有結合又は吸着で有することを特徴とするアフィニティー粒子。
【化３】
（１）
【請求項４】
前記有機粒子が、スチレン、メタクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸、Ｎ−アルキルアクリルアミド、（メタ）アクリル酸アルキルのうち１種または２種以上のモノマー単位を重合体中に含む合成粒子、又は、アガロース若しくはセファロースからなる多糖類であって、その平均粒子径が２０ｎｍ〜５００μｍであることを特徴とする請求項１〜３記載のアフィニティー粒子。
【請求項５】
前記リガンドが、各種抗体、抗原、酵素、基質、レセプター、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、ビオチン、キレート化合物、各種金属イオンからなる群から選ばれた一種又は二種以上のリガンドであることを特徴とする請求項１〜４記載のアフィニティー粒子。
【請求項６】
（１）請求項１又は２記載のアフィニティー粒子に任意のリガンドを結合させる第１工程、（２）第１工程で製造したアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む液体試料に分散させる第２工程、（３）アフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収する第３工程を含むことを特徴とする、有機粒子による目的物質のアフィニティー分離方法。
【請求項７】
（１）請求項３記載のアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む液体試料に分散させる第１工程、（２）アフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収する第２工程を含むことを特徴とする、有機粒子による目的物質のアフィニティー分離方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドと結合可能な反応基又は吸着基を有機粒子の表面に共有結合又は吸着で有することを特徴とするアフィニティー粒子であって、前記有機粒子が、スチレン、メタクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸、Ｎ−アルキルアクリルアミド、（メタ）アクリル酸アルキルのうち１種または２種以上のモノマー単位を重合体中に含む合成粒子、又は、アガロース若しくはセファロースからなる多糖類であり、その平均粒子径が２０ｎｍ〜５００μｍであることを特徴とするアフィニティー粒子。
【化２】
（１）
【請求項２】
下記式（１）で示されるホスホリルコリン基を有機粒子の表面に共有結合で有し、ある目的物質に特異的に親和性を持つリガンドを有機粒子の表面に共有結合又は吸着で有することを特徴とするアフィニティー粒子であって、前記有機粒子が、スチレン、メタクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸、Ｎ−アルキルアクリルアミド、（メタ）アクリル酸アルキルのうち１種または２種以上のモノマー単位を重合体中に含む合成粒子、又は、アガロース若しくはセファロースからなる多糖類であり、その平均粒子径が２０ｎｍ〜５００μｍであることを特徴とするアフィニティー粒子。
【化３】
（１）
【請求項３】
前記リガンドが、各種抗体、抗原、酵素、基質、レセプター、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、ビオチン、キレート化合物、各種金属イオンからなる群から選ばれた一種又は二種以上のリガンドであることを特徴とする請求項１または２記載のアフィニティー粒子。
【請求項４】
前記有機粒子の表面にアミノ基を直接的に導入し、アミノ基を有する粒子に対し、グリセロホスホリルコリンの酸化的開裂反応により得られたアルデヒド体又はハイドレート体を、還元的アミノ化反応によって、前記式（１）のホスホリルコリン基を粒子表面に直接的に付加させるか、または、上記アミノ基に下記式（２）で示される化合物を反応させた
ことを特徴とする請求項１、２または３記載のアフィニティー粒子。
【化９−１】
（２）
【請求項５】
前記有機粒子の粒子表面に存在する水酸基と、下記式（３）または（４）の化合物のＳｉ−ＯＭｅから脱水によって化学結合を形成させることによって、前記式（１）のホスホリルコリン基を粒子表面に直接的に付加させたことを特徴とする請求項１、２または３記載のアフィニティー粒子。
【化１０−１】
（３）
【化１１−１】
（４）
式中、ｍは２〜６、ｎは１〜４である。ＯＭｅは、ＯＥｔ、Ｃｌであってもよい。またＳｉと結合するＯＭｅまたはＯＥｔまたはＣｌの内、２つまではメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基でも良い。
【請求項６】
前記有機粒子の粒子表面に存在する水酸基と、下記式（２）の化合物を反応させたことを特徴とする請求項１、２または３記載のアフィニティー粒子。
【化９−２】
（２）
【請求項７】
前記有機粒子の表面にカルボキシル基を直接的に導入し、カルボキシル基を有する粒子に対し、下記式（９）で示されるホスホリルコリン含有化合物を常法により反応させて、ホスホリルコリン基を酸アミド結合させて、前記式（１）のホスホリルコリン基を粒子表面に直接的に付加させたことを特徴とする請求項１、２または３記載のアフィニティー粒子。
【化１６−１】
（９）
【請求項８】
（１）請求項１記載のアフィニティー粒子に任意のリガンドを結合させる第１工程、（２）第１工程で製造したアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む液体試料に分散させる第２工程、（３）アフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収する第３工程を含むことを特徴とする、有機粒子による目的物質の選択的なアフィニティー分離方法。
【請求項９】
（１）請求項２記載のアフィニティー粒子を、任意のリガンドにより選択的に捕捉される目的物質を含む液体試料に分散させる第１工程、（２）アフィニティー粒子から捕捉した目的物質を回収する第２工程を含むことを特徴とする、有機粒子による目的物質の選択的なアフィニティー分離方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００６−７２０３（Ｐ２００６−７２０３Ａ）
【公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１３８５５１（Ｐ２００５−１３８５５１）
【出願日】平成１７年５月１１日（２００５．５．１１）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月１１日（２００５．５．１１）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
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