アルコール常習者またはアルコール常習者における肝臓疾患を判定するためのペプチドマーカーの測定法
【課題】アルコール常習者またはアルコール常習者における肝臓疾患を判定するためのペプチドマーカーの量を測定する方法を提供することが課題である。
【解決手段】アルコール常習者として疑われる患者またはアルコール常習者で更に肝臓疾患が疑われる患者由来の生体試料中の色素上皮由来因子（Pigment epithelium-derived factor; ＰＥＤＦ）の量を測定することにより、アルコール常習者またはアルコール常習者における肝臓疾患を判定することができる。
【解決手段】アルコール常習者として疑われる患者またはアルコール常習者で更に肝臓疾患が疑われる患者由来の生体試料中の色素上皮由来因子（Pigment epithelium-derived factor; ＰＥＤＦ）の量を測定することにより、アルコール常習者またはアルコール常習者における肝臓疾患を判定することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール常習者またはアルコール常習者における肝臓疾患を判定するためのペプチドマーカーの測定法に関する。更に詳細には、生体試料のプロテオーム解析の結果、習慣飲酒に伴って増減しさらに肝臓疾患診断用マーカーとして利用できることが見出された蛋白質のレベルを測定する方法であって、アルコール常習者か非飲酒者かを判定し、アルコール常習者の肝炎か肝硬変かを判定し、またアルコール常習者の断酒による治療効果などを判定するために利用することができるペプチドマーカーの測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルコールによる臓器障害の診断の第一歩は正確な飲酒歴の把握であるが、アルコール依存は否認の病気といわれ、常習飲酒家が、その飲酒量を正確に申告しないのは古今東西変わりがない。従って、その裏づけとなる客観的なマーカーが必要である。習慣飲酒のマーカーとして最も広く測定されているのはγ−ＧＴＰ（ＧＧＴ）であるが、飲酒家がＧＧＴ高値を示す場合でも、その値は肝障害の重症度や積算飲酒量とは必ずしも相関せず、またアルコール飲用後のＧＧＴの変化には個体差があり、大量飲酒後にも増加しないいわゆるノンリスポンダーが相当数存在する。
一方、飲酒習慣がない場合でも肥満に伴う脂肪肝、ある種の薬剤の常用者など飲酒以外の要因でＧＧＴが上昇する場合も多く、人間ドック等などにおいてＧＧＴ高値、即ち飲酒家といった短絡的指導が行われる場合も少なくない。従って、ＧＧＴに相補的な検査として糖鎖欠損トンランスフェリン（ＣＤＴ）が北欧の研究者達により開発され、欧米の文献（非特許文献１）ではその有用性が強調されているが、日本人を対象とした成績では飲酒マーカーとしてのＣＤＴはＧＧＴのノンレスポンダーの１０％程度を拾いあげるにとどまっている。
習慣飲酒は肝障害の要因のひとつである。わが国において、２００万人を超えると予想されるアルコール依存症の存在を考えると、医療機関を受診する機会がないアルコール性肝障害患者が多数潜在していると予想される。また、習慣飲酒は脳出血、高血圧、痛風などの増悪因子でもあり、問題飲酒者を早期にかつ的確にスクリーニングすることは極めて重要である。しかし、上記のように、現在存在するいわゆる飲酒マーカーにおいて感度・特異度において決定的なものはなく、新たなマーカーを検索することが求められている。
【非特許文献１】CLIN.CHEM.,37/12,2029-2037(1991)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明の課題は、問題飲酒者などを早期にしかも的確に判定しうる方法を見出し、肝障害の種類を判定する方法、更にアルコール常習者の断酒による治療効果を判定する方法を見出し、医療に役立てることを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記の課題に関して鋭意検討した結果、本発明を完成した。即ち、本発明者らはプロテオーム解析を応用し、断酒目的に入院したアルコール依存症患者において経時的に採取された血清検体を用い、習慣飲酒に伴って増減する血清蛋白を同定することに成功した。そしてこの血清蛋白質は肝臓疾患診断マーカー蛋白質として利用できることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、アルコール常習者として疑われる患者またはアルコール常習者で更に肝臓疾患が疑われる患者由来の生体試料中の色素上皮由来因子（Pigment epithelium-derived factor; ＰＥＤＦ）の量（ＰＥＤＦ値）を測定することを特徴とする、アルコール常習者またはアルコール常習者における肝臓疾患を判定するためのペプチドマーカーの測定方法である。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によって、患者由来の生体試料中のＰＥＤＦの量（ＰＥＤＦ値）を測定することにより、問題飲酒者などを早期にしかも的確に判定でき、問題飲酒者における肝障害の種類を判定でき、更にはアルコール常習者の断酒による治療効果も早期にしかも的確に判定でき、医療に役立てることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明で対象とする患者は、アルコール常習者として疑われる患者またはアルコール常習者で更に肝臓疾患が疑われる患者であり、本発明において生体試料は、これらの患者由来の生体試料であり、生体試料としては、例えば、血漿、血清等の血液由来の試料を例示できる。
本発明により、アルコール常習者またはアルコール常習者における更なる肝臓疾患を判定するためのペプチドマーカーとして利用できることが見出された蛋白質は、色素上皮由来因子（Pigment epithelium-derived factor; ＰＥＤＦ）である。ＰＥＤＦは、Pigment epithelium-derived factor・Serpin-F1・EPC-1とも呼ばれ、ヒト網膜色素上皮から単離された蛋白質であり（Tombran-Tink et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci., 29, 414, 1989）、４１８アミノ酸で構成される分子量４６３４２Ｄａの蛋白質で（ＷＯ２００６/０９０６８９号公報）、近年、新たな血管新生阻害因子として注目されているものである（Dawson DW, et al., Science 1999; 285: 245-8）。
【０００７】
本明細書において、ペプチドの量あるいはペプチド値とは、ペプチド濃度増加により依存して増加または減少する測定値であってもよく、例えば、質量分析でその量や値を求めるときは、シグナル強度であってよい。
【０００８】
本発明において、ＰＥＤＦの量の測定は、現在蛋白質を測定できる方法として知られている既知のあらゆる方法を採用することができる。例えば、二次元電気泳動法、質量分析法、免疫測定法、電気泳動法、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）法、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法などが挙げられる。
二次元電気泳動法としては、一次元目に等電点電気泳動、二次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色によりスポットを可視化する方法を挙げることができる。等電点電気泳動のゲルは、例えば、アガロースを等電点範囲ｐＩ３〜１０で長さ７ｃｍのものを用いることができる。二次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥとしては、例えば、１０〜２０％のアクリルアミド濃度勾配をつけた、縦８ｃｍ、横１４ｃｍ、厚さ１ｍｍのポリアクリルアミドゲル（ＤＲＣ社）を用いることができる。分子量マーカーには、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ（バイオラッド社）を用い、検体中のタンパク質の泳動に影響を与えない泳動ゲルの端部分を利用して、検体と同時に泳動することができる。
【０００９】
質量分析法としては、レーザーイオン化飛行時間型質量分析計（ＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）により行う方法が挙げられる。レーザーイオン化飛行時間型質量分析計としては、表面増強レーザー脱離イオン化（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ法）、マトリックス支援レーザーイオン化（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ法）などを例示できる。
例えば、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ法を用いる場合、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ社により開発されたプロテイン・バイオロジー・システムＩＩ・マス・スペクトロメーター（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を使用することができる。この機械はＳＥＬＤＩ（ｓｕｒｆａｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）と飛行型質量分析計を組み合わせたプロテインチップテクノロジーである。その詳細はＷＯ ０１／２５７９１ Ａ２号公報、特開２００１−２８１２２号公報等に詳しい。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ法の場合、通常、検体を、前処理した後、チップに吸着させて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ質量計に付す。検体が血清の場合、アルブミンの吸着剤を用いるか、イオン交換チップでアルブミンが電荷をもたなくなるまでバッファーで洗浄してアルブミンを系から除去することが好ましい。
これらの方法に用いられるプロテインチップとしては、本発明のマーカーペプチドを吸着できるチップであれば特に限定しない。例えば、疎水性やイオン交換などの蛋白質に親和性を持つ官能基が修飾されているチップ（ケミカルチップともいう）、目的の蛋白質に対する抗体を固定化したチップ（バイオケミカルチップ）等を例示できる。
その他の質量分析法としては、例えばＥＳＩ法（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）による質量分析法が挙げられる。ＥＳＩ法の場合は、プロテアーゼ処理等の前処理した検体を、高速液体クロマトグラフィー等の分離手段と直結した質量分析計に付するのが好ましいことが多い。
【００１０】
免疫測定法としては、本発明のＰＥＤＦに対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を作成し、従来知られている蛋白質を測定する方法を挙げることができる。そのような免疫測定法として、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、免疫比濁測定法（ＴＩＡ法）、ラテックス免疫凝集法（ＬＡＴＥＸ法）、電気化学発光法、蛍光法などを例示することができる。またイムノクロマト法、試験紙を利用した方法も有効である。これらの方法は、いずれも当業者に周知の方法でありこれら周知の方法をそのまま採用することができる。
上記免疫測定法に使用できる抗体としては既に汎用されている方法により作製されるポリクローナルやモノクローナル抗体が挙げられる。これらの抗体はヒト血液由来精製蛋白質、具体的には、精製ＰＥＤＦを免疫原（抗原）として使用することにより得ることができる。抗体を作成するための蛋白質ＰＥＤＦは、ヒト血液から精製して入手してもよいが、公知のペプチド合成技術を用い、化学合成して入手してもよい。これに限らず培養細胞などの産生蛋白質も抗原として用いることができる。更には、遺伝子工学的に作製された完全長の組換え蛋白質、それらの変異体、それらの一部分を用いることも常套手段であり、利用され得るものである。
【００１１】
モノクローナル抗体は、ＰＥＤＦを免疫原として用いて動物を免疫し、その脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞とを融合させることにより得られるハイブリドーマによって産生される。
ハイブリドーマは、例えば、以下の方法によって得ることができる。即ち上述のようにして得た抗原、例えば、マーカー蛋白質をフロイントの完全、不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳アジュバント等既に公知のものを用いて共に混和し、感作用アジュバント液を作製して数回に分けてマウス、ラット等の動物に１〜３週間おきに腹腔内皮下または尾静脈投与することによって免疫する。感作抗原量は通常１μｇ〜１００ｍｇの間とされているが、一般的には５０μｇ程度が好ましい。免疫回数は２〜７回が一般的であるがさまざまな方法が知られている。次いで脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞（ミエローマ細胞）等を試験管内で融合する。融合法としては既にそれ自体公知であるケーラーとミルスタインの定法（Ｎａｔｕｒｅ．２５６，４９５．１９７５）によってポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いることで融合できる。センダイウィルス、電気融合法によっても融合を行うことができる。
融合した細胞からマーカー蛋白質を認識する抗体を産生するハイブリドーマを選択する方法としては以下のようにして行うことができる。即ち、融合した細胞から限界希釈法によってＨＡＴ培地及びＨＴ培地で生存している細胞により作られるコロニーからハイブリドーマを選択する。９６穴ウェルなどにまかれた融合細胞からできたコロニー培養上清中にマーカー蛋白質に対する抗体が含まれている場合には、マーカー蛋白質をプレート上に固定化したアッセイプレート上に上清をのせ、反応後に抗マウスイムノグロブリン−ＨＲＰ標識抗体等、２次標識抗体を反応させるＥＬＩＳＡ法により、マーカー蛋白質に対するモノクローナル抗体産生クローンを選択できる。標識抗体の標識物質にはＨＲＰの他、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、蛍光物質、放射性物質等を用いることができる。またコントロールとしてブロッキング剤であるＢＳＡのみを結合したアッセイプレートによるＥＬＩＳＡを同時に行うことでマーカー蛋白質それぞれに対する特異的抗体のスクリーニングができることになる。つまりマーカー蛋白質プレートのいずれかで陽性であり、ＢＳＡによるＥＬＩＳＡ法で陰性のクローンを選択する。
ハイブリドーマは通常細胞培養に用いられる培地、例えばα−ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＳＦ、Ｓ−ｃｌｏｎｅなどで培養し、その培養上清よりモノクローナル抗体を回収することができる。ハイブリドーマが由来する動物、ヌードマウスをあらかじめプリスタン処理しておき、その動物に細胞を腹腔内注射することによって腹水を貯留させ、その腹水からモノクローナル抗体を回収することもできる。上清、腹水よりモノクローナル抗体を回収する方法としては、通常の方法を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法やクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡなどによるアフィニティークロマトグラフィーなどが挙げられる。
また、ＰＥＤＦに対するモノクローナル抗体は、市販されており、それらを用いることもできる。
【００１２】
上記方法によって精製されたモノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体によって検体中のＰＥＤＦを精密測定することができる。ＥＩＡ法で検体中のＰＥＤＦを測定する方法としては、蛋白質を測定する方法としてそれ自体は公知であり、抗体として蛋白質ＰＥＤＦに対する１種または複数のモノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を用いることにより行うことができる。以下にその例を記述する。初めにポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ナイロン、ポリメタクリレートなどのそれ自体公知である固相に直接または間接的に物理結合や化学結合、アフィニティーを利用してマーカー蛋白質ＰＥＤＦに対するモノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を結合させる。感作抗体量は通常１ｎｇ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。物理結合や化学結合、アフィニティーなどによって固相に結合したモノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体に検体を加えて反応させる。一定時間反応させた後、固相を洗浄し対応する二次標識抗体を加えて更に２次反応させる。固相を再度洗浄し、ＤＡＢ発色基質などを加え反応させる。標識物質にＨＲＰを用いた場合、基質には既知のＤＡＢ、ＴＭＢなどを用いることができ、標識物質はこれに限定されるものではない。例えば酵素だけではなく金コロイド、ユーロピウムなどの標識金属やＦＩＴＣ、ローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ、ＧＦＰなどの化学的、生物的各種蛍光物質、３２Ｐ、５１Ｃｒなどの放射性物質など識別可能なあらゆる物質が挙げられる。
【００１３】
以上に説明した方法によりヒト生体試料由来のＰＥＤＦ量を測定することにより、アルコール非飲酒者と常習者を区別したり、肝障害の種類を区別したり、また、アルコール常習者における断酒の改善効果の指標とすることができる。
すなわち、ＰＥＤＦ値は、アルコール常習者の場合高く、逆にアルコール非飲酒者の場合低いのでアルコール非飲酒者と常習者を区別することができる。また、ＰＥＤＦ値は、肝炎で高くなりやすく、逆に肝硬変では低くなりやすいので肝障害の種類を区別することができる。さらに、ＰＥＤＦ値は、アルコール常習者の断酒により低くなりやすいので、アルコール常習者における断酒の改善効果の指標とすることができる。
【００１４】
以下に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１
マーカーペプチドの同定
インフォームド・コンセントを行なった患者血清を使用し、二次元電気泳動を用いて血清中の新規肝障害マーカーおよび飲酒マーカーを検索した。検体としてアルコール依存症患者入院直後及び禁酒後３ヶ月の血清を用いた。
以下に実験操作法を簡単に述べる。血清サンプルは前処理としてＭｕｌｔｉ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりメジャータンパク質（ａｌｂｕｍｉｎ， ＩｇＧ， ａｎｔｉ−ｔｒｙｐｓｉｎ， ＩｇＡ， ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ， ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ）を除去後、ＶＩＶＡ ＳＰＩＮ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｓｔｅｄｉｍ ｂｉｏｔｅｃｈ）で脱塩・濃縮を行った。血清１００μＬ相当にイモビライン抽出液（７Ｍ 尿素、２Ｍ チオ尿素、２％ ＣＨＡＰＳ、０．１Ｍ ＤＴＴ、２．５％ ファルマライト、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ １ ｔａｂｌｅｔ）を１０μＬ加え懸濁した。等電点電気泳動のゲルはアガロースを等電点範囲ｐＩ３〜１０で長さ７ｃｍのものを用い、４００Ｖ、１５時間電気泳動を行う。二次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥは１０〜２０％のアクリルアミド濃度勾配をつけた、縦８ｃｍ、横１４ｃｍ、厚さ１ｍｍのポリアクリルアミドゲル（ＤＲＣ社）を用い、１５０Ｖ、２時間電気泳動を行った。分子量マーカーにはＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ（バイオラッド社）を用い、検体中のタンパク質の泳動に影響を与えない泳動ゲルの端部分を利用して、検体と同時に泳動した。続いてＣＢＢ染色を行い、アルコール依存症患者入院時と禁酒後３ヶ月の二次元電気泳動パターンを比較した。タンパク質同定は、違いのあるスポットを切り抜き、ゲル中のタンパク質を一晩トリプシン（Ｒｏｃｈｅ社）で処理してペプチド断片にした後、これを質量分析機（Ｑ−Ｓｔａｒ（登録商標）ＭＳ、ＡＢＩ社）にかけ、質量パターンを得て、それをタンパク質同定ソフトＭａｓｃｏｔにて解析した。その結果、ＰＥＤＦであった。
【００１５】
実施例２
アルコール非飲酒者とアルコール常習飲酒者のＰＥＤＦ値の測定
アルコール非飲酒者６人と、１日平均アルコール３合以上（日本酒換算８０ｇ以上）のアルコール常習飲酒者６人の各血清について、以下に記載する方法によってＰＥＤＦ値を測定した。
ＰＥＤＦ測定のため、血清の前処理としてＭｕｌｔｉ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりメジャータンパク質（ａｌｂｕｍｉｎ， ＩｇＧ， ａｎｔｉ−ｔｒｙｐｓｉｎ， ＩｇＡ， ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ， ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ）を除去後、ＶＩＶＡ ＳＰＩＮ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｓｔｅｄｉｍ ｂｉｏｔｅｃｈ）で脱塩・濃縮を行った。血清２μＬ相当に２×ＳＤＳ−ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、２．０％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール、０．０５％ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８）を１０μＬ加え懸濁し、９５℃で３分処理した後、遠心（１２０００ｇ×２０秒）を行ない、得られた上清を新しいチューブに移した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１０〜２０％のアクリルアミド濃度勾配をつけた、縦８ｃｍ、横１４ｃｍ、厚さ１ｍｍのポリアクリルアミドゲル（ＤＲＣ社）を用い行った。次いで、公知の方法に従いウェスタンブロッティングを行ない、ＳＤＳ−Ｐａｇｅで分離したタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。転写後のニトロセルロース膜を所定の大きさに切り、ポンソーＳ染色に供し転写ムラがないか確認した。次いで、ニトロセルロース膜を０．５％スキムミルク−ＰＢＳ（和光純薬）に室温で６０分間浸してブロッキンクし、続いてＰＢＳ ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）に室温で５分間浸し洗浄する操作を３回繰り返した。洗浄後のニトロセルロース膜を、マウス抗ヒトＰＥＤＦ抗体（トランスジェニック（株））含有するＰＢＳ中、室温で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）に室温で５分間浸し洗浄する操作を３回繰り返した。洗浄後のニトロセルロース膜を、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ダコ社）を含有するＰＢＳ中、室温で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）に室温で５分間浸し洗浄する操作を３回繰り返した。洗浄後のニトロセルロース膜を、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（ＧＥヘルスケア）を用いて添付のプロトコルに従い染色した。画像解析はＴｏｔａｌ Ｌａｂ ＴＬ１２０（島津製作所）を使用し、各バンドの数値化を行った。
【００１６】
ウェスタンブロッティングの結果および画像解析の結果を図１に示した。また、画像解析結果における各バンド（ＰＥＤＦ）の体積を数値化しＰＥＤＦ値を求めたところ表１の結果となった。
【００１７】
【表１】
【００１８】
表１に示されるように、アルコール非飲酒者全員のＰＥＤＦ値が８×１０５未満であるのに対し、アルコール１日３合以上のアルコール常習飲酒者６人のうち、５人が８×１０５以上であった。従って、ＰＥＤＦ値を求めることにより、アルコール非飲酒者とアルコール常習飲酒者を判定しやすいことが判明した。
【００１９】
実施例３
アルコール常習飲酒者における肝障害の種類によるＰＥＤＦ値の比較
断酒目的のアルコール常習飲酒者の入院時の状況として、肝機能正常者（６人）、肝炎患者（６人）、肝硬変患者（６人）の各血清について、実施例２と同様の方法により、ウェスタンブロッティングおよび画像解析を行った。
ウェスタンブロッティングの結果および画像解析の結果を図２に示した。また、画像解析結果における各バンド（ＰＥＤＦ）の体積を数値化しＰＥＤＦ値を求めたところ表２の結果となった。
【００２０】
【表２】
【００２１】
表２に示されるように、肝炎患者６人全員が９．３×１０５以上であるのに対し、肝硬変患者６人全員が逆に９．３×１０５未満であった。このことは、ＰＥＤＦの測定により、アルコール患者の肝炎と肝硬変を区別することが可能であることが判明した。
【００２２】
実施例４
アルコール常習飲酒者における３カ月の断酒によるＰＥＤＦ値の変化
アルコール常習飲酒者で入院し治療を受けた患者８人を対象に入院時と３カ月断酒の各血清について、実施例２と同様の方法により、ウェスタンブロッティングおよび画像解析を行った。
ウェスタンブロッティングの結果および画像解析の結果に基く各バンド（ＰＥＤＦ）の体積を数値化しＰＥＤＦ値の変化を図３に示した。
図３に示すように、アルコール常習で入院した患者８人のうち７人が、３カ月断酒によりＰＥＤＦ値が減少した。このことは、ＰＥＤＦ値がアルコール常習者の断酒による改善効果を反映できるマーカーとして使用できうることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
以上に説明したように、患者由来生体試料中のＰＥＤＦ量を測定することにより、アルコール非飲酒者と常習者を区別したり、肝障害の種類を区別したり、また、アルコール常習者における断酒の改善効果の指標とすることができ。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例２で行った、アルコール非飲酒者とアルコール常習飲酒者からの血清についてのウェスタンブロッティングおよび画像解析の結果を示す。
【図２】実施例３で行った、アルコール常習飲酒者における各種肝障害患者からの血清についてのウェスタンブロッティングおよび画像解析の結果を示す。
【図３】実施例４で行った、アルコール常習飲酒者における３カ月の断酒によるＰＥＤＦ値の変化を調べるためのウェスタンブロッティングおよび画像解析の結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール常習者またはアルコール常習者における肝臓疾患を判定するためのペプチドマーカーの測定法に関する。更に詳細には、生体試料のプロテオーム解析の結果、習慣飲酒に伴って増減しさらに肝臓疾患診断用マーカーとして利用できることが見出された蛋白質のレベルを測定する方法であって、アルコール常習者か非飲酒者かを判定し、アルコール常習者の肝炎か肝硬変かを判定し、またアルコール常習者の断酒による治療効果などを判定するために利用することができるペプチドマーカーの測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルコールによる臓器障害の診断の第一歩は正確な飲酒歴の把握であるが、アルコール依存は否認の病気といわれ、常習飲酒家が、その飲酒量を正確に申告しないのは古今東西変わりがない。従って、その裏づけとなる客観的なマーカーが必要である。習慣飲酒のマーカーとして最も広く測定されているのはγ−ＧＴＰ（ＧＧＴ）であるが、飲酒家がＧＧＴ高値を示す場合でも、その値は肝障害の重症度や積算飲酒量とは必ずしも相関せず、またアルコール飲用後のＧＧＴの変化には個体差があり、大量飲酒後にも増加しないいわゆるノンリスポンダーが相当数存在する。
一方、飲酒習慣がない場合でも肥満に伴う脂肪肝、ある種の薬剤の常用者など飲酒以外の要因でＧＧＴが上昇する場合も多く、人間ドック等などにおいてＧＧＴ高値、即ち飲酒家といった短絡的指導が行われる場合も少なくない。従って、ＧＧＴに相補的な検査として糖鎖欠損トンランスフェリン（ＣＤＴ）が北欧の研究者達により開発され、欧米の文献（非特許文献１）ではその有用性が強調されているが、日本人を対象とした成績では飲酒マーカーとしてのＣＤＴはＧＧＴのノンレスポンダーの１０％程度を拾いあげるにとどまっている。
習慣飲酒は肝障害の要因のひとつである。わが国において、２００万人を超えると予想されるアルコール依存症の存在を考えると、医療機関を受診する機会がないアルコール性肝障害患者が多数潜在していると予想される。また、習慣飲酒は脳出血、高血圧、痛風などの増悪因子でもあり、問題飲酒者を早期にかつ的確にスクリーニングすることは極めて重要である。しかし、上記のように、現在存在するいわゆる飲酒マーカーにおいて感度・特異度において決定的なものはなく、新たなマーカーを検索することが求められている。
【非特許文献１】CLIN.CHEM.,37/12,2029-2037(1991)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明の課題は、問題飲酒者などを早期にしかも的確に判定しうる方法を見出し、肝障害の種類を判定する方法、更にアルコール常習者の断酒による治療効果を判定する方法を見出し、医療に役立てることを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記の課題に関して鋭意検討した結果、本発明を完成した。即ち、本発明者らはプロテオーム解析を応用し、断酒目的に入院したアルコール依存症患者において経時的に採取された血清検体を用い、習慣飲酒に伴って増減する血清蛋白を同定することに成功した。そしてこの血清蛋白質は肝臓疾患診断マーカー蛋白質として利用できることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、アルコール常習者として疑われる患者またはアルコール常習者で更に肝臓疾患が疑われる患者由来の生体試料中の色素上皮由来因子（Pigment epithelium-derived factor; ＰＥＤＦ）の量（ＰＥＤＦ値）を測定することを特徴とする、アルコール常習者またはアルコール常習者における肝臓疾患を判定するためのペプチドマーカーの測定方法である。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によって、患者由来の生体試料中のＰＥＤＦの量（ＰＥＤＦ値）を測定することにより、問題飲酒者などを早期にしかも的確に判定でき、問題飲酒者における肝障害の種類を判定でき、更にはアルコール常習者の断酒による治療効果も早期にしかも的確に判定でき、医療に役立てることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明で対象とする患者は、アルコール常習者として疑われる患者またはアルコール常習者で更に肝臓疾患が疑われる患者であり、本発明において生体試料は、これらの患者由来の生体試料であり、生体試料としては、例えば、血漿、血清等の血液由来の試料を例示できる。
本発明により、アルコール常習者またはアルコール常習者における更なる肝臓疾患を判定するためのペプチドマーカーとして利用できることが見出された蛋白質は、色素上皮由来因子（Pigment epithelium-derived factor; ＰＥＤＦ）である。ＰＥＤＦは、Pigment epithelium-derived factor・Serpin-F1・EPC-1とも呼ばれ、ヒト網膜色素上皮から単離された蛋白質であり（Tombran-Tink et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci., 29, 414, 1989）、４１８アミノ酸で構成される分子量４６３４２Ｄａの蛋白質で（ＷＯ２００６/０９０６８９号公報）、近年、新たな血管新生阻害因子として注目されているものである（Dawson DW, et al., Science 1999; 285: 245-8）。
【０００７】
本明細書において、ペプチドの量あるいはペプチド値とは、ペプチド濃度増加により依存して増加または減少する測定値であってもよく、例えば、質量分析でその量や値を求めるときは、シグナル強度であってよい。
【０００８】
本発明において、ＰＥＤＦの量の測定は、現在蛋白質を測定できる方法として知られている既知のあらゆる方法を採用することができる。例えば、二次元電気泳動法、質量分析法、免疫測定法、電気泳動法、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）法、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法などが挙げられる。
二次元電気泳動法としては、一次元目に等電点電気泳動、二次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色によりスポットを可視化する方法を挙げることができる。等電点電気泳動のゲルは、例えば、アガロースを等電点範囲ｐＩ３〜１０で長さ７ｃｍのものを用いることができる。二次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥとしては、例えば、１０〜２０％のアクリルアミド濃度勾配をつけた、縦８ｃｍ、横１４ｃｍ、厚さ１ｍｍのポリアクリルアミドゲル（ＤＲＣ社）を用いることができる。分子量マーカーには、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ（バイオラッド社）を用い、検体中のタンパク質の泳動に影響を与えない泳動ゲルの端部分を利用して、検体と同時に泳動することができる。
【０００９】
質量分析法としては、レーザーイオン化飛行時間型質量分析計（ＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）により行う方法が挙げられる。レーザーイオン化飛行時間型質量分析計としては、表面増強レーザー脱離イオン化（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ法）、マトリックス支援レーザーイオン化（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ法）などを例示できる。
例えば、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ法を用いる場合、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ社により開発されたプロテイン・バイオロジー・システムＩＩ・マス・スペクトロメーター（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を使用することができる。この機械はＳＥＬＤＩ（ｓｕｒｆａｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）と飛行型質量分析計を組み合わせたプロテインチップテクノロジーである。その詳細はＷＯ ０１／２５７９１ Ａ２号公報、特開２００１−２８１２２号公報等に詳しい。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ法の場合、通常、検体を、前処理した後、チップに吸着させて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ質量計に付す。検体が血清の場合、アルブミンの吸着剤を用いるか、イオン交換チップでアルブミンが電荷をもたなくなるまでバッファーで洗浄してアルブミンを系から除去することが好ましい。
これらの方法に用いられるプロテインチップとしては、本発明のマーカーペプチドを吸着できるチップであれば特に限定しない。例えば、疎水性やイオン交換などの蛋白質に親和性を持つ官能基が修飾されているチップ（ケミカルチップともいう）、目的の蛋白質に対する抗体を固定化したチップ（バイオケミカルチップ）等を例示できる。
その他の質量分析法としては、例えばＥＳＩ法（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）による質量分析法が挙げられる。ＥＳＩ法の場合は、プロテアーゼ処理等の前処理した検体を、高速液体クロマトグラフィー等の分離手段と直結した質量分析計に付するのが好ましいことが多い。
【００１０】
免疫測定法としては、本発明のＰＥＤＦに対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を作成し、従来知られている蛋白質を測定する方法を挙げることができる。そのような免疫測定法として、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、免疫比濁測定法（ＴＩＡ法）、ラテックス免疫凝集法（ＬＡＴＥＸ法）、電気化学発光法、蛍光法などを例示することができる。またイムノクロマト法、試験紙を利用した方法も有効である。これらの方法は、いずれも当業者に周知の方法でありこれら周知の方法をそのまま採用することができる。
上記免疫測定法に使用できる抗体としては既に汎用されている方法により作製されるポリクローナルやモノクローナル抗体が挙げられる。これらの抗体はヒト血液由来精製蛋白質、具体的には、精製ＰＥＤＦを免疫原（抗原）として使用することにより得ることができる。抗体を作成するための蛋白質ＰＥＤＦは、ヒト血液から精製して入手してもよいが、公知のペプチド合成技術を用い、化学合成して入手してもよい。これに限らず培養細胞などの産生蛋白質も抗原として用いることができる。更には、遺伝子工学的に作製された完全長の組換え蛋白質、それらの変異体、それらの一部分を用いることも常套手段であり、利用され得るものである。
【００１１】
モノクローナル抗体は、ＰＥＤＦを免疫原として用いて動物を免疫し、その脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞とを融合させることにより得られるハイブリドーマによって産生される。
ハイブリドーマは、例えば、以下の方法によって得ることができる。即ち上述のようにして得た抗原、例えば、マーカー蛋白質をフロイントの完全、不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳アジュバント等既に公知のものを用いて共に混和し、感作用アジュバント液を作製して数回に分けてマウス、ラット等の動物に１〜３週間おきに腹腔内皮下または尾静脈投与することによって免疫する。感作抗原量は通常１μｇ〜１００ｍｇの間とされているが、一般的には５０μｇ程度が好ましい。免疫回数は２〜７回が一般的であるがさまざまな方法が知られている。次いで脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞（ミエローマ細胞）等を試験管内で融合する。融合法としては既にそれ自体公知であるケーラーとミルスタインの定法（Ｎａｔｕｒｅ．２５６，４９５．１９７５）によってポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いることで融合できる。センダイウィルス、電気融合法によっても融合を行うことができる。
融合した細胞からマーカー蛋白質を認識する抗体を産生するハイブリドーマを選択する方法としては以下のようにして行うことができる。即ち、融合した細胞から限界希釈法によってＨＡＴ培地及びＨＴ培地で生存している細胞により作られるコロニーからハイブリドーマを選択する。９６穴ウェルなどにまかれた融合細胞からできたコロニー培養上清中にマーカー蛋白質に対する抗体が含まれている場合には、マーカー蛋白質をプレート上に固定化したアッセイプレート上に上清をのせ、反応後に抗マウスイムノグロブリン−ＨＲＰ標識抗体等、２次標識抗体を反応させるＥＬＩＳＡ法により、マーカー蛋白質に対するモノクローナル抗体産生クローンを選択できる。標識抗体の標識物質にはＨＲＰの他、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、蛍光物質、放射性物質等を用いることができる。またコントロールとしてブロッキング剤であるＢＳＡのみを結合したアッセイプレートによるＥＬＩＳＡを同時に行うことでマーカー蛋白質それぞれに対する特異的抗体のスクリーニングができることになる。つまりマーカー蛋白質プレートのいずれかで陽性であり、ＢＳＡによるＥＬＩＳＡ法で陰性のクローンを選択する。
ハイブリドーマは通常細胞培養に用いられる培地、例えばα−ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＳＦ、Ｓ−ｃｌｏｎｅなどで培養し、その培養上清よりモノクローナル抗体を回収することができる。ハイブリドーマが由来する動物、ヌードマウスをあらかじめプリスタン処理しておき、その動物に細胞を腹腔内注射することによって腹水を貯留させ、その腹水からモノクローナル抗体を回収することもできる。上清、腹水よりモノクローナル抗体を回収する方法としては、通常の方法を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法やクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡなどによるアフィニティークロマトグラフィーなどが挙げられる。
また、ＰＥＤＦに対するモノクローナル抗体は、市販されており、それらを用いることもできる。
【００１２】
上記方法によって精製されたモノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体によって検体中のＰＥＤＦを精密測定することができる。ＥＩＡ法で検体中のＰＥＤＦを測定する方法としては、蛋白質を測定する方法としてそれ自体は公知であり、抗体として蛋白質ＰＥＤＦに対する１種または複数のモノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を用いることにより行うことができる。以下にその例を記述する。初めにポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ナイロン、ポリメタクリレートなどのそれ自体公知である固相に直接または間接的に物理結合や化学結合、アフィニティーを利用してマーカー蛋白質ＰＥＤＦに対するモノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を結合させる。感作抗体量は通常１ｎｇ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。物理結合や化学結合、アフィニティーなどによって固相に結合したモノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体に検体を加えて反応させる。一定時間反応させた後、固相を洗浄し対応する二次標識抗体を加えて更に２次反応させる。固相を再度洗浄し、ＤＡＢ発色基質などを加え反応させる。標識物質にＨＲＰを用いた場合、基質には既知のＤＡＢ、ＴＭＢなどを用いることができ、標識物質はこれに限定されるものではない。例えば酵素だけではなく金コロイド、ユーロピウムなどの標識金属やＦＩＴＣ、ローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ、ＧＦＰなどの化学的、生物的各種蛍光物質、３２Ｐ、５１Ｃｒなどの放射性物質など識別可能なあらゆる物質が挙げられる。
【００１３】
以上に説明した方法によりヒト生体試料由来のＰＥＤＦ量を測定することにより、アルコール非飲酒者と常習者を区別したり、肝障害の種類を区別したり、また、アルコール常習者における断酒の改善効果の指標とすることができる。
すなわち、ＰＥＤＦ値は、アルコール常習者の場合高く、逆にアルコール非飲酒者の場合低いのでアルコール非飲酒者と常習者を区別することができる。また、ＰＥＤＦ値は、肝炎で高くなりやすく、逆に肝硬変では低くなりやすいので肝障害の種類を区別することができる。さらに、ＰＥＤＦ値は、アルコール常習者の断酒により低くなりやすいので、アルコール常習者における断酒の改善効果の指標とすることができる。
【００１４】
以下に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１
マーカーペプチドの同定
インフォームド・コンセントを行なった患者血清を使用し、二次元電気泳動を用いて血清中の新規肝障害マーカーおよび飲酒マーカーを検索した。検体としてアルコール依存症患者入院直後及び禁酒後３ヶ月の血清を用いた。
以下に実験操作法を簡単に述べる。血清サンプルは前処理としてＭｕｌｔｉ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりメジャータンパク質（ａｌｂｕｍｉｎ， ＩｇＧ， ａｎｔｉ−ｔｒｙｐｓｉｎ， ＩｇＡ， ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ， ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ）を除去後、ＶＩＶＡ ＳＰＩＮ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｓｔｅｄｉｍ ｂｉｏｔｅｃｈ）で脱塩・濃縮を行った。血清１００μＬ相当にイモビライン抽出液（７Ｍ 尿素、２Ｍ チオ尿素、２％ ＣＨＡＰＳ、０．１Ｍ ＤＴＴ、２．５％ ファルマライト、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ １ ｔａｂｌｅｔ）を１０μＬ加え懸濁した。等電点電気泳動のゲルはアガロースを等電点範囲ｐＩ３〜１０で長さ７ｃｍのものを用い、４００Ｖ、１５時間電気泳動を行う。二次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥは１０〜２０％のアクリルアミド濃度勾配をつけた、縦８ｃｍ、横１４ｃｍ、厚さ１ｍｍのポリアクリルアミドゲル（ＤＲＣ社）を用い、１５０Ｖ、２時間電気泳動を行った。分子量マーカーにはＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ（バイオラッド社）を用い、検体中のタンパク質の泳動に影響を与えない泳動ゲルの端部分を利用して、検体と同時に泳動した。続いてＣＢＢ染色を行い、アルコール依存症患者入院時と禁酒後３ヶ月の二次元電気泳動パターンを比較した。タンパク質同定は、違いのあるスポットを切り抜き、ゲル中のタンパク質を一晩トリプシン（Ｒｏｃｈｅ社）で処理してペプチド断片にした後、これを質量分析機（Ｑ−Ｓｔａｒ（登録商標）ＭＳ、ＡＢＩ社）にかけ、質量パターンを得て、それをタンパク質同定ソフトＭａｓｃｏｔにて解析した。その結果、ＰＥＤＦであった。
【００１５】
実施例２
アルコール非飲酒者とアルコール常習飲酒者のＰＥＤＦ値の測定
アルコール非飲酒者６人と、１日平均アルコール３合以上（日本酒換算８０ｇ以上）のアルコール常習飲酒者６人の各血清について、以下に記載する方法によってＰＥＤＦ値を測定した。
ＰＥＤＦ測定のため、血清の前処理としてＭｕｌｔｉ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりメジャータンパク質（ａｌｂｕｍｉｎ， ＩｇＧ， ａｎｔｉ−ｔｒｙｐｓｉｎ， ＩｇＡ， ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ， ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ）を除去後、ＶＩＶＡ ＳＰＩＮ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｓｔｅｄｉｍ ｂｉｏｔｅｃｈ）で脱塩・濃縮を行った。血清２μＬ相当に２×ＳＤＳ−ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、２．０％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール、０．０５％ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８）を１０μＬ加え懸濁し、９５℃で３分処理した後、遠心（１２０００ｇ×２０秒）を行ない、得られた上清を新しいチューブに移した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１０〜２０％のアクリルアミド濃度勾配をつけた、縦８ｃｍ、横１４ｃｍ、厚さ１ｍｍのポリアクリルアミドゲル（ＤＲＣ社）を用い行った。次いで、公知の方法に従いウェスタンブロッティングを行ない、ＳＤＳ−Ｐａｇｅで分離したタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。転写後のニトロセルロース膜を所定の大きさに切り、ポンソーＳ染色に供し転写ムラがないか確認した。次いで、ニトロセルロース膜を０．５％スキムミルク−ＰＢＳ（和光純薬）に室温で６０分間浸してブロッキンクし、続いてＰＢＳ ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）に室温で５分間浸し洗浄する操作を３回繰り返した。洗浄後のニトロセルロース膜を、マウス抗ヒトＰＥＤＦ抗体（トランスジェニック（株））含有するＰＢＳ中、室温で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）に室温で５分間浸し洗浄する操作を３回繰り返した。洗浄後のニトロセルロース膜を、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ダコ社）を含有するＰＢＳ中、室温で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）に室温で５分間浸し洗浄する操作を３回繰り返した。洗浄後のニトロセルロース膜を、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（ＧＥヘルスケア）を用いて添付のプロトコルに従い染色した。画像解析はＴｏｔａｌ Ｌａｂ ＴＬ１２０（島津製作所）を使用し、各バンドの数値化を行った。
【００１６】
ウェスタンブロッティングの結果および画像解析の結果を図１に示した。また、画像解析結果における各バンド（ＰＥＤＦ）の体積を数値化しＰＥＤＦ値を求めたところ表１の結果となった。
【００１７】
【表１】
【００１８】
表１に示されるように、アルコール非飲酒者全員のＰＥＤＦ値が８×１０５未満であるのに対し、アルコール１日３合以上のアルコール常習飲酒者６人のうち、５人が８×１０５以上であった。従って、ＰＥＤＦ値を求めることにより、アルコール非飲酒者とアルコール常習飲酒者を判定しやすいことが判明した。
【００１９】
実施例３
アルコール常習飲酒者における肝障害の種類によるＰＥＤＦ値の比較
断酒目的のアルコール常習飲酒者の入院時の状況として、肝機能正常者（６人）、肝炎患者（６人）、肝硬変患者（６人）の各血清について、実施例２と同様の方法により、ウェスタンブロッティングおよび画像解析を行った。
ウェスタンブロッティングの結果および画像解析の結果を図２に示した。また、画像解析結果における各バンド（ＰＥＤＦ）の体積を数値化しＰＥＤＦ値を求めたところ表２の結果となった。
【００２０】
【表２】
【００２１】
表２に示されるように、肝炎患者６人全員が９．３×１０５以上であるのに対し、肝硬変患者６人全員が逆に９．３×１０５未満であった。このことは、ＰＥＤＦの測定により、アルコール患者の肝炎と肝硬変を区別することが可能であることが判明した。
【００２２】
実施例４
アルコール常習飲酒者における３カ月の断酒によるＰＥＤＦ値の変化
アルコール常習飲酒者で入院し治療を受けた患者８人を対象に入院時と３カ月断酒の各血清について、実施例２と同様の方法により、ウェスタンブロッティングおよび画像解析を行った。
ウェスタンブロッティングの結果および画像解析の結果に基く各バンド（ＰＥＤＦ）の体積を数値化しＰＥＤＦ値の変化を図３に示した。
図３に示すように、アルコール常習で入院した患者８人のうち７人が、３カ月断酒によりＰＥＤＦ値が減少した。このことは、ＰＥＤＦ値がアルコール常習者の断酒による改善効果を反映できるマーカーとして使用できうることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
以上に説明したように、患者由来生体試料中のＰＥＤＦ量を測定することにより、アルコール非飲酒者と常習者を区別したり、肝障害の種類を区別したり、また、アルコール常習者における断酒の改善効果の指標とすることができ。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例２で行った、アルコール非飲酒者とアルコール常習飲酒者からの血清についてのウェスタンブロッティングおよび画像解析の結果を示す。
【図２】実施例３で行った、アルコール常習飲酒者における各種肝障害患者からの血清についてのウェスタンブロッティングおよび画像解析の結果を示す。
【図３】実施例４で行った、アルコール常習飲酒者における３カ月の断酒によるＰＥＤＦ値の変化を調べるためのウェスタンブロッティングおよび画像解析の結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコール常習者として疑われる患者またはアルコール常習者で更に肝臓疾患が疑われる患者由来の生体試料中の色素上皮由来因子（Pigment epithelium-derived factor; ＰＥＤＦ）の量を測定することを特徴とする、アルコール常習者またはアルコール常習者における肝臓疾患を判定するためのペプチドマーカーの測定方法。
【請求項２】
請求項１記載の測定方法を用いることを特徴とする、アルコール常習者か非飲酒者かを判定する判定方法。
【請求項３】
請求項１記載の測定方法を用いることを特徴とする、アルコール常習者の肝炎か肝硬変かを判定する判定方法。
【請求項４】
請求項１記載の測定方法を用いることを特徴とする、アルコール常習者の断酒による治療効果を判定する判定方法。
【請求項５】
生体試料が血液サンプルである請求項１から４のいずれかに記載の測定方法または判定方法。
【請求項６】
二次元電気泳動法、質量分析法または免疫測定法によりＰＥＤＦ値を測定する請求項１から５のいずれかに記載の測定方法または判定方法。
【請求項１】
アルコール常習者として疑われる患者またはアルコール常習者で更に肝臓疾患が疑われる患者由来の生体試料中の色素上皮由来因子（Pigment epithelium-derived factor; ＰＥＤＦ）の量を測定することを特徴とする、アルコール常習者またはアルコール常習者における肝臓疾患を判定するためのペプチドマーカーの測定方法。
【請求項２】
請求項１記載の測定方法を用いることを特徴とする、アルコール常習者か非飲酒者かを判定する判定方法。
【請求項３】
請求項１記載の測定方法を用いることを特徴とする、アルコール常習者の肝炎か肝硬変かを判定する判定方法。
【請求項４】
請求項１記載の測定方法を用いることを特徴とする、アルコール常習者の断酒による治療効果を判定する判定方法。
【請求項５】
生体試料が血液サンプルである請求項１から４のいずれかに記載の測定方法または判定方法。
【請求項６】
二次元電気泳動法、質量分析法または免疫測定法によりＰＥＤＦ値を測定する請求項１から５のいずれかに記載の測定方法または判定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−７１７８８（Ｐ２０１０−７１７８８Ａ）
【公開日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２３９２３５（Ｐ２００８−２３９２３５）
【出願日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【出願人】（０００００３９７５）日東紡績株式会社 (251)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【出願人】（０００００３９７５）日東紡績株式会社 (251)
【Ｆターム（参考）】
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