アンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤
【課題】緑茶に含まれるカテキン類を有効成分とし、より有効にその効果を発揮することができるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤を提供する。
【解決手段】メチル化カテキンをアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤の有効成分とする。前記メチル化カテキンが、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレートであることが好ましい。また、そのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤は、べにふうき、べにふじ、べにほまれから選ばれた少なくとも１種の茶葉抽出物を含むことが好ましい。
【解決手段】メチル化カテキンをアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤の有効成分とする。前記メチル化カテキンが、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレートであることが好ましい。また、そのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤は、べにふうき、べにふじ、べにほまれから選ばれた少なくとも１種の茶葉抽出物を含むことが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチル化カテキンを有効成分とするアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの高血圧の９０％以上はその原因がつかめない本態性高血圧である。この本態性高血圧は、レニン・アンジオテンシン系と呼ばれる昇圧メカニズムの関与が大きいと言われている。このレニン・アンジオテンシン系において、アンジオテンシンＩから強い昇圧作用を示すアンジオテンシンIIへ変換する酵素がアンジオテンシンＩ変換酵素（以下、「ＡＣＥ」ともいう。）である。このアンジオテンシンＩ変換酵素を阻害することによる本態性高血圧の予防および改善をする薬品や食品が知られている。
【０００３】
一方、茶カテキンには、抗酸化作用、抗腫瘍作用、血糖値低下作用、脂質吸収抑制作用、抗肥満作用、抗アレルギー作用および血圧低下作用など幅広い生理機能が報告されている。血圧低下作用に関しては、緑茶から得られるエステル型カテキン類および紅茶から得られるテアフラビン類が、血圧上昇に関与する酵素であるアンジオテンシンＩ変換酵素(ＡＣＥ)を阻害することによって血圧降下作用を有するという報告がある（下記非特許文献１参照）。また、茶カテキンの境界型高血圧者に対する血圧抑制効果を確認した報告がされている（下記非特許文献２参照）。また、メチル化カテキンについては、非常に強い抗アレルギー効果や体内への吸収の高さが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】「茶成分のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害能について」原征彦、松崎妙子、鈴水建夫 日本農芸化学会誌61(7)p803-808 (１９８７)
【非特許文献２】静岡県産学共同研究開発事業委託研究「茶を利用した高機能食品素材の開発研究」（１９８９-１９９１）、金谷節子、小國伊太郎、後藤幸一ら
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、やぶきた種等の従来の緑茶に含まれるEGCGなどのカテキン類は、経口的に摂取したときの腸管からの吸収性や生体内安定性が良好でないことなどもあり、高血圧の症状に対して、必ずしもその効果を有効に発揮できるものではなく、その効果を期待するためには、高用量のカテキン類の摂取が必要であった。このことは、カテキンによる胃腸への悪影響や、茶エキスとして摂取する場合に付随してくるカフェイン量の問題、さらに高濃度で摂取する場合の苦味や渋味の問題があった。
【０００６】
本発明の目的は、緑茶に含まれるカテキン類の中でアンジオテンシンＩ変換酵素阻害効果の強いカテキン類を有効成分とし、より有効にその効果を発揮することができるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、メチル化カテキンの生理機能を研究していく過程においてメチル化カテキンに、アンジオテンシンＩ変換酵素の活性を阻害する強い効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は下記のとおりである。
【０００８】
[１] メチル化カテキンを有効成分とすることを特徴とするアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
[２] 前記メチル化カテキンが、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレートである上記[１]記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
[３]
べにふうき、べにふじ、べにほまれから選ばれた少なくとも１種の茶葉抽出物を含む上記[１]又は[２]記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、メチル化カテキンにより、より有効にアンジオテンシンＩ変換酵素阻害効果を発揮できるので、高血圧症の予防および改善のために有用である。メチル化カテキンを単独もしくは他カテキンとの併用で利用することで低用量化が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（EGCG）又はエピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート（EGCG3"Me）によるＡＣＥ活性阻害効果を示す図表である。
【図２】「やぶきた茶」エキス又は「べにふうき」エキスの摂取によるヒト抗高血圧効果を示す図表である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について好ましい態様を挙げて、更に詳細に説明する。
【００１２】
本発明において「メチル化カテキン」とは、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレートなどのカテキン類化合物のメチル化体である。更に詳細には、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（以下、「EGCG」ともいう。）のメチル化体のエピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート（以下、「EGCG3"Me」ともいう。）や、エピカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート、ガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート（以下、「GCG3"Me」ともいう。）などを用いることできる。特に、べにふうきは茶葉中の含有量が多く利用が容易であるので、EGCG3"Me、GCG3"Meを用いることが好ましい。
【００１３】
本発明において、上記メチル化カテキンは、アンジオテンシンＩ変換酵素（EC.3.4.15.1，peptidyl-dipeptidase A）(以下、「ＡＣＥ」ともいう。)の活性を阻害するための有効成分とされる。具体的には、生体内においてアンジオテンシンＩをアンジオテンシンIIへ変換する役割を果たしている上記アンジオテンシンＩ変換酵素の活性を阻害して、レニン・アンジオテンシン系と呼ばれる昇圧メカニズムにおいて強い昇圧作用に寄与するアンジオテンシンIIの生成を抑える。これにより、高血圧症を予防し、又はその症状を改善することができる。特に、本態性高血圧を予防し、又はその症状を改善することに適している。
【００１４】
本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤の効果を発揮させるための好ましい摂取量としては、１日あたり、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレートの当量に換算したときに、約４０μｇ〜１ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは約９０μｇ〜０．９７ｍｇ／体重１ｋｇである。また、このエピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレートに換算した当量の４〜９９倍量の他のカテキン類を同時に含むことが更に好ましい。
【００１５】
本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤は、上記メチル化カテキンを有効成分とするものであるので、上記メチル化カテキンを含有量高く含む天然物の抽出物などを用いることもできる。具体的には、べにふうき種（例えば農林水産省品種登録番号：第４５９１号）、べにふじ種、べにほまれ種などの茶葉抽出物には、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート（EGCG3"Me）が含有量高く含まれているので、これらを好ましく用いることができる。
【００１６】
茶葉抽出物の原料としては、通常の緑茶や包種茶に製した茶葉などを用いることができる。茶葉抽出物の調製は、茶葉を水あるいは熱水等の溶媒を用いて抽出することによって行うことができる。例えば、茶葉１質量部に対し、５〜１００質量部の溶媒を加え、室温〜１００℃程度の温度で、１〜１２０分間程度抽出する方法が挙げられる。
【００１７】
本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤は、その総量当たり、メチル化カテキンを、固形分換算で０．０１〜１００質量％含有することが好ましく、０．１〜９５質量％含有することがより好ましく、２〜５０質量％含有することが更に好ましい。
【００１８】
本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤には、上記の基本的成分以外に、炭水化物、食物繊維、たんぱく質、ビタミン類等その他の成分を含むことができる。
【００１９】
本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤は、医薬品、健康食品、加工食品等の各種分野で用いられ、医薬の有効成分、食品原料等として使用することができる。
【００２０】
例えば、医薬品とする場合には、薬学的に許容される基材や担体と共に製剤化し、医薬組成物として提供することができる。この医薬組成物には、基材や担体の他、薬学的に許容されることを限度として、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、保存剤、保湿剤、抗菌剤、防腐剤、香料、顔料、界面活性剤、安定剤、溶解補助剤等の添加剤を任意に配合してもよい。そして、当該医薬組成物の形態としては、丸剤、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、ゼリー剤、トローチ剤等の剤型が例示できる。
【００２１】
また、本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤を飲食品に添加して摂取する場合には、一般の食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品等に配合して用いることができる。このような食品としては、例えば、チョコレート、ビスケット、ガム、キャンディー、クッキー、グミ、打錠菓子等の菓子類；シリアル；粉末飲料、清涼飲料、乳飲料、栄養飲料、炭酸飲料、ゼリー飲料等の飲料；アイスクリーム、シャーベットなどの冷菓が挙げられる。更に、そば、パスタ、うどん、そーめん等の麺類も好ましく例示できる。また、特定保健用食品や栄養補助食品等の場合であれば、粉末、顆粒、カプセル、シロップ、タブレット、糖衣錠等の形態のものであってもよい。
【実施例】
【００２２】
以下に例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００２３】
＜試験例１＞ （in vitro ＡＣＥ活性阻害効果）
エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（EGCG）と、そのメチル化体のエピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート（EGCG3"Me）とについて、以下のようにして、それらによるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害効果を調べた。
【００２４】
（１）試料
EGCG（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）
EGCG3"Me(長良サイエンス株式会社製)
上記を超純水に溶解して用いた。
【００２５】
（２）アンジオテンシンＩ変換酵素阻害の測定
（ａ）測定方法
アンジオテンシンＩ変換酵素の活性の測定は、堀江らの方法に従って行った(「食品機能性マニュアル集」（１９８７）ｐ１１７−１２１)。すなわちHippuryl-His-Leu溶液（株式会社ペプチド研製）を基質に用い、ＡＣＥとの反応後生成したヒスチジルロイシンを定量する方法を用いた。
【００２６】
具体的には、600mM NaClを含む400mMリン酸カリウム緩衝液(pH8.3)に溶解した4.7mM基質溶液５０μＬに、EGCG又はEGCG3"Meの試料溶液２５μＬ（それぞれの反応液中での濃度が各4.26、21.4、85.2、208μＭとなるように濃度調整したもの）を加え３７℃で１０分間予備加熱した後、０．０２５Ｕ／ｍＬのACE（シグマアルドリッチジャバン（株）製ウサギ肺由来）５０μＬを添加し３７℃で４０分間反応させて、その２５μＬを取り出し、0.3Ｍ NaOH１５０μＬを加えて反応を停止させた。反応後の溶液１７５μＬにo−フタルアルデヒド（和光純薬工業株式会社製）の２％メタノール溶液１０μＬを加え、正確に１０分後、３Ｍ HCl ２０μＬを加えた。超純水で希釈し，励起波長340nm、蛍光波長455nmで蛍光を測定した。
【００２７】
ＡＣＥ活性の阻害率は下記に示した計算式により試料溶液を加えたときのＡＣＥの活性低下率を阻害率として算出した。
阻害率（％）＝１００−{(サンプル−ブランク１)/(対照−ブランク２)}×１００
（上記式中、「サンプル」は酵素／基質／カテキン溶液での蛍光強度、「対照」は酵素／基質／超純水での蛍光強度、「サンプル」と「対照」とに対する各ブランク１，２は、酵素の代わりに超純水を加えたときの蛍光強度とする。）
【００２８】
（ｂ）統計処理
各群とも実験データは平均値±標準偏差で表した。群間の有意差検定には、市販のソフトウェア(「SPSS 13.0J for Windows」商品名、エス・ピー・エス・エス株式会社)を用いて二元配置分散分析を行った後、下位検定としてDunnet検定を行い、ｐ＜０．０５を統計学的に有意と判定した。
【００２９】
図１に示されるように、EGCGおよびメチル化カテキン（EGCG3"Me）はそれぞれ濃度依存的にＡＣＥ活性を阻害した。そのときのEGCG3"Meを添加した場合のＡＣＥ活性阻害の強さは、EGCGを添加した場合と比較して、有意(p=0.048)に高かった。メチル化カテキンの５０％有効濃度（ED50）は0.13ｍMであり、EGCGの0.05mMに比較して2.6倍高くなった。メチル化カテキンの体内への吸収率がEGCGに比べて３〜９倍高いことを考え合わせると、同量を経口摂取した場合のメチル化カテキンの体内でのACE阻害効果はEGCGに比べて7.8〜23.4倍高く、メチル化カテキンを用いればかなり低用量の摂取でも抗高血圧効果が発揮できる可能性が示唆された。
【００３０】
＜試験例２＞ （ヒトにおける抗高血圧効果）
「日本高血圧学会高血圧治療ガイドライン２００４」の成人における血圧値の分類で正常高値血圧または軽症高血圧の者で、かつ特定保健用食品、医薬品等を用いていない者を対象者としてヒト臨床試験を行った。なお、この試験はヘルシンキ宣言に従って行い、被験者に試験の目的、内容を十分に説明した後、被験者の同意を文書にて得て実施した。
【００３１】
具体的には、以下のようにして行った。
（１）試料
緑茶エキスパウダーNo.１６７１４（やぶきた種、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製）及び「べにふうき」緑茶エキスパウダー（アサヒ飲料株式会社製）を用いた。
（２）試料中のカフェイン及びカテキン類含有量の測定
試験試料を１％リン酸（Ｈ３ＰＯ４）含有５０％エタノール溶液で３０℃、５０分間抽出をし、適宜超純水で希釈後０．４５μｍ親水性フィルターで濾過した溶液を、高速液体クロマトグラフ法により以下の条件で定量した。
【００３２】
・ カラム：「Wakopac Navi Ｃ18-5」(4.6×15 0mm, 5μｍ 和光純薬工業株式会社製)
・ 移動相：移動相Ａ（超純水：アセトニトリル：リン酸＝体積比４００：１０：１）と移動相Ｂ（メタノール：移動相Ａ＝１：２）によるグラジエント分析
・ 流速：1ｍL/min
・ カラム温度：４０℃，
・ 試料注入量：２０μＬ
・ 検出器：「SCL-M10A VP」(株式会社島津製作所製)
・ 検出波長：272nm又は242nm
【００３３】
表１には、緑茶エキス溶液及び「べにふうき」緑茶エキス溶液のカテキン組成を示す。「べにふうき」緑茶エキス溶液はEGCG3"Meを１８９μｇ／ｍｌ含有しているが、緑茶エキス溶液にはEGCG3"Meが含まれておらず、それ以外のメチル化カテキンも、「べにふうき」緑茶エキス溶液に比べて含有量が少ない。そしてその分、緑茶エキス溶液にはEGCGの含有量が「べにふうき」緑茶エキス溶液に比べて高くなっている（緑茶エキス溶液のEGCG濃度；１１８２μｇ／ｍｌ、「べにふうき」緑茶エキス溶液中のEGCG濃度；８４４μｇ／ｍｌ）。
【００３４】
【表１】
【００３５】
（３）ヒト試験方法
評価試験群は、「べにふうき」エキスパウダーの摂取群（以下「べにふうき群」という。）、及び「やぶきた」エキスパウダーの摂取群（以下、「やぶきた群」という。）の２群とし、試験食の中身が外観からはわからないように作製したカプセルを使用した並行２群間二重盲検比較試験とした。１群の被験者数は各１０名とした。被験者の２群への割付は拡張期血圧、収縮期血圧．性別，年齢の偏りのないように行った。
【００３６】
下記表２にべにふうき群およびやぶきた群のカプセルのカテキン組成を示す。
【００３７】
【表２】
【００３８】
カプセルは１日２回（朝食後及び昼食後）、１回に４カプセルずつ水とともに８週間摂取してもらった。べにふうき群、やぶきた群ともに、１回に摂取する茶カテキン量が総非重合カテキン量としてほぼ等しくなるように設定した。また、１回当たりのEGCG3"Me摂取量を2 0mgと設定した。この摂取量は、「べにふうき」茶葉２ｇを熱湯で抽出した際のEGCG3"Me量に相当する。
【００３９】
血圧の測定は，収縮期血圧および拡張期血圧を試験食品摂取開始前、摂取開始８週間後（試験終了時）にそれぞれ行い、同時に医師による診察を実施し
有害事象等の確認をした。
【００４０】
下記表３に被験者の属性を示す。べにふうき群で１名辞退（自己都合）により最終的に１９名の被験者が試験に参加した。
【００４１】
【表３】
【００４２】
その結果、摂取後第８週の収縮期血圧（平均値±標準偏差）において、やぶきた群が１４０．８±８．７ mmHｇであるのに対して、べにふうき群が１３３．３±１２．８ mmHｇであり、血圧が低下する傾向がみられた（図２ａ）。また、摂取後第８週の拡張期血圧（平均値±標準偏差）において、やぶきた群が９５．５±７．５ mmHｇであるのに対して、べにふうき群が８７．６±９．３ mmHｇであり、血圧が低下する傾向がみられた（図２ｂ）。
【００４３】
したがって、「べにふうき」緑茶エキス摂取群には、有意なヒト抗高血圧効果が認められた。しかしながら、酵素阻害試験の結果から予想されたほどの大きな効果ではなかった。これは、エキス中に血圧を高める作用のあるカフェインが含有していたためで、脱カフェイン処理したエキスを用いれば、効果はもっと明らかになると考えられた。
【００４４】
以上をまとめると、上記試験例１の結果から、メチル化カテキンにはACE阻害効果が強いことが知られているEGCGに比べてより強い活性が認められた。メチル化カテキンの体内への吸収率がEGCGに比べて３〜９倍高いことを考え合わせると、同量を経口摂取した場合のメチル化カテキンの体内でのACE阻害効果はEGCGに比べて7.8〜23.4倍高く、メチル化カテキンを用いることでEGCGよりも低用量で抗高血圧効果を期待できることが示唆された。また、上記試験例２の結果から、茶エキスを用いたヒトでの試験でも、実際にメチル化カテキンを含むべにふうきエキスを摂取した群の方が、メチル化カテキンを含まない「やぶきた」エキスを摂取した群よりも強い抗高血圧効果が確認された。これらの結果より、メチル化カテキンはACEを阻害することにより抗高血圧効果が期待できることが示唆された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチル化カテキンを有効成分とするアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの高血圧の９０％以上はその原因がつかめない本態性高血圧である。この本態性高血圧は、レニン・アンジオテンシン系と呼ばれる昇圧メカニズムの関与が大きいと言われている。このレニン・アンジオテンシン系において、アンジオテンシンＩから強い昇圧作用を示すアンジオテンシンIIへ変換する酵素がアンジオテンシンＩ変換酵素（以下、「ＡＣＥ」ともいう。）である。このアンジオテンシンＩ変換酵素を阻害することによる本態性高血圧の予防および改善をする薬品や食品が知られている。
【０００３】
一方、茶カテキンには、抗酸化作用、抗腫瘍作用、血糖値低下作用、脂質吸収抑制作用、抗肥満作用、抗アレルギー作用および血圧低下作用など幅広い生理機能が報告されている。血圧低下作用に関しては、緑茶から得られるエステル型カテキン類および紅茶から得られるテアフラビン類が、血圧上昇に関与する酵素であるアンジオテンシンＩ変換酵素(ＡＣＥ)を阻害することによって血圧降下作用を有するという報告がある（下記非特許文献１参照）。また、茶カテキンの境界型高血圧者に対する血圧抑制効果を確認した報告がされている（下記非特許文献２参照）。また、メチル化カテキンについては、非常に強い抗アレルギー効果や体内への吸収の高さが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】「茶成分のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害能について」原征彦、松崎妙子、鈴水建夫 日本農芸化学会誌61(7)p803-808 (１９８７)
【非特許文献２】静岡県産学共同研究開発事業委託研究「茶を利用した高機能食品素材の開発研究」（１９８９-１９９１）、金谷節子、小國伊太郎、後藤幸一ら
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、やぶきた種等の従来の緑茶に含まれるEGCGなどのカテキン類は、経口的に摂取したときの腸管からの吸収性や生体内安定性が良好でないことなどもあり、高血圧の症状に対して、必ずしもその効果を有効に発揮できるものではなく、その効果を期待するためには、高用量のカテキン類の摂取が必要であった。このことは、カテキンによる胃腸への悪影響や、茶エキスとして摂取する場合に付随してくるカフェイン量の問題、さらに高濃度で摂取する場合の苦味や渋味の問題があった。
【０００６】
本発明の目的は、緑茶に含まれるカテキン類の中でアンジオテンシンＩ変換酵素阻害効果の強いカテキン類を有効成分とし、より有効にその効果を発揮することができるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、メチル化カテキンの生理機能を研究していく過程においてメチル化カテキンに、アンジオテンシンＩ変換酵素の活性を阻害する強い効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は下記のとおりである。
【０００８】
[１] メチル化カテキンを有効成分とすることを特徴とするアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
[２] 前記メチル化カテキンが、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレートである上記[１]記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
[３]
べにふうき、べにふじ、べにほまれから選ばれた少なくとも１種の茶葉抽出物を含む上記[１]又は[２]記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、メチル化カテキンにより、より有効にアンジオテンシンＩ変換酵素阻害効果を発揮できるので、高血圧症の予防および改善のために有用である。メチル化カテキンを単独もしくは他カテキンとの併用で利用することで低用量化が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（EGCG）又はエピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート（EGCG3"Me）によるＡＣＥ活性阻害効果を示す図表である。
【図２】「やぶきた茶」エキス又は「べにふうき」エキスの摂取によるヒト抗高血圧効果を示す図表である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について好ましい態様を挙げて、更に詳細に説明する。
【００１２】
本発明において「メチル化カテキン」とは、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレートなどのカテキン類化合物のメチル化体である。更に詳細には、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（以下、「EGCG」ともいう。）のメチル化体のエピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート（以下、「EGCG3"Me」ともいう。）や、エピカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート、ガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート（以下、「GCG3"Me」ともいう。）などを用いることできる。特に、べにふうきは茶葉中の含有量が多く利用が容易であるので、EGCG3"Me、GCG3"Meを用いることが好ましい。
【００１３】
本発明において、上記メチル化カテキンは、アンジオテンシンＩ変換酵素（EC.3.4.15.1，peptidyl-dipeptidase A）(以下、「ＡＣＥ」ともいう。)の活性を阻害するための有効成分とされる。具体的には、生体内においてアンジオテンシンＩをアンジオテンシンIIへ変換する役割を果たしている上記アンジオテンシンＩ変換酵素の活性を阻害して、レニン・アンジオテンシン系と呼ばれる昇圧メカニズムにおいて強い昇圧作用に寄与するアンジオテンシンIIの生成を抑える。これにより、高血圧症を予防し、又はその症状を改善することができる。特に、本態性高血圧を予防し、又はその症状を改善することに適している。
【００１４】
本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤の効果を発揮させるための好ましい摂取量としては、１日あたり、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレートの当量に換算したときに、約４０μｇ〜１ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは約９０μｇ〜０．９７ｍｇ／体重１ｋｇである。また、このエピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレートに換算した当量の４〜９９倍量の他のカテキン類を同時に含むことが更に好ましい。
【００１５】
本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤は、上記メチル化カテキンを有効成分とするものであるので、上記メチル化カテキンを含有量高く含む天然物の抽出物などを用いることもできる。具体的には、べにふうき種（例えば農林水産省品種登録番号：第４５９１号）、べにふじ種、べにほまれ種などの茶葉抽出物には、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート（EGCG3"Me）が含有量高く含まれているので、これらを好ましく用いることができる。
【００１６】
茶葉抽出物の原料としては、通常の緑茶や包種茶に製した茶葉などを用いることができる。茶葉抽出物の調製は、茶葉を水あるいは熱水等の溶媒を用いて抽出することによって行うことができる。例えば、茶葉１質量部に対し、５〜１００質量部の溶媒を加え、室温〜１００℃程度の温度で、１〜１２０分間程度抽出する方法が挙げられる。
【００１７】
本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤は、その総量当たり、メチル化カテキンを、固形分換算で０．０１〜１００質量％含有することが好ましく、０．１〜９５質量％含有することがより好ましく、２〜５０質量％含有することが更に好ましい。
【００１８】
本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤には、上記の基本的成分以外に、炭水化物、食物繊維、たんぱく質、ビタミン類等その他の成分を含むことができる。
【００１９】
本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤は、医薬品、健康食品、加工食品等の各種分野で用いられ、医薬の有効成分、食品原料等として使用することができる。
【００２０】
例えば、医薬品とする場合には、薬学的に許容される基材や担体と共に製剤化し、医薬組成物として提供することができる。この医薬組成物には、基材や担体の他、薬学的に許容されることを限度として、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、保存剤、保湿剤、抗菌剤、防腐剤、香料、顔料、界面活性剤、安定剤、溶解補助剤等の添加剤を任意に配合してもよい。そして、当該医薬組成物の形態としては、丸剤、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、ゼリー剤、トローチ剤等の剤型が例示できる。
【００２１】
また、本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤を飲食品に添加して摂取する場合には、一般の食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品等に配合して用いることができる。このような食品としては、例えば、チョコレート、ビスケット、ガム、キャンディー、クッキー、グミ、打錠菓子等の菓子類；シリアル；粉末飲料、清涼飲料、乳飲料、栄養飲料、炭酸飲料、ゼリー飲料等の飲料；アイスクリーム、シャーベットなどの冷菓が挙げられる。更に、そば、パスタ、うどん、そーめん等の麺類も好ましく例示できる。また、特定保健用食品や栄養補助食品等の場合であれば、粉末、顆粒、カプセル、シロップ、タブレット、糖衣錠等の形態のものであってもよい。
【実施例】
【００２２】
以下に例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００２３】
＜試験例１＞ （in vitro ＡＣＥ活性阻害効果）
エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（EGCG）と、そのメチル化体のエピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート（EGCG3"Me）とについて、以下のようにして、それらによるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害効果を調べた。
【００２４】
（１）試料
EGCG（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）
EGCG3"Me(長良サイエンス株式会社製)
上記を超純水に溶解して用いた。
【００２５】
（２）アンジオテンシンＩ変換酵素阻害の測定
（ａ）測定方法
アンジオテンシンＩ変換酵素の活性の測定は、堀江らの方法に従って行った(「食品機能性マニュアル集」（１９８７）ｐ１１７−１２１)。すなわちHippuryl-His-Leu溶液（株式会社ペプチド研製）を基質に用い、ＡＣＥとの反応後生成したヒスチジルロイシンを定量する方法を用いた。
【００２６】
具体的には、600mM NaClを含む400mMリン酸カリウム緩衝液(pH8.3)に溶解した4.7mM基質溶液５０μＬに、EGCG又はEGCG3"Meの試料溶液２５μＬ（それぞれの反応液中での濃度が各4.26、21.4、85.2、208μＭとなるように濃度調整したもの）を加え３７℃で１０分間予備加熱した後、０．０２５Ｕ／ｍＬのACE（シグマアルドリッチジャバン（株）製ウサギ肺由来）５０μＬを添加し３７℃で４０分間反応させて、その２５μＬを取り出し、0.3Ｍ NaOH１５０μＬを加えて反応を停止させた。反応後の溶液１７５μＬにo−フタルアルデヒド（和光純薬工業株式会社製）の２％メタノール溶液１０μＬを加え、正確に１０分後、３Ｍ HCl ２０μＬを加えた。超純水で希釈し，励起波長340nm、蛍光波長455nmで蛍光を測定した。
【００２７】
ＡＣＥ活性の阻害率は下記に示した計算式により試料溶液を加えたときのＡＣＥの活性低下率を阻害率として算出した。
阻害率（％）＝１００−{(サンプル−ブランク１)/(対照−ブランク２)}×１００
（上記式中、「サンプル」は酵素／基質／カテキン溶液での蛍光強度、「対照」は酵素／基質／超純水での蛍光強度、「サンプル」と「対照」とに対する各ブランク１，２は、酵素の代わりに超純水を加えたときの蛍光強度とする。）
【００２８】
（ｂ）統計処理
各群とも実験データは平均値±標準偏差で表した。群間の有意差検定には、市販のソフトウェア(「SPSS 13.0J for Windows」商品名、エス・ピー・エス・エス株式会社)を用いて二元配置分散分析を行った後、下位検定としてDunnet検定を行い、ｐ＜０．０５を統計学的に有意と判定した。
【００２９】
図１に示されるように、EGCGおよびメチル化カテキン（EGCG3"Me）はそれぞれ濃度依存的にＡＣＥ活性を阻害した。そのときのEGCG3"Meを添加した場合のＡＣＥ活性阻害の強さは、EGCGを添加した場合と比較して、有意(p=0.048)に高かった。メチル化カテキンの５０％有効濃度（ED50）は0.13ｍMであり、EGCGの0.05mMに比較して2.6倍高くなった。メチル化カテキンの体内への吸収率がEGCGに比べて３〜９倍高いことを考え合わせると、同量を経口摂取した場合のメチル化カテキンの体内でのACE阻害効果はEGCGに比べて7.8〜23.4倍高く、メチル化カテキンを用いればかなり低用量の摂取でも抗高血圧効果が発揮できる可能性が示唆された。
【００３０】
＜試験例２＞ （ヒトにおける抗高血圧効果）
「日本高血圧学会高血圧治療ガイドライン２００４」の成人における血圧値の分類で正常高値血圧または軽症高血圧の者で、かつ特定保健用食品、医薬品等を用いていない者を対象者としてヒト臨床試験を行った。なお、この試験はヘルシンキ宣言に従って行い、被験者に試験の目的、内容を十分に説明した後、被験者の同意を文書にて得て実施した。
【００３１】
具体的には、以下のようにして行った。
（１）試料
緑茶エキスパウダーNo.１６７１４（やぶきた種、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製）及び「べにふうき」緑茶エキスパウダー（アサヒ飲料株式会社製）を用いた。
（２）試料中のカフェイン及びカテキン類含有量の測定
試験試料を１％リン酸（Ｈ３ＰＯ４）含有５０％エタノール溶液で３０℃、５０分間抽出をし、適宜超純水で希釈後０．４５μｍ親水性フィルターで濾過した溶液を、高速液体クロマトグラフ法により以下の条件で定量した。
【００３２】
・ カラム：「Wakopac Navi Ｃ18-5」(4.6×15 0mm, 5μｍ 和光純薬工業株式会社製)
・ 移動相：移動相Ａ（超純水：アセトニトリル：リン酸＝体積比４００：１０：１）と移動相Ｂ（メタノール：移動相Ａ＝１：２）によるグラジエント分析
・ 流速：1ｍL/min
・ カラム温度：４０℃，
・ 試料注入量：２０μＬ
・ 検出器：「SCL-M10A VP」(株式会社島津製作所製)
・ 検出波長：272nm又は242nm
【００３３】
表１には、緑茶エキス溶液及び「べにふうき」緑茶エキス溶液のカテキン組成を示す。「べにふうき」緑茶エキス溶液はEGCG3"Meを１８９μｇ／ｍｌ含有しているが、緑茶エキス溶液にはEGCG3"Meが含まれておらず、それ以外のメチル化カテキンも、「べにふうき」緑茶エキス溶液に比べて含有量が少ない。そしてその分、緑茶エキス溶液にはEGCGの含有量が「べにふうき」緑茶エキス溶液に比べて高くなっている（緑茶エキス溶液のEGCG濃度；１１８２μｇ／ｍｌ、「べにふうき」緑茶エキス溶液中のEGCG濃度；８４４μｇ／ｍｌ）。
【００３４】
【表１】
【００３５】
（３）ヒト試験方法
評価試験群は、「べにふうき」エキスパウダーの摂取群（以下「べにふうき群」という。）、及び「やぶきた」エキスパウダーの摂取群（以下、「やぶきた群」という。）の２群とし、試験食の中身が外観からはわからないように作製したカプセルを使用した並行２群間二重盲検比較試験とした。１群の被験者数は各１０名とした。被験者の２群への割付は拡張期血圧、収縮期血圧．性別，年齢の偏りのないように行った。
【００３６】
下記表２にべにふうき群およびやぶきた群のカプセルのカテキン組成を示す。
【００３７】
【表２】
【００３８】
カプセルは１日２回（朝食後及び昼食後）、１回に４カプセルずつ水とともに８週間摂取してもらった。べにふうき群、やぶきた群ともに、１回に摂取する茶カテキン量が総非重合カテキン量としてほぼ等しくなるように設定した。また、１回当たりのEGCG3"Me摂取量を2 0mgと設定した。この摂取量は、「べにふうき」茶葉２ｇを熱湯で抽出した際のEGCG3"Me量に相当する。
【００３９】
血圧の測定は，収縮期血圧および拡張期血圧を試験食品摂取開始前、摂取開始８週間後（試験終了時）にそれぞれ行い、同時に医師による診察を実施し
有害事象等の確認をした。
【００４０】
下記表３に被験者の属性を示す。べにふうき群で１名辞退（自己都合）により最終的に１９名の被験者が試験に参加した。
【００４１】
【表３】
【００４２】
その結果、摂取後第８週の収縮期血圧（平均値±標準偏差）において、やぶきた群が１４０．８±８．７ mmHｇであるのに対して、べにふうき群が１３３．３±１２．８ mmHｇであり、血圧が低下する傾向がみられた（図２ａ）。また、摂取後第８週の拡張期血圧（平均値±標準偏差）において、やぶきた群が９５．５±７．５ mmHｇであるのに対して、べにふうき群が８７．６±９．３ mmHｇであり、血圧が低下する傾向がみられた（図２ｂ）。
【００４３】
したがって、「べにふうき」緑茶エキス摂取群には、有意なヒト抗高血圧効果が認められた。しかしながら、酵素阻害試験の結果から予想されたほどの大きな効果ではなかった。これは、エキス中に血圧を高める作用のあるカフェインが含有していたためで、脱カフェイン処理したエキスを用いれば、効果はもっと明らかになると考えられた。
【００４４】
以上をまとめると、上記試験例１の結果から、メチル化カテキンにはACE阻害効果が強いことが知られているEGCGに比べてより強い活性が認められた。メチル化カテキンの体内への吸収率がEGCGに比べて３〜９倍高いことを考え合わせると、同量を経口摂取した場合のメチル化カテキンの体内でのACE阻害効果はEGCGに比べて7.8〜23.4倍高く、メチル化カテキンを用いることでEGCGよりも低用量で抗高血圧効果を期待できることが示唆された。また、上記試験例２の結果から、茶エキスを用いたヒトでの試験でも、実際にメチル化カテキンを含むべにふうきエキスを摂取した群の方が、メチル化カテキンを含まない「やぶきた」エキスを摂取した群よりも強い抗高血圧効果が確認された。これらの結果より、メチル化カテキンはACEを阻害することにより抗高血圧効果が期待できることが示唆された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチル化カテキンを有効成分とすることを特徴とするアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
【請求項２】
前記メチル化カテキンが、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレートである請求項１記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
【請求項３】
べにふうき、べにふじ、べにほまれから選ばれた少なくとも１種の茶葉抽出物を含む請求項１又は２記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
【請求項１】
メチル化カテキンを有効成分とすることを特徴とするアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
【請求項２】
前記メチル化カテキンが、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレートである請求項１記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
【請求項３】
べにふうき、べにふじ、べにほまれから選ばれた少なくとも１種の茶葉抽出物を含む請求項１又は２記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−７９７８９（Ｐ２０１１−７９７８９Ａ）
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３４７９１（Ｐ２００９−２３４７９１）
【出願日】平成２１年１０月９日（２００９．１０．９）
【出願人】（０００００６１１６）森永製菓株式会社 (130)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月９日（２００９．１０．９）
【出願人】（０００００６１１６）森永製菓株式会社 (130)
【Ｆターム（参考）】
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