アンドロゲン受容体陽性癌を処置する方法
アンドロゲン受容体陽性癌細胞の成長を阻害する方法を提供する。この方法は、アンドロゲン受容体陽性癌と診断された、またはその疑いがある個体に投与すること、およびその個体に、アンドロゲン受容体陽性癌の成長を阻害できる化合物を含む組成物を投与することを必要とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示内容を参照によって本明細書に援用する、２００９年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／２５４，３９５号明細書に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）が交付するｇｒａｎｔ ｎｏ．Ｒ４２ ＣＡ １１０４００−０１ ２００４−２００５による政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は全般的に癌治療に関し、より詳細にはアンドロゲン受容体陽性癌細胞を含む癌を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
前立腺癌（ＰＣａ：ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）は、最も多く見られる腫瘍性疾患であり、男性の癌関連死の原因として２番目に多く、米国だけで毎年３０，０００を超える人の生命を奪っている。ＰＣａの腫瘍は主に前立腺管腔の上皮細胞からなる。前立腺管腔の上皮細胞の分化は、アンドロゲン受容体（ＡＲ：Ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）による前立腺特異的マーカーの発現により、ある程度制御される。ＡＲは、複数のメカニズムにより細胞の生存を制御するが、そのメカニズムは、まだ不明である。ＡＲは、前立腺癌だけでなく、乳癌など他の癌の原因にも関与している。ＡＲは、ステロイド受容体（ＳＲ：ｓｔｅｒｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ファミリーに属し、転写因子として働く。このファミリーのメンバーは、リガンドの非存在下では、熱ショックタンパク質９０（Ｈｓｐ９０）と結合して、細胞質に存在している不安定なタンパク質である。ＡＲのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ：ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）にアンドロゲンなどのステロイドが結合すると、ＡＲは、Ｈｓｐ９０から遊離され、核に移行する。核内のアンドロゲン結合ＡＲは、遺伝子のプロモーターのアンドロゲン応答配列（ＡＲＥ：ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）と共に遺伝子の転写を活性化する（Ｃａｔｏ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ９：１５０−１５４）。ＡＲは、転写活性化因子としての機能だけでなく、一部の遺伝子の転写を抑制することもできる（Ｃｌａｅｓｓｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７６：２３−３０）。
【０００５】
アンドロゲンを枯渇させると、正常な前立腺管腔の上皮細胞の死を引き起こすことから、その生存におけるＡＲ経路の決定的役割が明らかにされる。癌性前立腺細胞はＡＲを発現し続け、同時に癌性前立腺細胞の生存がアンドロゲンの存在に依存しているため、アンドロゲン除去が、進行したＰＣａ患者に最適な治療法になっている。阻害剤のフルタミドおよびカソデックスの使用を含む抗アンドロゲン療法は通常、当初は効果的であるものの、完全な治癒に至るのは稀である。こうした療法で処置された患者の大部分でＰＣａの再発が起こり、アンドロゲン非依存性で化学療法抵抗性の腫瘍が発生し、予後は不良である。このため、抗アンドロゲン療法に対する抵抗性が、ＰＣａ処置の成功の大きな障害になっている。
【０００６】
腫瘍進行の過程でＰＣａにより獲得されるアンドロゲン非依存性のメカニズムの解析から、ＡＲシグナル伝達の低下が伴うことは稀であることが明らかにされる（Ｂａｌｋ，Ｓ．Ｐ．２００２．Ｕｒｏｌｏｇｙ ６０：１３２−１３８；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ １３８−１３９）。これとは反対に、アンドロゲン非依存性ＰＣａは典型的には、リガンド非依存性（恒常的に活性）であるかまたは非アンドロゲンリガンドに応答性であるＡＲミュータントの発現により、ＡＲ活性が増強していることを特徴とする（Ｃｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．２００８．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ８：４４０−４４８；Ｔｉｌｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２：２７７−２８５；Ｋｏｉｖｉｓｔｏ，ｅｔ ａｌ．１９９８ Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５２：１−９；Ｍａｒｑｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．２００５．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １１７：２２１−２２９；Ｂｏｈｌ，Ｃｅｔ ａｌ．２００５．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０：３７７４７−３７７５４；Ｈａｒａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．２００３．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３：１４９−１５３）。
【０００７】
自己複製する腫瘍細胞の主要な供給源と考えられる微量の細胞集団である前立腺の「腫瘍起源細胞」または「癌幹細胞」は、正常な前立腺幹細胞と異なり、機能的ＡＲを発現することが最近明らかにされた（Ｖａｎｄｅｒ Ｇｒｉｅｎｄ，ｅｔ ａｌ．２００８．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６８：９７０３−９７１１１）。このことと、去勢抵抗性の段階まで進行したＰＣａ腫瘍でＡＲ活性が維持されることが観察されることとを考え合わせると、ＡＲが、アンドロゲン依存性ＰＣａとアンドロゲン非依存性ＰＣａとの双方のみならず、ＡＲ陽性の他の癌型も有望な治療標的となる可能性が示唆される。たとえば、乳房上皮細胞は、多くの点、前立腺細胞に類似している。ＰＣ細胞の生存がアンドロゲンの刺激による活性ＡＲに依存するように、乳房上皮細胞も同様、関連するエストロゲン受容体（ＥＲ：ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、およびプロゲステロン受容体（ＰＲ：ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に依存する。乳癌（ＢＣ：ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）におけるＥＲおよびＰＲの役割と、治療アプローチとしてそれらの機能を調節することとが、長年研究の中心であった。しかしながら、ＡＲの発現は、正常な乳腺細胞では低レベルであり、大部分のＢＣでは、標的治療がまだ利用できない「トリプルネガティブ」（ＥＲ陰性、ＰＲ陰性、Ｈｅｒ２陰性）ＢＣの５０％など、様々なレベルで発現する。乳房上皮細胞に対するアンドロゲンの作用については、いくつかの研究で検討されてきものの、ＢＣにおいてＡＲが果たす役割は、依然として不明である（Ｂｉｒｒｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５２，４５９−４６７；Ｂｒｅｔｔｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｂｕｌｌ Ｃａｎｃｅｒ ９５，４９５−５０２；Ｄｉ Ｍｏｎａｃｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５，２５８１−２５８４）。このため、ＡＲ陽性癌に対する現行の処置方法は大部分が無効であり、以下に限定されるものではないが、ＰＣａおよび乳癌などＡＲ陽性癌細胞治療の新たな方法が現在も求められている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、個体におけるＡＲ陽性癌細胞の成長を阻害する方法を提供する。この方法は、ＡＲ陽性癌と診断されたまたはその疑いがある個体に、ＡＲ陽性癌細胞の成長を阻害するか、またはＡＲ陽性癌細胞を殺すことができる化合物を含む組成物を投与することを含む。ＡＲ陽性細胞は、どのようなＡＲ陽性癌細胞であってもよい。種々の実施形態では、ＡＲ陽性癌細胞は、乳癌細胞、前立腺癌細胞、肝細胞癌細胞、甲状腺癌の細胞、グリオブラストーマまたは星状細胞腫である。
【０００９】
本発明に使用するのに好適な化合物の構造を図７、図８、図９、図１０、図１１に示す。図７、図８、図９、図１０、図１１に示した化合物の特定の例を、それぞれｃ５、ｃ６、ｃ１１、ｃ５２およびｃ８５と呼ぶ。化合物は各々、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入したＤｉｖｅｒＳｅｔ化学ライブラリーのスクリーニングから同定し、各化合物については、特定の化合物構造の識別に使用できる、一般に入手可能なＣｈｅｍｂｒｉｄｇｅ識別（ＩＤ）番号と関連付けてある。種々の実施形態では、種々の実施形態では、本発明の方法においてｃ５（Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ ＩＤ６０９９１１２）、ｃ６（Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ ＩＤ５６５２３０６）、ｃ１１（Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ ＩＤ６００５９７８）、ｃ５２（Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ ＩＤ５５８２３６７）およびｃ８５（Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ ＩＤ６０２８７１７）を使用することがある。
【００１０】
一実施形態では、本発明の方法は、ＡＲ陽性癌と診断されたまたはその疑いがある個体に、本明細書でｃ５、ｃ６、ｃ１１、ｃ５２およびｃ８５と呼ばれる化合物、ならびにこれらの組み合わせから選択される化合物を含む組成物を投与することを含む。
【００１１】
一実施形態では、個体に投与される組成物は、ｃ５２を含む。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、個体が、ＡＲ陽性癌細胞の成長を阻害するか、またはＡＲ陽性癌細胞を殺すことができる化合物を含む組成物を用いた処置の候補であるかどうかを確認する方法を提供する。この方法は、個体から生物学的サンプルを採取すること、およびサンプルがアンドロゲン受容体陽性癌細胞を含んでいるかどうかを判定することを含み、生物学的サンプルがアンドロゲン受容体陽性癌細胞を含んでいると判定することは、個体が処置の候補であることを示唆し、生物学的サンプルがアンドロゲン受容体陽性癌細胞を含んでいないと判定することは、個体が処置の候補でないことを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａは、ＡＲＤＬＢＤが無血清の培地（ＳＦＭ：ｓｔｅｒｏｉｄ−ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ）中で転写活性があることを示す日付をグラフ化したものを示す。ＨｅＬａ細胞に、ＡＲ依存性レポーターコンストラクトｐＡＲＥ−Ｌｕｃと、野生型（ｗｔ）ＡＲ発現コンストラクト、ＡＲＤＬＢＤ発現コンストラクトまたは陰性対照（空ベクター）発現コンストラクトとをＳＦＭ中でトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＡＲＤＬＢＤが常に核に局在化することを示す写真を示す。図Ａと同様にＳＦＭ中でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を未処理のままか、または１ｎＭのジヒドロテストステロン（ＤＨＴ：ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）で２４時間処理し、続いて抗ＡＲ抗体で免疫蛍光染色を行った。
【図１Ｃ】図１Ｃは、形質導入を用いてあるいは用いずに調製した細胞ライセートのウエスタンブロッティングにより得られた結果の写真を示す。図１Ｃでは、内因性のＡＲ転写物の非翻訳領域を標的とするｓｈＲＮＡ、およびＡＲＤＬＢＤ発現コンストラクトを組み合わせたレンチウイルスの形質導入により、ＣＷＲ２２Ｒ細胞の内因性のＡＲを異所性ＡＲＤＬＢＤで置換した。ブロットを抗ＡＲ抗体および抗アクチン抗体でブローブした。
【図１Ｄ】図１Ｄは、様々な濃度のＤＨＴの添加によりＳＦＭで成長させた最初の細胞および形質導入細胞を用いたＡＲ依存性レポーターアッセイ（ｐＡＲＥ−Ｌｕｃ）から得られたデータをグラフ化したものを示す。図１Ｄでは、内因性のＡＲ転写物の非翻訳領域を標的とするｓｈＲＮＡ、およびＡＲＤＬＢＤ発現コンストラクトを組み合わせたレンチウイルスの形質導入により、ＣＷＲ２２Ｒ細胞の内因性のＡＲを異所性ＡＲＤＬＢＤで置換した。図１Ｄに示したアッセイは、３回ずつ行った。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、血清を含む標準培地中で最初の細胞および形質導入細胞の成長速度（細胞数）を測定して得られたデータをグラフ化したものを示す。図１Ｅでは、内因性のＡＲ転写物の非翻訳領域を標的とするｓｈＲＮＡ、およびＡＲＤＬＢＤ発現コンストラクトを組み合わせたレンチウイルスの形質導入により、ＣＷＲ２２Ｒ細胞の内因性のＡＲを異所性ＡＲＤＬＢＤで置換した。図１Ｅに示したアッセイは、３回ずつ行った。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、様々な細胞に対するＡＲ阻害剤の毒性を示すデータを示す。図２Ａは、様々な化学物質で７日間処理した表記の細胞のコロニー形成アッセイの解析により得られたデータをグラフ化したものである。図２Ａのエラーバーは、３回の実験の標準偏差を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、様々な細胞に対するＡＲ阻害剤の毒性を示すデータを示す。図２Ｂは、ＥＣ５０（ＣＷＲ２２Ｒ細胞のＡＲ依存性レポーターの阻害）およびＩＣ５０（ＣＷＲ２２Ｒ細胞に対する毒性）のグラフによる比較である。図２Ｂのエラーバーは、ＥＣ５０およびＩＣ５０の信頼区間である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、様々な細胞に対するＡＲ阻害剤の毒性を示すデータを示す。図２Ｃは、由来の異なる一連の細胞株に対するいくつかの化合物の用量依存性の毒性を示すデータをグラフ化したものである。図２Ｃのエラーバーは、３回の実験の標準偏差を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＡＲタンパク質のレベルの低下が、ＰＣａ細胞に対する選択したＡＲ阻害剤ヒットの毒性に関連することを示すデータを示す。図１Ａは、１０ｍＭの表記のヒットで３６時間処理したＣＷＲ２２Ｒ細胞のライセートのウエスタンブロッティングの写真である。ＡＲ抗体により、これらの細胞に自然に存在するＡＲの全長およびＤＬＢＤ型が明らかになる。ＧＡＰＤＨ抗体をタンパク質ローディングのコントロールに用いた。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＡＲタンパク質のレベルの低下が、ＰＣａ細胞に対する選択したＡＲ阻害剤ヒットの毒性に関連することを示すデータを示す。図３Ｂは、ｃ５２の存在下で選択したクローン（ｃ５２Ｒ）が、親ＣＷＲ２２Ｒ細胞と異なり、ｃ５２の作用に抵抗性があることを示すデータをグラフ化したものである。ＣＷＲ２２Ｒのｃ５２ＲクローンのＡＲタンパク質発現は、ｃ５２処理により低下しなかった。ｃ５２処理（１０μＭで３６時間）をしてまたはせずに、親およびｃ５２抵抗性ＣＷＲ２２Ｒ細胞のウエスタンブロッティングを行った。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＡＲタンパク質のレベルの低下が、ＰＣａ細胞に対する選択したＡＲ阻害剤ヒットの毒性に関連することを示すデータを示す。図３Ｃは、化合物の添加から４日後のメチレンブルー染色により細胞生存能を解析したデータをグラフ化したものを示す。エラーバーは、３回の実験の標準偏差を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＡＲタンパク質のレベルの低下が、ＰＣａ細胞に対する選択したＡＲ阻害剤ヒットの毒性に関連することを示すデータを示す。図３Ｄは、蛍光活性化細胞分類法を用いて、細胞のＤＮＡ内容物（ｃｏｎｔｅｎｔ）のヨウ化プロピジウム染色により測定したＣＷＲ２２Ｒ細胞の細胞周期分布に対する選択した化合物の作用を示すデータをグラフ化したものである。アッセイは、２回行った。エラーバーは、２回の測定値の偏差を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＡＲ発現ＰＣａ細胞のＡＲ依存性の転写に対する、ＡＲを標的とする２種類のｓｈＲＮＡ（ｓｈＡＲ５およびｓｈＡＲ６）と、ＡＲミュータントＨＤ１−ＫＲＡＢ−ＡＲ１２２との作用を比較したデータを示す。図４は、ｐＡＲＥ−Ｌｕｃコンストラクトと、ｘ軸に示した様々な量のｓｈＲＮＡコンストラクトまたはＡＲミュータントＨＤ１−ＫＲＡＢ−ＡＲ１２２コンストラクトとをコトランスフェクトしたＣＷＲ２２Ｒ細胞に実施したレポーターアッセイ（ａｓｓａｓｙ）から得られたデータをグラフ化したものを示す。トランスフェクション混合物の総ＤＮＡ量は、ベクターＤＮＡを加えて同量に維持した。トランスフェクション効率は、ｐＣＭＶ−ｂ−ｇａｌコンストラクトのコトランスフェクションにより補正した。アッセイは、２回ずつ行った。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＡＲ発現ＰＣａ細胞のＡＲ依存性の生存に対する、ＡＲを標的とする２種類のｓｈＲＮＡ（ｓｈＡＲ５およびｓｈＡＲ６）と、ＡＲミュータントＨＤ１−ＫＲＡＢ−ＡＲ１２２との作用を比較したデータを示す。図４Ｂは、表記のコンストラクトをトランスフェクトし、ピューロマイシン耐性で選択したＣＷＲ２２Ｒ細胞のコロニー形成アッセイ得られたデータをグラフ化したものを示す。アッセイは、２回ずつ行った。エラーバーは、反復実験の結果の偏差である。
【図５Ａ】図５Ａは、ステロイド受容体の活性に対するＡＲ阻害剤の作用を示すデータである。図５Ａは、ＣＷＲ２２Ｒ細胞のＡＲＥ−Ｌｕｃレポーター活性が、様々なステロイド（ＤＨＴ−ジヒドロテストステロン、Ｄｅｘ−デキサメタゾン、Ａｌｄ−アルドステロン）により誘導され得るものの、ＡＲ発現に依存することを示すデータをグラフ化したものを示す。ＡＲまたはＧＡＰＤＨ（対照）を標的とするｓｉＲＮＡを、ＳＦＭ中でＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲＥ−Ｌｕｃ細胞にトランスフェクトした。表記の濃度のステロイドをトランスフェクト細胞に加え、２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ステロイド受容体の活性に対するＡＲ阻害剤の作用を示すデータである。図４Ｂは、ＤＨＴ、ＤｅｘまたはＡｌｄにより誘導された、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３−ＭＭＴＶ−Ｌｕｃ細胞のルシフェラーゼ活性に対するヒット化合物の作用を示すデータをＤＭＳＯ対照に対する比率として示してグラフ化したものを示す。Ｘ軸は、ヒットの濃度をμＭ単位で示す。エラーバーは、反復実験の標準偏差を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、アンドロゲン非依存性ＰＣａのマウスモデルにおける、選択したヒットの抗腫瘍活性を示すデータである。図６Ａは、記載した化合物またはＤＭＳＯビヒクルを、皮下に（ｓ．ｃ．）Ｃ４−２腫瘍を持つヌードマウスにｉ．ｐ．注射して得られたデータをグラフ化したものを示す。腫瘍の大きさが約１００ｍｍ３になってから６回の連日注射を行った。各群４〜５匹のマウスとし、各マウスには２つの腫瘍があった。ＡＮＯＶＡ検定により対照群との間に統計的有意差がある（＞９９％）、ｃ６群およびｃ１１群の測定の平均値の下にそれぞれアスタリスク（＊）および番号記号（＃）を付してある。エラーバーは、所定の処置群内の腫瘍の大きさの標準偏差を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、アンドロゲン非依存性ＰＣａのマウスモデルにおける、選択したヒットの抗腫瘍活性を示すデータである。図６Ｂでは、腫瘍の大きさが約４０ｍｍ３になってから、ｓ．ｃ．ＣＷＲ２２Ｒ腫瘍を持つヌードマウスの尾静脈に、Ｃ５２（９ｍｇ／ｋｇもしくは１８ｍｇ／ｋｇ）またはＤＭＳＯビヒクルを注射した。５回の連日注射を行った。各群１０匹のマウスとし、各マウスには１つの腫瘍があった。ＡＮＯＶＡ検定により対照群との間に統計的有意差がある（＞９９％）測定の平均値の下にアスタリスク（＊）を付してある。エラーバーは、所定の処置群内の腫瘍の大きさの標準偏差を示す。
【図７】図７は、クラス１化合物の構造を示す。
【図８】図８は、クラス３化合物の構造を示す。
【図９】図９は、クラス６化合物の構造を示す／
【図１０】図１０は、クラス５４化合物の構造を示す。
【図１１】図１１は、クラスＸＸ化合物の構造を示す。
【図１２】図１２は、様々な濃度の化合物ｃ５２、ｃ７０およびｃ８５により別々の乳癌細胞および前立腺癌細胞に引き起こされる細胞死を解析することによって得られたデータをグラフ化したものを示す。９ＡＡは９−アミノアグリジンであり、陽性対照として使用する。さらに、ＡＲ（ＡＲ）の発現に対する化合物の作用を示すウエスタンブロット（ＷＢ：Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）も示す。
【図１３】図１３は、様々な濃度の化合物ｃ５２、ｃ７０およびｃ８５の存在下で別々の乳癌細胞および前立腺癌細胞の細胞生存を解析することにより得られたデータをグラフ化したものを示す。
【図１４】図１４は、様々な濃度の化合物ｃ５２、ｃ７０およびｃ８５の存在下で別々の乳癌細胞および前立腺癌細胞の細胞細胞生存を解析することにより得られたデータをグラフ化したものを示す。さらに、ＡＲタンパク質の発現に対する化合物の作用を示すウエスタンブロット）も示す。
【図１５】図１５は、様々な濃度の化合物ｃ５２、ｃ７０およびｃ８５の存在下での乳癌細胞および前立腺癌細胞の細胞細胞生存を解析することにより得られたデータをグラフ化したものを示す。
【図１６】図１６は、様々な濃度の化合物ｃ５２、ｃ７０およびｃ８５により引き起こされる乳癌細胞および前立腺癌細胞の細胞死を解析することにより得られたデータをグラフ化したものを示す。
【図１７】図１７は、様々な濃度の化合物ｃ５２、ｃ７０およびｃ８５の存在下でのＡＲ陰性乳癌および子宮頸癌の細胞細胞生存を解析することにより得られたデータをグラフ化したものを示す。
【図１８】図１８は、ＣＷＲ２２Ｒ、ＬＮＣａＰ、Ｃ４−２（ＡＲ陽性前立腺癌ＡＲ）、ＰＣ３、ＤＵ１４５、ＰＰＣ１（ＡＲ陰性前立腺癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＲ陰性乳癌）、ＡＣＨＮ、ＳＫ−ＲＣ４５（ＡＲ陰性腎細胞癌）、ＭＲＣ５（正常２倍体線維芽細胞）およびＮＫＥ−ｈＴＥＲＴ（正常腎上皮線維芽細胞）など複数の細胞株の生存に対する種々の濃度のｃ５、ｃ８５、ｃ６およびｃ５２の作用を解析することにより得られたデータをグラフ化したものを示す
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、個体におけるＡＲ陽性癌細胞の成長を阻害する方法を提供する。この方法は、ＡＲ陽性癌と診断されたまたはその疑いがある個体に、ＡＲ陽性癌細胞の成長を阻害するか、またはＡＲ陽性癌細胞を殺すことができる化合物を含む組成物を投与することを含む。本発明に使用するのに好適な化合物の一般構造を図７、図８、図９、図１０、図１１に示す。本明細書では、図７に示した構造をクラス１ということもある。本明細書では、図８に示した構造をクラス３ということもある。本明細書では、図９に示した構造をクラス６ということもある。図１０に示した構造をクラス５４ということもある。本明細書では、図１１に示した構造をクラスＸＸということもある。
【００１５】
図７、図８、図９、図１０、図１１に示した化合物の特定の例は、それぞれｃ５、ｃ６、ｃ１１、ｃ５２およびｃ８５という。ｃ５、ｃ６、ｃ１１、ｃ５２およびｃ８５は、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入したＤｉｖｅｒＳｅｔ化学ライブラリーに存在する３４，０００の化合物から本発明の方法に使用するのに好適であると確認された。各化合物は、一般に入手可能なＣｈｅｍｂｒｉｄｇｅ識別（ＩＤ）番号と関連付けてあるため、各構造は、それに従って評価することができる。
【００１６】
当業者であれば、図７〜１１に示した各構造は、Ｒの位置に存在し得る別の基によって相互に異なる複数の化合物を含むことを認識するであろう。たとえば、図７に示す化合物のクラスの場合、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、アリール部分が５または６個の炭素を含み、アルキル部分が１〜４個の炭素を含むアリールアルキル基（メチルベンゼン基など）、アルキル部分が１〜４個の炭素を含むアルキルケトン基（アセテート基など）、ハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージド）、またはヒドロキシル基である。Ｒ３は、水素またはヒドロキシル基である。Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、ハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージドなど）、またはニトロ基である。Ｘ１は、酸素原子または硫黄原子である。
【００１７】
図８に示した化合物のクラスでは、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、アルキル部分が１〜６個の炭素を含むアルキルエーテル基（メチルエーテル基またはエチルエーテル基など）、ハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージドなど）、アミノ基、ヒドロキシル基、またはニトロ基である。Ｘ２は、酸素原子または硫黄原子である。
【００１８】
図９に示した化合物のクラスでは、Ｒ１７およびＲ１８は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはアルキル部分が１〜４個の炭素を含むアルキルエーテル基（メチルエーテルまたはエチルエーテルなど）である。Ｒ１９およびＲ２０は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージドなど）である。
【００１９】
図１０に示した化合物のクラスでは、Ｒ２１（Ｒ２５）は、水素、または任意に１つもしくは複数のヒドロキシル基またはシアノで置換されていてもよい１〜６個の炭素を含むアルキル基である。Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４（Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２９）は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、アルキル部分が１〜４個の炭素を含み、かつ任意に１つもしくは複数のハライドで置換されていてもよいアルキルケトン基（アセテート基またはトリフルロアセテート基）、アルキル部分が１〜４個の炭素を含み、かつ任意に１つもしくは複数のハライドで置換されていてもよいアルコキシ基、ハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージドなど）、アルキル基が１〜４個の炭素を含むアルキルスルホンアミド（メチルスルホンアミドなど）、またはヒドロキシル基である。Ｒ３０、Ｒ３１およびＲ４１は独立に、水素、または任意に１つもしくは複数のハライドで置換されていてもよい１〜６個の炭素を含むアルキル基である。Ｒ３２は、任意に１つもしくは複数のハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージドなど）で置換されていてもよい１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはアミノ基である。Ｒ３３およびＲ３４は独立に、任意に１つもしくは複数のハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージドなど）で置換されていてもよい１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはアルキル部分が１〜４個の炭素を含むアルキルシクロヘキシル基（メチルシクロヘキシル基など）である。
【００２０】
図１１に示した化合物のクラスでは、Ｒ３５は、水素、任意に１つもしくは複数のハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージドなど）で置換されていてもよい１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージドなど）である。Ｒ３６およびＲ３７は独立に、水素、または任意に１つもしくは複数のハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージドなど）で置換されていてもよい１〜６個の炭素を含むアルキル基である。Ｒ３８およびＲ３９は独立に、水素、任意に１つもしくは複数のハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージドなど）で置換されていてもよい１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはヒドロキシル基である。Ｒ４０は、水素またはヒドロキシル基である。本明細書に示した一部の構造には、位置によっては水素を示していない。当業者であれば、こうした構造は、そうした水素置換基を含むことが理解されよう。
【００２１】
本開示内に包含される化合物の特定の例は、指定されたｃ５、ｃ６、ｃ８、ｃ１１、ｃ１６、ｃ１７、ｃ１８、ｃ４７、ｃ５２、ｃ５５、ｃ６１、ｃ６６およびｃ７３（Ｃｈｅｍｂｒｉｇｅ ＩＤ番号６４４３２１３）である。個々の構造をＣｈｅｍｂｒｉｄｇｅ ＩＤ番号と共に下記に示す。
【００２２】
一実施形態では、本発明の方法は、ＡＲ陽性癌と診断されたまたはその疑いがある個体に、本明細書でｃ５、ｃ６、ｃ１１、ｃ５２およびｃ８５と呼ばれる化合物、ならびにこれらの組み合わせから選択される化合物を含む組成物を投与することを含む。
【００２３】
一実施形態では、個体に投与される組成物は、ｃ５２を含む。
【００２４】
本明細書に言及されるＡＲ陽性癌細胞は、検出可能な量のＡＲタンパク質を発現する癌細胞である。「アンドロゲン受容体」（およびその略語「ＡＲ」）は、当業者によく知られている用語であり、ヒトＡＲタンパク質のすべてのアイソフォームおよび対立遺伝子変異体を含む、ヒト癌細胞に発現するＡＲタンパク質という意味で使用される。
【００２５】
一実施形態では、本発明の方法の実施により個体におけるその成長を阻害できるＡＲ陽性癌細胞は、任意の種類の抗ヒトＡＲ抗体により特異的に認識されるＡＲを発現する細胞である。抗ヒトＡＲ抗体は、市販されている。一実施形態では、本発明の方法の実施により個体におけるその成長を阻害できるＡＲ陽性癌細胞は、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから、カタログ番号＃５５４２２５で入手可能な抗ヒトＡＲ抗体により特異的に認識され得るＡＲを発現する細胞である。一実施形態では、ＡＲタンパク質の検出可能な量は、ウエスタンブロットにより検出できるＡＲタンパク質の量である。
【００２６】
一実施形態では、ＡＲ陽性癌細胞は、参照によって本明細書に援用する、２００９年９月１日エントリーのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ１０２７５のアミノ酸配列を持つＡＲを発現する細胞である。代替の実施形態では、ＡＲ陽性癌細胞は、２００９年９月１日にＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ１０２７５で登録されたアミノ酸配列に対して７０％以上９９％以下（その間の整数をすべてを含む）相同であるアミノ酸配列を持つＡＲを発現する細胞である。ＡＲ陽性細胞は、そうした配列のいずれを持つＡＲを発現する癌細胞であってもよく、ＡＲは、ウエスタンブロットにより検出可能である。
【００２７】
ＡＲ陽性癌細胞は、どのような種類の癌細胞であってもよい。一実施形態では、癌細胞は、前立腺癌細胞である。前立腺癌細胞は、アンドロゲン依存性でも、またはアンドロゲン非依存性でもよい。
【００２８】
別の実施形態では、ＡＲ陽性細胞は、乳癌細胞である。乳癌細胞は、どのような種類の乳癌細胞であってもよい。ただし、乳癌細胞は、ＡＲ陽性である。乳癌細胞は、ＥＲ−乳癌細胞でも、ＰＲ−乳癌細胞でも、Ｈｅｒ２−乳癌細胞でも、またはこれらの組み合わせのいずれであってもよい。
【００２９】
別の実施形態では、ＡＲ陽性細胞は、肝細胞癌細胞、甲状腺の癌細胞、グリオブラストーマまたは星状細胞腫である。
【００３０】
ＡＲ陽性癌細胞の成長の阻害は、部分的な阻害でも、または完全な阻害でもよい。個体由来のＡＲ陽性癌細胞の一部または全部の根絶は、ＡＲ陽性癌細胞の成長の阻害の一種と見なされる。
【００３１】
一実施形態では、本発明は、図７、図８、図９、図１０、図１１に示した構造を持つ化合物を含む有効量の組成物を細胞と接触させることにより、癌細胞の成長を阻害することを含む。
【００３２】
本発明の一実施形態では、個体は、図７、図８、図９、図１０、図１１に示した化合物の群から選択される有効量の化合物を含む組成物を用いた処置の候補として確認することができる。個体は、個体由来の癌性組織の生物学的サンプルを採取し、癌性組織がＡＲを発現しているか否かを判定することにより、こうした候補として確認することができる。癌性組織がＡＲを発現していると判定することは、個体が処置の候補であることを示唆する。同様に、組織が検出可能な量のＡＲを発現していないと判定することは、個体が処置の候補でないことを示唆する。癌性組織がＡＲを発現しているかどうかの判定は、免疫学的な技術など任意の好適な手法を用いて行うことができる。一実施形態では、本発明は、個体から採取した生物学的サンプル中のＡＲをＡＲ−抗体複合体に変換すること、および免疫診断の装置を用いてＡＲ−抗体複合体を検出することを含む。
【００３３】
種々の実施形態では、本発明は、癌性組織がＡＲを発現しているか否かの判定を有形媒体に固定すること、および／または個体の推奨処置を有形媒体に固定することをさらに含む。有形媒体は、以下に限定されるものではないが、コンピューター、ＤＶＤ、ＣＤ−ＲＯＭまたは電子メールメッセージに保存できるデジタルファイルのような任意の種類のデジタル媒体など、どのような種類の有形媒体であってもよい。有形媒体は、処置プロトコルを開発し、それにより本発明の方法の実施を含む、個体の処置法を開発するため、医療提供者に提供してもよい。
【００３４】
本発明の方法を実施するための化合物を含む組成物は、任意の好適な薬学的に許容されるキャリア、賦形剤および／または安定剤と混合することにより調製することができる。化合物との混合に好適な組成物の一部の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００５）２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓで確認することができる。
【００３５】
本明細書に記載の化合物を含む組成物は、経口注射、非経口注射、皮下注射、腹腔内注射、肺内注射、鼻腔内注射および頭蓋内注射など任意の利用可能な方法および経路を用いて個体に投与してもよい。非経口注入としては、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与および皮下投与がある。
【００３６】
本発明の方法は、以下に限定されるものではないが、化学療法、外科的介入および放射線療法など従来の抗癌療法の前に実施しても、同時に実施しても、または後に実施してもよい。
【００３７】
当業者であれば、本発明の方法に利用される特定の投与レジメンの形態および特徴は、投与経路、および他のよく知られた可変要素、個体の性別および大きさ、ならびに処置対象の特定の癌の種類および段階によって決まることを認識するであろう。こうした判断基準に基づき、当業者は、個体に投与する組成物の有効量を判定することができる。
【００３８】
我々は、本発明に到達した際に、ＡＲ−リガンド相互作用とは異なるＡＲの機能面を標的とするＡＲ阻害剤を同定した。我々は、これを、リガンド非依存性ＰＣａ細胞株におけるＡＲ依存性の転写の特定の阻害剤を最初に同定することにより達成した。我々は、ＡＲ発現ＰＣａ細胞株に対して特異的な毒性を示す化合物を選択した。特に、ＡＲ依存性の転写の阻害剤がすべてアンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞株に毒性があるとは限らなかったことから、ＡＲの転写機能が、ＰＣａの細胞生存を単独では制御しないことが示唆される。我々は、マウスのＰＣａの異種移植モデルを用いてインビボでの抗腫瘍活性に最も優れたＡＲ阻害剤を試験し、最も効果的な化合物によりＡＲ阻害の分子機構を解析した。これが、細胞からのＡＲタンパク質の除去が、細胞生存に対して、ＡＲのトランス活性化機能の抑制と異なる影響を与えるという発見につながった。このことは、ＡＲが、本明細書に示したデータにより明らかなように、転写非依存性メカニズムを介して前立腺細胞生存、さらにおそらく乳癌細胞など他の種類のＡＲ陽性癌細胞も制御することを示唆する。これは、重要、かつまだ認識されていない抗癌アプローチと考えられる。
【００３９】
以下の実施例は、本発明の説明を意図するものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００４０】
実施例１
本実施例は、本明細書に示した結果を得るために使用した材料および方法については説明する。
【００４１】
細胞株：ＬＮＣａＰ細胞、ＤＵ１４５細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３−ＭＭＴＶ−Ｌｕｃ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＡＣＨＮ細胞、ＭＲＣ５細胞およびＨＴ１０８０細胞をＡＴＣＣから取得した。ＲＣＣ４５および正常腎上皮細胞（ＮＫＥ：ｎｏｒｍａｌ ｋｉｄｎｅｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）については、Ｇｕｒｏｖａ，ｅｔ ａｌ．２００４．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４：１９５１−１９５８）に記載された。ｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏベクターを用いたヒトテロメラーゼサブユニットの形質導入により、不死化ＮＫＥ−ｈＴＥＲＴ細胞を得た。ＣＷＲ２２Ｒ細胞およびＣ４−２細胞は、Ｄｒ．Ｗａｒｒｅｎ Ｈｅｓｔｏｎ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ）から提供された。ｐＡＲＥ−ＬｕｃレポーターコンストラクトおよびＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲＥ−Ｌｕｃレポーター細胞については、既に記載された（Ｔａｒａｒｏｖａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．２００７．Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６７：１８０１−１８１５）。ＡＲが結合するコンセンサスＤＮＡエレメントは他のいくつかのステロイド受容体によっても認識されるが、ｐＡＲＥ−Ｌｕｃレポーターは、最もＡＲ特異的プロモーター領域の１つとして知られるプロバシンプロモーターの領域を利用するものである（Ｔａｒａｒｏｖａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．２００７．Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６７：１８０１−１８１５４）。
【００４２】
前立腺細胞株およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３−ＭＭＴＶ−Ｌｕｃはすべて、１０％ＦＢＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、５５ｎＭのβ−メルカプトエタノールおよび抗生物質を補充したＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。ＨｅＬａおよびＨＴ１０８０細胞は、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を含むＤＭＥＭ培地で維持した。ステロイドを含まない培地（ＳＦＭ）の作製には、フェノールレッドを含まない培地およびチャコール処理血清（ＣＳＳ：ｃｈａｒｃｏａｌ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ ｓｅｒｕｍ）を使用した。ＣＳＳは、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。
【００４３】
プラスミド：ｐＴＺＶ−ｗｔＡＲおよびｐＴＺＶ−ＡＲΔＬＢＤレンチウイルス発現コンストラクトを、野生型全長（１〜９１９ａａ）ＡＲ、またはヒトＡＲの最初の６３９ａａに対応するＡＲフラグメントをｐＴＺＶ−ＣＭＶベクターにサブクローニングすることにより得た（Ｔａｒａｒｏｖａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．２００７．Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６７：１８０１−１８１５）。ヒトＡＲに対するｓｈＲＮＡの発現を誘導するｐＬＰＣＰｗ−ｓｈＡＲレンチウイルスベクターについては、記載されているように作製した（Ｔａｒａｒｏｖａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．２００７．Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６７：１８０１−１８１５４）。ヒトＡＲの非翻訳領域に対応するｓｈＲＮＡ配列（ｅｑｕｅｎｃｅ）は、ＴＧＡＴＣＣＴＣＡＴＡＴＧＧＣＣＣＡＧであった。ｐＨＤ１−ＫＲＡＢ−ＡＲ１２２は、Ｄｒ．Ｇ．Ｊｅｎｓｔｅｒ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ，Ｊｏｓｅｐｈｉｎｅ Ｎｅｆｋｅｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｅｒａｓｍｕｓ ＭＣ，Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））から入手したものであり、既に記載された（２３）。ｐＬＶ−ＣＭＶ−Ｌｕｃベクターは、Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ Ｃｈｕｍａｋｏｖ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ）から好意により提供された。
【００４４】
レンチウイルスの形質導入およびｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、以前記載されたとおり、従来の技術を用いて行った（Ｇｕｒｏｖａ，ｅｔ ａｌ． ２００４．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４：１９５１−１９５８）。
【００４５】
化学物質：３４，０００のＤｉｖｅｒＳｅｔ化学ライブラリー（分子量約５００Ｄａの多環低分子からなる）は、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。ＤＨＴは、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から入手した。アルドステロン、デキサメタゾン、ＢＳＡ、ＲＮａｓｅ Ａおよびヨウ化プロピジウムは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。カソデックス（ビカルタミド）は、ＴＲＣ（Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。
【００４６】
化学物質の一次スクリーニング：ＤｉｖｅｒＳｅｔライブラリーの化学物質を、最終濃度２０μＭで９６ウェルプレート中のＣＷ２２Ｒ−ＡＲＥ−Ｌｕｃ細胞の単層に塗布した。翌日、ルシフェラーゼ活性を、ＢｒｉｇｈｔＧｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて読み取り、化学物質処理した細胞内のレポーター活性のパーセンタイルを計算した（ＤＭＳＯで処理した細胞を１００％と見なして比較）。このパラメーターが５０％以下であった化合物を一次ヒットとした。ヒットのリストを、ｐ５３、ＮＦ−κｂまたはＥ−ｂｏｘの結合エレメントを含むプロモーターにより誘導されるレポーターの阻害剤と、ＨｅＬａ細胞、メラノーマ細胞および神経芽細胞腫細胞に対して毒性がある化合物とを含む、同じライブラリーの他のスクリーニングから得られたものと比較した。これらの他のリストのいずれかにも存在したＡＲ阻害ヒットは、その後の検討から除外した。転写／翻訳またはルシフェラーゼ活性の非特異的阻害については、ＨＴ１０８０細胞を用いてＣＭＶ−ｌｕｃレポーターにより試験し、この系で活性なヒット化合物をその後の検討から除外した。
【００４７】
レポーター活性の用量依存性の阻害：ＣＷＲ２２Ｒ細胞を、９６ウェルプレート中、１ウェル当たり５×１０４個蒔いた。化合物を、１〜２００００ｎＭの用量範囲で２倍ずつ増やしながら加えた。各用量について、２回ずつ試験した。対照は、０．１％ＤＭＳＯおよび１５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤであった。ルシフェラーゼ活性を、Ｂｒｉｇｈｔ Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、化合物の添加から２４時間後に測定した。アッセイは、２回実施し、ＤＭＳＯと比較してレポーター活性を５０％阻害する化合物の有効濃度（ＥＣ５０）を、ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェア（Ｂｉｏｓｏｆｔ，Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いてシグモイド近似法により計算した。シグモイドごとに信頼区間を計算した。
【００４８】
細胞コロニーアッセイ：細胞を、コンフルエント前の指数関数的増殖まで６〜７日を要する密度で２４ウェルプレートに蒔いた。培地および化合物を４８時間ごとに交換し、起こり得る化合物の不安定性作用を最小限に抑えた。化合物の存在下でのインキュベーションから７日後、細胞を固定し、メチレンブルーで染色し、続いて１％ＳＤＳで染色物を抽出し、６５０ｎｍで分光光度法を実施した。各アッセイは、３回ずつ実施し、対照ウェルと化合物処理ウェルとの差をスチューデントのｔ検定を用いて判定した。
【００４９】
細胞成長の用量依存性の阻害：細胞を、９６ウェルプレート中、１ウェル当たり１×１０３個蒔いた。化合物を、１〜２００００ｎＭの用量範囲で２倍ずつ増やしながら加えた。各用量について、３回ずつ試験した。対照は、０．１％ＤＭＳＯ（細胞生存能に対する影響なし）、および５０μＭの９−アミノアクリジン（完全な細胞死）であった。細胞を６日間インキュベートし、次いで固定し、メチレンブルーで染色し、続いて１％ＳＤＳで染色物を抽出し、６５０ｎｍで分光光度法を実施した。アッセイは、２回実施し、結果に基づき、ＤＭＳＯと比較して細胞成長を５０％抑制する化合物の阻害濃度（ＩＣ５０）を、ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェア（Ｂｉｏｓｏｆｔ，Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いてシグモイド近似法により計算した。シグモイドごとに信頼区間を計算した。
【００５０】
ＣＷＲ２２Ｒ細胞の化合物抵抗性変異体の選択を、１０７個の細胞を１０×ＩＣ５０の化合物の存在下で３日間インキュベートして行った。次いで細胞を、プレコンフルエントレベルになるまで薬剤を含まない培地で維持した。この手順を、化合物の存在下で死細胞が観察されなくなるまで数回繰り返した。
【００５１】
コンディション培地におけるＰＳＡタンパク質のレベルを、細胞を１０μＭの被検化合物と、あるいはそれなしで７２時間インキュベートしてから、Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ Ａｍｅｒｉｃａ（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）製の「Ｈｕｍａｎ ＰＳＡ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ」を用いて判定した。
【００５２】
ウエスタンブロット解析。細胞を、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に溶解した。総タンパク質濃度を、Ｄｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて測定した。ウエスタンブロッティングについては、４〜１２％ＳＤＳプレキャストＮｏｖｅｘゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＰＶＤＦ膜（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏＴｅｃｈ）を用いて行った。以下の抗体を使用した：ＡＲに対する抗体（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；＃５５４２２５、１μｇ／ｍｌ）；ローディングコントロールとしてのＧＡＰＤＨに対する抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）。
【００５３】
細胞周期分布の解析を、ヨウ化プロピジウムによるＤＮＡ内容物（ｃｏｎｔｅｎｔ）の染色に基づき行った。トリプシンを用いて１０５個の細胞を培養皿から剥がし、ＰＢＳで洗浄し、３％ＢＳＡのＰＢＳ溶液３００μｌに再懸濁し、続いて７０％エタノール５μｌを加えた。細胞を−２０℃で数時間維持し、次いで３０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａの存在下で１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムで２時間３７℃にて染色した。ＤＮＡ内容物（ｃｏｎｔｅｎｔ）については、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ機器およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を用いて評価した。
【００５４】
マウスを用いた化合物安全性の試験を、ＩＡＣＵＣ承認のプロトコルに従い行った。実験は、Ｈａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）製の８週齢の非近交系ＮＩＨ Ｓｗｉｓｓ雄マウスを用いて、各群４匹のマウスで実施した。マウス体重に基づくインビボ用量の計算には、ＩＣ５０濃度を使用した（１ｇのマウス組織は約１ｍｌの量を含むという仮定に基づき、ｍｇ／ｋｇに相当するＩＣ５０のインビボ用量＝ｍｇ／ｍｌのＩＣ５０×１０００）。化合物は、２５％ＤＭＳＯ−７５％ＰＢＳを用いて、化合物のインビトロでの細胞致死量に相当する２０×ＩＣ５０から腹腔内に（ｉ．ｐ．）注射した。その後マウスを３日間観察してから、５０×ＩＣ５０（用量２）および１００×ＩＣ５０（用量３）の２回の各注射を行った。マウスの対照群には、２５％ＤＭＳＯ−７５％ＰＢＳを３日間の間隔をおいて３回注射した。ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて血液生化学的解析を行った。
【００５５】
マウスを用いた化合物の抗腫瘍作用の試験を、Ｈａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）製の８週齢の雄無胸腺ヌードマウスを用いて、ＩＡＣＵＣ承認のプロトコルに従い行った。Ｃ４−２異種移植モデルでは、１０６個のＣ４−２細胞を、５０％マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｒａｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＰＢＳ溶液を用いて各マウスの２部位に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。目視可能な腫瘍が発生したら、デジタルカリパスを用いて測定した。腫瘍容積を、式：容積＝長さ×幅２／２に従い計算した。各マウスで少なくとも１つの腫瘍の大きさが１００ｍｍ３になったら、マウスに化合物を６日間毎日ｉ．ｐ．注射した。各群５匹のマウスを使用した。ＣＷＲ２２Ｒ異種移植モデルでは、ＣＷＲ２２Ｒ細胞を、５０％マトリゲルを用いてマウス１匹当たり１部位に接種した（１接種当たり１０５個の細胞）。腫瘍が少なくとも２５ｍｍ３の大きさになったとき、処置を開始した。化合物をキャプティソル（ｃａｐｔｉｓｏｌ）（ＣｙＤｅｘ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）で希釈し、１日１回５日間静脈内に（肝「初回通過」効果の抑制のため）送達した。各群１０匹のマウスを使用した。マウスを毎日モニターし、腫瘍を１日おきに測定した。腫瘍の大きさが１０００ｍｍ３に達したとき、委員会の規制に従いマウスを安楽死させた。ＡＮＯＶＡ試験を用いて対照マウスと処置マウスとの腫瘍成長の比較を行った。
【００５６】
実施例２
本実施例は、本発明の方法に使用するのに好適である化合物の同定について説明する。
【００５７】
我々は、ＡＲの阻害剤を同定するため低分子のライブラリーをスクリーニングした。我々は、以下のいくつかの理由から細胞ベースの読み出し（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ｒｅａｄｏｕｔ）アプローチを選択した。（ｉ）我々は、標的の可能性を単にＡＲタンパク質自体から、インビトロでの生化学的分析では不可能であるＡＲシグナル伝達経路全体へと広げることを目指していた。（ｉｉ）ＡＲのどの機能／ドメイン／結合部位が細胞生存の制御に関与しているか不明である。（ｉｉｉ）全長ＡＲの結晶構造がまだ解明されていない。後者２つの現状から、合理的設計アプローチは、不可能である。
【００５８】
ＡＲ−リガンド相互作用と異なるメカニズムを介した新しい種類のＡＲ阻害剤を同定する可能性を高めるため、我々は、いくつかの入手可能な培養細胞株から最もアンドロゲン非依存性の細胞ＣＷＲ２２Ｒを選択して、ライブラリーのスクリーニングに使用した。この細胞の増殖は、アンドロゲンの非存在により影響を受けず、アンドロゲン除去に伴うＡＲ転写活性の低下が最小限になる（他のＰＣａ細胞株と比較して）。この細胞株のもう１つの重要な特徴は、ＬＢＤを欠損したＡＲの切断型ミュータントを発現することである（ＡＲΔＬＢＤ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６２：６６０６−６６１４）。ＣＷＲ２２Ｒ細胞内に存在する５０％を超えるＡＲタンパク質がＡＲΔＬＢＤ型であるのに対し、残りは、ＬＢＤ突然変異を含む全長のＡＲタンパク質である。ＡＲ活性の大部分が、ＬＢＤを欠損したミュータントに起因する細胞を使用すると、ＡＲ−リガンド相互作用の阻害以外のメカニズムを介して作用する低分子阻害剤を単離する可能性が高まる。ＡＲΔＬＢＤがリガンド非依存性のＡＲ機能を持ち、阻害剤の同定に好適な標的であることを証明するため、我々は、ＡＲΔＬＢＤのみが存在するＣＷＲ２２Ｒ細胞を実験的に作製した。ＣＷＲ２２Ｒ細胞に、内因性のＡＲ転写物の非翻訳領域を標的とするｓｈＲＮＡ、およびＡＲΔＬＢＤの異所性発現を誘導する発現コンストラクトを同時形質導入した（図１）。こうした細胞では、ＡＲΔＬＢＤミュータントが転写因子として恒常的に活性であり、任意のリガンドの非存在下（すなわち、チャコール処理血清を用いて作製した、ステロイドを含まない培地（ＳＦＭ）中、図１Ａおよび図１Ｂ）でも核に局在する。我々はさらに、全ＡＲタンパク質の除去が、ＣＷＲ２２Ｒ細胞に対して毒性があるのに対し、異所性に発現したＡＲΔＬＢＤは、全長ＡＲの非存在下でＣＷＲ２２Ｒ細胞の増殖を支持し得ることも明らかにした（図１Ｃ〜図Ｅ）。これらの結果は、ＡＲΔＬＢＤミュータント型のＡＲが、全長タンパク質と同じ転写および細胞生存に導く活性を持ってはいるものの、リガンドを必要としないことを示唆する。
【００５９】
我々は、ＡＲの活性に対するライブラリーの化学物質の作用をモニターするため、ＡＲ依存性ルシフェラーゼレポーターコンストラクト（ｐＡＲＥ−Ｌｕｃ）をＣＷＲ２２Ｒ細胞に導入し、レポーターを組み込んだ安定な細胞株を作製した。得られたＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲＥ−Ｌｕｃ細胞に、３４，０００の低分子のライブラリーを２０μＭの濃度で塗布し、インキュベーションから２４時間後、レポーター細胞のルシフェラーゼ活性を少なくとも２倍阻害した化合物を一次ヒットとして選択した。我々は、一次ヒットのリストから、（ｉ）転写または翻訳の一般的または非特異的阻害剤、およびルシフェラーゼ酵素活性の阻害剤を回避するため、同じライブラリーを用いて試験した他のレポーター系（たとえば、ＣＭＶ−ＧＦＰ、Ｅ−ｂｏｘ−ルシフェラーゼ）を阻害する化合物と、（ｉｉ）非特異的（ＡＲシグナル伝達に明らかに無関係である）毒性がある化合物を回避するため、非ＰＣａ細胞（たとえば、ＨｅＬａ細胞、メラノーマ細胞、ＲＣＣ細胞）に対して毒性がある化合物とを除外した。選別したヒットについては、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲＥ−Ｌｕｃ細胞を用いたレポーター用量応答アッセイで確認し、ＥＣ５０（レポーター活性を５０％低下させる有効濃度）が＜１０μＭであるものを、その後の解析のために選択した。
【００６０】
我々は、内因性のＡＲ標的遺伝子に対するヒットのＡＲ阻害活性を確認するため、前立腺特異抗原（ＰＳＡ：Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）の発現に対する化合物の作用を評価した。このアッセイは、１つの特定の細胞型に対する特異的なヒットを除外するため、ライブラリーのスクリーニングに使用したのと異なるＰＣａ細胞株（Ｃ４−２）で行った。Ｃ４−２細胞株は、去勢マウスにおける増殖能に基づき選択されたアンドロゲン感受性ＬＮＣａＰ細胞株から誘導したものであり、したがって、去勢抵抗性ＰＣａのもう１つのモデルとなる。Ｃ４−２細胞は、ＬＮＣａＰ細胞と同じＡＲ ＬＢＤ突然変異を持っているが、ＡＲコレギュレーターの発現が異なるため、ＤＨＴに対するＡＲの感受性が数倍高くなっている。１０μＭの濃度で塗布したときに、Ｃ４−２細胞によるＰＳＡの分泌を＞６０％阻害した化合物を選択し、その後１０μＭの化合物の存在下で２４時間インキュベートしたＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲＥ−Ｌｕｃ細胞のルシフェラーゼ活性を用いた解析を行い、０．１％ＤＭＳＯとインキュベートした細胞のルシフェラーゼ活性に対する比率として解析した。ｓｈＡＲ６の作用については、７２時間で測定した。１０μＭの化合物の存在下で７２時間インキュベートしたＣ４−２細胞の培地中のＰＳＡレベルを、０．１％ＤＭＳＯとインキュベートした細胞内のＰＳＡレベルに対する比率として解析した。ｓｈＡＲ６の作用を７２時間で測定した。１０μＭの化合物の存在下で成長したコロニー数を、０．１％ＤＭＳＯの存在下でのコロニー形成に対する比率として解析した。
【００６１】
選択した化合物は、ＦＢＳ中に自然に存在するステロイドの存在下で、あるいは、ＳＦＭ中、最大１０ｎＭのジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）の存在下でどちらの細胞株（ＣＷＲ２２ＲおよびＣ４−２）のＡＲ転写活性も阻害した。したがって、選択した化合物は、アンドロゲン非依存性ＰＣａの少なくとも２つのモデルのＡＲ転写活性の阻害剤である。
【００６２】
実施例３
本実施例は、ＰＣａ細胞の成長に対する選択した化合物の作用について説明する。我々は、様々な由来の細胞に対する同定したＡＲ阻害剤の毒性を試験するため、いくつかのＰＣａ（ＬＮＣａＰ、Ｃ４−２、ＣＷＲ２２ＲおよびＤＵ１４５）および２種の非ＰＣａ（ＨＴ１０８０およびＨｅＬａ）細胞株への各化合物（１０μＭ）の単回投与を用いて、コロニー形成アッセイを行った（図２Ａ）。１つの化合物（ｃ６６）を除き、選択した低分子は、非ＰＣａ細胞またはＡＲ陰性ＰＣａ細胞（ＤＵ１４５）の成長に影響を与えなかった。試験した分子のほとんどすべてのほか、陽性対照ビカルタミド（診療所で現在使用されているＡＲ阻害剤）が、ＡＲを発現するアンドロゲン感受性ＬＮＣａＰ細胞の成長を、程度は異なるが抑制した（図２Ａ）。一方、ビカルタミドは、Ｃ４−２細胞あるいはＣＷＲ２２Ｒ細胞（ＡＲ発現、アンドロゲン非依存性細胞株）の成長を抑制しなかったのに対し、選択した分子には、抑制したものがあった。このため、我々は、３種のＡＲ発現ＰＣａ細胞株に対して様々な程度の毒性を持つものの、非ＰＣａ細胞またはＡＲ陰性細胞に対しては毒性がない、いくつかの化合物（ｃ５、ｃ６、ｃ１１、ｃ１７、ｃ１８、ｃ５２、ｃ８５）を同定した。しかしながら、化合物の中には（ｃ８、ｃ１６、ｃ４７、ｃ５５、ｃ６１、ｃ７３）、ＬＮＣａＰ細胞の成長を抑制するが、ＣＷＲ２２Ｒ細胞またはＣ４−２細胞の成長を抑制しないという点でビカルタミドと同様の挙動を示すものもあった。これらの化合物は、ＣＷＲ２２Ｒ細胞またはＣ４−２細胞の成長を阻害した化合物と比較して、そうした細胞のＡＲ転写活性の弱い阻害剤ではない。たとえば、化合物ｃ５５、ｃ６１およびｃ８５は、ＡＲＥ−Ｌｕｃレポーター活性およびＰＳＡ分泌のＥＣ５０および最大阻害で判断すると、ＡＲ依存性の転写の阻害剤として同等である。しかしながら、ｃ８５は、アンドロゲン非依存性ＣＷＲ２２Ｒ細胞株およびＣ４−２細胞株の成長を阻害するのに対し、ｃ５５およびｃ６１は、阻害しない。これらの知見は、ＡＲ依存性の転写活性の阻害がそれ自体で、アンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞の成長を抑制するのに十分でないことを示す。
【００６３】
ライブラリーのスクリーニングに使用したパラメーターである、ＣＷＲ２２Ｒ細胞におけるＡＲ依存性レポーターの発現の阻害が、こうした細胞に対する化合物の毒性を必ずしも反映するものではないという我々の知見からは、以下の２つの考えられる理由を示唆する。すなわち、（ｉ）ＡＲは、転写非依存性メカニズムを介してアンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞の生存を制御し、ＡＲ依存性の転写を阻害すると同定された化合物プールは、ＡＲの転写非依存性の抗アポトーシス機能をも阻害すると仮定される一部の化合物を含む。または（ｉｉ）スクリーニングで同定されたＡＲ阻害剤の毒性は、ＡＲに依存するものではなく、ＡＲ転写活性について観察された阻害は、何か他のメカニズムを介して生じる、これらの化合物の毒性または他の作用を反映するものである。我々のスクリーニングで同定された毒性のある化合物は、その毒性において特異性を示す（ＡＲを発現する試験した３種の標的ＰＣａ細胞株の３種に対して毒性があるのに対し、試験した３種の非標的細胞株の３種に対して毒性がない）ということは、この第２のシナリオと相反する。
【００６４】
我々は、化合物のＡＲ特異性をさらに解析するため、化合物により引き起こされるＡＲ阻害とＰＣａ細胞毒性との定量的パラメーターを比較した。化合物の添加から２４時間後に測定した、ＣＷＲ２２Ｒ細胞のＡＲ依存性ルシフェラーゼ活性を阻害するＥＣ５０を、化合物の添加から６日後のＣＷＲ２２Ｒ細胞に対する毒性のＩＣ５０（生細胞を５０％未満にする化合物の阻害濃度）と比較した（図２Ｂ）。重要な点として、２４時間で毒性を示した化合物がなかった（データ示さず）。これは、ｓｉＲＮＡの塗布から４〜６日後に明らかになる、ＡＲを標的としたｓｉＲＮＡの、こうした細胞に対する毒性作用の遅延性に類似している。図２Ｂは、ＡＲ依存性レポーターを阻害する２４時間後のＥＣ５０が、毒性に関する６日後のＩＣ５０と同じ範囲内にあることを示す。このことは、ＡＲ依存性の転写の阻害が、毒性が起こる前に起こること、さらにＰＣａ細胞に対して毒性があるこれらの化合物では、ＰＣａ細胞に対するＡＲの阻害と毒性との間に相関性があることを示す。これらの結果を、一部のＡＲ阻害剤に毒性がないことと考え合わせると、ＡＲを不活化し得る異なる機序があることが示唆される。すなわち、（ｉ）ＡＲの転写活性のみの阻害は、アンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞に対して毒性がない（アンドロゲン除去の作用に類似）、（ｉｉ）ＡＲ転写活性と、ＰＣａ細胞の生存を制御するＡＲの他の何らかの転写非依存性機能との阻害は、アンドロゲン依存性および非依存性ＰＣａ細胞の両方に対して毒性がある。（ｉｉｉ）ＡＲを介した転写に影響を与えずに細胞生存に導くと仮定される転写非依存性のＡＲ機能のみの阻害は、すべてのＰＣａ細胞に対して毒性があると予想されるけれども、こうした阻害剤は、これまで同定されなかった。我々の読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）システムは、ＡＲ依存性トランス活性化のモニタリングに基づくものであり、我々のスクリーニングでは、仮定される第３の機序を介して作用する化合物は、単離されなかった。
【００６５】
我々はさらに、より大きな群（ｎ＝１０）の非標的細胞株（ＡＲを発現しない非ＰＣａ細胞株およびＰＣａ細胞）に対する、選択した化合物の作用について試験した。これらのデータの例を図２Ｃに示す。選択したヒットは、試験した全濃度で、標的細胞に対してのみ毒性があり、ＡＲ陰性細胞に対して無毒性であった。このため、毒性を示す選択したヒットは、ＡＲを発現するＰＣａ細胞に対してのみ毒性があり、したがって、これらの化合物の毒性は、ＡＲに対するそれらの作用に関係している可能性が高いと、我々は強い確信を持って結論することができる。
【００６６】
図２Ｃのデータはさらに、ＰＣａ細胞に対して毒性がある化合物を、その毒性の程度に基づき２つの分類に分けることができることを示す。すなわち、化合物ｃ５２およびｃ８５は、７日目までに培養物中のほぼすべてのＰＣａ細胞を殺す。これに対し、他の化合物は、未処理の対照細胞と比較して成長の抑制を引き起こしたものの、明らかな細胞死を引き起こさなかった（図２Ｃの化合物ｃ５およびｃ６、化合物ｃ１１、ｃ１７、ｃ１８のデータは示していない）。この後者の場合、インキュベーションの時間または化合物の用量を増やしても、依然として細胞の完全な除去には至らなかった。これは、あるサブセットの化合物が、ＰＣａ細胞の増殖を抑制するものの、ＰＣａ細胞を殺さないことを示唆する。この可能性を試験するため、我々は、化合物の両分類で処理したＣＷＲ２２Ｒ細胞の細胞周期分布を評価した。第１の種類の化合物（ｃ５２、ｃ８５）で処理すると、アポトーシス細胞の特徴であるｓｕｂ−Ｇ１ ＤＮＡ内容物（ｃｏｎｔｅｎｔ）を含む細胞が出現する（図３Ｄ）。これに対し、第２の種類の代表的な化合物（ｃ５、ｃ６、ｃ１１）で細胞を処理すると、ｓｕｂ−Ｇ１ ＤＮＡ内容物（ｃｏｎｔｅｎｔ）を含む細胞は出現しなかったけれども、細胞周期停止を示唆する細胞周期分布の変化が生じた（細胞周期のＧ１期の細胞の比率の上昇、およびＳ期の細胞の比率の減少）。したがって、これらの細胞では、アンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞のＡＲ依存性の転写を阻害する様々なサブセットの化合物が、成長停止、あるいはアポトーシスのいずれかを引き起こす。化合物が成長停止を引き起こすか、それともアポトーシスを引き起こすかは、ＡＲ依存性の転写の阻害剤としての化合物の効力によって左右されない（すなわち、図２Ｂ）。
【００６７】
実施例４
本実施例は、ＰＣａ細胞に対する化合物の毒性とＡＲタンパク質のレベルに対するその作用との間の相関性について説明する。
【００６８】
我々は、上述の結果に基づき、我々のスクリーニングで同定されたＡＲ依存性転写の阻害剤の化合物を３つの分類に区別することができる。すなわち、（ｉ）アンドロゲン感受性ＬＮＣａＰ細胞の成長を抑制するけれども、アンドロゲン非依存性のＣ４−２細胞またはＣＷＲ２２Ｒ細胞の成長には作用しないビカルタミドに似た化合物（ｃ８、ｃ１６、ｃ４７、ｃ５５、ｃ６１およびｃ７３）、（ｉｉ）ＡＲを発現するすべての（アンドロゲン依存性および非依存性の）ＰＣａ細胞の成長を抑制する化合物（ｃ５、ｃ６、ｃ１１、ｃ１７，およびｃ１８）、および（ｉｉｉ）ＡＲを発現するすべてのＰＣａ細胞を殺す化合物（ｃ５２およびｃ８５）である。第１の分類のＡＲ阻害剤は、リガンド結合を標的とする（すなわち、アンドロゲン非依存性癌細胞に対して毒性がない）可能性があるため、本発明の方法に有用とは見なされない。残りの２つの分類は、アンドロゲン非依存性ＰＣａおよび他のＡＲ陽性癌を処置できる可能性がある新しい種類のＡＲ阻害剤であると見られるため、考慮の対象になるものであった。このため、残りの２つの分類をＡＲＴＩＳ（ＡＲ転写阻害剤−抑制性、化合物ｃ５、ｃ６、ｃ１１、ｃ１７、ｃ１８など）、およびＡＲＴＩＫ（ＡＲ転写阻害剤−殺傷性、化合物ｃ５２およびｃ８５など）と名付けた。
【００６９】
ＡＲＴＩＳおよびＡＲＴＩＫ化合物がＰＣａ細胞の成長に対して異なる作用を持つ理由を解明すること目的として、我々は、２つの分類の化合物で処理したＣＷＲ２２Ｒ細胞内のＡＲタンパク質のレベル、およびＰＣａ細胞に対して毒性がない第１の分類のいくつかのヒットを比較した。この解析から、ＡＲＴＩＫ（ｃ５２およびｃ８５）により処理すると、ＡＲタンパク質が細胞から完全に消失することが示された。これに対し、ＡＲＴＩＳ化合物または無毒性のＡＲ阻害剤による処理は、細胞内のＡＲタンパク質のレベルに影響を与えなかった（図３Ａ）。これは、ＡＲが転写非依存性メカニズムを介してアンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞の生存を制御することを裏付ける。様々な化合物の比較により、ＡＲタンパク質の除去は、アンドロゲン依存性および非依存性細胞の死を引き起こす（さらに、ＡＲ依存性の転写で観察される阻害を説明すると考えられる）ことが示される。一方、ＡＲタンパク質のレベルが低下しないＡＲ依存性の転写の阻害は、アンドロゲン依存性ＰＣａ細胞、さらに場合によっては、アンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞の成長を抑制するけれども、殺しはしない。１種のＡＲＴＩＫ化合物の毒性作用におけるＡＲ除去の決定的な重要性が、ＡＲＴＩＫの毒性に抵抗性を示すＣＷＲ２２Ｒクローンのインビトロでの選択によって、明らかにされた（図３Ｂ、詳細については実施例１を参照）。ｃ５２の存在下で１０７個の細胞の成長後に単一クローンを得た。このクローンは、ｃ５２が常時存在する中で成長しても、ＡＲの発現を維持していた（図３Ｃ）ことから、ＡＲがｃ５２の直接の標的である可能性があることが示唆される。化合物ｃ８５に抵抗性を示すクローンは、得られなかった。
【００７０】
ＡＲの転写非依存性機能がＰＣａ細胞の生存を制御するかどうかの別の試験として、我々は、ＣＷＲ２２Ｒ細胞の生存に対する２つの遺伝子コンストラクトの作用を比較した。ＡＲを標的とするｓｈＲＮＡはＡＲＴＩＫ化合物と同様に、ＡＲタンパク質の除去に至るＡＲ発現の抑制を引き起こす）。一方、ＡＲミュータント、ＨＤ１−ＫＲＡＢ−ＡＲ１２２の方は、ＡＲのトランス活性化ドメインの一部（ａａ１〜１２２）がＫＲＡＢおよびＨＤＡＣ１のトランスリプレッションドメインで置換されたもので、内因性のＡＲタンパク質のレベルに影響を与えないものの、ＡＲＥ ＤＮＡ配列に対する結合に際して内因性のＡＲタンパク質との競合することにより、ＡＲ依存性の転写を完全に停止させる（Ｂｒａｍｌｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １８３：１９−２８）。これらの２つのコンストラクトについて、ＡＲＥ−ＬｕｃレポーターとのＣＷＲ２２Ｒコトランスフェクションアッセイにより、一定の用量範囲におけるＡＲ依存性の転写に対するその作用（図４Ａ）を試験し、さらに、コロニー形成アッセイによりＣＷＲ２２Ｒの生存に対するその作用を試験した（図４Ｂ）。どちらのコンストラクトも、ＣＷＲ２２Ｒ細胞のＡＲ依存性のルシフェラーゼ発現をほぼ完全に抑制したが、同量のＤＮＡのトランスフェクションの場合、ＨＤ１−ＫＲＡＢ−ＡＲ１２２ミュータントの方が、ｓｈＲＮＡコンストラクトより若干強力であった。しかしながら、既に示したように、ＡＲに対するｓｈＲＮＡは、ＣＷＲ２２Ｒコロニーの成長を抑制したのに対し、ＨＤ１−ＫＲＡＢ−ＡＲ１２２コンストラクトは、抑制しなかった。この状況は、我々の一連のＡＲ阻害低分子で観察された状況によく似ており、ＡＲが、これまでに特性が明らかにされていないトランス活性化非依存性機能を介してＰＣａ細胞の生存を制御するという仮説をさらに裏付けるものである。
【００７１】
実施例５
いくつかのステロイド受容体（ＳＲ）は、ＡＲを含め、エストロゲン受容体（ＥＲ：ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、糖質コルチコイド受容体（ＧＲ：ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）およびミネラルコルチコイド受容体（ＭＲ：ｍｉｎｅｒａｌｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）など高度に相同的である。リガンド活性化型のこれらの受容体はすべて、同じＤＮＡ配列エレメントを認識し，結合する。受容体リガンド相互作用の下流で作用するＡＲ阻害化合物を単離する試み（我々のスクリーニングなど）は、理論的には、これらのＳＲのすべてを阻害できる分子の単離に至る可能性がある。ＥＲまたはＰＲの阻害は、これらの受容体が男性の重要な機能を制御しないため、ＰＣａの処置にとって重量な問題ではないと予想される。しかしながら、ＧＲおよびＭＲ系は、男性で機能的であり、交差反応性の（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ）ＡＲ阻害剤によりこれらを阻害すると、特に長期的投与を伴う場合に有害な副作用を引き起こす恐れがある。
【００７２】
我々のＡＲ阻害化合物のいずれかが、ＧＲまたはＭＲをも阻害するかどうかを判定するため、我々は最初に、我々のスクリーニングに使用したＣＷＲ２２ＲＡＲＥ−Ｌｕｃレポーター系がアンドロゲン以外のステロイドに反応するかどうかを試験した。これは、我々のライブラリーのスクリーニングが、ＧＲおよびＭＲのリガンドを含み得るＦＢＳの存在下で行われたため、実施すべき重要な実験であった。我々は、ＧＲリガンド、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）またはＭＲリガンド、アルドステロン（Ａｌｄ）のどちらかを用いてＳＦＭ中でＣＷＲ２２ＲＡＲＥ−Ｌｕｃ細胞を処理し、選択したヒットの存在下または非存在下でルシフェラーゼ活性を測定した。ＤｅｘおよびＡｌｄはどちらも、ＣＷＲ２２Ｒ細胞のＡＲＥ−Ｌｕｃレポーターの活性を誘導した。さらに、選択したＡＲ阻害ヒットはすべて、この活性を抑制し、抑制の程度は、ＤＨＴが誘導するＡＲＥ−Ｌｕｃ活性に対するそれらの作用と比例した（データ示さず）。
【００７３】
ＣＷＲ２２Ｒ細胞は、ＡＲΔＬＢＤのみならず、そのリガンド特異性に影響を与え得るＬＢＤ突然変異を含む全長ＡＲも発現する（図１）。ＤｅｘおよびＡｌｄにより観察されたルシフェラーゼの誘導が、これらのリガンドによるＡＲの活性化によるものであるかどうかを試験するため、我々は、ＡＲ特異的ｓｉＲＮＡを用いて、ＣＷＲ２２Ｒ細胞のＡＲ（ＬＢＤおよび全長の両方）の発現を遮断した。こうした細胞では、全３種のリガンド、ＤＨＴ、ＤｅｘおよびＡｌｄによるＡＲＥ−Ｌｕｃ活性化は、対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞と比較して抑制された。これは、ＣＷＲ２２Ｒ細胞に存在するＬＢＤ変異ＡＲの交雑性（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ｎａｔｕｒｅ）を説明する（図５Ａ）。この実験は、選択したヒットがＤＨＴ以外のリガンドにより刺激された場合でも、ＡＲを阻害することができることを明らかにした。一方で、このデータは、ヒットが他の細胞のＧＲおよび／またはＭＲ活性に影響を与える可能性を完全には排除できない。
【００７４】
我々は、我々のＡＲ阻害ヒットが他のＳＲに影響を与えるかどうかをさらに明らかにするため、文献によりＧＲ、ＭＲおよびＡＲを発現するとされるＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌細胞を使用した（Ｚｈｏｕ，Ｃｅｔ ａｌ．２００８．ＤＢｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５４：４４０−４５０２９）。我々は、プロモーター領域に、３種のＳＲのすべてが認識するＤＮＡ結合エレメントを含むＭＭＴＶ−Ｌｕｃレポーターコンストラクトを、この細胞にトランスフェクトした。この系では、ｃ６６を除くヒット化合物のすべてが、ＤＨＴの刺激によるレポーター活性の特異的阻害剤であり、ＤｅｘまたはＡｌｄの刺激によるＭＭＴＶ−Ｌｕｃに対しては作用がなかった（図５Ｂ）。したがって、我々は、選択したヒット分子の大部分が、高度に相同的なＧＲおよびＭＲに対してさえも活性を持たない特異的ＡＲ阻害剤であると結論する（表１）。
【００７５】
実施例６
インビボ試験のため、前の全アッセイをベースにして、ＡＲＴＩＳ分類とＡＲＴＩＫ分類を代表する５つのヒット化合物（ｃ６、ｃ１１、ｃ１７、ｃ５２およびｃ８５）を選択した。化合物ｃ５は、ミクロソーム安定性が非常に低いため（ラットのミクロソームとの１時間のインキュベーション後で＜５％）、除外した。化合物の毒性は、用量漸増アッセイ（ｄｏｓｅ ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）で評価した。このアッセイでは、ＮＩＨ Ｓｗｉｓｓ雄マウス（ｎ＝４）に、３日おきに、送達される各化合物を連続的に３回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。第１の用量は、マウス体重に基づき再計算した、ＣＷＲ２２Ｒ細胞内の化合物のインビトロでのＩＣ５０の２０倍（２０×ＩＣ５０）（実施例１を参照）、第２および第３の用量はそれぞれ、５０×ＩＣ５０および１００×ＩＣ５０であった。最後の注射の翌日に、肉眼的病理検査と、総タンパク質レベル、グルコースレベル、ビリルビンレベルおよびクレアチニンレベル、肝臓酵素の活性、ならびにイオン濃度を含む血清の生化学アッセイのための採血とのため、各群のマウスの半数を屠殺した。化合物の最後の注射から７日後に、残りのマウスも同様に屠殺し、評価した。生きたマウスの目視検査、あるいは肉眼的病理検査の際に、化合物を注射したどのマウスも、異常は観察されなかった。化合物の最後の注射の翌日に、ほとんどすべてのマウスで血清中のグルコース濃度の若干の低下（対照の７０〜８０％）が観察されたが、１週間後のグルコースレベルは、正常であった（データ示さず）。血清中のグルコースレベルが低いのは、選択した化合物の弱い一過性のＧＲ阻害作用を反映したのかもしれない。しかしながら、全体的に見ると、この実験からは、マウスの場合、試験した用量の化合物が無毒性であり、したがってインビボでの有効性試験に好適であることが明らかにされた。
【００７６】
我々は、ヌードマウスのアンドロゲン非依存性ＰＣａのＣ４−２およびＣＷＲ２２Ｒ異種移植モデルを用いて、ヒットに起こり得る抗腫瘍作用を評価した。Ｃ４−２腫瘍を持つマウス群（各群マウス４〜５匹、それぞれ２つの腫瘍を持つ）に、化合物（１００×ＩＣ５０用量）またはＤＭＳＯビヒクルを６回連日ｉ．ｐ．注射した。この処置レジメンでは、化合物ｃ６およびｃ１１は、Ｃ４−２腫瘍成長の明確な抑制を示したのに対し、ｃ１７、ｃ５２およびｃ８５は、示さなかった（図６Ａ）。
【００７７】
ＡＲＴＩＫ化合物ｃ５２およびｃ８５も、ＣＷＲ２２Ｒモデルを用いて試験した。１８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量（２００×ＩＣ５０と同等）でｃ５２を５回連日静脈内（ｉ．ｖ．）注射したところ、顕著な有害な副作用をまったく起こさずにＣＷＲ２２Ｒの皮下腫瘍の成長を抑制した（図６Ｂ）。化合物ｃ８５は、腫瘍成長の確かな抑制を示さなかった。１８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのｃ５２で処置した１０匹のマウスのうち、２匹のマウスで腫瘍が完全に消失し、１匹のマウスで退縮し、５匹のマウスで大きくならなかった。これに対し、１０匹の対照動物のうち９匹は、腫瘍が次第に成長し、１匹のマウスは、腫瘍がゆっくりと成長した。
【００７８】
これらのインビボでの結果から、ＡＲＴＩＫとＡＲＴＩＳとの代表的な化合物（化合物ｃ６、ｃ１１およびｃ５２）は一般に無毒性であるが、アンドロゲン非依存性ＰＣａの腫瘍の成長を遮断し、したがって、ＰＣａおよびＡＲ陽性ＢＣに対して候補治療薬として有力であることが示唆される。本開示の利点を踏まえると、薬理作用の最適化のための通常の実験法を用いれば、これらの化合物の抗腫瘍効果が大きく改善するだけでなく、上述の実験で腫瘍成長を抑制しなかった他のヒット化合物のインビボでの有効性も明らかになり得る可能性がある。
【００７９】
実施例７
本実施例は、ＡＲ陽性およびＡＲ陰性癌細胞、ならびに非癌性細胞に対する化合物の作用の解析を示す。特に、化合物を、ＡＲ陽性乳癌細胞、ＡＲ陰性乳癌細胞、ＡＲ陽性前立腺癌細胞、ＡＲ陰性腎細胞癌、ＡＲ陰性頸部細胞およびＡＲ陽性肝細胞癌、ならびに正常肝実質細胞に対して試験した。本実施例に記載した実験は、本質的に実施例１に記載されているように実施した。その結果から、本発明の方法に使用するのに好適であると本明細書に記載された化合物がＡＲ陽性癌細胞の成長の阻害には効果的であるものの、ＡＲ陰性癌細胞には効果的でないことが明らかにされる。結果は、図１２〜図２０にグラフでまとめてある。
【００８０】
我々は、アンドロゲン非依存性（およびアンドロゲン依存性）ＰＣａの処置に使用される新しい種類のＡＲ阻害剤を同定するため、ＡＲのＬＢＤを欠損した形態（ＡＲΔＬＢＤ）に対して低分子をスクリーニングしたことが、本発明の明細書本文および実施例から当業者には明らかであろう。他のＡＲドメインを標的にすると、大部分の突然変異は、ドメイン機能（たとえば、トランス活性化、ＤＮＡ結合、補助因子の相互作用）の喪失を引き起こすことが予想されるため、再発を起こす突然変異の選択につながる可能性が低くなる。
【００８１】
いくつかの我々の知見は、ＡＲΔＬＢＤが完全にアンドロゲン非依存性であっても、なおＰＣａ細胞生存能に不可欠なＡＲ機能をすべて保持することを明らかにした。すなわち、ｉ）ＡＲΔＬＢＤは、ＡＲ特異的プロバシンプロモーターからｐＡＲＥ−Ｌｕｃレポーターの発現を活性化する（実施例１を参照）。ｉｉ）ＣＷＲ２２Ｒ細胞は、ＡＲの非存在下で生存できない一方、ＡＲΔＬＢＤの発現は、この細胞の通常の増殖を支持するのに十分である。さらに、ｉｉｉ）ＳＦＭ中のＡＲΔＬＢＤの活性は、アンドロゲンの存在下での野生型ＡＲの活性と同等か、またはそれを上回る（レポーター活性のアッセイ、核局在化など）。これらのデータは、細胞生存に決定的に重要なＡＲの機能に干渉し、ＡＲの様々な変異体に対して広範な活性を持ち得る新しい種類の（リガンド結合に影響を与えない）ＡＲ阻害剤を同定するための標的としてＡＲΔＬＢＤを使用することの正当性を立証するものである。
【００８２】
ＡＲを標的とするのに我々が用いたアプローチは、異なる根拠に基づき、他の報告に記載されたものと異なる戦略を利用した。Ａｔｔａｒ ｅｔ ａｌ．は、ＡＲのＬＢＤに結合したビカルタミドの結晶構造に基づき新しい非ステロイド性ＡＲ阻害剤の合理的なデザインを報告した（Ｓａｌｖａｔｉ，ｅｔ ａｌ．２００５．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ １５：２７１−２７６）。これらの新しい阻害剤は、ビカルタミドと比較してＡＲ結合特性が向上しており、さらに、ビカルタミドがＡＲの一部のミュータント型に対して活性であるのに対し、この新しい化合物は、アンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞に対して毒性が強くなっている。しかしながら、このアプローチは、ＡＲのＬＢＤに対する治療法の変異形であり、したがってＬＢＤの変異性によって限定される可能性がある。
【００８３】
別のグループは、アンドロゲンの非存在下で成長が可能なアンドロゲン感受性ＬＮＣａＰ細胞を選択する際、最も多く見られる遺伝子変化がＡＲ遺伝子の増幅であることを見出したＮａｔ Ｍｅｄ １０：３３−３９）。著者らは、観察された増幅が、１細胞当たりのＡＲ分子を増大させることによりリガンドの非存在下でのＡＲの低活性を補うために選択されると仮定した。同じグループは最近、こうした細胞を用いてアンドロゲン非依存性ＰＣａに対して活性を持つ低分子を選択したと報告した（Ｔｒａｎ，ｅｔ ａｌ．２００９．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｅｃｏｎｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉａｎｄｒｏｇｅｎ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４：７８７−７９０）。この分子、ＭＤＶ３１００が、去勢抵抗性ＰＣａ患者の第Ｉ相臨床試験でＰＳＡレベルの低下に有効性を示した。しかしながら、ＡＲに対するＭＤＶ３１００の活性のメカニズムは、我々のアプローチにより単離されたＡＲ阻害剤が使用すると我々が考えるものと異なる。ＭＤＶ３１００、およびそれに近いホモログＲＤ１６２はどちらも、ＡＲのＬＢＤに高い親和性で結合するＡＲの非競合的アンタゴニストである。ＭＤＶ３１００（およびＲＤ１６２）の結合親和性は、アンタゴニストに対してこれまでに得られたアンドロゲンの結合親和性に最も近い。このため、これらの化合物は、アンドロゲンによるＡＲの活性化を妨げるもので、ビカルタミドおよびフルタミドなど診療所で利用可能なＡＲアンタゴニストよりも優れた効力を持つ。さらに、後者の分子は、ＭＤＶ３１００またはＲＤ１６２が示さないパーシャルアゴニスト活性により妨げられる（Ｔｒａｎ，ｅｔ ａｌ．２００９．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｅｃｏｎｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉａｎｄｒｏｇｅｎ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４：７８７−７９０）。これらの新しい化合物に起こり得る問題は、化合物がＬＢＤにも結合し、カソデックスと同様にＬＢＤの突然変異の選択を誘導し得ることに起因するかもしれない。
【００８４】
我々のスクリーニングの予想外の知見の１つは、ＡＲ転写活性の喪失が必ずしも、アンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞の成長または生存の阻害につながらないことであった。我々がＡＲ依存性の転写の阻害剤として同定した分子のほとんどすべては、ＬＮＣａＰ細胞の成長も阻害しており、それによりＡＲ転写活性がリガンド依存性ＰＣａ細胞の成長に重要であることが確認された。しかしながら、アンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞（Ｃ４−２およびＣＷＲ２２Ｒ）の成長に対して作用を有する化合物は、一部のみであった。重要な点として、ＡＲを発現するすべてのＰＣａ細胞（アンドロゲン依存性および非依存性の両方）の成長を抑制した少数のヒット化合物が、アンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞の成長に対して作用を示さない分子より、ＡＲ依存性の転写の阻害剤として必ずしも強力ではなかった。スクリーニング結果のかなりの割合のＡＲ依存性転写の無毒性阻害剤と毒性阻害剤（死または成長停止を引き起こす）とは、ＡＲ依存性の転写の阻害が、少なくともアンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞に対する毒性を必ずしも決定するものではないことを示唆する。これは、これまでに特徴付けられていない転写調節以外のＡＲの別の機能が、ＰＣａ細胞の生存にとって重要であることを示唆する。これらの結果はさらに、この仮定された細胞生存に導く別の機能を除去せずに低分子を用いて特異的に、ＡＲの転写調節機能を阻害し得ることも示唆する。
【００８５】
アンドロゲン非依存性ＰＣａに対する毒性を示すＡＲ阻害ヒットのさらなる特徴付けから、ヒットを２つの分類、ＰＣａ細胞を殺すヒットとその増殖を抑制しかしないヒットとに明確に分けることができることが示される。さらに、ＡＲタンパク質のレベルに対する化合物の作用は、化合物が誘導する毒性の種類と相関関係があった。すなわち、ＡＲタンパク質の除去を引き起こす化合物は、アンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞を殺したのに対し、ＡＲレベルに対する作用を持たない化合物は、その成長を抑制するのみであった。このデータもやはり、ＰＣａ細胞の生存を制御し、ＡＲタンパク質が細胞から除去されたときのみ完全に消失する、ＡＲの転写非依存性機能の存在により説明することができる。
【００８６】
前立腺癌の細胞死を誘導するには、ＡＲのトランス活性化機能の阻害にとどまらず、ＡＲタンパク質の除去を必要とするという考えは、野生型ＡＲを発現する正常な前立腺上皮細胞と、ＬＢＤの突然変異を含み、ＡＲを発現する前立腺腫瘍細胞とでは、去勢の作用が異なることにより裏付けられる。野生型ＡＲは、アンドロゲンの非存在下では、特にその結合パートナーＨＳＰ９０が限られている場合には、不安定である。このため、去勢を行うと、ＡＲタンパク質の消失、および正常前立腺上皮細胞のアポトーシスが起こる。これに対し、ＡＲのＬＢＤ突然変異はリガンド結合の特異性に影響を与えるだけでなく、アンドロゲンの非存在下でＡＲの安定性を促進するため、去勢は、変異ＬＢＤを含む多くのＰＣａ細胞を殺さずに、その増殖を抑制するのみである。
【００８７】
ＰＣａ細胞の生存を制御するＡＲの転写非依存性の役割の存在は、ｓｈＲＮＡを介したＡＲの除去が、ＰＣａ細胞によるコロニー形成を抑制するのに対し、トランス活性化欠損ドミナントネガティブ型ＨＤ１−ＫＲＡＢ−ＡＲ１２２ＡＲミュータントの発現は、抑制しなかったという我々の知見によりさらに裏付けられる。このため、我々のデータから、ＡＲが、前立腺細胞生存に影響を与える、以前に認識されていない転写非依存性機能を持つ可能性が裏付けられる
【００８８】
我々の選択したＡＲ阻害ヒットには、ＰＣａ細胞を効率的に殺すものもあれば、抗増殖作用が弱いものもあるが、どちらの分類の化合物も、マウスのＰＣａの腫瘍モデルに対して有効性を示すことは、注目に値する。どちらの分類の化合物にもインビボで抗腫瘍有効性があることは、以下のいくつかの点で説明することができる。すなわち、（ｉ）化合物が、インビトロよりインビボで強力になる代謝変換をインビボで受ける。（ｉｉ）化合物が、インビトロでのＰＣａ細胞生存には決定的に重要ではないけれども、インビボではより重要となる活性のメカニズムを持つ。および／または、（ｉｉｉ）一部の化合物の成長抑制作用は、インビボで腫瘍成長を停止させるのに十分である。
【００８９】
我々が調査したマウスモデルでは、インビトロでアンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞に対して毒性があったいくつかの化合物が、インビボでの腫瘍成長に対して顕著な作用をまったく有さなかった。これに対して考えられる２つの理由として、（ｉ）これらの化合物は、薬理作用が最適化されていなかったものの、過度の実験を行うことなく本開示を応用したものになる可能性がある。および／または、（ｉｉ）これらの化合物の作用メカニズムは、インビボではインビトロほど重要でないことがある。化合物Ｃ５２は、Ｃ４−２モデルを用いた我々の実験においてインビボで有効性を示さなかったものの、ＣＷＲ２２Ｒ腫瘍を用いた我々の実験では効果的であった。この相違は、後者の実験で、より高用量の化合物および異なる投与経路（ｉ．ｖ．とｉ．ｐ．）を我々が使用したことによるかもしれない。静脈内注射は、ｉ．ｐ．注射で起こる肝初回通過を回避することにより、ｃ５２（ラットのミクロソームとの１時間のインキュベーション後に残る化合物は１７％）など比較的不安定な化合物のバイオアベイラビリティーを著しく向上させることができる。このため、Ｃ４−２モデルにおけるｃ５２の有効性の喪失は、当業者であれば本開示に基づき対処し得る、化合物の不十分な薬理学的特性による可能性がある。
【００９０】
要約すると、我々は、インビトロおよびインビボで非常に特異的抗ＰＣａ特性を持ついくつかのＡＲ阻害化合物を同定した。これらの化合物は、ＡＲ−リガンド相互作用を標的としないため、新しいクラスのＡＲ阻害剤である。したがって、これらの化合物は、標準的な抗アンドロゲン療法に応じて発生するＬＢＤ突然変異に関係なく、ＡＲ陽性細胞に対して活性である可能性がある。このため、本開示で試験した個々の化合物が属する化学クラスも、ＡＲ陽性癌に対して有用であると予想される。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示内容を参照によって本明細書に援用する、２００９年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／２５４，３９５号明細書に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）が交付するｇｒａｎｔ ｎｏ．Ｒ４２ ＣＡ １１０４００−０１ ２００４−２００５による政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は全般的に癌治療に関し、より詳細にはアンドロゲン受容体陽性癌細胞を含む癌を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
前立腺癌（ＰＣａ：ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）は、最も多く見られる腫瘍性疾患であり、男性の癌関連死の原因として２番目に多く、米国だけで毎年３０，０００を超える人の生命を奪っている。ＰＣａの腫瘍は主に前立腺管腔の上皮細胞からなる。前立腺管腔の上皮細胞の分化は、アンドロゲン受容体（ＡＲ：Ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）による前立腺特異的マーカーの発現により、ある程度制御される。ＡＲは、複数のメカニズムにより細胞の生存を制御するが、そのメカニズムは、まだ不明である。ＡＲは、前立腺癌だけでなく、乳癌など他の癌の原因にも関与している。ＡＲは、ステロイド受容体（ＳＲ：ｓｔｅｒｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ファミリーに属し、転写因子として働く。このファミリーのメンバーは、リガンドの非存在下では、熱ショックタンパク質９０（Ｈｓｐ９０）と結合して、細胞質に存在している不安定なタンパク質である。ＡＲのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ：ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）にアンドロゲンなどのステロイドが結合すると、ＡＲは、Ｈｓｐ９０から遊離され、核に移行する。核内のアンドロゲン結合ＡＲは、遺伝子のプロモーターのアンドロゲン応答配列（ＡＲＥ：ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）と共に遺伝子の転写を活性化する（Ｃａｔｏ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ９：１５０−１５４）。ＡＲは、転写活性化因子としての機能だけでなく、一部の遺伝子の転写を抑制することもできる（Ｃｌａｅｓｓｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７６：２３−３０）。
【０００５】
アンドロゲンを枯渇させると、正常な前立腺管腔の上皮細胞の死を引き起こすことから、その生存におけるＡＲ経路の決定的役割が明らかにされる。癌性前立腺細胞はＡＲを発現し続け、同時に癌性前立腺細胞の生存がアンドロゲンの存在に依存しているため、アンドロゲン除去が、進行したＰＣａ患者に最適な治療法になっている。阻害剤のフルタミドおよびカソデックスの使用を含む抗アンドロゲン療法は通常、当初は効果的であるものの、完全な治癒に至るのは稀である。こうした療法で処置された患者の大部分でＰＣａの再発が起こり、アンドロゲン非依存性で化学療法抵抗性の腫瘍が発生し、予後は不良である。このため、抗アンドロゲン療法に対する抵抗性が、ＰＣａ処置の成功の大きな障害になっている。
【０００６】
腫瘍進行の過程でＰＣａにより獲得されるアンドロゲン非依存性のメカニズムの解析から、ＡＲシグナル伝達の低下が伴うことは稀であることが明らかにされる（Ｂａｌｋ，Ｓ．Ｐ．２００２．Ｕｒｏｌｏｇｙ ６０：１３２−１３８；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ １３８−１３９）。これとは反対に、アンドロゲン非依存性ＰＣａは典型的には、リガンド非依存性（恒常的に活性）であるかまたは非アンドロゲンリガンドに応答性であるＡＲミュータントの発現により、ＡＲ活性が増強していることを特徴とする（Ｃｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．２００８．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ８：４４０−４４８；Ｔｉｌｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２：２７７−２８５；Ｋｏｉｖｉｓｔｏ，ｅｔ ａｌ．１９９８ Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５２：１−９；Ｍａｒｑｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．２００５．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １１７：２２１−２２９；Ｂｏｈｌ，Ｃｅｔ ａｌ．２００５．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０：３７７４７−３７７５４；Ｈａｒａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．２００３．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３：１４９−１５３）。
【０００７】
自己複製する腫瘍細胞の主要な供給源と考えられる微量の細胞集団である前立腺の「腫瘍起源細胞」または「癌幹細胞」は、正常な前立腺幹細胞と異なり、機能的ＡＲを発現することが最近明らかにされた（Ｖａｎｄｅｒ Ｇｒｉｅｎｄ，ｅｔ ａｌ．２００８．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６８：９７０３−９７１１１）。このことと、去勢抵抗性の段階まで進行したＰＣａ腫瘍でＡＲ活性が維持されることが観察されることとを考え合わせると、ＡＲが、アンドロゲン依存性ＰＣａとアンドロゲン非依存性ＰＣａとの双方のみならず、ＡＲ陽性の他の癌型も有望な治療標的となる可能性が示唆される。たとえば、乳房上皮細胞は、多くの点、前立腺細胞に類似している。ＰＣ細胞の生存がアンドロゲンの刺激による活性ＡＲに依存するように、乳房上皮細胞も同様、関連するエストロゲン受容体（ＥＲ：ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、およびプロゲステロン受容体（ＰＲ：ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に依存する。乳癌（ＢＣ：ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）におけるＥＲおよびＰＲの役割と、治療アプローチとしてそれらの機能を調節することとが、長年研究の中心であった。しかしながら、ＡＲの発現は、正常な乳腺細胞では低レベルであり、大部分のＢＣでは、標的治療がまだ利用できない「トリプルネガティブ」（ＥＲ陰性、ＰＲ陰性、Ｈｅｒ２陰性）ＢＣの５０％など、様々なレベルで発現する。乳房上皮細胞に対するアンドロゲンの作用については、いくつかの研究で検討されてきものの、ＢＣにおいてＡＲが果たす役割は、依然として不明である（Ｂｉｒｒｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５２，４５９−４６７；Ｂｒｅｔｔｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｂｕｌｌ Ｃａｎｃｅｒ ９５，４９５−５０２；Ｄｉ Ｍｏｎａｃｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５，２５８１−２５８４）。このため、ＡＲ陽性癌に対する現行の処置方法は大部分が無効であり、以下に限定されるものではないが、ＰＣａおよび乳癌などＡＲ陽性癌細胞治療の新たな方法が現在も求められている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、個体におけるＡＲ陽性癌細胞の成長を阻害する方法を提供する。この方法は、ＡＲ陽性癌と診断されたまたはその疑いがある個体に、ＡＲ陽性癌細胞の成長を阻害するか、またはＡＲ陽性癌細胞を殺すことができる化合物を含む組成物を投与することを含む。ＡＲ陽性細胞は、どのようなＡＲ陽性癌細胞であってもよい。種々の実施形態では、ＡＲ陽性癌細胞は、乳癌細胞、前立腺癌細胞、肝細胞癌細胞、甲状腺癌の細胞、グリオブラストーマまたは星状細胞腫である。
【０００９】
本発明に使用するのに好適な化合物の構造を図７、図８、図９、図１０、図１１に示す。図７、図８、図９、図１０、図１１に示した化合物の特定の例を、それぞれｃ５、ｃ６、ｃ１１、ｃ５２およびｃ８５と呼ぶ。化合物は各々、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入したＤｉｖｅｒＳｅｔ化学ライブラリーのスクリーニングから同定し、各化合物については、特定の化合物構造の識別に使用できる、一般に入手可能なＣｈｅｍｂｒｉｄｇｅ識別（ＩＤ）番号と関連付けてある。種々の実施形態では、種々の実施形態では、本発明の方法においてｃ５（Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ ＩＤ６０９９１１２）、ｃ６（Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ ＩＤ５６５２３０６）、ｃ１１（Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ ＩＤ６００５９７８）、ｃ５２（Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ ＩＤ５５８２３６７）およびｃ８５（Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ ＩＤ６０２８７１７）を使用することがある。
【００１０】
一実施形態では、本発明の方法は、ＡＲ陽性癌と診断されたまたはその疑いがある個体に、本明細書でｃ５、ｃ６、ｃ１１、ｃ５２およびｃ８５と呼ばれる化合物、ならびにこれらの組み合わせから選択される化合物を含む組成物を投与することを含む。
【００１１】
一実施形態では、個体に投与される組成物は、ｃ５２を含む。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、個体が、ＡＲ陽性癌細胞の成長を阻害するか、またはＡＲ陽性癌細胞を殺すことができる化合物を含む組成物を用いた処置の候補であるかどうかを確認する方法を提供する。この方法は、個体から生物学的サンプルを採取すること、およびサンプルがアンドロゲン受容体陽性癌細胞を含んでいるかどうかを判定することを含み、生物学的サンプルがアンドロゲン受容体陽性癌細胞を含んでいると判定することは、個体が処置の候補であることを示唆し、生物学的サンプルがアンドロゲン受容体陽性癌細胞を含んでいないと判定することは、個体が処置の候補でないことを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａは、ＡＲＤＬＢＤが無血清の培地（ＳＦＭ：ｓｔｅｒｏｉｄ−ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ）中で転写活性があることを示す日付をグラフ化したものを示す。ＨｅＬａ細胞に、ＡＲ依存性レポーターコンストラクトｐＡＲＥ−Ｌｕｃと、野生型（ｗｔ）ＡＲ発現コンストラクト、ＡＲＤＬＢＤ発現コンストラクトまたは陰性対照（空ベクター）発現コンストラクトとをＳＦＭ中でトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＡＲＤＬＢＤが常に核に局在化することを示す写真を示す。図Ａと同様にＳＦＭ中でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を未処理のままか、または１ｎＭのジヒドロテストステロン（ＤＨＴ：ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）で２４時間処理し、続いて抗ＡＲ抗体で免疫蛍光染色を行った。
【図１Ｃ】図１Ｃは、形質導入を用いてあるいは用いずに調製した細胞ライセートのウエスタンブロッティングにより得られた結果の写真を示す。図１Ｃでは、内因性のＡＲ転写物の非翻訳領域を標的とするｓｈＲＮＡ、およびＡＲＤＬＢＤ発現コンストラクトを組み合わせたレンチウイルスの形質導入により、ＣＷＲ２２Ｒ細胞の内因性のＡＲを異所性ＡＲＤＬＢＤで置換した。ブロットを抗ＡＲ抗体および抗アクチン抗体でブローブした。
【図１Ｄ】図１Ｄは、様々な濃度のＤＨＴの添加によりＳＦＭで成長させた最初の細胞および形質導入細胞を用いたＡＲ依存性レポーターアッセイ（ｐＡＲＥ−Ｌｕｃ）から得られたデータをグラフ化したものを示す。図１Ｄでは、内因性のＡＲ転写物の非翻訳領域を標的とするｓｈＲＮＡ、およびＡＲＤＬＢＤ発現コンストラクトを組み合わせたレンチウイルスの形質導入により、ＣＷＲ２２Ｒ細胞の内因性のＡＲを異所性ＡＲＤＬＢＤで置換した。図１Ｄに示したアッセイは、３回ずつ行った。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、血清を含む標準培地中で最初の細胞および形質導入細胞の成長速度（細胞数）を測定して得られたデータをグラフ化したものを示す。図１Ｅでは、内因性のＡＲ転写物の非翻訳領域を標的とするｓｈＲＮＡ、およびＡＲＤＬＢＤ発現コンストラクトを組み合わせたレンチウイルスの形質導入により、ＣＷＲ２２Ｒ細胞の内因性のＡＲを異所性ＡＲＤＬＢＤで置換した。図１Ｅに示したアッセイは、３回ずつ行った。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、様々な細胞に対するＡＲ阻害剤の毒性を示すデータを示す。図２Ａは、様々な化学物質で７日間処理した表記の細胞のコロニー形成アッセイの解析により得られたデータをグラフ化したものである。図２Ａのエラーバーは、３回の実験の標準偏差を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、様々な細胞に対するＡＲ阻害剤の毒性を示すデータを示す。図２Ｂは、ＥＣ５０（ＣＷＲ２２Ｒ細胞のＡＲ依存性レポーターの阻害）およびＩＣ５０（ＣＷＲ２２Ｒ細胞に対する毒性）のグラフによる比較である。図２Ｂのエラーバーは、ＥＣ５０およびＩＣ５０の信頼区間である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、様々な細胞に対するＡＲ阻害剤の毒性を示すデータを示す。図２Ｃは、由来の異なる一連の細胞株に対するいくつかの化合物の用量依存性の毒性を示すデータをグラフ化したものである。図２Ｃのエラーバーは、３回の実験の標準偏差を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＡＲタンパク質のレベルの低下が、ＰＣａ細胞に対する選択したＡＲ阻害剤ヒットの毒性に関連することを示すデータを示す。図１Ａは、１０ｍＭの表記のヒットで３６時間処理したＣＷＲ２２Ｒ細胞のライセートのウエスタンブロッティングの写真である。ＡＲ抗体により、これらの細胞に自然に存在するＡＲの全長およびＤＬＢＤ型が明らかになる。ＧＡＰＤＨ抗体をタンパク質ローディングのコントロールに用いた。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＡＲタンパク質のレベルの低下が、ＰＣａ細胞に対する選択したＡＲ阻害剤ヒットの毒性に関連することを示すデータを示す。図３Ｂは、ｃ５２の存在下で選択したクローン（ｃ５２Ｒ）が、親ＣＷＲ２２Ｒ細胞と異なり、ｃ５２の作用に抵抗性があることを示すデータをグラフ化したものである。ＣＷＲ２２Ｒのｃ５２ＲクローンのＡＲタンパク質発現は、ｃ５２処理により低下しなかった。ｃ５２処理（１０μＭで３６時間）をしてまたはせずに、親およびｃ５２抵抗性ＣＷＲ２２Ｒ細胞のウエスタンブロッティングを行った。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＡＲタンパク質のレベルの低下が、ＰＣａ細胞に対する選択したＡＲ阻害剤ヒットの毒性に関連することを示すデータを示す。図３Ｃは、化合物の添加から４日後のメチレンブルー染色により細胞生存能を解析したデータをグラフ化したものを示す。エラーバーは、３回の実験の標準偏差を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＡＲタンパク質のレベルの低下が、ＰＣａ細胞に対する選択したＡＲ阻害剤ヒットの毒性に関連することを示すデータを示す。図３Ｄは、蛍光活性化細胞分類法を用いて、細胞のＤＮＡ内容物（ｃｏｎｔｅｎｔ）のヨウ化プロピジウム染色により測定したＣＷＲ２２Ｒ細胞の細胞周期分布に対する選択した化合物の作用を示すデータをグラフ化したものである。アッセイは、２回行った。エラーバーは、２回の測定値の偏差を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＡＲ発現ＰＣａ細胞のＡＲ依存性の転写に対する、ＡＲを標的とする２種類のｓｈＲＮＡ（ｓｈＡＲ５およびｓｈＡＲ６）と、ＡＲミュータントＨＤ１−ＫＲＡＢ−ＡＲ１２２との作用を比較したデータを示す。図４は、ｐＡＲＥ−Ｌｕｃコンストラクトと、ｘ軸に示した様々な量のｓｈＲＮＡコンストラクトまたはＡＲミュータントＨＤ１−ＫＲＡＢ−ＡＲ１２２コンストラクトとをコトランスフェクトしたＣＷＲ２２Ｒ細胞に実施したレポーターアッセイ（ａｓｓａｓｙ）から得られたデータをグラフ化したものを示す。トランスフェクション混合物の総ＤＮＡ量は、ベクターＤＮＡを加えて同量に維持した。トランスフェクション効率は、ｐＣＭＶ−ｂ−ｇａｌコンストラクトのコトランスフェクションにより補正した。アッセイは、２回ずつ行った。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＡＲ発現ＰＣａ細胞のＡＲ依存性の生存に対する、ＡＲを標的とする２種類のｓｈＲＮＡ（ｓｈＡＲ５およびｓｈＡＲ６）と、ＡＲミュータントＨＤ１−ＫＲＡＢ−ＡＲ１２２との作用を比較したデータを示す。図４Ｂは、表記のコンストラクトをトランスフェクトし、ピューロマイシン耐性で選択したＣＷＲ２２Ｒ細胞のコロニー形成アッセイ得られたデータをグラフ化したものを示す。アッセイは、２回ずつ行った。エラーバーは、反復実験の結果の偏差である。
【図５Ａ】図５Ａは、ステロイド受容体の活性に対するＡＲ阻害剤の作用を示すデータである。図５Ａは、ＣＷＲ２２Ｒ細胞のＡＲＥ−Ｌｕｃレポーター活性が、様々なステロイド（ＤＨＴ−ジヒドロテストステロン、Ｄｅｘ−デキサメタゾン、Ａｌｄ−アルドステロン）により誘導され得るものの、ＡＲ発現に依存することを示すデータをグラフ化したものを示す。ＡＲまたはＧＡＰＤＨ（対照）を標的とするｓｉＲＮＡを、ＳＦＭ中でＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲＥ−Ｌｕｃ細胞にトランスフェクトした。表記の濃度のステロイドをトランスフェクト細胞に加え、２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ステロイド受容体の活性に対するＡＲ阻害剤の作用を示すデータである。図４Ｂは、ＤＨＴ、ＤｅｘまたはＡｌｄにより誘導された、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３−ＭＭＴＶ−Ｌｕｃ細胞のルシフェラーゼ活性に対するヒット化合物の作用を示すデータをＤＭＳＯ対照に対する比率として示してグラフ化したものを示す。Ｘ軸は、ヒットの濃度をμＭ単位で示す。エラーバーは、反復実験の標準偏差を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、アンドロゲン非依存性ＰＣａのマウスモデルにおける、選択したヒットの抗腫瘍活性を示すデータである。図６Ａは、記載した化合物またはＤＭＳＯビヒクルを、皮下に（ｓ．ｃ．）Ｃ４−２腫瘍を持つヌードマウスにｉ．ｐ．注射して得られたデータをグラフ化したものを示す。腫瘍の大きさが約１００ｍｍ３になってから６回の連日注射を行った。各群４〜５匹のマウスとし、各マウスには２つの腫瘍があった。ＡＮＯＶＡ検定により対照群との間に統計的有意差がある（＞９９％）、ｃ６群およびｃ１１群の測定の平均値の下にそれぞれアスタリスク（＊）および番号記号（＃）を付してある。エラーバーは、所定の処置群内の腫瘍の大きさの標準偏差を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、アンドロゲン非依存性ＰＣａのマウスモデルにおける、選択したヒットの抗腫瘍活性を示すデータである。図６Ｂでは、腫瘍の大きさが約４０ｍｍ３になってから、ｓ．ｃ．ＣＷＲ２２Ｒ腫瘍を持つヌードマウスの尾静脈に、Ｃ５２（９ｍｇ／ｋｇもしくは１８ｍｇ／ｋｇ）またはＤＭＳＯビヒクルを注射した。５回の連日注射を行った。各群１０匹のマウスとし、各マウスには１つの腫瘍があった。ＡＮＯＶＡ検定により対照群との間に統計的有意差がある（＞９９％）測定の平均値の下にアスタリスク（＊）を付してある。エラーバーは、所定の処置群内の腫瘍の大きさの標準偏差を示す。
【図７】図７は、クラス１化合物の構造を示す。
【図８】図８は、クラス３化合物の構造を示す。
【図９】図９は、クラス６化合物の構造を示す／
【図１０】図１０は、クラス５４化合物の構造を示す。
【図１１】図１１は、クラスＸＸ化合物の構造を示す。
【図１２】図１２は、様々な濃度の化合物ｃ５２、ｃ７０およびｃ８５により別々の乳癌細胞および前立腺癌細胞に引き起こされる細胞死を解析することによって得られたデータをグラフ化したものを示す。９ＡＡは９−アミノアグリジンであり、陽性対照として使用する。さらに、ＡＲ（ＡＲ）の発現に対する化合物の作用を示すウエスタンブロット（ＷＢ：Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）も示す。
【図１３】図１３は、様々な濃度の化合物ｃ５２、ｃ７０およびｃ８５の存在下で別々の乳癌細胞および前立腺癌細胞の細胞生存を解析することにより得られたデータをグラフ化したものを示す。
【図１４】図１４は、様々な濃度の化合物ｃ５２、ｃ７０およびｃ８５の存在下で別々の乳癌細胞および前立腺癌細胞の細胞細胞生存を解析することにより得られたデータをグラフ化したものを示す。さらに、ＡＲタンパク質の発現に対する化合物の作用を示すウエスタンブロット）も示す。
【図１５】図１５は、様々な濃度の化合物ｃ５２、ｃ７０およびｃ８５の存在下での乳癌細胞および前立腺癌細胞の細胞細胞生存を解析することにより得られたデータをグラフ化したものを示す。
【図１６】図１６は、様々な濃度の化合物ｃ５２、ｃ７０およびｃ８５により引き起こされる乳癌細胞および前立腺癌細胞の細胞死を解析することにより得られたデータをグラフ化したものを示す。
【図１７】図１７は、様々な濃度の化合物ｃ５２、ｃ７０およびｃ８５の存在下でのＡＲ陰性乳癌および子宮頸癌の細胞細胞生存を解析することにより得られたデータをグラフ化したものを示す。
【図１８】図１８は、ＣＷＲ２２Ｒ、ＬＮＣａＰ、Ｃ４−２（ＡＲ陽性前立腺癌ＡＲ）、ＰＣ３、ＤＵ１４５、ＰＰＣ１（ＡＲ陰性前立腺癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＲ陰性乳癌）、ＡＣＨＮ、ＳＫ−ＲＣ４５（ＡＲ陰性腎細胞癌）、ＭＲＣ５（正常２倍体線維芽細胞）およびＮＫＥ−ｈＴＥＲＴ（正常腎上皮線維芽細胞）など複数の細胞株の生存に対する種々の濃度のｃ５、ｃ８５、ｃ６およびｃ５２の作用を解析することにより得られたデータをグラフ化したものを示す
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、個体におけるＡＲ陽性癌細胞の成長を阻害する方法を提供する。この方法は、ＡＲ陽性癌と診断されたまたはその疑いがある個体に、ＡＲ陽性癌細胞の成長を阻害するか、またはＡＲ陽性癌細胞を殺すことができる化合物を含む組成物を投与することを含む。本発明に使用するのに好適な化合物の一般構造を図７、図８、図９、図１０、図１１に示す。本明細書では、図７に示した構造をクラス１ということもある。本明細書では、図８に示した構造をクラス３ということもある。本明細書では、図９に示した構造をクラス６ということもある。図１０に示した構造をクラス５４ということもある。本明細書では、図１１に示した構造をクラスＸＸということもある。
【００１５】
図７、図８、図９、図１０、図１１に示した化合物の特定の例は、それぞれｃ５、ｃ６、ｃ１１、ｃ５２およびｃ８５という。ｃ５、ｃ６、ｃ１１、ｃ５２およびｃ８５は、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入したＤｉｖｅｒＳｅｔ化学ライブラリーに存在する３４，０００の化合物から本発明の方法に使用するのに好適であると確認された。各化合物は、一般に入手可能なＣｈｅｍｂｒｉｄｇｅ識別（ＩＤ）番号と関連付けてあるため、各構造は、それに従って評価することができる。
【００１６】
当業者であれば、図７〜１１に示した各構造は、Ｒの位置に存在し得る別の基によって相互に異なる複数の化合物を含むことを認識するであろう。たとえば、図７に示す化合物のクラスの場合、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、アリール部分が５または６個の炭素を含み、アルキル部分が１〜４個の炭素を含むアリールアルキル基（メチルベンゼン基など）、アルキル部分が１〜４個の炭素を含むアルキルケトン基（アセテート基など）、ハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージド）、またはヒドロキシル基である。Ｒ３は、水素またはヒドロキシル基である。Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、ハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージドなど）、またはニトロ基である。Ｘ１は、酸素原子または硫黄原子である。
【００１７】
図８に示した化合物のクラスでは、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、アルキル部分が１〜６個の炭素を含むアルキルエーテル基（メチルエーテル基またはエチルエーテル基など）、ハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージドなど）、アミノ基、ヒドロキシル基、またはニトロ基である。Ｘ２は、酸素原子または硫黄原子である。
【００１８】
図９に示した化合物のクラスでは、Ｒ１７およびＲ１８は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはアルキル部分が１〜４個の炭素を含むアルキルエーテル基（メチルエーテルまたはエチルエーテルなど）である。Ｒ１９およびＲ２０は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージドなど）である。
【００１９】
図１０に示した化合物のクラスでは、Ｒ２１（Ｒ２５）は、水素、または任意に１つもしくは複数のヒドロキシル基またはシアノで置換されていてもよい１〜６個の炭素を含むアルキル基である。Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４（Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２９）は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、アルキル部分が１〜４個の炭素を含み、かつ任意に１つもしくは複数のハライドで置換されていてもよいアルキルケトン基（アセテート基またはトリフルロアセテート基）、アルキル部分が１〜４個の炭素を含み、かつ任意に１つもしくは複数のハライドで置換されていてもよいアルコキシ基、ハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージドなど）、アルキル基が１〜４個の炭素を含むアルキルスルホンアミド（メチルスルホンアミドなど）、またはヒドロキシル基である。Ｒ３０、Ｒ３１およびＲ４１は独立に、水素、または任意に１つもしくは複数のハライドで置換されていてもよい１〜６個の炭素を含むアルキル基である。Ｒ３２は、任意に１つもしくは複数のハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージドなど）で置換されていてもよい１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはアミノ基である。Ｒ３３およびＲ３４は独立に、任意に１つもしくは複数のハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージドなど）で置換されていてもよい１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはアルキル部分が１〜４個の炭素を含むアルキルシクロヘキシル基（メチルシクロヘキシル基など）である。
【００２０】
図１１に示した化合物のクラスでは、Ｒ３５は、水素、任意に１つもしくは複数のハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージドなど）で置換されていてもよい１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージドなど）である。Ｒ３６およびＲ３７は独立に、水素、または任意に１つもしくは複数のハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージドなど）で置換されていてもよい１〜６個の炭素を含むアルキル基である。Ｒ３８およびＲ３９は独立に、水素、任意に１つもしくは複数のハライド（フッ化物、クロリド、ブロミドおよびヨージドなど）で置換されていてもよい１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはヒドロキシル基である。Ｒ４０は、水素またはヒドロキシル基である。本明細書に示した一部の構造には、位置によっては水素を示していない。当業者であれば、こうした構造は、そうした水素置換基を含むことが理解されよう。
【００２１】
本開示内に包含される化合物の特定の例は、指定されたｃ５、ｃ６、ｃ８、ｃ１１、ｃ１６、ｃ１７、ｃ１８、ｃ４７、ｃ５２、ｃ５５、ｃ６１、ｃ６６およびｃ７３（Ｃｈｅｍｂｒｉｇｅ ＩＤ番号６４４３２１３）である。個々の構造をＣｈｅｍｂｒｉｄｇｅ ＩＤ番号と共に下記に示す。
【００２２】
一実施形態では、本発明の方法は、ＡＲ陽性癌と診断されたまたはその疑いがある個体に、本明細書でｃ５、ｃ６、ｃ１１、ｃ５２およびｃ８５と呼ばれる化合物、ならびにこれらの組み合わせから選択される化合物を含む組成物を投与することを含む。
【００２３】
一実施形態では、個体に投与される組成物は、ｃ５２を含む。
【００２４】
本明細書に言及されるＡＲ陽性癌細胞は、検出可能な量のＡＲタンパク質を発現する癌細胞である。「アンドロゲン受容体」（およびその略語「ＡＲ」）は、当業者によく知られている用語であり、ヒトＡＲタンパク質のすべてのアイソフォームおよび対立遺伝子変異体を含む、ヒト癌細胞に発現するＡＲタンパク質という意味で使用される。
【００２５】
一実施形態では、本発明の方法の実施により個体におけるその成長を阻害できるＡＲ陽性癌細胞は、任意の種類の抗ヒトＡＲ抗体により特異的に認識されるＡＲを発現する細胞である。抗ヒトＡＲ抗体は、市販されている。一実施形態では、本発明の方法の実施により個体におけるその成長を阻害できるＡＲ陽性癌細胞は、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから、カタログ番号＃５５４２２５で入手可能な抗ヒトＡＲ抗体により特異的に認識され得るＡＲを発現する細胞である。一実施形態では、ＡＲタンパク質の検出可能な量は、ウエスタンブロットにより検出できるＡＲタンパク質の量である。
【００２６】
一実施形態では、ＡＲ陽性癌細胞は、参照によって本明細書に援用する、２００９年９月１日エントリーのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ１０２７５のアミノ酸配列を持つＡＲを発現する細胞である。代替の実施形態では、ＡＲ陽性癌細胞は、２００９年９月１日にＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ１０２７５で登録されたアミノ酸配列に対して７０％以上９９％以下（その間の整数をすべてを含む）相同であるアミノ酸配列を持つＡＲを発現する細胞である。ＡＲ陽性細胞は、そうした配列のいずれを持つＡＲを発現する癌細胞であってもよく、ＡＲは、ウエスタンブロットにより検出可能である。
【００２７】
ＡＲ陽性癌細胞は、どのような種類の癌細胞であってもよい。一実施形態では、癌細胞は、前立腺癌細胞である。前立腺癌細胞は、アンドロゲン依存性でも、またはアンドロゲン非依存性でもよい。
【００２８】
別の実施形態では、ＡＲ陽性細胞は、乳癌細胞である。乳癌細胞は、どのような種類の乳癌細胞であってもよい。ただし、乳癌細胞は、ＡＲ陽性である。乳癌細胞は、ＥＲ−乳癌細胞でも、ＰＲ−乳癌細胞でも、Ｈｅｒ２−乳癌細胞でも、またはこれらの組み合わせのいずれであってもよい。
【００２９】
別の実施形態では、ＡＲ陽性細胞は、肝細胞癌細胞、甲状腺の癌細胞、グリオブラストーマまたは星状細胞腫である。
【００３０】
ＡＲ陽性癌細胞の成長の阻害は、部分的な阻害でも、または完全な阻害でもよい。個体由来のＡＲ陽性癌細胞の一部または全部の根絶は、ＡＲ陽性癌細胞の成長の阻害の一種と見なされる。
【００３１】
一実施形態では、本発明は、図７、図８、図９、図１０、図１１に示した構造を持つ化合物を含む有効量の組成物を細胞と接触させることにより、癌細胞の成長を阻害することを含む。
【００３２】
本発明の一実施形態では、個体は、図７、図８、図９、図１０、図１１に示した化合物の群から選択される有効量の化合物を含む組成物を用いた処置の候補として確認することができる。個体は、個体由来の癌性組織の生物学的サンプルを採取し、癌性組織がＡＲを発現しているか否かを判定することにより、こうした候補として確認することができる。癌性組織がＡＲを発現していると判定することは、個体が処置の候補であることを示唆する。同様に、組織が検出可能な量のＡＲを発現していないと判定することは、個体が処置の候補でないことを示唆する。癌性組織がＡＲを発現しているかどうかの判定は、免疫学的な技術など任意の好適な手法を用いて行うことができる。一実施形態では、本発明は、個体から採取した生物学的サンプル中のＡＲをＡＲ−抗体複合体に変換すること、および免疫診断の装置を用いてＡＲ−抗体複合体を検出することを含む。
【００３３】
種々の実施形態では、本発明は、癌性組織がＡＲを発現しているか否かの判定を有形媒体に固定すること、および／または個体の推奨処置を有形媒体に固定することをさらに含む。有形媒体は、以下に限定されるものではないが、コンピューター、ＤＶＤ、ＣＤ−ＲＯＭまたは電子メールメッセージに保存できるデジタルファイルのような任意の種類のデジタル媒体など、どのような種類の有形媒体であってもよい。有形媒体は、処置プロトコルを開発し、それにより本発明の方法の実施を含む、個体の処置法を開発するため、医療提供者に提供してもよい。
【００３４】
本発明の方法を実施するための化合物を含む組成物は、任意の好適な薬学的に許容されるキャリア、賦形剤および／または安定剤と混合することにより調製することができる。化合物との混合に好適な組成物の一部の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００５）２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓで確認することができる。
【００３５】
本明細書に記載の化合物を含む組成物は、経口注射、非経口注射、皮下注射、腹腔内注射、肺内注射、鼻腔内注射および頭蓋内注射など任意の利用可能な方法および経路を用いて個体に投与してもよい。非経口注入としては、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与および皮下投与がある。
【００３６】
本発明の方法は、以下に限定されるものではないが、化学療法、外科的介入および放射線療法など従来の抗癌療法の前に実施しても、同時に実施しても、または後に実施してもよい。
【００３７】
当業者であれば、本発明の方法に利用される特定の投与レジメンの形態および特徴は、投与経路、および他のよく知られた可変要素、個体の性別および大きさ、ならびに処置対象の特定の癌の種類および段階によって決まることを認識するであろう。こうした判断基準に基づき、当業者は、個体に投与する組成物の有効量を判定することができる。
【００３８】
我々は、本発明に到達した際に、ＡＲ−リガンド相互作用とは異なるＡＲの機能面を標的とするＡＲ阻害剤を同定した。我々は、これを、リガンド非依存性ＰＣａ細胞株におけるＡＲ依存性の転写の特定の阻害剤を最初に同定することにより達成した。我々は、ＡＲ発現ＰＣａ細胞株に対して特異的な毒性を示す化合物を選択した。特に、ＡＲ依存性の転写の阻害剤がすべてアンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞株に毒性があるとは限らなかったことから、ＡＲの転写機能が、ＰＣａの細胞生存を単独では制御しないことが示唆される。我々は、マウスのＰＣａの異種移植モデルを用いてインビボでの抗腫瘍活性に最も優れたＡＲ阻害剤を試験し、最も効果的な化合物によりＡＲ阻害の分子機構を解析した。これが、細胞からのＡＲタンパク質の除去が、細胞生存に対して、ＡＲのトランス活性化機能の抑制と異なる影響を与えるという発見につながった。このことは、ＡＲが、本明細書に示したデータにより明らかなように、転写非依存性メカニズムを介して前立腺細胞生存、さらにおそらく乳癌細胞など他の種類のＡＲ陽性癌細胞も制御することを示唆する。これは、重要、かつまだ認識されていない抗癌アプローチと考えられる。
【００３９】
以下の実施例は、本発明の説明を意図するものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００４０】
実施例１
本実施例は、本明細書に示した結果を得るために使用した材料および方法については説明する。
【００４１】
細胞株：ＬＮＣａＰ細胞、ＤＵ１４５細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３−ＭＭＴＶ−Ｌｕｃ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＡＣＨＮ細胞、ＭＲＣ５細胞およびＨＴ１０８０細胞をＡＴＣＣから取得した。ＲＣＣ４５および正常腎上皮細胞（ＮＫＥ：ｎｏｒｍａｌ ｋｉｄｎｅｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）については、Ｇｕｒｏｖａ，ｅｔ ａｌ．２００４．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４：１９５１−１９５８）に記載された。ｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏベクターを用いたヒトテロメラーゼサブユニットの形質導入により、不死化ＮＫＥ−ｈＴＥＲＴ細胞を得た。ＣＷＲ２２Ｒ細胞およびＣ４−２細胞は、Ｄｒ．Ｗａｒｒｅｎ Ｈｅｓｔｏｎ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ）から提供された。ｐＡＲＥ−ＬｕｃレポーターコンストラクトおよびＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲＥ−Ｌｕｃレポーター細胞については、既に記載された（Ｔａｒａｒｏｖａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．２００７．Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６７：１８０１−１８１５）。ＡＲが結合するコンセンサスＤＮＡエレメントは他のいくつかのステロイド受容体によっても認識されるが、ｐＡＲＥ−Ｌｕｃレポーターは、最もＡＲ特異的プロモーター領域の１つとして知られるプロバシンプロモーターの領域を利用するものである（Ｔａｒａｒｏｖａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．２００７．Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６７：１８０１−１８１５４）。
【００４２】
前立腺細胞株およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３−ＭＭＴＶ−Ｌｕｃはすべて、１０％ＦＢＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、５５ｎＭのβ−メルカプトエタノールおよび抗生物質を補充したＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。ＨｅＬａおよびＨＴ１０８０細胞は、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を含むＤＭＥＭ培地で維持した。ステロイドを含まない培地（ＳＦＭ）の作製には、フェノールレッドを含まない培地およびチャコール処理血清（ＣＳＳ：ｃｈａｒｃｏａｌ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ ｓｅｒｕｍ）を使用した。ＣＳＳは、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。
【００４３】
プラスミド：ｐＴＺＶ−ｗｔＡＲおよびｐＴＺＶ−ＡＲΔＬＢＤレンチウイルス発現コンストラクトを、野生型全長（１〜９１９ａａ）ＡＲ、またはヒトＡＲの最初の６３９ａａに対応するＡＲフラグメントをｐＴＺＶ−ＣＭＶベクターにサブクローニングすることにより得た（Ｔａｒａｒｏｖａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．２００７．Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６７：１８０１−１８１５）。ヒトＡＲに対するｓｈＲＮＡの発現を誘導するｐＬＰＣＰｗ−ｓｈＡＲレンチウイルスベクターについては、記載されているように作製した（Ｔａｒａｒｏｖａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．２００７．Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６７：１８０１−１８１５４）。ヒトＡＲの非翻訳領域に対応するｓｈＲＮＡ配列（ｅｑｕｅｎｃｅ）は、ＴＧＡＴＣＣＴＣＡＴＡＴＧＧＣＣＣＡＧであった。ｐＨＤ１−ＫＲＡＢ−ＡＲ１２２は、Ｄｒ．Ｇ．Ｊｅｎｓｔｅｒ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ，Ｊｏｓｅｐｈｉｎｅ Ｎｅｆｋｅｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｅｒａｓｍｕｓ ＭＣ，Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））から入手したものであり、既に記載された（２３）。ｐＬＶ−ＣＭＶ−Ｌｕｃベクターは、Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ Ｃｈｕｍａｋｏｖ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ）から好意により提供された。
【００４４】
レンチウイルスの形質導入およびｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、以前記載されたとおり、従来の技術を用いて行った（Ｇｕｒｏｖａ，ｅｔ ａｌ． ２００４．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４：１９５１−１９５８）。
【００４５】
化学物質：３４，０００のＤｉｖｅｒＳｅｔ化学ライブラリー（分子量約５００Ｄａの多環低分子からなる）は、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。ＤＨＴは、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から入手した。アルドステロン、デキサメタゾン、ＢＳＡ、ＲＮａｓｅ Ａおよびヨウ化プロピジウムは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。カソデックス（ビカルタミド）は、ＴＲＣ（Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。
【００４６】
化学物質の一次スクリーニング：ＤｉｖｅｒＳｅｔライブラリーの化学物質を、最終濃度２０μＭで９６ウェルプレート中のＣＷ２２Ｒ−ＡＲＥ−Ｌｕｃ細胞の単層に塗布した。翌日、ルシフェラーゼ活性を、ＢｒｉｇｈｔＧｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて読み取り、化学物質処理した細胞内のレポーター活性のパーセンタイルを計算した（ＤＭＳＯで処理した細胞を１００％と見なして比較）。このパラメーターが５０％以下であった化合物を一次ヒットとした。ヒットのリストを、ｐ５３、ＮＦ−κｂまたはＥ−ｂｏｘの結合エレメントを含むプロモーターにより誘導されるレポーターの阻害剤と、ＨｅＬａ細胞、メラノーマ細胞および神経芽細胞腫細胞に対して毒性がある化合物とを含む、同じライブラリーの他のスクリーニングから得られたものと比較した。これらの他のリストのいずれかにも存在したＡＲ阻害ヒットは、その後の検討から除外した。転写／翻訳またはルシフェラーゼ活性の非特異的阻害については、ＨＴ１０８０細胞を用いてＣＭＶ−ｌｕｃレポーターにより試験し、この系で活性なヒット化合物をその後の検討から除外した。
【００４７】
レポーター活性の用量依存性の阻害：ＣＷＲ２２Ｒ細胞を、９６ウェルプレート中、１ウェル当たり５×１０４個蒔いた。化合物を、１〜２００００ｎＭの用量範囲で２倍ずつ増やしながら加えた。各用量について、２回ずつ試験した。対照は、０．１％ＤＭＳＯおよび１５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤであった。ルシフェラーゼ活性を、Ｂｒｉｇｈｔ Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、化合物の添加から２４時間後に測定した。アッセイは、２回実施し、ＤＭＳＯと比較してレポーター活性を５０％阻害する化合物の有効濃度（ＥＣ５０）を、ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェア（Ｂｉｏｓｏｆｔ，Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いてシグモイド近似法により計算した。シグモイドごとに信頼区間を計算した。
【００４８】
細胞コロニーアッセイ：細胞を、コンフルエント前の指数関数的増殖まで６〜７日を要する密度で２４ウェルプレートに蒔いた。培地および化合物を４８時間ごとに交換し、起こり得る化合物の不安定性作用を最小限に抑えた。化合物の存在下でのインキュベーションから７日後、細胞を固定し、メチレンブルーで染色し、続いて１％ＳＤＳで染色物を抽出し、６５０ｎｍで分光光度法を実施した。各アッセイは、３回ずつ実施し、対照ウェルと化合物処理ウェルとの差をスチューデントのｔ検定を用いて判定した。
【００４９】
細胞成長の用量依存性の阻害：細胞を、９６ウェルプレート中、１ウェル当たり１×１０３個蒔いた。化合物を、１〜２００００ｎＭの用量範囲で２倍ずつ増やしながら加えた。各用量について、３回ずつ試験した。対照は、０．１％ＤＭＳＯ（細胞生存能に対する影響なし）、および５０μＭの９−アミノアクリジン（完全な細胞死）であった。細胞を６日間インキュベートし、次いで固定し、メチレンブルーで染色し、続いて１％ＳＤＳで染色物を抽出し、６５０ｎｍで分光光度法を実施した。アッセイは、２回実施し、結果に基づき、ＤＭＳＯと比較して細胞成長を５０％抑制する化合物の阻害濃度（ＩＣ５０）を、ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェア（Ｂｉｏｓｏｆｔ，Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いてシグモイド近似法により計算した。シグモイドごとに信頼区間を計算した。
【００５０】
ＣＷＲ２２Ｒ細胞の化合物抵抗性変異体の選択を、１０７個の細胞を１０×ＩＣ５０の化合物の存在下で３日間インキュベートして行った。次いで細胞を、プレコンフルエントレベルになるまで薬剤を含まない培地で維持した。この手順を、化合物の存在下で死細胞が観察されなくなるまで数回繰り返した。
【００５１】
コンディション培地におけるＰＳＡタンパク質のレベルを、細胞を１０μＭの被検化合物と、あるいはそれなしで７２時間インキュベートしてから、Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ Ａｍｅｒｉｃａ（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）製の「Ｈｕｍａｎ ＰＳＡ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ」を用いて判定した。
【００５２】
ウエスタンブロット解析。細胞を、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に溶解した。総タンパク質濃度を、Ｄｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて測定した。ウエスタンブロッティングについては、４〜１２％ＳＤＳプレキャストＮｏｖｅｘゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＰＶＤＦ膜（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏＴｅｃｈ）を用いて行った。以下の抗体を使用した：ＡＲに対する抗体（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；＃５５４２２５、１μｇ／ｍｌ）；ローディングコントロールとしてのＧＡＰＤＨに対する抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）。
【００５３】
細胞周期分布の解析を、ヨウ化プロピジウムによるＤＮＡ内容物（ｃｏｎｔｅｎｔ）の染色に基づき行った。トリプシンを用いて１０５個の細胞を培養皿から剥がし、ＰＢＳで洗浄し、３％ＢＳＡのＰＢＳ溶液３００μｌに再懸濁し、続いて７０％エタノール５μｌを加えた。細胞を−２０℃で数時間維持し、次いで３０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａの存在下で１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムで２時間３７℃にて染色した。ＤＮＡ内容物（ｃｏｎｔｅｎｔ）については、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ機器およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を用いて評価した。
【００５４】
マウスを用いた化合物安全性の試験を、ＩＡＣＵＣ承認のプロトコルに従い行った。実験は、Ｈａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）製の８週齢の非近交系ＮＩＨ Ｓｗｉｓｓ雄マウスを用いて、各群４匹のマウスで実施した。マウス体重に基づくインビボ用量の計算には、ＩＣ５０濃度を使用した（１ｇのマウス組織は約１ｍｌの量を含むという仮定に基づき、ｍｇ／ｋｇに相当するＩＣ５０のインビボ用量＝ｍｇ／ｍｌのＩＣ５０×１０００）。化合物は、２５％ＤＭＳＯ−７５％ＰＢＳを用いて、化合物のインビトロでの細胞致死量に相当する２０×ＩＣ５０から腹腔内に（ｉ．ｐ．）注射した。その後マウスを３日間観察してから、５０×ＩＣ５０（用量２）および１００×ＩＣ５０（用量３）の２回の各注射を行った。マウスの対照群には、２５％ＤＭＳＯ−７５％ＰＢＳを３日間の間隔をおいて３回注射した。ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて血液生化学的解析を行った。
【００５５】
マウスを用いた化合物の抗腫瘍作用の試験を、Ｈａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）製の８週齢の雄無胸腺ヌードマウスを用いて、ＩＡＣＵＣ承認のプロトコルに従い行った。Ｃ４−２異種移植モデルでは、１０６個のＣ４−２細胞を、５０％マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｒａｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＰＢＳ溶液を用いて各マウスの２部位に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。目視可能な腫瘍が発生したら、デジタルカリパスを用いて測定した。腫瘍容積を、式：容積＝長さ×幅２／２に従い計算した。各マウスで少なくとも１つの腫瘍の大きさが１００ｍｍ３になったら、マウスに化合物を６日間毎日ｉ．ｐ．注射した。各群５匹のマウスを使用した。ＣＷＲ２２Ｒ異種移植モデルでは、ＣＷＲ２２Ｒ細胞を、５０％マトリゲルを用いてマウス１匹当たり１部位に接種した（１接種当たり１０５個の細胞）。腫瘍が少なくとも２５ｍｍ３の大きさになったとき、処置を開始した。化合物をキャプティソル（ｃａｐｔｉｓｏｌ）（ＣｙＤｅｘ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）で希釈し、１日１回５日間静脈内に（肝「初回通過」効果の抑制のため）送達した。各群１０匹のマウスを使用した。マウスを毎日モニターし、腫瘍を１日おきに測定した。腫瘍の大きさが１０００ｍｍ３に達したとき、委員会の規制に従いマウスを安楽死させた。ＡＮＯＶＡ試験を用いて対照マウスと処置マウスとの腫瘍成長の比較を行った。
【００５６】
実施例２
本実施例は、本発明の方法に使用するのに好適である化合物の同定について説明する。
【００５７】
我々は、ＡＲの阻害剤を同定するため低分子のライブラリーをスクリーニングした。我々は、以下のいくつかの理由から細胞ベースの読み出し（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ｒｅａｄｏｕｔ）アプローチを選択した。（ｉ）我々は、標的の可能性を単にＡＲタンパク質自体から、インビトロでの生化学的分析では不可能であるＡＲシグナル伝達経路全体へと広げることを目指していた。（ｉｉ）ＡＲのどの機能／ドメイン／結合部位が細胞生存の制御に関与しているか不明である。（ｉｉｉ）全長ＡＲの結晶構造がまだ解明されていない。後者２つの現状から、合理的設計アプローチは、不可能である。
【００５８】
ＡＲ−リガンド相互作用と異なるメカニズムを介した新しい種類のＡＲ阻害剤を同定する可能性を高めるため、我々は、いくつかの入手可能な培養細胞株から最もアンドロゲン非依存性の細胞ＣＷＲ２２Ｒを選択して、ライブラリーのスクリーニングに使用した。この細胞の増殖は、アンドロゲンの非存在により影響を受けず、アンドロゲン除去に伴うＡＲ転写活性の低下が最小限になる（他のＰＣａ細胞株と比較して）。この細胞株のもう１つの重要な特徴は、ＬＢＤを欠損したＡＲの切断型ミュータントを発現することである（ＡＲΔＬＢＤ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６２：６６０６−６６１４）。ＣＷＲ２２Ｒ細胞内に存在する５０％を超えるＡＲタンパク質がＡＲΔＬＢＤ型であるのに対し、残りは、ＬＢＤ突然変異を含む全長のＡＲタンパク質である。ＡＲ活性の大部分が、ＬＢＤを欠損したミュータントに起因する細胞を使用すると、ＡＲ−リガンド相互作用の阻害以外のメカニズムを介して作用する低分子阻害剤を単離する可能性が高まる。ＡＲΔＬＢＤがリガンド非依存性のＡＲ機能を持ち、阻害剤の同定に好適な標的であることを証明するため、我々は、ＡＲΔＬＢＤのみが存在するＣＷＲ２２Ｒ細胞を実験的に作製した。ＣＷＲ２２Ｒ細胞に、内因性のＡＲ転写物の非翻訳領域を標的とするｓｈＲＮＡ、およびＡＲΔＬＢＤの異所性発現を誘導する発現コンストラクトを同時形質導入した（図１）。こうした細胞では、ＡＲΔＬＢＤミュータントが転写因子として恒常的に活性であり、任意のリガンドの非存在下（すなわち、チャコール処理血清を用いて作製した、ステロイドを含まない培地（ＳＦＭ）中、図１Ａおよび図１Ｂ）でも核に局在する。我々はさらに、全ＡＲタンパク質の除去が、ＣＷＲ２２Ｒ細胞に対して毒性があるのに対し、異所性に発現したＡＲΔＬＢＤは、全長ＡＲの非存在下でＣＷＲ２２Ｒ細胞の増殖を支持し得ることも明らかにした（図１Ｃ〜図Ｅ）。これらの結果は、ＡＲΔＬＢＤミュータント型のＡＲが、全長タンパク質と同じ転写および細胞生存に導く活性を持ってはいるものの、リガンドを必要としないことを示唆する。
【００５９】
我々は、ＡＲの活性に対するライブラリーの化学物質の作用をモニターするため、ＡＲ依存性ルシフェラーゼレポーターコンストラクト（ｐＡＲＥ−Ｌｕｃ）をＣＷＲ２２Ｒ細胞に導入し、レポーターを組み込んだ安定な細胞株を作製した。得られたＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲＥ−Ｌｕｃ細胞に、３４，０００の低分子のライブラリーを２０μＭの濃度で塗布し、インキュベーションから２４時間後、レポーター細胞のルシフェラーゼ活性を少なくとも２倍阻害した化合物を一次ヒットとして選択した。我々は、一次ヒットのリストから、（ｉ）転写または翻訳の一般的または非特異的阻害剤、およびルシフェラーゼ酵素活性の阻害剤を回避するため、同じライブラリーを用いて試験した他のレポーター系（たとえば、ＣＭＶ−ＧＦＰ、Ｅ−ｂｏｘ−ルシフェラーゼ）を阻害する化合物と、（ｉｉ）非特異的（ＡＲシグナル伝達に明らかに無関係である）毒性がある化合物を回避するため、非ＰＣａ細胞（たとえば、ＨｅＬａ細胞、メラノーマ細胞、ＲＣＣ細胞）に対して毒性がある化合物とを除外した。選別したヒットについては、ＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲＥ−Ｌｕｃ細胞を用いたレポーター用量応答アッセイで確認し、ＥＣ５０（レポーター活性を５０％低下させる有効濃度）が＜１０μＭであるものを、その後の解析のために選択した。
【００６０】
我々は、内因性のＡＲ標的遺伝子に対するヒットのＡＲ阻害活性を確認するため、前立腺特異抗原（ＰＳＡ：Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）の発現に対する化合物の作用を評価した。このアッセイは、１つの特定の細胞型に対する特異的なヒットを除外するため、ライブラリーのスクリーニングに使用したのと異なるＰＣａ細胞株（Ｃ４−２）で行った。Ｃ４−２細胞株は、去勢マウスにおける増殖能に基づき選択されたアンドロゲン感受性ＬＮＣａＰ細胞株から誘導したものであり、したがって、去勢抵抗性ＰＣａのもう１つのモデルとなる。Ｃ４−２細胞は、ＬＮＣａＰ細胞と同じＡＲ ＬＢＤ突然変異を持っているが、ＡＲコレギュレーターの発現が異なるため、ＤＨＴに対するＡＲの感受性が数倍高くなっている。１０μＭの濃度で塗布したときに、Ｃ４−２細胞によるＰＳＡの分泌を＞６０％阻害した化合物を選択し、その後１０μＭの化合物の存在下で２４時間インキュベートしたＣＷＲ２２Ｒ−ＡＲＥ−Ｌｕｃ細胞のルシフェラーゼ活性を用いた解析を行い、０．１％ＤＭＳＯとインキュベートした細胞のルシフェラーゼ活性に対する比率として解析した。ｓｈＡＲ６の作用については、７２時間で測定した。１０μＭの化合物の存在下で７２時間インキュベートしたＣ４−２細胞の培地中のＰＳＡレベルを、０．１％ＤＭＳＯとインキュベートした細胞内のＰＳＡレベルに対する比率として解析した。ｓｈＡＲ６の作用を７２時間で測定した。１０μＭの化合物の存在下で成長したコロニー数を、０．１％ＤＭＳＯの存在下でのコロニー形成に対する比率として解析した。
【００６１】
選択した化合物は、ＦＢＳ中に自然に存在するステロイドの存在下で、あるいは、ＳＦＭ中、最大１０ｎＭのジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）の存在下でどちらの細胞株（ＣＷＲ２２ＲおよびＣ４−２）のＡＲ転写活性も阻害した。したがって、選択した化合物は、アンドロゲン非依存性ＰＣａの少なくとも２つのモデルのＡＲ転写活性の阻害剤である。
【００６２】
実施例３
本実施例は、ＰＣａ細胞の成長に対する選択した化合物の作用について説明する。我々は、様々な由来の細胞に対する同定したＡＲ阻害剤の毒性を試験するため、いくつかのＰＣａ（ＬＮＣａＰ、Ｃ４−２、ＣＷＲ２２ＲおよびＤＵ１４５）および２種の非ＰＣａ（ＨＴ１０８０およびＨｅＬａ）細胞株への各化合物（１０μＭ）の単回投与を用いて、コロニー形成アッセイを行った（図２Ａ）。１つの化合物（ｃ６６）を除き、選択した低分子は、非ＰＣａ細胞またはＡＲ陰性ＰＣａ細胞（ＤＵ１４５）の成長に影響を与えなかった。試験した分子のほとんどすべてのほか、陽性対照ビカルタミド（診療所で現在使用されているＡＲ阻害剤）が、ＡＲを発現するアンドロゲン感受性ＬＮＣａＰ細胞の成長を、程度は異なるが抑制した（図２Ａ）。一方、ビカルタミドは、Ｃ４−２細胞あるいはＣＷＲ２２Ｒ細胞（ＡＲ発現、アンドロゲン非依存性細胞株）の成長を抑制しなかったのに対し、選択した分子には、抑制したものがあった。このため、我々は、３種のＡＲ発現ＰＣａ細胞株に対して様々な程度の毒性を持つものの、非ＰＣａ細胞またはＡＲ陰性細胞に対しては毒性がない、いくつかの化合物（ｃ５、ｃ６、ｃ１１、ｃ１７、ｃ１８、ｃ５２、ｃ８５）を同定した。しかしながら、化合物の中には（ｃ８、ｃ１６、ｃ４７、ｃ５５、ｃ６１、ｃ７３）、ＬＮＣａＰ細胞の成長を抑制するが、ＣＷＲ２２Ｒ細胞またはＣ４−２細胞の成長を抑制しないという点でビカルタミドと同様の挙動を示すものもあった。これらの化合物は、ＣＷＲ２２Ｒ細胞またはＣ４−２細胞の成長を阻害した化合物と比較して、そうした細胞のＡＲ転写活性の弱い阻害剤ではない。たとえば、化合物ｃ５５、ｃ６１およびｃ８５は、ＡＲＥ−Ｌｕｃレポーター活性およびＰＳＡ分泌のＥＣ５０および最大阻害で判断すると、ＡＲ依存性の転写の阻害剤として同等である。しかしながら、ｃ８５は、アンドロゲン非依存性ＣＷＲ２２Ｒ細胞株およびＣ４−２細胞株の成長を阻害するのに対し、ｃ５５およびｃ６１は、阻害しない。これらの知見は、ＡＲ依存性の転写活性の阻害がそれ自体で、アンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞の成長を抑制するのに十分でないことを示す。
【００６３】
ライブラリーのスクリーニングに使用したパラメーターである、ＣＷＲ２２Ｒ細胞におけるＡＲ依存性レポーターの発現の阻害が、こうした細胞に対する化合物の毒性を必ずしも反映するものではないという我々の知見からは、以下の２つの考えられる理由を示唆する。すなわち、（ｉ）ＡＲは、転写非依存性メカニズムを介してアンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞の生存を制御し、ＡＲ依存性の転写を阻害すると同定された化合物プールは、ＡＲの転写非依存性の抗アポトーシス機能をも阻害すると仮定される一部の化合物を含む。または（ｉｉ）スクリーニングで同定されたＡＲ阻害剤の毒性は、ＡＲに依存するものではなく、ＡＲ転写活性について観察された阻害は、何か他のメカニズムを介して生じる、これらの化合物の毒性または他の作用を反映するものである。我々のスクリーニングで同定された毒性のある化合物は、その毒性において特異性を示す（ＡＲを発現する試験した３種の標的ＰＣａ細胞株の３種に対して毒性があるのに対し、試験した３種の非標的細胞株の３種に対して毒性がない）ということは、この第２のシナリオと相反する。
【００６４】
我々は、化合物のＡＲ特異性をさらに解析するため、化合物により引き起こされるＡＲ阻害とＰＣａ細胞毒性との定量的パラメーターを比較した。化合物の添加から２４時間後に測定した、ＣＷＲ２２Ｒ細胞のＡＲ依存性ルシフェラーゼ活性を阻害するＥＣ５０を、化合物の添加から６日後のＣＷＲ２２Ｒ細胞に対する毒性のＩＣ５０（生細胞を５０％未満にする化合物の阻害濃度）と比較した（図２Ｂ）。重要な点として、２４時間で毒性を示した化合物がなかった（データ示さず）。これは、ｓｉＲＮＡの塗布から４〜６日後に明らかになる、ＡＲを標的としたｓｉＲＮＡの、こうした細胞に対する毒性作用の遅延性に類似している。図２Ｂは、ＡＲ依存性レポーターを阻害する２４時間後のＥＣ５０が、毒性に関する６日後のＩＣ５０と同じ範囲内にあることを示す。このことは、ＡＲ依存性の転写の阻害が、毒性が起こる前に起こること、さらにＰＣａ細胞に対して毒性があるこれらの化合物では、ＰＣａ細胞に対するＡＲの阻害と毒性との間に相関性があることを示す。これらの結果を、一部のＡＲ阻害剤に毒性がないことと考え合わせると、ＡＲを不活化し得る異なる機序があることが示唆される。すなわち、（ｉ）ＡＲの転写活性のみの阻害は、アンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞に対して毒性がない（アンドロゲン除去の作用に類似）、（ｉｉ）ＡＲ転写活性と、ＰＣａ細胞の生存を制御するＡＲの他の何らかの転写非依存性機能との阻害は、アンドロゲン依存性および非依存性ＰＣａ細胞の両方に対して毒性がある。（ｉｉｉ）ＡＲを介した転写に影響を与えずに細胞生存に導くと仮定される転写非依存性のＡＲ機能のみの阻害は、すべてのＰＣａ細胞に対して毒性があると予想されるけれども、こうした阻害剤は、これまで同定されなかった。我々の読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）システムは、ＡＲ依存性トランス活性化のモニタリングに基づくものであり、我々のスクリーニングでは、仮定される第３の機序を介して作用する化合物は、単離されなかった。
【００６５】
我々はさらに、より大きな群（ｎ＝１０）の非標的細胞株（ＡＲを発現しない非ＰＣａ細胞株およびＰＣａ細胞）に対する、選択した化合物の作用について試験した。これらのデータの例を図２Ｃに示す。選択したヒットは、試験した全濃度で、標的細胞に対してのみ毒性があり、ＡＲ陰性細胞に対して無毒性であった。このため、毒性を示す選択したヒットは、ＡＲを発現するＰＣａ細胞に対してのみ毒性があり、したがって、これらの化合物の毒性は、ＡＲに対するそれらの作用に関係している可能性が高いと、我々は強い確信を持って結論することができる。
【００６６】
図２Ｃのデータはさらに、ＰＣａ細胞に対して毒性がある化合物を、その毒性の程度に基づき２つの分類に分けることができることを示す。すなわち、化合物ｃ５２およびｃ８５は、７日目までに培養物中のほぼすべてのＰＣａ細胞を殺す。これに対し、他の化合物は、未処理の対照細胞と比較して成長の抑制を引き起こしたものの、明らかな細胞死を引き起こさなかった（図２Ｃの化合物ｃ５およびｃ６、化合物ｃ１１、ｃ１７、ｃ１８のデータは示していない）。この後者の場合、インキュベーションの時間または化合物の用量を増やしても、依然として細胞の完全な除去には至らなかった。これは、あるサブセットの化合物が、ＰＣａ細胞の増殖を抑制するものの、ＰＣａ細胞を殺さないことを示唆する。この可能性を試験するため、我々は、化合物の両分類で処理したＣＷＲ２２Ｒ細胞の細胞周期分布を評価した。第１の種類の化合物（ｃ５２、ｃ８５）で処理すると、アポトーシス細胞の特徴であるｓｕｂ−Ｇ１ ＤＮＡ内容物（ｃｏｎｔｅｎｔ）を含む細胞が出現する（図３Ｄ）。これに対し、第２の種類の代表的な化合物（ｃ５、ｃ６、ｃ１１）で細胞を処理すると、ｓｕｂ−Ｇ１ ＤＮＡ内容物（ｃｏｎｔｅｎｔ）を含む細胞は出現しなかったけれども、細胞周期停止を示唆する細胞周期分布の変化が生じた（細胞周期のＧ１期の細胞の比率の上昇、およびＳ期の細胞の比率の減少）。したがって、これらの細胞では、アンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞のＡＲ依存性の転写を阻害する様々なサブセットの化合物が、成長停止、あるいはアポトーシスのいずれかを引き起こす。化合物が成長停止を引き起こすか、それともアポトーシスを引き起こすかは、ＡＲ依存性の転写の阻害剤としての化合物の効力によって左右されない（すなわち、図２Ｂ）。
【００６７】
実施例４
本実施例は、ＰＣａ細胞に対する化合物の毒性とＡＲタンパク質のレベルに対するその作用との間の相関性について説明する。
【００６８】
我々は、上述の結果に基づき、我々のスクリーニングで同定されたＡＲ依存性転写の阻害剤の化合物を３つの分類に区別することができる。すなわち、（ｉ）アンドロゲン感受性ＬＮＣａＰ細胞の成長を抑制するけれども、アンドロゲン非依存性のＣ４−２細胞またはＣＷＲ２２Ｒ細胞の成長には作用しないビカルタミドに似た化合物（ｃ８、ｃ１６、ｃ４７、ｃ５５、ｃ６１およびｃ７３）、（ｉｉ）ＡＲを発現するすべての（アンドロゲン依存性および非依存性の）ＰＣａ細胞の成長を抑制する化合物（ｃ５、ｃ６、ｃ１１、ｃ１７，およびｃ１８）、および（ｉｉｉ）ＡＲを発現するすべてのＰＣａ細胞を殺す化合物（ｃ５２およびｃ８５）である。第１の分類のＡＲ阻害剤は、リガンド結合を標的とする（すなわち、アンドロゲン非依存性癌細胞に対して毒性がない）可能性があるため、本発明の方法に有用とは見なされない。残りの２つの分類は、アンドロゲン非依存性ＰＣａおよび他のＡＲ陽性癌を処置できる可能性がある新しい種類のＡＲ阻害剤であると見られるため、考慮の対象になるものであった。このため、残りの２つの分類をＡＲＴＩＳ（ＡＲ転写阻害剤−抑制性、化合物ｃ５、ｃ６、ｃ１１、ｃ１７、ｃ１８など）、およびＡＲＴＩＫ（ＡＲ転写阻害剤−殺傷性、化合物ｃ５２およびｃ８５など）と名付けた。
【００６９】
ＡＲＴＩＳおよびＡＲＴＩＫ化合物がＰＣａ細胞の成長に対して異なる作用を持つ理由を解明すること目的として、我々は、２つの分類の化合物で処理したＣＷＲ２２Ｒ細胞内のＡＲタンパク質のレベル、およびＰＣａ細胞に対して毒性がない第１の分類のいくつかのヒットを比較した。この解析から、ＡＲＴＩＫ（ｃ５２およびｃ８５）により処理すると、ＡＲタンパク質が細胞から完全に消失することが示された。これに対し、ＡＲＴＩＳ化合物または無毒性のＡＲ阻害剤による処理は、細胞内のＡＲタンパク質のレベルに影響を与えなかった（図３Ａ）。これは、ＡＲが転写非依存性メカニズムを介してアンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞の生存を制御することを裏付ける。様々な化合物の比較により、ＡＲタンパク質の除去は、アンドロゲン依存性および非依存性細胞の死を引き起こす（さらに、ＡＲ依存性の転写で観察される阻害を説明すると考えられる）ことが示される。一方、ＡＲタンパク質のレベルが低下しないＡＲ依存性の転写の阻害は、アンドロゲン依存性ＰＣａ細胞、さらに場合によっては、アンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞の成長を抑制するけれども、殺しはしない。１種のＡＲＴＩＫ化合物の毒性作用におけるＡＲ除去の決定的な重要性が、ＡＲＴＩＫの毒性に抵抗性を示すＣＷＲ２２Ｒクローンのインビトロでの選択によって、明らかにされた（図３Ｂ、詳細については実施例１を参照）。ｃ５２の存在下で１０７個の細胞の成長後に単一クローンを得た。このクローンは、ｃ５２が常時存在する中で成長しても、ＡＲの発現を維持していた（図３Ｃ）ことから、ＡＲがｃ５２の直接の標的である可能性があることが示唆される。化合物ｃ８５に抵抗性を示すクローンは、得られなかった。
【００７０】
ＡＲの転写非依存性機能がＰＣａ細胞の生存を制御するかどうかの別の試験として、我々は、ＣＷＲ２２Ｒ細胞の生存に対する２つの遺伝子コンストラクトの作用を比較した。ＡＲを標的とするｓｈＲＮＡはＡＲＴＩＫ化合物と同様に、ＡＲタンパク質の除去に至るＡＲ発現の抑制を引き起こす）。一方、ＡＲミュータント、ＨＤ１−ＫＲＡＢ−ＡＲ１２２の方は、ＡＲのトランス活性化ドメインの一部（ａａ１〜１２２）がＫＲＡＢおよびＨＤＡＣ１のトランスリプレッションドメインで置換されたもので、内因性のＡＲタンパク質のレベルに影響を与えないものの、ＡＲＥ ＤＮＡ配列に対する結合に際して内因性のＡＲタンパク質との競合することにより、ＡＲ依存性の転写を完全に停止させる（Ｂｒａｍｌｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １８３：１９−２８）。これらの２つのコンストラクトについて、ＡＲＥ−ＬｕｃレポーターとのＣＷＲ２２Ｒコトランスフェクションアッセイにより、一定の用量範囲におけるＡＲ依存性の転写に対するその作用（図４Ａ）を試験し、さらに、コロニー形成アッセイによりＣＷＲ２２Ｒの生存に対するその作用を試験した（図４Ｂ）。どちらのコンストラクトも、ＣＷＲ２２Ｒ細胞のＡＲ依存性のルシフェラーゼ発現をほぼ完全に抑制したが、同量のＤＮＡのトランスフェクションの場合、ＨＤ１−ＫＲＡＢ−ＡＲ１２２ミュータントの方が、ｓｈＲＮＡコンストラクトより若干強力であった。しかしながら、既に示したように、ＡＲに対するｓｈＲＮＡは、ＣＷＲ２２Ｒコロニーの成長を抑制したのに対し、ＨＤ１−ＫＲＡＢ−ＡＲ１２２コンストラクトは、抑制しなかった。この状況は、我々の一連のＡＲ阻害低分子で観察された状況によく似ており、ＡＲが、これまでに特性が明らかにされていないトランス活性化非依存性機能を介してＰＣａ細胞の生存を制御するという仮説をさらに裏付けるものである。
【００７１】
実施例５
いくつかのステロイド受容体（ＳＲ）は、ＡＲを含め、エストロゲン受容体（ＥＲ：ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、糖質コルチコイド受容体（ＧＲ：ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）およびミネラルコルチコイド受容体（ＭＲ：ｍｉｎｅｒａｌｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）など高度に相同的である。リガンド活性化型のこれらの受容体はすべて、同じＤＮＡ配列エレメントを認識し，結合する。受容体リガンド相互作用の下流で作用するＡＲ阻害化合物を単離する試み（我々のスクリーニングなど）は、理論的には、これらのＳＲのすべてを阻害できる分子の単離に至る可能性がある。ＥＲまたはＰＲの阻害は、これらの受容体が男性の重要な機能を制御しないため、ＰＣａの処置にとって重量な問題ではないと予想される。しかしながら、ＧＲおよびＭＲ系は、男性で機能的であり、交差反応性の（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ）ＡＲ阻害剤によりこれらを阻害すると、特に長期的投与を伴う場合に有害な副作用を引き起こす恐れがある。
【００７２】
我々のＡＲ阻害化合物のいずれかが、ＧＲまたはＭＲをも阻害するかどうかを判定するため、我々は最初に、我々のスクリーニングに使用したＣＷＲ２２ＲＡＲＥ−Ｌｕｃレポーター系がアンドロゲン以外のステロイドに反応するかどうかを試験した。これは、我々のライブラリーのスクリーニングが、ＧＲおよびＭＲのリガンドを含み得るＦＢＳの存在下で行われたため、実施すべき重要な実験であった。我々は、ＧＲリガンド、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）またはＭＲリガンド、アルドステロン（Ａｌｄ）のどちらかを用いてＳＦＭ中でＣＷＲ２２ＲＡＲＥ−Ｌｕｃ細胞を処理し、選択したヒットの存在下または非存在下でルシフェラーゼ活性を測定した。ＤｅｘおよびＡｌｄはどちらも、ＣＷＲ２２Ｒ細胞のＡＲＥ−Ｌｕｃレポーターの活性を誘導した。さらに、選択したＡＲ阻害ヒットはすべて、この活性を抑制し、抑制の程度は、ＤＨＴが誘導するＡＲＥ−Ｌｕｃ活性に対するそれらの作用と比例した（データ示さず）。
【００７３】
ＣＷＲ２２Ｒ細胞は、ＡＲΔＬＢＤのみならず、そのリガンド特異性に影響を与え得るＬＢＤ突然変異を含む全長ＡＲも発現する（図１）。ＤｅｘおよびＡｌｄにより観察されたルシフェラーゼの誘導が、これらのリガンドによるＡＲの活性化によるものであるかどうかを試験するため、我々は、ＡＲ特異的ｓｉＲＮＡを用いて、ＣＷＲ２２Ｒ細胞のＡＲ（ＬＢＤおよび全長の両方）の発現を遮断した。こうした細胞では、全３種のリガンド、ＤＨＴ、ＤｅｘおよびＡｌｄによるＡＲＥ−Ｌｕｃ活性化は、対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞と比較して抑制された。これは、ＣＷＲ２２Ｒ細胞に存在するＬＢＤ変異ＡＲの交雑性（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ｎａｔｕｒｅ）を説明する（図５Ａ）。この実験は、選択したヒットがＤＨＴ以外のリガンドにより刺激された場合でも、ＡＲを阻害することができることを明らかにした。一方で、このデータは、ヒットが他の細胞のＧＲおよび／またはＭＲ活性に影響を与える可能性を完全には排除できない。
【００７４】
我々は、我々のＡＲ阻害ヒットが他のＳＲに影響を与えるかどうかをさらに明らかにするため、文献によりＧＲ、ＭＲおよびＡＲを発現するとされるＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌細胞を使用した（Ｚｈｏｕ，Ｃｅｔ ａｌ．２００８．ＤＢｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５４：４４０−４５０２９）。我々は、プロモーター領域に、３種のＳＲのすべてが認識するＤＮＡ結合エレメントを含むＭＭＴＶ−Ｌｕｃレポーターコンストラクトを、この細胞にトランスフェクトした。この系では、ｃ６６を除くヒット化合物のすべてが、ＤＨＴの刺激によるレポーター活性の特異的阻害剤であり、ＤｅｘまたはＡｌｄの刺激によるＭＭＴＶ−Ｌｕｃに対しては作用がなかった（図５Ｂ）。したがって、我々は、選択したヒット分子の大部分が、高度に相同的なＧＲおよびＭＲに対してさえも活性を持たない特異的ＡＲ阻害剤であると結論する（表１）。
【００７５】
実施例６
インビボ試験のため、前の全アッセイをベースにして、ＡＲＴＩＳ分類とＡＲＴＩＫ分類を代表する５つのヒット化合物（ｃ６、ｃ１１、ｃ１７、ｃ５２およびｃ８５）を選択した。化合物ｃ５は、ミクロソーム安定性が非常に低いため（ラットのミクロソームとの１時間のインキュベーション後で＜５％）、除外した。化合物の毒性は、用量漸増アッセイ（ｄｏｓｅ ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）で評価した。このアッセイでは、ＮＩＨ Ｓｗｉｓｓ雄マウス（ｎ＝４）に、３日おきに、送達される各化合物を連続的に３回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。第１の用量は、マウス体重に基づき再計算した、ＣＷＲ２２Ｒ細胞内の化合物のインビトロでのＩＣ５０の２０倍（２０×ＩＣ５０）（実施例１を参照）、第２および第３の用量はそれぞれ、５０×ＩＣ５０および１００×ＩＣ５０であった。最後の注射の翌日に、肉眼的病理検査と、総タンパク質レベル、グルコースレベル、ビリルビンレベルおよびクレアチニンレベル、肝臓酵素の活性、ならびにイオン濃度を含む血清の生化学アッセイのための採血とのため、各群のマウスの半数を屠殺した。化合物の最後の注射から７日後に、残りのマウスも同様に屠殺し、評価した。生きたマウスの目視検査、あるいは肉眼的病理検査の際に、化合物を注射したどのマウスも、異常は観察されなかった。化合物の最後の注射の翌日に、ほとんどすべてのマウスで血清中のグルコース濃度の若干の低下（対照の７０〜８０％）が観察されたが、１週間後のグルコースレベルは、正常であった（データ示さず）。血清中のグルコースレベルが低いのは、選択した化合物の弱い一過性のＧＲ阻害作用を反映したのかもしれない。しかしながら、全体的に見ると、この実験からは、マウスの場合、試験した用量の化合物が無毒性であり、したがってインビボでの有効性試験に好適であることが明らかにされた。
【００７６】
我々は、ヌードマウスのアンドロゲン非依存性ＰＣａのＣ４−２およびＣＷＲ２２Ｒ異種移植モデルを用いて、ヒットに起こり得る抗腫瘍作用を評価した。Ｃ４−２腫瘍を持つマウス群（各群マウス４〜５匹、それぞれ２つの腫瘍を持つ）に、化合物（１００×ＩＣ５０用量）またはＤＭＳＯビヒクルを６回連日ｉ．ｐ．注射した。この処置レジメンでは、化合物ｃ６およびｃ１１は、Ｃ４−２腫瘍成長の明確な抑制を示したのに対し、ｃ１７、ｃ５２およびｃ８５は、示さなかった（図６Ａ）。
【００７７】
ＡＲＴＩＫ化合物ｃ５２およびｃ８５も、ＣＷＲ２２Ｒモデルを用いて試験した。１８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量（２００×ＩＣ５０と同等）でｃ５２を５回連日静脈内（ｉ．ｖ．）注射したところ、顕著な有害な副作用をまったく起こさずにＣＷＲ２２Ｒの皮下腫瘍の成長を抑制した（図６Ｂ）。化合物ｃ８５は、腫瘍成長の確かな抑制を示さなかった。１８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのｃ５２で処置した１０匹のマウスのうち、２匹のマウスで腫瘍が完全に消失し、１匹のマウスで退縮し、５匹のマウスで大きくならなかった。これに対し、１０匹の対照動物のうち９匹は、腫瘍が次第に成長し、１匹のマウスは、腫瘍がゆっくりと成長した。
【００７８】
これらのインビボでの結果から、ＡＲＴＩＫとＡＲＴＩＳとの代表的な化合物（化合物ｃ６、ｃ１１およびｃ５２）は一般に無毒性であるが、アンドロゲン非依存性ＰＣａの腫瘍の成長を遮断し、したがって、ＰＣａおよびＡＲ陽性ＢＣに対して候補治療薬として有力であることが示唆される。本開示の利点を踏まえると、薬理作用の最適化のための通常の実験法を用いれば、これらの化合物の抗腫瘍効果が大きく改善するだけでなく、上述の実験で腫瘍成長を抑制しなかった他のヒット化合物のインビボでの有効性も明らかになり得る可能性がある。
【００７９】
実施例７
本実施例は、ＡＲ陽性およびＡＲ陰性癌細胞、ならびに非癌性細胞に対する化合物の作用の解析を示す。特に、化合物を、ＡＲ陽性乳癌細胞、ＡＲ陰性乳癌細胞、ＡＲ陽性前立腺癌細胞、ＡＲ陰性腎細胞癌、ＡＲ陰性頸部細胞およびＡＲ陽性肝細胞癌、ならびに正常肝実質細胞に対して試験した。本実施例に記載した実験は、本質的に実施例１に記載されているように実施した。その結果から、本発明の方法に使用するのに好適であると本明細書に記載された化合物がＡＲ陽性癌細胞の成長の阻害には効果的であるものの、ＡＲ陰性癌細胞には効果的でないことが明らかにされる。結果は、図１２〜図２０にグラフでまとめてある。
【００８０】
我々は、アンドロゲン非依存性（およびアンドロゲン依存性）ＰＣａの処置に使用される新しい種類のＡＲ阻害剤を同定するため、ＡＲのＬＢＤを欠損した形態（ＡＲΔＬＢＤ）に対して低分子をスクリーニングしたことが、本発明の明細書本文および実施例から当業者には明らかであろう。他のＡＲドメインを標的にすると、大部分の突然変異は、ドメイン機能（たとえば、トランス活性化、ＤＮＡ結合、補助因子の相互作用）の喪失を引き起こすことが予想されるため、再発を起こす突然変異の選択につながる可能性が低くなる。
【００８１】
いくつかの我々の知見は、ＡＲΔＬＢＤが完全にアンドロゲン非依存性であっても、なおＰＣａ細胞生存能に不可欠なＡＲ機能をすべて保持することを明らかにした。すなわち、ｉ）ＡＲΔＬＢＤは、ＡＲ特異的プロバシンプロモーターからｐＡＲＥ−Ｌｕｃレポーターの発現を活性化する（実施例１を参照）。ｉｉ）ＣＷＲ２２Ｒ細胞は、ＡＲの非存在下で生存できない一方、ＡＲΔＬＢＤの発現は、この細胞の通常の増殖を支持するのに十分である。さらに、ｉｉｉ）ＳＦＭ中のＡＲΔＬＢＤの活性は、アンドロゲンの存在下での野生型ＡＲの活性と同等か、またはそれを上回る（レポーター活性のアッセイ、核局在化など）。これらのデータは、細胞生存に決定的に重要なＡＲの機能に干渉し、ＡＲの様々な変異体に対して広範な活性を持ち得る新しい種類の（リガンド結合に影響を与えない）ＡＲ阻害剤を同定するための標的としてＡＲΔＬＢＤを使用することの正当性を立証するものである。
【００８２】
ＡＲを標的とするのに我々が用いたアプローチは、異なる根拠に基づき、他の報告に記載されたものと異なる戦略を利用した。Ａｔｔａｒ ｅｔ ａｌ．は、ＡＲのＬＢＤに結合したビカルタミドの結晶構造に基づき新しい非ステロイド性ＡＲ阻害剤の合理的なデザインを報告した（Ｓａｌｖａｔｉ，ｅｔ ａｌ．２００５．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ １５：２７１−２７６）。これらの新しい阻害剤は、ビカルタミドと比較してＡＲ結合特性が向上しており、さらに、ビカルタミドがＡＲの一部のミュータント型に対して活性であるのに対し、この新しい化合物は、アンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞に対して毒性が強くなっている。しかしながら、このアプローチは、ＡＲのＬＢＤに対する治療法の変異形であり、したがってＬＢＤの変異性によって限定される可能性がある。
【００８３】
別のグループは、アンドロゲンの非存在下で成長が可能なアンドロゲン感受性ＬＮＣａＰ細胞を選択する際、最も多く見られる遺伝子変化がＡＲ遺伝子の増幅であることを見出したＮａｔ Ｍｅｄ １０：３３−３９）。著者らは、観察された増幅が、１細胞当たりのＡＲ分子を増大させることによりリガンドの非存在下でのＡＲの低活性を補うために選択されると仮定した。同じグループは最近、こうした細胞を用いてアンドロゲン非依存性ＰＣａに対して活性を持つ低分子を選択したと報告した（Ｔｒａｎ，ｅｔ ａｌ．２００９．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｅｃｏｎｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉａｎｄｒｏｇｅｎ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４：７８７−７９０）。この分子、ＭＤＶ３１００が、去勢抵抗性ＰＣａ患者の第Ｉ相臨床試験でＰＳＡレベルの低下に有効性を示した。しかしながら、ＡＲに対するＭＤＶ３１００の活性のメカニズムは、我々のアプローチにより単離されたＡＲ阻害剤が使用すると我々が考えるものと異なる。ＭＤＶ３１００、およびそれに近いホモログＲＤ１６２はどちらも、ＡＲのＬＢＤに高い親和性で結合するＡＲの非競合的アンタゴニストである。ＭＤＶ３１００（およびＲＤ１６２）の結合親和性は、アンタゴニストに対してこれまでに得られたアンドロゲンの結合親和性に最も近い。このため、これらの化合物は、アンドロゲンによるＡＲの活性化を妨げるもので、ビカルタミドおよびフルタミドなど診療所で利用可能なＡＲアンタゴニストよりも優れた効力を持つ。さらに、後者の分子は、ＭＤＶ３１００またはＲＤ１６２が示さないパーシャルアゴニスト活性により妨げられる（Ｔｒａｎ，ｅｔ ａｌ．２００９．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｅｃｏｎｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉａｎｄｒｏｇｅｎ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４：７８７−７９０）。これらの新しい化合物に起こり得る問題は、化合物がＬＢＤにも結合し、カソデックスと同様にＬＢＤの突然変異の選択を誘導し得ることに起因するかもしれない。
【００８４】
我々のスクリーニングの予想外の知見の１つは、ＡＲ転写活性の喪失が必ずしも、アンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞の成長または生存の阻害につながらないことであった。我々がＡＲ依存性の転写の阻害剤として同定した分子のほとんどすべては、ＬＮＣａＰ細胞の成長も阻害しており、それによりＡＲ転写活性がリガンド依存性ＰＣａ細胞の成長に重要であることが確認された。しかしながら、アンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞（Ｃ４−２およびＣＷＲ２２Ｒ）の成長に対して作用を有する化合物は、一部のみであった。重要な点として、ＡＲを発現するすべてのＰＣａ細胞（アンドロゲン依存性および非依存性の両方）の成長を抑制した少数のヒット化合物が、アンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞の成長に対して作用を示さない分子より、ＡＲ依存性の転写の阻害剤として必ずしも強力ではなかった。スクリーニング結果のかなりの割合のＡＲ依存性転写の無毒性阻害剤と毒性阻害剤（死または成長停止を引き起こす）とは、ＡＲ依存性の転写の阻害が、少なくともアンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞に対する毒性を必ずしも決定するものではないことを示唆する。これは、これまでに特徴付けられていない転写調節以外のＡＲの別の機能が、ＰＣａ細胞の生存にとって重要であることを示唆する。これらの結果はさらに、この仮定された細胞生存に導く別の機能を除去せずに低分子を用いて特異的に、ＡＲの転写調節機能を阻害し得ることも示唆する。
【００８５】
アンドロゲン非依存性ＰＣａに対する毒性を示すＡＲ阻害ヒットのさらなる特徴付けから、ヒットを２つの分類、ＰＣａ細胞を殺すヒットとその増殖を抑制しかしないヒットとに明確に分けることができることが示される。さらに、ＡＲタンパク質のレベルに対する化合物の作用は、化合物が誘導する毒性の種類と相関関係があった。すなわち、ＡＲタンパク質の除去を引き起こす化合物は、アンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞を殺したのに対し、ＡＲレベルに対する作用を持たない化合物は、その成長を抑制するのみであった。このデータもやはり、ＰＣａ細胞の生存を制御し、ＡＲタンパク質が細胞から除去されたときのみ完全に消失する、ＡＲの転写非依存性機能の存在により説明することができる。
【００８６】
前立腺癌の細胞死を誘導するには、ＡＲのトランス活性化機能の阻害にとどまらず、ＡＲタンパク質の除去を必要とするという考えは、野生型ＡＲを発現する正常な前立腺上皮細胞と、ＬＢＤの突然変異を含み、ＡＲを発現する前立腺腫瘍細胞とでは、去勢の作用が異なることにより裏付けられる。野生型ＡＲは、アンドロゲンの非存在下では、特にその結合パートナーＨＳＰ９０が限られている場合には、不安定である。このため、去勢を行うと、ＡＲタンパク質の消失、および正常前立腺上皮細胞のアポトーシスが起こる。これに対し、ＡＲのＬＢＤ突然変異はリガンド結合の特異性に影響を与えるだけでなく、アンドロゲンの非存在下でＡＲの安定性を促進するため、去勢は、変異ＬＢＤを含む多くのＰＣａ細胞を殺さずに、その増殖を抑制するのみである。
【００８７】
ＰＣａ細胞の生存を制御するＡＲの転写非依存性の役割の存在は、ｓｈＲＮＡを介したＡＲの除去が、ＰＣａ細胞によるコロニー形成を抑制するのに対し、トランス活性化欠損ドミナントネガティブ型ＨＤ１−ＫＲＡＢ−ＡＲ１２２ＡＲミュータントの発現は、抑制しなかったという我々の知見によりさらに裏付けられる。このため、我々のデータから、ＡＲが、前立腺細胞生存に影響を与える、以前に認識されていない転写非依存性機能を持つ可能性が裏付けられる
【００８８】
我々の選択したＡＲ阻害ヒットには、ＰＣａ細胞を効率的に殺すものもあれば、抗増殖作用が弱いものもあるが、どちらの分類の化合物も、マウスのＰＣａの腫瘍モデルに対して有効性を示すことは、注目に値する。どちらの分類の化合物にもインビボで抗腫瘍有効性があることは、以下のいくつかの点で説明することができる。すなわち、（ｉ）化合物が、インビトロよりインビボで強力になる代謝変換をインビボで受ける。（ｉｉ）化合物が、インビトロでのＰＣａ細胞生存には決定的に重要ではないけれども、インビボではより重要となる活性のメカニズムを持つ。および／または、（ｉｉｉ）一部の化合物の成長抑制作用は、インビボで腫瘍成長を停止させるのに十分である。
【００８９】
我々が調査したマウスモデルでは、インビトロでアンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞に対して毒性があったいくつかの化合物が、インビボでの腫瘍成長に対して顕著な作用をまったく有さなかった。これに対して考えられる２つの理由として、（ｉ）これらの化合物は、薬理作用が最適化されていなかったものの、過度の実験を行うことなく本開示を応用したものになる可能性がある。および／または、（ｉｉ）これらの化合物の作用メカニズムは、インビボではインビトロほど重要でないことがある。化合物Ｃ５２は、Ｃ４−２モデルを用いた我々の実験においてインビボで有効性を示さなかったものの、ＣＷＲ２２Ｒ腫瘍を用いた我々の実験では効果的であった。この相違は、後者の実験で、より高用量の化合物および異なる投与経路（ｉ．ｖ．とｉ．ｐ．）を我々が使用したことによるかもしれない。静脈内注射は、ｉ．ｐ．注射で起こる肝初回通過を回避することにより、ｃ５２（ラットのミクロソームとの１時間のインキュベーション後に残る化合物は１７％）など比較的不安定な化合物のバイオアベイラビリティーを著しく向上させることができる。このため、Ｃ４−２モデルにおけるｃ５２の有効性の喪失は、当業者であれば本開示に基づき対処し得る、化合物の不十分な薬理学的特性による可能性がある。
【００９０】
要約すると、我々は、インビトロおよびインビボで非常に特異的抗ＰＣａ特性を持ついくつかのＡＲ阻害化合物を同定した。これらの化合物は、ＡＲ−リガンド相互作用を標的としないため、新しいクラスのＡＲ阻害剤である。したがって、これらの化合物は、標準的な抗アンドロゲン療法に応じて発生するＬＢＤ突然変異に関係なく、ＡＲ陽性細胞に対して活性である可能性がある。このため、本開示で試験した個々の化合物が属する化学クラスも、ＡＲ陽性癌に対して有用であると予想される。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＲ陽性癌と診断されたまたはその疑いがある個体におけるＡＲ陽性癌細胞の成長を阻害する方法において、下記ｉ）〜ｖ）の構造を持つ化合物であり、
式中、Ｒ２１またはＲ２５は、水素、または任意に１つもしくは複数のヒドロキシル基またはシアノ基で置換されている１〜６個の炭素を含むアルキル基であり、
Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４、またはＲ２６、Ｒ２７もしくはＲ２９は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、アルキル部分が１〜４個の炭素を含み、かつ任意に１つもしくは複数のハライドで置換されているアルキルケトン基、ハライド、アルキル基が１〜４個の炭素を含むアルキルスルホンアミド、ヒドロキシル基、アルキル部分が１〜４個の炭素を含むアルコキシ基、または以下の基であり、
式中、Ｒ３１は、任意に１つもしくは複数のハライドで置換されている１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはアミノ基であり、
Ｒ３２は、任意に１つもしくは複数のハライドで置換されている１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはアミノ基であり、
Ｒ３３は、任意に１つもしくは複数のハライドで置換されている１〜６個の炭素を含むアルキル基、アミノ基、任意に１つもしくは複数のハライドで置換されている１〜４個の炭素を含むアルキルケトン基、またはアルキル部分が１〜４個の炭素を含むアルキルシクロヘキシル基であり、
式中、Ｒ３５は、水素、任意に１つもしくは複数のハライドで置換されている１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはハライドであり、
Ｒ３６およびＲ３７は独立に、水素、または任意に１つもしくは複数のハライドで置換されている１〜６個の炭素を含むアルキル基であり、
Ｒ３８およびＲ３９は独立に、水素、または任意に１つもしくは複数のハライドで置換されている１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはヒドロキシル基であり、
Ｒ４０は、水素またはヒドロキシル基であり、
式中、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、アリール部分が５または６個の炭素を含み、かつアルキル部分が１〜４個の炭素を含むアリールアルキル基、アルキル部分が１〜４個の炭素を含むアルキルケトン基、ハライド、またはヒドロキシル基であり、
Ｒ３は、水素またはヒドロキシル基であり、
Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、ハライド、またはニトロ基であり、
Ｘ１は、酸素原子または硫黄原子であり、
式中、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、アルキル部分が１〜６個の炭素を含むアルキルエーテル基、ハライド、アミノ基、ヒドロキシル基、またはニトロ基であり、
Ｘ２は、酸素原子または硫黄原子であり、
式中、Ｒ１７およびＲ１８は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはアルキル部分が１〜４個の炭素を含むアルキルエーテル基であり、
Ｒ１９およびＲ２０は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはハライドである
化合物および
ｉ）〜ｖ）に記載された前記化合物の組み合わせ
の群から選択される化合物を含む組成物を前記個体に投与することを含み、
前記個体の前記アンドロゲン受容体陽性癌の成長が、前記個体への前記組成物の投与後に阻害されることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記化合物が下記構造を持つことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記化合物が下記構造を持つことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記化合物が下記構造を持つことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、前記化合物が下記構造を持つことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、前記化合物が下記構造を持つことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、前記アンドロゲン受容体陽性癌細胞は、前立腺癌細胞、乳癌細胞、肝細胞癌細胞、甲状腺癌細胞、グリオブラストーマまたは星状細胞腫から選択されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、前記個体は、アンドロゲン受容体陽性前立腺癌と診断された、またはその疑いがあることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、前記アンドロゲン受容体陽性前立腺癌は、アンドロゲン非依存性前立腺癌であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法において、前記個体は、アンドロゲン受容体陽性乳癌と診断された、またはその疑いがあることを特徴とする方法。
【請求項１１】
個体が、請求項１に記載の化合物を含む組成物を用いた処置の候補であるかどうかを確認することを特徴とする方法において、前記方法は、前記個体から生物学的サンプルを採取すること、および前記サンプルがアンドロゲン受容体陽性癌細胞を含んでいるかどうかを判定することを含み、前記生物学的サンプルがアンドロゲン受容体陽性癌細胞を含んでいると判定することは、前記個体が前記処置の候補であることを示唆し、前記生物学的サンプルがアンドロゲン受容体陽性癌細胞を含んでいないと判定することは、前記個体が前記処置の候補でないことを示唆することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記生物学的サンプルは、アンドロゲン受容体陽性前立腺癌細胞を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法において、前記生物学的サンプルは、アンドロゲン受容体陽性乳癌細胞を含むことを特徴とする方法。
【請求項１】
ＡＲ陽性癌と診断されたまたはその疑いがある個体におけるＡＲ陽性癌細胞の成長を阻害する方法において、下記ｉ）〜ｖ）の構造を持つ化合物であり、
式中、Ｒ２１またはＲ２５は、水素、または任意に１つもしくは複数のヒドロキシル基またはシアノ基で置換されている１〜６個の炭素を含むアルキル基であり、
Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４、またはＲ２６、Ｒ２７もしくはＲ２９は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、アルキル部分が１〜４個の炭素を含み、かつ任意に１つもしくは複数のハライドで置換されているアルキルケトン基、ハライド、アルキル基が１〜４個の炭素を含むアルキルスルホンアミド、ヒドロキシル基、アルキル部分が１〜４個の炭素を含むアルコキシ基、または以下の基であり、
式中、Ｒ３１は、任意に１つもしくは複数のハライドで置換されている１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはアミノ基であり、
Ｒ３２は、任意に１つもしくは複数のハライドで置換されている１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはアミノ基であり、
Ｒ３３は、任意に１つもしくは複数のハライドで置換されている１〜６個の炭素を含むアルキル基、アミノ基、任意に１つもしくは複数のハライドで置換されている１〜４個の炭素を含むアルキルケトン基、またはアルキル部分が１〜４個の炭素を含むアルキルシクロヘキシル基であり、
式中、Ｒ３５は、水素、任意に１つもしくは複数のハライドで置換されている１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはハライドであり、
Ｒ３６およびＲ３７は独立に、水素、または任意に１つもしくは複数のハライドで置換されている１〜６個の炭素を含むアルキル基であり、
Ｒ３８およびＲ３９は独立に、水素、または任意に１つもしくは複数のハライドで置換されている１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはヒドロキシル基であり、
Ｒ４０は、水素またはヒドロキシル基であり、
式中、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、アリール部分が５または６個の炭素を含み、かつアルキル部分が１〜４個の炭素を含むアリールアルキル基、アルキル部分が１〜４個の炭素を含むアルキルケトン基、ハライド、またはヒドロキシル基であり、
Ｒ３は、水素またはヒドロキシル基であり、
Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、ハライド、またはニトロ基であり、
Ｘ１は、酸素原子または硫黄原子であり、
式中、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、アルキル部分が１〜６個の炭素を含むアルキルエーテル基、ハライド、アミノ基、ヒドロキシル基、またはニトロ基であり、
Ｘ２は、酸素原子または硫黄原子であり、
式中、Ｒ１７およびＲ１８は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはアルキル部分が１〜４個の炭素を含むアルキルエーテル基であり、
Ｒ１９およびＲ２０は独立に、水素、１〜６個の炭素を含むアルキル基、またはハライドである
化合物および
ｉ）〜ｖ）に記載された前記化合物の組み合わせ
の群から選択される化合物を含む組成物を前記個体に投与することを含み、
前記個体の前記アンドロゲン受容体陽性癌の成長が、前記個体への前記組成物の投与後に阻害されることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記化合物が下記構造を持つことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記化合物が下記構造を持つことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記化合物が下記構造を持つことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、前記化合物が下記構造を持つことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、前記化合物が下記構造を持つことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、前記アンドロゲン受容体陽性癌細胞は、前立腺癌細胞、乳癌細胞、肝細胞癌細胞、甲状腺癌細胞、グリオブラストーマまたは星状細胞腫から選択されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、前記個体は、アンドロゲン受容体陽性前立腺癌と診断された、またはその疑いがあることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、前記アンドロゲン受容体陽性前立腺癌は、アンドロゲン非依存性前立腺癌であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法において、前記個体は、アンドロゲン受容体陽性乳癌と診断された、またはその疑いがあることを特徴とする方法。
【請求項１１】
個体が、請求項１に記載の化合物を含む組成物を用いた処置の候補であるかどうかを確認することを特徴とする方法において、前記方法は、前記個体から生物学的サンプルを採取すること、および前記サンプルがアンドロゲン受容体陽性癌細胞を含んでいるかどうかを判定することを含み、前記生物学的サンプルがアンドロゲン受容体陽性癌細胞を含んでいると判定することは、前記個体が前記処置の候補であることを示唆し、前記生物学的サンプルがアンドロゲン受容体陽性癌細胞を含んでいないと判定することは、前記個体が前記処置の候補でないことを示唆することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記生物学的サンプルは、アンドロゲン受容体陽性前立腺癌細胞を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法において、前記生物学的サンプルは、アンドロゲン受容体陽性乳癌細胞を含むことを特徴とする方法。
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２０１３−５０８４１７（Ｐ２０１３−５０８４１７Ａ）
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３５４４１（Ｐ２０１２−５３５４４１）
【出願日】平成２２年１０月２５日（２０１０．１０．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５３９１６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５０３５３
【国際公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【出願人】（５０４２０６０５６）ヘルス リサーチ インコーポレイテッド (8)
【氏名又は名称原語表記】ＨＥＡＬＴＨ ＲＥＳＥＡＲＣＨ， ＩＮＣ．
【出願人】（５１２１０１２５７）パナセラ ラブズ，インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＰＡＮＡＣＥＬＡ ＬＡＢＳ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月２５日（２０１０．１０．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５３９１６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５０３５３
【国際公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【出願人】（５０４２０６０５６）ヘルス リサーチ インコーポレイテッド (8)
【氏名又は名称原語表記】ＨＥＡＬＴＨ ＲＥＳＥＡＲＣＨ， ＩＮＣ．
【出願人】（５１２１０１２５７）パナセラ ラブズ，インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＰＡＮＡＣＥＬＡ ＬＡＢＳ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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