タンパク質の不溶化方法、タンパク質由来樹脂の製造方法、並びに、タンパク質由来の樹脂及び生分解性プラスチック
【課題】 タンパク質の不溶化方法の提供を目的とする。
【解決手段】 前記目的を達成するために、本発明のタンパク質の不溶化方法は、タンパク質を溶解した水溶液を亜臨界水条件下で反応させることにより、タンパク質を不溶化する方法である。本発明の方法によれば、さまざまなタンパク質を原料として、新規な樹脂を製造できる。そして、この樹脂は、タンパク質由来であるから、生分解性プラスチック又はその材料として使用できる。また、前記樹脂の合成反応は、タンパク質が溶解した水溶液を亜臨界条件とするだけで起こり、その反応時間も数分以内に短くすることができるから、前記樹脂の製造は、簡便であり、そのコストも低減できる。
【解決手段】 前記目的を達成するために、本発明のタンパク質の不溶化方法は、タンパク質を溶解した水溶液を亜臨界水条件下で反応させることにより、タンパク質を不溶化する方法である。本発明の方法によれば、さまざまなタンパク質を原料として、新規な樹脂を製造できる。そして、この樹脂は、タンパク質由来であるから、生分解性プラスチック又はその材料として使用できる。また、前記樹脂の合成反応は、タンパク質が溶解した水溶液を亜臨界条件とするだけで起こり、その反応時間も数分以内に短くすることができるから、前記樹脂の製造は、簡便であり、そのコストも低減できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の不溶化方法、タンパク質由来樹脂の製造方法、並びに、タンパク質由来の樹脂及び生分解性プラスチックに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の石油関連プラスチックの継続的及び拡大的使用にともない、石油関連プラスチック廃棄物が増加し、このことが、埋立て地不足の加速や、固形廃棄物処理の焼却処分にともなう深刻な公害問題を引き起こしている。例えば、石油関連プラスチック廃棄物は、自然界では分解されにくいため長期間残存し、例えば、後述のようにして、生態系を乱す。すなわち、水や空気を通さない石油関連プラスチック廃棄物は、土壌の肥沃状態を減退させ、その他の物質の分解をも阻害し、地下水源を枯渇させ、動物の生態に危険を及ぼす。また、海中においては、石油関連プラスチック廃棄物は、海生動物を窒息させたり、絡ませたりして、彼等の生存に影響を及ぼす。また、日本やヨーロッパ等の多くの国々では、埋立てに使用できる場所がほとんど残されておらず、石油関連プラスチック廃棄物を含む固形廃棄物の処理問題の重要性が、ますます増大している。それゆえ、環境に安全かつ容易に処分できるプラスチック材料を製造することには、非常に多くの利点がある。
【０００３】
適切な環境に置かれた場合に著しい構造変化（主として、分子量の減少）を受けるポリマーは、環境分解型ポリマー(ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ)とよばれる（ＡＳＴＭ Ｄ８８３）。この環境分解型ポリマーは、以下の４つに分類することができる。
（１）生分解性 ：微生物の作用により、定量的にＣＯ2及びＨ2Ｏ又はＣＨ4及びＨ2Ｏのいずれかに変換されるポリマー。
（２）加水分解性：加水分解のプロセスにより分解されるポリマー。
（３）光分解性 ：光と酸素との総合作用により分解されるポリマー。
（４）酸化分解性：酸化分解プロセスにより分解されるポリマー。
【０００４】
これらの環境分解型ポリマーを大量生産し、既存の石油関連プラスチックの代替とすることは、石油や天然ガス等の再利用ができない資源の保護に役立ち、廃棄物問題の解決に寄与することとなる。環境分解型プラスチックは、例えば、農業用マルチ、外科用インプラント、産業包装、ラップ、乳製品の包装（ｓａｃｈｅｔ）、フードサービス、日常生活介護、製薬及び医療機器等の分野に適用できる。
【０００５】
生分解性の環境分解型ポリマー（生分解性プラスチック）は、例えば、以下のように、３つに分類することができる（非特許文献１参照）。
（１）微生物産生系：糖等を原料として微生物の体内に蓄積させるタイプ。ポリヒドロキシブチレート等。
（２）天然物系：バイオマスを利用したタイプ。澱粉、酢酸セルロース、キトサン等。
（３）化学合成系：モノマーを重合するタイプ。ポリ乳酸、ポリビニルアルコール等。
【０００６】
これらの中でも、前記化学合成系の生分解性プラスチックであるポリ乳酸は、バイオマスから抽出した澱粉を発酵等して利用するものであり、近年注目を集めている。しかし一方では、石油関連プラスチックに対抗するには高価すぎるという問題があり、費用効率に優れる新たな生分解性プラスチックやその製造方法についての技術が必要とされている。また、より多くの分野で生分解性プラスチックを利用できるよう、より多くの種類の生分解性プラスチックが必要とされている。
【０００７】
他方、タンパク質は、原則的には、生分解性であり、熱を加えることで変性し、凝集することが知られている。さらに、タンパク質の中には、ゲル化するものもある。例えば、コラーゲンは、アルカリ又は酸で処理することでゼラチンとなる。また、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）も、熱処理によってゲル化することが知られている（非特許文献２及び３参照）。しかしながら、これらの凝集物やゲルをプラスチックとして使用するには、例えば、強度が足りない等の問題がある。タンパク質をプラスチックとして利用するには、タンパク質のより強度な重合体マトリックスを形成させる必要がある。
【非特許文献１】生分解性プラスチック研究会、「生分解性プラスチックの本」、ｐ．２２−２３、日刊工業新聞社、２００４年８月３０日発行
【非特許文献２】Nakamura, T. et al. "Interaction during heat induced gelatin in a mixed system of soybean 7S and 11S globulins" Agric. Biol. Chem. Vol. 50, PP. 2429-2435, 1986
【非特許文献３】Kitabatake, N. et al. "Rheological properties of heat induced ovalbumin gels prepared by two-step and one-step heating methods." J. Food Sci. Vol. 54, PP. 1632-1638, 1989
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、タンパク質の不溶化方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明のタンパク質の不溶化方法は、タンパク質を亜臨界水処理して不溶化する工程を含む方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明者等は、さまざまな組成物に対する亜臨界水処理の作用について鋭意研究を重ね、その結果、従来であれば、主に、組成物の分解や低分子化を目的として使用されていた亜臨界水処理が、逆に、タンパク質の不溶化物の形成反応を引き起こし、前記不溶化物が、タンパク質由来樹脂として利用できることを見出し、本発明に到達した。
【００１１】
本発明の方法によれば、原料とするタンパク質に応じて、さまざまな不溶化反応を起こすことができるから、新規な樹脂を製造できる。そして、この樹脂は、タンパク質由来であるから、生分解性プラスチック又はその材料として使用できる。また、前記不溶化反応は、タンパク質が溶解した水溶液を亜臨界条件とすることだけで起こり、その反応時間も数分以内に短くすることができる簡便な方法であるから、前記樹脂や生分解性プラスチックの製造コストを低減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
タンパク質を含む水溶液を亜臨界水処理すると、異なる２つの反応が起こる。第１の反応は、タンパク質の変性、凝集、重合及び架橋を含む不溶化反応であり、第２の反応は、前記不溶化反応により形成された不溶化物が低分子化される分解反応である。亜臨界水処理の初期段階においては、前記第１の不溶化反応が優勢である。そして、その後に前記第２の分解反応が、前記第１の反応よりも優勢となり、合成された不溶化物を分解する。したがって、前記第２の分解反応が優勢となる前に亜臨界水処理を止めることで、前記第１の不溶化反応により合成された不溶化物を、分解されて減少する前に回収することができる。本発明の方法は、本発明者らが初めて見出したこれらの知見に基づくものである。
【００１３】
前記第１の反応におけるタンパク質を不溶化する反応とは、タンパク質が、亜臨界水処理後に不溶化物となる反応であって、タンパク質の間の様々な結合を含む反応である。前記結合は、特に制限されず、例えば、ジスルフィド結合等のタンパク質間の共有結合や、水素・イオン・ファンデルワールス結合等のタンパク質間の非共有結合があげられる。前記結合は、共有結合であることが好ましい。さらに、前記結合は、タンパク質がアンフォールディングされ互いに絡まりあうことによる物理的な結合も含む。前記第２の分解反応は、前記不溶化物が低分子化される反応であって、前記低分子化は、例えば、加水分解等によるものと考えられる。
【００１４】
本発明で使用するタンパク質は、特に制限されず、いずれのタンパク質も使用でき、例えば、水溶性タンパク質全般があげられる。入手の容易さ、コスト等の点から、本発明で使用するタンパク質としては、アルブミン、コラーゲン等があげられる。前記アルブミンの種類は、特に制限されず、例えば、血清アルブミン、オボアルブミン、ラクトアルブミンの他、植物由来のアルブミンであってもよい。また、本発明で使用するタンパク質は、単一種類であってもよく、数種類のタンパク質の混合物であってもよい。
【００１５】
次に、本発明の方法における亜臨界水処理について説明する。前記亜臨界水処理の工程は、例えば、バッチ式で行ってもよく、連続式で行っても良い。バッチ式で行う場合、例えば、ステンレス鋼等の材質から形成された耐圧耐熱反応器に、原料となる前記タンパク質を含む水を入れて密閉し、この反応器を所定の反応温度に加熱して前記反応器内を高温高圧とすれば、前記反応器内部の水が亜臨界水となり、内部のタンパク質の不溶化反応を開始させることができる。なお、必要に応じて、反応器内部に加える前記水に、例えば、酸やアルカリ、アルコール等を加えてもよい。前記反応の停止は、例えば、前記反応器を急冷することにより行うことができる。急冷後の前記反応器の内部には、前記樹脂と水相とが含まれることになるが、これらは、例えば、遠心分離等により、前記樹脂を分離することができる。
【００１６】
亜臨界水とは、一般に、臨界点（３７４.３℃、２２.１ＭＰａ）より低い温度又は圧力の水をいう。なお、亜臨界水の温度、圧力の下限値は、通常、定義されないが、本発明においては、タンパク質の前記不溶化反応が起こりうる温度、圧力であって、例えば、１２７℃、０．２７ＭＰａである。
【００１７】
本発明の方法において、前記亜臨界水処理の反応温度は、例えば、前記第１の不溶化反応が起こる温度以上、前記第２の分解反応が過剰とならない温度以下であって、例えば、１２７℃以上３００℃以下であって、好ましくは、１６０℃以上２９０℃以下であって、より好ましくは、１８０℃以上２８０℃以下であり、さらにより好ましくは、２００℃以上２７５℃以下である。
【００１８】
また、前記亜臨界水処理の反応時間は、前記第１の不溶化反応により不溶化物の合成が開始され、かつ、前記第２の分解反応が活性化するまでの時間であることが好ましく、例えば、０秒を超え２０分以下であって、好ましくは、１０秒以上１０分以下であって、より好ましくは、１５秒以上５分以下であり、さらにより好ましくは、３０秒以上１分以下である。
【００１９】
前記亜臨界水処理の反応圧力は、例えば、０．０２７ＭＰａ以上２８ＭＰａ以下であって、好ましくは、０．５ＭＰａ以上１５ＭＰａ以下であり、より好ましくは、１ＭＰａ以上１０ＭＰａ以下であり、さらにより好ましくは、１.５ＭＰａ以上１０ＭＰａ以下である。なお、バッチ式で亜臨界水処理を行う場合には、閉式反応器を使用するため、内部の圧力は、飽和水蒸気圧に従うこととなる。
【００２０】
本発明のタンパク質由来の樹脂の製造方法は、本発明の方法によりタンパク質を不溶化する工程を含む製造方法である。前記不溶化の工程で得られる不溶化物が、本発明のタンパク質由来の樹脂となる。
【００２１】
次に、本発明の樹脂について説明する。本発明の樹脂は、上述のとおり、タンパク質を亜臨界水処理して不溶化する工程を含む製造方法により合成される樹脂である。前記亜臨界水処理に際して、単一又は複数種類のタンパク質に、さらに、他の組成物を加えてもよい。加える前記組成物としては、特に制限されないが、例えば、改質を目的とした組成物であって、例えば、糖や脂質、有機化合物が挙げられる。
【００２２】
本発明の樹脂は、タンパク質由来の樹脂であるから、生分解性である。したがって、本発明の樹脂は、例えば、後述する生分解性プラスチック等に利用できる。その場合、亜臨界水処理に際して加える前記組成物も、生分解性であることが好ましい。
【００２３】
本発明の樹脂の加工は、特に制限されないが、例えば、以下の方法で行うことができる。まず、亜臨界水処理して合成された本発明の樹脂を乾燥させたのち、グラインドしてパウダー状とする。次に、このパウダーを、例えば、水と混合させて混合物を調製し、この混合物を、例えば、金型に埋め込んだり、塗布したりする。そして、金型に合わせてプレスして成形を行う。前記混合物における本発明の樹脂のパウダーと水との割合は、特に制限されず、例えば、前記混合物の粘度等に応じて適宜調節できる。また、前記プレスは、加熱プレスであってもよく、常温のプレスであってもよい。前記混合物の塗膜の厚みは、特に制限されないが、例えば、１ｍｍ〜４ｍｍである。プレスの圧力は、特に制限されず、加工後に必要な厚みに応じて調節できるが、例えば、０を超え４０ＭＰａ以下であって、好ましくは、１５〜３０ＭＰａであって、より好ましくは、２０〜２５ＭＰａである。プレスの時間としては、例えば、１５〜６０分であって、好ましくは、３０〜５０であって、より好ましくは、３０〜４０分である。また、加熱する場合、その温度としては、例えば、８０〜１５０℃であって、好ましくは、８０〜１３０℃であって、より好ましくは、１００℃〜１２０℃である。
【００２４】
本発明の樹脂の加工の際には、例えば、改質剤を使用できる。前記改質剤は、加工後の本発明の樹脂の硬度、耐久性、柔軟性等の特性を調整するために使用される。その使用方法は、特に制限されないが、例えば、前記パウダーと水との混合物を調製する際に、前記改質剤を添加する方法が挙げられる。前記改質剤としては、特に制限されないが、例えば、グリセリン、スターチ、コラーゲン、ケナフ、ポリ乳酸等が挙げられる。前記改質剤の添加量としては、特に制限されないが、例えば、前記混合物における水以外の重量に対して、０を超え７０重量％以下であり、好ましくは、０を超え５０重量％以下であり、より好ましくは、０を越え３０重量％以下である。なお、本発明の樹脂を生分解性プラスチックとして使用する場合、前記改質剤も生分解性であることが好ましい。
【００２５】
本発明の樹脂は、他の樹脂の改質剤として使用してもよい。本発明の樹脂は、本来生分解性であるから、例えば、他の生分解性プラスチックへ改質剤として用いてもよい。
【００２６】
本発明の生分解性プラスチックは、本発明の樹脂のみからなる、または、本発明の樹脂を生分解性プラスチック材料の一つとして含む生分解性プラスチックである。本発明の生分解性プラスチックは、例えば、農業用マルチ、外科用インプラント、産業包装、ラップ、乳製品の包装（ｓａｃｈｅｔ）、フードサービス、日常生活介護、製薬、医療機器等の分野に適用できる。
【００２７】
本発明の生分解性プラスチック製品は、本発明の生分解性プラスチックを利用した製品であり、例えば、本発明の生分解性プラスチックを成形したり、積層したりして得られる製品である。本発明の生分解性プラスチック製品も、上述の様々な分野に適用できる。
【００２８】
以下に、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
本実施例では、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を原料タンパク質として、本発明の方法を用いてＢＳＡ樹脂を合成し、このＢＳＡ樹脂のキャラクタライゼーションを行った。
【００３０】
（ＢＳＡ）
前記原料タンパク質のＢＳＡは、市販の精製ＢＳＡ（和光純薬工業株式会社製）を使用した。以下で使用する他の薬品類も同様に市販のものを使用した。なお、前記ＢＳＡは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）において確認したところ均質的であり、また、その含水量が５％であった。
【００３１】
（反応器）
亜臨界水処理のためのバッチ式反応器として、ステンレス鋼（材質：ＳＵＳ３１６製）のパイプの両端にそれぞれキャップ（ＳＷＡＧＥＬＯＫ社製）を取り付けた反応器を作製した。前記反応器を、前記パイプの内径を変えて２つ作製したところ、内容積は、それぞれ９.０ｃｍ3及び３４ｃｍ3であった。
【００３２】
（反応試料）
反応器に充填する反応試料は、前記精製ＢＳＡを、純水（Ｍｉｌｌｉ-Ｑ（ミリポア社製）で処理した水、以下同じ。）に溶解して調製した。特に言及しない場合、ＢＳＡ濃度は、１６０ｇ／Ｌである。
【００３３】
（亜臨界水処理によるＢＳＡ樹脂の合成）
亜臨界水処理は、以下のように行った。まず、前記反応器に反応試料を充填し、密閉する。次に、この反応器を所定温度（例えば、１２７℃〜３００℃）で安定しているソルトバス（Ｔｈｏｍａｓ Ｋａｇａｋｕ Ｃｏ.Ｌｔｄ.製）に投入し、所定時間の後、前記反応器を、前記ソルトバスからすみやかに取り出し、大量の冷却水中に投入して急冷した。なお、この亜臨界水処理においては、前記ソルトバスの温度を反応温度、前記反応器が前記ソルトバス内にある時間を反応時間とした。前記急冷後、不溶性固体と水相とからなる反応生成物を前記反応器から回収し、５０ｍｌの純水に稀釈後、室温、３，０００ ｇ、１５分で遠心分離した。上澄み液を取り除き、ミリポアメンブレン（孔径２.２×１０-7ｍ、ミリポア社製）により不溶性固形成分として合成されたＢＳＡ樹脂を分離した。
【００３４】
（反応温度と反応時間の関係）
亜臨界水処理時の反応温度及び反応時間が、ＢＳＡ樹脂の収率に与える影響を確認した。その結果を図１に示す。同図に示すとおり、反応温度及び反応時間の増加とともに、生成されるＢＳＡ樹脂の収率が減少した。
【００３５】
次に、反応開始から５秒、１０秒及び１５秒後における反応後の水相中のＢＳＡタンパク質の濃度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。その結果を図２に示す。同図に示すとおり、亜臨界水処理後僅か１０秒から１５秒でＢＳＡタンパク質のバンドが消滅し、水相におけるＢＳＡタンパク質のほとんどがＢＳＡ樹脂に変換されたことが確認された。
【００３６】
（ＢＳＡ樹脂の電子顕微鏡観察）
前記ＢＳＡ樹脂の性質を確認するため、２００℃及び２５０℃で０.５分反応させて合成したＢＳＡ樹脂、並びに、天然（未処理）ＢＳＡについてＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）観察した。前記ＳＥＭは、ＪＥＯＬ６７００電界放出ＳＥＭ（ＪＥＯＬ Ｉｎｃ.製）を使用した。観察試料は、乾燥させた前記ＢＳＡ樹脂を固形試料として使用し、その他については、製造業者の取扱い説明書にしたがって行った。その結果の一例を図３に示す。同図に示すとおり、ＢＳＡ樹脂（図３Ｂ，Ｃ）と天然ＢＳＡ（図３Ａ）とは、一見して区別できた。また、２００℃で合成されたＢＳＡ樹脂では、ＢＳＡが、細い紐からなる多孔性の相互接続ネットワークを形成するように凝集していた（図３Ｂ）。他方、２５０℃で合成されたＢＳＡ樹脂では、ＢＳＡが、より大きな塊を形成するように凝集していた（図３Ｃ）。
【００３７】
（元素成分分析）
ＢＳＡ樹脂及び天然ＢＳＡの炭素、窒素、硫黄の各元素成分の割合を、ＣＨＮＳコーダ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＪａｐａｎ製、商品名：ＰＥ２４００ＳｅｒｉｅｓＩＩ）を用いて測定した。測定試料は、天然ＢＳＡ及び２００℃〜３００℃、０.５分〜１.５分で合成されたＢＳＡ樹脂を使用した。前記測定試料は、測定前に、７５℃のオーブンで２日間乾燥させた。その結果の一例を図４に示す。同図に示すとおり、０.５分の段階では、全ての温度で変化がなかったが、３００℃のＢＳＡ樹脂の場合、１.０分後に、窒素の含有量が減少し、炭素及び硫黄の含有量が増加した。これは、３００℃のＢＳＡ樹脂では、反応１.０分後に既に加水分解が始まっていることを示す。
【００３８】
（ＢＳＡの結合形成）
ＢＳＡ樹脂において形成される結合を、ＦＴ-ＩＲ分光法により確認した。ＢＳＡ樹脂試料のＩＲスペクトルは、ＦＴ/ＩＲ-４１０フーリエ変換赤外線分光器（ＪＡＳＣＯ ＣＯ.Ｌｔｄ.製）により記録した。ＩＲ解析の固形試料は、ＫＢｒパウダーとともに圧縮成形して調製した。前記固形試料として、天然ＢＳＡ及び２５０℃、０.５分及び２０分で合成したＢＳＡ樹脂を使用した。その結果の一例を図５に示す。同図に示すとおり、天然ＢＳＡのＩＲスペクトルの特徴と、２５０℃、０.５分のＢＳＡ樹脂のそれとは、同一であった。このことは、前記ＢＳＡ樹脂が、天然ＢＳＡから、新たな結合形成や結合切断をすることなく、結合されたものであることを示す。また、２５０℃２０分のＢＳＡ樹脂のＩＲスペクトルからは、タンパク質構造の劇的な変形が読み取れた。すなわち、８１５〜５６０ｃｍ-1及び７１０〜６９５ｃｍ-1の-Ｒ-Ｏ-Ｎ-結合を示すピーク、並びに、６９０〜６８５ｃｍ-1の-ＣＳ-ＳＳ-ＣＳ-結合を示すピークが現れた。
【００３９】
以上の結果から、ＢＳＡ樹脂を合成する好ましい条件は、２００℃〜２７５℃で０.５分〜１分であることが示された。
【００４０】
（反応開始時のＢＳＡ濃度）
反応試料のＢＳＡ濃度を、５〜１６０ｇ/Ｌの範囲で変化させて、２５０℃、１分の条件でＢＳＡ樹脂を合成した。その結果の一例を図７Ａに示す。同図に示すとおり、反応開始時の濃度が、上記範囲のどの濃度にであっても、不溶化反応が起こり、樹脂が合成されることが示された。なお、５０ｇ/Ｌは、ＢＳＡの一般的な血清中の濃度である。また、図７Ｂに、それぞれのＢＳＡ濃度における収率を示す。同図に示すとおり、ＢＳＡ濃度が高くなるにつれ収率は落ちてはいるものの、いずれの濃度においても非常に高い収率を示した。
【００４１】
（ＢＳＡ樹脂対する反応温度の影響）
所定の温度で形成されたＢＳＡ樹脂への熱流（ｈｅａｔ ｆｌｏｗ）を、ＤＳＣ（示差走査熱量計、商品名：ＤＳＣ ６２００、セイコーインストルメント社製）で測定した。スキャンレートは、５℃/ｍｉｎに設定し、較正試料として、インジウム（ΔＨ＝２８.５Ｊ/ｇ、Ｔｍ＝１５６℃）を使用した。測定試料として、天然ＢＳＡ並びに２００、２５０、２７５及び３００℃、１分で合成したＢＳＡ樹脂を使用した。測定は、製造業者の取扱い説明書に従い行った。ＤＳＣによれば、熱により誘導されてタンパク質分子構造が溶解や変性する変換点（転移温度）が、スペクトルのピークとして検出できる。前記測定の結果、天然ＢＳＡの転移温度が６６℃であったのに対して、２００、２５０、２７５及び３００℃のＢＳＡ樹脂の転移温度は、それぞれ、６６、７７、７８及び８５.５℃であり、ＢＳＡ樹脂の合成反応温度が高くなるほど、転移温度が高くなった。このことから、反応温度が高くなるほど、ＢＳＡ樹脂の結合力、すなわち、架橋の程度が大きくなることが示された。
【００４２】
（最大吸水度）
ＢＳＡ樹脂の最大吸水度の測定は、乾燥させたＢＳＡ樹脂を３日間４℃で純水中に浸し平衡最大吸収に達したところで重量を測定し、乾燥時の重量に対する増加分の重量の割合として算出することで行った。２００、２５０、２７５及び３００℃のＢＳＡ樹脂の最大吸水度の結果の一例を図８に示す。同図に示すとおり、ＢＳＡの不溶化反応温度が高くなるほど、ＢＳＡ樹脂の最大吸水度が減少した。
【００４３】
（機械的性質）
ＢＳＡ樹脂の機械的性質を、一軸方向の引張試験を行い確認した。測定装置は、１００ｋＮのスタティックロードセル（ＡＳＴＭ Ｄ６３８）を備えた商品名Ｉｎｓｔｒｏｎ ５５８２を用いた。測定試料は、１０ｍｍ×１５ｍｍ×４０ｍｍの大きさに調製した、最大吸水状態の２５０℃及び２７５℃のＢＳＡ樹脂、並びに、６０％の乾燥状態の２７５℃のＢＳＡ樹脂を用いた。測定は、室温、１０ｍｍ/分の引張り速度で行った。その応力・歪み曲線の一例を図９に示す。同図に示すとおり、全ての試料において、降伏点まで応力と歪みとは直線の比例関係であり、降伏点を過ぎると、応力が減少し、破断するまで歪みが増加した。また、全ての試料において、塑性を示す部分が少なかったが、特に、６０％乾燥試料において顕著であった。２５０及び２７５℃の最大吸水試料の平均降伏強さは、それぞれ、０.０２６ＭＰａ及び０.０２４ＭＰａであり、平均引張り弾性率は、それぞれ、０.００１６及び０.００１４であった。６０％乾燥試料は、前記最大吸水試料よりも剛性が高く、平均降伏強さ及び平均引張り弾性率は、それぞれ、０.０６ＭＰａ及び０.００３２であった。
【００４４】
（変性剤等に対する溶解度）
ＢＳＡ樹脂の変性剤に対する溶解度を確認した。乾燥させたＢＳＡ樹脂をグラインドしてパウダー状にし、下記１〜５に示す溶液に混合し、溶解したタンパク質を測定した。タンパク濃度は、分光光度計（商品名：ＵＶ-２１００、島津製作所製）を用いて、ε＝０.５５(ｇ/Ｌ)-1ｃｍ-1として、波長２７９ｎｍで測定した。
１：水
２：６Ｍ 尿素
３：６Ｍ グアニジン塩酸
４：６Ｍ 尿素 ＋ ２０ｍＭ ＥＤＴＡ ＋ ０.２Ｍ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）
５：６Ｍ グアニジン塩酸 ＋ ２０ｍＭ ＥＤＴＡ ＋ ０.２Ｍ ＤＴＴ
その結果、ＢＳＡ樹脂は、１の水には、不溶であり、２及び３の尿素及びグアニジン塩酸には、１０％未満の溶解度であった。そして、４及び５に対しては、８０％以上の溶解度を示した。尿素やグアニジン塩酸は、水の構造を壊すことによって、水等の極性溶媒に対する非極性物質の溶解を促進することができる。ＢＳＡ樹脂が、尿素やグアニジン塩酸に対して難溶性を示したことから、ＢＳＡ樹脂の合成における重合には、例えば、ジスルフィド結合等のタンパク分子間の共有結合が関与していることが確認できた。
【実施例２】
【００４５】
（合成したＢＳＡ樹脂の加工）
２５０℃、１分の条件で合成したＢＡＳ樹脂を乾燥させてグラインドして得たＢＳＡ樹脂のパウダーを用いて、ＢＳＡ樹脂を板状に成形した。まず、前記ＢＳＡ樹脂パウダー１００重量部に対し、水を１５０重量部混合してペースト状の混合物を調製した。次に、前記混合物を平らに塗布した後、１２０℃、２０ＭＰａ、３０分の熱プレスを行い、板状に加工されたＢＳＡ樹脂を得た。加工前のＢＳＡ樹脂と加工後のＢＳＡ樹脂についてＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）観察した結果を図１０に示す。図１０Ａは、加工前のＢＳＡ樹脂、図１０Ｂは、加工後のＢＳＡ樹脂のＳＥＭ写真である。これらの図に示すとおり、加工後には、ＢＳＡ樹脂が均一化されたことが分かる。
【実施例３】
【００４６】
（改質剤を用いたＢＳＡ樹脂の加工）
前記ＢＳＡ樹脂パウダーを１００重量部使用することに代えて、改質剤としてグリセリン及び／又はスターチを１０又は２５重量％含むＢＳＡ樹脂パウダーを１００重量部使用した他は、実施例２と同様にして加工し、板状のＢＳＡ樹脂を得た。得られた加工ＢＳＡ樹脂について、一軸方向の引張試験を行い、機械的性質を確認した。測定装置は、１００ｋＮのスタティックロードセル（ＡＳＴＭ Ｄ６３８）を備えた商品名Ｉｎｓｔｒｏｎ ５５８２を用いた。その結果を下記表１に示す。
【００４７】
（表１）
試料 ＢＳＡ樹脂 スターチ グリセリン 水 引張応力 引張歪み 伸び
番号 ｗｔ％ ｗｔ％ ｗｔ％ ｗｔ％ ＭＰａ ％ ｍｍ
１ １００ ０ ０ １５０ １２.７ １.７ １
２ ９０ ０ １０ １５０ １０.３ ４.４ ２.４
３ ７５ ０ ２５ １５０ ８.０ ７.８ ４.７
４ ９０ １０ ０ １５０ ８.６ １.３ ０.５
５ ７５ ２５ ０ １５０ ０.６ ２.８ １.７
６ ８０ １０ １０ １５０ ５.８ １.２ ０.７
【００４８】
上記表１に示すとおり、ＢＳＡ樹脂の加工時に改質剤を添加することで、添加剤を加えない場合（試料番号１）に比べ、加工後のＢＳＡ樹脂の機械的性質（引張応力、引張歪み等）が調整できることが確認できた（試料番号２〜６）。また、グリセリンは、特に、ＢＳＡ樹脂に柔軟性を付与する効果が顕著であった（試料番号２及び３）。
【実施例４】
【００４９】
（メタン発酵菌によるＢＳＡ樹脂の分解）
ＢＳＡ樹脂の生分解性を示すため、ＢＳＡ樹脂試料を発酵培地に加えて嫌気条件下で培養し、ＢＳＡ樹脂が分解されることによって発生するメタンガス（ＣＨ4）を測定した。
【００５０】
前記ＢＳＡ樹脂試料は、実施例２で得られた約１.１ｇの板状の加工ＢＳＡ樹脂を使用した。また、発酵培地は、京都府下の分解業者が使用している発酵培地を５ｍｌ使用した。培養は、オートサンプラー（パーキンエルマー社製、２０−ＣＶ）のバイアルに、嫌気性雰囲気下（Ｎ2/ＣＯ2 ８０/２０ vol./vol.）で前記ＢＳＡ樹脂試料及び発酵培地を入れてシールし、３７℃で培養した。培養中、前記バイアル上部の空間から気密シリンジで０．５ｍｌのサンプルを回収し、ガスクロマトグラフィー（島津製作所製 ＧＣ-８ＡＰＴ）により、ＣＨ4、Ｃｏ2、及びＮ2の濃度を測定した。培養後、１日、４日〜７日後のＣＨ4及びＣｏ2の測定結果を図１１に示す。同図において、コントロールは、ＢＳＡ樹脂試料を加えない以外は上述の条件と同様に培養した結果である。
【００５１】
同図に示すように、ＢＳＡ樹脂試料と発酵培地とを培養した場合、４〜７日後の試料からメタンガスの発生が認められた。この結果は、ＢＳＡ樹脂が、生分解性であることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
以上説明したとおり、本発明によれば、タンパク質由来の生分解性プラスチックを製造できるから、本発明は、例えば、農業用マルチ等の農業分野、外科用インプラント、生体吸収性物質等の医薬・医療分野、コンポスト化、資源リサイクル等の資源保護、環境保全の分野等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、亜臨界水処理における反応温度とＢＳＡ樹脂の収率との関係の一例を示すグラフである。
【図２】図２は、亜臨界水処理における反応開始から所定時間後の水相の電気泳動パターンの一例を示す写真である。
【図３】図３Ａ〜Ｃは、それぞれ、天然ＢＳＡ、ＢＳＡ樹脂（２００℃）及びＢＳＡ樹脂（２５０℃）のＳＥＭ観察写真の一例である。
【図４】図４Ａ〜Ｃは、それぞれ、ＢＳＡ樹脂の炭素、窒素、硫黄の含有量測定結果の一例を示すグラフである。
【図５】図５は、ＦＴ-ＩＲ分光法によりＢＳＡ樹脂を測定した結果の一例を示すグラフである。
【図６】図６は、反応初期段階における水相中のタンパク質濃度を測定した結果の一例を示すグラフである。
【図７】図７Ａは、反応に用いたＢＳＡ量を変化させた場合に得られるＢＳＡ樹脂の収量の一例を示す写真であり、図７Ｂは、その収率を測定した結果の一例である。
【図８】図８は、所定温度で合成されたＢＳＡ樹脂と最大吸水率度との関係の一例を示すグラフである。
【図９】図９は、ＢＳＡ樹脂の応力・歪み曲線の一例を示すグラフである。
【図１０】図１０Ａ及びＢは、それぞれ、加工前のＢＳＡ樹脂及び加工後のＢＳＡ樹脂のＳＥＭ観察写真の一例である。
【図１１】図１１は、メタン発酵菌によるＢＳＡ樹脂の分解の一例を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の不溶化方法、タンパク質由来樹脂の製造方法、並びに、タンパク質由来の樹脂及び生分解性プラスチックに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の石油関連プラスチックの継続的及び拡大的使用にともない、石油関連プラスチック廃棄物が増加し、このことが、埋立て地不足の加速や、固形廃棄物処理の焼却処分にともなう深刻な公害問題を引き起こしている。例えば、石油関連プラスチック廃棄物は、自然界では分解されにくいため長期間残存し、例えば、後述のようにして、生態系を乱す。すなわち、水や空気を通さない石油関連プラスチック廃棄物は、土壌の肥沃状態を減退させ、その他の物質の分解をも阻害し、地下水源を枯渇させ、動物の生態に危険を及ぼす。また、海中においては、石油関連プラスチック廃棄物は、海生動物を窒息させたり、絡ませたりして、彼等の生存に影響を及ぼす。また、日本やヨーロッパ等の多くの国々では、埋立てに使用できる場所がほとんど残されておらず、石油関連プラスチック廃棄物を含む固形廃棄物の処理問題の重要性が、ますます増大している。それゆえ、環境に安全かつ容易に処分できるプラスチック材料を製造することには、非常に多くの利点がある。
【０００３】
適切な環境に置かれた場合に著しい構造変化（主として、分子量の減少）を受けるポリマーは、環境分解型ポリマー(ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ)とよばれる（ＡＳＴＭ Ｄ８８３）。この環境分解型ポリマーは、以下の４つに分類することができる。
（１）生分解性 ：微生物の作用により、定量的にＣＯ2及びＨ2Ｏ又はＣＨ4及びＨ2Ｏのいずれかに変換されるポリマー。
（２）加水分解性：加水分解のプロセスにより分解されるポリマー。
（３）光分解性 ：光と酸素との総合作用により分解されるポリマー。
（４）酸化分解性：酸化分解プロセスにより分解されるポリマー。
【０００４】
これらの環境分解型ポリマーを大量生産し、既存の石油関連プラスチックの代替とすることは、石油や天然ガス等の再利用ができない資源の保護に役立ち、廃棄物問題の解決に寄与することとなる。環境分解型プラスチックは、例えば、農業用マルチ、外科用インプラント、産業包装、ラップ、乳製品の包装（ｓａｃｈｅｔ）、フードサービス、日常生活介護、製薬及び医療機器等の分野に適用できる。
【０００５】
生分解性の環境分解型ポリマー（生分解性プラスチック）は、例えば、以下のように、３つに分類することができる（非特許文献１参照）。
（１）微生物産生系：糖等を原料として微生物の体内に蓄積させるタイプ。ポリヒドロキシブチレート等。
（２）天然物系：バイオマスを利用したタイプ。澱粉、酢酸セルロース、キトサン等。
（３）化学合成系：モノマーを重合するタイプ。ポリ乳酸、ポリビニルアルコール等。
【０００６】
これらの中でも、前記化学合成系の生分解性プラスチックであるポリ乳酸は、バイオマスから抽出した澱粉を発酵等して利用するものであり、近年注目を集めている。しかし一方では、石油関連プラスチックに対抗するには高価すぎるという問題があり、費用効率に優れる新たな生分解性プラスチックやその製造方法についての技術が必要とされている。また、より多くの分野で生分解性プラスチックを利用できるよう、より多くの種類の生分解性プラスチックが必要とされている。
【０００７】
他方、タンパク質は、原則的には、生分解性であり、熱を加えることで変性し、凝集することが知られている。さらに、タンパク質の中には、ゲル化するものもある。例えば、コラーゲンは、アルカリ又は酸で処理することでゼラチンとなる。また、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）も、熱処理によってゲル化することが知られている（非特許文献２及び３参照）。しかしながら、これらの凝集物やゲルをプラスチックとして使用するには、例えば、強度が足りない等の問題がある。タンパク質をプラスチックとして利用するには、タンパク質のより強度な重合体マトリックスを形成させる必要がある。
【非特許文献１】生分解性プラスチック研究会、「生分解性プラスチックの本」、ｐ．２２−２３、日刊工業新聞社、２００４年８月３０日発行
【非特許文献２】Nakamura, T. et al. "Interaction during heat induced gelatin in a mixed system of soybean 7S and 11S globulins" Agric. Biol. Chem. Vol. 50, PP. 2429-2435, 1986
【非特許文献３】Kitabatake, N. et al. "Rheological properties of heat induced ovalbumin gels prepared by two-step and one-step heating methods." J. Food Sci. Vol. 54, PP. 1632-1638, 1989
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、タンパク質の不溶化方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明のタンパク質の不溶化方法は、タンパク質を亜臨界水処理して不溶化する工程を含む方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明者等は、さまざまな組成物に対する亜臨界水処理の作用について鋭意研究を重ね、その結果、従来であれば、主に、組成物の分解や低分子化を目的として使用されていた亜臨界水処理が、逆に、タンパク質の不溶化物の形成反応を引き起こし、前記不溶化物が、タンパク質由来樹脂として利用できることを見出し、本発明に到達した。
【００１１】
本発明の方法によれば、原料とするタンパク質に応じて、さまざまな不溶化反応を起こすことができるから、新規な樹脂を製造できる。そして、この樹脂は、タンパク質由来であるから、生分解性プラスチック又はその材料として使用できる。また、前記不溶化反応は、タンパク質が溶解した水溶液を亜臨界条件とすることだけで起こり、その反応時間も数分以内に短くすることができる簡便な方法であるから、前記樹脂や生分解性プラスチックの製造コストを低減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
タンパク質を含む水溶液を亜臨界水処理すると、異なる２つの反応が起こる。第１の反応は、タンパク質の変性、凝集、重合及び架橋を含む不溶化反応であり、第２の反応は、前記不溶化反応により形成された不溶化物が低分子化される分解反応である。亜臨界水処理の初期段階においては、前記第１の不溶化反応が優勢である。そして、その後に前記第２の分解反応が、前記第１の反応よりも優勢となり、合成された不溶化物を分解する。したがって、前記第２の分解反応が優勢となる前に亜臨界水処理を止めることで、前記第１の不溶化反応により合成された不溶化物を、分解されて減少する前に回収することができる。本発明の方法は、本発明者らが初めて見出したこれらの知見に基づくものである。
【００１３】
前記第１の反応におけるタンパク質を不溶化する反応とは、タンパク質が、亜臨界水処理後に不溶化物となる反応であって、タンパク質の間の様々な結合を含む反応である。前記結合は、特に制限されず、例えば、ジスルフィド結合等のタンパク質間の共有結合や、水素・イオン・ファンデルワールス結合等のタンパク質間の非共有結合があげられる。前記結合は、共有結合であることが好ましい。さらに、前記結合は、タンパク質がアンフォールディングされ互いに絡まりあうことによる物理的な結合も含む。前記第２の分解反応は、前記不溶化物が低分子化される反応であって、前記低分子化は、例えば、加水分解等によるものと考えられる。
【００１４】
本発明で使用するタンパク質は、特に制限されず、いずれのタンパク質も使用でき、例えば、水溶性タンパク質全般があげられる。入手の容易さ、コスト等の点から、本発明で使用するタンパク質としては、アルブミン、コラーゲン等があげられる。前記アルブミンの種類は、特に制限されず、例えば、血清アルブミン、オボアルブミン、ラクトアルブミンの他、植物由来のアルブミンであってもよい。また、本発明で使用するタンパク質は、単一種類であってもよく、数種類のタンパク質の混合物であってもよい。
【００１５】
次に、本発明の方法における亜臨界水処理について説明する。前記亜臨界水処理の工程は、例えば、バッチ式で行ってもよく、連続式で行っても良い。バッチ式で行う場合、例えば、ステンレス鋼等の材質から形成された耐圧耐熱反応器に、原料となる前記タンパク質を含む水を入れて密閉し、この反応器を所定の反応温度に加熱して前記反応器内を高温高圧とすれば、前記反応器内部の水が亜臨界水となり、内部のタンパク質の不溶化反応を開始させることができる。なお、必要に応じて、反応器内部に加える前記水に、例えば、酸やアルカリ、アルコール等を加えてもよい。前記反応の停止は、例えば、前記反応器を急冷することにより行うことができる。急冷後の前記反応器の内部には、前記樹脂と水相とが含まれることになるが、これらは、例えば、遠心分離等により、前記樹脂を分離することができる。
【００１６】
亜臨界水とは、一般に、臨界点（３７４.３℃、２２.１ＭＰａ）より低い温度又は圧力の水をいう。なお、亜臨界水の温度、圧力の下限値は、通常、定義されないが、本発明においては、タンパク質の前記不溶化反応が起こりうる温度、圧力であって、例えば、１２７℃、０．２７ＭＰａである。
【００１７】
本発明の方法において、前記亜臨界水処理の反応温度は、例えば、前記第１の不溶化反応が起こる温度以上、前記第２の分解反応が過剰とならない温度以下であって、例えば、１２７℃以上３００℃以下であって、好ましくは、１６０℃以上２９０℃以下であって、より好ましくは、１８０℃以上２８０℃以下であり、さらにより好ましくは、２００℃以上２７５℃以下である。
【００１８】
また、前記亜臨界水処理の反応時間は、前記第１の不溶化反応により不溶化物の合成が開始され、かつ、前記第２の分解反応が活性化するまでの時間であることが好ましく、例えば、０秒を超え２０分以下であって、好ましくは、１０秒以上１０分以下であって、より好ましくは、１５秒以上５分以下であり、さらにより好ましくは、３０秒以上１分以下である。
【００１９】
前記亜臨界水処理の反応圧力は、例えば、０．０２７ＭＰａ以上２８ＭＰａ以下であって、好ましくは、０．５ＭＰａ以上１５ＭＰａ以下であり、より好ましくは、１ＭＰａ以上１０ＭＰａ以下であり、さらにより好ましくは、１.５ＭＰａ以上１０ＭＰａ以下である。なお、バッチ式で亜臨界水処理を行う場合には、閉式反応器を使用するため、内部の圧力は、飽和水蒸気圧に従うこととなる。
【００２０】
本発明のタンパク質由来の樹脂の製造方法は、本発明の方法によりタンパク質を不溶化する工程を含む製造方法である。前記不溶化の工程で得られる不溶化物が、本発明のタンパク質由来の樹脂となる。
【００２１】
次に、本発明の樹脂について説明する。本発明の樹脂は、上述のとおり、タンパク質を亜臨界水処理して不溶化する工程を含む製造方法により合成される樹脂である。前記亜臨界水処理に際して、単一又は複数種類のタンパク質に、さらに、他の組成物を加えてもよい。加える前記組成物としては、特に制限されないが、例えば、改質を目的とした組成物であって、例えば、糖や脂質、有機化合物が挙げられる。
【００２２】
本発明の樹脂は、タンパク質由来の樹脂であるから、生分解性である。したがって、本発明の樹脂は、例えば、後述する生分解性プラスチック等に利用できる。その場合、亜臨界水処理に際して加える前記組成物も、生分解性であることが好ましい。
【００２３】
本発明の樹脂の加工は、特に制限されないが、例えば、以下の方法で行うことができる。まず、亜臨界水処理して合成された本発明の樹脂を乾燥させたのち、グラインドしてパウダー状とする。次に、このパウダーを、例えば、水と混合させて混合物を調製し、この混合物を、例えば、金型に埋め込んだり、塗布したりする。そして、金型に合わせてプレスして成形を行う。前記混合物における本発明の樹脂のパウダーと水との割合は、特に制限されず、例えば、前記混合物の粘度等に応じて適宜調節できる。また、前記プレスは、加熱プレスであってもよく、常温のプレスであってもよい。前記混合物の塗膜の厚みは、特に制限されないが、例えば、１ｍｍ〜４ｍｍである。プレスの圧力は、特に制限されず、加工後に必要な厚みに応じて調節できるが、例えば、０を超え４０ＭＰａ以下であって、好ましくは、１５〜３０ＭＰａであって、より好ましくは、２０〜２５ＭＰａである。プレスの時間としては、例えば、１５〜６０分であって、好ましくは、３０〜５０であって、より好ましくは、３０〜４０分である。また、加熱する場合、その温度としては、例えば、８０〜１５０℃であって、好ましくは、８０〜１３０℃であって、より好ましくは、１００℃〜１２０℃である。
【００２４】
本発明の樹脂の加工の際には、例えば、改質剤を使用できる。前記改質剤は、加工後の本発明の樹脂の硬度、耐久性、柔軟性等の特性を調整するために使用される。その使用方法は、特に制限されないが、例えば、前記パウダーと水との混合物を調製する際に、前記改質剤を添加する方法が挙げられる。前記改質剤としては、特に制限されないが、例えば、グリセリン、スターチ、コラーゲン、ケナフ、ポリ乳酸等が挙げられる。前記改質剤の添加量としては、特に制限されないが、例えば、前記混合物における水以外の重量に対して、０を超え７０重量％以下であり、好ましくは、０を超え５０重量％以下であり、より好ましくは、０を越え３０重量％以下である。なお、本発明の樹脂を生分解性プラスチックとして使用する場合、前記改質剤も生分解性であることが好ましい。
【００２５】
本発明の樹脂は、他の樹脂の改質剤として使用してもよい。本発明の樹脂は、本来生分解性であるから、例えば、他の生分解性プラスチックへ改質剤として用いてもよい。
【００２６】
本発明の生分解性プラスチックは、本発明の樹脂のみからなる、または、本発明の樹脂を生分解性プラスチック材料の一つとして含む生分解性プラスチックである。本発明の生分解性プラスチックは、例えば、農業用マルチ、外科用インプラント、産業包装、ラップ、乳製品の包装（ｓａｃｈｅｔ）、フードサービス、日常生活介護、製薬、医療機器等の分野に適用できる。
【００２７】
本発明の生分解性プラスチック製品は、本発明の生分解性プラスチックを利用した製品であり、例えば、本発明の生分解性プラスチックを成形したり、積層したりして得られる製品である。本発明の生分解性プラスチック製品も、上述の様々な分野に適用できる。
【００２８】
以下に、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
本実施例では、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を原料タンパク質として、本発明の方法を用いてＢＳＡ樹脂を合成し、このＢＳＡ樹脂のキャラクタライゼーションを行った。
【００３０】
（ＢＳＡ）
前記原料タンパク質のＢＳＡは、市販の精製ＢＳＡ（和光純薬工業株式会社製）を使用した。以下で使用する他の薬品類も同様に市販のものを使用した。なお、前記ＢＳＡは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）において確認したところ均質的であり、また、その含水量が５％であった。
【００３１】
（反応器）
亜臨界水処理のためのバッチ式反応器として、ステンレス鋼（材質：ＳＵＳ３１６製）のパイプの両端にそれぞれキャップ（ＳＷＡＧＥＬＯＫ社製）を取り付けた反応器を作製した。前記反応器を、前記パイプの内径を変えて２つ作製したところ、内容積は、それぞれ９.０ｃｍ3及び３４ｃｍ3であった。
【００３２】
（反応試料）
反応器に充填する反応試料は、前記精製ＢＳＡを、純水（Ｍｉｌｌｉ-Ｑ（ミリポア社製）で処理した水、以下同じ。）に溶解して調製した。特に言及しない場合、ＢＳＡ濃度は、１６０ｇ／Ｌである。
【００３３】
（亜臨界水処理によるＢＳＡ樹脂の合成）
亜臨界水処理は、以下のように行った。まず、前記反応器に反応試料を充填し、密閉する。次に、この反応器を所定温度（例えば、１２７℃〜３００℃）で安定しているソルトバス（Ｔｈｏｍａｓ Ｋａｇａｋｕ Ｃｏ.Ｌｔｄ.製）に投入し、所定時間の後、前記反応器を、前記ソルトバスからすみやかに取り出し、大量の冷却水中に投入して急冷した。なお、この亜臨界水処理においては、前記ソルトバスの温度を反応温度、前記反応器が前記ソルトバス内にある時間を反応時間とした。前記急冷後、不溶性固体と水相とからなる反応生成物を前記反応器から回収し、５０ｍｌの純水に稀釈後、室温、３，０００ ｇ、１５分で遠心分離した。上澄み液を取り除き、ミリポアメンブレン（孔径２.２×１０-7ｍ、ミリポア社製）により不溶性固形成分として合成されたＢＳＡ樹脂を分離した。
【００３４】
（反応温度と反応時間の関係）
亜臨界水処理時の反応温度及び反応時間が、ＢＳＡ樹脂の収率に与える影響を確認した。その結果を図１に示す。同図に示すとおり、反応温度及び反応時間の増加とともに、生成されるＢＳＡ樹脂の収率が減少した。
【００３５】
次に、反応開始から５秒、１０秒及び１５秒後における反応後の水相中のＢＳＡタンパク質の濃度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。その結果を図２に示す。同図に示すとおり、亜臨界水処理後僅か１０秒から１５秒でＢＳＡタンパク質のバンドが消滅し、水相におけるＢＳＡタンパク質のほとんどがＢＳＡ樹脂に変換されたことが確認された。
【００３６】
（ＢＳＡ樹脂の電子顕微鏡観察）
前記ＢＳＡ樹脂の性質を確認するため、２００℃及び２５０℃で０.５分反応させて合成したＢＳＡ樹脂、並びに、天然（未処理）ＢＳＡについてＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）観察した。前記ＳＥＭは、ＪＥＯＬ６７００電界放出ＳＥＭ（ＪＥＯＬ Ｉｎｃ.製）を使用した。観察試料は、乾燥させた前記ＢＳＡ樹脂を固形試料として使用し、その他については、製造業者の取扱い説明書にしたがって行った。その結果の一例を図３に示す。同図に示すとおり、ＢＳＡ樹脂（図３Ｂ，Ｃ）と天然ＢＳＡ（図３Ａ）とは、一見して区別できた。また、２００℃で合成されたＢＳＡ樹脂では、ＢＳＡが、細い紐からなる多孔性の相互接続ネットワークを形成するように凝集していた（図３Ｂ）。他方、２５０℃で合成されたＢＳＡ樹脂では、ＢＳＡが、より大きな塊を形成するように凝集していた（図３Ｃ）。
【００３７】
（元素成分分析）
ＢＳＡ樹脂及び天然ＢＳＡの炭素、窒素、硫黄の各元素成分の割合を、ＣＨＮＳコーダ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＪａｐａｎ製、商品名：ＰＥ２４００ＳｅｒｉｅｓＩＩ）を用いて測定した。測定試料は、天然ＢＳＡ及び２００℃〜３００℃、０.５分〜１.５分で合成されたＢＳＡ樹脂を使用した。前記測定試料は、測定前に、７５℃のオーブンで２日間乾燥させた。その結果の一例を図４に示す。同図に示すとおり、０.５分の段階では、全ての温度で変化がなかったが、３００℃のＢＳＡ樹脂の場合、１.０分後に、窒素の含有量が減少し、炭素及び硫黄の含有量が増加した。これは、３００℃のＢＳＡ樹脂では、反応１.０分後に既に加水分解が始まっていることを示す。
【００３８】
（ＢＳＡの結合形成）
ＢＳＡ樹脂において形成される結合を、ＦＴ-ＩＲ分光法により確認した。ＢＳＡ樹脂試料のＩＲスペクトルは、ＦＴ/ＩＲ-４１０フーリエ変換赤外線分光器（ＪＡＳＣＯ ＣＯ.Ｌｔｄ.製）により記録した。ＩＲ解析の固形試料は、ＫＢｒパウダーとともに圧縮成形して調製した。前記固形試料として、天然ＢＳＡ及び２５０℃、０.５分及び２０分で合成したＢＳＡ樹脂を使用した。その結果の一例を図５に示す。同図に示すとおり、天然ＢＳＡのＩＲスペクトルの特徴と、２５０℃、０.５分のＢＳＡ樹脂のそれとは、同一であった。このことは、前記ＢＳＡ樹脂が、天然ＢＳＡから、新たな結合形成や結合切断をすることなく、結合されたものであることを示す。また、２５０℃２０分のＢＳＡ樹脂のＩＲスペクトルからは、タンパク質構造の劇的な変形が読み取れた。すなわち、８１５〜５６０ｃｍ-1及び７１０〜６９５ｃｍ-1の-Ｒ-Ｏ-Ｎ-結合を示すピーク、並びに、６９０〜６８５ｃｍ-1の-ＣＳ-ＳＳ-ＣＳ-結合を示すピークが現れた。
【００３９】
以上の結果から、ＢＳＡ樹脂を合成する好ましい条件は、２００℃〜２７５℃で０.５分〜１分であることが示された。
【００４０】
（反応開始時のＢＳＡ濃度）
反応試料のＢＳＡ濃度を、５〜１６０ｇ/Ｌの範囲で変化させて、２５０℃、１分の条件でＢＳＡ樹脂を合成した。その結果の一例を図７Ａに示す。同図に示すとおり、反応開始時の濃度が、上記範囲のどの濃度にであっても、不溶化反応が起こり、樹脂が合成されることが示された。なお、５０ｇ/Ｌは、ＢＳＡの一般的な血清中の濃度である。また、図７Ｂに、それぞれのＢＳＡ濃度における収率を示す。同図に示すとおり、ＢＳＡ濃度が高くなるにつれ収率は落ちてはいるものの、いずれの濃度においても非常に高い収率を示した。
【００４１】
（ＢＳＡ樹脂対する反応温度の影響）
所定の温度で形成されたＢＳＡ樹脂への熱流（ｈｅａｔ ｆｌｏｗ）を、ＤＳＣ（示差走査熱量計、商品名：ＤＳＣ ６２００、セイコーインストルメント社製）で測定した。スキャンレートは、５℃/ｍｉｎに設定し、較正試料として、インジウム（ΔＨ＝２８.５Ｊ/ｇ、Ｔｍ＝１５６℃）を使用した。測定試料として、天然ＢＳＡ並びに２００、２５０、２７５及び３００℃、１分で合成したＢＳＡ樹脂を使用した。測定は、製造業者の取扱い説明書に従い行った。ＤＳＣによれば、熱により誘導されてタンパク質分子構造が溶解や変性する変換点（転移温度）が、スペクトルのピークとして検出できる。前記測定の結果、天然ＢＳＡの転移温度が６６℃であったのに対して、２００、２５０、２７５及び３００℃のＢＳＡ樹脂の転移温度は、それぞれ、６６、７７、７８及び８５.５℃であり、ＢＳＡ樹脂の合成反応温度が高くなるほど、転移温度が高くなった。このことから、反応温度が高くなるほど、ＢＳＡ樹脂の結合力、すなわち、架橋の程度が大きくなることが示された。
【００４２】
（最大吸水度）
ＢＳＡ樹脂の最大吸水度の測定は、乾燥させたＢＳＡ樹脂を３日間４℃で純水中に浸し平衡最大吸収に達したところで重量を測定し、乾燥時の重量に対する増加分の重量の割合として算出することで行った。２００、２５０、２７５及び３００℃のＢＳＡ樹脂の最大吸水度の結果の一例を図８に示す。同図に示すとおり、ＢＳＡの不溶化反応温度が高くなるほど、ＢＳＡ樹脂の最大吸水度が減少した。
【００４３】
（機械的性質）
ＢＳＡ樹脂の機械的性質を、一軸方向の引張試験を行い確認した。測定装置は、１００ｋＮのスタティックロードセル（ＡＳＴＭ Ｄ６３８）を備えた商品名Ｉｎｓｔｒｏｎ ５５８２を用いた。測定試料は、１０ｍｍ×１５ｍｍ×４０ｍｍの大きさに調製した、最大吸水状態の２５０℃及び２７５℃のＢＳＡ樹脂、並びに、６０％の乾燥状態の２７５℃のＢＳＡ樹脂を用いた。測定は、室温、１０ｍｍ/分の引張り速度で行った。その応力・歪み曲線の一例を図９に示す。同図に示すとおり、全ての試料において、降伏点まで応力と歪みとは直線の比例関係であり、降伏点を過ぎると、応力が減少し、破断するまで歪みが増加した。また、全ての試料において、塑性を示す部分が少なかったが、特に、６０％乾燥試料において顕著であった。２５０及び２７５℃の最大吸水試料の平均降伏強さは、それぞれ、０.０２６ＭＰａ及び０.０２４ＭＰａであり、平均引張り弾性率は、それぞれ、０.００１６及び０.００１４であった。６０％乾燥試料は、前記最大吸水試料よりも剛性が高く、平均降伏強さ及び平均引張り弾性率は、それぞれ、０.０６ＭＰａ及び０.００３２であった。
【００４４】
（変性剤等に対する溶解度）
ＢＳＡ樹脂の変性剤に対する溶解度を確認した。乾燥させたＢＳＡ樹脂をグラインドしてパウダー状にし、下記１〜５に示す溶液に混合し、溶解したタンパク質を測定した。タンパク濃度は、分光光度計（商品名：ＵＶ-２１００、島津製作所製）を用いて、ε＝０.５５(ｇ/Ｌ)-1ｃｍ-1として、波長２７９ｎｍで測定した。
１：水
２：６Ｍ 尿素
３：６Ｍ グアニジン塩酸
４：６Ｍ 尿素 ＋ ２０ｍＭ ＥＤＴＡ ＋ ０.２Ｍ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）
５：６Ｍ グアニジン塩酸 ＋ ２０ｍＭ ＥＤＴＡ ＋ ０.２Ｍ ＤＴＴ
その結果、ＢＳＡ樹脂は、１の水には、不溶であり、２及び３の尿素及びグアニジン塩酸には、１０％未満の溶解度であった。そして、４及び５に対しては、８０％以上の溶解度を示した。尿素やグアニジン塩酸は、水の構造を壊すことによって、水等の極性溶媒に対する非極性物質の溶解を促進することができる。ＢＳＡ樹脂が、尿素やグアニジン塩酸に対して難溶性を示したことから、ＢＳＡ樹脂の合成における重合には、例えば、ジスルフィド結合等のタンパク分子間の共有結合が関与していることが確認できた。
【実施例２】
【００４５】
（合成したＢＳＡ樹脂の加工）
２５０℃、１分の条件で合成したＢＡＳ樹脂を乾燥させてグラインドして得たＢＳＡ樹脂のパウダーを用いて、ＢＳＡ樹脂を板状に成形した。まず、前記ＢＳＡ樹脂パウダー１００重量部に対し、水を１５０重量部混合してペースト状の混合物を調製した。次に、前記混合物を平らに塗布した後、１２０℃、２０ＭＰａ、３０分の熱プレスを行い、板状に加工されたＢＳＡ樹脂を得た。加工前のＢＳＡ樹脂と加工後のＢＳＡ樹脂についてＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）観察した結果を図１０に示す。図１０Ａは、加工前のＢＳＡ樹脂、図１０Ｂは、加工後のＢＳＡ樹脂のＳＥＭ写真である。これらの図に示すとおり、加工後には、ＢＳＡ樹脂が均一化されたことが分かる。
【実施例３】
【００４６】
（改質剤を用いたＢＳＡ樹脂の加工）
前記ＢＳＡ樹脂パウダーを１００重量部使用することに代えて、改質剤としてグリセリン及び／又はスターチを１０又は２５重量％含むＢＳＡ樹脂パウダーを１００重量部使用した他は、実施例２と同様にして加工し、板状のＢＳＡ樹脂を得た。得られた加工ＢＳＡ樹脂について、一軸方向の引張試験を行い、機械的性質を確認した。測定装置は、１００ｋＮのスタティックロードセル（ＡＳＴＭ Ｄ６３８）を備えた商品名Ｉｎｓｔｒｏｎ ５５８２を用いた。その結果を下記表１に示す。
【００４７】
（表１）
試料 ＢＳＡ樹脂 スターチ グリセリン 水 引張応力 引張歪み 伸び
番号 ｗｔ％ ｗｔ％ ｗｔ％ ｗｔ％ ＭＰａ ％ ｍｍ
１ １００ ０ ０ １５０ １２.７ １.７ １
２ ９０ ０ １０ １５０ １０.３ ４.４ ２.４
３ ７５ ０ ２５ １５０ ８.０ ７.８ ４.７
４ ９０ １０ ０ １５０ ８.６ １.３ ０.５
５ ７５ ２５ ０ １５０ ０.６ ２.８ １.７
６ ８０ １０ １０ １５０ ５.８ １.２ ０.７
【００４８】
上記表１に示すとおり、ＢＳＡ樹脂の加工時に改質剤を添加することで、添加剤を加えない場合（試料番号１）に比べ、加工後のＢＳＡ樹脂の機械的性質（引張応力、引張歪み等）が調整できることが確認できた（試料番号２〜６）。また、グリセリンは、特に、ＢＳＡ樹脂に柔軟性を付与する効果が顕著であった（試料番号２及び３）。
【実施例４】
【００４９】
（メタン発酵菌によるＢＳＡ樹脂の分解）
ＢＳＡ樹脂の生分解性を示すため、ＢＳＡ樹脂試料を発酵培地に加えて嫌気条件下で培養し、ＢＳＡ樹脂が分解されることによって発生するメタンガス（ＣＨ4）を測定した。
【００５０】
前記ＢＳＡ樹脂試料は、実施例２で得られた約１.１ｇの板状の加工ＢＳＡ樹脂を使用した。また、発酵培地は、京都府下の分解業者が使用している発酵培地を５ｍｌ使用した。培養は、オートサンプラー（パーキンエルマー社製、２０−ＣＶ）のバイアルに、嫌気性雰囲気下（Ｎ2/ＣＯ2 ８０/２０ vol./vol.）で前記ＢＳＡ樹脂試料及び発酵培地を入れてシールし、３７℃で培養した。培養中、前記バイアル上部の空間から気密シリンジで０．５ｍｌのサンプルを回収し、ガスクロマトグラフィー（島津製作所製 ＧＣ-８ＡＰＴ）により、ＣＨ4、Ｃｏ2、及びＮ2の濃度を測定した。培養後、１日、４日〜７日後のＣＨ4及びＣｏ2の測定結果を図１１に示す。同図において、コントロールは、ＢＳＡ樹脂試料を加えない以外は上述の条件と同様に培養した結果である。
【００５１】
同図に示すように、ＢＳＡ樹脂試料と発酵培地とを培養した場合、４〜７日後の試料からメタンガスの発生が認められた。この結果は、ＢＳＡ樹脂が、生分解性であることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
以上説明したとおり、本発明によれば、タンパク質由来の生分解性プラスチックを製造できるから、本発明は、例えば、農業用マルチ等の農業分野、外科用インプラント、生体吸収性物質等の医薬・医療分野、コンポスト化、資源リサイクル等の資源保護、環境保全の分野等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、亜臨界水処理における反応温度とＢＳＡ樹脂の収率との関係の一例を示すグラフである。
【図２】図２は、亜臨界水処理における反応開始から所定時間後の水相の電気泳動パターンの一例を示す写真である。
【図３】図３Ａ〜Ｃは、それぞれ、天然ＢＳＡ、ＢＳＡ樹脂（２００℃）及びＢＳＡ樹脂（２５０℃）のＳＥＭ観察写真の一例である。
【図４】図４Ａ〜Ｃは、それぞれ、ＢＳＡ樹脂の炭素、窒素、硫黄の含有量測定結果の一例を示すグラフである。
【図５】図５は、ＦＴ-ＩＲ分光法によりＢＳＡ樹脂を測定した結果の一例を示すグラフである。
【図６】図６は、反応初期段階における水相中のタンパク質濃度を測定した結果の一例を示すグラフである。
【図７】図７Ａは、反応に用いたＢＳＡ量を変化させた場合に得られるＢＳＡ樹脂の収量の一例を示す写真であり、図７Ｂは、その収率を測定した結果の一例である。
【図８】図８は、所定温度で合成されたＢＳＡ樹脂と最大吸水率度との関係の一例を示すグラフである。
【図９】図９は、ＢＳＡ樹脂の応力・歪み曲線の一例を示すグラフである。
【図１０】図１０Ａ及びＢは、それぞれ、加工前のＢＳＡ樹脂及び加工後のＢＳＡ樹脂のＳＥＭ観察写真の一例である。
【図１１】図１１は、メタン発酵菌によるＢＳＡ樹脂の分解の一例を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を不溶化する方法であって、タンパク質を亜臨界水処理して不溶化する工程を含む方法。
【請求項２】
さらに、亜臨界水処理後に処理物を急冷する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が、水溶性タンパク質を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記亜臨界水処理の温度が、１２７℃〜３００℃であり、圧力が、０．２７ＭＰａ〜２８ＭＰａである請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記亜臨界水処理の反応時間が、０秒を超え２０分以下である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
タンパク質由来の樹脂の製造方法であって、請求項１から５のいずれかに記載の方法によりタンパク質を不溶化する工程を含む製造方法。
【請求項７】
請求項６に記載の製造方法により製造されるタンパク質由来の樹脂。
【請求項８】
タンパク質の不溶化物の製造方法であって、請求項１から５のいずれかに記載の方法によりタンパク質を不溶化する工程を含む製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載の製造方法により製造されるタンパク質の不溶化物。
【請求項１０】
請求項７に記載の樹脂及び請求項９に記載の不溶化物の少なくとも一方を含む生分解性プラスチック。
【請求項１１】
さらに、改質剤を含む請求項１０に記載の生分解性プラスチック。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の生分解性プラスチックを用いて成形及び積層の少なくとも一方をすることにより得られる生分解性プラスチック製品。
【請求項１】
タンパク質を不溶化する方法であって、タンパク質を亜臨界水処理して不溶化する工程を含む方法。
【請求項２】
さらに、亜臨界水処理後に処理物を急冷する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が、水溶性タンパク質を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記亜臨界水処理の温度が、１２７℃〜３００℃であり、圧力が、０．２７ＭＰａ〜２８ＭＰａである請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記亜臨界水処理の反応時間が、０秒を超え２０分以下である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
タンパク質由来の樹脂の製造方法であって、請求項１から５のいずれかに記載の方法によりタンパク質を不溶化する工程を含む製造方法。
【請求項７】
請求項６に記載の製造方法により製造されるタンパク質由来の樹脂。
【請求項８】
タンパク質の不溶化物の製造方法であって、請求項１から５のいずれかに記載の方法によりタンパク質を不溶化する工程を含む製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載の製造方法により製造されるタンパク質の不溶化物。
【請求項１０】
請求項７に記載の樹脂及び請求項９に記載の不溶化物の少なくとも一方を含む生分解性プラスチック。
【請求項１１】
さらに、改質剤を含む請求項１０に記載の生分解性プラスチック。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の生分解性プラスチックを用いて成形及び積層の少なくとも一方をすることにより得られる生分解性プラスチック製品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００６−２１３６４１（Ｐ２００６−２１３６４１Ａ）
【公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２８０６６（Ｐ２００５−２８０６６）
【出願日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【出願人】（８０１００００６１）財団法人大阪産業振興機構 (168)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【出願人】（８０１００００６１）財団法人大阪産業振興機構 (168)
【Ｆターム（参考）】
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