フェロセン修飾抗体
【課題】総電流値の高いフェロセン修飾抗体を提供すること
【解決手段】一般式(化２) Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ （ＮＨＳ：Ｎ‐Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ）または一般式(化３) Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ、または一般式（化４) Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳで表されるフェロセン化合物を、抗体のリシン残基にアミド結合によって結合させた構造であって、アミド基、ＰＥＧ鎖を介して抗体に電子メディエーターであるフェロセンが結合していることを特徴とするフェロセン修飾抗体を用いることによって高い総電流値を獲得できる。
【解決手段】一般式(化２) Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ （ＮＨＳ：Ｎ‐Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ）または一般式(化３) Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ、または一般式（化４) Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳで表されるフェロセン化合物を、抗体のリシン残基にアミド結合によって結合させた構造であって、アミド基、ＰＥＧ鎖を介して抗体に電子メディエーターであるフェロセンが結合していることを特徴とするフェロセン修飾抗体を用いることによって高い総電流値を獲得できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体にフェロセン化合物を修飾した、フェロセン修飾抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素、微生物、抗体といった生体関連物質が有する分子識別機能を利用して、特異的な分子計測を行うバイオセンサの一般的な基本構成は、測定対象物質を特異的に認識する識別素子と、生体関連物質や微生物等が引き起こす物理化学的な現象を電気信号に変換する信号変換素子とからなっている。そのため、測定対象物質を抗体によって認識して捉え、反応した抗体量を、電気応答性を有するフェロセンで検出するバイオセンサにおいては、フェロセンが抗体に結合したフェロセン修飾抗体が必要となる。
【０００３】
フェロセン修飾抗体と測定対象物質である抗原との結合活性の低下を抑えるため、予め活性基であるスクシンイミド基が導入され、さらに抗体への導入効率を上げるためにフェロセンと活性基の間にスペーサーとしてアルキル鎖が導入された一般式（化１）Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐(ＣＨ2)5‐ＣＯ‐ＮＨＳ （ＮＨＳ：Ｎ‐Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ）で表されるＦｅｒｒｏｃｅｎｅ ａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒ（ｅｍｐ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ製）を修飾した抗体が考えられる（ 例えば、非特許文献１ 参照）。
【０００４】
【化１】
【０００５】
しかしながらこの修飾抗体の場合、アルキル鎖及びフェロセンの可溶性が低いため、修飾されたフェロセンの数が増加するにつれて抗体の回収率が低下し、最終的に得られる総電流値は増加しないという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第８７／０６００７号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｉｌａｄ Ｐｉｐｅｒｂｅｒｇ， Ｏｆｅｒ Ｉ． Ｗｉｌｎｅｒ， Ｏｍｅｒ Ｙｅｈｅｚｋｅｌｉ， Ｒａｎ Ｔｅｌ‐Ｖｅｒｅｄ， ａｎｄ Ｉｔａｍａｒ Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｔｈｅ Ｈｅｂｒｅｗ ＵｎｉＶｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ， Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ ９１９０４, Ｉｓｒａｅｌ Ｒｅｃｅｉｖｅｄ Ｊａｎｕａｒｙ ２９， ２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
高感度のバイオセンサを作製する場合、フェロセンの修飾数を増加させることで低濃度の抗体の電流値を測定することが可能となる。しかしながら上記のようなフェロセン修飾抗体を合成した場合、アルキル鎖及びフェロセンの可溶性が低いため、溶液中で修飾できるフェロセンの数には限界があり、修飾数を増加させると抗体の回収率も低下した。そのため一定量の抗体にフェロセン化合物を修飾した場合に得られるフェロセン修飾抗体の総電流値（フェロセンの修飾数と抗体の回収率を加味した値）を増加させることは困難であった。そこで、本発明はフェロセンの修飾数を増加させてもフェロセン修飾抗体の回収率が低下するのを抑え、高い総電流値を得ることができるフェロセン修飾抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記従来の課題を解決するために、本発明では、一般式(化２) Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ （ＮＨＳ：Ｎ‐Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ）で表されるフェロセン化合物を、抗体のリシン残基にアミド結合によって結合させた構造であって、アミド基、ＰＥＧ鎖を介して抗体に電子メディエーターであるフェロセンが結合していることを特徴とするフェロセン修飾抗体、もしくは一般式(化３) Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ （ＮＨＳ：Ｎ‐Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ）で表されるフェロセン化合物を、抗体のリシン残基にアミド結合によって結合させた構造であって、アミド基、ＰＥＧ鎖を介して抗体に電子メディエーターであるフェロセンが結合していることを特徴とするフェロセン修飾抗体、もしくは一般式(化４)Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ （ＮＨＳ：Ｎ‐Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ）で表されるフェロセン化合物を、抗体のリシン残基にアミド結合によって結合させた構造であって、アミド基、ＰＥＧ鎖を介して抗体に電子メディエーターであるフェロセンが結合していることを特徴とするフェロセン修飾抗体を用いることによって、ＰＥＧ鎖部分の分極率が増加して水溶性も増加することができる。
【００１０】
【化２】
【００１１】
【化３】
【００１２】
【化４】
【００１３】
この作用によりフェロセン修飾抗体の可溶性低下による変性を抑えることができるため、フェロセン修飾抗体の回収率を維持しながらフェロセンの修飾数を増加させことができる。
【発明の効果】
【００１４】
本フェロセン修飾抗体を用いることによって、フェロセンの修飾数を増加させても抗体の損失が少なく、高い総電流値を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の各工程を示す模式図
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、実施の形態を用いて、フェロセン修飾抗体の合成方法について説明する。
【００１７】
（実施の形態１）
図１は本実施の形態１におけるにフェロセン化合物を修飾する工程を模式的に表した図である。図１（ａ）に示すように、抗体１を緩衝液中に分散させておく。次に、図１（ｂ）に示すように、有機溶媒中に溶解させたＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ２を図１（ａ）に示す抗体１が分散した緩衝液中に混合し、３０分以上攪拌して結合させ、図１（ｂ）に示すようなフェロセン修飾抗体３を得る。
【００１８】
図１（ｂ）に示す緩衝液中には、フェロセン修飾抗体３の他に、抗体１と結合しなかった未反応のＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ２が存在する。このＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ２を図１（ｃ）に示すように、脱塩処理によって分離する。また、緩衝液を変えたい場合はここで同時に目的の緩衝液へ交換し、必要に応じて濃縮を行う。
【００１９】
上記と同様の方法で、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳを抗体に修飾したフェロセン修飾抗体も得ることができる。
【００２０】
なお、反応に用いる緩衝液は、カップリング効率を著しく低下させる１級アミノ基（‐ＮＨ2）をもつ物質が混入していない、中性付近の生体用緩衝液であれば特に限定はしない。
【００２１】
また、修飾物質を修飾する抗体は測定対象物質を特異的に結合することが可能なものであれば、特に限定されない。例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤのいずれの抗体のサブクラスであってもよく、これらの混合物であってもよい。また、抗体の由来動物種に関しても、特に限定されないが、ウサギ、ヤギ、マウス由来の抗体が比較的入手も容易であり、使用例も多いため、好ましい。
【００２２】
なお、本実施の形態における抗体濃度は、低濃度の場合は濃縮などの作業数が増え、また高濃度の場合は抗体の凝集がおきやすいことから、０．２ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬであることが好ましい。
【００２３】
なお、本実施の形態における抗体１とＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ２との反応時の温度はスクシンイミド基の活性時間を考慮すると、４℃〜室温であることが好ましい。また、反応時間および攪拌速度は特に制限されないが、目的とする修飾数によって調整する必要がある。
【００２４】
なお、未反応のＦｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒ２は、0.5 Mの1級アミノ基（‐ＮＨ2）を持つ低分子化合物（モノエタノールアミン、グリシン、トリスなど） 、0.5 M ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）によって、回収前に不活性化させておくとより好ましい。
【００２５】
なお、脱塩処理は、透析、限外ろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー、脱塩カラム、沈殿/再懸濁によって行うことができる。
【００２６】
次に、以下に示す方法で、上記の方法で合成したフェロセン修飾抗体の評価を行う。まず、ＢＣＡ法またはＢｒａｄｆｏｒｄ法によって溶液中の抗体濃度を測定する。次に、電気化学測定装置によりサイクリックボルタンメトリー（以下、ＣＶと省略）測定を行う。ＣＶ測定は参照電極およびカウンター電極、作用電極を用いる３極構成で行う。この結果より、電流値が最も大きくなるピーク電流値を測定することができる。そして、それぞれのフェロセン修飾抗体のピーク電流値、タンパク濃度、抗体量をかけた値を比較し、総電流値の比較を行うことができる。
【００２７】
なお、フェロセン修飾抗体溶液の濃度は、抗体の塩基性アミノ酸への結合を利用して計測するＢｒａｄｆｏｒｄ法では、リシン残基に結合したフェロセン化合物の影響によってフェロセンの修飾数が増加するほど測定結果に誤差が生じる可能性があるため、ＢＣＡ法の方がより好ましい。
【００２８】
なお、電気化学測定で使用する作用電極は、測定対象酸化還元種の酸化還元電位が、電極の有する電位窓の範囲内に位置するものであれば特に限定されない。対極は作用電極の電子の授受を損ねないもの及び面積であれば、特に限定されない。また、参照電極も特に限定されない。
【００２９】
以下に実施例を示し、本発明を詳しく説明する。これら実施例は例示であり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００３０】
実施例１ Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体の合成
０．２ｍｇ／ｍｌの抗ＨＳＡマウスモノクローナルＩｇＧ1抗体（以下、抗ＨＳＡ抗体と省略）溶液５ｍｌをｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（０．２Ｍ ＮａＨＣＯ3, ０．５Ｍ ＮａＣｌ, ｐＨ８．３）を用いて調整する。次に、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳが２２２．３ｍＭ（ＤＭＳＯ最終濃度が３％、抗ＨＳＡ抗体に対するフェロセン化合物の最終混合濃度比が２００倍の場合）となるようにＤＭＳＯに溶解させ、このフェロセン溶液１５０μＬを上記抗ＨＳＡ抗体溶液に加える。室温で１時間攪拌させてフェロセンを抗ＨＳＡ抗体に結合させる。１時間後同様にＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳをＤＭＳＯに溶解させた２２２．３ｍＭのフェロセン溶液１５０μＬを上記溶液にさらに加えて１時間攪拌させて修飾し、修飾数を増加させる。攪拌後、１０ｍＭ リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）（以下、ＰＢＳと略す）で平衡化したＰＤ１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）に上記抗ＨＳＡ抗体溶液を２．５ｍＬ流し、さらに３．５ｍＬのＰＢＳを流して溶出する溶液を回収する。これにより、ＰＢＳにバッファーを交換すると共に、抗ＨＳＡ抗体と結合しなかった未反応のフェロセンを取り除く。最後にアミコン（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社製、３０Ｋ）を用いて限外ろ過を行い、未反応のフェロセン化合物を完全に取り除く。
【００３１】
合成後、フェロセン修飾抗ＨＳＡ抗体の濃度をＢＣＡ法によって計測し、全て１ｍｇ／ｍｌに調整する。
【００３２】
実施例２ Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ-ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐（ＣＨ2）2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体の合成
０．２ｍｇ／ｍｌの抗ＨＳＡ抗体溶液５ｍｌをｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（０．２Ｍ ＮａＨＣＯ3, ０．５Ｍ ＮａＣｌ, ｐＨ８．３）を用いて調整する。次に、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳが２２２．３ｍＭ（ＤＭＳＯ最終濃度が３％、抗ＨＳＡ抗体に対するフェロセン化合物の最終混合濃度比が２００倍の場合）となるようにＤＭＳＯに溶解させ、このフェロセン溶液１５０μＬを上記抗ＨＳＡ抗体溶液に加える。室温で１時間攪拌させてフェロセンを抗ＨＳＡ抗体に結合させる。１時間後同様にＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳをＤＭＳＯに溶解させた２２２．３ｍＭのフェロセン溶液１５０μＬを上記溶液にさらに加えて１時間攪拌させて修飾し、修飾数を増加させる。攪拌後、ＰＢＳで平衡化したＰＤ１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）に上記抗体溶液を２．５ｍＬ流し、さらに３．５ｍＬのＰＢＳバッファーを流して溶出する溶液を回収する。これにより、ＰＢＳにバッファーを交換すると共に、抗ＨＳＡ抗体と結合しなかった未反応のフェロセン化合物を取り除く。最後にアミコン（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社製、３０Ｋ）を用いて限外ろ過を行い、未反応のフェロセンを完全に取り除く。
【００３３】
合成後、フェロセン修飾抗ＨＳＡ抗体の濃度をＢＣＡ法によって計測し、全て１ｍｇ／ｍｌに調整する。
【００３４】
実施例３ Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐（ＣＨ2）2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体の合成
２ｍｇ／ｍｌの抗ＨＳＡ抗体溶液５ｍｌをｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３, ０．５Ｍ ＮａＣｌ, ｐＨ８．３）を用いて調整する。次に、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳが２２２．３ｍＭ（ＤＭＳＯ最終濃度が３％、抗ＨＳＡ抗体に対するフェロセン化合物の最終混合濃度比が２００倍の場合）となるようにＤＭＳＯに溶解させ、このフェロセン溶液１５０μＬを上記抗ＨＳＡ抗体溶液に加える。室温で１時間攪拌させてフェロセンを抗ＨＳＡ抗体に結合させる。1時間後同様にＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳをＤＭＳＯに溶解させた２２２．３ｍＭのフェロセン溶液１５０μＬを上記溶液にさらに加えて１時間攪拌させて修飾し、修飾数を増加させる。攪拌後、ＰＢＳで平衡化したＰＤ１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）に上記抗体溶液を２．５ｍＬ流し、さらに３．５ｍＬのＰＢＳバッファーを流して溶出する溶液を回収する。これにより、PBSにバッファーを交換すると共に、抗ＨＳＡ抗体と結合しなかった未反応のフェロセンを取り除く。最後にアミコン（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社製、３０Ｋ）を用いて限外ろ過を行い、未反応のフェロセン化合物を完全に取り除く。
【００３５】
合成後、フェロセン修飾抗ＨＳＡ抗体の濃度をＢＣＡ法によって計測し、全て１ｍｇ／ｍｌに調整する。
【００３６】
実施例４ フェロセン修飾抗体の電気化学測定
１ｍｇ／ｍＬに調整したＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体溶液、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ-ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐（ＣＨ2）2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体溶液、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体溶液をそれぞれ、電気化学測定装置によってＣＶ測定を行った。電気化学測定装置には電気化学アナライザー（ＡＬＳモデル６６０Ａ、ＢＡＳ社）を使用する。なお、参照電極にＡｇ／ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ)（ＲＥ‐１Ｃ 参照電極、ＢＡＳ社製）、カウンター電極に白金電極（ＶＣ‐２用Ｐｔカウンター電極、ＢＡＳ社製）作用電極に金電極（ＳＡＵＥ金電極、外径３．０ｍｍ、内径１．６ｍｍ 、ＢＡＳ社製）を用いる３極構成とし、２５℃で測定を行う。ＶＣ‐２ ボルタンメトリー用セルにＰＢＳを１０ｍＬ入れ、ＶＣ‐２用テフロン（登録商標）キャップに参照電極およびカウンター電極をセットする。測定前に作用電極を研磨用アルミナ(ＢＡＳ社製、ＰＫ‐３セル研磨キット）で研磨する。ケーブルの接続リード線を作用電極、カウンター電極、参照電極にそれぞれつなぐ。フェロセン溶液をサンプルホルダー（９ｍｍφ、ＢＡＳ社製）に１００μＬ入れて上記キャップにセットし、金電極を測定対象の溶液中に入れて、ポテンシャルスイーパーによって作用電極の電位（０〜６００ｍＶ）を走査速度１０ｍＶ／分で掃引して電流を測定し、電流−電位曲線を得る。抗体に対する混合濃度比が１２０倍および２００倍の条件で合成を行ったＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2）5‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐（ＣＨ2）2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体それぞれのＣＶ測定を行い、またベースラインとしてフェロセンを修飾していない１ｍｇ／ｍＬの抗ＨＳＡ抗体溶液も同様にＣＶ測定を行った。そして、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2）5‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)3‐（ＣＨ2）2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体のそれぞれのサイクリックボルタモグラムからベースラインを差し引き、抗ＨＳＡ抗体に結合したフェロセンのピーク電流値をそれぞれ算出した。Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、およびＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体溶液では走査電位が０．４８Ｖのとき酸化反応のピーク電流となり、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体溶液では、走査電位が０．２３５Ｖのとき酸化反応のピーク電流となる。
【００３７】
比較例１
実施例１〜実施例３の方法と同様に、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ ａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒを抗体に対する混合濃度比２００倍で抗ＨＳＡ抗体に修飾を行い、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2）5‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体を得た。ＢＣＡ法によりフェロセン修飾抗ＨＳＡ抗体の濃度を測定し、１ｍｇ／ｍｌに調整した溶液を実施例４と同様にＣＶ測定を行い、ベースラインを差し引いたサイクリックボルタモグラムからピークの電流値を算出した。
【００３８】
実施例５
比較例１におけるＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2）5‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体の抗体回収率を１とし、実施例１〜３におけるＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐（ＣＨ2）2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体の抗体回収率をそれぞれ比較した結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】
表１より、同条件で合成を行った場合、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2）5‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体と比較して、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体は２．７倍、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体は１．６倍、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐（ＣＨ2）2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体は２．６倍の抗体を獲得することができることがわかる。
【００４１】
また、抗体の総電流値は、最終的に得られる溶液の量を同一にした場合のピーク電流値の値で比較することができる。溶液中の抗体濃度と電流値は比例するため、抗体濃度が一定の条件で測定したときに得られる電流値と抗体の回収率をかけた値でも比較することができる。Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2）5‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体の総電流量を１としたときの、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐（ＣＨ2）2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体の総電流値の値をそれぞれ表２に示す。
【００４２】
【表２】
【００４３】
表２より、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2）5‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体と比較して、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体は３．４倍、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体は２倍、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐（ＣＨ2）2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体は１．７倍の総電流値を獲得することができた。
【００４４】
以上よりＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐（ＣＨ2）2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体を用いることによって、フェロセンの修飾数を増加させても抗体の損失が少なく、高い総電流値を得ることができるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明によるフェロセン修飾抗体は、高い総電流値を得ることができ、抗体の特異的相互作用を利用したバイオセンサにおける修飾抗体として有用である。また、医学、薬学、生物学、化学、食品学等の諸分野における免疫反応測定抗体等の用途にも応用できる。
【符号の説明】
【００４６】
１ 抗ＨＳＡマウスモノクローナル抗体
２ Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ
３ Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体にフェロセン化合物を修飾した、フェロセン修飾抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素、微生物、抗体といった生体関連物質が有する分子識別機能を利用して、特異的な分子計測を行うバイオセンサの一般的な基本構成は、測定対象物質を特異的に認識する識別素子と、生体関連物質や微生物等が引き起こす物理化学的な現象を電気信号に変換する信号変換素子とからなっている。そのため、測定対象物質を抗体によって認識して捉え、反応した抗体量を、電気応答性を有するフェロセンで検出するバイオセンサにおいては、フェロセンが抗体に結合したフェロセン修飾抗体が必要となる。
【０００３】
フェロセン修飾抗体と測定対象物質である抗原との結合活性の低下を抑えるため、予め活性基であるスクシンイミド基が導入され、さらに抗体への導入効率を上げるためにフェロセンと活性基の間にスペーサーとしてアルキル鎖が導入された一般式（化１）Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐(ＣＨ2)5‐ＣＯ‐ＮＨＳ （ＮＨＳ：Ｎ‐Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ）で表されるＦｅｒｒｏｃｅｎｅ ａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒ（ｅｍｐ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ製）を修飾した抗体が考えられる（ 例えば、非特許文献１ 参照）。
【０００４】
【化１】
【０００５】
しかしながらこの修飾抗体の場合、アルキル鎖及びフェロセンの可溶性が低いため、修飾されたフェロセンの数が増加するにつれて抗体の回収率が低下し、最終的に得られる総電流値は増加しないという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第８７／０６００７号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｉｌａｄ Ｐｉｐｅｒｂｅｒｇ， Ｏｆｅｒ Ｉ． Ｗｉｌｎｅｒ， Ｏｍｅｒ Ｙｅｈｅｚｋｅｌｉ， Ｒａｎ Ｔｅｌ‐Ｖｅｒｅｄ， ａｎｄ Ｉｔａｍａｒ Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｔｈｅ Ｈｅｂｒｅｗ ＵｎｉＶｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ， Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ ９１９０４, Ｉｓｒａｅｌ Ｒｅｃｅｉｖｅｄ Ｊａｎｕａｒｙ ２９， ２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
高感度のバイオセンサを作製する場合、フェロセンの修飾数を増加させることで低濃度の抗体の電流値を測定することが可能となる。しかしながら上記のようなフェロセン修飾抗体を合成した場合、アルキル鎖及びフェロセンの可溶性が低いため、溶液中で修飾できるフェロセンの数には限界があり、修飾数を増加させると抗体の回収率も低下した。そのため一定量の抗体にフェロセン化合物を修飾した場合に得られるフェロセン修飾抗体の総電流値（フェロセンの修飾数と抗体の回収率を加味した値）を増加させることは困難であった。そこで、本発明はフェロセンの修飾数を増加させてもフェロセン修飾抗体の回収率が低下するのを抑え、高い総電流値を得ることができるフェロセン修飾抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記従来の課題を解決するために、本発明では、一般式(化２) Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ （ＮＨＳ：Ｎ‐Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ）で表されるフェロセン化合物を、抗体のリシン残基にアミド結合によって結合させた構造であって、アミド基、ＰＥＧ鎖を介して抗体に電子メディエーターであるフェロセンが結合していることを特徴とするフェロセン修飾抗体、もしくは一般式(化３) Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ （ＮＨＳ：Ｎ‐Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ）で表されるフェロセン化合物を、抗体のリシン残基にアミド結合によって結合させた構造であって、アミド基、ＰＥＧ鎖を介して抗体に電子メディエーターであるフェロセンが結合していることを特徴とするフェロセン修飾抗体、もしくは一般式(化４)Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ （ＮＨＳ：Ｎ‐Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ）で表されるフェロセン化合物を、抗体のリシン残基にアミド結合によって結合させた構造であって、アミド基、ＰＥＧ鎖を介して抗体に電子メディエーターであるフェロセンが結合していることを特徴とするフェロセン修飾抗体を用いることによって、ＰＥＧ鎖部分の分極率が増加して水溶性も増加することができる。
【００１０】
【化２】
【００１１】
【化３】
【００１２】
【化４】
【００１３】
この作用によりフェロセン修飾抗体の可溶性低下による変性を抑えることができるため、フェロセン修飾抗体の回収率を維持しながらフェロセンの修飾数を増加させことができる。
【発明の効果】
【００１４】
本フェロセン修飾抗体を用いることによって、フェロセンの修飾数を増加させても抗体の損失が少なく、高い総電流値を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の各工程を示す模式図
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、実施の形態を用いて、フェロセン修飾抗体の合成方法について説明する。
【００１７】
（実施の形態１）
図１は本実施の形態１におけるにフェロセン化合物を修飾する工程を模式的に表した図である。図１（ａ）に示すように、抗体１を緩衝液中に分散させておく。次に、図１（ｂ）に示すように、有機溶媒中に溶解させたＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ２を図１（ａ）に示す抗体１が分散した緩衝液中に混合し、３０分以上攪拌して結合させ、図１（ｂ）に示すようなフェロセン修飾抗体３を得る。
【００１８】
図１（ｂ）に示す緩衝液中には、フェロセン修飾抗体３の他に、抗体１と結合しなかった未反応のＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ２が存在する。このＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ２を図１（ｃ）に示すように、脱塩処理によって分離する。また、緩衝液を変えたい場合はここで同時に目的の緩衝液へ交換し、必要に応じて濃縮を行う。
【００１９】
上記と同様の方法で、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳを抗体に修飾したフェロセン修飾抗体も得ることができる。
【００２０】
なお、反応に用いる緩衝液は、カップリング効率を著しく低下させる１級アミノ基（‐ＮＨ2）をもつ物質が混入していない、中性付近の生体用緩衝液であれば特に限定はしない。
【００２１】
また、修飾物質を修飾する抗体は測定対象物質を特異的に結合することが可能なものであれば、特に限定されない。例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤのいずれの抗体のサブクラスであってもよく、これらの混合物であってもよい。また、抗体の由来動物種に関しても、特に限定されないが、ウサギ、ヤギ、マウス由来の抗体が比較的入手も容易であり、使用例も多いため、好ましい。
【００２２】
なお、本実施の形態における抗体濃度は、低濃度の場合は濃縮などの作業数が増え、また高濃度の場合は抗体の凝集がおきやすいことから、０．２ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬであることが好ましい。
【００２３】
なお、本実施の形態における抗体１とＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ２との反応時の温度はスクシンイミド基の活性時間を考慮すると、４℃〜室温であることが好ましい。また、反応時間および攪拌速度は特に制限されないが、目的とする修飾数によって調整する必要がある。
【００２４】
なお、未反応のＦｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒ２は、0.5 Mの1級アミノ基（‐ＮＨ2）を持つ低分子化合物（モノエタノールアミン、グリシン、トリスなど） 、0.5 M ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）によって、回収前に不活性化させておくとより好ましい。
【００２５】
なお、脱塩処理は、透析、限外ろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー、脱塩カラム、沈殿/再懸濁によって行うことができる。
【００２６】
次に、以下に示す方法で、上記の方法で合成したフェロセン修飾抗体の評価を行う。まず、ＢＣＡ法またはＢｒａｄｆｏｒｄ法によって溶液中の抗体濃度を測定する。次に、電気化学測定装置によりサイクリックボルタンメトリー（以下、ＣＶと省略）測定を行う。ＣＶ測定は参照電極およびカウンター電極、作用電極を用いる３極構成で行う。この結果より、電流値が最も大きくなるピーク電流値を測定することができる。そして、それぞれのフェロセン修飾抗体のピーク電流値、タンパク濃度、抗体量をかけた値を比較し、総電流値の比較を行うことができる。
【００２７】
なお、フェロセン修飾抗体溶液の濃度は、抗体の塩基性アミノ酸への結合を利用して計測するＢｒａｄｆｏｒｄ法では、リシン残基に結合したフェロセン化合物の影響によってフェロセンの修飾数が増加するほど測定結果に誤差が生じる可能性があるため、ＢＣＡ法の方がより好ましい。
【００２８】
なお、電気化学測定で使用する作用電極は、測定対象酸化還元種の酸化還元電位が、電極の有する電位窓の範囲内に位置するものであれば特に限定されない。対極は作用電極の電子の授受を損ねないもの及び面積であれば、特に限定されない。また、参照電極も特に限定されない。
【００２９】
以下に実施例を示し、本発明を詳しく説明する。これら実施例は例示であり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００３０】
実施例１ Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体の合成
０．２ｍｇ／ｍｌの抗ＨＳＡマウスモノクローナルＩｇＧ1抗体（以下、抗ＨＳＡ抗体と省略）溶液５ｍｌをｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（０．２Ｍ ＮａＨＣＯ3, ０．５Ｍ ＮａＣｌ, ｐＨ８．３）を用いて調整する。次に、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳが２２２．３ｍＭ（ＤＭＳＯ最終濃度が３％、抗ＨＳＡ抗体に対するフェロセン化合物の最終混合濃度比が２００倍の場合）となるようにＤＭＳＯに溶解させ、このフェロセン溶液１５０μＬを上記抗ＨＳＡ抗体溶液に加える。室温で１時間攪拌させてフェロセンを抗ＨＳＡ抗体に結合させる。１時間後同様にＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳをＤＭＳＯに溶解させた２２２．３ｍＭのフェロセン溶液１５０μＬを上記溶液にさらに加えて１時間攪拌させて修飾し、修飾数を増加させる。攪拌後、１０ｍＭ リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）（以下、ＰＢＳと略す）で平衡化したＰＤ１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）に上記抗ＨＳＡ抗体溶液を２．５ｍＬ流し、さらに３．５ｍＬのＰＢＳを流して溶出する溶液を回収する。これにより、ＰＢＳにバッファーを交換すると共に、抗ＨＳＡ抗体と結合しなかった未反応のフェロセンを取り除く。最後にアミコン（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社製、３０Ｋ）を用いて限外ろ過を行い、未反応のフェロセン化合物を完全に取り除く。
【００３１】
合成後、フェロセン修飾抗ＨＳＡ抗体の濃度をＢＣＡ法によって計測し、全て１ｍｇ／ｍｌに調整する。
【００３２】
実施例２ Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ-ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐（ＣＨ2）2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体の合成
０．２ｍｇ／ｍｌの抗ＨＳＡ抗体溶液５ｍｌをｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（０．２Ｍ ＮａＨＣＯ3, ０．５Ｍ ＮａＣｌ, ｐＨ８．３）を用いて調整する。次に、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳが２２２．３ｍＭ（ＤＭＳＯ最終濃度が３％、抗ＨＳＡ抗体に対するフェロセン化合物の最終混合濃度比が２００倍の場合）となるようにＤＭＳＯに溶解させ、このフェロセン溶液１５０μＬを上記抗ＨＳＡ抗体溶液に加える。室温で１時間攪拌させてフェロセンを抗ＨＳＡ抗体に結合させる。１時間後同様にＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳをＤＭＳＯに溶解させた２２２．３ｍＭのフェロセン溶液１５０μＬを上記溶液にさらに加えて１時間攪拌させて修飾し、修飾数を増加させる。攪拌後、ＰＢＳで平衡化したＰＤ１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）に上記抗体溶液を２．５ｍＬ流し、さらに３．５ｍＬのＰＢＳバッファーを流して溶出する溶液を回収する。これにより、ＰＢＳにバッファーを交換すると共に、抗ＨＳＡ抗体と結合しなかった未反応のフェロセン化合物を取り除く。最後にアミコン（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社製、３０Ｋ）を用いて限外ろ過を行い、未反応のフェロセンを完全に取り除く。
【００３３】
合成後、フェロセン修飾抗ＨＳＡ抗体の濃度をＢＣＡ法によって計測し、全て１ｍｇ／ｍｌに調整する。
【００３４】
実施例３ Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐（ＣＨ2）2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体の合成
２ｍｇ／ｍｌの抗ＨＳＡ抗体溶液５ｍｌをｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３, ０．５Ｍ ＮａＣｌ, ｐＨ８．３）を用いて調整する。次に、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳが２２２．３ｍＭ（ＤＭＳＯ最終濃度が３％、抗ＨＳＡ抗体に対するフェロセン化合物の最終混合濃度比が２００倍の場合）となるようにＤＭＳＯに溶解させ、このフェロセン溶液１５０μＬを上記抗ＨＳＡ抗体溶液に加える。室温で１時間攪拌させてフェロセンを抗ＨＳＡ抗体に結合させる。1時間後同様にＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳをＤＭＳＯに溶解させた２２２．３ｍＭのフェロセン溶液１５０μＬを上記溶液にさらに加えて１時間攪拌させて修飾し、修飾数を増加させる。攪拌後、ＰＢＳで平衡化したＰＤ１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）に上記抗体溶液を２．５ｍＬ流し、さらに３．５ｍＬのＰＢＳバッファーを流して溶出する溶液を回収する。これにより、PBSにバッファーを交換すると共に、抗ＨＳＡ抗体と結合しなかった未反応のフェロセンを取り除く。最後にアミコン（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社製、３０Ｋ）を用いて限外ろ過を行い、未反応のフェロセン化合物を完全に取り除く。
【００３５】
合成後、フェロセン修飾抗ＨＳＡ抗体の濃度をＢＣＡ法によって計測し、全て１ｍｇ／ｍｌに調整する。
【００３６】
実施例４ フェロセン修飾抗体の電気化学測定
１ｍｇ／ｍＬに調整したＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体溶液、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ-ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐（ＣＨ2）2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体溶液、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体溶液をそれぞれ、電気化学測定装置によってＣＶ測定を行った。電気化学測定装置には電気化学アナライザー（ＡＬＳモデル６６０Ａ、ＢＡＳ社）を使用する。なお、参照電極にＡｇ／ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ)（ＲＥ‐１Ｃ 参照電極、ＢＡＳ社製）、カウンター電極に白金電極（ＶＣ‐２用Ｐｔカウンター電極、ＢＡＳ社製）作用電極に金電極（ＳＡＵＥ金電極、外径３．０ｍｍ、内径１．６ｍｍ 、ＢＡＳ社製）を用いる３極構成とし、２５℃で測定を行う。ＶＣ‐２ ボルタンメトリー用セルにＰＢＳを１０ｍＬ入れ、ＶＣ‐２用テフロン（登録商標）キャップに参照電極およびカウンター電極をセットする。測定前に作用電極を研磨用アルミナ(ＢＡＳ社製、ＰＫ‐３セル研磨キット）で研磨する。ケーブルの接続リード線を作用電極、カウンター電極、参照電極にそれぞれつなぐ。フェロセン溶液をサンプルホルダー（９ｍｍφ、ＢＡＳ社製）に１００μＬ入れて上記キャップにセットし、金電極を測定対象の溶液中に入れて、ポテンシャルスイーパーによって作用電極の電位（０〜６００ｍＶ）を走査速度１０ｍＶ／分で掃引して電流を測定し、電流−電位曲線を得る。抗体に対する混合濃度比が１２０倍および２００倍の条件で合成を行ったＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2）5‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐（ＣＨ2）2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体それぞれのＣＶ測定を行い、またベースラインとしてフェロセンを修飾していない１ｍｇ／ｍＬの抗ＨＳＡ抗体溶液も同様にＣＶ測定を行った。そして、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2）5‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)3‐（ＣＨ2）2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体のそれぞれのサイクリックボルタモグラムからベースラインを差し引き、抗ＨＳＡ抗体に結合したフェロセンのピーク電流値をそれぞれ算出した。Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、およびＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体溶液では走査電位が０．４８Ｖのとき酸化反応のピーク電流となり、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体溶液では、走査電位が０．２３５Ｖのとき酸化反応のピーク電流となる。
【００３７】
比較例１
実施例１〜実施例３の方法と同様に、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ ａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒを抗体に対する混合濃度比２００倍で抗ＨＳＡ抗体に修飾を行い、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2）5‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体を得た。ＢＣＡ法によりフェロセン修飾抗ＨＳＡ抗体の濃度を測定し、１ｍｇ／ｍｌに調整した溶液を実施例４と同様にＣＶ測定を行い、ベースラインを差し引いたサイクリックボルタモグラムからピークの電流値を算出した。
【００３８】
実施例５
比較例１におけるＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2）5‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体の抗体回収率を１とし、実施例１〜３におけるＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐（ＣＨ2）2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体の抗体回収率をそれぞれ比較した結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】
表１より、同条件で合成を行った場合、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2）5‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体と比較して、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体は２．７倍、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体は１．６倍、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐（ＣＨ2）2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体は２．６倍の抗体を獲得することができることがわかる。
【００４１】
また、抗体の総電流値は、最終的に得られる溶液の量を同一にした場合のピーク電流値の値で比較することができる。溶液中の抗体濃度と電流値は比例するため、抗体濃度が一定の条件で測定したときに得られる電流値と抗体の回収率をかけた値でも比較することができる。Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2）5‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体の総電流量を１としたときの、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐（ＣＨ2）2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体の総電流値の値をそれぞれ表２に示す。
【００４２】
【表２】
【００４３】
表２より、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2）5‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体と比較して、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体は３．４倍、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体は２倍、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐（ＣＨ2）2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体は１．７倍の総電流値を獲得することができた。
【００４４】
以上よりＦｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐（ＣＨ2）2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体を用いることによって、フェロセンの修飾数を増加させても抗体の損失が少なく、高い総電流値を得ることができるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明によるフェロセン修飾抗体は、高い総電流値を得ることができ、抗体の特異的相互作用を利用したバイオセンサにおける修飾抗体として有用である。また、医学、薬学、生物学、化学、食品学等の諸分野における免疫反応測定抗体等の用途にも応用できる。
【符号の説明】
【００４６】
１ 抗ＨＳＡマウスモノクローナル抗体
２ Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ
３ Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ修飾抗体
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（化２) Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ（ＮＨＳ：Ｎ‐Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ）で表されるフェロセン誘導体を、抗体のリシン残基にアミド結合によって結合させた構造であって、アミド基、ＰＥＧ鎖を介して抗体に電子メディエーターであるフェロセンが結合していることを特徴とするフェロセン修飾抗体。
【請求項２】
一般式（化３) Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ（ＮＨＳ：Ｎ‐Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ）で表されるフェロセン誘導体を、抗体のリシン残基にアミド結合によって結合させた構造であって、アミド基、ＰＥＧ鎖を介して抗体に電子メディエーターであるフェロセンが結合していることを特徴とするフェロセン修飾抗体。
【請求項３】
一般式（化４) Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ（ＮＨＳ：Ｎ‐Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ）で表されるフェロセン誘導体を、抗体のリシン残基にアミド結合によって結合させた構造であって、アミド基、ＰＥＧ鎖を介して抗体に電子メディエーターであるフェロセンが結合していることを特徴とするフェロセン修飾抗体。
【請求項１】
一般式（化２) Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ（ＮＨＳ：Ｎ‐Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ）で表されるフェロセン誘導体を、抗体のリシン残基にアミド結合によって結合させた構造であって、アミド基、ＰＥＧ鎖を介して抗体に電子メディエーターであるフェロセンが結合していることを特徴とするフェロセン修飾抗体。
【請求項２】
一般式（化３) Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＮＨＣＯ‐ＣＨ2ＣＨ2Ｏ‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ（ＮＨＳ：Ｎ‐Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ）で表されるフェロセン誘導体を、抗体のリシン残基にアミド結合によって結合させた構造であって、アミド基、ＰＥＧ鎖を介して抗体に電子メディエーターであるフェロセンが結合していることを特徴とするフェロセン修飾抗体。
【請求項３】
一般式（化４) Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ‐ＣＯＮＨ‐（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3‐(ＣＨ2)2‐ＣＯ‐ＮＨＳ（ＮＨＳ：Ｎ‐Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ）で表されるフェロセン誘導体を、抗体のリシン残基にアミド結合によって結合させた構造であって、アミド基、ＰＥＧ鎖を介して抗体に電子メディエーターであるフェロセンが結合していることを特徴とするフェロセン修飾抗体。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−４１３１７（Ｐ２０１２−４１３１７Ａ）
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８５７５７（Ｐ２０１０−１８５７５７）
【出願日】平成２２年８月２３日（２０１０．８．２３）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２３日（２０１０．８．２３）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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