プラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤
組換えヒト血清アルブミンの液状製剤を収容するプラスチック容器と、当該プラスチック容器を包装するエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有するガスバリア性外包装材とを備えるプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤であって、長期間保存安定性に優れている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、プラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤に関する。
【背景技術】
アルブミン、特にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は血漿中に最も多く含まれる蛋白質であり、肝臓中で作られ、血流中で正常な浸透圧を維持したり、栄養物質や代謝物質と結合してこれらを運搬するなどの機能をもっている。そのため、ＨＳＡは出血性ショック患者、熱傷患者等の外傷に関連する症状、低アルブミン血症や胎児性赤芽球症に罹っている患者の治療に有効とされている。このようなＨＳＡは精製水に溶解させた液状製剤として、臨床現場においてヒト体内へ注射または点滴により投与されている。
ＨＳＡ製剤を収容する容器としては、従来からガラス製容器が使用され、例えば、脱アルカリ処理した軟質ガラス容器中で保存することが提案されている（例えば、特開平４−２１０６４８号公報を参照）。また、タイプＩＩガラスバイアル、例えば、標準表面処理を施されたケイ酸塩ガラス（アンモニウム塩または酸化イオウ処理、タイプＩＩのガラス）にＨＳＡ製剤を収容することも提案されている（例えば、特開平９−２２１４３１号公報を参照）。これらのガラス容器はいずれも、ガラス容器からのアルミニウムの遊離を回避することを目的とする。しかしながら、これらのガラス容器は、重い、壊れやすいなどの欠点を有する。また、これらのＨＳＡ製剤のガラス容器への注入に際しては、容器内のＨＳＡ製剤中に大気中の細菌、その他の夾雑物質が混入する危険があり、汎用的ではない。
近年、緊急時の医薬品の使用においてガラス容器と好適に代替し得る容器として、軽量で割れないプラスチック容器が検討されている。例えば、特開２０００−１８９４９２号公報には、プラスチック容器を使用し、かつ、ＨＳＡ製剤を大気中の夾雑物質と接触しない系で該容器内部に注入し、比較的低温度で該容器開口端を密封することによって、アルブミン加熱変性物の生成を完全に抑制したＨＳＡ製剤収容プラスチック容器を提供できることが開示されている。また特開２００３−１０２８７号公報には、温度２５℃、相対湿度６０％における水蒸気透過量が特定の範囲になるようにプラスチック材料を成型加工して低水蒸気透過性を有する容器を用いることにより、充填されたＨＳＡ製剤は長期間変性もほとんどなく、その性状を維持できることが開示されている。さらにこの特開２００３−１０２８７号公報には、同条件における酸素透過量が特定の範囲になるようにプラスチック材料を成型加工して低酸素透過性を有する外包装材を併せて使用することも開示されている。
ところで、従来、ＨＳＡは、ヒトから採取した血液を分画することによって製造されていたが、かかる製造法は不経済であり、血液の供給が困難であるという問題があった。また、血液は肝炎ウィルスのように好ましくない物質を含んでいるため、ＨＳＡに代替し得る原料の開発が望まれていた。
そこで近年、遺伝子操作によるアルブミン（組換えヒト血清アルブミン；ｒＨＳＡ）の大量生産、精製技術の研究開発が進み、遺伝子組換えによる治療薬も市販されようとしている。
しかし、ｒＨＳＡ製剤の場合、上記プラスチック容器にて製剤化（プラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤）すると、５０℃で６０日間の保存により、外観変化、二量体以上のｒＨＳＡの重合体の形成、アンモニア含有量の増加というような現象が起こるということが、本発明者等の試験によって新たに判った。
これらの現象が起こる理由の詳細は不明であるが、当該試験は酸素存在下で実施されていることから酸素暴露による影響が懸念される。
上記試験は、当該製剤の長期保存時の安定性を短期間で予測するために行ったものである。この外観変化、重合体の形成、アンモニア含有量の増加という現象は、本試験結果のレベルであれば必ずしも安全性に影響を与えるものではないが、品質面からみると、製造直後の品質状態を保存期間中ほぼ一定に保つことが望ましいと考えられる。
以上のように、本発明者等は、外観変化、重合体形成ならびにアンモニア含有量増加を極力抑制でき、長期間の保存安定性に優れるプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤の開発が必要であることを、解決すべき新たなる課題として見出した。
【発明の開示】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、長期間保存安定性に優れた新規なプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤を提供することである。
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下のとおりである。
（１）組換えヒト血清アルブミンの液状製剤を収容するプラスチック容器と、当該プラスチック容器を包装するエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有するガスバリア性外包装材とを備えるプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤。
（２）プラスチック容器と外包装材との間に脱酸素剤が収容されてなることを特徴とする上記（１）に記載の製剤。
（３）外包装材のエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層の厚みが５〜５０μｍである上記（１）または（２）に記載の製剤。
（４）外包装材の厚みが５〜１０００μｍである上記（１）〜（３）のいずれかに記載の製剤。
（５）外包装材の酸素透過量が、温度２５℃、相対湿度６０％において、５０ｃｍ３／ｍ２／日・１０１３．２５ｈＰａ未満である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の製剤。
（６）外包装材が、ポリエチレンにて形成された最内層、エチレン−ビニルアルコール共重合体にて形成された中間層、ならびにナイロンにて形成された最外層を有する多層構造である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の製剤。
（７）組換えヒト血清アルブミンの液状製剤中の組換えヒト血清アルブミン濃度が１〜５００ｍｇ／ｍＬである、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の製剤。
（８）プラスチック容器の材料が、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、またはエチレン−酢酸ビニル共重合体である、上記（１）記載の製剤。
（９）組換えヒト血清アルブミンの液状製剤が、プラスチック容器中に、無菌状態で密封されている、上記（１）記載の製剤。
（１０）成型金型内においてプラスチック容器が成型された後、該プラスチック容器がまだ成型金型内にある間に、該プラスチック容器内に組換えヒト血清アルブミンの液状製剤が注入され、かつ、開口部が金型によって押圧されて密封されている、上記（９）記載の製剤。
（１１）組換えヒト血清アルブミンの液状製剤中の二量体以上の組換えヒト血清アルブミン重合体の含有量が３．８％以下である、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の製剤。
（１２）組換えヒト血清アルブミンの液状製剤中のアンモニア含有量が４．６０μｇ／ｍＬ以下である、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の製剤。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明における好ましい一例のプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤１を簡略化して示す図である。図中における符号は、１：プラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤、２：プラスチック容器、３：ｒＨＳＡ製剤、１５：外包装材、をそれぞれに示している。
図２は、本発明におけるｒＨＳＡ製剤を収容したプラスチック容器の製造方法の好ましい一例を段階的に示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明のプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤は、組換えヒト血清アルブミンの液状製剤（ｒＨＳＡ製剤）を収容するプラスチック容器と、当該プラスチック容器を包装するエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有するガスバリア性外包装材とを備える。
かかる構成を備える本発明によって、組換えヒト血清アルブミンの液状製剤をプラスチック容器に収容して製剤化した構成でありながら、長期間の保存安定性に優れるプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤を提供することができる。
ここで、「長期間の保存安定性に優れる」とは、上記プラスチック容器入りｒＨＳＡ製剤を室温（３０℃以下、具体的には１０〜３０℃）で２年間保存した場合に、外観、重合体形成、アンモニア含有量を含めた品質・性状に保存開始時と比較して大きな変化が認められないことを意味する（生物学的製剤基準に則ったＨＳＡ製剤（血漿由来）の有効期間に準拠）。
また、この長期保存安定性を予測する手段として、当該プラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤（５（ｗ／ｖ）％）を５０℃、７５％ＲＨの条件下に６０日間放置後、ｒＨＳＡ製剤の外観が淡黄色澄明であり、ｒＨＳＡ製剤中に含有される二量体以上のｒＨＳＡ重合体が３．８％以下、好ましくは２．４％以下、ｒＨＳＡ製剤中のアンモニア含有量が４．６０μｇ／ｍＬ以下、好ましくは３．３５μｇ／ｍＬ以下であれば、上記長期間の保存安定性と同等の効果が得られるものと推測することができる。
なお、上記放置後のｒＨＳＡ製剤中の重合体形成は、ＨＰＬＣゲル濾過法によって二量体以上の高分子量画分をｒＨＳＡの重合体として算出することによって測定することができる。また、上記放置後のｒＨＳＡ製剤中のアンモニア含有量は、ｒＨＳＡ製剤の５倍希釈液を、限外濾過膜（分子量３万カット）にて限外濾過し、得られた濾液を試料溶液とした後、日局・一般試験法のアンモニア試験法によって、インドフェノール（λｍａｘ、６４０ｎｍ）の吸光度を測定して定量することによって、算出することができる。
以下、本発明を構成する〔１〕組換えヒト血清アルブミン製剤、〔２〕プラスチック容器、〔３〕外包装材、についてそれぞれ詳述する。
〔１〕組換えヒト血清アルブミン製剤（ｒＨＳＡ製剤）
本発明において使用される組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）は、遺伝子工学的手法によって生産された、分子量約６７，０００のヒト血清アルブミンである。ｒＨＳＡとしては、ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子を単離し、適当なベクターに組み込み、得られた組換えベクターを適当な宿主に導入して形質転換体を得て、該形質転換体を培養し、培養後に培養抽出物を種々の精製手法により精製したｒＨＳＡなどが例示される。
本発明において、上記ｒＨＳＡを従来公知の方法にて製剤化してなる組換えヒト血清アルブミンの液状製剤（ｒＨＳＡ製剤）が、プラスチック容器内に収容される。かかるｒＨＳＡ製剤は、例えば注射用水に溶解したｒＨＳＡ濃度が１〜５００ｍｇ／ｍＬ（好ましくは、１０〜１００ｍｇ／ｍＬ）の溶液である。本発明におけるｒＨＳＡ製剤には、アセチルトリプトファン塩、炭素数６〜１８の有機カルボン酸またはその塩等の安定化剤が含有されていることが好ましい。このような安定化剤、例えばアセチルトリプトファンはｒＨＳＡ製剤中に含有されるｒＨＳＡ１ｇ当り、約２０〜６０ｍｇであることが好ましい。炭素数６〜１８の有機カルボン酸としては、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、オレイン酸等が例示され、その塩としてはナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム等のアルカリ土類金属塩が挙げられる。
本発明におけるｒＨＳＡは、具体的には、以下のような方法にて調製され、製剤化される。
（ｉ）遺伝子操作によるｒＨＳＡの調製
本発明において用いられる遺伝子操作により調製されるｒＨＳＡ産生宿主は、遺伝子操作を経て調製されたものであれば特に限定されず、既に公知文献記載のものの他、今後開発されるものであっても適宜利用することができる。具体的には、遺伝子操作を経てｒＨＳＡ産生性とされた菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌等）、動物細胞などが例示される。特に、宿主として酵母、中でもサッカロマイセス属〔例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、もしくはピキア属〔例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）〕を用いることが好ましい。また、栄養要求性株や抗生物質感受性株を用いてもよい。さらに好適には、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株（ａ，ｈｉｓ ４，ｌｅｕ ２，ｃａｎ １）、ピキア・パストリスＧＴＳ１１５株（ｈｉｓ ４）が用いられる。
これらのｒＨＳＡ産生宿主の調製方法、該宿主を培養することによるｒＨＳＡの生産方法及び培養物からのｒＨＳＡの分離採取方法は、公知ならびにそれに準じた手法を採用することによって実施できる。ｒＨＳＡ産生宿主の調製方法としては、例えば、通常のＨＳＡ遺伝子を用いる方法（特開昭５８−５６６８４号公報、特開昭５８−９０５１５号公報、特開昭５８−１５０５１７号公報を参照）、新規なＨＳＡ遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５号公報、特開平１−９８４８６号公報を参照）、合成シグナル配列を用いる方法（特開平１−２４０１９１号公報を参照）、血清アルブミンシグナル配列を用いる方法（特開平２−１６７０９５号公報を参照）、組換えプラスミドを染色体上に組み込む方法（特開平３−７２８８９号公報を参照）、宿主同士を融合させる方法（特開平３−５３８７７号公報を参照）、メタノール含有培地で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ２プロモーターを用いる方法（特開平６−９０７６８号公報、特開平４−２９９９８４号公報を参照）、枯草菌によるＨＳＡの発現（特開昭６２−２５１３３号公報を参照）、酵母によるＨＳＡの発現（特開昭６０−４１４８７号公報、特開昭６３−３９５７６号公報、特開昭６３−７４４９３号公報を参照）、ピキア酵母によるＨＳＡの発現（特開平２−１０４２９０号公報を参照）が例示される。
このうち、メタノール含有培地中で変異を起こさせる方法は具体的には以下のように行う。すなわち、まず適当な宿主、好ましくはピキア酵母、具体的にはＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）のＡＯＸ１遺伝子領域に常法によりＡＯＸ１プロモーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを有するプラスミドを導入して形質転換体を得る（特開平２−１０４２９０号公報を参照）。この形質転換体はメタノール培地中での増殖能は弱い。そこで、この形質転換体をメタノール含有培地中で培養して変異を起こさせ、生育可能な菌株のみを回収する。この際、メタノール濃度としては、０．０００１〜５％程度が例示される。培地は人工培地、天然培地のいずれでもよい。培養条件としては１５〜４０℃、１〜１０００時間程度が例示される。
またｒＨＳＡ産生宿主の培養方法としては、上記の各公報に記載された方法の他に、フェッドバッチ培養（半回分培養）により、高濃度のグルコース或いはメタノール等を適度に少量ずつ供給し、産生菌体に対する高濃度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る方法（特開平３−８３５９５号公報を参照）、培地中に脂肪酸を添加してｒＨＳＡの産生を増強する方法（特開平４−２９３４９５号公報を参照）等が例示される。
（ｉｉ）ｒＨＳＡの精製
培養処理により産生されたｒＨＳＡを宿主細胞に由来する成分および培養成分等から、十分な精度をもって単離・精製する方法が各種研究されている。例えば、従来行われている方法としてｒＨＳＡを含有する酵母培養液を、圧搾→限外濾過膜処理→加熱処理→限外濾過膜処理に供した後、陽イオン交換体、疎水性クロマト、陰イオン交換体のカラムクロマトグラフィー処理等の工程に供する方法が挙げられる（特開平５−３１７０７９号公報，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．１９９３，Ｖｏｌ．２２７，２９３−２９８を参照）。また、上記従来法の後で、さらにキレート樹脂処理またはホウ酸・塩処理の工程に供する方法も報告されている（特開平６−５６８８３号公報、特開平６−２４５７８９号公報を参照）。また、当該酵母培養液を加熱処理後に吸着流動床技術を用いたストリームライン法等を用いることもできる（特開平８−１１６９８５号公報を参照）。すなわち、ｒＨＳＡの産生宿主を含有する培養液を加熱処理し、該加熱処理液を流動床中に浮遊する吸着体粒子に接触させ、その吸着画分を回収することを特徴とするものである。
（ｉｉｉ）高度精製されたｒＨＳＡの性状
本発明におけるｒＨＳＡは、分子量約６７，０００、等電点約４．９の単一物質である。当該ｒＨＳＡは単量体および微量の二量体からなり、三量体以上の重合体、分解物を実質的に含まない。ここで、上記「実質的に含まない」とは、少なくとも製造直後のものでは、当該分野で汎用される手法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル濾過、逆相クロマトなど）により上記三量体以上の重合体、分解物が検出されないことを意味する。また本発明におけるｒＨＳＡは、産生宿主に由来する夾雑成分も実質的に含まない。具体的にはｒＨＳＡ２５（ｗ／ｖ）％溶液の場合で、宿主由来の抗原性を有する夾雑成分は１ｎｇ／ｍＬ以下が例示される。パイロジェンは同様の場合で１ＥＵ／ｍＬ以下が例示される。
着色度は２５（ｗ／ｖ）％のｒＨＳＡ製剤の場合で、Ａ３５０／Ａ２８０が、通常、０．０１５以下、好ましくは０．０１３以下である（具体的には、Ａ３５０／Ａ２８０が０．０１〜０．０１５程度が例示される。）。なお、公知の精製方法をさらに適宜組み合わせて用いることにより、さらに着色度が抑えられた、すなわちＡ３５０／Ａ２８０の値が低いｒＨＳＡを得ることができる。
（ｉｖ）製剤化
得られたｒＨＳＡは、公知の手法（例えば、５０〜８０℃で３０分間以上の加熱滅菌処理、限外濾過、除菌濾過、分注、凍結乾燥等）により製剤化することができる。製剤としては、具体的にはｒＨＳＡを５〜２５（ｗ／ｖ）％溶液（ｒＨＳＡ量として５〜１２．５ｇ）となるように含有し、ｐＨは６．４〜７．４程度、浸透圧比は１程度（生理食塩水に対する比として）の液状製剤が例示される。本発明におけるｒＨＳＡ製剤には、安定化剤としてカプリル酸ナトリウムおよび／またはアセチルトリプトファンが配合されることが好ましい。安定化剤の添加量としては各々ｒＨＳＡ１ｇ当たり２０〜６０ｍｇ程度が例示される。また、ナトリウム含量は３．７ｍｇ／ｍＬ以下が例示される。当該安定化剤の添加時期は、通常、加熱滅菌処理、限外濾過、除菌濾過、分注、凍結乾燥等の処理前である。かくして、ｒＨＳＡはその保存安定性のみならず、当該製剤化工程における安定化も図られる。
〔２〕ｒＨＳＡ製剤を収容するプラスチック容器
図１は、本発明における好ましい一例のプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤１を簡略化して示す断面図である。本発明において、ｒＨＳＡ製剤３を収容するプラスチック容器２の形状は、液状物を収容し得る内部空間を有するものであれば、特には制限されるものではないが、一方にのみ開口端４を有する筒状の容器で実現される（プラスチック容器において開口端４を除く部分を「容器本体５」と呼ぶことがある。）。ここで、本発明におけるプラスチック容器２の開口端４は、ｒＨＳＡ製剤を該容器内に収容するための開口端であり、後述するように密閉されて容器頭部６を形成してもよい（用時には、開口端４が開口され、この部分よりｒＨＳＡ製剤が供される）。本発明におけるプラスチック容器２は、容器本体５が、開口端４の近辺において容器本体５の断面積が徐々に小さくなるように形成された部分（以下、「肩部７」と称する。）および上記肩部７に連なって同程度の断面積で開口端４にまで伸びる部分（以下、「首部８」と称する。）とを有するように形成されるのが好ましい。また、肩部７と首部８との間、あるいは首部８に、外方に突出するようなフランジ９が周方向にわたって形成されていてもよい。本発明におけるプラスチック容器２においては、首部８および開口端４は、容器本体と一体的に形成されていてもよい、別体的に（例えば、容器本体とは異なる樹脂材料にて）形成されていてもよい。
本発明におけるプラスチック容器２は、首部８の長さＤ（首部７の肩部側端から開口端までの距離）と容器本体の長さＬ（容器底部から肩部７の首部８側端までの距離（好ましくは、容器底部からフランジ９までの距離））の比、Ｄ／Ｌが、好ましくは０．１〜０．５、より好ましくは０．１〜０．３、特に好ましくは０．１〜０．１５である。
また、容器本体５と開口端４の水平切断面との比は、目的とするｒＨＳＡ製剤３の収容量により種々異なるが、好ましくは０．０１〜０．５、より好ましくは、０．１〜０．２、もっとも好ましくは０．１〜０．１５である。
本発明におけるプラスチック容器２の容器本体５および開口端４の水平切断面に特に制限はなく、円形状（真円形状、楕円形状）、方形状（正方形状、長方形状）などが挙げられるが、中でも円形状または方形状が好ましい。本発明におけるプラスチック容器２の大きさにも特に制限はなく、収容するｒＨＳＡ製剤３の量によって、種々選択できるが、例えば、容器本体５の水平断面形状が真円形状である場合、その直径が、１０〜１５０ｍｍであるのが好ましく、５０〜１００ｍｍであるのがより好ましく、６０〜８０ｍｍであるのが特に好ましい。また、容器本体の水平断面形状が楕円形状である場合、その長軸／短軸比が１．１以上であるのが好ましく、１．５〜５．０であるのがより好ましく、２．０〜３．０であるのが特に好ましい。また、容器本体５の水平断面形状が方形状である場合、その長辺／短辺比は、１．１以上であるのが好ましく、１．５〜５．０であるのがより好ましく、２．０〜３．０であるのが特に好ましい。
さらに容器本体５の肉厚は、通常、０．２〜２．５ｍｍ、好ましくは０．３〜１．５ｍｍ、もっとも好ましくは０．４〜０．７ｍｍであり、容器首部８の肉厚は、通常、０．３〜３．０ｍｍ、好ましくは０．８〜２．０ｍｍ、もっとも好ましくは１．０〜１．５ｍｍである。
プラスチック容器２は、単層でも多層構造でもよく、その形成材料としては特に制限されず公知の樹脂材料を適宜使用することができるが、ｒＨＳＡ製剤の加熱滅菌の温度（４０〜６０℃）に耐えるとともに、ｒＨＳＡ製剤３を収容したプラスチック容器２の開口端内面温度４０〜７０℃の温度で、後述するように頭部金型による押圧により密封しうる樹脂材料が好ましい。かかる樹脂材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、エチレン−酢酸ビニル共重合体等が例示される。具体的には、融点が９０〜１４０℃であり、密度が０．８９０〜０．９４０である低密度ポリエチレンなどのポリオレフィンが挙げられる。
本発明におけるプラスチック容器２は、圧力１０１３．２５ｈＰａ下において、表面積１ｍ２、２４時間当りの水蒸気透過量が、温度２５℃および相対湿度６０％において、１．５ｇ／ｍ２／日・１０１３．２５ｈＰａ以下（すなわち、６．２５×１０−３ｍｇ／ｃｍ２／時・１０１３．２５ｈＰａ以下）であることが好ましい。水蒸気透過量がこの値を越える容器においては、長期間、例えば８００日以上の保存において、ｒＨＳＡ製剤中のｒＨＳＡ濃度が、表示量に対して１１０％以上の過剰濃度となり、好ましくない。上記水蒸気透過量の測定は、ＡＳＴＭ Ｅ ９６の規定に準拠した重量法によって行うことができる。このような水蒸気透過量を実現し得る材料としては、ポリオレフィン系（ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、ポリ塩化ビニル、エチレン−酢酸ビニル共重合体などから選ばれる少なくとも１種の樹脂材料が挙げられ、中でもポリエチレンが好ましく、さらには直鎖状低密度ポリエチレンと低密度ポリエチレンとの樹脂混合物が好ましい。
さらにヒートシールによって当該プラスチック容器を密封形成する場合には、最内の層が、比較的低温度（約４０〜７０℃程度）にて熱融着できる材料、例えばポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、エチレン−酢酸ビニル共重合体から形成されることが望ましい。また、ｒＨＳＡ製剤をプラスチック容器に収容した後に、これを蒸気、熱水滅菌を行うこともあり得るが、その場合ｒＨＳＡを変性させない温度（７０℃以下）であることが要求される。
プラスチック容器の製法としては、ブロー成型法とインフレーション法（押出成型法）があるが、本発明のプラスチック容器を製造するには、いずれの製造方法を採用してもよい。ｒＨＳＡ製剤のプラスチック容器の注入は、該製剤を変性させない温度下で、プラスチック容器がｒＨＳＡ製剤を収容し得る状態であるならば、プラスチック容器の製造時、製造後のいずれの段階で行ってもよいが、特開２０００−１８９４９２号公報に記載された下記の方法によって、プラスチック容器の成形とｒＨＳＡ製剤の注入とを一緒に行うのが好ましい。
図２は、特開２０００−１８９４９２号公報に記載された方法を段階的に示す図である。
まず、（１）一端が閉鎖された円筒状プラスチック成形体（パリソン）２１を溶融成形し、（２）該成形体２１を本体金型２２内部に設置し（図２（ａ），（ｂ））、（３）マンドレル２３を成形体２１の上部開口端から押し込み、該成形体２１内部に圧縮ガスを吹き込んで容器２４を成形し（図２（ｃ））、（４）該成形した容器２４の開口端から薬液注入用ノズル２５をマンドレル２３に挿入して、容器２４の底部にまで下降させ、ｒＨＳＡ製剤３を注入し（図２（ｄ））、次いで、（５）得られた容器２４の開口端を頭部金型２６により押圧して密封する。なお、上記圧縮ガスを吹き込んで容器を成形する工程に代えて、頭部金型２６の吸引孔２７より本体金型２２内を真空にして容器を成形することも可能である。
上述のように型開きした本体金型２２内に円筒状プラスチック成形体２１を溶融押出し、その一端を金型内で閉鎖した円筒状プラスチック成形体（パリソン）を作製し、該本体金型２２内で該成形体２１内部に圧縮ガスを吹き込むか、あるいは本体金型２２内部を真空にして容器２４を成形し、該容器２４が未だ本体金型２２内にある間に、ｒＨＳＡ製剤３を容器開口端から内部に注入することで、ｒＨＳＡ製剤３が大気にほぼ触れることなく、無菌状態でｒＨＳＡ製剤３をプラスチック容器に収容することが可能となる。さらに本体金型２２の冷却によって容器本体２４を急冷した後、プラスチック容器の開口端を頭部金型２６により押圧して密封し、頭部金型２６の冷却により容器頭部を冷却することで、アルブミン加熱変性物の生成を完全に抑制して、ｒＨＳＡ製剤を収容したプラスチック容器を形成することができる。
上記ｒＨＳＡ製剤を収容したプラスチック容器を製造する方法を行うための装置としては、例えばロメラグ社のボトルパック機などのブローフィルシールシステムが例示されるが、無論これに限定されるものではない。
該容器を製造する条件としては、例えば、以下のとおりである。
（１）一端が閉鎖された円筒状プラスチック成形体２１を溶融成形するには、まず、材料であるプラスチックを溶融温度以上に加熱し、筒状のオリフィスを有する押出機から押出し、開かれた金型の間に垂下するように押し出す。
（２）該成形体２１を本体金型２２内部に設置するには、本体金型２２および頭部金型２６を有する金型の本体金型２２内に、上記溶融した円筒状プラスチック成形体２１を重力により垂下させて、設置する。このとき、本体金型２２および頭部金型２６の温度は、通常、５〜３０℃に制御されている。したがって、溶融状態で垂下した円筒状プラスチック成形体２１は約１００〜１５０℃に低下している。
（３）該成形体２１内部に圧縮ガスを吹き込んで容器２４を成形するには、上記円筒状プラスチック成形体２１の開口端から圧縮ガス、例えば、空気を吹き込み、上記成形体２１を膨張させ、本体金型２２内面に接触させて容器２４を成形する。このとき、本体金型２２の温度が通常、５〜３０℃に制御されているから、円筒状プラスチック成形体２１本体の温度は、例えば、１０〜７０℃に低下する。しかしながら、該円筒状プラスチック成形体２１の上部であって、本体金型２２に接触しない部分（開口端）は、通常、１００〜１５０℃の状態にある。または金型内部を真空にして成形するには、常法に従う。この場合においても、該円筒状プラスチック成形体２１の上部であって、本体金型２２に接触しない部分（開口端）は、通常、１００〜１５０℃の状態にある。
（４）該成形した容器２４の開口端からｒＨＳＡ製剤３を注入するには、上記円筒状プラスチック成形体から容器を成形した後、できるかぎり速やかに行う。注入するｒＨＳＡ製剤３の温度は通常、５〜２５℃に近いから、該ｒＨＳＡ製剤の注入により、成形された容器本体の温度は、１０〜６０℃である。しかし、容器開口部の内面温度は、５０〜９０℃の状態のままである。
（５）得られたプラスチック容器の開口端を頭部金型２６により押圧して密封する。これは、容器開口端の内面温度が４０〜７０℃であるときに行うことが好ましい。
本発明において、ｒＨＳＡ製剤を収容したプラスチック容器は、必要により加熱滅菌に供して、ｒＨＳＡ製剤中に混入する虞のある微生物等を不活性化することが必要である。滅菌条件としては、５０〜８０℃で３０分間以上の加熱を行うことが望ましい。
ｒＨＳＡ製剤を収容したプラスチック容器の保存条件としては、凍結や変性をさけるため、温度５℃〜５０℃、相対湿度１０％以上であることが望ましい。
本発明におけるプラスチック容器は、図１に簡略化して示す例のように、容器頭部６の上面にゴム状弾性体１０が固着されていてもよい。上記のように肩部７と首部８との間、あるいは首部８に、外方に突出するフランジ９を周方向にわたって有する場合には、かしめ部材１２を使用し、当該かしめ部材１２の底端と溶着し、ゴム状弾性体１０を容器頭部６に固着するようにしてもよい。ｒＨＳＡ製剤３を収容するプラスチック容器２の容器頭部の上面にゴム状弾性体１０が固着されると、穿刺針がゴム状弾性体１０および容器頭部に穿刺してもゴム状弾性体１０に穿刺された針穴は閉塞する方向に復元力が作用するので、穿刺針が針穴と当接しｒＨＳＡ製剤３が外部に漏れることはないという利点がある。ゴム状弾性体１０を設ける場合、当該ゴム状弾性体１０の外面が熱収縮性保護フィルム１１にて被覆されているのが好ましい。これによりゴム状弾性体１０への大気汚染物質の付着を防止することができる。上記ゴム状弾性体１０の形成材料としては、ブチルゴム、ポリイソブチレンゴム、シリコーンゴム、エチレン−ポリプロピレンゴム等の合成ゴムまたは天然ゴム等が挙げられる。また、上記熱収縮保護フィルム１１の形成材料としては、例えばポリエチレンテレフタレート、スチレン、塩化ビニル、二軸延伸ポリプロピレンなどを用いることができ、中でもポリエチレンテレフタレートを用いることが好ましい。また、かしめ部材１２の材料としては、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリアミド等のプラスチックが好ましいが、アルミニウム、ステンレス等の金属、セラミック等でもよい。
〔３〕外包装材
本発明において上記プラスチック容器２を包装する外包装材１５は、エチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有するプラスチック製のものであって、ガスバリア性を有することが特徴である。かかるエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有する外包装材１５を用いることによって、上述したような長期の保存安定性に優れたプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤を得ることができる。ここで、本発明における外包装材１５は、圧力１０１３．２５ｈＰａ下、温度２５℃、相対湿度６０％における酸素透過量が、通常、５０ｃｍ３／ｍ２／日・１０１３．２５ｈＰａ未満であり、好ましくは５ｃｍ３／ｍ２／日・１０１３．２５ｈＰａ未満、さらに好ましくは１ｃｍ３／ｍ２／日・１０１３．２５ｈＰａ未満である。かかる酸素透過量は、ＪＩＳ Ｋ ７１２６の規定に準拠した差圧法によって測定することができる。
また、エチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有する外包装材１５を使用することによって、比較的小さな厚みでもガスバリア性を示すため、他のガスバリア性材料と比較しても取り扱い性（操作性）がよく、しかも安価に上述のような長期の保存安定性に優れるプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤を得ることができる、という利点がある。
当該外包装材１５は、上記エチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有しているならば、このエチレン−ビニルアルコール共重合体で形成された単層であってもよいし、他の樹脂材料で形成された層をさらに有する複数層であってもよい。
外包装材１５が単層からなる場合には、エチレン−ビニルアルコール共重合体のみで調製されていてもよく、また、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、架橋エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリ塩化ビニリデン、ポリブテン、ポリエステル、エチレン共重合体から選ばれる少なくとも１種（好ましくは、２種以上）とエチレン−ビニルアルコール共重合体との混合物から調製されていてもよい。なお、エチレン−ビニルアルコール共重合体のみで形成された単層の外包装材は、その厚みにもよるが、他のガスバリア性材料で形成した場合と比較して透明性に優れるという利点もある。
また外包装材１５が複数層である場合には、エチレン−ビニルアルコール共重合体を含む（樹脂）層は、最外層、最内層、中間層のいずれに位置していてもよい（中間層が複数ある場合には、そのいずれの位置でもよい）。かかる場合、エチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層以外の層の形成材料としては、上述したエチレン−ビニルアルコール共重合体と混合されてもよい樹脂として上記例示したものを好適に使用することができる。外包装材が複数層である場合、具体的には、ポリエチレンにて形成された最内層、エチレン−ビニルアルコール共重合体にて形成された中間層、ならびにナイロンにて形成された最外層を有する多層構造の外包装材が好適なものとして例示される。
また、上記のように外包装材１５が複数層（最内層、最外層、および必要に応じ１または複数の中間層）である場合、各層の厚みは、種々選択することができるが、少なくともエチレン−ビニルアルコール共重合体で形成された層について、上述した酸素透過量を満足するようにその厚みを選択する（好ましくは５〜５０μｍ、より好ましくは１０〜３０μｍ）。
本発明のプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤１は、上記ｒＨＳＡ製剤３を収容したプラスチック容器２を、上記外包装材１５にて包装する。ここで「包装」とは、外包装材が、ｒＨＳＡ製剤を収容したプラスチック容器の少なくとも容器本体を、好適にはプラスチック容器全体を、完全にその内部に収容するように覆い、包み込んでなることを指す。外包装材１５の形状については特に制限されるものではないが、取扱い性の観点から、薄膜であることが好ましい。その厚み（多層の場合には、全ての層の厚みの総計）は、５〜１０００μｍであるのが好ましく、１０〜５００μｍであるのがより好ましい。
外包装材１５は、従来公知の適宜の製造方法、例えば、ブロー成型法、インフレーション法（押出成型法）などを用いて製造することができる。また、ｒＨＳＡ製剤３を収容するプラスチック容器２を外包装材１５にて包装する方法としては、従来公知の適宜の方法、例えば、プラスチック容器を収容後に外包装材の開口部をシールする方法などが挙げられる。
本発明においては、上記のようにｒＨＳＡ製剤３を収容するプラスチック容器２を外包装材１５にて包装する際に、ｒＨＳＡ製剤３に対する酸素の影響をさらに抑制すべく、プラスチック容器２と外包装材１５との間の空間部１６に脱酸素剤が収容されてなるのが好ましい。脱酸素剤としては、従来公知の適宜の市販品、たとえば、エージレス（三菱ガス化学株式会社製）、タモツ（王子タック株式会社製）などを特に制限なく使用することができる。さらに酸素による暴露を受けたかどうかを確認するために酸素検知剤（商品名：エージレスアイ（三菱ガス化学株式会社製））などを収容していてもよい。
【実施例】
次に本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（１）ｒＨＳＡの調製
ｒＨＳＡ産生酵母菌ピキアパストリスの取得およびその培養については、特開平５−３１７０７９号公報に記載された方法に準じて行った。得られた培養液からｒＨＳＡを回収・精製するには、特開平８−１１６９８５号公報に記載された方法に準じて、培養液の加熱処理→吸着体粒子処理（ストリームラインＳＰ処理）→加熱処理→疎水性クロマト処理→陰イオン交換体処理→キレート樹脂処理→ホウ酸・塩処理を行った。
調製されたｒＨＳＡは５（ｗ／ｖ）％溶液に調整し、さらにカプリル酸ナトリウムおよびアセチルトリプトファンナトリウムを当該溶液１００ｍＬ当たり各々６６．５ｍｇおよび１０７．３ｍｇ添加した後に、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）を用いて除菌濾過することにより、ｒＨＳＡを注射剤として使用することができる。その組成は、塩化ナトリウム含量３．７ｍｇ／ｍＬ以下、ｐＨ６．４〜７．４、浸透圧比約１（生理食塩水に対する比）であった。
（２）精製ｒＨＳＡ（含有組成物）の性状
〔ＨＰＬＣ分析〕
ｒＨＳＡをＨＰＬＣゲル濾過により分析した。ゲル濾過分析は下記の条件で行った。
（ａ）カラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（東ソー社製）
（ｂ）展開液：０．１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４／０．３Ｍ ＮａＣｌ緩衝液
（ｃ）検出：波長２８０ｎｍでの吸光度
精製ｒＨＳＡ含有組成物における主ピークはｒＨＳＡのモノマーに相当するものであった。
〔酵母由来成分分析〕
ＨＳＡ非産生酵母の培養上清を本法と同様の方法で粗精製したものをウサギに免疫し、得られた抗血清を用いて精製ｒＨＳＡ含有組成物中に存在する酵母由来成分の検出を行った。測定は酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）で行った。酵母由来成分量はｒＨＳＡ２５０ｍｇ当たり１ｎｇ未満であった。
〔分子量〕
分子量測定は前述のＨＰＬＣゲル濾過法によった。本発明の精製ｒＨＳＡ含有組成物中の、ｒＨＳＡの分子量は約６７０００であった。
〔等電点〕
等電点は薄層ポリアクリルアミドゲルを用い、Ａｌｌｅｎらの方法［Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，１４６，ｐ１（１９７８）］に準じて測定した。本発明の精製ｒＨＳＡ含有組成物中の、ｒＨＳＡの等電点は約４．９であった。
〔着色度〕
着色度は２８０ｎｍ、３５０ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍでの吸光度を測定し、Ａ３５０／Ａ２８０、Ａ４５０／Ａ２８０、Ａ５００／Ａ２８０を算出した。本発明の精製ｒＨＳＡ含有組成物の着色度はＡ３５０／Ａ２８０で約０．０１５、Ａ４５０／Ａ２８０は約０．０１、Ａ５００／Ａ２８０は約０．００２であった。
〔パイロジェンの測定〕
生化学工業のエンドスペシーを用いて測定したところ、パイロジェン量はｒＨＳＡ２５０ｍｇ当たり０．５ＥＵ未満であった。
（３）プラスチック容器の成形およびｒＨＳＡ製剤の注入
密度０．９０６ｇ／ｃｍ３の低密度ポリエチレン（ＤＥＦＤ−１１３７、日本ユニカー社製）を溶融し、押出しノズルから押出温度１９０℃で円筒状に押出し、一端が閉鎖した円筒状成形体２１（パリソン）を製造した。このパリソン２１を割金型の間に下降させ（図２（ａ））、本体金型２２を型締めした（図２（ｂ））。次いで、マンドレル２３をパリソン２１の上部開口端から押し込み、圧力３ｋｇ／ｃｍ２で加圧空気をブローし、容器本体２４を成形した。この時の本体金型２２の温度は５０℃であった（図２（ｃ））。その後、薬液注入用ノズル２５をその先端が容器本体２４の底部まで下降させ、５（ｗ／ｖ）％ｒＨＳＡ水溶液２５０ｍＬを容器本体２４に注入した（図２（ｄ））。次いで、薬液注入用ノズル２５を上昇させ、開口端内面温度４０℃において、頭部金型２６を型締めし、吸引孔２７から真空成形して容器頭部６を形成するとともに容器開口端４を密封した（図２（ｅ），図２（ｆ））。
（４）外包装材による包装
第１層（最内層）直鎖状低密度ポリエチレン５０μｍ、第２層エチレン−ビニルアルコール共重合体１５μｍ、第３層（最外層）ナイロン１５μｍ、の３層からなる外包装材（藤森工業製、外寸：約１６０ｍｍ×２６０ｍｍ（シール幅：１０ｍｍ）、内寸：約１４０ｍｍ×２４０ｍｍ）を準備した。本外包装材はガスバリア性（２５℃、６０％相対湿度（ＲＨ）における酸素透過量が約０．５ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・１０１３．２５ｈＰａ以下（ＪＩＳ Ｋ ７１２６の規定に準拠した差圧法にて測定））を有する。上記（３）で作製した、５（ｗ／ｖ）％のｒＨＳＡ製剤５０ｍＬを収容したプラスチック容器を、当該外包装材にて包装し、さらにその際、プラスチック容器と外包装材との間に脱酸素剤（エージレスＺＨ１００、三菱ガス化学株式会社製）を収容した。
その後、６０℃で３０分間の加熱滅菌を施し、本発明のプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤を得た。
比較例１
外包装材でプラスチック容器を包装しなかったこと以外は、実施例１と同様にした。
〔評価試験〕
実施例１、比較例１にて作製したプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤を、５０℃、相対湿度７５％条件下に６０日間放置した後、以下の３項目について評価した。
・外観
目視により外観を評価した。
・ｒＨＳＡ重合体の含有量
各ｒＨＳＡ製剤について、上述のＨＰＬＣゲル濾過法により測定し、二量体以上の高分子量画分を重合体として算出した。
・アンモニア含有量
各ｒＨＳＡ製剤の５倍希釈液を限外ろ過膜（分子量３万カット、アミコン社製セントリコン−３０）で限外濾過し、得られた濾液を試料溶液とした。試験は、日局・一般試験法のアンモニア試験法により行い、インドフェノール（λｍａｘ、６４０ｎｍ）の吸光度測定により定量した。
結果を表１に示す。なお、表中のＮＤは、定量限界（１．６８μｇ／ｍＬ）以下であり、定量できなかったことを意味する。
結果、脱酸素剤とともにガスバリア性の外包装材で包装することにより外観の変化、アンモニア含有量および重合体含有量の増加を抑制することができた。すなわち、この効果は酸素暴露の影響を抑えたことによるものであると推察された。
また、ｒＨＳＡ製剤ではなく、血漿由来ＨＳＡを使用した以外は、上記実施例１、比較例１とそれぞれ同様のサンプルを作製し、これらについて同様の評価試験を行ったところ、外装材の有無は、重合体含量に影響しなかった。
産業上の利用分野
本発明によれば、外包装材として、エチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を有するガスバリア性、特に低酸素透過性、のプラスチック製のものを使用し、さらに脱酸素剤と組み合わせることにより、遺伝子組換え技術を用いて調製した組換えヒト血清アルブミン製剤をプラスチック容器に収容して製剤化しても組換えヒト血清アルブミン製剤の重合体形成、ならびにアンモニア含有量の増加を従来よりも格段に抑制することができ、長期間安定に保存することが可能となった。したがって、より利便性に優れた組換えヒト血清アルブミン製剤を医療の場に提供することができる。
本出願は、日本で出願された特願２００３−１９５１９１を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含される。
【図１】
【図２】
【技術分野】
本発明は、プラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤に関する。
【背景技術】
アルブミン、特にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は血漿中に最も多く含まれる蛋白質であり、肝臓中で作られ、血流中で正常な浸透圧を維持したり、栄養物質や代謝物質と結合してこれらを運搬するなどの機能をもっている。そのため、ＨＳＡは出血性ショック患者、熱傷患者等の外傷に関連する症状、低アルブミン血症や胎児性赤芽球症に罹っている患者の治療に有効とされている。このようなＨＳＡは精製水に溶解させた液状製剤として、臨床現場においてヒト体内へ注射または点滴により投与されている。
ＨＳＡ製剤を収容する容器としては、従来からガラス製容器が使用され、例えば、脱アルカリ処理した軟質ガラス容器中で保存することが提案されている（例えば、特開平４−２１０６４８号公報を参照）。また、タイプＩＩガラスバイアル、例えば、標準表面処理を施されたケイ酸塩ガラス（アンモニウム塩または酸化イオウ処理、タイプＩＩのガラス）にＨＳＡ製剤を収容することも提案されている（例えば、特開平９−２２１４３１号公報を参照）。これらのガラス容器はいずれも、ガラス容器からのアルミニウムの遊離を回避することを目的とする。しかしながら、これらのガラス容器は、重い、壊れやすいなどの欠点を有する。また、これらのＨＳＡ製剤のガラス容器への注入に際しては、容器内のＨＳＡ製剤中に大気中の細菌、その他の夾雑物質が混入する危険があり、汎用的ではない。
近年、緊急時の医薬品の使用においてガラス容器と好適に代替し得る容器として、軽量で割れないプラスチック容器が検討されている。例えば、特開２０００−１８９４９２号公報には、プラスチック容器を使用し、かつ、ＨＳＡ製剤を大気中の夾雑物質と接触しない系で該容器内部に注入し、比較的低温度で該容器開口端を密封することによって、アルブミン加熱変性物の生成を完全に抑制したＨＳＡ製剤収容プラスチック容器を提供できることが開示されている。また特開２００３−１０２８７号公報には、温度２５℃、相対湿度６０％における水蒸気透過量が特定の範囲になるようにプラスチック材料を成型加工して低水蒸気透過性を有する容器を用いることにより、充填されたＨＳＡ製剤は長期間変性もほとんどなく、その性状を維持できることが開示されている。さらにこの特開２００３−１０２８７号公報には、同条件における酸素透過量が特定の範囲になるようにプラスチック材料を成型加工して低酸素透過性を有する外包装材を併せて使用することも開示されている。
ところで、従来、ＨＳＡは、ヒトから採取した血液を分画することによって製造されていたが、かかる製造法は不経済であり、血液の供給が困難であるという問題があった。また、血液は肝炎ウィルスのように好ましくない物質を含んでいるため、ＨＳＡに代替し得る原料の開発が望まれていた。
そこで近年、遺伝子操作によるアルブミン（組換えヒト血清アルブミン；ｒＨＳＡ）の大量生産、精製技術の研究開発が進み、遺伝子組換えによる治療薬も市販されようとしている。
しかし、ｒＨＳＡ製剤の場合、上記プラスチック容器にて製剤化（プラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤）すると、５０℃で６０日間の保存により、外観変化、二量体以上のｒＨＳＡの重合体の形成、アンモニア含有量の増加というような現象が起こるということが、本発明者等の試験によって新たに判った。
これらの現象が起こる理由の詳細は不明であるが、当該試験は酸素存在下で実施されていることから酸素暴露による影響が懸念される。
上記試験は、当該製剤の長期保存時の安定性を短期間で予測するために行ったものである。この外観変化、重合体の形成、アンモニア含有量の増加という現象は、本試験結果のレベルであれば必ずしも安全性に影響を与えるものではないが、品質面からみると、製造直後の品質状態を保存期間中ほぼ一定に保つことが望ましいと考えられる。
以上のように、本発明者等は、外観変化、重合体形成ならびにアンモニア含有量増加を極力抑制でき、長期間の保存安定性に優れるプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤の開発が必要であることを、解決すべき新たなる課題として見出した。
【発明の開示】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、長期間保存安定性に優れた新規なプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤を提供することである。
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下のとおりである。
（１）組換えヒト血清アルブミンの液状製剤を収容するプラスチック容器と、当該プラスチック容器を包装するエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有するガスバリア性外包装材とを備えるプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤。
（２）プラスチック容器と外包装材との間に脱酸素剤が収容されてなることを特徴とする上記（１）に記載の製剤。
（３）外包装材のエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層の厚みが５〜５０μｍである上記（１）または（２）に記載の製剤。
（４）外包装材の厚みが５〜１０００μｍである上記（１）〜（３）のいずれかに記載の製剤。
（５）外包装材の酸素透過量が、温度２５℃、相対湿度６０％において、５０ｃｍ３／ｍ２／日・１０１３．２５ｈＰａ未満である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の製剤。
（６）外包装材が、ポリエチレンにて形成された最内層、エチレン−ビニルアルコール共重合体にて形成された中間層、ならびにナイロンにて形成された最外層を有する多層構造である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の製剤。
（７）組換えヒト血清アルブミンの液状製剤中の組換えヒト血清アルブミン濃度が１〜５００ｍｇ／ｍＬである、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の製剤。
（８）プラスチック容器の材料が、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、またはエチレン−酢酸ビニル共重合体である、上記（１）記載の製剤。
（９）組換えヒト血清アルブミンの液状製剤が、プラスチック容器中に、無菌状態で密封されている、上記（１）記載の製剤。
（１０）成型金型内においてプラスチック容器が成型された後、該プラスチック容器がまだ成型金型内にある間に、該プラスチック容器内に組換えヒト血清アルブミンの液状製剤が注入され、かつ、開口部が金型によって押圧されて密封されている、上記（９）記載の製剤。
（１１）組換えヒト血清アルブミンの液状製剤中の二量体以上の組換えヒト血清アルブミン重合体の含有量が３．８％以下である、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の製剤。
（１２）組換えヒト血清アルブミンの液状製剤中のアンモニア含有量が４．６０μｇ／ｍＬ以下である、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の製剤。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明における好ましい一例のプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤１を簡略化して示す図である。図中における符号は、１：プラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤、２：プラスチック容器、３：ｒＨＳＡ製剤、１５：外包装材、をそれぞれに示している。
図２は、本発明におけるｒＨＳＡ製剤を収容したプラスチック容器の製造方法の好ましい一例を段階的に示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明のプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤は、組換えヒト血清アルブミンの液状製剤（ｒＨＳＡ製剤）を収容するプラスチック容器と、当該プラスチック容器を包装するエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有するガスバリア性外包装材とを備える。
かかる構成を備える本発明によって、組換えヒト血清アルブミンの液状製剤をプラスチック容器に収容して製剤化した構成でありながら、長期間の保存安定性に優れるプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤を提供することができる。
ここで、「長期間の保存安定性に優れる」とは、上記プラスチック容器入りｒＨＳＡ製剤を室温（３０℃以下、具体的には１０〜３０℃）で２年間保存した場合に、外観、重合体形成、アンモニア含有量を含めた品質・性状に保存開始時と比較して大きな変化が認められないことを意味する（生物学的製剤基準に則ったＨＳＡ製剤（血漿由来）の有効期間に準拠）。
また、この長期保存安定性を予測する手段として、当該プラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤（５（ｗ／ｖ）％）を５０℃、７５％ＲＨの条件下に６０日間放置後、ｒＨＳＡ製剤の外観が淡黄色澄明であり、ｒＨＳＡ製剤中に含有される二量体以上のｒＨＳＡ重合体が３．８％以下、好ましくは２．４％以下、ｒＨＳＡ製剤中のアンモニア含有量が４．６０μｇ／ｍＬ以下、好ましくは３．３５μｇ／ｍＬ以下であれば、上記長期間の保存安定性と同等の効果が得られるものと推測することができる。
なお、上記放置後のｒＨＳＡ製剤中の重合体形成は、ＨＰＬＣゲル濾過法によって二量体以上の高分子量画分をｒＨＳＡの重合体として算出することによって測定することができる。また、上記放置後のｒＨＳＡ製剤中のアンモニア含有量は、ｒＨＳＡ製剤の５倍希釈液を、限外濾過膜（分子量３万カット）にて限外濾過し、得られた濾液を試料溶液とした後、日局・一般試験法のアンモニア試験法によって、インドフェノール（λｍａｘ、６４０ｎｍ）の吸光度を測定して定量することによって、算出することができる。
以下、本発明を構成する〔１〕組換えヒト血清アルブミン製剤、〔２〕プラスチック容器、〔３〕外包装材、についてそれぞれ詳述する。
〔１〕組換えヒト血清アルブミン製剤（ｒＨＳＡ製剤）
本発明において使用される組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）は、遺伝子工学的手法によって生産された、分子量約６７，０００のヒト血清アルブミンである。ｒＨＳＡとしては、ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子を単離し、適当なベクターに組み込み、得られた組換えベクターを適当な宿主に導入して形質転換体を得て、該形質転換体を培養し、培養後に培養抽出物を種々の精製手法により精製したｒＨＳＡなどが例示される。
本発明において、上記ｒＨＳＡを従来公知の方法にて製剤化してなる組換えヒト血清アルブミンの液状製剤（ｒＨＳＡ製剤）が、プラスチック容器内に収容される。かかるｒＨＳＡ製剤は、例えば注射用水に溶解したｒＨＳＡ濃度が１〜５００ｍｇ／ｍＬ（好ましくは、１０〜１００ｍｇ／ｍＬ）の溶液である。本発明におけるｒＨＳＡ製剤には、アセチルトリプトファン塩、炭素数６〜１８の有機カルボン酸またはその塩等の安定化剤が含有されていることが好ましい。このような安定化剤、例えばアセチルトリプトファンはｒＨＳＡ製剤中に含有されるｒＨＳＡ１ｇ当り、約２０〜６０ｍｇであることが好ましい。炭素数６〜１８の有機カルボン酸としては、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、オレイン酸等が例示され、その塩としてはナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム等のアルカリ土類金属塩が挙げられる。
本発明におけるｒＨＳＡは、具体的には、以下のような方法にて調製され、製剤化される。
（ｉ）遺伝子操作によるｒＨＳＡの調製
本発明において用いられる遺伝子操作により調製されるｒＨＳＡ産生宿主は、遺伝子操作を経て調製されたものであれば特に限定されず、既に公知文献記載のものの他、今後開発されるものであっても適宜利用することができる。具体的には、遺伝子操作を経てｒＨＳＡ産生性とされた菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌等）、動物細胞などが例示される。特に、宿主として酵母、中でもサッカロマイセス属〔例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、もしくはピキア属〔例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）〕を用いることが好ましい。また、栄養要求性株や抗生物質感受性株を用いてもよい。さらに好適には、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株（ａ，ｈｉｓ ４，ｌｅｕ ２，ｃａｎ １）、ピキア・パストリスＧＴＳ１１５株（ｈｉｓ ４）が用いられる。
これらのｒＨＳＡ産生宿主の調製方法、該宿主を培養することによるｒＨＳＡの生産方法及び培養物からのｒＨＳＡの分離採取方法は、公知ならびにそれに準じた手法を採用することによって実施できる。ｒＨＳＡ産生宿主の調製方法としては、例えば、通常のＨＳＡ遺伝子を用いる方法（特開昭５８−５６６８４号公報、特開昭５８−９０５１５号公報、特開昭５８−１５０５１７号公報を参照）、新規なＨＳＡ遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５号公報、特開平１−９８４８６号公報を参照）、合成シグナル配列を用いる方法（特開平１−２４０１９１号公報を参照）、血清アルブミンシグナル配列を用いる方法（特開平２−１６７０９５号公報を参照）、組換えプラスミドを染色体上に組み込む方法（特開平３−７２８８９号公報を参照）、宿主同士を融合させる方法（特開平３−５３８７７号公報を参照）、メタノール含有培地で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ２プロモーターを用いる方法（特開平６−９０７６８号公報、特開平４−２９９９８４号公報を参照）、枯草菌によるＨＳＡの発現（特開昭６２−２５１３３号公報を参照）、酵母によるＨＳＡの発現（特開昭６０−４１４８７号公報、特開昭６３−３９５７６号公報、特開昭６３−７４４９３号公報を参照）、ピキア酵母によるＨＳＡの発現（特開平２−１０４２９０号公報を参照）が例示される。
このうち、メタノール含有培地中で変異を起こさせる方法は具体的には以下のように行う。すなわち、まず適当な宿主、好ましくはピキア酵母、具体的にはＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）のＡＯＸ１遺伝子領域に常法によりＡＯＸ１プロモーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを有するプラスミドを導入して形質転換体を得る（特開平２−１０４２９０号公報を参照）。この形質転換体はメタノール培地中での増殖能は弱い。そこで、この形質転換体をメタノール含有培地中で培養して変異を起こさせ、生育可能な菌株のみを回収する。この際、メタノール濃度としては、０．０００１〜５％程度が例示される。培地は人工培地、天然培地のいずれでもよい。培養条件としては１５〜４０℃、１〜１０００時間程度が例示される。
またｒＨＳＡ産生宿主の培養方法としては、上記の各公報に記載された方法の他に、フェッドバッチ培養（半回分培養）により、高濃度のグルコース或いはメタノール等を適度に少量ずつ供給し、産生菌体に対する高濃度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る方法（特開平３−８３５９５号公報を参照）、培地中に脂肪酸を添加してｒＨＳＡの産生を増強する方法（特開平４−２９３４９５号公報を参照）等が例示される。
（ｉｉ）ｒＨＳＡの精製
培養処理により産生されたｒＨＳＡを宿主細胞に由来する成分および培養成分等から、十分な精度をもって単離・精製する方法が各種研究されている。例えば、従来行われている方法としてｒＨＳＡを含有する酵母培養液を、圧搾→限外濾過膜処理→加熱処理→限外濾過膜処理に供した後、陽イオン交換体、疎水性クロマト、陰イオン交換体のカラムクロマトグラフィー処理等の工程に供する方法が挙げられる（特開平５−３１７０７９号公報，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．１９９３，Ｖｏｌ．２２７，２９３−２９８を参照）。また、上記従来法の後で、さらにキレート樹脂処理またはホウ酸・塩処理の工程に供する方法も報告されている（特開平６−５６８８３号公報、特開平６−２４５７８９号公報を参照）。また、当該酵母培養液を加熱処理後に吸着流動床技術を用いたストリームライン法等を用いることもできる（特開平８−１１６９８５号公報を参照）。すなわち、ｒＨＳＡの産生宿主を含有する培養液を加熱処理し、該加熱処理液を流動床中に浮遊する吸着体粒子に接触させ、その吸着画分を回収することを特徴とするものである。
（ｉｉｉ）高度精製されたｒＨＳＡの性状
本発明におけるｒＨＳＡは、分子量約６７，０００、等電点約４．９の単一物質である。当該ｒＨＳＡは単量体および微量の二量体からなり、三量体以上の重合体、分解物を実質的に含まない。ここで、上記「実質的に含まない」とは、少なくとも製造直後のものでは、当該分野で汎用される手法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル濾過、逆相クロマトなど）により上記三量体以上の重合体、分解物が検出されないことを意味する。また本発明におけるｒＨＳＡは、産生宿主に由来する夾雑成分も実質的に含まない。具体的にはｒＨＳＡ２５（ｗ／ｖ）％溶液の場合で、宿主由来の抗原性を有する夾雑成分は１ｎｇ／ｍＬ以下が例示される。パイロジェンは同様の場合で１ＥＵ／ｍＬ以下が例示される。
着色度は２５（ｗ／ｖ）％のｒＨＳＡ製剤の場合で、Ａ３５０／Ａ２８０が、通常、０．０１５以下、好ましくは０．０１３以下である（具体的には、Ａ３５０／Ａ２８０が０．０１〜０．０１５程度が例示される。）。なお、公知の精製方法をさらに適宜組み合わせて用いることにより、さらに着色度が抑えられた、すなわちＡ３５０／Ａ２８０の値が低いｒＨＳＡを得ることができる。
（ｉｖ）製剤化
得られたｒＨＳＡは、公知の手法（例えば、５０〜８０℃で３０分間以上の加熱滅菌処理、限外濾過、除菌濾過、分注、凍結乾燥等）により製剤化することができる。製剤としては、具体的にはｒＨＳＡを５〜２５（ｗ／ｖ）％溶液（ｒＨＳＡ量として５〜１２．５ｇ）となるように含有し、ｐＨは６．４〜７．４程度、浸透圧比は１程度（生理食塩水に対する比として）の液状製剤が例示される。本発明におけるｒＨＳＡ製剤には、安定化剤としてカプリル酸ナトリウムおよび／またはアセチルトリプトファンが配合されることが好ましい。安定化剤の添加量としては各々ｒＨＳＡ１ｇ当たり２０〜６０ｍｇ程度が例示される。また、ナトリウム含量は３．７ｍｇ／ｍＬ以下が例示される。当該安定化剤の添加時期は、通常、加熱滅菌処理、限外濾過、除菌濾過、分注、凍結乾燥等の処理前である。かくして、ｒＨＳＡはその保存安定性のみならず、当該製剤化工程における安定化も図られる。
〔２〕ｒＨＳＡ製剤を収容するプラスチック容器
図１は、本発明における好ましい一例のプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤１を簡略化して示す断面図である。本発明において、ｒＨＳＡ製剤３を収容するプラスチック容器２の形状は、液状物を収容し得る内部空間を有するものであれば、特には制限されるものではないが、一方にのみ開口端４を有する筒状の容器で実現される（プラスチック容器において開口端４を除く部分を「容器本体５」と呼ぶことがある。）。ここで、本発明におけるプラスチック容器２の開口端４は、ｒＨＳＡ製剤を該容器内に収容するための開口端であり、後述するように密閉されて容器頭部６を形成してもよい（用時には、開口端４が開口され、この部分よりｒＨＳＡ製剤が供される）。本発明におけるプラスチック容器２は、容器本体５が、開口端４の近辺において容器本体５の断面積が徐々に小さくなるように形成された部分（以下、「肩部７」と称する。）および上記肩部７に連なって同程度の断面積で開口端４にまで伸びる部分（以下、「首部８」と称する。）とを有するように形成されるのが好ましい。また、肩部７と首部８との間、あるいは首部８に、外方に突出するようなフランジ９が周方向にわたって形成されていてもよい。本発明におけるプラスチック容器２においては、首部８および開口端４は、容器本体と一体的に形成されていてもよい、別体的に（例えば、容器本体とは異なる樹脂材料にて）形成されていてもよい。
本発明におけるプラスチック容器２は、首部８の長さＤ（首部７の肩部側端から開口端までの距離）と容器本体の長さＬ（容器底部から肩部７の首部８側端までの距離（好ましくは、容器底部からフランジ９までの距離））の比、Ｄ／Ｌが、好ましくは０．１〜０．５、より好ましくは０．１〜０．３、特に好ましくは０．１〜０．１５である。
また、容器本体５と開口端４の水平切断面との比は、目的とするｒＨＳＡ製剤３の収容量により種々異なるが、好ましくは０．０１〜０．５、より好ましくは、０．１〜０．２、もっとも好ましくは０．１〜０．１５である。
本発明におけるプラスチック容器２の容器本体５および開口端４の水平切断面に特に制限はなく、円形状（真円形状、楕円形状）、方形状（正方形状、長方形状）などが挙げられるが、中でも円形状または方形状が好ましい。本発明におけるプラスチック容器２の大きさにも特に制限はなく、収容するｒＨＳＡ製剤３の量によって、種々選択できるが、例えば、容器本体５の水平断面形状が真円形状である場合、その直径が、１０〜１５０ｍｍであるのが好ましく、５０〜１００ｍｍであるのがより好ましく、６０〜８０ｍｍであるのが特に好ましい。また、容器本体の水平断面形状が楕円形状である場合、その長軸／短軸比が１．１以上であるのが好ましく、１．５〜５．０であるのがより好ましく、２．０〜３．０であるのが特に好ましい。また、容器本体５の水平断面形状が方形状である場合、その長辺／短辺比は、１．１以上であるのが好ましく、１．５〜５．０であるのがより好ましく、２．０〜３．０であるのが特に好ましい。
さらに容器本体５の肉厚は、通常、０．２〜２．５ｍｍ、好ましくは０．３〜１．５ｍｍ、もっとも好ましくは０．４〜０．７ｍｍであり、容器首部８の肉厚は、通常、０．３〜３．０ｍｍ、好ましくは０．８〜２．０ｍｍ、もっとも好ましくは１．０〜１．５ｍｍである。
プラスチック容器２は、単層でも多層構造でもよく、その形成材料としては特に制限されず公知の樹脂材料を適宜使用することができるが、ｒＨＳＡ製剤の加熱滅菌の温度（４０〜６０℃）に耐えるとともに、ｒＨＳＡ製剤３を収容したプラスチック容器２の開口端内面温度４０〜７０℃の温度で、後述するように頭部金型による押圧により密封しうる樹脂材料が好ましい。かかる樹脂材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、エチレン−酢酸ビニル共重合体等が例示される。具体的には、融点が９０〜１４０℃であり、密度が０．８９０〜０．９４０である低密度ポリエチレンなどのポリオレフィンが挙げられる。
本発明におけるプラスチック容器２は、圧力１０１３．２５ｈＰａ下において、表面積１ｍ２、２４時間当りの水蒸気透過量が、温度２５℃および相対湿度６０％において、１．５ｇ／ｍ２／日・１０１３．２５ｈＰａ以下（すなわち、６．２５×１０−３ｍｇ／ｃｍ２／時・１０１３．２５ｈＰａ以下）であることが好ましい。水蒸気透過量がこの値を越える容器においては、長期間、例えば８００日以上の保存において、ｒＨＳＡ製剤中のｒＨＳＡ濃度が、表示量に対して１１０％以上の過剰濃度となり、好ましくない。上記水蒸気透過量の測定は、ＡＳＴＭ Ｅ ９６の規定に準拠した重量法によって行うことができる。このような水蒸気透過量を実現し得る材料としては、ポリオレフィン系（ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、ポリ塩化ビニル、エチレン−酢酸ビニル共重合体などから選ばれる少なくとも１種の樹脂材料が挙げられ、中でもポリエチレンが好ましく、さらには直鎖状低密度ポリエチレンと低密度ポリエチレンとの樹脂混合物が好ましい。
さらにヒートシールによって当該プラスチック容器を密封形成する場合には、最内の層が、比較的低温度（約４０〜７０℃程度）にて熱融着できる材料、例えばポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、エチレン−酢酸ビニル共重合体から形成されることが望ましい。また、ｒＨＳＡ製剤をプラスチック容器に収容した後に、これを蒸気、熱水滅菌を行うこともあり得るが、その場合ｒＨＳＡを変性させない温度（７０℃以下）であることが要求される。
プラスチック容器の製法としては、ブロー成型法とインフレーション法（押出成型法）があるが、本発明のプラスチック容器を製造するには、いずれの製造方法を採用してもよい。ｒＨＳＡ製剤のプラスチック容器の注入は、該製剤を変性させない温度下で、プラスチック容器がｒＨＳＡ製剤を収容し得る状態であるならば、プラスチック容器の製造時、製造後のいずれの段階で行ってもよいが、特開２０００−１８９４９２号公報に記載された下記の方法によって、プラスチック容器の成形とｒＨＳＡ製剤の注入とを一緒に行うのが好ましい。
図２は、特開２０００−１８９４９２号公報に記載された方法を段階的に示す図である。
まず、（１）一端が閉鎖された円筒状プラスチック成形体（パリソン）２１を溶融成形し、（２）該成形体２１を本体金型２２内部に設置し（図２（ａ），（ｂ））、（３）マンドレル２３を成形体２１の上部開口端から押し込み、該成形体２１内部に圧縮ガスを吹き込んで容器２４を成形し（図２（ｃ））、（４）該成形した容器２４の開口端から薬液注入用ノズル２５をマンドレル２３に挿入して、容器２４の底部にまで下降させ、ｒＨＳＡ製剤３を注入し（図２（ｄ））、次いで、（５）得られた容器２４の開口端を頭部金型２６により押圧して密封する。なお、上記圧縮ガスを吹き込んで容器を成形する工程に代えて、頭部金型２６の吸引孔２７より本体金型２２内を真空にして容器を成形することも可能である。
上述のように型開きした本体金型２２内に円筒状プラスチック成形体２１を溶融押出し、その一端を金型内で閉鎖した円筒状プラスチック成形体（パリソン）を作製し、該本体金型２２内で該成形体２１内部に圧縮ガスを吹き込むか、あるいは本体金型２２内部を真空にして容器２４を成形し、該容器２４が未だ本体金型２２内にある間に、ｒＨＳＡ製剤３を容器開口端から内部に注入することで、ｒＨＳＡ製剤３が大気にほぼ触れることなく、無菌状態でｒＨＳＡ製剤３をプラスチック容器に収容することが可能となる。さらに本体金型２２の冷却によって容器本体２４を急冷した後、プラスチック容器の開口端を頭部金型２６により押圧して密封し、頭部金型２６の冷却により容器頭部を冷却することで、アルブミン加熱変性物の生成を完全に抑制して、ｒＨＳＡ製剤を収容したプラスチック容器を形成することができる。
上記ｒＨＳＡ製剤を収容したプラスチック容器を製造する方法を行うための装置としては、例えばロメラグ社のボトルパック機などのブローフィルシールシステムが例示されるが、無論これに限定されるものではない。
該容器を製造する条件としては、例えば、以下のとおりである。
（１）一端が閉鎖された円筒状プラスチック成形体２１を溶融成形するには、まず、材料であるプラスチックを溶融温度以上に加熱し、筒状のオリフィスを有する押出機から押出し、開かれた金型の間に垂下するように押し出す。
（２）該成形体２１を本体金型２２内部に設置するには、本体金型２２および頭部金型２６を有する金型の本体金型２２内に、上記溶融した円筒状プラスチック成形体２１を重力により垂下させて、設置する。このとき、本体金型２２および頭部金型２６の温度は、通常、５〜３０℃に制御されている。したがって、溶融状態で垂下した円筒状プラスチック成形体２１は約１００〜１５０℃に低下している。
（３）該成形体２１内部に圧縮ガスを吹き込んで容器２４を成形するには、上記円筒状プラスチック成形体２１の開口端から圧縮ガス、例えば、空気を吹き込み、上記成形体２１を膨張させ、本体金型２２内面に接触させて容器２４を成形する。このとき、本体金型２２の温度が通常、５〜３０℃に制御されているから、円筒状プラスチック成形体２１本体の温度は、例えば、１０〜７０℃に低下する。しかしながら、該円筒状プラスチック成形体２１の上部であって、本体金型２２に接触しない部分（開口端）は、通常、１００〜１５０℃の状態にある。または金型内部を真空にして成形するには、常法に従う。この場合においても、該円筒状プラスチック成形体２１の上部であって、本体金型２２に接触しない部分（開口端）は、通常、１００〜１５０℃の状態にある。
（４）該成形した容器２４の開口端からｒＨＳＡ製剤３を注入するには、上記円筒状プラスチック成形体から容器を成形した後、できるかぎり速やかに行う。注入するｒＨＳＡ製剤３の温度は通常、５〜２５℃に近いから、該ｒＨＳＡ製剤の注入により、成形された容器本体の温度は、１０〜６０℃である。しかし、容器開口部の内面温度は、５０〜９０℃の状態のままである。
（５）得られたプラスチック容器の開口端を頭部金型２６により押圧して密封する。これは、容器開口端の内面温度が４０〜７０℃であるときに行うことが好ましい。
本発明において、ｒＨＳＡ製剤を収容したプラスチック容器は、必要により加熱滅菌に供して、ｒＨＳＡ製剤中に混入する虞のある微生物等を不活性化することが必要である。滅菌条件としては、５０〜８０℃で３０分間以上の加熱を行うことが望ましい。
ｒＨＳＡ製剤を収容したプラスチック容器の保存条件としては、凍結や変性をさけるため、温度５℃〜５０℃、相対湿度１０％以上であることが望ましい。
本発明におけるプラスチック容器は、図１に簡略化して示す例のように、容器頭部６の上面にゴム状弾性体１０が固着されていてもよい。上記のように肩部７と首部８との間、あるいは首部８に、外方に突出するフランジ９を周方向にわたって有する場合には、かしめ部材１２を使用し、当該かしめ部材１２の底端と溶着し、ゴム状弾性体１０を容器頭部６に固着するようにしてもよい。ｒＨＳＡ製剤３を収容するプラスチック容器２の容器頭部の上面にゴム状弾性体１０が固着されると、穿刺針がゴム状弾性体１０および容器頭部に穿刺してもゴム状弾性体１０に穿刺された針穴は閉塞する方向に復元力が作用するので、穿刺針が針穴と当接しｒＨＳＡ製剤３が外部に漏れることはないという利点がある。ゴム状弾性体１０を設ける場合、当該ゴム状弾性体１０の外面が熱収縮性保護フィルム１１にて被覆されているのが好ましい。これによりゴム状弾性体１０への大気汚染物質の付着を防止することができる。上記ゴム状弾性体１０の形成材料としては、ブチルゴム、ポリイソブチレンゴム、シリコーンゴム、エチレン−ポリプロピレンゴム等の合成ゴムまたは天然ゴム等が挙げられる。また、上記熱収縮保護フィルム１１の形成材料としては、例えばポリエチレンテレフタレート、スチレン、塩化ビニル、二軸延伸ポリプロピレンなどを用いることができ、中でもポリエチレンテレフタレートを用いることが好ましい。また、かしめ部材１２の材料としては、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリアミド等のプラスチックが好ましいが、アルミニウム、ステンレス等の金属、セラミック等でもよい。
〔３〕外包装材
本発明において上記プラスチック容器２を包装する外包装材１５は、エチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有するプラスチック製のものであって、ガスバリア性を有することが特徴である。かかるエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有する外包装材１５を用いることによって、上述したような長期の保存安定性に優れたプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤を得ることができる。ここで、本発明における外包装材１５は、圧力１０１３．２５ｈＰａ下、温度２５℃、相対湿度６０％における酸素透過量が、通常、５０ｃｍ３／ｍ２／日・１０１３．２５ｈＰａ未満であり、好ましくは５ｃｍ３／ｍ２／日・１０１３．２５ｈＰａ未満、さらに好ましくは１ｃｍ３／ｍ２／日・１０１３．２５ｈＰａ未満である。かかる酸素透過量は、ＪＩＳ Ｋ ７１２６の規定に準拠した差圧法によって測定することができる。
また、エチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有する外包装材１５を使用することによって、比較的小さな厚みでもガスバリア性を示すため、他のガスバリア性材料と比較しても取り扱い性（操作性）がよく、しかも安価に上述のような長期の保存安定性に優れるプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤を得ることができる、という利点がある。
当該外包装材１５は、上記エチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有しているならば、このエチレン−ビニルアルコール共重合体で形成された単層であってもよいし、他の樹脂材料で形成された層をさらに有する複数層であってもよい。
外包装材１５が単層からなる場合には、エチレン−ビニルアルコール共重合体のみで調製されていてもよく、また、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、架橋エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリ塩化ビニリデン、ポリブテン、ポリエステル、エチレン共重合体から選ばれる少なくとも１種（好ましくは、２種以上）とエチレン−ビニルアルコール共重合体との混合物から調製されていてもよい。なお、エチレン−ビニルアルコール共重合体のみで形成された単層の外包装材は、その厚みにもよるが、他のガスバリア性材料で形成した場合と比較して透明性に優れるという利点もある。
また外包装材１５が複数層である場合には、エチレン−ビニルアルコール共重合体を含む（樹脂）層は、最外層、最内層、中間層のいずれに位置していてもよい（中間層が複数ある場合には、そのいずれの位置でもよい）。かかる場合、エチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層以外の層の形成材料としては、上述したエチレン−ビニルアルコール共重合体と混合されてもよい樹脂として上記例示したものを好適に使用することができる。外包装材が複数層である場合、具体的には、ポリエチレンにて形成された最内層、エチレン−ビニルアルコール共重合体にて形成された中間層、ならびにナイロンにて形成された最外層を有する多層構造の外包装材が好適なものとして例示される。
また、上記のように外包装材１５が複数層（最内層、最外層、および必要に応じ１または複数の中間層）である場合、各層の厚みは、種々選択することができるが、少なくともエチレン−ビニルアルコール共重合体で形成された層について、上述した酸素透過量を満足するようにその厚みを選択する（好ましくは５〜５０μｍ、より好ましくは１０〜３０μｍ）。
本発明のプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤１は、上記ｒＨＳＡ製剤３を収容したプラスチック容器２を、上記外包装材１５にて包装する。ここで「包装」とは、外包装材が、ｒＨＳＡ製剤を収容したプラスチック容器の少なくとも容器本体を、好適にはプラスチック容器全体を、完全にその内部に収容するように覆い、包み込んでなることを指す。外包装材１５の形状については特に制限されるものではないが、取扱い性の観点から、薄膜であることが好ましい。その厚み（多層の場合には、全ての層の厚みの総計）は、５〜１０００μｍであるのが好ましく、１０〜５００μｍであるのがより好ましい。
外包装材１５は、従来公知の適宜の製造方法、例えば、ブロー成型法、インフレーション法（押出成型法）などを用いて製造することができる。また、ｒＨＳＡ製剤３を収容するプラスチック容器２を外包装材１５にて包装する方法としては、従来公知の適宜の方法、例えば、プラスチック容器を収容後に外包装材の開口部をシールする方法などが挙げられる。
本発明においては、上記のようにｒＨＳＡ製剤３を収容するプラスチック容器２を外包装材１５にて包装する際に、ｒＨＳＡ製剤３に対する酸素の影響をさらに抑制すべく、プラスチック容器２と外包装材１５との間の空間部１６に脱酸素剤が収容されてなるのが好ましい。脱酸素剤としては、従来公知の適宜の市販品、たとえば、エージレス（三菱ガス化学株式会社製）、タモツ（王子タック株式会社製）などを特に制限なく使用することができる。さらに酸素による暴露を受けたかどうかを確認するために酸素検知剤（商品名：エージレスアイ（三菱ガス化学株式会社製））などを収容していてもよい。
【実施例】
次に本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（１）ｒＨＳＡの調製
ｒＨＳＡ産生酵母菌ピキアパストリスの取得およびその培養については、特開平５−３１７０７９号公報に記載された方法に準じて行った。得られた培養液からｒＨＳＡを回収・精製するには、特開平８−１１６９８５号公報に記載された方法に準じて、培養液の加熱処理→吸着体粒子処理（ストリームラインＳＰ処理）→加熱処理→疎水性クロマト処理→陰イオン交換体処理→キレート樹脂処理→ホウ酸・塩処理を行った。
調製されたｒＨＳＡは５（ｗ／ｖ）％溶液に調整し、さらにカプリル酸ナトリウムおよびアセチルトリプトファンナトリウムを当該溶液１００ｍＬ当たり各々６６．５ｍｇおよび１０７．３ｍｇ添加した後に、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）を用いて除菌濾過することにより、ｒＨＳＡを注射剤として使用することができる。その組成は、塩化ナトリウム含量３．７ｍｇ／ｍＬ以下、ｐＨ６．４〜７．４、浸透圧比約１（生理食塩水に対する比）であった。
（２）精製ｒＨＳＡ（含有組成物）の性状
〔ＨＰＬＣ分析〕
ｒＨＳＡをＨＰＬＣゲル濾過により分析した。ゲル濾過分析は下記の条件で行った。
（ａ）カラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（東ソー社製）
（ｂ）展開液：０．１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４／０．３Ｍ ＮａＣｌ緩衝液
（ｃ）検出：波長２８０ｎｍでの吸光度
精製ｒＨＳＡ含有組成物における主ピークはｒＨＳＡのモノマーに相当するものであった。
〔酵母由来成分分析〕
ＨＳＡ非産生酵母の培養上清を本法と同様の方法で粗精製したものをウサギに免疫し、得られた抗血清を用いて精製ｒＨＳＡ含有組成物中に存在する酵母由来成分の検出を行った。測定は酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）で行った。酵母由来成分量はｒＨＳＡ２５０ｍｇ当たり１ｎｇ未満であった。
〔分子量〕
分子量測定は前述のＨＰＬＣゲル濾過法によった。本発明の精製ｒＨＳＡ含有組成物中の、ｒＨＳＡの分子量は約６７０００であった。
〔等電点〕
等電点は薄層ポリアクリルアミドゲルを用い、Ａｌｌｅｎらの方法［Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，１４６，ｐ１（１９７８）］に準じて測定した。本発明の精製ｒＨＳＡ含有組成物中の、ｒＨＳＡの等電点は約４．９であった。
〔着色度〕
着色度は２８０ｎｍ、３５０ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍでの吸光度を測定し、Ａ３５０／Ａ２８０、Ａ４５０／Ａ２８０、Ａ５００／Ａ２８０を算出した。本発明の精製ｒＨＳＡ含有組成物の着色度はＡ３５０／Ａ２８０で約０．０１５、Ａ４５０／Ａ２８０は約０．０１、Ａ５００／Ａ２８０は約０．００２であった。
〔パイロジェンの測定〕
生化学工業のエンドスペシーを用いて測定したところ、パイロジェン量はｒＨＳＡ２５０ｍｇ当たり０．５ＥＵ未満であった。
（３）プラスチック容器の成形およびｒＨＳＡ製剤の注入
密度０．９０６ｇ／ｃｍ３の低密度ポリエチレン（ＤＥＦＤ−１１３７、日本ユニカー社製）を溶融し、押出しノズルから押出温度１９０℃で円筒状に押出し、一端が閉鎖した円筒状成形体２１（パリソン）を製造した。このパリソン２１を割金型の間に下降させ（図２（ａ））、本体金型２２を型締めした（図２（ｂ））。次いで、マンドレル２３をパリソン２１の上部開口端から押し込み、圧力３ｋｇ／ｃｍ２で加圧空気をブローし、容器本体２４を成形した。この時の本体金型２２の温度は５０℃であった（図２（ｃ））。その後、薬液注入用ノズル２５をその先端が容器本体２４の底部まで下降させ、５（ｗ／ｖ）％ｒＨＳＡ水溶液２５０ｍＬを容器本体２４に注入した（図２（ｄ））。次いで、薬液注入用ノズル２５を上昇させ、開口端内面温度４０℃において、頭部金型２６を型締めし、吸引孔２７から真空成形して容器頭部６を形成するとともに容器開口端４を密封した（図２（ｅ），図２（ｆ））。
（４）外包装材による包装
第１層（最内層）直鎖状低密度ポリエチレン５０μｍ、第２層エチレン−ビニルアルコール共重合体１５μｍ、第３層（最外層）ナイロン１５μｍ、の３層からなる外包装材（藤森工業製、外寸：約１６０ｍｍ×２６０ｍｍ（シール幅：１０ｍｍ）、内寸：約１４０ｍｍ×２４０ｍｍ）を準備した。本外包装材はガスバリア性（２５℃、６０％相対湿度（ＲＨ）における酸素透過量が約０．５ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・１０１３．２５ｈＰａ以下（ＪＩＳ Ｋ ７１２６の規定に準拠した差圧法にて測定））を有する。上記（３）で作製した、５（ｗ／ｖ）％のｒＨＳＡ製剤５０ｍＬを収容したプラスチック容器を、当該外包装材にて包装し、さらにその際、プラスチック容器と外包装材との間に脱酸素剤（エージレスＺＨ１００、三菱ガス化学株式会社製）を収容した。
その後、６０℃で３０分間の加熱滅菌を施し、本発明のプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤を得た。
比較例１
外包装材でプラスチック容器を包装しなかったこと以外は、実施例１と同様にした。
〔評価試験〕
実施例１、比較例１にて作製したプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤を、５０℃、相対湿度７５％条件下に６０日間放置した後、以下の３項目について評価した。
・外観
目視により外観を評価した。
・ｒＨＳＡ重合体の含有量
各ｒＨＳＡ製剤について、上述のＨＰＬＣゲル濾過法により測定し、二量体以上の高分子量画分を重合体として算出した。
・アンモニア含有量
各ｒＨＳＡ製剤の５倍希釈液を限外ろ過膜（分子量３万カット、アミコン社製セントリコン−３０）で限外濾過し、得られた濾液を試料溶液とした。試験は、日局・一般試験法のアンモニア試験法により行い、インドフェノール（λｍａｘ、６４０ｎｍ）の吸光度測定により定量した。
結果を表１に示す。なお、表中のＮＤは、定量限界（１．６８μｇ／ｍＬ）以下であり、定量できなかったことを意味する。
結果、脱酸素剤とともにガスバリア性の外包装材で包装することにより外観の変化、アンモニア含有量および重合体含有量の増加を抑制することができた。すなわち、この効果は酸素暴露の影響を抑えたことによるものであると推察された。
また、ｒＨＳＡ製剤ではなく、血漿由来ＨＳＡを使用した以外は、上記実施例１、比較例１とそれぞれ同様のサンプルを作製し、これらについて同様の評価試験を行ったところ、外装材の有無は、重合体含量に影響しなかった。
産業上の利用分野
本発明によれば、外包装材として、エチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を有するガスバリア性、特に低酸素透過性、のプラスチック製のものを使用し、さらに脱酸素剤と組み合わせることにより、遺伝子組換え技術を用いて調製した組換えヒト血清アルブミン製剤をプラスチック容器に収容して製剤化しても組換えヒト血清アルブミン製剤の重合体形成、ならびにアンモニア含有量の増加を従来よりも格段に抑制することができ、長期間安定に保存することが可能となった。したがって、より利便性に優れた組換えヒト血清アルブミン製剤を医療の場に提供することができる。
本出願は、日本で出願された特願２００３−１９５１９１を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含される。
【図１】
【図２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えヒト血清アルブミンの液状製剤を収容するプラスチック容器と、当該プラスチック容器を包装する、エチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有するガスバリア性外包装材とを備えるプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤。
【請求項２】
プラスチック容器と外包装材との間に脱酸素剤が収容されてなることを特徴とする請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
外包装材のエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層の厚みが５〜５０μｍである請求項１または２に記載の製剤。
【請求項４】
外包装材の厚みが５〜１０００μｍである請求項１〜３のいずれかに記載の製剤。
【請求項５】
外包装材の酸素透過量が、温度２５℃、相対湿度６０％において、５０ｃｍ３／ｍ２／日・１０１３．２５ｈＰａ未満である、請求項１〜４のいずれかに記載の製剤。
【請求項６】
外包装材が、ポリエチレンにて形成された最内層、エチレン−ビニルアルコール共重合体にて形成された中間層、ならびにナイロンにて形成された最外層を有する多層構造である、請求項１〜５のいずれかに記載の製剤。
【請求項７】
組換えヒト血清アルブミンの液状製剤中の組換えヒト血清アルブミン濃度が１〜５００ｍｇ／ｍＬである、請求項１〜６のいずれかに記載の製剤。
【請求項８】
プラスチック容器の材料が、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、またはエチレン−酢酸ビニル共重合体である、請求項１記載の製剤。
【請求項９】
組換えヒト血清アルブミンの液状製剤が、プラスチック容器中に、無菌状態で密封されている、請求項１記載の製剤。
【請求項１０】
成型金型内においてプラスチック容器が成型された後、該プラスチック容器がまだ成型金型内にある間に、該プラスチック容器内に組換えヒト血清アルブミンの液状製剤が注入され、かつ、開口部が金型によって押圧されて密封されている、請求項９記載の製剤。
【請求項１１】
組換えヒト血清アルブミンの液状製剤中の二量体以上の組換えヒト血清アルブミン重合体の含有量が３．８％以下である、請求項１〜１０のいずれかに記載の製剤。
【請求項１２】
組換えヒト血清アルブミンの液状製剤中のアンモニア含有量が４．６０μｇ／ｍＬ以下である、請求項１〜１１のいずれかに記載の製剤。
【請求項１】
組換えヒト血清アルブミンの液状製剤を収容するプラスチック容器と、当該プラスチック容器を包装する、エチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有するガスバリア性外包装材とを備えるプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤。
【請求項２】
プラスチック容器と外包装材との間に脱酸素剤が収容されてなることを特徴とする請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
外包装材のエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層の厚みが５〜５０μｍである請求項１または２に記載の製剤。
【請求項４】
外包装材の厚みが５〜１０００μｍである請求項１〜３のいずれかに記載の製剤。
【請求項５】
外包装材の酸素透過量が、温度２５℃、相対湿度６０％において、５０ｃｍ３／ｍ２／日・１０１３．２５ｈＰａ未満である、請求項１〜４のいずれかに記載の製剤。
【請求項６】
外包装材が、ポリエチレンにて形成された最内層、エチレン−ビニルアルコール共重合体にて形成された中間層、ならびにナイロンにて形成された最外層を有する多層構造である、請求項１〜５のいずれかに記載の製剤。
【請求項７】
組換えヒト血清アルブミンの液状製剤中の組換えヒト血清アルブミン濃度が１〜５００ｍｇ／ｍＬである、請求項１〜６のいずれかに記載の製剤。
【請求項８】
プラスチック容器の材料が、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、またはエチレン−酢酸ビニル共重合体である、請求項１記載の製剤。
【請求項９】
組換えヒト血清アルブミンの液状製剤が、プラスチック容器中に、無菌状態で密封されている、請求項１記載の製剤。
【請求項１０】
成型金型内においてプラスチック容器が成型された後、該プラスチック容器がまだ成型金型内にある間に、該プラスチック容器内に組換えヒト血清アルブミンの液状製剤が注入され、かつ、開口部が金型によって押圧されて密封されている、請求項９記載の製剤。
【請求項１１】
組換えヒト血清アルブミンの液状製剤中の二量体以上の組換えヒト血清アルブミン重合体の含有量が３．８％以下である、請求項１〜１０のいずれかに記載の製剤。
【請求項１２】
組換えヒト血清アルブミンの液状製剤中のアンモニア含有量が４．６０μｇ／ｍＬ以下である、請求項１〜１１のいずれかに記載の製剤。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００４９０２
【国際公開日】平成１７年１月２０日（２００５．１．２０）
【発行日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１１５８３（Ｐ２００５−５１１５８３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１００６４
【国際出願日】平成１６年７月８日（２００４．７．８）
【出願人】（０００１３５０３６）ニプロ株式会社 (583)
【出願人】（０００００６７２５）三菱ウェルファーマ株式会社 (92)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年１月２０日（２００５．１．２０）
【発行日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１００６４
【国際出願日】平成１６年７月８日（２００４．７．８）
【出願人】（０００１３５０３６）ニプロ株式会社 (583)
【出願人】（０００００６７２５）三菱ウェルファーマ株式会社 (92)
【Ｆターム（参考）】
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