プラバスタチンを調製するための方法
本発明は、配列番号３、配列番号６または配列番号４３〜５９に従うアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。本発明はまた、これらのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでなるポリヌクレオチド、およびコンパクチンからプラバスタチンへの変換を改善することが可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するための方法を提供する。さらに加えて、本発明は、プラバスタチンを産生させるための方法、およびプラバスタチンを含んでなる医薬組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、プラバスタチンの産生のための方法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
スタチン系薬剤は、３−ヒドロキシ−３−メチルブチリルコエンザイムＡレダクターゼ、コレステロール生合成における律速酵素の既知のインヒビターである。従って、スタチン系薬剤は、ヒトを含むさまざまな哺乳動物において血漿コレステロールレベルを減少することが可能であり、従って、化合物は、高コレステロール血症の治療に有効である。市場には、いくらかのタイプのスタチン系薬剤、中でも、アトルバスタチン、プラバスタチン、コンパクチン、ロバスタチンおよびシンバスタチンが存在する。前者は化学合成を介して作製される一方、後者の４つは、直接発酵または前駆体発酵のいずれかを介して産生される。これらの（前駆体）発酵は、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属およびモナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属の真菌によって行われる。
【０００３】
プラバスタチンは、２つの順次発酵で産生される。まず、ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）がコンパクチンを産生し、そのラクトン環を化学的に加水分解し、続いて、得られる生成物を、これをプラバスタチンにヒドロキシル化するストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）の培養に供給する。本発明に関して、用語「加水分解されたコンパクチン」は、非ラクトン型のコンパクチン（即ち、水との反応によりラクトン環が開裂した（図１））を指し；同様に、用語「コンパクチンの加水分解」は、ラクトン環の開裂を指す。これらの代謝物の産生のための産業用の種およびプロセスは、異なる方法を使用して最適化される。それ故、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）によるコンパクチン産生は、本来の４０ｍｇ／ｌから５ｇ／ｌに増加された。生体触媒変換のために、８０％変換収率を伴う３ｇ／ｌのメバスタチンに対する耐性を伴うストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）変異株がＭｅｔｋｉｎｅｎにより得られた（Ｍｅｔｋｉｎｅｎ Ｎｅｗｓ、２０００年３月、Ｍｅｔｋｉｎｅｎ Ｏｙ、フィンランド；マンゾーニ（Ｍａｎｚｏｎｉ）およびロリーニ（Ｒｏｌｌｉｎｉ）、２００２年、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５８：５５５−５６４により検討された）。商業的には成り立つものの、コンパクチン力価は、例えば、産業用アミノ酸またはペニシリンＧ産生と比較して低いため、このプロセスは、最適な状態からはかけ離れている；さらに、コンパクチンは、生体変換に使用されるストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株に対する毒性効果を防止するため、希釈しなければならず（ホソブチ（Ｈｏｓｏｂｕｃｈｉ）ら、１９８３年、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．３６：８８７−８９１）、そして供給される２０％のコンパクチンがストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株によって変換されない。
【０００４】
コンパクチンからプラバスタチンへの変換は、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）のｐ４５０酵素によって触媒される（マツオカ（Ｍａｔｓｕｏｋａ）ら、１９８９年、Ｅｕｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８４：７０７−７１３を参照のこと）。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細菌は糸状に増殖するため、高い粘度を伴う培養を生じ、低い酸素移動速度、従って、より低い発酵生産性をもたらすため、それらの細菌では、一般的に問題が存在する。最適には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（大規模生体触媒において広範に使用される宿主）のような産業的に十分に装備された種が有用であるが、この種は、ｐ４５０酵素も、またｐ４５０酸化還元再生系も有さない。これまでのところ、コンパクチンからプラバスタチンへの変換における大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のような発酵および酵素産生に適切な種の使用については、報告されていない。
【０００５】
別の問題は、ｐ４５０酵素には補因子の再生が必要であることであり、典型的に、宿主細胞に存在する特定の対のタンパク質によって実現される。この系が最適でない場合、全体的な変換は、コンパクチンの例のように、実質的に１００％未満である。代替的種を単離するための様々な試みが行われているが、１００％の変換率を有するものは認められていない（米国特許第６，９０５，８５１号明細書、米国特許第６，３６５，３８２号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１５３４２２号明細書、米国特許出願公開第２００４／０２５３６９２号明細書および米国特許出願公開第２００４／０２０９３３５号明細書を参照のこと）。さらに、これらのうち、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）について現実的な改善を示すものはない。コンパクチンに対して極度に高い耐性を伴う種も報告されているが、変換の効率は不十分である（米国特許第６，３０６，６２９号明細書、米国特許第６，７５０，３６６号明細書）。他は、既知のｐ４５０酵素の変換率を改善する方法としてファミリーシャッフリングを使用することを示唆しているが、ｐ４５０酵素は、極めて基質特異的であり、それほど高い配列相同性を有さず、そして補因子再生のための１組の特定の酵素を必要とし得るため、これは極めて困難であることから、何らデータを示していない（米国特許第６，６０５，４３０号明細書）。変換のための異なる酵素を使用する種を単離することによって、この後者の問題を解決することが試されている。この分野における１つの特定の例は、７８％の最大変換率でコンパクチンをプラバスタチンに変換することが可能なアクチノマジュラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）種である（ポン（Ｐｅｎｇ）およびドマン（Ｄｅｍａｉｎ）（１９９８年、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：３７３−３７５；米国特許第６，２７４，３６０号明細書））。そのため、あらゆる取組みにもかかわらず、僅か８０％変換率しか伴わないストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）がなお、プラバスタチンの形成のための選好される産業的種として使用され、そして改善が非常に望まれている。
【０００６】
［発明の説明］
本発明に関して、用語「保存的置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換を意味することが意図される。これらのファミリーは、当該技術分野において公知であり、そして塩基側鎖（例えば、リジン、アルギニンおよびヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン類、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）ならびに芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニントリプトファン、ヒスチジン）を伴うアミノ酸を含む。
【０００７】
本明細書において使用する用語「単離されたポリヌクレオチドまたは核酸配列」は、他の核酸配列を本質的に含まない、例えば、アガロース電気泳動によって決定されるように、少なくとも２０％純粋、好ましくは少なくとも４０％純粋、より好ましくは少なくとも６０％純粋、さらにより好ましくは少なくとも８０％純粋、最も好ましくは少なくとも９０％純粋であるポリヌクレオチドまたは核酸配列を指す。例えば、単離された核酸配列は、その天然の局在由来の核酸配列を、それが再生される、異なる部位に再局在化するために、遺伝子操作において使用される標準的なクローニング手順によって得ることができる。
【０００８】
用語「プラバスタチン」は、αもしくはβ−配置、またはαおよびβ−配置の両方の混合を伴うコンパクチンの６’−ヒドロキシル変種として規定される。ここで、科学文献において、プラバスタチンという用語は、コンパクチンの６’−ヒドロキシル変種のβ−配置についてのみ使用される一方、α変種はエピプラバスタチンと命名されることを述べることが重要である。しかし、本発明は、コンパクチンの６−ヒドロキシル変種を作製するための一般に効率的な方法について記載した。従って、プラバスタチンという用語は、αおよびβ型の両方に当てはまる。
【０００９】
本発明の目的は、コンパクチンをプラバスタチンに変換する有効かつ産業的適用可能な方法を提供することである。本発明の別の目的は、コンパクチンをプラバスタチンに変換するためのアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）由来の新規のｐ４５０酵素を使用することである。本発明は、コンパクチンのヒドロキシル化は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において効率的に実施されるプロセスを提供することによって、先行技術のプロセスにおいて遭遇する問題を解決する。コンパクチンのヒドロキシル化が１００％変換で実施されるプロセスもまた、提供される。より具体的には、アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）の細胞全体または無細胞抽出物のいずれかとコンパクチンとを接触させることによって、コンパクチンを（ｃｍｐＨ遺伝子によってコードされる）アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）コンパクチンヒドロキシラーゼ酵素と接触させるプロセスが提供される。好ましくは、コンパクチンヒドロキシラーゼ（ｃｍｐＨ）がアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）から得られ、そして別の宿主種に移されるプロセスが提供される。好ましくは、本宿主は、高レベルのコンパクチンに耐性であり、そしてコンパクチン産生が可能である。
【００１０】
第１の態様では、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号３の配列に実質的に相同であるアミノ酸を有するポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドが提供され、ポリペプチドは、コンパクチンヒドロキシラーゼ活性を示す。
【００１１】
第１の実施形態では、前記ポリペプチドは、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９９％の効率でコンパクチンをヒドロキシル化する。好ましくは、前記ヒドロキシル化の生成物はプラバスタチンである。
【００１２】
本発明の部分として、現在利用可能なコンパクチンヒドロキシラーゼの産業的適用がアクチノマイセテス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）のクラス由来の種に限定され；即ち、それらは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）または糸状菌例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）もしくはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種のような産業規模での発酵により従う種に移すことができることが実証される。本発明によって記載されるコンパクチンヒドロキシラーゼ遺伝子は、この問題を有さない。従って、これらの遺伝子によってコードされる新規のポリペプチドの活性は、次のように特徴付けることができる：それらは、アクチノマイセテス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）以外の種、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における適用を可能にし、および／またはそれらは、少なくとも８０％の変換効率を伴うコンパクチンからプラバスタチンへの効率的なヒドロキシル化を可能にする。本発明に関して、少なくとも８０％の効率は、少なくとも８０％のコンパクチンがプラバスタチンに変換されることを意味する。
【００１３】
配列番号３に実質的に相同であるアミノ酸配列を伴うポリペプチドは、特定されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、なお最も好ましくは少なくとも９７％、究極的に少なくとも９８％、なおより究極的に少なくとも９９％の同一性の程度でアミノ酸配列を伴うポリペプチドとして規定され、実質的に相同なペプチドは、コンパクチンヒドロキシラーゼ活性を示す。実質的に相同なポリペプチドは、異なる集団由来の細胞または天然の対立遺伝子または株内の変動による集団内に存在し得る多型を包含する。実質的に相同なポリペプチドは、さらに、特定されたアミノ酸および／またはＤＮＡ配列を生じる種以外の種から誘導してもよく、または人工的に設計および合成されたＤＮＡ配列によってコードされてもよい。特定されたＤＮＡ配列に関連し、そして遺伝子暗号の縮重によって得られるＤＮＡ配列もまた、本発明の部分である。相同体はまた、なおコンパクチンヒドロキシラーゼ活性を示す全長配列の生物学的に活性なフラグメントを包含する。
【００１４】
２つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、２つの配列間で同一であるアミノ酸の百分率を指す。同一の程度は、ラッチド（Ｌａｔｃｈｅｄ）ら（１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）において記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定される。ＢＬＡＳＴ解析ソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に入手することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）およびヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５を参照のこと）５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５およびＮ＝４を使用する。
【００１５】
実質的に相同なポリペプチドは、単に、特定されたアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸の保存的置換または非必須アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を含有してもよい。従って、非必須アミノ酸は、生物学的機能を実質的に変更することなく、これらの配列の１つにおいて変更することができる残基である。例えば、表現型性サイレントアミノ酸置換の作製方法に関する指針は、ボウイ（Ｂｏｗｉｅ）ら、（１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１３０６−１３１０）に提供されており、アミノ酸配列の変更に対する忍容性を研究するための主な２つのアプローチが存在することを示している。第１の方法は、変異が天然の選択によって許容されるかまたは拒絶されるかのいずれかである進化のプロセスに依存する。第２のアプローチは、遺伝子操作を使用して、クローニングされた遺伝子の特定の位置におけるアミノ酸変化を誘導し、そして選択またはスクリーニングして、機能性を維持する配列を同定する。これらの研究は、タンパク質がアミノ酸置換に驚くほど忍容性であることを示しており、そしてタンパク質の所定の位置においてどの変化が許容性である可能性があるかを示す。例えば、ほとんどの埋没されるアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般的にほとんど保存されない。他のそのような表現型性サイレント置換については、ボウイ（Ｂｏｗｉｅ）ら、および本明細書において引用した参考文献に記載されている。
【００１６】
第２の実施形態では、改善された触媒機能（即ち、コンパクチンからプラバスタチンへの変換）をもたらす変種は、コンパクチンヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を改変することによって、入手し得る。そのような改変は：
・コドンがコンパクチンヒドロキシラーゼを発現させるために使用される宿主種に適応されるような方法で、コドン使用頻度を改善すること。
・コドンがコンパクチンヒドロキシラーゼを発現させるために使用される宿主種に適応されるような方法で、コドン対使用頻度を改善すること。
・半減期が増加したｍＲＮＡ分子を生じるコンパクチンヒドロキシラーゼをコードする遺伝子情報への安定化配列の付加。
・無作為変異を誘導するためのエラープローンＰＣＲ、それに続く、得られる変種のスクリーニング（実施例４において本質的に記載されている）および改善された動態特性を伴う変種の単離。
・コンパクチンヒドロキシラーゼの関連変種のファミリーシャッフリング、それに続く、得られる変種のスクリーニング（実施例４において本質的に記載されている）および改善された動態特性を伴う変種の単離。
【００１７】
改善された動態特性を伴う変種を伴う好適な方法については、国際公開第０３０１０１８３号パンフレットおよび国際公開第０３０１３１１号パンフレットに記載されている。
【００１８】
改善された機能性を伴うコンパクチンヒドロキシラーゼをコードする改善されたポリヌクレオチドが得られる場合、改善された触媒機能が得られる。本発明の部分として、意外なことに、コンパクチンの６−ヒドロキシル変種のβ−配置（即ち、薬学的に活性なプラバスタチン異性体）とコンパクチンの６−ヒドロキシル変種のα−配置との間の比は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５もしくは２６またはこれらに実質的に相同な配列の改善されたポリペプチド配列を使用して、有意に改善し得ることが見出されている。
【００１９】
加えて、本発明の第１の態様のポリペプチドの配列内の所定のストレッチは、コンパクチンのヒドロキシル化の触媒機構に直接関与することが確立された。配列番号４３、４４、４５、４６および４７が存在する。改善された触媒機能は、配列番号４３〜４７のいずれかまたはすべてに改変を導入することによって入手し得る。好ましくは、配列番号４３〜４７のいずれかまたはすべては、単一アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸または多くても４アミノ酸を置き換えることによって、改変される。以下の改変は、改善された触媒機能をもたらすことが確立されている。配列番号４３では、好適な改変は配列番号４８、４９および５０であり、配列番号４４では、好適な改変は配列番号５１、５２および５３であり、配列番号４５では、好適な改変は配列番号５４であり、配列番号４６では、好適な改変は配列番号５５であり、そして配列番号４７では、好適な改変は配列番号５６、５７、５８および５９である。コンパクチンのヒドロキシル化に寄与するのに適切なストレッチはまた、配列番号４３〜５９であり、ここで、１、２、もしくは３アミノ酸は、代替的アミノ酸で置き換えられる。
【００２０】
第３の実施形態では、上記のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでなるポリヌクレオチドまたは核酸配列が提供される。これは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成由来であるか、またはこれらのいずれかの組み合わせの単離されたポリヌクレオチドであり得る。特に、配列番号３のポリペプチドをコードする特定のＤＮＡ配列、即ち、配列番号１もしくは２が提供される。より好ましくは、配列番号１９〜２６のポリペプチドをコードする特定のＤＮＡ配列、即ち、配列番号１１〜１８が提供される。他で示さない限り、本明細書に記載のＤＮＡ分子を配列決定することによって決定されるすべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡシークエンサーを使用して決定され、そして本明細書において決定されるＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記で決定したＤＮＡ配列の翻訳によって推定した。従って、この自動化アプローチによって決定される任意のＤＮＡ配列では、決定される任意のヌクレオチド配列は、いくつかのエラーを含有してもよい。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、典型的には、少なくとも約９０％同一、より典型的には、少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、手動のＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによって、より正確に決定することができる。また、当該分野においても既知であるとおり、挿入または欠失のポイントから開始して、決定されたヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列が、配列決定したＤＡＮ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なるように、実際の配列と比較して、決定されたヌクレオチド配列におけるそのような単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを生じる。当業者であれば、そのように誤って同定される塩基を同定することが可能であり、そのようなエラーを補正する方法を知っている。
【００２１】
ポリペプチドおよび本発明の第１の態様のコーディング核酸配列は、任意の原核細胞、好ましくは、アクチノマイセテス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）から得ることができる。好適なアクチノマイセテス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）種として、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）、シュードノカルジア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）、ミクロモノスポア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）およびアクチノキネオスポラ（Ａｃｔｉｎｏｋｉｎｅｏｓｐｏｒａ）の株が挙げられるが、これらに限定されない。好適な実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）の株から得られる。
【００２２】
本発明のＤＮＡ配列は、ハイブリダイゼーションによって同定してもよい。変種（例えば、天然の対立遺伝子変種）に対応する核酸分子、および本発明のＤＮＡの相同体は、好ましくは、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてこれらの核酸またはその適切なフラグメントを使用して、本明細書に開示した核酸に対するそれらの相同性に基づいて、単離することができる。あるいは、利用可能なゲノムデータベースを介してインシリコで適用し得る。ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定することができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（１９９５年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照のこと。
【００２３】
核酸配列は、例えば、問題の微生物のゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、単離してもよい。一旦、本発明に従う活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を、例えば、配列番号２から誘導されるプローブによって検出したら、配列は、当業者に公知の技術（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）を利用して、単離またはクローニングすることができる。また、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法、または発現ライブラリーの抗体スクリーニングを使用することによって、そのような（ゲノム）ＤＮＡ由来の本発明の核酸配列のクローニングを行って、共有する構造特徴を伴うクローニングされたＤＮＡフラグメントを検出することができる（例えば、イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら、１９９０年、ＰＣＲ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．を参照のこと）。
【００２４】
本明細書において提供される配列情報は、誤って同定される塩基の夾在を要するようにし、あまりに限られた範囲で解釈すべきではない。本明細書において開示する特定の配列を使用して、アクチノマイセテス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、特に、アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）由来の完全な遺伝子を容易に単離し、次いで、さらなる配列分析に容易に供し、それによってシークエンスエラーを同定することができる。
【００２５】
他で示さない限り、本明細書に記載のＤＮＡ分子を配列決定することによって決定されるすべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡシークエンサーを使用して決定され、そして本明細書において決定されるＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記で決定したＤＮＡ配列の翻訳によって推定した。従って、このアプローチによって決定される任意のＤＮＡ配列について当該分野において公知であるように、本明細書において決定される任意のヌクレオチド配列は、エラーを含有してもよい。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、典型的には、少なくとも約９０％同一、より典型的には、少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該分野において周知の手動のＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによって、より正確に決定することができる。また、当該分野においても既知であるとおり、挿入または欠失のポイントから開始して、決定されたヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列が、配列決定したＤＡＮ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なるように、実際の配列と比較して、決定されたヌクレオチド配列におけるそのような単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを生じる。当業者であれば、そのように誤って同定される塩基を同定することが可能であり、そのようなエラーを補正する方法を知っている。
【００２６】
第４の実施形態では、本発明は、配列番号３のポリペプチドをいわゆるレダクターゼドメインに融合して、配列番号６のポリペプチドを形成し、そしてコンパクチンヒドロキシラーゼ活性を示すことによって、改善したコンパクチンヒドロキシラーゼ酵素を提供する。本発明の範囲は、この特定のアミノ酸配列に限定されるものではなく、特定されたアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、なおより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性の程度を所有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとして規定され、配列番号６の配列に「実質的に相同」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、実質的に相同なペプチドは、コンパクチンヒドロキシラーゼ活性を示す。実質的に相同なポリペプチドは、異なる集団由来の細胞または天然の対立遺伝子または株内の変動による集団内に存在し得る多型を包含し得る。実質的に相同なポリペプチドは、さらに、特定されたアミノ酸および／またはＤＮＡ配列を生じる種以外の種から誘導してもよく、または人工的に設計および合成されたＤＮＡ配列によってコードされてもよい。特定されたＤＮＡ配列に関連し、そして遺伝子暗号の縮重によって得られるＤＮＡ配列もまた、本発明の部分である。相同体はまた、なおコンパクチンヒドロキシラーゼ活性を示す全長配列の生物学的に活性なフラグメントを包含し得る。当業者は、この融合タンパク質のヒドロキシラーゼ部分は、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）ｐ４５０ｓｃａ−２遺伝子のようなコンパクチンをヒドロキシル化することが可能な他のｐ４５０酵素のような非相同であるが、なお機能的に均等な配列と交換してもよいが、但し、融合タンパク質は、コンパクチンヒドロキシル化プラバスタチンを示すことを理解するであろう。また、レダクターゼドメインを、非相同であるが、なお機能的に均等な配列、例えば、フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼと交換することができるが、但し、融合タンパク質は、コンパクチンのプラバスタチンへのヒドロキシル化を示す。使用することができる代替的レダクターゼドメインは、例えば、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｐ４５０ ＢＭ３、ＮＣＢＩジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ｇｉ１４２７９７由来の自己充足（ｓｅｌｆ−ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ）Ｐ４５０酵素のレダクターゼドメインである。好適な融合ポリペプチドは、配列番号１９〜２６の改善されたポリペプチドの同類物、即ち、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１もしくは４２またはこれらに実質的に相同な配列である。加えて、また、配列番号３４〜４２のポリペプチドをコードする特定のＤＮＡ配列、即ち、配列番号２７〜３４も本発明の部分である。あるいは、第２の実施形態に記載の触媒機能の改善はまた、レダクターゼ領域において実施してもよい。
【００２７】
第２の態様では、本発明は、組み換え宿主株における第１の態様のポリヌクレオチドの使用を開示する。より詳細には、以下の工程を含んでなる、プラバスタチンを産生させるための方法を開示する：
（ｉ）コンパクチンヒドロキシラーゼをコードする目的の遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換すること、
（ｉｉ）形質転換された細胞のクローンを選択すること、
（ｉｉｉ）前記選択された細胞を培養すること、
（ｉｖ）場合により、前記培養細胞を処理する（即ち、固定化する）こと、
（ｖ）コンパクチンを前記培養細胞に供給すること、
（ｖｉ）前記培養からプラバスタチンを単離すること。
【００２８】
本発明の方法における宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする目的の核酸配列（遺伝子）の供給源に大いに依存する。好ましくは、宿主細胞は原核細胞である。好適な実施形態では、原核宿主細胞は、第１もしくは第２の態様のポリヌクレオチドが入手され得る種として例示される種の細胞であって、例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種（即ち、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトマイセス・フラビドビレンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｉｄｏｖｉｒｅｎｓ）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・エクスフォリアタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｘｆｏｌｉａｔｕｓ）またはアミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種（即ち、アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ））があるが、これらに限定されない。最も好適な状況では、宿主細胞は、大規模発酵に適切な宿主細胞であって、例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種（即ち、ストレプトマイセス・アバーミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ））またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（即ち、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））またはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種（即ち、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））またはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種（即ち、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））があるが、これらに限定されない。さらにより好ましくは、宿主細胞は、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種のような真核細胞であって、適切な例として、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または糸状菌アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）またはペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）がある。
【００２９】
核酸構築物、例えば、発現構築物は、選択マーカー遺伝子および本発明のポリヌクレオチド（コンパクチンヒドロキシラーゼ）を含有してもよく、それぞれが１つ以上の制御配列に作動可能に連結され、適切な発現宿主においてコードされたポリペプチドの発現を指令する。核酸構築物は、個別のフラグメント上にあってもよく、または好ましくは、１つのＤＮＡフラグメント上にあってもよい。発現は、ポリペプチドの産生に関与する任意の工程を含むことが理解され、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌を含み得る。核酸構築物が、特定の宿主生物体におけるコーディング配列の発現のために要求されるすべての制御配列を含有する場合、用語「核酸構築物」は、用語「発現ベクター」または「カセット」と同義である。用語「制御配列」は、本明細書において、ポリペプチドの発現に必要または有利であるすべての成分を含むものと規定される。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に生来または外来性であってもよい。そのような制御配列として、プロモーター、リーダー、（コザック（Ｋｏｚａｋ）、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０に記載のような）最適な翻訳開始配列、分泌シグナル配列、プロペプチド配列、ポリアデニル化配列、転写ターミネーターが挙げられ得るが、これらに限定されない。少なくとも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。用語「作動可能に連結」は、本明細書において、制御配列が、ポリペプチドの産生を指令するようなＤＮＡ配列のコーディング配列に対する位置に、制御配列が適切に配置される配置形態として規定される。
【００３０】
制御配列は、転写制御配列を含有する適切なプロモーター配列を含んでもよい。プロモーターは、変異、短縮型、およびハイブリッドプロモーターを含む細胞において転写調節活性を示す任意の核酸配列であってもよく、そして細胞外もしくは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から入手してもよい。プロモーターは、細胞もしくはポリペプチドに対して同種または異種のいずれであってもよい。原核細胞の好適なプロモーターは、当該技術分野において公知であり、そして例えば、高レベルのメッセンジャーＲＮＡを確実にする強力なプロモーターであり得る。本発明に従う発現カセットにおいて使用されるプロモーターは、すべての芳香族アミノ酸（ａｒｏ）の生合成に共通の酵素をコードするラクトースオペロン（ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５）、アラビノースオペロン（ａｒａ）、トリプトファンオペロン（ｔｒｐ）、およびオペロンのような高度に発現されるオペロン／遺伝子の周知の組の誘導性プロモーター、またはこれらの機能的ハイブリッド（例えば、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーターの融合であるｔａｃプロモーター（アマン（Ａｍａｎｎ）ら、１９８３年、Ｇｅｎｅ２５：１６１−１７８））から選択してもよい。あるいは、細胞周期（ｃｅｌｌ’ｓ ｌｉｆｅ）全体を通してメッセンジャーＲＮＡの一定の供給を提供する構成性プロモーターを使用することもできる。他の任意の有用なプロモーターは、とりわけ、ＮＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／）において見出すことができる。
【００３１】
好適な実施形態では、プロモーターは、高度に発現される（本明細書において、少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）の全細胞ｍＲＮＡを伴うｍＲＮＡ濃度として規定される）遺伝子から誘導され得る。別の好適な実施形態では、プロモーターは、中程度に発現される（本明細書において、少なくとも０．０１％〜０．５％（ｗ／ｗ）の全細胞ｍＲＮＡを伴うｍＲＮＡ濃度として規定される）遺伝子から誘導され得る。好適な実施形態では、プロモーターは、低度で発現される（本明細書において、０．０１％（ｗ／ｗ）未満の全細胞ｍＲＮＡを伴うｍＲＮＡ濃度として規定される）遺伝子から誘導され得る。
【００３２】
なおより好適な実施形態では、遺伝子、およびそれ故、所定の転写レベルおよび調節を有するそれらの遺伝子のプロモーターを選択するために、マイクロアレイデータが使用される。この方法では、遺伝子発現カセットを、それが機能すべき条件に至適に適応することができる。
【００３３】
あるいは、本発明のポリヌクレオチドの前方にランダムＤＮＡフラグメントをクローニングし得る。これらは、いわゆる直接選択アプローチを介して単離することができる。プロモーター−レス選択マーカー遺伝子（即ち、カナマイシン耐性）を使用して、この遺伝子の前方にランダムＤＮＡフラグメントをクローニングして、そして活性なプロモーター（これらはカナマイシンを含有する培地における増殖を容易にすべきであるため）について容易にスクリーニングすることができる。これらのＤＮＡフラグメントは、多くの供給源、即ち、異なる種から、ＰＣＲ増幅、合成などによって誘導することができる。続いて、配列を単離し、そして本発明のポリヌクレオチドの前方にクローニングすることができる。同様のストラテジーを使用して、ｒｅｃＤＮＡ方法論を介して、高度に翻訳された伸長因子Ｔｕタンパク質をコードするｔｕｆ遺伝子、またはトリプトファンオペロンの改変されたもしくは合成変種から入手可能なもののような効率的に翻訳されたメッセンジャーＲＮＡ由来の５’−非翻訳リーダー領域を導入することによって、メッセンジャーＲＮＡプールの翻訳を改善することができる。
【００３４】
制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、転写を終結するために原核細胞によって認識される配列を含んでもよい。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端と操作可能に連結される。細胞において機能的であるいずれのターミネーターも本発明において使用することができる。原核細胞の好適なターミネーターは、発現させようとする生来の遺伝子またはｒＲＮＡ遺伝子もしくはウイルスオペロンのような供給源のいずれかから入手され、例えば、リボソームＲＮＡターミネーター、またはｆｄターミネーター（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ第２版；ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ）がある。
【００３５】
ポリペプチドの分泌のための制御配列は、コードされるポリペプチドを細胞の分泌経路に向けることができる、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードするシグナルペプチドコード領域を含んでもよい。コード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントを伴う翻訳リーディングフレームにおいて天然に連結されるシグナルペプチドコード領域を本質的に含有してもよい。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含有してもよい。外来性のシグナルペプチドコード領域は、コード配列がシグナルペプチドコード領域を天然には含有しない場合に要求され得る。あるいは、外来性シグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの増強された分泌を得るために、天然のシグナルペプチドコード領域と単純に置き換わってもよい。
【００３６】
核酸構築物は、発現ベクターであってもよい。発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に簡便に供され得、ポリペプチドをコードする核酸配列の発現をもたらし得るいずれのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であってもよい。ベクターの選択は、典型的に、ベクターと、ベクターを導入しようとする細胞との適合性に依存する。ベクターは、線状であってもまたは閉環状プラスミドであってもよい。
【００３７】
別の実施形態では、前述の発現カセットは、本来のプロモーターのｔｒｐプロモーターまたはａｒｏプロモーターによる置換によって、さらに改変される。発現効率の基本的改善を十分に利用するために、増加した遺伝子発現、メッセンジャーＲＮＡ翻訳およびプラスミド安定性に関与するさらなる改変を、実際の産生株を作製するために使用されるｒｅｃＤＮＡ構築物に適用してもよい（例えば、ファージｆｄの転写ターミネーターの付加、またはプラスミドｐＳＣ１０１由来の分配機能ｐａｒの導入）（チャーチワード（Ｃｈｕｒｃｈｗａｒｄ）ら、１９８３年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１１：５６４５−５６５９）。
【００３８】
所望されるタンパク質の産生を増加するために、プラスミドＣｏｌＥ１、ＣｏｌＤ、Ｒ１１６２、ＲＫ２のような染色体外因子上の発現カセット、または所定の低コピー数もしくはしばしば、動的に高コピー数で存在するおよび例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＨＢ１０１、Ｂ７、ＲＶ３０８、ＤＨ１、ＨＭＳ１７４、Ｗ３１１０、ＢＬ２１における増殖または自律複製が可能である誘導体を挿入することができる。
【００３９】
ベクターは、自律的複製型ベクター、即ち、その複製が染色体複製とは独立する細胞外染色体実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であってもよい。あるいは、ベクターは、細胞に導入される場合、ゲノムに組込まれ、それが組込まれている染色体と共に複製するものであってもよい。組込みクローニングベクターは、宿主細胞の染色体の無作為または所定の標的遺伝子座に組込み得る。本発明の好適な実施形態では、組込みクローニングベクターは、この所定の座位へのクローニングベクターの組込みを標的化するための宿主細胞のゲノムにおける所定の標的遺伝子座のＤＮＡ配列に相同であるＤＮＡフラグメントを含んでなる。標的化組込みを促進するために、クローニングベクターは、好ましくは、宿主細胞の形質転換の前に線状化される。線状化は、好ましくは、少なくとも１つ、但し、好ましくは、クローニングベクターのいずれか一方の末端が標的遺伝子座に相同な配列によって隣接されるように、実施される。標的遺伝子座に隣接する相同配列の長さは、好ましくは、少なくとも０．１ｋｂ、なお好ましくは、さらに少なくとも０．２ｋｂ、より好ましくは、少なくとも０．５ｋｂ、さらにより好ましくは、少なくとも１ｋｂ、最も好ましくは少なくとも２ｋｂである。ベクターシステムは、宿主細胞のゲノムに導入しようとする全ＤＮＡを共に含有する単一のベクターまたはプラスミドあるいは２つ以上のベクターまたはプラスミドであってもよい。
【００４０】
ＤＮＡ構築物は、エピソームベクター上で使用してもよい。好ましくは、構築物は、宿主株のゲノムに組込まれる。
【００４１】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドの適用は、プラバスタチン産出を制限する酵素をコードする宿主株のゲノムから内因性遺伝子の１つ以上を欠失することによって、改善することができる。そのような酵素の例には、コンパクチンまたはプラバスタチンの側鎖を加水分解する酵素があるが、これらに限定されない。
【００４２】
好適な実施形態では、ｃｍｐＨ遺伝子（配列番号１）、すべての相同配列、レダクターゼドメインへのｃｍｐＨ融合（配列番号４）およびコンパクチンヒドロキシラーゼをコードするすべての機能的な均等物を、コンパクチン産生宿主細胞において発現させて、プラバスタチンを産生させることができる。原核生物宿主の場合、上記のような宿主において機能的発現のすべての態様を適用することができる。真核宿主細胞の場合、好ましくは、そのような宿主における効率的発現に対して発現構築物を適用する。好ましくは、宿主細胞は真菌であり、より好ましくは、糸状菌であり、最も好ましくは、真菌宿主細胞は、スタチン系薬剤、好ましくは、コンパクチンを産生する細胞である。それらの例には、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種（即ち、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ））、またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種（即ち、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）もしくはクリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））、またはモナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）種（即ち、モナスカス・ルバー（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｅｒ）もしくはパキシー（ｐａｘｉｉ））があるが、これらに限定されない。
【００４３】
糸状菌細胞に好適なプロモーターは、当該技術分野において公知であり、そして例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼｇｐｄＡプロモーター、ｐｅｐＡ、ｐｅｐＢ、ｐｅｐＣのようなプロテアーゼプロモーター、グルコアミラーゼｇｌａＡプロモーター、アミラーゼａｍｙＡ、ａｍｙＢプロモーター、カタラーゼｃａｔＲまたはｃａｔＡプロモーター、グルコースオキシダーゼｇｏｘＣプロモーター、β−ガラクトシダーゼｌａｃＡプロモーター、α−グルコシダーゼａｇｌＡプロモーター、翻訳伸長因子ｔｅｆＡプロモーター、ｘｌｎＡ、ｘｌｎＢ、ｘｌｎＣ、ｘｌｎＤのようなキシラナーゼプロモーター、ｅｇｌＡ、ｅｇｌＢ、ｃｂｈＡのようなセルラーゼプロモーター、ａｒｅＡ、ｃｒｅＡ、ｘｌｎＲ、ｐａｃＣ、ｐｒｔＴなどのような転写調節因子のプロモーターなどであり得、そしてとりわけ、ＮＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／）において見出すことができる。
【００４４】
好適な実施形態では、プロモーターは、高度に発現される（本明細書において、少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）の全細胞ｍＲＮＡを伴うｍＲＮＡ濃度として規定される）遺伝子から誘導され得る。別の好適な実施形態では、プロモーターは、中度に発現される（本明細書において、少なくとも０．０１％〜０．５％（ｗ／ｗ）の全細胞ｍＲＮＡを伴うｍＲＮＡ濃度として規定される）遺伝子から誘導され得る。別の好適な実施形態では、プロモーターは、低度で発現される（本明細書において、少なくとも０．０１％（ｗ／ｗ）の全細胞ｍＲＮＡを伴うｍＲＮＡ濃度として規定される）遺伝子から誘導され得る。
【００４５】
なおより好適な実施形態では、遺伝子、ひいては、所定の転写レベルおよび調節を有するそれらの遺伝子のプロモーターを選択するために、マイクロアレイデータが使用される。この方法では、遺伝子発現カセットを、それが機能すべき条件に至適に適応することができる。
【００４６】
制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、転写を終結するために糸状菌細胞によって認識される配列を含んでもよい。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端と操作可能に連結される。細胞において機能的であるいずれのターミネーターも本発明において使用することができる。糸状菌細胞のための好適なターミネーターは、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、ｔｒｐＣ遺伝子およびフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から入手される。
【００４７】
制御配列はまた、適切なリーダー配列、糸状菌細胞による翻訳に重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域を含んでもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’−末端と作動可能に連結される。細胞において機能的であるいずれのリーダー配列も本発明において使用することができる。糸状菌細胞のための好適なリーダーは、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびアスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼおよびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ｇｌａＡをコードする遺伝子から得られる。
【００４８】
制御配列はまた、核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、転写される場合、転写されるｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして糸状菌細胞に認識されるポリアデニル化配列を含んでもよい。細胞において機能的ないずれのポリアデニル化配列も本発明において使用することができる。糸状菌細胞のための好適なポリアデニル化配列は、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ、およびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。
【００４９】
核酸構築物は、発現ベクターであってもよい。発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に簡便に供され得、ポリペプチドをコードする核酸配列の発現をもたらし得るいずれのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であってもよい。ベクターの選択は、典型的に、ベクターと、ベクターを導入しようとする細胞との適合性に依存する。ベクターは、線状であってもまたは閉環状プラスミドであってもよい。
【００５０】
ベクターは、自律的複製型ベクター、即ち、その複製が染色体複製とは独立する細胞外染色体実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であってもよい。糸状菌の自律的に維持されるクローニングベクターは、ＡＭＡ１配列を含んでなり得る（例えば、アレクセンコ（Ａｌｅｋｓｅｎｋｏ）およびクラッターバック（Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ）（１９９７年）、Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．２１：３７３−３９７を参照のこと）。あるいは、ベクターは、細胞に導入される場合、ゲノムに組込まれ、それが組込まれている染色体と共に複製するものであってもよい。組込みクローニングベクターは、宿主細胞の染色体の無作為または所定の標的遺伝子座に組込み得る。好ましくは、組込みクローニングベクターは、この所定の座位へのクローニングベクターの組込みを標的化するための宿主細胞のゲノムにおける所定の標的遺伝子座のＤＮＡ配列に相同であるＤＮＡフラグメントを含んでなる。標的化組込みを促進するために、クローニングベクターは、好ましくは、宿主細胞の形質転換の前に線状化される。線状化は、好ましくは、少なくとも１つ、但し、好ましくは、クローニングベクターのいずれか一方の末端が標的遺伝子座に相同な配列によって隣接されるように、実施される。標的遺伝子座に隣接する相同配列の長さは、好ましくは、少なくとも０．１ｋｂ、なお好ましくは、さらに少なくとも０．２ｋｂ、より好ましくは、少なくとも０．５ｋｂ、さらにより好ましくは、少なくとも１ｋｂ、最も好ましくは少なくとも２ｋｂである。ベクターシステムは、宿主細胞のゲノムに導入しようとする全ＤＮＡを共に含有する単一のベクターまたはプラスミドあるいは２つ以上のベクターまたはプラスミドであってもよい。
【００５１】
ＤＮＡ構築物は、エピソームベクター上で使用してもよい。好ましくは、構築物は、宿主株のゲノムに組込まれる。
【００５２】
真菌細胞は、同時形質転換を使用して形質転換される（即ち、目的の遺伝子に伴って、選択マーカー遺伝子も形質転換される）。これは、目的の遺伝子（即ち、プラスミド上）または個別のフラグメント上のいずれかに物理的に連結することができる。トランスフェクション後、形質転換体を、この選択マーカー遺伝子の存在についてスクリーニングし、続いて、目的の遺伝子の存在について分析する。選択マーカーは、殺生物剤またはウイルスに対する耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に原栄養性などを提供する産物である。有用な選択マーカーとして、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣもしくはｓｕｔＢ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、ｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ｂｌｅ（フレオマイシン耐性タンパク質）、またはそれらの均等物が挙げられる。
【００５３】
得られる宿主細胞は、プラバスタチンを産生させるために使用してもよい。
【００５４】
第３の態様では、本発明は、以下の工程を含んでなる第２の態様のコンパクチンからプラバスタチンへの変換を改善することが可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するための方法を提供する：
（ｉ）本発明の第１の態様のポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換すること；
（ｉｉ）形質転換細胞のクローンを、コンパクチンをヒドロキシル化するそれらの能力について選択すること；
（ｉｉｉ）これらの単離されたクローンを、様々なポリヌクレオチドで再形質転換すること；
（ｉｖ）形質転換細胞のクローンを、コンパクチンをヒドロキシル化するそれらの改善された能力について選択すること；
（ｖ）プラスミドを単離すること；
（ｖｉ）プラスミドの挿入物を配列決定すること。
【００５５】
工程（ｉｉｉ）の様々なポリヌクレオチドは、いくらかの供給源から入手することができる。それは、ゲノムＤＮＡ、コピーＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成または合成由来であり得る。それは、真核生物または原核生物宿主由来であり得る。それは、環状または線状ポリヌクレオチドとして提供され得る。それは、特異的ポリヌクレオチド（即ち、遺伝子もしくは遺伝子ファミリーまたは遺伝子から誘導されるエラープローンライブラリー）であり得るか、あるいはそれは、ランダムポリヌクレオチド（即ち、メタゲノムライブラリーまたは無作為に消化されたゲノムＤＮＡ）であり得る。それは、それ自体のプロモーターから発現され得るか、またはそれは、工程（ｉ）の工程において機能的なプロモーターの後方にクローニングすることができる。
【００５６】
コンパクチンヒドロキシラーゼ活性を改善するポリペプチドをコードするそのような核酸配列は、例えば、第１の態様のポリヌクレオチドのドナー微生物のゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、単離してもよい。一旦、配列番号２から誘導されるプローブに相同な核酸配列を検出したら、配列およびその周囲のＤＮＡは、当業者に公知の技術（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）を利用して、単離またはクローニングすることができる。
【００５７】
この方法では、増強された機能を伴うポリペプチドをコードする変種ポリヌクレオチド、またはコンパクチンヒドロキシラーゼ酵素の機能化を支援もしくは容易にするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはコンパクチンヒドロキシラーゼ遺伝子より前方のプロモーターを活性化するポリヌクレオチドをクローニングすることが可能である。
【００５８】
一実施形態では、ｐ４５０酵素に必要な酸化還元再生系（ピリペンコ（Ｐｙｌｙｐｅｎｋｏ）およびシュリヒティンク（Ｓｃｈｌｉｃｈｔｉｎｇ）、２００４年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７３：９９１−１０１８）を単離し、そしてこれを、コンパクチンヒドロキシラーゼ発現宿主細胞に導入することによって、コンパクチンからプラバスタチンへの変換の効率を改善する方法を開示する。そのような系を宿主細胞に導入する一般的方法は、コンパクチンヒドロキシラーゼの導入に関する説明と同じであり、上記で概説している。そのような酸化還元再生系は、第２の態様のポリヌクレオチドが入手され得るか、または異種発現され得る種として例示される種から入手され得；その例には、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種（即ち、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトマイセス・フラビドビレンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｉｄｏｖｉｒｅｎｓ）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・エクスフォリエーテス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｘｆｏｌｉａｔｅｓ）、ストレプトマイセス・アバーミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ））またはアミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種（即ち、アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ））またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（即ち、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））またはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種（即ち、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））またはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種（即ち、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））があるが、これらに限定されない。また、代替的系を適用することもできる。代替的系の例には、本発明のコンパクチンヒドロキシラーゼをクラスＩＶｐ４５０系に組込み、それによって、それを酸化還元パートナーに融合すること（ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら、２００２年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：３８９８−３９０８およびクボタ（Ｋｕｂｏｔａ）ら、２００５年、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９：２４２１−２４３０）、または亜リン酸デヒドロゲナーゼのようなＮＡＤ（Ｐ）Ｈ生成非ｐ４５０連結酵素（ヨハネス（Ｊｏｈａｎｎｅｓ）ら、２００５年、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５７２８−５７３４）、または非酵素的手段（ホールマン（Ｈｏｌｌｍａｎｎ）ら、２００６年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２４：１６３−１７１）があるが、これらに限定されない。
【００５９】
本発明の第４の態様では、第３の態様の方法に従って産生されるプラバスタチンは、医薬組成物内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ｃｍｐＨ遺伝子の産物、コンパクチンヒドロキシラーゼによって触媒される変換を示す。説明：［Ｃ］＝コンパクチン；［Ｐ］＝プラバスタチン。
【図２】プラスミドｐＺＥＲＯ−Ａｏ−１１Ｈ９を示す。説明：ＯＲＦ−１＝第１のオープンリーディングフレーム、ＯＲＦ−２＝第２のオープンリーディングフレーム、ｚｅｏ＝ゼオシンに対する耐性をコードする遺伝子、ｋａｎ＝カナマイシンに対する耐性をコードする遺伝子。
【図３】プラスミドｐＺＥＲＯ−Ａｏ−１１Ｈ９ｄを示す。説明：ＯＲＦ−１＝第１のオープンリーディングフレーム、ｚｅｏ＝ゼオシンに対する耐性をコードする遺伝子、ｋａｎ＝カナマイシンに対する耐性をコードする遺伝子。
【図４】プラスミドｐＡＣＹＣ−ｔａｑＳｃｐ４５０を示す。説明：Ｓｃ−ｐ４５０＝コンパクチンヒドロキシラーゼｐ４５０をコードするストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）遺伝子、ｃａｔ＝クロラムフェニコールに対する耐性をコードする遺伝子。
【図５】プラスミドｐＡＣＹＣ−ｔａｑＡｏｐ４５０を示す。説明：Ａ０−ｃｍｐＨ＝コンパクチンヒドロキシラーゼｐ４５０をコードするアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）遺伝子、ｃａｔ＝クロラムフェニコールに対する耐性をコードする遺伝子。
【００６１】
［実施例］
［一般的方法］
標準的なＤＮＡ手順および原核生物培養は、その他（サンブルック，Ｊ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）ら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載のとおりに行った。ＤＮＡは、プルーフリーディング酵素Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を使用して、増幅した。制限酵素は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎまたはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製であった。コンパクチンを、２０ｍｇ／ｍｌの最終濃度でエタノールに溶解することによって、コンパクチンの加水分解を行った。ＮａＯＨを、４Ｍストックから、０．１Ｍの最終濃度まで添加した。溶液を、５０℃で１〜２時間、加熱し、続いて、室温まで冷却した。この溶液は、室温で３箇月間、貯蔵することができる。両方の化合物を２０ｍｇ／ｍｌでエタノールに溶解することによって、プラバスタチンおよび非加水分解コンパクチンストック溶液を作製した。
【００６２】
［実施例１］
［効率的な全細胞のコンパクチンからプラバスタチンへの生体変換のスクリーニング］
多様な原核および真菌種（表１）を試験して、加水分解されたコンパクチンからの改善された変換を伴う種を単離した。すべての種を、１〜３日間（種の増殖速度に依存する）、２５ｍｌの２×ＹＴ培地中でプレ培養し、洗浄し、そして２５ｍｌ新鮮２×ＹＴ培地中に懸濁した。２８０ｒｐｍおよび３０℃で振盪しながら数時間の順応期間後、加水分解したコンパクチンを、０．１、０．２、０．５および１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。２４時間のインキュベーション後、振盪フラスコの内容物を５０ｍｌグライナーチューブに移すことによって、ブロスを回収した。サンプルを−２０℃で凍結し、続いて、凍結乾燥した。１〜２ｍｌメタノールの凍結乾燥サンプルへの添加、それに続く、ボルテックス撹拌の反復によって、スタチン系薬剤を抽出した。遠心分離によって、液相から固体を分離した。２００μｌのメタノール抽出物をＨＰＬＣバイアルに移し、続いて、以下のようなＨＰＬＣ分析を行った：
【００６３】
【表１】
【００６４】
【表２】
【００６５】
表１において認められ得るように、４つの種の試験した組：アクチノキネオスポラ・リパリア（Ａｃｔｉｎｏｋｉｎｅｏｓｐｏｒａ ｒｉｐａｒｉａ）、シュードノカルジア・アルニ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ａｌｎｉ）、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）およびアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）によって、プラバスタチンを合成した。
【００６６】
［実施例２］
［コンパクチンの生物学的加水分解］
実施例１に記載の種がまた、コンパクチンをラクトン型で加水分解および／またはヒドロキシル化するかどうかを確立するために、選択した４つの種を、１〜３日間（種の増殖速度に依存する）、２５ｍｌの２×ＹＴ培地中でプレ培養し、洗浄し、そして２５ｍｌ新鮮２×ＹＴ培地中に再懸濁した。２８０ｒｐｍおよび３０℃で振盪しながら数時間の適応後、非加水分解コンパクチンを、０．２ｍｇ／ｍｌで添加した。２４時間のインキュベーション後、振盪フラスコの内容物を５０ｍｌグライナーチューブに移すことによって、ブロスを回収した。サンプルを−２０℃で凍結し、続いて、凍結乾燥した。１〜２ｍｌメタノールの添加、それに続くボルテックス撹拌の反復によって、スタチン系薬剤を抽出した。遠心分離によって、液相から固体を分離した。２００μｌのメタノール抽出物をＨＰＬＣバイアルに移し、続いて、実施例１に記載のようにＨＰＬＣ分析を行った。４つのすべての種（アクチノキネオスポラ・リパリア（Ａｃｔｉｎｏｋｉｎｅｏｓｐｏｒａ ｒｉｐａｒｉａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）およびアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ））は、コンパクチンを加水分解するが、これは、プラバスタチン形成に不可欠ではない。アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）は、プラバスタチンを合成するのに最も効率的な種であった。
【００６７】
【表３】
【００６８】
［実施例３］
［アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）は、極めて効率的なコンパクチンヒドロキシル化を有する］
実施例１から、アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）は、コンパクチンヒドロキシル化について、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）より優れていると結論付けた。さらなる研究のために、両方の種を、２４時間、２５ｍｌの２×ＹＴ培地中でプレ培養し、洗浄し、そして２５ｍｌ新鮮２×ＹＴ培地に再懸濁した。２８０ｒｐｍおよび３０℃で振盪しながら数時間後、加水分解コンパクチンを、０．１および０．２ｍｇ／ｍｌで添加した。２４時間のインキュベーション後、振盪フラスコの内容物を５０ｍｌグライナーチューブに移すことによって、ブロスを回収した。サンプルを−２０℃で凍結し、続いて、凍結乾燥した。１〜２ｍｌメタノールの乾燥サンプルへの添加、それに続く、ボルテックス撹拌の反復によって、スタチン系薬剤を抽出した。遠心分離によって、液相から固体を分離した。２００μｌのメタノール抽出物をＨＰＬＣバイアルに移し、続いて、実施例１に記載のようにＨＰＬＣ分析を行った。表３において認められ得るように、アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）は、１００％の効率でコンパクチンをプラバスタチンに変換することが可能であり、ここで、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）では認められない。
【００６９】
【表４】
【００７０】
［実施例４］
［コンパクチンをプラバスタチンに変換する生体触媒をコードする遺伝子フラグメントの単離］
［アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）の遺伝子ライブラリー］
液体培地（１０ｇ／ｌグルコース、５ｇ／ｌ酵母抽出物、２０ｇ／ｌデンプン、１ｇ／ｌのＣａＣＯ３および０．５ｇ／ｌカザミノ酸、バッフルフラスコ）中にアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）のコロニーを２８℃で、ＯＤ＝２．０まで増殖させた。一部を使用して、グリセロールストックを調製し、そして一部を使用して、ゲノムＤＮＡ単離のための細胞の調製のために５０ｍｌの液体培地を伴うフラスコに播種（比１／５０）した。２８℃で１６時間後、ゲノムＤＮＡを単離するために、培養を使用した。それに対し、インキュベーションの最後の１時間の間に、アンピシリンを２００μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。細胞を、遠心分離（８０００ｒｐｍで１５分間）に回収し、そしてペレットを５０ｍＭのＥＤＴＡを伴うｐＨ８．０に調整した５ｍｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌに再懸濁した。１００μｌのリゾチーム（１００ｍｇ／ｍｌ）および４０μｌプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、懸濁液を３０分間、３７℃でインキュベートした。Ｐｒｏｍｅｇａ製のＮｕｃｌｅｉ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（６ｍｌ）を添加した。８０℃で１５分間、および６５℃で３０分間のインキュベーションにより、ほぼ完全な細胞溶解物がもたらされた。ＲＮａｓｅ処置（１０μｌの１００ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ溶液）の後、２ｍｌのＰｒｏｍｅｇａ製のＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、混合物をボルテックス撹拌（２０秒間）し、そして氷上でインキュベート（１５分間）した。遠心分離（５０００ｒｐｍで１５分間）後、上清を、０．１容積のＮａＡｃ（３Ｍ、ｐＨ５）および２容積のＥｔＯＨ（９６％）と混合した。沈殿したゲノムＤＮＡの目視で認められる複合体をパスツールピペットで移し、そして５００μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）に溶解した。第２のプロテイナーゼＫ処置（１０μｌの２０ｍｇ／ｍｌストック溶液を２００μｌのサンプルあたりに使用し、続いて、３７℃で３０分間のインキュベーションを行った）を適用して、残留するタンパク質を取り出した。プロテイナーゼＫ工程後、５００μｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ＰＣＩ、２５：２４：１）を添加し、そして混合物を１４，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。上相を新しいバイアルに移し、そして微量に残留するフェノールを取り出すために、５００μｌのＰＣＩ（２４：１）を添加した。相を遠心分離により分離し、そしてＤＮＡの沈殿のために、上相を０．１容積のＮａＡｃ（３Ｍ、ｐＨ５）および２容積のＥｔＯＨ（９６％）と混合した。ゲノムＤＮＡをピペットで採取し、７０％冷ＥｔＯＨで洗浄し、そして５００μｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液に溶解した。これにより、１．８５のＡ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍを伴う１３４μｇの精製されたゲノムＤＮＡを生じた。Ｓａｕ３ＡＩ（０．０６７単位／μｇのＤＮＡ）を使用して、単離されたアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＤＮＡを部分的に消化して、４〜１０ｋｂの範囲のより小さなフラグメントを得た。ゲノムＤＮＡ（５０μｇ）を消化し、そしてＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ抽出キットを使用して、調製用０．６％アガロースゲルから４〜１０ｋｂの間のフラグメントを単離し、そして最終的に２０μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０に溶解した。これらのフラグメントをＢａｍＨＩで消化したｐＺＥｒＯ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、そして大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに形質転換して、約３９，０００個のコロニーを得た。２０個の個々のコロニーを使用して、１０ｍｌの２×ＹＴ培地に播種して、ライブラリーの多様性を確認し、そして平均的な挿入物のサイズを決定した。１９のプラスミドが異なるサイズの挿入物を含有した一方、１個のコロニーが挿入物を有さなかった（自己連結ベクター５％）。ｐＺＥｒＯ−２におけるｇＤＮＡフラグメントの平均挿入物サイズは、約３．８ｋｂであった。得られたすべての形質転換体をプレートから回収し、そしてカナマイシンを伴う液体２×ＹＴ培地に再懸濁し、そして８％（ｖ／ｖ）の最終濃度でグリセロールを添加し、そして−８０℃で貯蔵した。
【００７１】
［アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）遺伝子ライブラリーのスクリーニング］
アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）遺伝子ライブラリーを２×ＹＴ寒天＋カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）上にプレート化し、そして７２時間、室温でインキュベートした。ほぼ１２，０００個のコロニーを使用して、０．２ｍｌの２×ＹＴ培地＋３５ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有する１２０枚の９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に播種した。ＭＴＰを、２５℃、５００ｒｐｍで４８時間、インキュベートした。各ウェルから、１４０μｌの細胞懸濁液を、１０分間、３，０００ｒｐｍで遠心分離し、そしてプレートをティッシュペーパー上で軽くたたくことによって上清を廃棄した（培養物の残りを５０μｌの２０％グリセロールに添加し、そして−８０℃で貯蔵した）。１ウェルあたり２５０μｌの基質溶液（加水分解されたコンパクチン、２００ｍｇ／Ｌ；グルコース、２ｇ／ｌ；リン酸緩衝液、５０ｍＭ；ｐＨ６．８を伴う２×ＹＴ培地）。ウェル中の細胞ペレットを懸濁し、そして４８時間、３０℃で、２８０ｒｐｍでインキュベートした。１ウェルあたり０．３５ｍｌメタノールの添加後、スタチン系薬剤を抽出し、そして１時間、２８０ｒｐｍで混合した。細胞破砕物を、１５分間、２７５０ｒｐｍの遠心分離によって取り出した。１００μｌのサンプルを、ＬＣ−ＭＳによって分析した。
【００７２】
［アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）遺伝子ライブラリーのＬＣ−ＭＳ分析］
ヘリウム雰囲気２における撹拌下、１晩中ＭｅＯＨ中１．５ＭのＮａＯＨ（１：２）によるメバスタチン（Ａ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロット番号Ａ７４１３、純度９９．３６％）の加水分解によって、コンパクチン標準を調製した。ｐＨをＨＣｌ（４Ｍ）の添加によって減少し、そして標準物を水でさらに希釈する。サンプルを、ＡＣＴ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製のショート（２０ｍｍ）ＣＮカラムを伴うＷａｔｅｒｓ ＬＣ／ＭＳシステム上、移動相として水およびアセトニトリル（両者は０．１％ギ酸を伴う）で分析する。ＬＣ−部分の詳細は以下のとおりである：
【００７３】
【表５】
【００７４】
ポジティブモード（ＥＳ＋）のＭＳエレクトロスプレーイオン化を使用し、そして化合物を３つの化合物の選択されたイオン（ＳＩＲ）を伴うナトリウム付加物（［Ｍ＋Ｎａ］＋）として分析する。ＭＳ−部分の詳細は以下のとおりである：
【００７５】
【表６】
【００７６】
スキャンマス範囲（ｍ／ｚ）２００〜６００ａｍｕ、スキャン期間０．２０秒間、スキャン間遅延０．０５秒間；３チャンネルのＳＩＲ：４１３．３０、４３１．３、４４７．３、ドエル０．０７秒間、スキャン間遅延０．０５秒間。
【化１】
【００７７】
この装備により、４種の最も重要な分子、コンパクチン、加水分解されたコンパクチンならびに６−ヒドロキシ−コンパクチン２つの立体異性体、即ち、β−変種プラバスタチン（構造については上記を参照のこと）およびα−変種エピ−プラバスタチンを区別することが可能である。
【００７８】
【表７】
【００７９】
それらは、プラバスタチンの位置で小さいが、有意なピークを示したため、いくらかのクローンを候補として同定した。例として表４において、１個のクローンがバックグランドを超えるシグナルを生じる（ウェル位置Ｂ１のクローン）結果のサブセットを示す。
【００８０】
［実施例５］
［コンパクチンからプラバスタチンへの生体触媒をコードする遺伝子の同定］
［アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）由来の推定コンパクチンヒドロキシラーゼの再試験］
実施例４の分析を、推定クローンとして第１ラウンドにおいて同定した４個のクローンで反復した。しかし、今回、クローンを、ＭＴＰの代わりに振盪フラスコにおいて増殖させ、そしていくつかの培養培養条件を変動させた。クローンを、推定コンパクチンヒドロキシラーゼを含有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞を播種した１０ｍｌの２×ＹＴ中でプレ培養し、そして２４時間、３０℃、２８０ｒｐｍで増殖させた。続いて、０．１〜０．５ｍＭのＩＰＴＧおよび０．５ｍＭのδ−アミノレブリン酸を添加し、そして培養物を２２℃で、２８０ｒｐｍ、１２時間、インキュベートした。細胞を回収し、洗浄し、そして（加水分解されたコンパクチン、２００ｍｇ／Ｌ；グルコース、２ｇ／ｌ；リン酸緩衝液、５０ｍＭ；ｐＨ６．８で補充した）新鮮２×ＹＴ培地中でボルテックス撹拌することによって、再懸濁した。細胞懸濁液を、３０または３７℃のいずれか、２４または４８時間、２８０ｒｐｍでインキュベートした。スタチン系薬剤を抽出し、そして実施例４に記載のように分析した。
【００８１】
【表８】
【００８２】
表５において認められ得るように、唯一のクローン１１Ｈ９が真の有意なコンパクチンからプラバスタチンへの変換を有する。従って、この１つは、さらなる分析のために選択した。
【００８３】
［配列決定および配列解析］
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）クローン１１Ｈ９を、カナマイシンを伴う２×ＹＴにおいて培養し、そしてＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐｅｐキットを使用して、プラスミドＤＮＡを単離し、そしてｐＺＥＲＯ−２プラスミドにおけるアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ゲノム挿入物の配列を決定した。挿入物の配列は、２５４５ヌクレオチド長（配列番号１を参照のこと）である。ＤＮＡ配列の分析を実施して、そして２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定することができた（図２）。第１のＯＲＦは、既知のｐ４５０酵素（即ち、最良は、ストレプトマイセス・ツベルシジクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｃｕｓ）由来のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ１０５Ｓ２である）にいくつかの相同性を有する４０１アミノ酸（配列番号２および３）の推定タンパク質をコードする。第２のＯＲＦはいくつかの膜貫通領域を有し、そしてＡＴＰ型Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＡＢＣ）タンパク質をコードし得る。
【００８４】
［構造遺伝子、ｃｍｐＨの同定］
コンパクチンを加水分解することが可能な構造遺伝子を同定するために、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩによる二重消化を介して、ｐＺＥＲＯ−Ａｏ−１１Ｈ９からＯＲＦ−２を欠失させた。続いて、４．９ｋｂフラグメントを単離し、そして自己連結させた。得られるプラスミドｐＺＥＲＯ−Ａｏ−１１Ｈ９は、完全ＯＲＦとしてただ１つのＯＲＦ−１を含有する（図３）。このクローンは、クローンｐＺＥＲＯ−Ａｏ−１１Ｈ９と同じ変換率を有し、ＯＲＦ−１がｃｍｐＨと命名される機能的なコンパクチンヒドロキシラーゼをコードすることを示す。
【００８５】
［比較例６］
［大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）におけるストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）コンパクチンヒドロキシラーゼの活性］
［ｐ４５０−ＳＣＡ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現クローンの構築］
ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）ｐ４５０をコードする遺伝子を、配列番号７および配列番号８のプライマーを使用して、株ＦＥＲＭ−ＢＰ１１４５から単離したゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲフラグメントを、供給者の指示書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＴＡベクターにおけるクローンであった。発現クローンを、ｐＡＣＹＣ−ｔａｑ（Ｋｒａｅｍｅｒ，Ｍ．，２０００．Ｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇｅｎ ｚｕｍ Ｅｉｎｆｌｕｓｓ ｅｒｈｏｅｈｔｅｒ Ｂｅｒｅｉｔｓｔｅｌｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｓｅ−４−Ｐｈｏｓｐｈａｔ ｕｎｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔ ａｕｆ ｄｅｎ Ｋｏｈｌｅｎｓｔｏｆｆｆｌｕｓｓ ｉｎ ｄｅｎ Ａｒｏｍａｔｅｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｅｗｅｇ ｖｏｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｂｅｒｉｃｈｔｅ ｄｅｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍｓ Ｊｕｅｌｉｃｈ ３８２４，ＩＳＳＮ ０９４４−２９５２，ＰｈＤ Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ）を、Ａｃｃ６５Ｉで消化し、そしてｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＴＡベクターから単離したＡｃｃ６５Ｉフラグメントに連結することによって、構築し、ｐＡＣＹＣ−ｔａｑＳｃｐ４５０（図４）を得た。
【００８６】
［大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）抽出物における活性決定］
ｐＡＣＹＣ−ｔａｑＳｃｐ４５０を含有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞を、クロラムフェニコールを伴う１０ｍｌの２×ＹＴにおいて培養した。細胞懸濁液を、基本的に処理し、そして実施例５に記載のようにコンパクチンと共にインキュベートした。この場合、培養温度は３７℃であり、そしてクロラムフェニコールおよびＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）を、反応混合物に添加した。反応物を、３０℃および２２０ｒｐｍでインキュベートした。サンプルを様々な時点で採取し、そして実施例１に記載のようなＨＰＬＣプロトコルを使用して、分析した。２４時間後、プラバスタチンを決定することができなかった。
【００８７】
［実施例７］
［大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）におけるアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）コンパクチンヒドロキシラーゼの活性］
［Ａｏ−ｃｍｐＨ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）発現クローンの構築］
アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ｐ４５０をコードする遺伝子を、配列番号９および配列番号１０のプライマーを使用して単離したゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲフラグメントを、供給者の指示書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＴＡベクターにクローニングした。発現クローンを、ｐＡＣＹＣ−ｔａｑ（Ｋｒａｅｍｅｒ，２０００）をＡｃｃ６５Ｉで消化し、そしてｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＴＡベクターから単離したＡｃｃ６５Ｉフラグメントを連結することによって、構築し、ｐＡＣＹＣ−ｔａｑＡｏｐ４５０（図５）を得た。
【００８８】
［大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）抽出物における活性決定］
ｐＡＣＹＣ−ｔａｑＡｏｐ４５０（図５）を含有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞を、クロラムフェニコールを伴う２×ＹＴ（１０ｍｌ）において培養した。細胞懸濁液を、実施例５に記載のようにコンパクチンと共にインキュベートした。培養温度は３７℃であり、そしてクロラムフェニコールおよびＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）を添加した。反応物を、３０℃および２２０ｒｐｍでインキュベートした。サンプルを様々な時点で採取し、そして実施例１に記載のようなＨＰＬＣプロトコルを使用して、分析した。２４時間後、プラバスタチンの大きなピークを検出した。この結果は、アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ｐ４５０酵素が他のｐ４５０よりも大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においてコンパクチンを加水分解するのにかなり良好に適切であることを明確に実証する。
【００８９】
【表９】
【００９０】
［実施例８］
［大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）におけるアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）コンパクチンヒドロキシラーゼの誘導体の活性］
遺伝子配列番号１１〜１８、２７〜３４を合成的に生成し、そして（配列番号９について）ａｔｔＢ１および（配列番号１０について）ａｔｔＢ２が付加された組み換え部位を伴うオリゴヌクレオチド配列番号９および１０によるＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。ＢＰ反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を実施することによって、ＰＣＲフラグメントを、Ｇａｔｅｗａｙ ｐＤＯＮＲ２２１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、オランダ）にクローニングした；配列をＤＮＡ配列決定によって確認して、ＰＣＲ関連のエラーを排除した。Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ ｒｅａｃｔｉｏｎを使用して、遺伝子を、ｐＤＯＮＲ２２１ベクターからｐＥＴ−ＤＥＳＴ４２ベクターにトランスファーし、最終発現ベクターｐＥＴ−ＤＥＳＴ４２−Ｐ４５０を得た。ｐＥＴ−ＤＥＳＴ４２−Ｐ４５０（挿入物として配列番号１１〜１８、２７〜３４）を所有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ ＤＥ３を、カナマイシンを伴う１０ｍｌの２×ＹＴ中、３０℃でＯＤ６００＝０．５〜１．０まで培養した。続いて、培養物を０．１〜０．３ｍＭのＩＰＴＧおよび０．５ｍＭのδ−アミノレブリン酸で補充し、そして２２℃、２８０ｒｐｍで１２時間、インキュベートした。細胞を回収し、洗浄し、そして（加水分解されたコンパクチン、２００ｍｇ／Ｌ；グルコース、２ｇ／ｌ；リン酸緩衝液、５０ｍＭ；ｐＨ６．８で補充した）新鮮２×ＹＴ培地に再懸濁した。細胞懸濁液を、３０または３７℃のいずれか、２４または４８時間、２８０ｒｐｍでインキュベートした。スタチン系薬剤を抽出し、そして実施例４に記載のように分析した。２４時間後、極めて大きなプラバスタチンピークを同定することができた。実施例７に記載の実験とは対照的に、配列番号３または配列番号６によってコードされるコンパクチンヒドロキシラーゼ酵素と比較する場合、生成したプラバスタチンの大部分は、それぞれ配列番号１９〜２６および配列番号３５〜４２の酵素の有意に変化した立体特異性の証拠を示すβ−変異である。
【００９１】
【表１０】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、プラバスタチンの産生のための方法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
スタチン系薬剤は、３−ヒドロキシ−３−メチルブチリルコエンザイムＡレダクターゼ、コレステロール生合成における律速酵素の既知のインヒビターである。従って、スタチン系薬剤は、ヒトを含むさまざまな哺乳動物において血漿コレステロールレベルを減少することが可能であり、従って、化合物は、高コレステロール血症の治療に有効である。市場には、いくらかのタイプのスタチン系薬剤、中でも、アトルバスタチン、プラバスタチン、コンパクチン、ロバスタチンおよびシンバスタチンが存在する。前者は化学合成を介して作製される一方、後者の４つは、直接発酵または前駆体発酵のいずれかを介して産生される。これらの（前駆体）発酵は、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属およびモナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属の真菌によって行われる。
【０００３】
プラバスタチンは、２つの順次発酵で産生される。まず、ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）がコンパクチンを産生し、そのラクトン環を化学的に加水分解し、続いて、得られる生成物を、これをプラバスタチンにヒドロキシル化するストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）の培養に供給する。本発明に関して、用語「加水分解されたコンパクチン」は、非ラクトン型のコンパクチン（即ち、水との反応によりラクトン環が開裂した（図１））を指し；同様に、用語「コンパクチンの加水分解」は、ラクトン環の開裂を指す。これらの代謝物の産生のための産業用の種およびプロセスは、異なる方法を使用して最適化される。それ故、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）によるコンパクチン産生は、本来の４０ｍｇ／ｌから５ｇ／ｌに増加された。生体触媒変換のために、８０％変換収率を伴う３ｇ／ｌのメバスタチンに対する耐性を伴うストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）変異株がＭｅｔｋｉｎｅｎにより得られた（Ｍｅｔｋｉｎｅｎ Ｎｅｗｓ、２０００年３月、Ｍｅｔｋｉｎｅｎ Ｏｙ、フィンランド；マンゾーニ（Ｍａｎｚｏｎｉ）およびロリーニ（Ｒｏｌｌｉｎｉ）、２００２年、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５８：５５５−５６４により検討された）。商業的には成り立つものの、コンパクチン力価は、例えば、産業用アミノ酸またはペニシリンＧ産生と比較して低いため、このプロセスは、最適な状態からはかけ離れている；さらに、コンパクチンは、生体変換に使用されるストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株に対する毒性効果を防止するため、希釈しなければならず（ホソブチ（Ｈｏｓｏｂｕｃｈｉ）ら、１９８３年、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．３６：８８７−８９１）、そして供給される２０％のコンパクチンがストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株によって変換されない。
【０００４】
コンパクチンからプラバスタチンへの変換は、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）のｐ４５０酵素によって触媒される（マツオカ（Ｍａｔｓｕｏｋａ）ら、１９８９年、Ｅｕｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８４：７０７−７１３を参照のこと）。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細菌は糸状に増殖するため、高い粘度を伴う培養を生じ、低い酸素移動速度、従って、より低い発酵生産性をもたらすため、それらの細菌では、一般的に問題が存在する。最適には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（大規模生体触媒において広範に使用される宿主）のような産業的に十分に装備された種が有用であるが、この種は、ｐ４５０酵素も、またｐ４５０酸化還元再生系も有さない。これまでのところ、コンパクチンからプラバスタチンへの変換における大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のような発酵および酵素産生に適切な種の使用については、報告されていない。
【０００５】
別の問題は、ｐ４５０酵素には補因子の再生が必要であることであり、典型的に、宿主細胞に存在する特定の対のタンパク質によって実現される。この系が最適でない場合、全体的な変換は、コンパクチンの例のように、実質的に１００％未満である。代替的種を単離するための様々な試みが行われているが、１００％の変換率を有するものは認められていない（米国特許第６，９０５，８５１号明細書、米国特許第６，３６５，３８２号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１５３４２２号明細書、米国特許出願公開第２００４／０２５３６９２号明細書および米国特許出願公開第２００４／０２０９３３５号明細書を参照のこと）。さらに、これらのうち、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）について現実的な改善を示すものはない。コンパクチンに対して極度に高い耐性を伴う種も報告されているが、変換の効率は不十分である（米国特許第６，３０６，６２９号明細書、米国特許第６，７５０，３６６号明細書）。他は、既知のｐ４５０酵素の変換率を改善する方法としてファミリーシャッフリングを使用することを示唆しているが、ｐ４５０酵素は、極めて基質特異的であり、それほど高い配列相同性を有さず、そして補因子再生のための１組の特定の酵素を必要とし得るため、これは極めて困難であることから、何らデータを示していない（米国特許第６，６０５，４３０号明細書）。変換のための異なる酵素を使用する種を単離することによって、この後者の問題を解決することが試されている。この分野における１つの特定の例は、７８％の最大変換率でコンパクチンをプラバスタチンに変換することが可能なアクチノマジュラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）種である（ポン（Ｐｅｎｇ）およびドマン（Ｄｅｍａｉｎ）（１９９８年、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：３７３−３７５；米国特許第６，２７４，３６０号明細書））。そのため、あらゆる取組みにもかかわらず、僅か８０％変換率しか伴わないストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）がなお、プラバスタチンの形成のための選好される産業的種として使用され、そして改善が非常に望まれている。
【０００６】
［発明の説明］
本発明に関して、用語「保存的置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換を意味することが意図される。これらのファミリーは、当該技術分野において公知であり、そして塩基側鎖（例えば、リジン、アルギニンおよびヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン類、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）ならびに芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニントリプトファン、ヒスチジン）を伴うアミノ酸を含む。
【０００７】
本明細書において使用する用語「単離されたポリヌクレオチドまたは核酸配列」は、他の核酸配列を本質的に含まない、例えば、アガロース電気泳動によって決定されるように、少なくとも２０％純粋、好ましくは少なくとも４０％純粋、より好ましくは少なくとも６０％純粋、さらにより好ましくは少なくとも８０％純粋、最も好ましくは少なくとも９０％純粋であるポリヌクレオチドまたは核酸配列を指す。例えば、単離された核酸配列は、その天然の局在由来の核酸配列を、それが再生される、異なる部位に再局在化するために、遺伝子操作において使用される標準的なクローニング手順によって得ることができる。
【０００８】
用語「プラバスタチン」は、αもしくはβ−配置、またはαおよびβ−配置の両方の混合を伴うコンパクチンの６’−ヒドロキシル変種として規定される。ここで、科学文献において、プラバスタチンという用語は、コンパクチンの６’−ヒドロキシル変種のβ−配置についてのみ使用される一方、α変種はエピプラバスタチンと命名されることを述べることが重要である。しかし、本発明は、コンパクチンの６−ヒドロキシル変種を作製するための一般に効率的な方法について記載した。従って、プラバスタチンという用語は、αおよびβ型の両方に当てはまる。
【０００９】
本発明の目的は、コンパクチンをプラバスタチンに変換する有効かつ産業的適用可能な方法を提供することである。本発明の別の目的は、コンパクチンをプラバスタチンに変換するためのアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）由来の新規のｐ４５０酵素を使用することである。本発明は、コンパクチンのヒドロキシル化は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において効率的に実施されるプロセスを提供することによって、先行技術のプロセスにおいて遭遇する問題を解決する。コンパクチンのヒドロキシル化が１００％変換で実施されるプロセスもまた、提供される。より具体的には、アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）の細胞全体または無細胞抽出物のいずれかとコンパクチンとを接触させることによって、コンパクチンを（ｃｍｐＨ遺伝子によってコードされる）アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）コンパクチンヒドロキシラーゼ酵素と接触させるプロセスが提供される。好ましくは、コンパクチンヒドロキシラーゼ（ｃｍｐＨ）がアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）から得られ、そして別の宿主種に移されるプロセスが提供される。好ましくは、本宿主は、高レベルのコンパクチンに耐性であり、そしてコンパクチン産生が可能である。
【００１０】
第１の態様では、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号３の配列に実質的に相同であるアミノ酸を有するポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドが提供され、ポリペプチドは、コンパクチンヒドロキシラーゼ活性を示す。
【００１１】
第１の実施形態では、前記ポリペプチドは、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９９％の効率でコンパクチンをヒドロキシル化する。好ましくは、前記ヒドロキシル化の生成物はプラバスタチンである。
【００１２】
本発明の部分として、現在利用可能なコンパクチンヒドロキシラーゼの産業的適用がアクチノマイセテス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）のクラス由来の種に限定され；即ち、それらは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）または糸状菌例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）もしくはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種のような産業規模での発酵により従う種に移すことができることが実証される。本発明によって記載されるコンパクチンヒドロキシラーゼ遺伝子は、この問題を有さない。従って、これらの遺伝子によってコードされる新規のポリペプチドの活性は、次のように特徴付けることができる：それらは、アクチノマイセテス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）以外の種、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における適用を可能にし、および／またはそれらは、少なくとも８０％の変換効率を伴うコンパクチンからプラバスタチンへの効率的なヒドロキシル化を可能にする。本発明に関して、少なくとも８０％の効率は、少なくとも８０％のコンパクチンがプラバスタチンに変換されることを意味する。
【００１３】
配列番号３に実質的に相同であるアミノ酸配列を伴うポリペプチドは、特定されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、なお最も好ましくは少なくとも９７％、究極的に少なくとも９８％、なおより究極的に少なくとも９９％の同一性の程度でアミノ酸配列を伴うポリペプチドとして規定され、実質的に相同なペプチドは、コンパクチンヒドロキシラーゼ活性を示す。実質的に相同なポリペプチドは、異なる集団由来の細胞または天然の対立遺伝子または株内の変動による集団内に存在し得る多型を包含する。実質的に相同なポリペプチドは、さらに、特定されたアミノ酸および／またはＤＮＡ配列を生じる種以外の種から誘導してもよく、または人工的に設計および合成されたＤＮＡ配列によってコードされてもよい。特定されたＤＮＡ配列に関連し、そして遺伝子暗号の縮重によって得られるＤＮＡ配列もまた、本発明の部分である。相同体はまた、なおコンパクチンヒドロキシラーゼ活性を示す全長配列の生物学的に活性なフラグメントを包含する。
【００１４】
２つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、２つの配列間で同一であるアミノ酸の百分率を指す。同一の程度は、ラッチド（Ｌａｔｃｈｅｄ）ら（１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）において記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定される。ＢＬＡＳＴ解析ソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に入手することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）およびヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５を参照のこと）５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５およびＮ＝４を使用する。
【００１５】
実質的に相同なポリペプチドは、単に、特定されたアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸の保存的置換または非必須アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を含有してもよい。従って、非必須アミノ酸は、生物学的機能を実質的に変更することなく、これらの配列の１つにおいて変更することができる残基である。例えば、表現型性サイレントアミノ酸置換の作製方法に関する指針は、ボウイ（Ｂｏｗｉｅ）ら、（１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１３０６−１３１０）に提供されており、アミノ酸配列の変更に対する忍容性を研究するための主な２つのアプローチが存在することを示している。第１の方法は、変異が天然の選択によって許容されるかまたは拒絶されるかのいずれかである進化のプロセスに依存する。第２のアプローチは、遺伝子操作を使用して、クローニングされた遺伝子の特定の位置におけるアミノ酸変化を誘導し、そして選択またはスクリーニングして、機能性を維持する配列を同定する。これらの研究は、タンパク質がアミノ酸置換に驚くほど忍容性であることを示しており、そしてタンパク質の所定の位置においてどの変化が許容性である可能性があるかを示す。例えば、ほとんどの埋没されるアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般的にほとんど保存されない。他のそのような表現型性サイレント置換については、ボウイ（Ｂｏｗｉｅ）ら、および本明細書において引用した参考文献に記載されている。
【００１６】
第２の実施形態では、改善された触媒機能（即ち、コンパクチンからプラバスタチンへの変換）をもたらす変種は、コンパクチンヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を改変することによって、入手し得る。そのような改変は：
・コドンがコンパクチンヒドロキシラーゼを発現させるために使用される宿主種に適応されるような方法で、コドン使用頻度を改善すること。
・コドンがコンパクチンヒドロキシラーゼを発現させるために使用される宿主種に適応されるような方法で、コドン対使用頻度を改善すること。
・半減期が増加したｍＲＮＡ分子を生じるコンパクチンヒドロキシラーゼをコードする遺伝子情報への安定化配列の付加。
・無作為変異を誘導するためのエラープローンＰＣＲ、それに続く、得られる変種のスクリーニング（実施例４において本質的に記載されている）および改善された動態特性を伴う変種の単離。
・コンパクチンヒドロキシラーゼの関連変種のファミリーシャッフリング、それに続く、得られる変種のスクリーニング（実施例４において本質的に記載されている）および改善された動態特性を伴う変種の単離。
【００１７】
改善された動態特性を伴う変種を伴う好適な方法については、国際公開第０３０１０１８３号パンフレットおよび国際公開第０３０１３１１号パンフレットに記載されている。
【００１８】
改善された機能性を伴うコンパクチンヒドロキシラーゼをコードする改善されたポリヌクレオチドが得られる場合、改善された触媒機能が得られる。本発明の部分として、意外なことに、コンパクチンの６−ヒドロキシル変種のβ−配置（即ち、薬学的に活性なプラバスタチン異性体）とコンパクチンの６−ヒドロキシル変種のα−配置との間の比は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５もしくは２６またはこれらに実質的に相同な配列の改善されたポリペプチド配列を使用して、有意に改善し得ることが見出されている。
【００１９】
加えて、本発明の第１の態様のポリペプチドの配列内の所定のストレッチは、コンパクチンのヒドロキシル化の触媒機構に直接関与することが確立された。配列番号４３、４４、４５、４６および４７が存在する。改善された触媒機能は、配列番号４３〜４７のいずれかまたはすべてに改変を導入することによって入手し得る。好ましくは、配列番号４３〜４７のいずれかまたはすべては、単一アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸または多くても４アミノ酸を置き換えることによって、改変される。以下の改変は、改善された触媒機能をもたらすことが確立されている。配列番号４３では、好適な改変は配列番号４８、４９および５０であり、配列番号４４では、好適な改変は配列番号５１、５２および５３であり、配列番号４５では、好適な改変は配列番号５４であり、配列番号４６では、好適な改変は配列番号５５であり、そして配列番号４７では、好適な改変は配列番号５６、５７、５８および５９である。コンパクチンのヒドロキシル化に寄与するのに適切なストレッチはまた、配列番号４３〜５９であり、ここで、１、２、もしくは３アミノ酸は、代替的アミノ酸で置き換えられる。
【００２０】
第３の実施形態では、上記のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでなるポリヌクレオチドまたは核酸配列が提供される。これは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成由来であるか、またはこれらのいずれかの組み合わせの単離されたポリヌクレオチドであり得る。特に、配列番号３のポリペプチドをコードする特定のＤＮＡ配列、即ち、配列番号１もしくは２が提供される。より好ましくは、配列番号１９〜２６のポリペプチドをコードする特定のＤＮＡ配列、即ち、配列番号１１〜１８が提供される。他で示さない限り、本明細書に記載のＤＮＡ分子を配列決定することによって決定されるすべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡシークエンサーを使用して決定され、そして本明細書において決定されるＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記で決定したＤＮＡ配列の翻訳によって推定した。従って、この自動化アプローチによって決定される任意のＤＮＡ配列では、決定される任意のヌクレオチド配列は、いくつかのエラーを含有してもよい。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、典型的には、少なくとも約９０％同一、より典型的には、少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、手動のＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによって、より正確に決定することができる。また、当該分野においても既知であるとおり、挿入または欠失のポイントから開始して、決定されたヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列が、配列決定したＤＡＮ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なるように、実際の配列と比較して、決定されたヌクレオチド配列におけるそのような単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを生じる。当業者であれば、そのように誤って同定される塩基を同定することが可能であり、そのようなエラーを補正する方法を知っている。
【００２１】
ポリペプチドおよび本発明の第１の態様のコーディング核酸配列は、任意の原核細胞、好ましくは、アクチノマイセテス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）から得ることができる。好適なアクチノマイセテス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）種として、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）、シュードノカルジア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）、ミクロモノスポア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）およびアクチノキネオスポラ（Ａｃｔｉｎｏｋｉｎｅｏｓｐｏｒａ）の株が挙げられるが、これらに限定されない。好適な実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）の株から得られる。
【００２２】
本発明のＤＮＡ配列は、ハイブリダイゼーションによって同定してもよい。変種（例えば、天然の対立遺伝子変種）に対応する核酸分子、および本発明のＤＮＡの相同体は、好ましくは、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてこれらの核酸またはその適切なフラグメントを使用して、本明細書に開示した核酸に対するそれらの相同性に基づいて、単離することができる。あるいは、利用可能なゲノムデータベースを介してインシリコで適用し得る。ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定することができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（１９９５年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照のこと。
【００２３】
核酸配列は、例えば、問題の微生物のゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、単離してもよい。一旦、本発明に従う活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を、例えば、配列番号２から誘導されるプローブによって検出したら、配列は、当業者に公知の技術（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）を利用して、単離またはクローニングすることができる。また、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法、または発現ライブラリーの抗体スクリーニングを使用することによって、そのような（ゲノム）ＤＮＡ由来の本発明の核酸配列のクローニングを行って、共有する構造特徴を伴うクローニングされたＤＮＡフラグメントを検出することができる（例えば、イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら、１９９０年、ＰＣＲ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．を参照のこと）。
【００２４】
本明細書において提供される配列情報は、誤って同定される塩基の夾在を要するようにし、あまりに限られた範囲で解釈すべきではない。本明細書において開示する特定の配列を使用して、アクチノマイセテス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、特に、アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）由来の完全な遺伝子を容易に単離し、次いで、さらなる配列分析に容易に供し、それによってシークエンスエラーを同定することができる。
【００２５】
他で示さない限り、本明細書に記載のＤＮＡ分子を配列決定することによって決定されるすべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡシークエンサーを使用して決定され、そして本明細書において決定されるＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記で決定したＤＮＡ配列の翻訳によって推定した。従って、このアプローチによって決定される任意のＤＮＡ配列について当該分野において公知であるように、本明細書において決定される任意のヌクレオチド配列は、エラーを含有してもよい。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、典型的には、少なくとも約９０％同一、より典型的には、少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該分野において周知の手動のＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによって、より正確に決定することができる。また、当該分野においても既知であるとおり、挿入または欠失のポイントから開始して、決定されたヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列が、配列決定したＤＡＮ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なるように、実際の配列と比較して、決定されたヌクレオチド配列におけるそのような単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを生じる。当業者であれば、そのように誤って同定される塩基を同定することが可能であり、そのようなエラーを補正する方法を知っている。
【００２６】
第４の実施形態では、本発明は、配列番号３のポリペプチドをいわゆるレダクターゼドメインに融合して、配列番号６のポリペプチドを形成し、そしてコンパクチンヒドロキシラーゼ活性を示すことによって、改善したコンパクチンヒドロキシラーゼ酵素を提供する。本発明の範囲は、この特定のアミノ酸配列に限定されるものではなく、特定されたアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、なおより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性の程度を所有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとして規定され、配列番号６の配列に「実質的に相同」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、実質的に相同なペプチドは、コンパクチンヒドロキシラーゼ活性を示す。実質的に相同なポリペプチドは、異なる集団由来の細胞または天然の対立遺伝子または株内の変動による集団内に存在し得る多型を包含し得る。実質的に相同なポリペプチドは、さらに、特定されたアミノ酸および／またはＤＮＡ配列を生じる種以外の種から誘導してもよく、または人工的に設計および合成されたＤＮＡ配列によってコードされてもよい。特定されたＤＮＡ配列に関連し、そして遺伝子暗号の縮重によって得られるＤＮＡ配列もまた、本発明の部分である。相同体はまた、なおコンパクチンヒドロキシラーゼ活性を示す全長配列の生物学的に活性なフラグメントを包含し得る。当業者は、この融合タンパク質のヒドロキシラーゼ部分は、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）ｐ４５０ｓｃａ−２遺伝子のようなコンパクチンをヒドロキシル化することが可能な他のｐ４５０酵素のような非相同であるが、なお機能的に均等な配列と交換してもよいが、但し、融合タンパク質は、コンパクチンヒドロキシル化プラバスタチンを示すことを理解するであろう。また、レダクターゼドメインを、非相同であるが、なお機能的に均等な配列、例えば、フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼと交換することができるが、但し、融合タンパク質は、コンパクチンのプラバスタチンへのヒドロキシル化を示す。使用することができる代替的レダクターゼドメインは、例えば、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｐ４５０ ＢＭ３、ＮＣＢＩジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ｇｉ１４２７９７由来の自己充足（ｓｅｌｆ−ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ）Ｐ４５０酵素のレダクターゼドメインである。好適な融合ポリペプチドは、配列番号１９〜２６の改善されたポリペプチドの同類物、即ち、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１もしくは４２またはこれらに実質的に相同な配列である。加えて、また、配列番号３４〜４２のポリペプチドをコードする特定のＤＮＡ配列、即ち、配列番号２７〜３４も本発明の部分である。あるいは、第２の実施形態に記載の触媒機能の改善はまた、レダクターゼ領域において実施してもよい。
【００２７】
第２の態様では、本発明は、組み換え宿主株における第１の態様のポリヌクレオチドの使用を開示する。より詳細には、以下の工程を含んでなる、プラバスタチンを産生させるための方法を開示する：
（ｉ）コンパクチンヒドロキシラーゼをコードする目的の遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換すること、
（ｉｉ）形質転換された細胞のクローンを選択すること、
（ｉｉｉ）前記選択された細胞を培養すること、
（ｉｖ）場合により、前記培養細胞を処理する（即ち、固定化する）こと、
（ｖ）コンパクチンを前記培養細胞に供給すること、
（ｖｉ）前記培養からプラバスタチンを単離すること。
【００２８】
本発明の方法における宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする目的の核酸配列（遺伝子）の供給源に大いに依存する。好ましくは、宿主細胞は原核細胞である。好適な実施形態では、原核宿主細胞は、第１もしくは第２の態様のポリヌクレオチドが入手され得る種として例示される種の細胞であって、例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種（即ち、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトマイセス・フラビドビレンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｉｄｏｖｉｒｅｎｓ）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・エクスフォリアタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｘｆｏｌｉａｔｕｓ）またはアミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種（即ち、アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ））があるが、これらに限定されない。最も好適な状況では、宿主細胞は、大規模発酵に適切な宿主細胞であって、例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種（即ち、ストレプトマイセス・アバーミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ））またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（即ち、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））またはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種（即ち、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））またはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種（即ち、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））があるが、これらに限定されない。さらにより好ましくは、宿主細胞は、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種のような真核細胞であって、適切な例として、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または糸状菌アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）またはペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）がある。
【００２９】
核酸構築物、例えば、発現構築物は、選択マーカー遺伝子および本発明のポリヌクレオチド（コンパクチンヒドロキシラーゼ）を含有してもよく、それぞれが１つ以上の制御配列に作動可能に連結され、適切な発現宿主においてコードされたポリペプチドの発現を指令する。核酸構築物は、個別のフラグメント上にあってもよく、または好ましくは、１つのＤＮＡフラグメント上にあってもよい。発現は、ポリペプチドの産生に関与する任意の工程を含むことが理解され、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌を含み得る。核酸構築物が、特定の宿主生物体におけるコーディング配列の発現のために要求されるすべての制御配列を含有する場合、用語「核酸構築物」は、用語「発現ベクター」または「カセット」と同義である。用語「制御配列」は、本明細書において、ポリペプチドの発現に必要または有利であるすべての成分を含むものと規定される。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に生来または外来性であってもよい。そのような制御配列として、プロモーター、リーダー、（コザック（Ｋｏｚａｋ）、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０に記載のような）最適な翻訳開始配列、分泌シグナル配列、プロペプチド配列、ポリアデニル化配列、転写ターミネーターが挙げられ得るが、これらに限定されない。少なくとも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。用語「作動可能に連結」は、本明細書において、制御配列が、ポリペプチドの産生を指令するようなＤＮＡ配列のコーディング配列に対する位置に、制御配列が適切に配置される配置形態として規定される。
【００３０】
制御配列は、転写制御配列を含有する適切なプロモーター配列を含んでもよい。プロモーターは、変異、短縮型、およびハイブリッドプロモーターを含む細胞において転写調節活性を示す任意の核酸配列であってもよく、そして細胞外もしくは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から入手してもよい。プロモーターは、細胞もしくはポリペプチドに対して同種または異種のいずれであってもよい。原核細胞の好適なプロモーターは、当該技術分野において公知であり、そして例えば、高レベルのメッセンジャーＲＮＡを確実にする強力なプロモーターであり得る。本発明に従う発現カセットにおいて使用されるプロモーターは、すべての芳香族アミノ酸（ａｒｏ）の生合成に共通の酵素をコードするラクトースオペロン（ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５）、アラビノースオペロン（ａｒａ）、トリプトファンオペロン（ｔｒｐ）、およびオペロンのような高度に発現されるオペロン／遺伝子の周知の組の誘導性プロモーター、またはこれらの機能的ハイブリッド（例えば、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーターの融合であるｔａｃプロモーター（アマン（Ａｍａｎｎ）ら、１９８３年、Ｇｅｎｅ２５：１６１−１７８））から選択してもよい。あるいは、細胞周期（ｃｅｌｌ’ｓ ｌｉｆｅ）全体を通してメッセンジャーＲＮＡの一定の供給を提供する構成性プロモーターを使用することもできる。他の任意の有用なプロモーターは、とりわけ、ＮＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／）において見出すことができる。
【００３１】
好適な実施形態では、プロモーターは、高度に発現される（本明細書において、少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）の全細胞ｍＲＮＡを伴うｍＲＮＡ濃度として規定される）遺伝子から誘導され得る。別の好適な実施形態では、プロモーターは、中程度に発現される（本明細書において、少なくとも０．０１％〜０．５％（ｗ／ｗ）の全細胞ｍＲＮＡを伴うｍＲＮＡ濃度として規定される）遺伝子から誘導され得る。好適な実施形態では、プロモーターは、低度で発現される（本明細書において、０．０１％（ｗ／ｗ）未満の全細胞ｍＲＮＡを伴うｍＲＮＡ濃度として規定される）遺伝子から誘導され得る。
【００３２】
なおより好適な実施形態では、遺伝子、およびそれ故、所定の転写レベルおよび調節を有するそれらの遺伝子のプロモーターを選択するために、マイクロアレイデータが使用される。この方法では、遺伝子発現カセットを、それが機能すべき条件に至適に適応することができる。
【００３３】
あるいは、本発明のポリヌクレオチドの前方にランダムＤＮＡフラグメントをクローニングし得る。これらは、いわゆる直接選択アプローチを介して単離することができる。プロモーター−レス選択マーカー遺伝子（即ち、カナマイシン耐性）を使用して、この遺伝子の前方にランダムＤＮＡフラグメントをクローニングして、そして活性なプロモーター（これらはカナマイシンを含有する培地における増殖を容易にすべきであるため）について容易にスクリーニングすることができる。これらのＤＮＡフラグメントは、多くの供給源、即ち、異なる種から、ＰＣＲ増幅、合成などによって誘導することができる。続いて、配列を単離し、そして本発明のポリヌクレオチドの前方にクローニングすることができる。同様のストラテジーを使用して、ｒｅｃＤＮＡ方法論を介して、高度に翻訳された伸長因子Ｔｕタンパク質をコードするｔｕｆ遺伝子、またはトリプトファンオペロンの改変されたもしくは合成変種から入手可能なもののような効率的に翻訳されたメッセンジャーＲＮＡ由来の５’−非翻訳リーダー領域を導入することによって、メッセンジャーＲＮＡプールの翻訳を改善することができる。
【００３４】
制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、転写を終結するために原核細胞によって認識される配列を含んでもよい。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端と操作可能に連結される。細胞において機能的であるいずれのターミネーターも本発明において使用することができる。原核細胞の好適なターミネーターは、発現させようとする生来の遺伝子またはｒＲＮＡ遺伝子もしくはウイルスオペロンのような供給源のいずれかから入手され、例えば、リボソームＲＮＡターミネーター、またはｆｄターミネーター（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ第２版；ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ）がある。
【００３５】
ポリペプチドの分泌のための制御配列は、コードされるポリペプチドを細胞の分泌経路に向けることができる、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードするシグナルペプチドコード領域を含んでもよい。コード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントを伴う翻訳リーディングフレームにおいて天然に連結されるシグナルペプチドコード領域を本質的に含有してもよい。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含有してもよい。外来性のシグナルペプチドコード領域は、コード配列がシグナルペプチドコード領域を天然には含有しない場合に要求され得る。あるいは、外来性シグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの増強された分泌を得るために、天然のシグナルペプチドコード領域と単純に置き換わってもよい。
【００３６】
核酸構築物は、発現ベクターであってもよい。発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に簡便に供され得、ポリペプチドをコードする核酸配列の発現をもたらし得るいずれのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であってもよい。ベクターの選択は、典型的に、ベクターと、ベクターを導入しようとする細胞との適合性に依存する。ベクターは、線状であってもまたは閉環状プラスミドであってもよい。
【００３７】
別の実施形態では、前述の発現カセットは、本来のプロモーターのｔｒｐプロモーターまたはａｒｏプロモーターによる置換によって、さらに改変される。発現効率の基本的改善を十分に利用するために、増加した遺伝子発現、メッセンジャーＲＮＡ翻訳およびプラスミド安定性に関与するさらなる改変を、実際の産生株を作製するために使用されるｒｅｃＤＮＡ構築物に適用してもよい（例えば、ファージｆｄの転写ターミネーターの付加、またはプラスミドｐＳＣ１０１由来の分配機能ｐａｒの導入）（チャーチワード（Ｃｈｕｒｃｈｗａｒｄ）ら、１９８３年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１１：５６４５−５６５９）。
【００３８】
所望されるタンパク質の産生を増加するために、プラスミドＣｏｌＥ１、ＣｏｌＤ、Ｒ１１６２、ＲＫ２のような染色体外因子上の発現カセット、または所定の低コピー数もしくはしばしば、動的に高コピー数で存在するおよび例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＨＢ１０１、Ｂ７、ＲＶ３０８、ＤＨ１、ＨＭＳ１７４、Ｗ３１１０、ＢＬ２１における増殖または自律複製が可能である誘導体を挿入することができる。
【００３９】
ベクターは、自律的複製型ベクター、即ち、その複製が染色体複製とは独立する細胞外染色体実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であってもよい。あるいは、ベクターは、細胞に導入される場合、ゲノムに組込まれ、それが組込まれている染色体と共に複製するものであってもよい。組込みクローニングベクターは、宿主細胞の染色体の無作為または所定の標的遺伝子座に組込み得る。本発明の好適な実施形態では、組込みクローニングベクターは、この所定の座位へのクローニングベクターの組込みを標的化するための宿主細胞のゲノムにおける所定の標的遺伝子座のＤＮＡ配列に相同であるＤＮＡフラグメントを含んでなる。標的化組込みを促進するために、クローニングベクターは、好ましくは、宿主細胞の形質転換の前に線状化される。線状化は、好ましくは、少なくとも１つ、但し、好ましくは、クローニングベクターのいずれか一方の末端が標的遺伝子座に相同な配列によって隣接されるように、実施される。標的遺伝子座に隣接する相同配列の長さは、好ましくは、少なくとも０．１ｋｂ、なお好ましくは、さらに少なくとも０．２ｋｂ、より好ましくは、少なくとも０．５ｋｂ、さらにより好ましくは、少なくとも１ｋｂ、最も好ましくは少なくとも２ｋｂである。ベクターシステムは、宿主細胞のゲノムに導入しようとする全ＤＮＡを共に含有する単一のベクターまたはプラスミドあるいは２つ以上のベクターまたはプラスミドであってもよい。
【００４０】
ＤＮＡ構築物は、エピソームベクター上で使用してもよい。好ましくは、構築物は、宿主株のゲノムに組込まれる。
【００４１】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドの適用は、プラバスタチン産出を制限する酵素をコードする宿主株のゲノムから内因性遺伝子の１つ以上を欠失することによって、改善することができる。そのような酵素の例には、コンパクチンまたはプラバスタチンの側鎖を加水分解する酵素があるが、これらに限定されない。
【００４２】
好適な実施形態では、ｃｍｐＨ遺伝子（配列番号１）、すべての相同配列、レダクターゼドメインへのｃｍｐＨ融合（配列番号４）およびコンパクチンヒドロキシラーゼをコードするすべての機能的な均等物を、コンパクチン産生宿主細胞において発現させて、プラバスタチンを産生させることができる。原核生物宿主の場合、上記のような宿主において機能的発現のすべての態様を適用することができる。真核宿主細胞の場合、好ましくは、そのような宿主における効率的発現に対して発現構築物を適用する。好ましくは、宿主細胞は真菌であり、より好ましくは、糸状菌であり、最も好ましくは、真菌宿主細胞は、スタチン系薬剤、好ましくは、コンパクチンを産生する細胞である。それらの例には、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種（即ち、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ））、またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種（即ち、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）もしくはクリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））、またはモナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）種（即ち、モナスカス・ルバー（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｅｒ）もしくはパキシー（ｐａｘｉｉ））があるが、これらに限定されない。
【００４３】
糸状菌細胞に好適なプロモーターは、当該技術分野において公知であり、そして例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼｇｐｄＡプロモーター、ｐｅｐＡ、ｐｅｐＢ、ｐｅｐＣのようなプロテアーゼプロモーター、グルコアミラーゼｇｌａＡプロモーター、アミラーゼａｍｙＡ、ａｍｙＢプロモーター、カタラーゼｃａｔＲまたはｃａｔＡプロモーター、グルコースオキシダーゼｇｏｘＣプロモーター、β−ガラクトシダーゼｌａｃＡプロモーター、α−グルコシダーゼａｇｌＡプロモーター、翻訳伸長因子ｔｅｆＡプロモーター、ｘｌｎＡ、ｘｌｎＢ、ｘｌｎＣ、ｘｌｎＤのようなキシラナーゼプロモーター、ｅｇｌＡ、ｅｇｌＢ、ｃｂｈＡのようなセルラーゼプロモーター、ａｒｅＡ、ｃｒｅＡ、ｘｌｎＲ、ｐａｃＣ、ｐｒｔＴなどのような転写調節因子のプロモーターなどであり得、そしてとりわけ、ＮＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／）において見出すことができる。
【００４４】
好適な実施形態では、プロモーターは、高度に発現される（本明細書において、少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）の全細胞ｍＲＮＡを伴うｍＲＮＡ濃度として規定される）遺伝子から誘導され得る。別の好適な実施形態では、プロモーターは、中度に発現される（本明細書において、少なくとも０．０１％〜０．５％（ｗ／ｗ）の全細胞ｍＲＮＡを伴うｍＲＮＡ濃度として規定される）遺伝子から誘導され得る。別の好適な実施形態では、プロモーターは、低度で発現される（本明細書において、少なくとも０．０１％（ｗ／ｗ）の全細胞ｍＲＮＡを伴うｍＲＮＡ濃度として規定される）遺伝子から誘導され得る。
【００４５】
なおより好適な実施形態では、遺伝子、ひいては、所定の転写レベルおよび調節を有するそれらの遺伝子のプロモーターを選択するために、マイクロアレイデータが使用される。この方法では、遺伝子発現カセットを、それが機能すべき条件に至適に適応することができる。
【００４６】
制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、転写を終結するために糸状菌細胞によって認識される配列を含んでもよい。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端と操作可能に連結される。細胞において機能的であるいずれのターミネーターも本発明において使用することができる。糸状菌細胞のための好適なターミネーターは、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、ｔｒｐＣ遺伝子およびフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から入手される。
【００４７】
制御配列はまた、適切なリーダー配列、糸状菌細胞による翻訳に重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域を含んでもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’−末端と作動可能に連結される。細胞において機能的であるいずれのリーダー配列も本発明において使用することができる。糸状菌細胞のための好適なリーダーは、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびアスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼおよびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ｇｌａＡをコードする遺伝子から得られる。
【００４８】
制御配列はまた、核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、転写される場合、転写されるｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして糸状菌細胞に認識されるポリアデニル化配列を含んでもよい。細胞において機能的ないずれのポリアデニル化配列も本発明において使用することができる。糸状菌細胞のための好適なポリアデニル化配列は、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ、およびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。
【００４９】
核酸構築物は、発現ベクターであってもよい。発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に簡便に供され得、ポリペプチドをコードする核酸配列の発現をもたらし得るいずれのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であってもよい。ベクターの選択は、典型的に、ベクターと、ベクターを導入しようとする細胞との適合性に依存する。ベクターは、線状であってもまたは閉環状プラスミドであってもよい。
【００５０】
ベクターは、自律的複製型ベクター、即ち、その複製が染色体複製とは独立する細胞外染色体実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であってもよい。糸状菌の自律的に維持されるクローニングベクターは、ＡＭＡ１配列を含んでなり得る（例えば、アレクセンコ（Ａｌｅｋｓｅｎｋｏ）およびクラッターバック（Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ）（１９９７年）、Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．２１：３７３−３９７を参照のこと）。あるいは、ベクターは、細胞に導入される場合、ゲノムに組込まれ、それが組込まれている染色体と共に複製するものであってもよい。組込みクローニングベクターは、宿主細胞の染色体の無作為または所定の標的遺伝子座に組込み得る。好ましくは、組込みクローニングベクターは、この所定の座位へのクローニングベクターの組込みを標的化するための宿主細胞のゲノムにおける所定の標的遺伝子座のＤＮＡ配列に相同であるＤＮＡフラグメントを含んでなる。標的化組込みを促進するために、クローニングベクターは、好ましくは、宿主細胞の形質転換の前に線状化される。線状化は、好ましくは、少なくとも１つ、但し、好ましくは、クローニングベクターのいずれか一方の末端が標的遺伝子座に相同な配列によって隣接されるように、実施される。標的遺伝子座に隣接する相同配列の長さは、好ましくは、少なくとも０．１ｋｂ、なお好ましくは、さらに少なくとも０．２ｋｂ、より好ましくは、少なくとも０．５ｋｂ、さらにより好ましくは、少なくとも１ｋｂ、最も好ましくは少なくとも２ｋｂである。ベクターシステムは、宿主細胞のゲノムに導入しようとする全ＤＮＡを共に含有する単一のベクターまたはプラスミドあるいは２つ以上のベクターまたはプラスミドであってもよい。
【００５１】
ＤＮＡ構築物は、エピソームベクター上で使用してもよい。好ましくは、構築物は、宿主株のゲノムに組込まれる。
【００５２】
真菌細胞は、同時形質転換を使用して形質転換される（即ち、目的の遺伝子に伴って、選択マーカー遺伝子も形質転換される）。これは、目的の遺伝子（即ち、プラスミド上）または個別のフラグメント上のいずれかに物理的に連結することができる。トランスフェクション後、形質転換体を、この選択マーカー遺伝子の存在についてスクリーニングし、続いて、目的の遺伝子の存在について分析する。選択マーカーは、殺生物剤またはウイルスに対する耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に原栄養性などを提供する産物である。有用な選択マーカーとして、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣもしくはｓｕｔＢ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、ｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ｂｌｅ（フレオマイシン耐性タンパク質）、またはそれらの均等物が挙げられる。
【００５３】
得られる宿主細胞は、プラバスタチンを産生させるために使用してもよい。
【００５４】
第３の態様では、本発明は、以下の工程を含んでなる第２の態様のコンパクチンからプラバスタチンへの変換を改善することが可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するための方法を提供する：
（ｉ）本発明の第１の態様のポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換すること；
（ｉｉ）形質転換細胞のクローンを、コンパクチンをヒドロキシル化するそれらの能力について選択すること；
（ｉｉｉ）これらの単離されたクローンを、様々なポリヌクレオチドで再形質転換すること；
（ｉｖ）形質転換細胞のクローンを、コンパクチンをヒドロキシル化するそれらの改善された能力について選択すること；
（ｖ）プラスミドを単離すること；
（ｖｉ）プラスミドの挿入物を配列決定すること。
【００５５】
工程（ｉｉｉ）の様々なポリヌクレオチドは、いくらかの供給源から入手することができる。それは、ゲノムＤＮＡ、コピーＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成または合成由来であり得る。それは、真核生物または原核生物宿主由来であり得る。それは、環状または線状ポリヌクレオチドとして提供され得る。それは、特異的ポリヌクレオチド（即ち、遺伝子もしくは遺伝子ファミリーまたは遺伝子から誘導されるエラープローンライブラリー）であり得るか、あるいはそれは、ランダムポリヌクレオチド（即ち、メタゲノムライブラリーまたは無作為に消化されたゲノムＤＮＡ）であり得る。それは、それ自体のプロモーターから発現され得るか、またはそれは、工程（ｉ）の工程において機能的なプロモーターの後方にクローニングすることができる。
【００５６】
コンパクチンヒドロキシラーゼ活性を改善するポリペプチドをコードするそのような核酸配列は、例えば、第１の態様のポリヌクレオチドのドナー微生物のゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、単離してもよい。一旦、配列番号２から誘導されるプローブに相同な核酸配列を検出したら、配列およびその周囲のＤＮＡは、当業者に公知の技術（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）を利用して、単離またはクローニングすることができる。
【００５７】
この方法では、増強された機能を伴うポリペプチドをコードする変種ポリヌクレオチド、またはコンパクチンヒドロキシラーゼ酵素の機能化を支援もしくは容易にするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはコンパクチンヒドロキシラーゼ遺伝子より前方のプロモーターを活性化するポリヌクレオチドをクローニングすることが可能である。
【００５８】
一実施形態では、ｐ４５０酵素に必要な酸化還元再生系（ピリペンコ（Ｐｙｌｙｐｅｎｋｏ）およびシュリヒティンク（Ｓｃｈｌｉｃｈｔｉｎｇ）、２００４年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７３：９９１−１０１８）を単離し、そしてこれを、コンパクチンヒドロキシラーゼ発現宿主細胞に導入することによって、コンパクチンからプラバスタチンへの変換の効率を改善する方法を開示する。そのような系を宿主細胞に導入する一般的方法は、コンパクチンヒドロキシラーゼの導入に関する説明と同じであり、上記で概説している。そのような酸化還元再生系は、第２の態様のポリヌクレオチドが入手され得るか、または異種発現され得る種として例示される種から入手され得；その例には、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種（即ち、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトマイセス・フラビドビレンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｉｄｏｖｉｒｅｎｓ）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・エクスフォリエーテス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｘｆｏｌｉａｔｅｓ）、ストレプトマイセス・アバーミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ））またはアミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種（即ち、アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ））またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（即ち、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））またはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種（即ち、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））またはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種（即ち、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））があるが、これらに限定されない。また、代替的系を適用することもできる。代替的系の例には、本発明のコンパクチンヒドロキシラーゼをクラスＩＶｐ４５０系に組込み、それによって、それを酸化還元パートナーに融合すること（ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら、２００２年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：３８９８−３９０８およびクボタ（Ｋｕｂｏｔａ）ら、２００５年、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９：２４２１−２４３０）、または亜リン酸デヒドロゲナーゼのようなＮＡＤ（Ｐ）Ｈ生成非ｐ４５０連結酵素（ヨハネス（Ｊｏｈａｎｎｅｓ）ら、２００５年、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５７２８−５７３４）、または非酵素的手段（ホールマン（Ｈｏｌｌｍａｎｎ）ら、２００６年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２４：１６３−１７１）があるが、これらに限定されない。
【００５９】
本発明の第４の態様では、第３の態様の方法に従って産生されるプラバスタチンは、医薬組成物内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ｃｍｐＨ遺伝子の産物、コンパクチンヒドロキシラーゼによって触媒される変換を示す。説明：［Ｃ］＝コンパクチン；［Ｐ］＝プラバスタチン。
【図２】プラスミドｐＺＥＲＯ−Ａｏ−１１Ｈ９を示す。説明：ＯＲＦ−１＝第１のオープンリーディングフレーム、ＯＲＦ−２＝第２のオープンリーディングフレーム、ｚｅｏ＝ゼオシンに対する耐性をコードする遺伝子、ｋａｎ＝カナマイシンに対する耐性をコードする遺伝子。
【図３】プラスミドｐＺＥＲＯ−Ａｏ−１１Ｈ９ｄを示す。説明：ＯＲＦ−１＝第１のオープンリーディングフレーム、ｚｅｏ＝ゼオシンに対する耐性をコードする遺伝子、ｋａｎ＝カナマイシンに対する耐性をコードする遺伝子。
【図４】プラスミドｐＡＣＹＣ−ｔａｑＳｃｐ４５０を示す。説明：Ｓｃ−ｐ４５０＝コンパクチンヒドロキシラーゼｐ４５０をコードするストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）遺伝子、ｃａｔ＝クロラムフェニコールに対する耐性をコードする遺伝子。
【図５】プラスミドｐＡＣＹＣ−ｔａｑＡｏｐ４５０を示す。説明：Ａ０−ｃｍｐＨ＝コンパクチンヒドロキシラーゼｐ４５０をコードするアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）遺伝子、ｃａｔ＝クロラムフェニコールに対する耐性をコードする遺伝子。
【００６１】
［実施例］
［一般的方法］
標準的なＤＮＡ手順および原核生物培養は、その他（サンブルック，Ｊ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）ら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載のとおりに行った。ＤＮＡは、プルーフリーディング酵素Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を使用して、増幅した。制限酵素は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎまたはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製であった。コンパクチンを、２０ｍｇ／ｍｌの最終濃度でエタノールに溶解することによって、コンパクチンの加水分解を行った。ＮａＯＨを、４Ｍストックから、０．１Ｍの最終濃度まで添加した。溶液を、５０℃で１〜２時間、加熱し、続いて、室温まで冷却した。この溶液は、室温で３箇月間、貯蔵することができる。両方の化合物を２０ｍｇ／ｍｌでエタノールに溶解することによって、プラバスタチンおよび非加水分解コンパクチンストック溶液を作製した。
【００６２】
［実施例１］
［効率的な全細胞のコンパクチンからプラバスタチンへの生体変換のスクリーニング］
多様な原核および真菌種（表１）を試験して、加水分解されたコンパクチンからの改善された変換を伴う種を単離した。すべての種を、１〜３日間（種の増殖速度に依存する）、２５ｍｌの２×ＹＴ培地中でプレ培養し、洗浄し、そして２５ｍｌ新鮮２×ＹＴ培地中に懸濁した。２８０ｒｐｍおよび３０℃で振盪しながら数時間の順応期間後、加水分解したコンパクチンを、０．１、０．２、０．５および１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。２４時間のインキュベーション後、振盪フラスコの内容物を５０ｍｌグライナーチューブに移すことによって、ブロスを回収した。サンプルを−２０℃で凍結し、続いて、凍結乾燥した。１〜２ｍｌメタノールの凍結乾燥サンプルへの添加、それに続く、ボルテックス撹拌の反復によって、スタチン系薬剤を抽出した。遠心分離によって、液相から固体を分離した。２００μｌのメタノール抽出物をＨＰＬＣバイアルに移し、続いて、以下のようなＨＰＬＣ分析を行った：
【００６３】
【表１】
【００６４】
【表２】
【００６５】
表１において認められ得るように、４つの種の試験した組：アクチノキネオスポラ・リパリア（Ａｃｔｉｎｏｋｉｎｅｏｓｐｏｒａ ｒｉｐａｒｉａ）、シュードノカルジア・アルニ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ａｌｎｉ）、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）およびアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）によって、プラバスタチンを合成した。
【００６６】
［実施例２］
［コンパクチンの生物学的加水分解］
実施例１に記載の種がまた、コンパクチンをラクトン型で加水分解および／またはヒドロキシル化するかどうかを確立するために、選択した４つの種を、１〜３日間（種の増殖速度に依存する）、２５ｍｌの２×ＹＴ培地中でプレ培養し、洗浄し、そして２５ｍｌ新鮮２×ＹＴ培地中に再懸濁した。２８０ｒｐｍおよび３０℃で振盪しながら数時間の適応後、非加水分解コンパクチンを、０．２ｍｇ／ｍｌで添加した。２４時間のインキュベーション後、振盪フラスコの内容物を５０ｍｌグライナーチューブに移すことによって、ブロスを回収した。サンプルを−２０℃で凍結し、続いて、凍結乾燥した。１〜２ｍｌメタノールの添加、それに続くボルテックス撹拌の反復によって、スタチン系薬剤を抽出した。遠心分離によって、液相から固体を分離した。２００μｌのメタノール抽出物をＨＰＬＣバイアルに移し、続いて、実施例１に記載のようにＨＰＬＣ分析を行った。４つのすべての種（アクチノキネオスポラ・リパリア（Ａｃｔｉｎｏｋｉｎｅｏｓｐｏｒａ ｒｉｐａｒｉａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）およびアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ））は、コンパクチンを加水分解するが、これは、プラバスタチン形成に不可欠ではない。アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）は、プラバスタチンを合成するのに最も効率的な種であった。
【００６７】
【表３】
【００６８】
［実施例３］
［アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）は、極めて効率的なコンパクチンヒドロキシル化を有する］
実施例１から、アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）は、コンパクチンヒドロキシル化について、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）より優れていると結論付けた。さらなる研究のために、両方の種を、２４時間、２５ｍｌの２×ＹＴ培地中でプレ培養し、洗浄し、そして２５ｍｌ新鮮２×ＹＴ培地に再懸濁した。２８０ｒｐｍおよび３０℃で振盪しながら数時間後、加水分解コンパクチンを、０．１および０．２ｍｇ／ｍｌで添加した。２４時間のインキュベーション後、振盪フラスコの内容物を５０ｍｌグライナーチューブに移すことによって、ブロスを回収した。サンプルを−２０℃で凍結し、続いて、凍結乾燥した。１〜２ｍｌメタノールの乾燥サンプルへの添加、それに続く、ボルテックス撹拌の反復によって、スタチン系薬剤を抽出した。遠心分離によって、液相から固体を分離した。２００μｌのメタノール抽出物をＨＰＬＣバイアルに移し、続いて、実施例１に記載のようにＨＰＬＣ分析を行った。表３において認められ得るように、アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）は、１００％の効率でコンパクチンをプラバスタチンに変換することが可能であり、ここで、ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）では認められない。
【００６９】
【表４】
【００７０】
［実施例４］
［コンパクチンをプラバスタチンに変換する生体触媒をコードする遺伝子フラグメントの単離］
［アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）の遺伝子ライブラリー］
液体培地（１０ｇ／ｌグルコース、５ｇ／ｌ酵母抽出物、２０ｇ／ｌデンプン、１ｇ／ｌのＣａＣＯ３および０．５ｇ／ｌカザミノ酸、バッフルフラスコ）中にアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）のコロニーを２８℃で、ＯＤ＝２．０まで増殖させた。一部を使用して、グリセロールストックを調製し、そして一部を使用して、ゲノムＤＮＡ単離のための細胞の調製のために５０ｍｌの液体培地を伴うフラスコに播種（比１／５０）した。２８℃で１６時間後、ゲノムＤＮＡを単離するために、培養を使用した。それに対し、インキュベーションの最後の１時間の間に、アンピシリンを２００μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。細胞を、遠心分離（８０００ｒｐｍで１５分間）に回収し、そしてペレットを５０ｍＭのＥＤＴＡを伴うｐＨ８．０に調整した５ｍｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌに再懸濁した。１００μｌのリゾチーム（１００ｍｇ／ｍｌ）および４０μｌプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、懸濁液を３０分間、３７℃でインキュベートした。Ｐｒｏｍｅｇａ製のＮｕｃｌｅｉ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（６ｍｌ）を添加した。８０℃で１５分間、および６５℃で３０分間のインキュベーションにより、ほぼ完全な細胞溶解物がもたらされた。ＲＮａｓｅ処置（１０μｌの１００ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ溶液）の後、２ｍｌのＰｒｏｍｅｇａ製のＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、混合物をボルテックス撹拌（２０秒間）し、そして氷上でインキュベート（１５分間）した。遠心分離（５０００ｒｐｍで１５分間）後、上清を、０．１容積のＮａＡｃ（３Ｍ、ｐＨ５）および２容積のＥｔＯＨ（９６％）と混合した。沈殿したゲノムＤＮＡの目視で認められる複合体をパスツールピペットで移し、そして５００μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）に溶解した。第２のプロテイナーゼＫ処置（１０μｌの２０ｍｇ／ｍｌストック溶液を２００μｌのサンプルあたりに使用し、続いて、３７℃で３０分間のインキュベーションを行った）を適用して、残留するタンパク質を取り出した。プロテイナーゼＫ工程後、５００μｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ＰＣＩ、２５：２４：１）を添加し、そして混合物を１４，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。上相を新しいバイアルに移し、そして微量に残留するフェノールを取り出すために、５００μｌのＰＣＩ（２４：１）を添加した。相を遠心分離により分離し、そしてＤＮＡの沈殿のために、上相を０．１容積のＮａＡｃ（３Ｍ、ｐＨ５）および２容積のＥｔＯＨ（９６％）と混合した。ゲノムＤＮＡをピペットで採取し、７０％冷ＥｔＯＨで洗浄し、そして５００μｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液に溶解した。これにより、１．８５のＡ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍを伴う１３４μｇの精製されたゲノムＤＮＡを生じた。Ｓａｕ３ＡＩ（０．０６７単位／μｇのＤＮＡ）を使用して、単離されたアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＤＮＡを部分的に消化して、４〜１０ｋｂの範囲のより小さなフラグメントを得た。ゲノムＤＮＡ（５０μｇ）を消化し、そしてＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ抽出キットを使用して、調製用０．６％アガロースゲルから４〜１０ｋｂの間のフラグメントを単離し、そして最終的に２０μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０に溶解した。これらのフラグメントをＢａｍＨＩで消化したｐＺＥｒＯ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、そして大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに形質転換して、約３９，０００個のコロニーを得た。２０個の個々のコロニーを使用して、１０ｍｌの２×ＹＴ培地に播種して、ライブラリーの多様性を確認し、そして平均的な挿入物のサイズを決定した。１９のプラスミドが異なるサイズの挿入物を含有した一方、１個のコロニーが挿入物を有さなかった（自己連結ベクター５％）。ｐＺＥｒＯ−２におけるｇＤＮＡフラグメントの平均挿入物サイズは、約３．８ｋｂであった。得られたすべての形質転換体をプレートから回収し、そしてカナマイシンを伴う液体２×ＹＴ培地に再懸濁し、そして８％（ｖ／ｖ）の最終濃度でグリセロールを添加し、そして−８０℃で貯蔵した。
【００７１】
［アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）遺伝子ライブラリーのスクリーニング］
アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）遺伝子ライブラリーを２×ＹＴ寒天＋カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）上にプレート化し、そして７２時間、室温でインキュベートした。ほぼ１２，０００個のコロニーを使用して、０．２ｍｌの２×ＹＴ培地＋３５ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有する１２０枚の９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に播種した。ＭＴＰを、２５℃、５００ｒｐｍで４８時間、インキュベートした。各ウェルから、１４０μｌの細胞懸濁液を、１０分間、３，０００ｒｐｍで遠心分離し、そしてプレートをティッシュペーパー上で軽くたたくことによって上清を廃棄した（培養物の残りを５０μｌの２０％グリセロールに添加し、そして−８０℃で貯蔵した）。１ウェルあたり２５０μｌの基質溶液（加水分解されたコンパクチン、２００ｍｇ／Ｌ；グルコース、２ｇ／ｌ；リン酸緩衝液、５０ｍＭ；ｐＨ６．８を伴う２×ＹＴ培地）。ウェル中の細胞ペレットを懸濁し、そして４８時間、３０℃で、２８０ｒｐｍでインキュベートした。１ウェルあたり０．３５ｍｌメタノールの添加後、スタチン系薬剤を抽出し、そして１時間、２８０ｒｐｍで混合した。細胞破砕物を、１５分間、２７５０ｒｐｍの遠心分離によって取り出した。１００μｌのサンプルを、ＬＣ−ＭＳによって分析した。
【００７２】
［アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）遺伝子ライブラリーのＬＣ−ＭＳ分析］
ヘリウム雰囲気２における撹拌下、１晩中ＭｅＯＨ中１．５ＭのＮａＯＨ（１：２）によるメバスタチン（Ａ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロット番号Ａ７４１３、純度９９．３６％）の加水分解によって、コンパクチン標準を調製した。ｐＨをＨＣｌ（４Ｍ）の添加によって減少し、そして標準物を水でさらに希釈する。サンプルを、ＡＣＴ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製のショート（２０ｍｍ）ＣＮカラムを伴うＷａｔｅｒｓ ＬＣ／ＭＳシステム上、移動相として水およびアセトニトリル（両者は０．１％ギ酸を伴う）で分析する。ＬＣ−部分の詳細は以下のとおりである：
【００７３】
【表５】
【００７４】
ポジティブモード（ＥＳ＋）のＭＳエレクトロスプレーイオン化を使用し、そして化合物を３つの化合物の選択されたイオン（ＳＩＲ）を伴うナトリウム付加物（［Ｍ＋Ｎａ］＋）として分析する。ＭＳ−部分の詳細は以下のとおりである：
【００７５】
【表６】
【００７６】
スキャンマス範囲（ｍ／ｚ）２００〜６００ａｍｕ、スキャン期間０．２０秒間、スキャン間遅延０．０５秒間；３チャンネルのＳＩＲ：４１３．３０、４３１．３、４４７．３、ドエル０．０７秒間、スキャン間遅延０．０５秒間。
【化１】
【００７７】
この装備により、４種の最も重要な分子、コンパクチン、加水分解されたコンパクチンならびに６−ヒドロキシ−コンパクチン２つの立体異性体、即ち、β−変種プラバスタチン（構造については上記を参照のこと）およびα−変種エピ−プラバスタチンを区別することが可能である。
【００７８】
【表７】
【００７９】
それらは、プラバスタチンの位置で小さいが、有意なピークを示したため、いくらかのクローンを候補として同定した。例として表４において、１個のクローンがバックグランドを超えるシグナルを生じる（ウェル位置Ｂ１のクローン）結果のサブセットを示す。
【００８０】
［実施例５］
［コンパクチンからプラバスタチンへの生体触媒をコードする遺伝子の同定］
［アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）由来の推定コンパクチンヒドロキシラーゼの再試験］
実施例４の分析を、推定クローンとして第１ラウンドにおいて同定した４個のクローンで反復した。しかし、今回、クローンを、ＭＴＰの代わりに振盪フラスコにおいて増殖させ、そしていくつかの培養培養条件を変動させた。クローンを、推定コンパクチンヒドロキシラーゼを含有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞を播種した１０ｍｌの２×ＹＴ中でプレ培養し、そして２４時間、３０℃、２８０ｒｐｍで増殖させた。続いて、０．１〜０．５ｍＭのＩＰＴＧおよび０．５ｍＭのδ−アミノレブリン酸を添加し、そして培養物を２２℃で、２８０ｒｐｍ、１２時間、インキュベートした。細胞を回収し、洗浄し、そして（加水分解されたコンパクチン、２００ｍｇ／Ｌ；グルコース、２ｇ／ｌ；リン酸緩衝液、５０ｍＭ；ｐＨ６．８で補充した）新鮮２×ＹＴ培地中でボルテックス撹拌することによって、再懸濁した。細胞懸濁液を、３０または３７℃のいずれか、２４または４８時間、２８０ｒｐｍでインキュベートした。スタチン系薬剤を抽出し、そして実施例４に記載のように分析した。
【００８１】
【表８】
【００８２】
表５において認められ得るように、唯一のクローン１１Ｈ９が真の有意なコンパクチンからプラバスタチンへの変換を有する。従って、この１つは、さらなる分析のために選択した。
【００８３】
［配列決定および配列解析］
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）クローン１１Ｈ９を、カナマイシンを伴う２×ＹＴにおいて培養し、そしてＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐｅｐキットを使用して、プラスミドＤＮＡを単離し、そしてｐＺＥＲＯ−２プラスミドにおけるアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ゲノム挿入物の配列を決定した。挿入物の配列は、２５４５ヌクレオチド長（配列番号１を参照のこと）である。ＤＮＡ配列の分析を実施して、そして２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定することができた（図２）。第１のＯＲＦは、既知のｐ４５０酵素（即ち、最良は、ストレプトマイセス・ツベルシジクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｃｕｓ）由来のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ１０５Ｓ２である）にいくつかの相同性を有する４０１アミノ酸（配列番号２および３）の推定タンパク質をコードする。第２のＯＲＦはいくつかの膜貫通領域を有し、そしてＡＴＰ型Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＡＢＣ）タンパク質をコードし得る。
【００８４】
［構造遺伝子、ｃｍｐＨの同定］
コンパクチンを加水分解することが可能な構造遺伝子を同定するために、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩによる二重消化を介して、ｐＺＥＲＯ−Ａｏ−１１Ｈ９からＯＲＦ−２を欠失させた。続いて、４．９ｋｂフラグメントを単離し、そして自己連結させた。得られるプラスミドｐＺＥＲＯ−Ａｏ−１１Ｈ９は、完全ＯＲＦとしてただ１つのＯＲＦ−１を含有する（図３）。このクローンは、クローンｐＺＥＲＯ−Ａｏ−１１Ｈ９と同じ変換率を有し、ＯＲＦ−１がｃｍｐＨと命名される機能的なコンパクチンヒドロキシラーゼをコードすることを示す。
【００８５】
［比較例６］
［大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）におけるストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）コンパクチンヒドロキシラーゼの活性］
［ｐ４５０−ＳＣＡ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現クローンの構築］
ストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）ｐ４５０をコードする遺伝子を、配列番号７および配列番号８のプライマーを使用して、株ＦＥＲＭ−ＢＰ１１４５から単離したゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲフラグメントを、供給者の指示書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＴＡベクターにおけるクローンであった。発現クローンを、ｐＡＣＹＣ−ｔａｑ（Ｋｒａｅｍｅｒ，Ｍ．，２０００．Ｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇｅｎ ｚｕｍ Ｅｉｎｆｌｕｓｓ ｅｒｈｏｅｈｔｅｒ Ｂｅｒｅｉｔｓｔｅｌｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｓｅ−４−Ｐｈｏｓｐｈａｔ ｕｎｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔ ａｕｆ ｄｅｎ Ｋｏｈｌｅｎｓｔｏｆｆｆｌｕｓｓ ｉｎ ｄｅｎ Ａｒｏｍａｔｅｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｅｗｅｇ ｖｏｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｂｅｒｉｃｈｔｅ ｄｅｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍｓ Ｊｕｅｌｉｃｈ ３８２４，ＩＳＳＮ ０９４４−２９５２，ＰｈＤ Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ）を、Ａｃｃ６５Ｉで消化し、そしてｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＴＡベクターから単離したＡｃｃ６５Ｉフラグメントに連結することによって、構築し、ｐＡＣＹＣ−ｔａｑＳｃｐ４５０（図４）を得た。
【００８６】
［大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）抽出物における活性決定］
ｐＡＣＹＣ−ｔａｑＳｃｐ４５０を含有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞を、クロラムフェニコールを伴う１０ｍｌの２×ＹＴにおいて培養した。細胞懸濁液を、基本的に処理し、そして実施例５に記載のようにコンパクチンと共にインキュベートした。この場合、培養温度は３７℃であり、そしてクロラムフェニコールおよびＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）を、反応混合物に添加した。反応物を、３０℃および２２０ｒｐｍでインキュベートした。サンプルを様々な時点で採取し、そして実施例１に記載のようなＨＰＬＣプロトコルを使用して、分析した。２４時間後、プラバスタチンを決定することができなかった。
【００８７】
［実施例７］
［大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）におけるアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）コンパクチンヒドロキシラーゼの活性］
［Ａｏ−ｃｍｐＨ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）発現クローンの構築］
アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ｐ４５０をコードする遺伝子を、配列番号９および配列番号１０のプライマーを使用して単離したゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲフラグメントを、供給者の指示書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＴＡベクターにクローニングした。発現クローンを、ｐＡＣＹＣ−ｔａｑ（Ｋｒａｅｍｅｒ，２０００）をＡｃｃ６５Ｉで消化し、そしてｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＴＡベクターから単離したＡｃｃ６５Ｉフラグメントを連結することによって、構築し、ｐＡＣＹＣ−ｔａｑＡｏｐ４５０（図５）を得た。
【００８８】
［大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）抽出物における活性決定］
ｐＡＣＹＣ−ｔａｑＡｏｐ４５０（図５）を含有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞を、クロラムフェニコールを伴う２×ＹＴ（１０ｍｌ）において培養した。細胞懸濁液を、実施例５に記載のようにコンパクチンと共にインキュベートした。培養温度は３７℃であり、そしてクロラムフェニコールおよびＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）を添加した。反応物を、３０℃および２２０ｒｐｍでインキュベートした。サンプルを様々な時点で採取し、そして実施例１に記載のようなＨＰＬＣプロトコルを使用して、分析した。２４時間後、プラバスタチンの大きなピークを検出した。この結果は、アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ｐ４５０酵素が他のｐ４５０よりも大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においてコンパクチンを加水分解するのにかなり良好に適切であることを明確に実証する。
【００８９】
【表９】
【００９０】
［実施例８］
［大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）におけるアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）コンパクチンヒドロキシラーゼの誘導体の活性］
遺伝子配列番号１１〜１８、２７〜３４を合成的に生成し、そして（配列番号９について）ａｔｔＢ１および（配列番号１０について）ａｔｔＢ２が付加された組み換え部位を伴うオリゴヌクレオチド配列番号９および１０によるＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。ＢＰ反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を実施することによって、ＰＣＲフラグメントを、Ｇａｔｅｗａｙ ｐＤＯＮＲ２２１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、オランダ）にクローニングした；配列をＤＮＡ配列決定によって確認して、ＰＣＲ関連のエラーを排除した。Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ ｒｅａｃｔｉｏｎを使用して、遺伝子を、ｐＤＯＮＲ２２１ベクターからｐＥＴ−ＤＥＳＴ４２ベクターにトランスファーし、最終発現ベクターｐＥＴ−ＤＥＳＴ４２−Ｐ４５０を得た。ｐＥＴ−ＤＥＳＴ４２−Ｐ４５０（挿入物として配列番号１１〜１８、２７〜３４）を所有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ ＤＥ３を、カナマイシンを伴う１０ｍｌの２×ＹＴ中、３０℃でＯＤ６００＝０．５〜１．０まで培養した。続いて、培養物を０．１〜０．３ｍＭのＩＰＴＧおよび０．５ｍＭのδ−アミノレブリン酸で補充し、そして２２℃、２８０ｒｐｍで１２時間、インキュベートした。細胞を回収し、洗浄し、そして（加水分解されたコンパクチン、２００ｍｇ／Ｌ；グルコース、２ｇ／ｌ；リン酸緩衝液、５０ｍＭ；ｐＨ６．８で補充した）新鮮２×ＹＴ培地に再懸濁した。細胞懸濁液を、３０または３７℃のいずれか、２４または４８時間、２８０ｒｐｍでインキュベートした。スタチン系薬剤を抽出し、そして実施例４に記載のように分析した。２４時間後、極めて大きなプラバスタチンピークを同定することができた。実施例７に記載の実験とは対照的に、配列番号３または配列番号６によってコードされるコンパクチンヒドロキシラーゼ酵素と比較する場合、生成したプラバスタチンの大部分は、それぞれ配列番号１９〜２６および配列番号３５〜４２の酵素の有意に変化した立体特異性の証拠を示すβ−変異である。
【００９１】
【表１０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３、配列番号６、配列番号４３〜５９に従うアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号３に対して少なくとも５０％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号６に対して少なくとも６０％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号４３〜５９と３アミノ酸以下異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群から選択される、ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号３、配列番号６、配列番号１９〜２６もしくは配列番号３５〜５９に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号３、配列番号６、配列番号１９〜２６もしくは配列番号３５〜５９に対して少なくとも９０％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも５０％の効率でコンパクチンをプラバスタチンに変換することが可能なポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１、２、４または５である、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
プラバスタチンを産生させるための方法であって、以下の工程：
（ｉ）産生宿主において請求項４または５に記載のポリヌクレオチドを発現させる工程と；
（ｉｉ）工程（ｉ）において得られる産生宿主を増殖させる工程と；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られる混合物からプラバスタチンを単離する工程と、
を含んでなる、方法。
【請求項７】
コンパクチンからプラバスタチンへの変換を改善することが可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）請求項４または５に記載のポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換する工程と；
（ｉｉ）形質転換細胞のクローンを、コンパクチンをヒドロキシル化するそれらの能力について選択する工程と；
（ｉｉｉ）これらの単離されたクローンを、様々なポリヌクレオチドで再形質転換する工程と；
（ｉｖ）形質転換細胞のクローンを、コンパクチンをヒドロキシル化するそれらの改善された能力について選択する工程と；
（ｖ）プラスミドを単離する工程と；
（ｖｉ）プラスミドの挿入物を配列決定する工程と、
を含んでなる、方法。
【請求項８】
工程（ｉ）において得られた産生宿主において請求項７に記載の単離されたポリヌクレオチドを共発現させる工程をさらに含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
コンパクチンは、前記産生宿主の増殖中に添加される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記産生宿主は、真菌細胞または細菌細胞である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記真菌細胞は酵母または糸状菌細胞であり、そして前記細菌細胞は、アクチノマイセテス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）およびプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵母はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クリュイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、そして前記糸状菌細胞はアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、モナスカス・ルバー（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｅｒ）またはモナスカス・パキシー（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐａｘｉｉ）であり、そして前記アクチノマイセテス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）またはアクチノマジュラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）であり、そして前記プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）はエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）はストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）またはストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）であり、そして前記アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）はアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）であり、そして前記エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であり、そして前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）はバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）または枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項６および８〜１３のいずれか一項に従って得られるプラバスタチンを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１】
配列番号３、配列番号６、配列番号４３〜５９に従うアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号３に対して少なくとも５０％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号６に対して少なくとも６０％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号４３〜５９と３アミノ酸以下異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群から選択される、ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号３、配列番号６、配列番号１９〜２６もしくは配列番号３５〜５９に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号３、配列番号６、配列番号１９〜２６もしくは配列番号３５〜５９に対して少なくとも９０％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも５０％の効率でコンパクチンをプラバスタチンに変換することが可能なポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１、２、４または５である、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
プラバスタチンを産生させるための方法であって、以下の工程：
（ｉ）産生宿主において請求項４または５に記載のポリヌクレオチドを発現させる工程と；
（ｉｉ）工程（ｉ）において得られる産生宿主を増殖させる工程と；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られる混合物からプラバスタチンを単離する工程と、
を含んでなる、方法。
【請求項７】
コンパクチンからプラバスタチンへの変換を改善することが可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）請求項４または５に記載のポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換する工程と；
（ｉｉ）形質転換細胞のクローンを、コンパクチンをヒドロキシル化するそれらの能力について選択する工程と；
（ｉｉｉ）これらの単離されたクローンを、様々なポリヌクレオチドで再形質転換する工程と；
（ｉｖ）形質転換細胞のクローンを、コンパクチンをヒドロキシル化するそれらの改善された能力について選択する工程と；
（ｖ）プラスミドを単離する工程と；
（ｖｉ）プラスミドの挿入物を配列決定する工程と、
を含んでなる、方法。
【請求項８】
工程（ｉ）において得られた産生宿主において請求項７に記載の単離されたポリヌクレオチドを共発現させる工程をさらに含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
コンパクチンは、前記産生宿主の増殖中に添加される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記産生宿主は、真菌細胞または細菌細胞である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記真菌細胞は酵母または糸状菌細胞であり、そして前記細菌細胞は、アクチノマイセテス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）およびプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵母はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クリュイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、そして前記糸状菌細胞はアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、モナスカス・ルバー（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｅｒ）またはモナスカス・パキシー（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐａｘｉｉ）であり、そして前記アクチノマイセテス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）またはアクチノマジュラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）であり、そして前記プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）はエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）はストレプトマイセス・カルボフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）またはストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）であり、そして前記アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）はアミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）であり、そして前記エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であり、そして前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）はバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）または枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項６および８〜１３のいずれか一項に従って得られるプラバスタチンを含んでなる、医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５１２７３３（Ｐ２０１０−５１２７３３Ａ）
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４０７４１（Ｐ２００９−５４０７４１）
【出願日】平成１９年１２月１１日（２００７．１２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６３６３８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７１６７３
【国際公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１１日（２００７．１２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６３６３８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７１６７３
【国際公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
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