マイクロサテライトＤＮＡを用いたホップ品種鑑定法
【課題】本発明の課題は、ホップから抽出したゲノムDNAに対して、プライマーを用いてPCRを行い、ホップ品種を識別しうるマイクロサテライト領域を増幅することで、現在ホップ市場で流通量の多い主要品種を識別する迅速・簡便な方法を提供することにある。
【解決手段】本発明は、被検体であるホップのＤＮＡを品種間における塩基配列上の多型を含むマイクロサテライトＤＮＡを増幅し得るように設計された品種識別プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、前記マイクロサテライトＤＮＡを増幅し、増幅ＤＮＡ断片を解析することにより品種を識別することを特徴とするホップの品種鑑定方法である。
【解決手段】本発明は、被検体であるホップのＤＮＡを品種間における塩基配列上の多型を含むマイクロサテライトＤＮＡを増幅し得るように設計された品種識別プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、前記マイクロサテライトＤＮＡを増幅し、増幅ＤＮＡ断片を解析することにより品種を識別することを特徴とするホップの品種鑑定方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はホップの品種鑑定法に関し、さらにはマイクロサテライトＤＮＡを用いることを特徴とするホップ品種鑑定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホップは桑科のHumulus属に属する植物であって、ビールに、特有の芳香や苦味を与えると同時に、過剰なタンパク質を沈殿・分離させ、雑菌の繁殖を防ぐなど、ビール醸造に不可欠な原料のひとつである。しかし、これらのホップの作用は品種によって大きく異なることから、安定した品質の良いビールを醸造するには正確なホップ品種の選別および識別が重要となる。また、これらのことからホップの市場価格も品種によって大きく異なっている。
【０００３】
これまで、ホップの品種鑑定はその毬花の外観の特徴や、毬花から得られる苦味成分や精油成分をガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーを用いて定量することで行われてきた。しかし、ホップはその殆どが収穫された地域で粉砕・圧縮されペレットの状態で輸送されることから、外観上の特徴から品種を識別することは非常に困難であり、また一方、成分を分析する方法では、その指標となる成分が、ホップが栽培されている地域の気候や土質、あるいはホップの保存方法などに大きく影響され、同じ品種でも収穫年度や収穫地域によって分析結果が異なるなど、正確な品種鑑定が難しい上分析作業にも多大な労力を必要とするなどの問題があった。
【０００４】
一方、近年いくつかの遺伝子工学を応用した品種鑑定方法が開発されてきた。これらの方法は品種間での塩基配列の違い、すなわち多型を検出することで品種識別を行っている。すなわち、栽培環境や保存方法に影響されない遺伝子上の特徴を指標とすることから、正確な品種鑑定が可能となる。既に多くの商業作物においてＲＡＰＤ（random amplified polymorphic DNA）法、ＲＦＬＰ（Restriction fragment length polymorphisms）法、ＡＦＬＰ（amplified fragment length polymorphisms）法、マイクロサテライト法などの遺伝子工学を用いた品種識別方法が開発されており、応用されている。
【０００５】
ホップにおいても、荒木らは、ＲＡＰＤ法により品種間で異なるＤＮＡ領域を見つけ、ＤＮＡの多型が明確になるような１０種のプライマーを作製してＰＣＲを行うことにより、ホップ品種を識別する方法を報告した（特許文献１）。同様にして、村上らもＲＡＰＤ法を用いたホップ品種の鑑定方法を報告した（特許文献２）。しかし、ＲＡＰＤ法はひとつのマーカーから得られる情報が少なく、実際の品種鑑定には多くのマーカーを必要とし、そのため多くの時間と労力を必要とした。
【０００６】
また、Bradyらも、ＲＡＰＤ法とマイクロサテライト領域を組み合わせた品種鑑定法を開発し、３４品種のホップが識別できることを報告したが（非特許文献１）、その多くはホップ市場で流通していない試験品種あるいは育種系統であり、現在実際に流通量の多い品種は含まれていない。
【特許文献１】再公表ＷＯ９７／０５２８１号公報
【特許文献２】特開平１１−１０３８９５号公報
【非特許文献１】Euphytica, 91, 277-288, 1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ホップゲノム上の多型を利用することでホップ品種を識別する上記方法は、ホップの栽培環境や収穫時期あるいは保存方法に関わらず、ホップの品種を識別しうる有効な手段といえるが、以上のように、現在までに報告されているゲノムDNA上の多型に基づくホップ品種鑑定法は、ひとつのマーカーから得られる情報が少なく、多くの時間と労力を必要とし、あるいは、実際にホップ市場に流通している主要品種を識別することができないため、効率的なホップ品種の鑑定が困難であった。
【０００８】
本発明の課題は、ホップから抽出したゲノムDNAに対して、プライマーを用いてPCRを行い、ホップ品種を識別しうるマイクロサテライト領域を増幅することで、現在ホップ市場で流通量の多い主要品種を識別する迅速・簡便な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のホップの品種識別方法は、品種間のマイクロサテライト領域における反復回数の違い、すなわち多型に基づき、この多型を遺伝学的な手法で検出して識別する方法であり、詳細には、被検体であるホップのＤＮＡのうち品種間で多型を含むマイクロサテライト領域を、品種識別プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲという）により増幅し、この増幅ＤＮＡを解析することにより品種を識別するものである。
【００１０】
上記の方法を達成するためには、ホップ品種間のマイクロサテライト領域における多型を知る必要がある。この多型とは、具体的にはマイクロサテライト領域中の反復配列の反復回数の違いを含み、また、多型に関与する配列の長さは１ｂｐであってもよい。
【００１１】
上記のような品種間の配列上の多型を含むマイクロサテライト領域を検出する方法としては、Kijasら、RajiendaraらあるいはIsabelらにより開発されたマイクロサテライト領域のクローニング方法を利用することができる。このクローニング方法は、配列が未知のゲノムＤＮＡ中のマイクロサテライト領域を、合成ビオチン化プローブを用いて単離する方法である。詳細にはホップのゲノムＤＮＡを制限酵素で処理し、これをベクターに組み込むことでホップゲノムライブラリーを作製する。このライブラリーを元に一本鎖ＤＮＡを合成し、ビオチン化プローブを用いてマイクロサテライト領域を濃縮する。このＤＮＡ溶液を元にＰＣＲを行うことでマイクロサテライト領域を単離することができる。
【００１２】
一方、上記の方法は、上記のように本発明におけるマイクロサテライトを単離する方法以外にも、ＰＣＲにより多型を検出し得るプライマーを選択する方法、すなわち、プライマー設計方法としても利用することができる。従って、上記の単離方法に基づき検出されるホップのマイクロサテライト領域における品種間のいかなる多型領域も本発明の対象に含まれる。また、上記の方法に基づき検出される多型領域を増幅し得るいかなるプライマーも本発明の品種識別プライマーとして利用することができる。
【００１３】
上記品種識別プライマーを用いて品種識別を行った場合、ＰＣＲにより品種間で内部の繰返し配列の、場合によってはサイズの異なる増幅ＤＮＡが生成される。ここで生成された増幅DNAを直接電気泳動により分画し、泳動パターンにより品種を識別することができる。
【００１４】
以上のように、本発明者らは鋭意検討の結果、ホップＤＮＡから１３の多型を有するマイクロサテライトＤＮＡを見出し、それらをＰＣＲにより増幅し得る配列番号１〜２６記載のプライマーを設計した。そのうち品種鑑定にもっとも適するマイクロサテライトを５種選定し、また、それらのマイクロサテライトを増幅し得るプライマーペアを選定し、多数の品種を識別できる品種鑑定方法を開発し、本発明を完成させた。
【００１５】
すなわち、本発明の第１は、被検体であるホップのＤＮＡを品種間における塩基配列上の多型を含むマイクロサテライトＤＮＡを増幅し得るように設計された品種識別プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、前記マイクロサテライトＤＮＡを増幅し、増幅ＤＮＡ断片の長さの差異を解析することにより品種を識別することを特徴とするホップの品種鑑定方法を提供する。
本発明の第２は、品種識別プライマーが配列番号１〜２６である第１の発明記載のホップの品種鑑定方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のホップの品種鑑定法により、従来より簡便に明瞭にホップの識別ができるようになり、ビール製造工程の原料管理及び品質管理の向上が図られた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
Ａ. ビオチン化プライマーを用いたマイクロサテライト領域のクローニング
ビオチン化プライマーを用いたマイクロサテライトのクローニング方法は、Kijasらの方法（Kijas JM，Fowler JC，Garbett CA，Thomas MR．（1994）Enrichment of microsatellite from the citrus genome using biotinylated oligonucleotide sequences bound to streptavidin−coated magnetic particles．Biotechniques 16,656-60，662）に、Rajiendara（Rajendra P．Kandpal， Geeta Kandpal，Sherman M．Weissman（1994）Construction of libraries enriched for sequence repeats and jumping clones，and hybridization selection for region-specific markers．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91，88−92）らと、Isabel（Isabel Tenser，Stefania Degli Ivanissevich，Michele Morgante，Cesare Gessler（1999）Identification of Microsatellite markers and their application to population genetics of Venturia inaequalis．Phytopathology 89：748−753）らの方法を参考に一部改変を加えた方法でクローニングを行った。
【００１８】
（１）ホップからのゲノムの抽出
岩手ホップ試験農場にて栽培されたアサヒビール登録品種であるホップ「南部早生」の葉よりＤＮＡを抽出した。ホップの葉１枚を５０ｍｌ遠沈管に入れ、液体窒素に約１分間浸して凍結させ、すぐにマルチビーズショッカー（安井器械）にセットし、１４００ｒｐｍで２０秒間粉砕した。得られた粉末からgenomic-tip(QIAGEN)を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
【００１９】
（２）ホップゲノムライブラリー作製
ホップゲノムＤＮＡ１００μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ（TaKaRa）とＭｓｅＩ（New England Biolabs）で消化したあと、アガロースゲル電気泳動にて分離し、約３００ｂｐ〜１、５００ｂｐの部分のゲルを切り出した。切り出したゲルからGeneCleanKit（BIOlOl）を用いてＤＮＡを回収した。次に、図１の配列のオリゴＤＮＡを作成し、９５℃で５分間インキュべ−トし、徐々に温度を下げてアニーリングさせることによって、末端がＥｃｏＲＩ消化またはＭｓｅＩ消化による突出末端となるようなアダプターＤＮＡを作製した。これと、上記のＥｃｏＲＩとＭｓｅＩで消化したホップゲノムＤＮＡをLigation Kit ver．II（TaKaRa）を用いてライゲーションした。
【００２０】
このライゲーション溶液中のＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行った。ポリメラーゼはAmpliTaq Gold（アプライド・バイオシステムズ）を使い、プライマーは図１のアダプター部分にアニーリングする０．０１μＭのＥｃｏＲＩプライマーとＭｓｅＩプライマー（図２）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応はＭＪリサーチ社製のサーマルサイクラーを用いた。反応温度は、９４℃で４分間のあと、９４℃で１分間、３７℃で１分間、７２℃で１分間を３３回繰り返し、そのあと７２℃で４分間伸長反応を行った。
【００２１】
（３）マイクロサテライトの単離
０．６ｍｌのStreptavidin-Coated Magnetic Beads（Promega）が入った１．５ｍｌ微量遠沈管に、３μｇのビオチン化プライマー（図３のうちのどちらか一方）を加え室温で１５分間インキュベー卜した。過剰なプライマーを取り除くため、０．５×ＳＳＣで３回洗浄後、ビオチン−アピジン結合物を３５０μｌの１０×ＳＳＣに懸濁した。（２）のＰＣＲ反応溶液１００μｌに滅菌水を５５０μｌ加え、９５℃で５分間熱変性後急冷し、ビオチン−アピジン結合物に加え２０分間室温に置いた。その後、２×ＳＳＣで４回、１×ＳＳＣで４回洗浄した。回収した磁気ビーズに１．５ＮａＯＨ２００μｌを加え混合し、室温で２０分間置いた。上清を回収し１．２５Ｍの酢酸で中和後、SUPREC−02（TaKaRa）を用いて脱塩し、マイクロサテライトＤＮＡ濃縮溶液とした。
【００２２】
（４）ＰＣＲ
脱塩したマイクロサテライトＤＮＡ濃縮溶液をテンプレートにしてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはAmpliTaq Gold（アプライド・システムズ）を使い、プライマーは０．０１μＭのＥｃｏＲＩプライマーとＭｓｅＩプライマー（図２）を用いてＰＣＲを行った。反応に使った機器、反応条件は（２）でのＰＣＲと同じ条件で行った。ＰＣＲ反応後、反応溶液をPCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。
【００２３】
（５）ライゲーションおよび塩基配列決定
精製したＤＮＡを、pGEM-T Easy Vector System（プロメガ）を用いてｐＧＥＭベクターとライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ１０９へトランスフォーメーションした。生育したコロニーのインサートチェックを行い、インサートのサイズが３００〜８００ｂｐのものについて通常の方法で塩基配列を決定した。
【００２４】
（６）シーケンス解析 キヤピラリーシーケンサー（BECKMAN COULTER；CEQ8000）を用いてシーケンスを解析したあと、反復回数が多いマイクロサテライト領域についてのみマイクロサテライト領域を挟むようにプライマーを設計し、合成した。その際、片側のプライマーにはＦＡＭ（青）、ＨＥＸ（緑）、ＮＥＤ（黄）のいずれかの蛍光色素を付加した。
【００２５】
Ｂ．多型解析
上記のようにして得られた、マイクロサテライトを挟むように設計された合成オリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行うことで、増幅するマイクロサテライト領域が多型を有するかを、現在世界で流通量が多い３７品種について調べた結果を以下（１）から（３）に示す。
（１）ホップゲノムDNAの抽出
現在世界で流通量の多いホップ３７品種（表１）の毬花を入手し,その試料からＤＮＡの抽出を行った。表中の３７各品種の毬花１個をそれぞれ１０ｍｌの破砕専用遠沈管（安井器械製）にいれ、液体窒素に約１分間浸し凍結させ、すぐにマルチビーズショッカーをにセットし、１４００ｒｐｍで２０秒間粉砕した。得られた粉末５０ｍｇからDNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN社製)を用いてプロトコールに従いＤＮＡを抽出した。その結果、各種ホップ品種のゲノムＤＮＡを３０〜５０μｇ得た。
【００２６】
【表１】
（２）ＰＣＲ
抽出したホップＤＮＡ５ｎｇをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはAmpliTaqGold（Applied Biosystems）を使い、プライマーは蛍光を付加して設計、合成した上記プライマーペアーを用いた。ＰＣＲ反応は、ＭＪリサーチ社製のサーマルサイタラーを用いた。反応温度は９４℃で１３分間のあと、９４℃で４５秒間、５５℃で３９秒間、７２℃で９０秒間を２７回繰り返し、そのあと、７２℃で１０分間伸長反応を行った。
【００２７】
（３）ＤＮＡシーケンサーを用いた電気泳動
ＰＣＲ反応溶液１μｌにつきホルムアミド（amresco）２．５μｌ、サイズスタンダードマーカー（Applied Biosystems）GENESCAN−400HD［ROX］０．５μｌ、ローディングバッファー（サイズスタンダードマーカーに添付）０．５μｌをそれぞれ混合し、９５℃で５分間熱変性させローディングサンプルとした。これを電気泳動装置（ABIPRISM 377 DNA Sequencer）で分離し解析した。その結果、多型を有するマイクロサテライトを増幅しうる配列番号１〜２６記載のプライマーペアーを選抜した。その中から特に明瞭な結果が得られるプライマーペアーである、配列番号１および２、５および６、１７および１８、２１および２２、２３および２４の５つのプライマーペアーを選び品種鑑定に用いることとした。
【００２８】
マイクロサテライトマーカーの選択
上記のようにして得られた、マイクロサテライトを挟むように設計された合成オリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてPCRを行うことで、増幅するマイクロサテライト領域が多型を有するかを、現在世界で流通量が多い３７品種について調べた結果を実施例１から１３に示す。
【実施例１】
【００２９】
上記のようにして得られたプライマーのうち、配列表の配列番号１記載の蛍光付加プライマー、および配列番号２記載のプライマーを、それぞれ終濃度０．１μＭになるように用いた。さらに、０．２ユニットのAmpli Taq Goldポリメラーゼ（アプライド・バイオシステムズ）、２００μMの４種類の各塩基（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）およびホップ３７品種それぞれから調製した５ｎｇのホップゲノムＤＮＡを加えた、５０ｍM KCｌ、１．５ｍM MgCｌを含有する１０ｍM トリス−塩酸緩衝液（ｐH８．３）中で、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。反応液量は２０μｌとした。上記のポリメラーゼ連鎖反応における各工程は下記の条件で行った。はじめに９４℃で１３分間保持した後、変性工程は９４℃で４５秒間加熱し、プライマーのアニーリング工程は５５℃で３９秒間インキュベートし、ＤＮＡポリメラーゼによる伸張工程は、７２℃で９０秒間処理するサイクルを２７回行い、７２℃で１０分間保持した。上記のポリメラーゼ連鎖反応により得られた増幅ＤＮＡは、ＡＢＩ Prism ３７７ ＤＮＡシーケンサー（アプライド・バイオシステムズ）用の３６ｃｍアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し分離した。その際に、サイズマーカーとしては、ＧＳ４００ＨＤ（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いた。泳動後の解析にはGene Scan （アプライド・バイオシステムズ社製）を使用し、バンドサイズを計算した。電気泳動の得られたゲルイメージを図４に示した。ゲルイメージをGene Scanを用いて解析した結果、表２に示すように、このプライマーセットを用いた場合は多型が１１種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを１７タイプに識別することができた。これらの多型は識別しやすく、再現性良く観察された。
【００３０】
【表２】
【実施例２】
【００３１】
プライマー配列として配列番号３および４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表３に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号３および４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が７種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを７タイプに識別することができた。
【００３２】
【表３】
【実施例３】
【００３３】
プライマー配列として配列番号５および６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表４に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号５および６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が９種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを１４タイプに識別することができた。
【００３４】
【表４】
【実施例４】
【００３５】
プライマー配列として配列番号７および８に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表５に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号７および８に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が９種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを１４タイプに識別することができた。
【００３６】
【表５】
【実施例５】
【００３７】
プライマー配列として配列番号９および１０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表６に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号９および１０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が５種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを８タイプに識別することができた。
【００３８】
【表６】
【実施例６】
【００３９】
プライマー配列として配列番号１１および１２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表７に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号１１および１２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が３種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを４タイプに識別することができた。
【００４０】
【表７】
【実施例７】
【００４１】
プライマー配列として配列番号１３および１４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表８に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号１３および１４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が１１種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを１７タイプに識別することができた。
【００４２】
【表８】
【実施例８】
【００４３】
プライマー配列として配列番号１５および１６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表９に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号１５および１６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が５種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを８タイプに識別することができた。
【００４４】
【表９】
【実施例９】
【００４５】
プライマー配列として配列番号１７および１８に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表１０に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号１７および１８に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が８種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを１２タイプに識別することができた。
【００４６】
【表１０】
【実施例１０】
【００４７】
プライマー配列として配列番号１９および２０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表１１に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号１９および２０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が１１種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを１４タイプに識別することができた。
【００４８】
【表１１】
【実施例１１】
【００４９】
プライマー配列として配列番号２１および２２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表１２に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号２１および２２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が１２種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを１４タイプに識別することができた。
【００５０】
【表１２】
【実施例１２】
【００５１】
プライマー配列として配列番号２３および２４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表１３に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号２３および２４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が１３種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを２２タイプに識別することができた。
【００５２】
【表１３】
【実施例１３】
【００５３】
プライマー配列として配列番号２５および２６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表１４に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号２５および２６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が３種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを５タイプに識別することができた。
【００５４】
【表１４】
【００５５】
ホップの品種鑑定に使用するマイクロサテライトの選抜とＰＣＲによるホップ品種鑑定
上記のように、ビオチン化プライマーを使ってマイクロサテライト領域を濃縮する方法でマイクロサテライトのクローニングを行い、得られたマイクロサテライトの中で、繰り返し回数が比較的多いもののみを選抜して多型解析を行った。その結果、表１５に示すように１３種のマイクロサテライトで品種によってバンドパターンが異なる（多型）結果を得た。
【００５６】
【表１５】
なお、マイクロサテライトの反復回数を「Microsatellite Type」の欄の下付き数字で示した。品種によってマイクロサテライトの反復回数が異なるため、マイクロサテライト領域をＰＣＲで増幅して電気泳動すると、バンドサイズが品種によって異なる。そのバンドサイズの種類数を「Allele」として示した。
【００５７】
多型が得られた１３種のマイクロサテライトの中でも、品種によってバンドサイズが大きく異なる様なマイクロサテライトを増幅するプライマーペアーであった、配列番号１および２、５および６、１７および１８、２１および２２、２３および２４を組み合わせて品種鑑定に使用する事とし、これらのマイクロサテライトを特異的に増幅するためのプライマーを表１６に示すように作製した。蛍光色と増幅するＤＮＡのサイズを調節して一回の泳動で品種鑑定が行えるように工夫した。（図５）
【００５８】
【表１６】
【００５９】
今回得られた、品種間で多型を有するマイクロサテライト領域を増幅するプライマーペアーのうち、配列番号１および２、５および６、１７および１８、２１および２２、２３および２４の５つのプライマーペアーを組み合わせて、ホップ３７品種について品種識別を行った結果、３７品種を２７のグループに分類することが可能であった（表１７）。分類できない主な品種として、NuggetとU．S．Nugget、HersbruckerとHersbrucker Spat、SaazerとTettnanger（Barth）などがあったが、これらは非常に近縁な品種として広く知られている品種であった。また、マイクロサテライト領域の多型を品種識別に応用した本方法は、これまで荒木らによって報告されているＲＡＰＤ法を用いた品種識別法よりも少ないマーカーで、より簡便に品種を識別することが可能であった。
【００６０】
【表１７】
【００６１】
電気泳動の結果、現れるバンドのパターンを数字で表したもの。同じ数字は同じバンドパターンとなることを示している。また、右端の列では同一パターンとなる品種同士を同じ印で示した。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ビオチン化プライマーを用いたホップのマイクロサテライト領域のクローニングにおけるアダプターＤＮＡの作製。
【図２】ビオチン化プライマーを用いたホップのマイクロサテライト領域のクローニングにおけるEcoRIプライマー及びMseIプライマー。
【図３】ビオチン化プライマーを用いたホップのマイクロサテライト領域のクローニングにおけるビオチン化プライマー。
【図４】配列番号１および２のプライマーを用いて３７品種のホップについてPCRを行い、電気泳動した結果。赤色のバンドはサイズマーカー。
【図５】ホップ37品種について、配列番号１および２、５および６、１７および１８、２１および２２、２３および２４の各プライマーによって増幅されるマイクロサテライト領域を含む断片を、一度にアクリルアミド電気泳動した結果。一番左のレーンから37レーンまでが表1の品種に付けた番号に対応する。
【技術分野】
【０００１】
本発明はホップの品種鑑定法に関し、さらにはマイクロサテライトＤＮＡを用いることを特徴とするホップ品種鑑定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホップは桑科のHumulus属に属する植物であって、ビールに、特有の芳香や苦味を与えると同時に、過剰なタンパク質を沈殿・分離させ、雑菌の繁殖を防ぐなど、ビール醸造に不可欠な原料のひとつである。しかし、これらのホップの作用は品種によって大きく異なることから、安定した品質の良いビールを醸造するには正確なホップ品種の選別および識別が重要となる。また、これらのことからホップの市場価格も品種によって大きく異なっている。
【０００３】
これまで、ホップの品種鑑定はその毬花の外観の特徴や、毬花から得られる苦味成分や精油成分をガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーを用いて定量することで行われてきた。しかし、ホップはその殆どが収穫された地域で粉砕・圧縮されペレットの状態で輸送されることから、外観上の特徴から品種を識別することは非常に困難であり、また一方、成分を分析する方法では、その指標となる成分が、ホップが栽培されている地域の気候や土質、あるいはホップの保存方法などに大きく影響され、同じ品種でも収穫年度や収穫地域によって分析結果が異なるなど、正確な品種鑑定が難しい上分析作業にも多大な労力を必要とするなどの問題があった。
【０００４】
一方、近年いくつかの遺伝子工学を応用した品種鑑定方法が開発されてきた。これらの方法は品種間での塩基配列の違い、すなわち多型を検出することで品種識別を行っている。すなわち、栽培環境や保存方法に影響されない遺伝子上の特徴を指標とすることから、正確な品種鑑定が可能となる。既に多くの商業作物においてＲＡＰＤ（random amplified polymorphic DNA）法、ＲＦＬＰ（Restriction fragment length polymorphisms）法、ＡＦＬＰ（amplified fragment length polymorphisms）法、マイクロサテライト法などの遺伝子工学を用いた品種識別方法が開発されており、応用されている。
【０００５】
ホップにおいても、荒木らは、ＲＡＰＤ法により品種間で異なるＤＮＡ領域を見つけ、ＤＮＡの多型が明確になるような１０種のプライマーを作製してＰＣＲを行うことにより、ホップ品種を識別する方法を報告した（特許文献１）。同様にして、村上らもＲＡＰＤ法を用いたホップ品種の鑑定方法を報告した（特許文献２）。しかし、ＲＡＰＤ法はひとつのマーカーから得られる情報が少なく、実際の品種鑑定には多くのマーカーを必要とし、そのため多くの時間と労力を必要とした。
【０００６】
また、Bradyらも、ＲＡＰＤ法とマイクロサテライト領域を組み合わせた品種鑑定法を開発し、３４品種のホップが識別できることを報告したが（非特許文献１）、その多くはホップ市場で流通していない試験品種あるいは育種系統であり、現在実際に流通量の多い品種は含まれていない。
【特許文献１】再公表ＷＯ９７／０５２８１号公報
【特許文献２】特開平１１−１０３８９５号公報
【非特許文献１】Euphytica, 91, 277-288, 1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ホップゲノム上の多型を利用することでホップ品種を識別する上記方法は、ホップの栽培環境や収穫時期あるいは保存方法に関わらず、ホップの品種を識別しうる有効な手段といえるが、以上のように、現在までに報告されているゲノムDNA上の多型に基づくホップ品種鑑定法は、ひとつのマーカーから得られる情報が少なく、多くの時間と労力を必要とし、あるいは、実際にホップ市場に流通している主要品種を識別することができないため、効率的なホップ品種の鑑定が困難であった。
【０００８】
本発明の課題は、ホップから抽出したゲノムDNAに対して、プライマーを用いてPCRを行い、ホップ品種を識別しうるマイクロサテライト領域を増幅することで、現在ホップ市場で流通量の多い主要品種を識別する迅速・簡便な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のホップの品種識別方法は、品種間のマイクロサテライト領域における反復回数の違い、すなわち多型に基づき、この多型を遺伝学的な手法で検出して識別する方法であり、詳細には、被検体であるホップのＤＮＡのうち品種間で多型を含むマイクロサテライト領域を、品種識別プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲという）により増幅し、この増幅ＤＮＡを解析することにより品種を識別するものである。
【００１０】
上記の方法を達成するためには、ホップ品種間のマイクロサテライト領域における多型を知る必要がある。この多型とは、具体的にはマイクロサテライト領域中の反復配列の反復回数の違いを含み、また、多型に関与する配列の長さは１ｂｐであってもよい。
【００１１】
上記のような品種間の配列上の多型を含むマイクロサテライト領域を検出する方法としては、Kijasら、RajiendaraらあるいはIsabelらにより開発されたマイクロサテライト領域のクローニング方法を利用することができる。このクローニング方法は、配列が未知のゲノムＤＮＡ中のマイクロサテライト領域を、合成ビオチン化プローブを用いて単離する方法である。詳細にはホップのゲノムＤＮＡを制限酵素で処理し、これをベクターに組み込むことでホップゲノムライブラリーを作製する。このライブラリーを元に一本鎖ＤＮＡを合成し、ビオチン化プローブを用いてマイクロサテライト領域を濃縮する。このＤＮＡ溶液を元にＰＣＲを行うことでマイクロサテライト領域を単離することができる。
【００１２】
一方、上記の方法は、上記のように本発明におけるマイクロサテライトを単離する方法以外にも、ＰＣＲにより多型を検出し得るプライマーを選択する方法、すなわち、プライマー設計方法としても利用することができる。従って、上記の単離方法に基づき検出されるホップのマイクロサテライト領域における品種間のいかなる多型領域も本発明の対象に含まれる。また、上記の方法に基づき検出される多型領域を増幅し得るいかなるプライマーも本発明の品種識別プライマーとして利用することができる。
【００１３】
上記品種識別プライマーを用いて品種識別を行った場合、ＰＣＲにより品種間で内部の繰返し配列の、場合によってはサイズの異なる増幅ＤＮＡが生成される。ここで生成された増幅DNAを直接電気泳動により分画し、泳動パターンにより品種を識別することができる。
【００１４】
以上のように、本発明者らは鋭意検討の結果、ホップＤＮＡから１３の多型を有するマイクロサテライトＤＮＡを見出し、それらをＰＣＲにより増幅し得る配列番号１〜２６記載のプライマーを設計した。そのうち品種鑑定にもっとも適するマイクロサテライトを５種選定し、また、それらのマイクロサテライトを増幅し得るプライマーペアを選定し、多数の品種を識別できる品種鑑定方法を開発し、本発明を完成させた。
【００１５】
すなわち、本発明の第１は、被検体であるホップのＤＮＡを品種間における塩基配列上の多型を含むマイクロサテライトＤＮＡを増幅し得るように設計された品種識別プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、前記マイクロサテライトＤＮＡを増幅し、増幅ＤＮＡ断片の長さの差異を解析することにより品種を識別することを特徴とするホップの品種鑑定方法を提供する。
本発明の第２は、品種識別プライマーが配列番号１〜２６である第１の発明記載のホップの品種鑑定方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のホップの品種鑑定法により、従来より簡便に明瞭にホップの識別ができるようになり、ビール製造工程の原料管理及び品質管理の向上が図られた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
Ａ. ビオチン化プライマーを用いたマイクロサテライト領域のクローニング
ビオチン化プライマーを用いたマイクロサテライトのクローニング方法は、Kijasらの方法（Kijas JM，Fowler JC，Garbett CA，Thomas MR．（1994）Enrichment of microsatellite from the citrus genome using biotinylated oligonucleotide sequences bound to streptavidin−coated magnetic particles．Biotechniques 16,656-60，662）に、Rajiendara（Rajendra P．Kandpal， Geeta Kandpal，Sherman M．Weissman（1994）Construction of libraries enriched for sequence repeats and jumping clones，and hybridization selection for region-specific markers．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91，88−92）らと、Isabel（Isabel Tenser，Stefania Degli Ivanissevich，Michele Morgante，Cesare Gessler（1999）Identification of Microsatellite markers and their application to population genetics of Venturia inaequalis．Phytopathology 89：748−753）らの方法を参考に一部改変を加えた方法でクローニングを行った。
【００１８】
（１）ホップからのゲノムの抽出
岩手ホップ試験農場にて栽培されたアサヒビール登録品種であるホップ「南部早生」の葉よりＤＮＡを抽出した。ホップの葉１枚を５０ｍｌ遠沈管に入れ、液体窒素に約１分間浸して凍結させ、すぐにマルチビーズショッカー（安井器械）にセットし、１４００ｒｐｍで２０秒間粉砕した。得られた粉末からgenomic-tip(QIAGEN)を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
【００１９】
（２）ホップゲノムライブラリー作製
ホップゲノムＤＮＡ１００μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ（TaKaRa）とＭｓｅＩ（New England Biolabs）で消化したあと、アガロースゲル電気泳動にて分離し、約３００ｂｐ〜１、５００ｂｐの部分のゲルを切り出した。切り出したゲルからGeneCleanKit（BIOlOl）を用いてＤＮＡを回収した。次に、図１の配列のオリゴＤＮＡを作成し、９５℃で５分間インキュべ−トし、徐々に温度を下げてアニーリングさせることによって、末端がＥｃｏＲＩ消化またはＭｓｅＩ消化による突出末端となるようなアダプターＤＮＡを作製した。これと、上記のＥｃｏＲＩとＭｓｅＩで消化したホップゲノムＤＮＡをLigation Kit ver．II（TaKaRa）を用いてライゲーションした。
【００２０】
このライゲーション溶液中のＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行った。ポリメラーゼはAmpliTaq Gold（アプライド・バイオシステムズ）を使い、プライマーは図１のアダプター部分にアニーリングする０．０１μＭのＥｃｏＲＩプライマーとＭｓｅＩプライマー（図２）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応はＭＪリサーチ社製のサーマルサイクラーを用いた。反応温度は、９４℃で４分間のあと、９４℃で１分間、３７℃で１分間、７２℃で１分間を３３回繰り返し、そのあと７２℃で４分間伸長反応を行った。
【００２１】
（３）マイクロサテライトの単離
０．６ｍｌのStreptavidin-Coated Magnetic Beads（Promega）が入った１．５ｍｌ微量遠沈管に、３μｇのビオチン化プライマー（図３のうちのどちらか一方）を加え室温で１５分間インキュベー卜した。過剰なプライマーを取り除くため、０．５×ＳＳＣで３回洗浄後、ビオチン−アピジン結合物を３５０μｌの１０×ＳＳＣに懸濁した。（２）のＰＣＲ反応溶液１００μｌに滅菌水を５５０μｌ加え、９５℃で５分間熱変性後急冷し、ビオチン−アピジン結合物に加え２０分間室温に置いた。その後、２×ＳＳＣで４回、１×ＳＳＣで４回洗浄した。回収した磁気ビーズに１．５ＮａＯＨ２００μｌを加え混合し、室温で２０分間置いた。上清を回収し１．２５Ｍの酢酸で中和後、SUPREC−02（TaKaRa）を用いて脱塩し、マイクロサテライトＤＮＡ濃縮溶液とした。
【００２２】
（４）ＰＣＲ
脱塩したマイクロサテライトＤＮＡ濃縮溶液をテンプレートにしてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはAmpliTaq Gold（アプライド・システムズ）を使い、プライマーは０．０１μＭのＥｃｏＲＩプライマーとＭｓｅＩプライマー（図２）を用いてＰＣＲを行った。反応に使った機器、反応条件は（２）でのＰＣＲと同じ条件で行った。ＰＣＲ反応後、反応溶液をPCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。
【００２３】
（５）ライゲーションおよび塩基配列決定
精製したＤＮＡを、pGEM-T Easy Vector System（プロメガ）を用いてｐＧＥＭベクターとライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ１０９へトランスフォーメーションした。生育したコロニーのインサートチェックを行い、インサートのサイズが３００〜８００ｂｐのものについて通常の方法で塩基配列を決定した。
【００２４】
（６）シーケンス解析 キヤピラリーシーケンサー（BECKMAN COULTER；CEQ8000）を用いてシーケンスを解析したあと、反復回数が多いマイクロサテライト領域についてのみマイクロサテライト領域を挟むようにプライマーを設計し、合成した。その際、片側のプライマーにはＦＡＭ（青）、ＨＥＸ（緑）、ＮＥＤ（黄）のいずれかの蛍光色素を付加した。
【００２５】
Ｂ．多型解析
上記のようにして得られた、マイクロサテライトを挟むように設計された合成オリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行うことで、増幅するマイクロサテライト領域が多型を有するかを、現在世界で流通量が多い３７品種について調べた結果を以下（１）から（３）に示す。
（１）ホップゲノムDNAの抽出
現在世界で流通量の多いホップ３７品種（表１）の毬花を入手し,その試料からＤＮＡの抽出を行った。表中の３７各品種の毬花１個をそれぞれ１０ｍｌの破砕専用遠沈管（安井器械製）にいれ、液体窒素に約１分間浸し凍結させ、すぐにマルチビーズショッカーをにセットし、１４００ｒｐｍで２０秒間粉砕した。得られた粉末５０ｍｇからDNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN社製)を用いてプロトコールに従いＤＮＡを抽出した。その結果、各種ホップ品種のゲノムＤＮＡを３０〜５０μｇ得た。
【００２６】
【表１】
（２）ＰＣＲ
抽出したホップＤＮＡ５ｎｇをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはAmpliTaqGold（Applied Biosystems）を使い、プライマーは蛍光を付加して設計、合成した上記プライマーペアーを用いた。ＰＣＲ反応は、ＭＪリサーチ社製のサーマルサイタラーを用いた。反応温度は９４℃で１３分間のあと、９４℃で４５秒間、５５℃で３９秒間、７２℃で９０秒間を２７回繰り返し、そのあと、７２℃で１０分間伸長反応を行った。
【００２７】
（３）ＤＮＡシーケンサーを用いた電気泳動
ＰＣＲ反応溶液１μｌにつきホルムアミド（amresco）２．５μｌ、サイズスタンダードマーカー（Applied Biosystems）GENESCAN−400HD［ROX］０．５μｌ、ローディングバッファー（サイズスタンダードマーカーに添付）０．５μｌをそれぞれ混合し、９５℃で５分間熱変性させローディングサンプルとした。これを電気泳動装置（ABIPRISM 377 DNA Sequencer）で分離し解析した。その結果、多型を有するマイクロサテライトを増幅しうる配列番号１〜２６記載のプライマーペアーを選抜した。その中から特に明瞭な結果が得られるプライマーペアーである、配列番号１および２、５および６、１７および１８、２１および２２、２３および２４の５つのプライマーペアーを選び品種鑑定に用いることとした。
【００２８】
マイクロサテライトマーカーの選択
上記のようにして得られた、マイクロサテライトを挟むように設計された合成オリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてPCRを行うことで、増幅するマイクロサテライト領域が多型を有するかを、現在世界で流通量が多い３７品種について調べた結果を実施例１から１３に示す。
【実施例１】
【００２９】
上記のようにして得られたプライマーのうち、配列表の配列番号１記載の蛍光付加プライマー、および配列番号２記載のプライマーを、それぞれ終濃度０．１μＭになるように用いた。さらに、０．２ユニットのAmpli Taq Goldポリメラーゼ（アプライド・バイオシステムズ）、２００μMの４種類の各塩基（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）およびホップ３７品種それぞれから調製した５ｎｇのホップゲノムＤＮＡを加えた、５０ｍM KCｌ、１．５ｍM MgCｌを含有する１０ｍM トリス−塩酸緩衝液（ｐH８．３）中で、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。反応液量は２０μｌとした。上記のポリメラーゼ連鎖反応における各工程は下記の条件で行った。はじめに９４℃で１３分間保持した後、変性工程は９４℃で４５秒間加熱し、プライマーのアニーリング工程は５５℃で３９秒間インキュベートし、ＤＮＡポリメラーゼによる伸張工程は、７２℃で９０秒間処理するサイクルを２７回行い、７２℃で１０分間保持した。上記のポリメラーゼ連鎖反応により得られた増幅ＤＮＡは、ＡＢＩ Prism ３７７ ＤＮＡシーケンサー（アプライド・バイオシステムズ）用の３６ｃｍアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し分離した。その際に、サイズマーカーとしては、ＧＳ４００ＨＤ（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いた。泳動後の解析にはGene Scan （アプライド・バイオシステムズ社製）を使用し、バンドサイズを計算した。電気泳動の得られたゲルイメージを図４に示した。ゲルイメージをGene Scanを用いて解析した結果、表２に示すように、このプライマーセットを用いた場合は多型が１１種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを１７タイプに識別することができた。これらの多型は識別しやすく、再現性良く観察された。
【００３０】
【表２】
【実施例２】
【００３１】
プライマー配列として配列番号３および４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表３に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号３および４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が７種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを７タイプに識別することができた。
【００３２】
【表３】
【実施例３】
【００３３】
プライマー配列として配列番号５および６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表４に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号５および６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が９種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを１４タイプに識別することができた。
【００３４】
【表４】
【実施例４】
【００３５】
プライマー配列として配列番号７および８に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表５に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号７および８に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が９種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを１４タイプに識別することができた。
【００３６】
【表５】
【実施例５】
【００３７】
プライマー配列として配列番号９および１０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表６に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号９および１０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が５種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを８タイプに識別することができた。
【００３８】
【表６】
【実施例６】
【００３９】
プライマー配列として配列番号１１および１２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表７に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号１１および１２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が３種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを４タイプに識別することができた。
【００４０】
【表７】
【実施例７】
【００４１】
プライマー配列として配列番号１３および１４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表８に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号１３および１４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が１１種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを１７タイプに識別することができた。
【００４２】
【表８】
【実施例８】
【００４３】
プライマー配列として配列番号１５および１６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表９に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号１５および１６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が５種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを８タイプに識別することができた。
【００４４】
【表９】
【実施例９】
【００４５】
プライマー配列として配列番号１７および１８に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表１０に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号１７および１８に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が８種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを１２タイプに識別することができた。
【００４６】
【表１０】
【実施例１０】
【００４７】
プライマー配列として配列番号１９および２０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表１１に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号１９および２０に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が１１種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを１４タイプに識別することができた。
【００４８】
【表１１】
【実施例１１】
【００４９】
プライマー配列として配列番号２１および２２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表１２に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号２１および２２に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が１２種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを１４タイプに識別することができた。
【００５０】
【表１２】
【実施例１２】
【００５１】
プライマー配列として配列番号２３および２４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表１３に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号２３および２４に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が１３種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを２２タイプに識別することができた。
【００５２】
【表１３】
【実施例１３】
【００５３】
プライマー配列として配列番号２５および２６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様の条件で実施した。得られた結果を表１４に示す。表から明らかなように、プライマーとして配列番号２５および２６に記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた場合は、多型が３種観察され、そのバンドの位置の組み合わせにより３７品種のホップを５タイプに識別することができた。
【００５４】
【表１４】
【００５５】
ホップの品種鑑定に使用するマイクロサテライトの選抜とＰＣＲによるホップ品種鑑定
上記のように、ビオチン化プライマーを使ってマイクロサテライト領域を濃縮する方法でマイクロサテライトのクローニングを行い、得られたマイクロサテライトの中で、繰り返し回数が比較的多いもののみを選抜して多型解析を行った。その結果、表１５に示すように１３種のマイクロサテライトで品種によってバンドパターンが異なる（多型）結果を得た。
【００５６】
【表１５】
なお、マイクロサテライトの反復回数を「Microsatellite Type」の欄の下付き数字で示した。品種によってマイクロサテライトの反復回数が異なるため、マイクロサテライト領域をＰＣＲで増幅して電気泳動すると、バンドサイズが品種によって異なる。そのバンドサイズの種類数を「Allele」として示した。
【００５７】
多型が得られた１３種のマイクロサテライトの中でも、品種によってバンドサイズが大きく異なる様なマイクロサテライトを増幅するプライマーペアーであった、配列番号１および２、５および６、１７および１８、２１および２２、２３および２４を組み合わせて品種鑑定に使用する事とし、これらのマイクロサテライトを特異的に増幅するためのプライマーを表１６に示すように作製した。蛍光色と増幅するＤＮＡのサイズを調節して一回の泳動で品種鑑定が行えるように工夫した。（図５）
【００５８】
【表１６】
【００５９】
今回得られた、品種間で多型を有するマイクロサテライト領域を増幅するプライマーペアーのうち、配列番号１および２、５および６、１７および１８、２１および２２、２３および２４の５つのプライマーペアーを組み合わせて、ホップ３７品種について品種識別を行った結果、３７品種を２７のグループに分類することが可能であった（表１７）。分類できない主な品種として、NuggetとU．S．Nugget、HersbruckerとHersbrucker Spat、SaazerとTettnanger（Barth）などがあったが、これらは非常に近縁な品種として広く知られている品種であった。また、マイクロサテライト領域の多型を品種識別に応用した本方法は、これまで荒木らによって報告されているＲＡＰＤ法を用いた品種識別法よりも少ないマーカーで、より簡便に品種を識別することが可能であった。
【００６０】
【表１７】
【００６１】
電気泳動の結果、現れるバンドのパターンを数字で表したもの。同じ数字は同じバンドパターンとなることを示している。また、右端の列では同一パターンとなる品種同士を同じ印で示した。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ビオチン化プライマーを用いたホップのマイクロサテライト領域のクローニングにおけるアダプターＤＮＡの作製。
【図２】ビオチン化プライマーを用いたホップのマイクロサテライト領域のクローニングにおけるEcoRIプライマー及びMseIプライマー。
【図３】ビオチン化プライマーを用いたホップのマイクロサテライト領域のクローニングにおけるビオチン化プライマー。
【図４】配列番号１および２のプライマーを用いて３７品種のホップについてPCRを行い、電気泳動した結果。赤色のバンドはサイズマーカー。
【図５】ホップ37品種について、配列番号１および２、５および６、１７および１８、２１および２２、２３および２４の各プライマーによって増幅されるマイクロサテライト領域を含む断片を、一度にアクリルアミド電気泳動した結果。一番左のレーンから37レーンまでが表1の品種に付けた番号に対応する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体であるホップのＤＮＡを品種間における塩基配列上の多型を含むマイクロサテライトＤＮＡを増幅し得るように設計された品種識別プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、前記マイクロサテライトＤＮＡを増幅し、増幅ＤＮＡ断片を解析することにより品種を識別することを特徴とするホップの品種鑑定方法。
【請求項２】
品種識別プライマーが配列番号１〜２６である請求項１記載のホップの品種鑑定方法。
【請求項１】
被検体であるホップのＤＮＡを品種間における塩基配列上の多型を含むマイクロサテライトＤＮＡを増幅し得るように設計された品種識別プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、前記マイクロサテライトＤＮＡを増幅し、増幅ＤＮＡ断片を解析することにより品種を識別することを特徴とするホップの品種鑑定方法。
【請求項２】
品種識別プライマーが配列番号１〜２６である請求項１記載のホップの品種鑑定方法。
【図３】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−３４１４２（Ｐ２００６−３４１４２Ａ）
【公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２１６５４６（Ｐ２００４−２１６５４６）
【出願日】平成１６年７月２３日（２００４．７．２３）
【出願人】（０００００００５５）アサヒビール株式会社 (535)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月２３日（２００４．７．２３）
【出願人】（０００００００５５）アサヒビール株式会社 (535)
【Ｆターム（参考）】
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