メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌のための反応培地
本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を検出および／または同定するための反応培地であって、発色性基質、セファロスポリン系統に属する第１抗生物質、及びアミノグリコシド系統に属する第２抗生物質を含んでなる培地に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を検出するための反応培地に関する。本発明は、この培地の使用とＭＲＳＡ細菌を同定する方法に関する。
【０００２】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、抗生物質メチシリン及びオキサシリンのような抗生物質に対する耐性によって特徴づけられる黄色ブドウ球菌の菌株である。ＭＲＳＡ細菌は、院内感染の高いパーセンテージを示し、しばしば深刻で潜在的に致命的な健康問題の原因となる。最も一般には医療スタッフを経て患者間で相互感染し、ＭＲＳＡは制御が非常に困難な固有の感染症の原因となる。適切な治療に加えて、ＭＲＳＡ保菌者と入ってくる患者の分離のためのスクリーニングは、公的組織（例えば米国医療疫学学会）によって現在推奨されている最も有効な方法で構成される。従って、初期の組織的スクリーニングは不可欠である。
【０００３】
ＭＲＳＡはさまざまな技術によって検出することができる。例えば分子生物学技術によってＭＲＳＡを検出することが可能である。これに関して、欧州出願ＥＰ８８７４２４を挙げることができる。しかしながら、上記の方法はルーチンテストとしては高価なままであり、有資格のスタッフを必要とする。
【０００４】
また、黄色ブドウ球菌を検出するために従来の培養培地（例えば欧州出願ＥＰ１３９０５２４に記載されている培地）を使用することができる。ＭＲＳＡの検出は、特異的な凝集検査（Ｓｌｉｄｅｘ ＭＲＳＡ、ビオメリュー）によって、又はオキサシリン、セホキシチンまたはモキサラクタム・ディスクの存在下で寒天内拡散法によって、追加の工程で実施される(Antibiogram Committee of the French Society for Microbiology及び臨床検査標準協会の推奨）。
【０００５】
また、抗生物質を含む寒天培地上で培養できる細菌はＭＲＳＡである場合がある。また、上記の培地は発色性であってもよく、それによりＭＲＳＡの読み取りと検出を容易にする。特に欧州出願ＥＰ１５４３１４７に記載されている培地を挙げることができる。しかしながら、記載されている条件でのホスファターゼ活性の検出はあまり特異的でないので、それを複数の他の酵素の活性の検出と組合わせる必要があり、それによって培地の繁殖性が減少し、そのコストが増大する。
【０００６】
本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の分離及び迅速な同定を可能にする新規の感受性の高い、特異的な反応培地を提供することによって従来技術の隙間を埋めることを提案する。
【０００７】
驚くべきことに、本願発明者は、セファロスポリンとアミノグリコシドを含む抗生物質の特定の組合せの使用は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を分離して同定するための優れた反応培地を得ることを可能にすることを証明した。
【０００８】
更に続ける前に、以下に示す定義は、より明確に本発明を理解することを可能にするものであり、限定するものではない。
本発明のために、「反応培地」なる用語は、微生物（例えば黄色ブドウ球菌）の生存及び／又は増殖のために必要な成分の全てを含む培地を意味することを目的とする。この反応培地は、検出（revealing）培地のみとしても、あるいは培養且つ検出培地としても用いられる。前者の場合は、微生物は接種前に培養され、後者の場合は反応培地は更に培養培地を構成する。
【０００９】
反応培地は、固体、半固体又は液体であってもよい。「固形培地」なる用語は、例えば、ゲル化培地を意味することを目的とする。好ましくは、本発明の培地はゲル化培地である。寒天は微生物を培養するための微生物学の従来のゲル化剤であるが、ゲルライト、ゼラチンまたはアガロースを使用することも可能である。一定数の製品が市販されており、コロンビア寒天、トリプチカーゼ大豆寒天、マッコンキー寒天、チャップマン寒天、サブロー寒天またはさらに一般的にはthe Handbook of Microbiological Media(CRC Press)に記載されているものである。
【００１０】
本発明による反応培地は、その他の可能な添加物、例えばペプトン、一つ以上の増殖因子、糖質、一つ以上の選択剤、緩衝液、一つ以上のゲル化剤等を含んでもよい。この反応培地は、すぐに使用できる液体またはゲルの形態、すなわちチューブ中またはフラスコ中にまたはシャーレ上において接種する準備ができているものであってもよい。提供される形態がフラスコ中のゲル形態である場合、培地の事前の再生はシャーレに注入される前に（１００℃に変化させる）実施することが好ましい。
【００１１】
好ましくは、本発明の培地は、選択培地、すなわち黄色ブドウ球菌細菌の増殖を助けるインヒビターを含んでなる培地である。特に塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、コリスチン、アンフォテリシン、アズトレオナム、コリマイシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、デフェロキサミン及びビブリオ菌増殖阻害化合物Ｏ／１２９を挙げることができる。
本発明では、酵素又は代謝活性用の基質は、酵素活性または代謝（例えば、特にオシダーゼ活性、好ましくはα−グルクロニダーゼ、グルコシダーゼ、またはガラクトシダーゼ活性）の直接的または間接的な検出を可能にする生成物に加水分解されることができる任意の基質から選択される。
【００１２】
それは天然基質でも合成基質であってもよい。基質の代謝によって、反応培地又は生物の細胞の生理化学的性質に変化が生じる。この変化は、物理化学的方法、特に光学的方法、オペーレーターの視覚により、または分光計、電気、磁気等の計測器を使用して検出することができる。それは、吸収、蛍光または発光の変化のような光学的性質の変異であることが望ましい。
【００１３】
本出願において、「色」なる用語は、可視スペクトルにおける光の吸収である色、又はある波長での吸収（λｅｘ）とより高い波長での放出である蛍光（λｅｍ、λｅｍ＞λｅｘ）をカバーするために使用される。
【００１４】
本発明のために、発色性基質なる用語は、酵素活性（例えば、特にオシダーゼ活性、好ましくはα−グルコシダーゼ活性、エステラーゼ活性、好ましくはホスファターゼ活性またはペプチダーゼ活性、好ましくはコアグラーゼ活性）の直接的または間接的な検出を可能にする生成物を与えるために加水分解されることができる任意の基質を意味することを目的とする。
特に、インドキシル、フラボン、アリザリン、アクリジン、フェノキサジン、ニトロフェノール、ニトロアニリン、ナフトール、カテコール、ヒドロキシキノリン、クマリンまたはヒドロキシフェニルキノザゾル−４−ワン（hydroxyphenylquinoxazol-4-one)に基づく基質を挙げることできる。好ましくは、本発明において使用する基質は、インドキシルに基づくものである。
【００１５】
α−グルコシダーゼ基質として、特に基質５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−α−グルコシド；ジヒドロキシフラボン−α−グルコシド；３，４−シクロヘキサノエスクレチン−α−グルコシド；８−ヒドロキシキノリン−α−グルコシド；５−ブロモ−４−クロル−３−インドキシル−α−グルコシド；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−メチル−α−グルコシド；６−クロロ−３−インドキシル−α−グルコシド；５−ブロモ−３−インドキシル−α−グルコシド；５−ヨウ化−３−インドキシル−α−グルコシド；６−フルオロ−３−インドキシル−α−グルコシド；アリザリン−α−グルコシド；ニトロフェニル−α−グルコシド；４−メチルウンベリフェリル−α−グルコシド；ナフトールベンゼイン−α−グルコシド；インドキシル−Ｎ−メチル−α−グルコシド；ナフチル−α−グルコシド；アミノフェニル−α−グルコシド；ジクロロアミノフェニル−α−グルコシドを挙げることができる。使用するα−グルコシダーゼ基質は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−メチル−α−グルコシドまたは５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−グルコシドであることが望ましい。
【００１６】
ホスファターゼ基質として、特に基質５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル・ホスフェート；３，４−シクロヘキサノエスクレチン・ホスフェート；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル・ホスフェート；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−メチル・ホスフェート；６−クロル−３−インドキシル・ホスフェート；５−ブロモ−３−インドキシル・ホスフェート；５−ヨード−３−インドキシル・ホスフェート； ６−フルオロ−３−インドキシル・ホスフェート；ニトロフェニル・ホスフェート；４−メチルウンベリフェリル・ホスフェート；インドキシル−Ｎ−メチル・ホスフェート；ナフチル・ホスフェート、ＥＬＦ９７−ホスフェートを挙げることができる。好ましくは、使用するホスファターゼ基質は６−クロロ−３インドキシル・ホスフェートであることが望ましい。
【００１７】
本発明において使用する基質は、オシダーゼ、エステラーゼ及び特にホスファターゼまたはホスホリパーゼ、ペプチダーゼ、及び特にコアグラーゼのような他の基質と組合せられてもよい。特に、培地は２−α−グルコシダーゼ基質を含んでもよい。
【００１８】
本発明の基質は、広いｐＨ範囲において、特にｐＨ５．５から１０、好ましくは６．５から９の間で使用することができる。
【００１９】
本発明のために、「セファロスポリン系統に属する抗生物質」は、好ましくは以下の抗生物質から選択される：
・第一世代のセファロスポリンは、例えば、セファレキシン、セファロリジン、セファロチン、セファゾリン、セファドロキシル、セファゼドン、セファトリジン、セファピリン、セフラジン、セファセトリル、セフロダキシン(cefrodaxine)、セフテゾールであり；
・第二世代のセファロスポリンは、例えば、セホキシチン、セフロキシム、セファマンドール、セファクロール、セフォテタン、セフォニシド、セホチアム、ロラカルベフ、セフメタゾール、セフプロジル、セホラニド、セフミノクスであり；
・第三世代のセファロスポリンは、例えば、セフォタキシム、セフタジジム、セフスロジン、セフトリアキソン、セフメノキシム、ラタモキセフ、セフチゾキシム、セフィキシム、セフォジジム、セフェタメト、セフピラミド、セホペラゾン、セフポドキシム、セフチブテン、セフジニル、セフジトレン、セフトリアキソン、セホペラゾン、セフブペラゾン、セフジニルであり；
・第四世代のセファロスポリンは、例えば、セフェピム、セフピロムである。
【００２０】
本発明の関して、セファロスポリン系統に属する抗生物質は、セフミノックスまたはセフジニルが好ましい。
本発明のために、アミノグリコシド系統に属する抗生物質は、抗生物質のアミカシン、ゲンタマイシン、イセパマイシン、カナマイシン、ネチルミシン、ストレプトマイシン及びトブラマイシンから選択されることが好ましい。
本発明の関して、アミノグリコシド系統に属する抗生物質は、アミカシンまたはカナマイシンであることが好ましい。
【００２１】
「生物学試料」なる用語は、気管支、気管又は肺吸引試料または胸膜液試料、気管支肺胞洗浄、喀痰、血液または肺生検、関節滑液または囲心腔液からの臨床試料；体液又は任意の種類の食物に由来する食物試料を意味することを目的とする。従って、この試料は液体であっても固体であってもよく、非限定的に、血液、血漿、尿または糞便由来の臨床試料、または鼻から、会陰部から、のどから、皮膚から、損傷から、または脳脊髄液から得られた試料、または食物試料を挙げることができる。
【００２２】
「試料」なる用語は、従って、標本自体（ぬぐい液、大便、食物など）及び前記試料から生じた微生物のコロニー（例えば、ゲル化された培養培地に分離後、または前記標本を接種した濃縮ブロス）の両方を意味することを目的とする。
【００２３】
これに関して、本発明は、発色性基質、セファロスポリン系統に属する第１抗生物質及びアミノグリコシド系統に属する第２抗生物質を含む、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を検出および／または同定するための反応培地に関する。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記第１抗生物質は、セフミノクスまたはセフジニルである。好ましくは、セフミノクス濃度は、１０から３５ｍｇ／ｌであり、好ましくは１２から２８ｍｇ／ｌである。好ましくは、セフジニル濃度は、０．１から１ｍｇ／ｌであり、好ましくは０．２から０．６ｍｇ／ｌである。
【００２４】
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記第２抗生物質は、カナマイシンまたはアミカシンである。
好ましくは、カナマイシン濃度は、０．２から１．５ｍｇ／ｌであり、好ましくは０．５から１．２５ｍｇ／ｌである。好ましくは、アミカシン濃度は０．５から５ｍｇ／ｌであり、好ましくは１から２ｍｇ／ｌである。
本発明の好ましい一実施形態によれば、２つの抗生物質の組合せは、セフミノクスとカナマイシンを含む。
別の本発明の好ましい実施例によれば、２つの抗生物質の組合せは、セフミノクスとアミカシンを含む。
別の本発明の好ましい実施例によれば、２つの抗生物質の組合せは、セフジニルとカナマイシンを含む。
別の本発明の好ましい実施例によれば、２つの抗生物質の組合せは、セフジニルとアミカシンを含む。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記発色性基質は、オシダーゼ、エステラーゼまたはペプチダーゼ活性の検出を可能にする。
【００２５】
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記オシダーゼ活性は、α−グルコシダーゼ活性である。
適切なα−グルコシダーゼ活性のための前記基質はインドキシル−α−グルコシドであることが好ましい。使用する基質は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−グルコシド（Ｘ−α−グルコシド）または５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−メチル−α−グルコシド（グリーンＡ−α−グルコシド）であることが望ましい。好ましくは、この基質は、０．０１から０．２ｇ／ｌ、好ましくは０．０３から０．１５ｇ／ｌの濃度で培地に存在する。実際には、この基質濃度において、より良好な呈色コントラストが得られる。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記エステラーゼ活性はホスファターゼ活性である。使用する基質は６−クロル−３−インドキシル・ホスフェート（ピンク−ホスフェート）であることが望ましい。好ましくは、この基質は、０．０５から０．５ｇ／ｌの濃度、好ましくは０．１から０．４ｇ／ｌの濃度で培地に存在する。実際には、この基質濃度において、より良好な呈色コントラストが得られる。
本発明のある特定の実施態様によれば、前記反応培地も第２酵素基質を含む。前記第２基質はα−グルコシダーゼ基質であることが望ましい。好ましくは、前記第１基質はα−グルコシダーゼ基質、好ましくは、Ｘ−α−グルコシド（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−グルコシド）であり、前記第２基質はα−グルコシダーゼ基質、好ましくグリーンＡ−α−グルコシド（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−メチル−α−グルコシド）である。
【００２６】
本発明の好ましい一実施形態によれば、更に培地は、黄色ブドウ球菌細菌の増殖を助ける少なくとも一つのインヒビター、例えば塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、コリスチン、アンホテリシン、アズトレオナム、ポリミキシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びデスフェリオキサミンを含む。
本発明の好ましい一実施形態によれば、更に培地は、黄色ブドウ球菌細菌の増殖を助ける４つのインヒビターを含んでなるインヒビター混合物を含み、前記インヒビターはＬｉＣｌ、ビブリオ菌増殖阻害化合物Ｏ／１２９、アズトレオナムとアンホテリシンである。
本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を分離して同定するために、上記の反応培地のインビトロ使用にも関する。
本発明は、生物試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を検出および／または同定する方法であって、
ａ）上記の反応培地上にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を含む可能性がある生物試料を接種をすること；
ｂ）インキュベートすること；
ｃ）コロニーをＭＲＳＡコロニーと同定することを含む方法にも関する。
【００２７】
インキュベーションは、３０℃から４２℃の温度で実施することが好ましい。ＭＲＳＡは、着色しているか又は蛍光性のコロニーを得ることを可能にする１または２のα−グルコシダーゼ活性またはホスファターゼ活性により検出されることが好ましい。ブドウ球菌の他の種は、無色に見えるか又は黄色ブドウ球菌とは異なる色または蛍光を有する。
工程ａ）が、選択培地又は非選択培地における前濃縮の工程の後にあってもよい。
【００２８】
本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を検出および／または同定するための反応培地であって、酵素又は代謝活性のための基質、セフジニル又はセフミノクスから選択される第１抗生物質、アミノグリコシド系統に属する第２抗生物質を含む培地にも関する。
好ましくは、セフミノクス濃度は１０から３５ｍｇ／ｌであり、好ましくは１２から２８ｍｇ／ｌである。好ましくは、セフジニル濃度は０．１から１ｍｇ／ｌであり、好ましくは０．２から０．６ｍｇ／ｌである。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記第２抗生物質はカナマイシンまたはアミカシンである。
好ましくは、カナマイシン濃度は０．２から１．５ｍｇ／ｌであり、好ましくは０．５から１．２５ｍｇ／ｌである。好ましくは、アミカシン濃度は０．５から５ｍｇ／ｌであり、好ましくは１から２ｍｇ／ｌである。
本発明の好ましい実施形態によれば、２つの抗生物質の組合せはセフミノクスとカナマイシンを含む。
別の本発明の好ましい実施例によれば、２つの抗生物質の組合せはセフミノクスとアミカシンを含む。
別の本発明の好ましい実施例によれば、２つの抗生物質の組合せは、セフジニルとカナマイシンを含む。
別の本発明の好ましい実施例によれば、２つの抗生物質の組合せは、セフジニルとアミカシンを含む。
【００２９】
本発明の好ましい一実施形態によれば、酵素又は代謝活性のための前記基質は、オシダーゼ、エステラーゼまたはペプチダーゼ活性の検出を可能にする。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記オシダーゼ活性はα−グルコシダーゼ活性である。
α−グルコシダーゼ活性のための前記基質はインドキシル−α−グルコシドであることが好ましい。使用する基質は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−グルコシド（Ｘ−α−グルコシド）または５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−メチル−α−グルコシド（グリーンＡ−α−グルコシド）であることが好ましい。好ましくは、この基質は０．０１から０．２ｇ／ｌ、好ましくは０．０３から０．１５ｇ／ｌの濃度で培地に存在する。実際には、この基質濃度において、より良好な呈色コントラストが得られる。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記エステラーゼ活性はホスファターゼ活性である。使用する基質は、６−クロロ−３−インドキシル・ホスフェート（ピンク-ホスフェート）であることが望ましい。好ましくは、この基質は、０．０５から０．５ｇ／ｌ、好ましくは０．１から０．４ｇ／ｌの濃度で培地に存在する。実際には、この基質濃度において、より良好な呈色コントラストが得られる。
【００３０】
本発明のある特定の実施態様によれば、前記反応培地も第２酵素基質を含む。前記第２基質はα−グルコシダーゼ基質であることが好ましい。好ましくは、前記第１基質はα−グルコシダーゼ基質、好ましくは、Ｘ−α−グルコシド（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−グルコシド）であり、前記第２基質はα−グルコシダーゼ基質、好ましくグリーンＡ−α−グルコシド（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−メチル−α−グルコシド）である。
【００３１】
本発明の好ましい一実施形態によれば、更に培地は、黄色ブドウ球菌細菌の増殖を助ける少なくとも一つのインヒビター、例えば塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、コリスチン、アンホテリシン、アズトレオナム、ポリミキシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びデスフェリオキサミンを含む。
【００３２】
本発明の好ましい一実施形態によれば、更に培地は、黄色ブドウ球菌細菌の増殖を助ける４つのインヒビターを含んでなるインヒビター混合物を含み、前記インヒビターはＬｉＣｌ、ビブリオ菌増殖阻害化合物Ｏ／１２９、アズトレオナムとアンホテリシンである。
本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を分離して同定するために、上記の反応培地のインビトロ使用にも関する。
【００３３】
本発明は、更に生物試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を検出および／または同定する方法であって、
ａ）上記の反応培地上に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を含む可能性がある生物試料を接種をすること；
ｂ）インキュベートすること；
ｃ）コロニーをＭＲＳＡコロニーと同定することを含む方法に関する。
【００３４】
インキュベーションは、３０℃から４２℃の温度で実施することが好ましい。
ＭＲＳＡは、着色しているか又は蛍光性のコロニーを得ることを可能にする１または２のα−グルコシダーゼ活性またはホスファターゼ活性を介して検出されることが好ましい。ブドウ球菌の他の種は、無色に見えるか又は黄色ブドウ球菌とは異なる色または蛍光を有する。工程ａ）が、選択培地又は非選択培地における濃縮前の工程の後にあってもよい。
下記の実施例は、説明として提供されるものであって、事実上限定するものではない。本発明を、より明らかに理解することを可能にするものである。
【実施例】
【００３５】
実施例１：セフミノクス−カナマイシン抗生物質の組合せとさまざまな発色性基質を含むＭＲＳＡ培地
１．本発明の培地の調製
実験において試験される培地は、以下である：
培地Ｔ：ｃｈｒｏｍＩＤ ＭＲＳＡ対照培地（ref.43 451）。
培地Ａ：セホキシチンが、セフミノクス（Daewoo Chemical, A8060902；１６ｍｇ／ｌ）／カナマイシン（シグマ、ref.K4000；１ｍｇ／ｌ）抗生物質の組合せ、ピンク・ホスフェートである発色性基質（Biosynth, ref.C 5100；０．２５ｇ／ｌ）によって置換された培地Ｔ。
培地Ｂ：セホキシチンが、セフミノクス（１６ｍｇ／ｌ）／カナマイシン（０．７５ｍｇ／ｌ）抗生物質の組合せ、発色性基質Ｘ−α−グルコシド（Biosynth、B7230；０．０４５ｇ／ｌ）及びグリーンＡ−α−グルコシド（Inalco、ref.1758-0730）によって置換されている培地Ｔ。
培地Ｃ：セホキシチンが、セフミノクス（１６ｍｇ／ｌ）／カナマイシン（０．７５ｍｇ／ｌ）抗生物質の組合せ、発色性基質Ｘ−α−グルコシドである（Biosynth、B7230；０．０４５ｇ／ｌ）及びグリーンＡ−α−グルコシド（Inalco、ref.1758-0730、０．０８ｇ／ｌ）によって置換されている培地Ｔ。
２．接種と培地の読み取り
黄色ブドウ球菌細菌のさまざまなメチシリン耐性株（ＭＲＳＡ）又はメチシリン感受性株（ＭＳＳＡ）、及びコアグラーゼ陰性ブドウ球菌菌株（ＣｏＮＳ）（全て出願人の収集に由来するものである）は生理食塩水に懸濁し、それから４クワトラント線条接種技術により培地に接種した。シャーレは３７℃で２４時間インキュベートされた。形成されたコロニーは、１８時間と２４時間のインキュベーション後に、視覚的に調べられた。
３．結果：
得られた結果は、表１に示す。
これらの結果は、本発明の培地の優れた感受性を示す。特に、培地Ａは、全てのＭＲＳＡを検出することを可能にする。
【００３６】
実施例２−セフミノクス及びカナマイシンをさまざまな濃度で含むＭＲＳＡ培地
１．本発明の培地の調製
実験において試験される培地は、以下である：
培地Ｔ：ｃｈｒｏｍＩＤ ＭＲＳＡ 対照培地（ｒｅｆ．４３ ４５１）。
培地Ｄ：セホキシチンが、セフミノクス（実施例１で使用したものと同じ抗生物質）／カナマイシン（実施例１で使用したものと同じ抗生物質）の組合せ（様々な濃度で）、Ｘ−α−グルコシドである発色性基質（実施例１で使用したものと同じ基質；０．０４５ｇ／ｌ）とグリーンＡ−α−グルコシド（実施例１で使用したものと同じ基質；０．０８ｇ／ｌ）により置換された培地Ｔ。
２．接種と培地の読取り
この工程は、実施例１のとおりに実施された。
得られた結果は、下記の表２に示される。
これらの結果は濃度１６ｍｇ／ｌのセフミノクス及び濃度０．７５ｍｇ／ｌのカナマイシンにより、優れた特異性と感受性を得ることが可能であることを示す。
【００３７】
実施例３−セフミノクス−アミカシン抗生物質の組合せ及びさまざまな発色性基質を含むＭＲＳＡ培地
１．本発明の培地の調製
実験において試験される培地は、以下である：
培地Ｔ：ｃｈｒｏｍＩＤ ＭＲＳＡ 対照培地（ｒｅｆ．４３ ４５１）。
培地Ｅ：セホキシチンが、セフミノクス（実施例１で使用したものと同じ抗生物質；１６ｍｇ／ｌ）／アミカシン（シグマ、ｒｅｆ．２３２４； ２ｍｇ／ｌ）抗生物質の組合せ、ピンク−ホスフェートである発色性基質（Biosynth、C-5100;０．２５ｇ／ｌ）によって置換されている培地Ｔ。
培地Ｆ：セホキシチンが、セフミノクス（１６ｍｇ／ｌ）／アミカシン（２．５ｍｇ／ｌ）抗生物質の組合せ、Ｘ−α−グルコシドである発色性基質（実施例１で使用したものと同じ基質；０．０４５ ｇ／ｌ）及びグリーンＡ−α−グルコシド（実施例１で使用したものと同じ基質；０．０８ｇ／ｌ）によって置換されている培地Ｔ。
２．接種と培地の読み取り
この工程は、実施例３のとおりに実施された。
３．結果：
得られた結果は、下記の表３に示される。
これらの結果は、使用する基質にかかわりなく、本発明の抗生物質の組合せにより優れた感受性を得ることが可能であることを示す。
【００３８】
実施例４−セフジニルとアミカシンを含むＭＲＳＡ培地
１．本発明の培地の調製
実験において試験される培地は、以下である：
培地Ｔ：ｃｈｒｏｍＩＤ ＭＲＳＡ 対照培地（ｒｅｆ．４３ ４５１）。
培地Ｇ：セホキシチンが、セフジニル（ＣＤＲ０８０６００７）／アミカシン（実施例３で使用されたものと同じ抗生物質）の様々な濃度の組合せ、ピンク−ホスフェートである発色性基質（それと同一の基質は、実施例３において使用した基質；０．２５ｇ／ｌ）により置換されている、培地Ｔ。
培地Ｈ：セホキシチンが、様々な濃度のセフジニル／アミカシン組合せ、Ｘ−α−グルコシドである発色性基質（実施例１で使用したものと同じ基質；０．０４５ｇ／ｌ）及びグリーンＡ−α−グルコシド（実施例１で使用したものと同じ基質；０．０８ｇ／ｌ）によって置換されている培地Ｔ。
２．接種と培地の読取り
この工程は、実施例１のとおりに実施された。
３．結果：得られた結果は、下記の表４に示される。
これらの結果は、使用する濃度にかかわりなく、本発明のセフジニル／アミカシン抗生物質の組合せにより、優れた感受性と特異性を得ることが可能であることを示す。
【００３９】
実施例５−本発明のＭＲＳＡ培地における臨床検査材料の分析
１．本発明の培地の調製
実験において試験される培地は、以下である：
培地Ｔ：ｃｈｒｏｍＩＤ ＭＲＳＡ 対照培地（ｒｅｆ．４３ ４５１）。
バッチ１：０．０８ｇ／ｌのグリーンＡ−α−Ｇｌｕ＋０．０４５ｇ／ｌのＸ−α−Ｇｌｕ（１６ｍｇ／ｌのセフミノクス＋０．７５ｍｇ／ｌのカナマイシン）。
バッチ２：０．０８ｇ／ｌのグリーンＡ−α−Ｇｌｕ＋０．０４５ｇ／ｌのＸ−α−Ｇｌｕ、０．３ｍｇ／ｌのセフジニル＋ ２ｍｇ／ｌのアミカシン。
バッチ３：０．２５ｇ／ｌのピンク−ホスフェート、１６ｍｇ／ｌのセフミノクス＋２ｍｇ／ｌのアミカシン。
バッチ４：０．２５ｇ／ｌのピンク−ホスフェート、０．３ｍｇ／ｌのセフジニル＋２ｍｇ／ｌのアミカシン。
使用する基質と抗生物質は、前の実施例において使用するものと同じものであった。
２．接種と培地の読み取り
２つの研究を、様々な臨床検査材料（鼻、のど、会陰部、傷）を使用して平行して行った。それらは、生理食塩水に懸濁し、それから培地上で分離したコロニーを得るために、４クワトラント線条接種技術により培地に接種した。シャーレは３７℃で２４時間インキュベートされた。形成されたコロニーは、１８時間と２４時間のインキュベーション後に、視覚的に調べられた。
３．結果：
得られた結果は、下記の表に示す。
これらの結果は、本発明の抗生物質の組合せが、１８時間以降から優れた検出感度を呈したことを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を検出するための反応培地に関する。本発明は、この培地の使用とＭＲＳＡ細菌を同定する方法に関する。
【０００２】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、抗生物質メチシリン及びオキサシリンのような抗生物質に対する耐性によって特徴づけられる黄色ブドウ球菌の菌株である。ＭＲＳＡ細菌は、院内感染の高いパーセンテージを示し、しばしば深刻で潜在的に致命的な健康問題の原因となる。最も一般には医療スタッフを経て患者間で相互感染し、ＭＲＳＡは制御が非常に困難な固有の感染症の原因となる。適切な治療に加えて、ＭＲＳＡ保菌者と入ってくる患者の分離のためのスクリーニングは、公的組織（例えば米国医療疫学学会）によって現在推奨されている最も有効な方法で構成される。従って、初期の組織的スクリーニングは不可欠である。
【０００３】
ＭＲＳＡはさまざまな技術によって検出することができる。例えば分子生物学技術によってＭＲＳＡを検出することが可能である。これに関して、欧州出願ＥＰ８８７４２４を挙げることができる。しかしながら、上記の方法はルーチンテストとしては高価なままであり、有資格のスタッフを必要とする。
【０００４】
また、黄色ブドウ球菌を検出するために従来の培養培地（例えば欧州出願ＥＰ１３９０５２４に記載されている培地）を使用することができる。ＭＲＳＡの検出は、特異的な凝集検査（Ｓｌｉｄｅｘ ＭＲＳＡ、ビオメリュー）によって、又はオキサシリン、セホキシチンまたはモキサラクタム・ディスクの存在下で寒天内拡散法によって、追加の工程で実施される(Antibiogram Committee of the French Society for Microbiology及び臨床検査標準協会の推奨）。
【０００５】
また、抗生物質を含む寒天培地上で培養できる細菌はＭＲＳＡである場合がある。また、上記の培地は発色性であってもよく、それによりＭＲＳＡの読み取りと検出を容易にする。特に欧州出願ＥＰ１５４３１４７に記載されている培地を挙げることができる。しかしながら、記載されている条件でのホスファターゼ活性の検出はあまり特異的でないので、それを複数の他の酵素の活性の検出と組合わせる必要があり、それによって培地の繁殖性が減少し、そのコストが増大する。
【０００６】
本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の分離及び迅速な同定を可能にする新規の感受性の高い、特異的な反応培地を提供することによって従来技術の隙間を埋めることを提案する。
【０００７】
驚くべきことに、本願発明者は、セファロスポリンとアミノグリコシドを含む抗生物質の特定の組合せの使用は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を分離して同定するための優れた反応培地を得ることを可能にすることを証明した。
【０００８】
更に続ける前に、以下に示す定義は、より明確に本発明を理解することを可能にするものであり、限定するものではない。
本発明のために、「反応培地」なる用語は、微生物（例えば黄色ブドウ球菌）の生存及び／又は増殖のために必要な成分の全てを含む培地を意味することを目的とする。この反応培地は、検出（revealing）培地のみとしても、あるいは培養且つ検出培地としても用いられる。前者の場合は、微生物は接種前に培養され、後者の場合は反応培地は更に培養培地を構成する。
【０００９】
反応培地は、固体、半固体又は液体であってもよい。「固形培地」なる用語は、例えば、ゲル化培地を意味することを目的とする。好ましくは、本発明の培地はゲル化培地である。寒天は微生物を培養するための微生物学の従来のゲル化剤であるが、ゲルライト、ゼラチンまたはアガロースを使用することも可能である。一定数の製品が市販されており、コロンビア寒天、トリプチカーゼ大豆寒天、マッコンキー寒天、チャップマン寒天、サブロー寒天またはさらに一般的にはthe Handbook of Microbiological Media(CRC Press)に記載されているものである。
【００１０】
本発明による反応培地は、その他の可能な添加物、例えばペプトン、一つ以上の増殖因子、糖質、一つ以上の選択剤、緩衝液、一つ以上のゲル化剤等を含んでもよい。この反応培地は、すぐに使用できる液体またはゲルの形態、すなわちチューブ中またはフラスコ中にまたはシャーレ上において接種する準備ができているものであってもよい。提供される形態がフラスコ中のゲル形態である場合、培地の事前の再生はシャーレに注入される前に（１００℃に変化させる）実施することが好ましい。
【００１１】
好ましくは、本発明の培地は、選択培地、すなわち黄色ブドウ球菌細菌の増殖を助けるインヒビターを含んでなる培地である。特に塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、コリスチン、アンフォテリシン、アズトレオナム、コリマイシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、デフェロキサミン及びビブリオ菌増殖阻害化合物Ｏ／１２９を挙げることができる。
本発明では、酵素又は代謝活性用の基質は、酵素活性または代謝（例えば、特にオシダーゼ活性、好ましくはα−グルクロニダーゼ、グルコシダーゼ、またはガラクトシダーゼ活性）の直接的または間接的な検出を可能にする生成物に加水分解されることができる任意の基質から選択される。
【００１２】
それは天然基質でも合成基質であってもよい。基質の代謝によって、反応培地又は生物の細胞の生理化学的性質に変化が生じる。この変化は、物理化学的方法、特に光学的方法、オペーレーターの視覚により、または分光計、電気、磁気等の計測器を使用して検出することができる。それは、吸収、蛍光または発光の変化のような光学的性質の変異であることが望ましい。
【００１３】
本出願において、「色」なる用語は、可視スペクトルにおける光の吸収である色、又はある波長での吸収（λｅｘ）とより高い波長での放出である蛍光（λｅｍ、λｅｍ＞λｅｘ）をカバーするために使用される。
【００１４】
本発明のために、発色性基質なる用語は、酵素活性（例えば、特にオシダーゼ活性、好ましくはα−グルコシダーゼ活性、エステラーゼ活性、好ましくはホスファターゼ活性またはペプチダーゼ活性、好ましくはコアグラーゼ活性）の直接的または間接的な検出を可能にする生成物を与えるために加水分解されることができる任意の基質を意味することを目的とする。
特に、インドキシル、フラボン、アリザリン、アクリジン、フェノキサジン、ニトロフェノール、ニトロアニリン、ナフトール、カテコール、ヒドロキシキノリン、クマリンまたはヒドロキシフェニルキノザゾル−４−ワン（hydroxyphenylquinoxazol-4-one)に基づく基質を挙げることできる。好ましくは、本発明において使用する基質は、インドキシルに基づくものである。
【００１５】
α−グルコシダーゼ基質として、特に基質５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−α−グルコシド；ジヒドロキシフラボン−α−グルコシド；３，４−シクロヘキサノエスクレチン−α−グルコシド；８−ヒドロキシキノリン−α−グルコシド；５−ブロモ−４−クロル−３−インドキシル−α−グルコシド；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−メチル−α−グルコシド；６−クロロ−３−インドキシル−α−グルコシド；５−ブロモ−３−インドキシル−α−グルコシド；５−ヨウ化−３−インドキシル−α−グルコシド；６−フルオロ−３−インドキシル−α−グルコシド；アリザリン−α−グルコシド；ニトロフェニル−α−グルコシド；４−メチルウンベリフェリル−α−グルコシド；ナフトールベンゼイン−α−グルコシド；インドキシル−Ｎ−メチル−α−グルコシド；ナフチル−α−グルコシド；アミノフェニル−α−グルコシド；ジクロロアミノフェニル−α−グルコシドを挙げることができる。使用するα−グルコシダーゼ基質は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−メチル−α−グルコシドまたは５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−グルコシドであることが望ましい。
【００１６】
ホスファターゼ基質として、特に基質５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル・ホスフェート；３，４−シクロヘキサノエスクレチン・ホスフェート；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル・ホスフェート；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−メチル・ホスフェート；６−クロル−３−インドキシル・ホスフェート；５−ブロモ−３−インドキシル・ホスフェート；５−ヨード−３−インドキシル・ホスフェート； ６−フルオロ−３−インドキシル・ホスフェート；ニトロフェニル・ホスフェート；４−メチルウンベリフェリル・ホスフェート；インドキシル−Ｎ−メチル・ホスフェート；ナフチル・ホスフェート、ＥＬＦ９７−ホスフェートを挙げることができる。好ましくは、使用するホスファターゼ基質は６−クロロ−３インドキシル・ホスフェートであることが望ましい。
【００１７】
本発明において使用する基質は、オシダーゼ、エステラーゼ及び特にホスファターゼまたはホスホリパーゼ、ペプチダーゼ、及び特にコアグラーゼのような他の基質と組合せられてもよい。特に、培地は２−α−グルコシダーゼ基質を含んでもよい。
【００１８】
本発明の基質は、広いｐＨ範囲において、特にｐＨ５．５から１０、好ましくは６．５から９の間で使用することができる。
【００１９】
本発明のために、「セファロスポリン系統に属する抗生物質」は、好ましくは以下の抗生物質から選択される：
・第一世代のセファロスポリンは、例えば、セファレキシン、セファロリジン、セファロチン、セファゾリン、セファドロキシル、セファゼドン、セファトリジン、セファピリン、セフラジン、セファセトリル、セフロダキシン(cefrodaxine)、セフテゾールであり；
・第二世代のセファロスポリンは、例えば、セホキシチン、セフロキシム、セファマンドール、セファクロール、セフォテタン、セフォニシド、セホチアム、ロラカルベフ、セフメタゾール、セフプロジル、セホラニド、セフミノクスであり；
・第三世代のセファロスポリンは、例えば、セフォタキシム、セフタジジム、セフスロジン、セフトリアキソン、セフメノキシム、ラタモキセフ、セフチゾキシム、セフィキシム、セフォジジム、セフェタメト、セフピラミド、セホペラゾン、セフポドキシム、セフチブテン、セフジニル、セフジトレン、セフトリアキソン、セホペラゾン、セフブペラゾン、セフジニルであり；
・第四世代のセファロスポリンは、例えば、セフェピム、セフピロムである。
【００２０】
本発明の関して、セファロスポリン系統に属する抗生物質は、セフミノックスまたはセフジニルが好ましい。
本発明のために、アミノグリコシド系統に属する抗生物質は、抗生物質のアミカシン、ゲンタマイシン、イセパマイシン、カナマイシン、ネチルミシン、ストレプトマイシン及びトブラマイシンから選択されることが好ましい。
本発明の関して、アミノグリコシド系統に属する抗生物質は、アミカシンまたはカナマイシンであることが好ましい。
【００２１】
「生物学試料」なる用語は、気管支、気管又は肺吸引試料または胸膜液試料、気管支肺胞洗浄、喀痰、血液または肺生検、関節滑液または囲心腔液からの臨床試料；体液又は任意の種類の食物に由来する食物試料を意味することを目的とする。従って、この試料は液体であっても固体であってもよく、非限定的に、血液、血漿、尿または糞便由来の臨床試料、または鼻から、会陰部から、のどから、皮膚から、損傷から、または脳脊髄液から得られた試料、または食物試料を挙げることができる。
【００２２】
「試料」なる用語は、従って、標本自体（ぬぐい液、大便、食物など）及び前記試料から生じた微生物のコロニー（例えば、ゲル化された培養培地に分離後、または前記標本を接種した濃縮ブロス）の両方を意味することを目的とする。
【００２３】
これに関して、本発明は、発色性基質、セファロスポリン系統に属する第１抗生物質及びアミノグリコシド系統に属する第２抗生物質を含む、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を検出および／または同定するための反応培地に関する。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記第１抗生物質は、セフミノクスまたはセフジニルである。好ましくは、セフミノクス濃度は、１０から３５ｍｇ／ｌであり、好ましくは１２から２８ｍｇ／ｌである。好ましくは、セフジニル濃度は、０．１から１ｍｇ／ｌであり、好ましくは０．２から０．６ｍｇ／ｌである。
【００２４】
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記第２抗生物質は、カナマイシンまたはアミカシンである。
好ましくは、カナマイシン濃度は、０．２から１．５ｍｇ／ｌであり、好ましくは０．５から１．２５ｍｇ／ｌである。好ましくは、アミカシン濃度は０．５から５ｍｇ／ｌであり、好ましくは１から２ｍｇ／ｌである。
本発明の好ましい一実施形態によれば、２つの抗生物質の組合せは、セフミノクスとカナマイシンを含む。
別の本発明の好ましい実施例によれば、２つの抗生物質の組合せは、セフミノクスとアミカシンを含む。
別の本発明の好ましい実施例によれば、２つの抗生物質の組合せは、セフジニルとカナマイシンを含む。
別の本発明の好ましい実施例によれば、２つの抗生物質の組合せは、セフジニルとアミカシンを含む。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記発色性基質は、オシダーゼ、エステラーゼまたはペプチダーゼ活性の検出を可能にする。
【００２５】
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記オシダーゼ活性は、α−グルコシダーゼ活性である。
適切なα−グルコシダーゼ活性のための前記基質はインドキシル−α−グルコシドであることが好ましい。使用する基質は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−グルコシド（Ｘ−α−グルコシド）または５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−メチル−α−グルコシド（グリーンＡ−α−グルコシド）であることが望ましい。好ましくは、この基質は、０．０１から０．２ｇ／ｌ、好ましくは０．０３から０．１５ｇ／ｌの濃度で培地に存在する。実際には、この基質濃度において、より良好な呈色コントラストが得られる。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記エステラーゼ活性はホスファターゼ活性である。使用する基質は６−クロル−３−インドキシル・ホスフェート（ピンク−ホスフェート）であることが望ましい。好ましくは、この基質は、０．０５から０．５ｇ／ｌの濃度、好ましくは０．１から０．４ｇ／ｌの濃度で培地に存在する。実際には、この基質濃度において、より良好な呈色コントラストが得られる。
本発明のある特定の実施態様によれば、前記反応培地も第２酵素基質を含む。前記第２基質はα−グルコシダーゼ基質であることが望ましい。好ましくは、前記第１基質はα−グルコシダーゼ基質、好ましくは、Ｘ−α−グルコシド（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−グルコシド）であり、前記第２基質はα−グルコシダーゼ基質、好ましくグリーンＡ−α−グルコシド（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−メチル−α−グルコシド）である。
【００２６】
本発明の好ましい一実施形態によれば、更に培地は、黄色ブドウ球菌細菌の増殖を助ける少なくとも一つのインヒビター、例えば塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、コリスチン、アンホテリシン、アズトレオナム、ポリミキシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びデスフェリオキサミンを含む。
本発明の好ましい一実施形態によれば、更に培地は、黄色ブドウ球菌細菌の増殖を助ける４つのインヒビターを含んでなるインヒビター混合物を含み、前記インヒビターはＬｉＣｌ、ビブリオ菌増殖阻害化合物Ｏ／１２９、アズトレオナムとアンホテリシンである。
本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を分離して同定するために、上記の反応培地のインビトロ使用にも関する。
本発明は、生物試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を検出および／または同定する方法であって、
ａ）上記の反応培地上にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を含む可能性がある生物試料を接種をすること；
ｂ）インキュベートすること；
ｃ）コロニーをＭＲＳＡコロニーと同定することを含む方法にも関する。
【００２７】
インキュベーションは、３０℃から４２℃の温度で実施することが好ましい。ＭＲＳＡは、着色しているか又は蛍光性のコロニーを得ることを可能にする１または２のα−グルコシダーゼ活性またはホスファターゼ活性により検出されることが好ましい。ブドウ球菌の他の種は、無色に見えるか又は黄色ブドウ球菌とは異なる色または蛍光を有する。
工程ａ）が、選択培地又は非選択培地における前濃縮の工程の後にあってもよい。
【００２８】
本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を検出および／または同定するための反応培地であって、酵素又は代謝活性のための基質、セフジニル又はセフミノクスから選択される第１抗生物質、アミノグリコシド系統に属する第２抗生物質を含む培地にも関する。
好ましくは、セフミノクス濃度は１０から３５ｍｇ／ｌであり、好ましくは１２から２８ｍｇ／ｌである。好ましくは、セフジニル濃度は０．１から１ｍｇ／ｌであり、好ましくは０．２から０．６ｍｇ／ｌである。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記第２抗生物質はカナマイシンまたはアミカシンである。
好ましくは、カナマイシン濃度は０．２から１．５ｍｇ／ｌであり、好ましくは０．５から１．２５ｍｇ／ｌである。好ましくは、アミカシン濃度は０．５から５ｍｇ／ｌであり、好ましくは１から２ｍｇ／ｌである。
本発明の好ましい実施形態によれば、２つの抗生物質の組合せはセフミノクスとカナマイシンを含む。
別の本発明の好ましい実施例によれば、２つの抗生物質の組合せはセフミノクスとアミカシンを含む。
別の本発明の好ましい実施例によれば、２つの抗生物質の組合せは、セフジニルとカナマイシンを含む。
別の本発明の好ましい実施例によれば、２つの抗生物質の組合せは、セフジニルとアミカシンを含む。
【００２９】
本発明の好ましい一実施形態によれば、酵素又は代謝活性のための前記基質は、オシダーゼ、エステラーゼまたはペプチダーゼ活性の検出を可能にする。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記オシダーゼ活性はα−グルコシダーゼ活性である。
α−グルコシダーゼ活性のための前記基質はインドキシル−α−グルコシドであることが好ましい。使用する基質は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−グルコシド（Ｘ−α−グルコシド）または５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−メチル−α−グルコシド（グリーンＡ−α−グルコシド）であることが好ましい。好ましくは、この基質は０．０１から０．２ｇ／ｌ、好ましくは０．０３から０．１５ｇ／ｌの濃度で培地に存在する。実際には、この基質濃度において、より良好な呈色コントラストが得られる。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記エステラーゼ活性はホスファターゼ活性である。使用する基質は、６−クロロ−３−インドキシル・ホスフェート（ピンク-ホスフェート）であることが望ましい。好ましくは、この基質は、０．０５から０．５ｇ／ｌ、好ましくは０．１から０．４ｇ／ｌの濃度で培地に存在する。実際には、この基質濃度において、より良好な呈色コントラストが得られる。
【００３０】
本発明のある特定の実施態様によれば、前記反応培地も第２酵素基質を含む。前記第２基質はα−グルコシダーゼ基質であることが好ましい。好ましくは、前記第１基質はα−グルコシダーゼ基質、好ましくは、Ｘ−α−グルコシド（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−グルコシド）であり、前記第２基質はα−グルコシダーゼ基質、好ましくグリーンＡ−α−グルコシド（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−メチル−α−グルコシド）である。
【００３１】
本発明の好ましい一実施形態によれば、更に培地は、黄色ブドウ球菌細菌の増殖を助ける少なくとも一つのインヒビター、例えば塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、コリスチン、アンホテリシン、アズトレオナム、ポリミキシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びデスフェリオキサミンを含む。
【００３２】
本発明の好ましい一実施形態によれば、更に培地は、黄色ブドウ球菌細菌の増殖を助ける４つのインヒビターを含んでなるインヒビター混合物を含み、前記インヒビターはＬｉＣｌ、ビブリオ菌増殖阻害化合物Ｏ／１２９、アズトレオナムとアンホテリシンである。
本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を分離して同定するために、上記の反応培地のインビトロ使用にも関する。
【００３３】
本発明は、更に生物試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を検出および／または同定する方法であって、
ａ）上記の反応培地上に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を含む可能性がある生物試料を接種をすること；
ｂ）インキュベートすること；
ｃ）コロニーをＭＲＳＡコロニーと同定することを含む方法に関する。
【００３４】
インキュベーションは、３０℃から４２℃の温度で実施することが好ましい。
ＭＲＳＡは、着色しているか又は蛍光性のコロニーを得ることを可能にする１または２のα−グルコシダーゼ活性またはホスファターゼ活性を介して検出されることが好ましい。ブドウ球菌の他の種は、無色に見えるか又は黄色ブドウ球菌とは異なる色または蛍光を有する。工程ａ）が、選択培地又は非選択培地における濃縮前の工程の後にあってもよい。
下記の実施例は、説明として提供されるものであって、事実上限定するものではない。本発明を、より明らかに理解することを可能にするものである。
【実施例】
【００３５】
実施例１：セフミノクス−カナマイシン抗生物質の組合せとさまざまな発色性基質を含むＭＲＳＡ培地
１．本発明の培地の調製
実験において試験される培地は、以下である：
培地Ｔ：ｃｈｒｏｍＩＤ ＭＲＳＡ対照培地（ref.43 451）。
培地Ａ：セホキシチンが、セフミノクス（Daewoo Chemical, A8060902；１６ｍｇ／ｌ）／カナマイシン（シグマ、ref.K4000；１ｍｇ／ｌ）抗生物質の組合せ、ピンク・ホスフェートである発色性基質（Biosynth, ref.C 5100；０．２５ｇ／ｌ）によって置換された培地Ｔ。
培地Ｂ：セホキシチンが、セフミノクス（１６ｍｇ／ｌ）／カナマイシン（０．７５ｍｇ／ｌ）抗生物質の組合せ、発色性基質Ｘ−α−グルコシド（Biosynth、B7230；０．０４５ｇ／ｌ）及びグリーンＡ−α−グルコシド（Inalco、ref.1758-0730）によって置換されている培地Ｔ。
培地Ｃ：セホキシチンが、セフミノクス（１６ｍｇ／ｌ）／カナマイシン（０．７５ｍｇ／ｌ）抗生物質の組合せ、発色性基質Ｘ−α−グルコシドである（Biosynth、B7230；０．０４５ｇ／ｌ）及びグリーンＡ−α−グルコシド（Inalco、ref.1758-0730、０．０８ｇ／ｌ）によって置換されている培地Ｔ。
２．接種と培地の読み取り
黄色ブドウ球菌細菌のさまざまなメチシリン耐性株（ＭＲＳＡ）又はメチシリン感受性株（ＭＳＳＡ）、及びコアグラーゼ陰性ブドウ球菌菌株（ＣｏＮＳ）（全て出願人の収集に由来するものである）は生理食塩水に懸濁し、それから４クワトラント線条接種技術により培地に接種した。シャーレは３７℃で２４時間インキュベートされた。形成されたコロニーは、１８時間と２４時間のインキュベーション後に、視覚的に調べられた。
３．結果：
得られた結果は、表１に示す。
これらの結果は、本発明の培地の優れた感受性を示す。特に、培地Ａは、全てのＭＲＳＡを検出することを可能にする。
【００３６】
実施例２−セフミノクス及びカナマイシンをさまざまな濃度で含むＭＲＳＡ培地
１．本発明の培地の調製
実験において試験される培地は、以下である：
培地Ｔ：ｃｈｒｏｍＩＤ ＭＲＳＡ 対照培地（ｒｅｆ．４３ ４５１）。
培地Ｄ：セホキシチンが、セフミノクス（実施例１で使用したものと同じ抗生物質）／カナマイシン（実施例１で使用したものと同じ抗生物質）の組合せ（様々な濃度で）、Ｘ−α−グルコシドである発色性基質（実施例１で使用したものと同じ基質；０．０４５ｇ／ｌ）とグリーンＡ−α−グルコシド（実施例１で使用したものと同じ基質；０．０８ｇ／ｌ）により置換された培地Ｔ。
２．接種と培地の読取り
この工程は、実施例１のとおりに実施された。
得られた結果は、下記の表２に示される。
これらの結果は濃度１６ｍｇ／ｌのセフミノクス及び濃度０．７５ｍｇ／ｌのカナマイシンにより、優れた特異性と感受性を得ることが可能であることを示す。
【００３７】
実施例３−セフミノクス−アミカシン抗生物質の組合せ及びさまざまな発色性基質を含むＭＲＳＡ培地
１．本発明の培地の調製
実験において試験される培地は、以下である：
培地Ｔ：ｃｈｒｏｍＩＤ ＭＲＳＡ 対照培地（ｒｅｆ．４３ ４５１）。
培地Ｅ：セホキシチンが、セフミノクス（実施例１で使用したものと同じ抗生物質；１６ｍｇ／ｌ）／アミカシン（シグマ、ｒｅｆ．２３２４； ２ｍｇ／ｌ）抗生物質の組合せ、ピンク−ホスフェートである発色性基質（Biosynth、C-5100;０．２５ｇ／ｌ）によって置換されている培地Ｔ。
培地Ｆ：セホキシチンが、セフミノクス（１６ｍｇ／ｌ）／アミカシン（２．５ｍｇ／ｌ）抗生物質の組合せ、Ｘ−α−グルコシドである発色性基質（実施例１で使用したものと同じ基質；０．０４５ ｇ／ｌ）及びグリーンＡ−α−グルコシド（実施例１で使用したものと同じ基質；０．０８ｇ／ｌ）によって置換されている培地Ｔ。
２．接種と培地の読み取り
この工程は、実施例３のとおりに実施された。
３．結果：
得られた結果は、下記の表３に示される。
これらの結果は、使用する基質にかかわりなく、本発明の抗生物質の組合せにより優れた感受性を得ることが可能であることを示す。
【００３８】
実施例４−セフジニルとアミカシンを含むＭＲＳＡ培地
１．本発明の培地の調製
実験において試験される培地は、以下である：
培地Ｔ：ｃｈｒｏｍＩＤ ＭＲＳＡ 対照培地（ｒｅｆ．４３ ４５１）。
培地Ｇ：セホキシチンが、セフジニル（ＣＤＲ０８０６００７）／アミカシン（実施例３で使用されたものと同じ抗生物質）の様々な濃度の組合せ、ピンク−ホスフェートである発色性基質（それと同一の基質は、実施例３において使用した基質；０．２５ｇ／ｌ）により置換されている、培地Ｔ。
培地Ｈ：セホキシチンが、様々な濃度のセフジニル／アミカシン組合せ、Ｘ−α−グルコシドである発色性基質（実施例１で使用したものと同じ基質；０．０４５ｇ／ｌ）及びグリーンＡ−α−グルコシド（実施例１で使用したものと同じ基質；０．０８ｇ／ｌ）によって置換されている培地Ｔ。
２．接種と培地の読取り
この工程は、実施例１のとおりに実施された。
３．結果：得られた結果は、下記の表４に示される。
これらの結果は、使用する濃度にかかわりなく、本発明のセフジニル／アミカシン抗生物質の組合せにより、優れた感受性と特異性を得ることが可能であることを示す。
【００３９】
実施例５−本発明のＭＲＳＡ培地における臨床検査材料の分析
１．本発明の培地の調製
実験において試験される培地は、以下である：
培地Ｔ：ｃｈｒｏｍＩＤ ＭＲＳＡ 対照培地（ｒｅｆ．４３ ４５１）。
バッチ１：０．０８ｇ／ｌのグリーンＡ−α−Ｇｌｕ＋０．０４５ｇ／ｌのＸ−α−Ｇｌｕ（１６ｍｇ／ｌのセフミノクス＋０．７５ｍｇ／ｌのカナマイシン）。
バッチ２：０．０８ｇ／ｌのグリーンＡ−α−Ｇｌｕ＋０．０４５ｇ／ｌのＸ−α−Ｇｌｕ、０．３ｍｇ／ｌのセフジニル＋ ２ｍｇ／ｌのアミカシン。
バッチ３：０．２５ｇ／ｌのピンク−ホスフェート、１６ｍｇ／ｌのセフミノクス＋２ｍｇ／ｌのアミカシン。
バッチ４：０．２５ｇ／ｌのピンク−ホスフェート、０．３ｍｇ／ｌのセフジニル＋２ｍｇ／ｌのアミカシン。
使用する基質と抗生物質は、前の実施例において使用するものと同じものであった。
２．接種と培地の読み取り
２つの研究を、様々な臨床検査材料（鼻、のど、会陰部、傷）を使用して平行して行った。それらは、生理食塩水に懸濁し、それから培地上で分離したコロニーを得るために、４クワトラント線条接種技術により培地に接種した。シャーレは３７℃で２４時間インキュベートされた。形成されたコロニーは、１８時間と２４時間のインキュベーション後に、視覚的に調べられた。
３．結果：
得られた結果は、下記の表に示す。
これらの結果は、本発明の抗生物質の組合せが、１８時間以降から優れた検出感度を呈したことを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を検出および／または同定するために反応培地であって、発色性基質、セファロスポリン系統に属する第１抗生物質、及びアミノグリコシド系統に属する第２抗生物質を含んでなる培地。
【請求項２】
前記第１抗生物質がセフミノクスまたはセフジニルである、請求項１に記載の反応培地。
【請求項３】
前記第２抗生物質がカナマイシンまたはアミカシンである、請求項１又は２に記載の反応培地。
【請求項４】
前記発色性基質がオシダーゼ、エステラーゼまたはペプチダーゼ活性の検出を可能にする、請求項１から３の何れか一項に記載の反応培地。
【請求項５】
前記オシダーゼ活性がα−グルコシダーゼ活性である、請求項４に記載の反応培地。
【請求項６】
前記エステラーゼ活性がホスファターゼ活性である、請求項５に記載の反応培地。
【請求項７】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を分離して同定するための請求項１から６の何れか一項に記載の反応培地のインビトロ使用。
【請求項８】
生物試料のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を検出および／または同定するための方法であって、
ａ）請求項１から６の何れか一項に記載の反応培地にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を含む可能性がある生物試料に接種すること；
ｂ）インキュベーションすること；
ｃ）コロニーをＭＲＳＡコロニーとして同定することを含む方法。
【請求項１】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を検出および／または同定するために反応培地であって、発色性基質、セファロスポリン系統に属する第１抗生物質、及びアミノグリコシド系統に属する第２抗生物質を含んでなる培地。
【請求項２】
前記第１抗生物質がセフミノクスまたはセフジニルである、請求項１に記載の反応培地。
【請求項３】
前記第２抗生物質がカナマイシンまたはアミカシンである、請求項１又は２に記載の反応培地。
【請求項４】
前記発色性基質がオシダーゼ、エステラーゼまたはペプチダーゼ活性の検出を可能にする、請求項１から３の何れか一項に記載の反応培地。
【請求項５】
前記オシダーゼ活性がα−グルコシダーゼ活性である、請求項４に記載の反応培地。
【請求項６】
前記エステラーゼ活性がホスファターゼ活性である、請求項５に記載の反応培地。
【請求項７】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を分離して同定するための請求項１から６の何れか一項に記載の反応培地のインビトロ使用。
【請求項８】
生物試料のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を検出および／または同定するための方法であって、
ａ）請求項１から６の何れか一項に記載の反応培地にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌を含む可能性がある生物試料に接種すること；
ｂ）インキュベーションすること；
ｃ）コロニーをＭＲＳＡコロニーとして同定することを含む方法。
【公表番号】特表２０１３−５０１５１３（Ｐ２０１３−５０１５１３Ａ）
【公表日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２４２６６（Ｐ２０１２−５２４２６６）
【出願日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０５１７０５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１８５８９
【国際公開日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【出願人】（３０４０４３９３６）ビオメリュー (26)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＭＥＲＩＥＵＸ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０５１７０５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１８５８９
【国際公開日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【出願人】（３０４０４３９３６）ビオメリュー (26)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＭＥＲＩＥＵＸ
【Ｆターム（参考）】
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