リアルタイムＰＣＲ検査に用いる標準分子及びその標準分子の検出法
【課題】リアルタイムＰＣＲ検査において、標準分子の試薬、検体等への意図しない混入による偽陽性結果の判別を、検査結果の判定時に同時に確認することができる標準分子、プライマー、プローブ及びこれらを用いた検査方法を提供する。
【解決手段】リアルタイムＰＣＲ検査の検査対象となるＤＮＡの標的領域と同一ＰＣＲ条件及び同一反応容器内で増幅することができる人為的ＤＮＡ配列と、検査対象ＤＮＡの標的領域の両方を含むリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子、及び上記ＤＮＡ配列のみを増幅、検出するためのプライマー／プローブを用いて検査することで、検査中の標準分子混入による偽陽性結果を検査と同時に判別する。
【解決手段】リアルタイムＰＣＲ検査の検査対象となるＤＮＡの標的領域と同一ＰＣＲ条件及び同一反応容器内で増幅することができる人為的ＤＮＡ配列と、検査対象ＤＮＡの標的領域の両方を含むリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子、及び上記ＤＮＡ配列のみを増幅、検出するためのプライマー／プローブを用いて検査することで、検査中の標準分子混入による偽陽性結果を検査と同時に判別する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リアルタイムＰＣＲ法を利用した検体、特に食肉（豚肉、鶏肉、牛肉、羊肉、馬肉）又は少なくとも１種以上の食肉を原材料として使用した加工食品又は食肉の原材料表示を含まない加工食品、に含まれる標的ＤＮＡの高感度定量ＰＣＲ検査に使用する標準分子、プライマー、プローブ及びこれらを用いた検査方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ法は、選択的に特定のＤＮＡを増幅する方法であり（非特許文献１）、医学検査領域から食品検査領域にわたり広く使用されている技術である（非特許文献２−５）。さらに、検体中の検査対象となるＤＮＡの定量測定を行う場合、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素が同一のオリゴヌクレオチドプローブに結合されたプローブの存在下でＰＣＲを行うリアルタイムＰＣＲ法により検査対象ＤＮＡの数を測定できることは、この分野においてはよく知られており（非特許文献６）、これを用いた食品中の食肉検出法（非特許文献７）など、検体中の標的ＤＮＡ定量、検出法も開発されている。
【０００３】
リアルタイムＰＣＲ検出においては、横軸にＰＣＲサイクル数、縦軸に測定される蛍光強度を設定して曲線作成する場合、測定される蛍光強度が急激に増加する時のＰＣＲサイクル数（Ｃｔ値）が検体中に含まれる検査対象ＤＮＡの個数（コピー数）に依存して変化するため、種々のコピー数既知の標準分子（標準核酸）でのＰＣＲの結果から標準曲線を作成し、検体を照合することで検体中の検査対象ＤＮＡの数を測定することができる。
【０００４】
なお、リアルタイムＰＣＲ機器は、同一ＰＣＲ条件で実施できるプライマー／プローブセットが設計できれば、検出に使用する蛍光色素を違えることで同時に、複数のＤＮＡ分子を検出できるという特徴を有する。
【０００５】
このように、リアルタイムＰＣＲ検査法により検体中の検査対象ＤＮＡの数を測定するためには、核酸コピー数既知の標準分子が必要となる。またこの標準分子は、検査の精度を安定的に保つために、安定的に供給可能であることが望まれている。
【０００６】
また、リアルタイムＰＣＲ検査については、コンベンショナルタイプのＰＣＲ検査を含む他の検査方法と同様に、偽陰性、偽陽性の結果を生じる場合があるという問題点がある。
【０００７】
リアルタイムＰＣＲ検査の偽陰性結果の原因の多くは、ＰＣＲ反応の失敗による。ＤＮＡを対象とするＰＣＲの場合、検体ＤＮＡの精製度の不足などにより検体中にＰＣＲ反応阻害因子が混入していることで、ＰＣＲ反応が阻害される場合がある。従って、偽陰性結果の判別は、多くの生物に保持されているＤＮＡ領域（共通ＤＮＡ領域）を標的としたＰＣＲを実施することで確認できる。すなわち、共通ＤＮＡ領域を標的としたＰＣＲにおいて目的サイズのＤＮＡの増幅が認められた場合、ＰＣＲ反応が問題なく実施されたと判断し、目的検査の結果から陽性又は陰性の判断を行う。一方、共通ＤＮＡ領域を標的としたＰＣＲにおいて目的サイズのＤＮＡの増幅が認められなかった場合、この検体はＰＣＲ検査に適さないと判断でき、検査結果としては検知不能となる。この場合の原因は検体の精製度不足であることが多く、別の手法によるＤＮＡ抽出を行うなどの対応が必要となる（非特許文献８）。
【０００８】
リアルタイムＰＣＲ検査の偽陽性結果の原因はコンタミネーションによることがほとんどであり、これによる偽陽性結果の判別が重大な問題となる。コンタミネーションの主な原因としては、標準分子を試薬、検体等に混入させてしまうこと、以前に増幅させたＰＣＲ産物（アンプリコン）を試薬、検体等に混入させてしまうこと、の２つがある。
【０００９】
なお、ＰＣＲ検査時の偽陽性結果判定方法については、既に開示されている文献がある（特許文献１）。この文献の方法においては、ＰＣＲに使用するプライマーに標的領域と非相補的なタグ配列を付加し、ＰＣＲサイクル中にアンプリコン検出フェーズとしてのアニーリング段階を加えている。これにより、ＰＣＲ検査と同時にアンプリコン混入による偽陽性結果の判定が可能である。
【００１０】
但し、リアルタイムＰＣＲでは、ＰＣＲに用いる試薬が既に混合されている形態で試薬が販売されており、またＤＮＡの増幅確認は蛍光光度の増幅をリアルタイムに検出することで実施されるため、コンベンショナルタイプのＰＣＲと異なりアンプリコンの電気泳動による確認を必要としない。つまり、試薬、プライマー、プローブ、検体を混合し、試験チューブを機械にセットした後は、試験チューブを開封することはない。よって、増幅後の試験チューブの廃棄を確実に行えば、アンプリコンのコンタミネーションは防ぐことが可能である。
【００１１】
従って、リアルタイムＰＣＲにおいては、検査操作中の標準分子の試薬、検体等への意図しない混入が最も頻繁でかつ有力な偽陽性原因であり、これを防ぐことが最も重要である。しかし、この検査操作中の標準分子混入は検査作業者の注意力や操作能力に大きく依存する部分であるため、これを確実に防ぐことは非常に困難である。
【００１２】
さらに、操作中の標準分子混入を確実に防ぐことが困難なだけでなく、得られた結果が標準分子の混入による偽陽性か否かをすぐに判断できないため、正確で迅速な偽陽性判別が困難となっている。なお、上記文献（特許文献１）には標準分子混入による偽陽性結果の判定に関しては何ら示されておらず、また、リアルタイムＰＣＲ検査法や、標準分子等について既に開示されている文献についても、例えばＢｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，３１３１−３１３５（２００７）（上述の食品検査法、非特許文献７）など、検査操作中の標準分子混入による偽陽性結果判別に関して示されているものは全くない。従って、リアルタイムＰＣＲ検査における、標準分子混入が原因による偽陽性結果の迅速な判別については、この検査に関する基本的な知識を有していても容易なことではなく、非常に困難な課題となっている。
【特許文献１】特表２００７−５３７７４６号公報
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１（１９８８）
【非特許文献２】ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３２，３６６−３７２（２００２）
【非特許文献３】Ｃａｎｃｅｒ，８２，１４１９−１４４２（１９９８）
【非特許文献４】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，９，２６３−２７３（２００３）
【非特許文献５】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，８３，３９−４８（２００３）
【非特許文献６】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，７２７６−７２８０（１９９１）
【非特許文献７】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，３１３１−３１３５（２００７）
【非特許文献８】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，２１５−２３３（２００６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、リアルタイムＰＣＲ検査において、標準分子の試薬、検体等への意図しない混入による偽陽性結果の判別を検査結果の判定時に同時に確認することができる、天然に存在しない人為的ＤＮＡ配列を設計、導入した標準分子、ならびにこれを特異的に増幅、検出するプライマー、プローブの提供、及びこれらを用いた検査方法を提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究の結果、リアルタイムＰＣＲ検査の検査対象となるＤＮＡの標的領域（種特異的領域）と同じ温度でプライマー及びプローブがアニーリングすることで検査対象ＤＮＡと同一のＰＣＲ条件及び同一の反応容器内で増幅することができる、天然に存在しない人為的ＤＮＡ配列、及びこのＤＮＡ配列のみをリアルタイムＰＣＲにより増幅、検出するためのＦ−プライマー、Ｒ−プライマー及びプローブを設計し、このＤＮＡ配列と上記検査対象ＤＮＡの標的領域の両方を同一分子上に含むリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子、及び上記プライマー及びプローブを検査に使用することで、検査操作中の意図しない標準分子混入による偽陽性を検査と同時に判別することができることを見いだし、本発明に至った。
【００１５】
すなわち、本発明の実施形態を例示すれば次のとおりである。
【００１６】
（１）リアルタイムＰＣＲ検査において、検査対象となるＤＮＡの標的領域と同一のＰＣＲ条件及び同一の反応容器内で増幅、検出することができる人為的ＤＮＡ配列、及び検査対象となるＤＮＡの標的領域の両方を同一分子上に含むことを特徴とするリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子（標準核酸）、及び当該ＤＮＡ配列のみをリアルタイムＰＣＲ検査で増幅、検出することができることを特徴とするプライマー（Ｆ−プライマー及びＲ−プライマー）及びプローブ。
（２）配列番号１で示される塩基配列を有することを特徴とする（１）に記載の人為的ＤＮＡ配列を含む（１）に記載のリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子、配列番号２で示される塩基配列を有することを特徴とする（１）に記載のＦ−プライマー、配列番号３で示される塩基配列を有することを特徴とする（１）に記載のＲ−プライマー及び配列番号４で示される塩基配列を有することを特徴とする（１）に記載のプローブ。
（３）配列番号１〜４で示される塩基配列において、配列中の塩基が１個若しくは数個欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなることを特徴とする（２）に記載のリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子、Ｆ−プライマー、Ｒ−プライマー及びプローブ。
（４）リアルタイムＰＣＲ検査の検体ＤＮＡが、食肉（豚肉、鶏肉、牛肉、羊肉、馬肉）、又は少なくとも１種以上の食肉を原材料として使用した加工食品、又は食肉の原材料表示を含まない加工食品のいずれかから得られたものであり、これらの検体ＤＮＡ中の食肉ＤＮＡの定量検査に使用する、食肉ＤＮＡの標的領域を含むことを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１項に記載のリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子。
（５）（１）〜（４）のいずれか１項に記載のリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子、プライマー及びプローブを使用することで、リアルタイムＰＣＲ検査操作中の、検体ＤＮＡ又は試薬への標準分子混入による偽陽性結果を検査と同時に判定することができることを特徴とするリアルタイムＰＣＲ検査方法。
（６）リアルタイムＰＣＲ検査の検体ＤＮＡが、食肉（豚肉、鶏肉、牛肉、羊肉、馬肉）、又は少なくとも１種以上の食肉を原材料として使用した加工食品、又は食肉の原材料表示を含まない加工食品のいずれかから得られたものであり、（４）に記載のリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子を用いてこれらの検体ＤＮＡ中の食肉ＤＮＡの定量検査を行うことを特徴とする、（５）に記載のリアルタイムＰＣＲ検査方法。
【００１７】
本発明においては、配列番号１及び図４、図５で示される塩基配列を有することを特徴とする天然には存在しない人為的ＤＮＡ配列、配列番号２及び図６で示される塩基配列を有し、当該ＤＮＡ配列のみをリアルタイムＰＣＲで増幅することができることを特徴とするＦ−プライマー、配列番号３及び図６で示される塩基配列を有し、当該ＤＮＡ配列のみをリアルタイムＰＣＲで増幅することができることを特徴とするＲ−プライマー、配列番号４及び図６で示される塩基配列を有し、当該ＤＮＡ配列のみをリアルタイムＰＣＲで検出することができることを特徴とするプローブを提供している。
【００１８】
さらに本発明は、上記ＤＮＡ配列がリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子中に検査対象となるＤＮＡの標的領域と共に含まれ、リアルタイムＰＣＲ検査において検査対象ＤＮＡの標的領域と同じ温度で上記プライマー／プローブセットがアニーリングすることにより、検査対象ＤＮＡと同一ＰＣＲ条件及び同一反応容器内で増幅、検出することができることを特徴とする。なお本発明には、配列番号１〜４で示される塩基配列において、配列中の塩基が１個若しくは数個欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなることを特徴し、上記ＤＮＡ配列と同様に検査対象ＤＮＡと同一のＰＣＲ条件及び同一の反応容器内で増幅することができるＤＮＡ配列、プライマー、プローブを含む。なお、これらの標準分子、プライマー、プローブは、全てが混合された状態の試薬として提供されてもよい。
【００１９】
また上記標準分子は、これに限定されるものではないが、上記ＤＮＡ配列、検査対象ＤＮＡの標的領域と共に、リアルタイムＰＣＲ検査が正しく実施されたことの判定に使用される共通ＤＮＡ領域（例えば１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡの部分塩基配列など）を含有することが好ましい。
【００２０】
また本発明は、これに限定されるものではないが、リアルタイムＰＣＲ検査の検体ＤＮＡが、食肉（豚肉、鶏肉、牛肉、羊肉、馬肉）、又は少なくとも１種以上の食肉を原材料として使用した加工食品から得られたものであり、この検体ＤＮＡ中に含まれる食肉ＤＮＡの定量検出検査に対して特に有効であることを特徴とする。さらに、肉類アレルゲン検出など、食肉の原材料表示を含まない加工食品から得られた検体ＤＮＡ中の、微量食肉ＤＮＡの存在の有無を検査する高感度定量検出検査に対しても特に有効であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、リアルタイムＰＣＲ検査、特に検体ＤＮＡが食肉（豚肉、鶏肉、牛肉、羊肉、馬肉）、又は少なくとも１種以上の食肉を原材料として使用した加工食品、又は食肉の原材料表示を含まない加工食品のいずれかから得られたものの検出検査において、標準分子の試薬、検体等への意図しない混入による偽陽性結果の判別を、同一反応容器内で、検査結果の判定時に同時に確認することができ、検査の信頼性を保障することができる。また、標準分子の混入が認められた場合には、検査に使用した試薬、検体等を、標準分子を増幅、検出するためのプライマー／プローブを用いて検査することで、その混入源の確認も容易となり、検査環境の適正化を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の人為的ＤＮＡ配列は、多くの生物が共通に保持している１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡの部分塩基配列で、リアルタイムＰＣＲ検査が正しく実施されたことの判定に使用される領域を含む馬の１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡ増幅プライマー／プローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐａｎ（ＡＢＩ）社製品）の標的領域を含む塩基配列と、大腸菌インサーション配列ｉｓｏ−ＩＳ１ゲノムの部分塩基配列を、クローニングベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）に導入した際の、この２つのゲノムをまたぐ領域に設計した。
【００２３】
さらに、このＤＮＡ配列を増幅、検出するためのＦ−プライマーを馬の１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡ上、Ｒ−プライマー及びプローブを大腸菌インサーション配列ｉｓｏ−ＩＳ１ゲノム上に設計することで、当該ＤＮＡ配列のみを増幅、検出できることを見いだした。すなわち、ここで設計したＤＮＡ配列は通常、自然界には存在しない塩基配列となり、上記増幅、検出用プライマー／プローブセットで検出されるのはこのＤＮＡ配列のみである。
【００２４】
また、上記クローニングベクター中の当該ＤＮＡ配列にリアルタイムＰＣＲ検査対象ＤＮＡの標的領域を結合したプラスミドをリアルタイムＰＣＲ検査の標準分子とし、リアルタイムＰＣＲ検査に使用する蛍光色素と異なった励起波長を有する蛍光色素を当該ＤＮＡ配列検出プローブに標識し、リアルタイムＰＣＲ検査と同時に当該ＤＮＡ配列の検出を行うことで、同一容器内で同時に当該標準分子の検出反応が可能となり、試薬調製時の標準分子のコンタミネーションを迅速にチェックできる。なお、ここで当該ＤＮＡ配列に結合するリアルタイムＰＣＲ検査対象ＤＮＡの標的領域に関しては、単一でも複数種であっても構わない。さらに、共通ＤＮＡ領域として馬の１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡを使用し、その検出プローブを上記２種類のプローブに標識された蛍光色素と異なった励起波長を有する蛍光色素で標識することで、リアルタイムＰＣＲ検査が正しく実施されたかどうかも同時に判定することが可能である。
【００２５】
リアルタイムＰＣＲ検査においては、複数施設で同じ検査を実施する場合、同一の品質を有する安定な物質での精度管理が必要となるが、当該標準分子はプラスミド化をしていることから安定供給が可能となる。よって、リアルタイムＰＣＲ検査のための精度管理試料としても有効である。
【００２６】
当該ＤＮＡ配列に結合させるリアルタイムＰＣＲ検査対象ＤＮＡの標的領域としては、リアルタイムＰＣＲ検査が実施できる塩基配列であれば特に限定はされないが、例えば、上述のＢｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，３１３１−３１３５（２００７）（非特許文献７）に示された食肉のリアルタイムＰＣＲ検査に使用するチトクロームＢ（ＣｙｔＢ）部分塩基配列を挙げることができる（図４）。これらが結合された標準分子は、食品中の食肉検出検査においての偽陽性結果の判定に特に有効である。
【００２７】
この検査には、反応中にＰＣＲ産物の蛍光検出が可能な、リアルタイムＰＣＲ検査に適した任意のＰＣＲ装置（サーマルサイクラー）を使用できる。また、ＰＣＲ反応温度条件は、例えば上記食肉検査では、酵素活性化及び初期変性として５０℃２分、９５℃１０分反応を行った後、９５℃１５秒のＤＮＡ変性反応−６０℃１分のアニーリング／伸長反応を４５サイクル行う条件などを用いることができる。検体等の条件により、アニーリング温度を伸長反応温度と変えた別の温度ステップとしてもよく、反応サイクル数も適宜増減させてよい。このＰＣＲ反応温度条件の調整は、リアルタイムＰＣＲに関する基本的な知識を有していれば、検体ＤＮＡ等に応じてすることは容易に行えるため、特に限定されるものではない。
【００２８】
また、ＰＣＲ反応温度条件に関して、上記で設計したＤＮＡ配列の検出条件と検査対象ＤＮＡの標的領域の検出条件が異なっていた場合、当該ＤＮＡ配列、プライマー、プローブのいずれか、又はいくつかの塩基配列中の塩基を１個若しくは数個欠失、置換若しくは付加し、プライマー、プローブのアニーリング温度条件を調整して当該ＤＮＡ配列の検出条件を検査対象ＤＮＡの標的領域の検出条件と合わせることで、検査に用いる標準分子とすることもできる。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００３０】
（実施例１：人為的ＤＮＡ配列（以下、キメラ核酸と呼ぶ）を含むリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子（以下、ＣＯＮＣＨＥ（コンチェ）標準分子、及びＣＯＮＣＨＥ Ｖ （コンチェ ファイブ）標準分子と呼ぶ）の構築）
リアルタイムＰＣＲ検査が正しく実施されたことの判定に使用される１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡとして、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている馬の１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＪ３１１６７３）の４０９番目−６５９番目（２５１ｂｐ断片）の塩基配列をＰＣＲにより増幅させた後、その増幅産物をＴＡクローニング技術によりクローニングベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にクローン化した。これをシークエンシングにより、目的塩基配列が挿入されたことを確認した。
【００３１】
次に、大腸菌インサーション配列ｉｓｏ−ＩＳ１ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃Ｄ６３５６９）の４６２８番目−４６８４番目（５７ｂｐ断片）の塩基配列の３´末端側に制限酵素ＮｏｔＩの切断部位を導入したトップストランドＤＮＡ（塩基配列：ＴＴＡＡＧＴＧＡＣＧＴＡＡＡＡＴＣＧＴＧＴＴＧＡＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＡＡＴＧＣＧＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＣＧＧＣＧＣ）と、これと相補するボトムストランドＤＮＡ（塩基配列：ＧＧＣＣＧＣＧＣＣＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＧＣＡＴＴＡＴＧＧＧＣＧＴＴＧＧＣＣＴＣＡＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴＡＣＧＴＣＡＣＴＴＡＡ）を合成した。これらを等量混合し、９５℃５分反応後、９４℃から２５℃まで１℃下げる毎に各１分ずつ反応し、最後に１５℃でホールドする反応条件により二本鎖ＤＮＡにした後、先のベクター中の制限酵素切断サイトＥｃｏＲＶ−ＮｏｔＩ部分に挿入し、キメラ核酸を構築した。さらに、キメラ核酸の下流に、食肉検査用のプライマー／プローブセットの標的領域（ＣｙｔＢ部分塩基配列）を導入し、ＣＯＮＣＨＥ標準分子（プラスミド）、ＣＯＮＣＨＥ Ｖ 標準分子（プラスミド）を構築した。それぞれのプラスミドの構築図（構造図）を図１、２に、それぞれのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）塩基配列を図４、５に示す。
【００３２】
（実施例２：ＣＯＮＣＨＥ標準分子の増幅、検出プライマー／プローブの設計）
１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡ増幅プライマー／プローブセット（１８ＳｒＲＮＡ内在性コントロールＭｉｘ（ＶＩＣ）：ＡＢＩ社製品）及び各種肉類検出用プライマー／プローブセット（非特許文献７に記載：ＡＢＩ社製品）と同一のＰＣＲ条件で使用できるＣＯＮＣＨＥ標準分子の増幅、検出プライマー／プローブとして、Ｆ−プライマーを馬の１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡ上、Ｒ−プライマー及びプローブを大腸菌インサーション配列ｉｓｏ−ＩＳ１ゲノム上に設計した。各種プライマー／プローブセットの位置を示す構造図を図３に、塩基配列を図６に示した。
【００３３】
（実施例３：リアルタイムＰＣＲ検査条件の設計）
リアルタイムＰＣＲ検査条件として、同一容器内で検出反応（以下、Ｄｕｐｌｅｘと呼ぶ）するための反応溶液組成及び反応温度条件を設計した。使用するＰＣＲ装置として、ＡＢＩ社製品であるＡＢＩ７５００を用いるため、同時に検出できる蛍光色素は最大２種類の波長までとなる。したがって、プローブにラベルする蛍光色素の関係から、ＣｙｔＢ部分塩基配列とキメラ核酸のＤｕｐｌｅｘ、及びＣｙｔＢ部分塩基配列と１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡのＤｕｐｌｅｘ反応溶液組成、それぞれに用いる反応温度条件を図７の通り設計した。
【００３４】
（実施例４：各種プライマー／プローブの動作確認）
ＣＯＮＣＨＥ標準分子及びその検出用プライマー／プローブの基本性能を確認するため、５種類のＣＯＮＣＨＥ標準分子（それぞれの食肉ＣｙｔＢ部分塩基配列を含む）を検体（ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅ）としたリアルタイムＰＣＲ検査を実施した（図８）。反応溶液組成としては、図７のうちＣｙｔＢ部分塩基配列とキメラ核酸のＤｕｐｌｅｘを用い、１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡは単独での検出反応（以下、Ｓｉｎｇｌｅと呼ぶ）を行った。反応温度条件としては、図７の条件を用いた。
また、ＣｙｔＢ部分塩基配列と１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡのＤｕｐｌｅｘについても別にリアルタイムＰＣＲ検査を実施した（図９）。
すべてのＰＣＲ反応は問題なく実施されており、いずれの結果からも、ＣＯＮＣＨＥ標準分子のキメラ核酸及びその検出用プライマー／プローブは、Ｄｕｐｌｅｘでの検出が可能であり、かつ他の標的領域、共通ＤＮＡ領域の検出に影響を与えないことが確認できた。
【００３５】
（実施例５：ＣＯＮＣＨＥ標準分子検出用プライマー／プローブの特異性確認）
ウシ、ブタ、ニワトリ、ヒツジ、ウマ、大腸菌、サケのゲノムＤＮＡならびにＣｏｌＥ１プラスミドを検体（ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅ）とした、ＣＯＮＣＨＥ標準分子検出用プライマー／プローブを用いたリアルタイムＰＣＲ検査を実施した（図１０）。結果から明らかなように、ＣＯＮＣＨＥ標準分子検出用プライマー／プローブは、ＣＯＮＣＨＥ標準分子は検出するが他の検体とは反応しないことが示された。すなわち、このプライマー／プローブ領域は通常自然界には存在しない塩基配列となっているため、ＣＯＮＣＨＥ標準分子検出用プライマー／プローブで検出されるのはこのＣＯＮＣＨＥ標準分子のみであることが実証できた。
【００３６】
（実施例６：ブタ標的領域を含むＣＯＮＣＨＥ標準分子の、精製ブタゲノム、精製ウシゲノム、精製ショルダーベーコンゲノムでの実用試験）
生豚肉より精製したブタゲノムＤＮＡ、生牛肉より精製したウシゲノムＤＮＡ、及びこれらに意図的にブタ標的領域を含むＣＯＮＣＨＥ標準分子を５，０００コピー添加した検体を、ＣＯＮＣＨＥ標準分子、ＣｙｔＢ部分塩基配列、１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡそれぞれの検出用プライマー／プローブでリアルタイムＰＣＲ検査した結果を図１１に示した。スタンダードは、ブタ標的領域を含むＣＯＮＣＨＥ標準分子１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００コピーを用いた。リアルタイムＰＣＲは、ＣｙｔＢ部分塩基配列検出とキメラ核酸検出のＤｕｐｌｅｘ、１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡのＳｉｎｇｌｅで同一プレートにて実施した。同様の条件で、精製ブタゲノムＤＮＡ及び市販ショルダーベーコンより精製したショルダーベーコンＤＮＡでも検査を実施した（図１２）。結果としては、意図的にＣＯＮＣＨＥ標準分子を添加したすべての検体において、ＣＯＮＣＨＥ標準分子検出用プライマー／プローブにてＣＯＮＣＨＥ標準分子を検出できること、及び他の反応には影響を与えていないことを実証できた。
以上のことから、ＣＯＮＣＨＥ標準分子及びその検出用プライマー／プローブは、検査中の検体ＤＮＡ等への標準分子コンタミネーション確認に充分使用できるものであることが確認できた。
【００３７】
（実施例７：５種食肉ＣｙｔＢ部分塩基配列を含むＣＯＮＣＨＥ Ｖ 標準分子の動作確認）
図２に示した、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、ウシ、ウマの５種類のＣｙｔＢ部分塩基配列を同一プラスミド上に挿入したＣＯＮＣＨＥ Ｖ 標準分子の基本性能を確認した（図１３）。リアルタイムＰＣＲ検査は、ＣＯＮＣＨＥ Ｖ 標準分子を検体とし、ＣｙｔＢ部分塩基配列検出とキメラ核酸検出のＤｕｐｌｅｘ、１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡのＳｉｎｇｌｅで同一プレートにて実施した。図１３は、それぞれの肉種毎に３種類のプライマー／プローブでの検査結果を同一グラフ上に重ねて表示している。図１３の結果からわかるように、すべてのＰＣＲ反応は問題なく実施されており、いずれの結果からも、５種類のＣｙｔＢ部分塩基配列を同一プラスミド上に挿入したＣＯＮＣＨＥ Ｖ 標準分子についても、各領域の検出反応に影響を与えないことが確認できた。
以上のことから、ＣＯＮＣＨＥ Ｖ 標準分子についても、検体ＤＮＡ等への標準分子コンタミネーションチェックに充分使用できるものであることが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ＣＯＮＣＨＥ標準分子（プラスミド）の構築図を示す。検査対象ＤＮＡの標的領域としては、肉類ＣｙｔＢ部分塩基配列を１種類のみ導入した場合を示している。
【図２】ＣＯＮＣＨＥ Ｖ 標準分子（プラスミド）の構築図を示す。検査対象ＤＮＡの標的領域としては、５種類の肉類ＣｙｔＢ部分塩基配列をすべて導入した場合を示している。
【図３】図１及び図２で示す標準分子の、キメラ核酸、検査対象ＤＮＡの標的領域、共通ＤＮＡ領域の増幅、検出用プライマー／プローブの位置詳細を示す。
【図４】図１に示したＣＯＮＣＨＥ標準分子のＭＣＳの塩基配列を示す。上はブタ検知用標準分子の場合の塩基配列、下はニワトリ、ウシ、ヒツジ、ウマの肉類ＣｙｔＢ部分塩基配列を示す。
【図５】図２に示したＣＯＮＣＨＥ Ｖ 標準分子のＭＣＳの塩基配列を示す。ここでは５種の肉類ＣｙｔＢ部分塩基配列をすべて導入している。
【図６】本発明に用いるプライマー及びプローブの塩基配列を示す。上は５種の肉類ＣｙｔＢ部分塩基配列、下はキメラ核酸の塩基配列増幅、検出用プライマー／プローブを示す。
【図７】図６に示すプライマー及びプローブを用いたＰＣＲ反応溶液組成、ＰＣＲ反応温度条件を示す。
【図８】ＣＯＮＣＨＥ標準分子及びＣＯＮＣＨＥ標準分子検出用プライマー／プローブの動作確認試験結果を示す。ここでは、５種の各肉種標準分子に対する、キメラ核酸検出とＣｙｔＢ検出のＤｕｐｌｅｘでの各プライマー／プローブの動作確認試験結果を示す。各グラフの横軸はＰＣＲサイクル数、横軸は蛍光強度を表す（以下の図も同様）。
【図９】ＣＯＮＣＨＥ標準分子及びＣＯＮＣＨＥ標準分子検出用プライマー／プローブの動作確認試験結果を示す。ここでは、ＣｙｔＢ検出と共通ＤＮＡ領域検出のＤｕｐｌｅｘでの動作確認試験結果及びＰＣＲ反応溶液組成、ＰＣＲ反応温度条件を示す。
【図１０】ＣＯＮＣＨＥ標準分子及びＣＯＮＣＨＥ標準分子検出用プライマー／プローブの動作確認試験結果を示す。ここでは、ＣＯＮＣＨＥ標準分子検出用プライマー／プローブの特異性確認試験結果を示す。
【図１１】ブタ標的領域を含むＣＯＮＣＨＥ標準分子の、精製ブタゲノム、精製ウシゲノムでの実用試験結果を示す。
【図１２】ブタ標的領域を含むＣＯＮＣＨＥ標準分子の、精製ブタゲノム、精製ショルダーベーコンゲノムでの実用試験結果を示す。
【図１３】５種食肉標的領域をすべて含むＣＯＮＣＨＥ V 標準分子の各プライマー／プローブでの動作確認試験結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リアルタイムＰＣＲ法を利用した検体、特に食肉（豚肉、鶏肉、牛肉、羊肉、馬肉）又は少なくとも１種以上の食肉を原材料として使用した加工食品又は食肉の原材料表示を含まない加工食品、に含まれる標的ＤＮＡの高感度定量ＰＣＲ検査に使用する標準分子、プライマー、プローブ及びこれらを用いた検査方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ法は、選択的に特定のＤＮＡを増幅する方法であり（非特許文献１）、医学検査領域から食品検査領域にわたり広く使用されている技術である（非特許文献２−５）。さらに、検体中の検査対象となるＤＮＡの定量測定を行う場合、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素が同一のオリゴヌクレオチドプローブに結合されたプローブの存在下でＰＣＲを行うリアルタイムＰＣＲ法により検査対象ＤＮＡの数を測定できることは、この分野においてはよく知られており（非特許文献６）、これを用いた食品中の食肉検出法（非特許文献７）など、検体中の標的ＤＮＡ定量、検出法も開発されている。
【０００３】
リアルタイムＰＣＲ検出においては、横軸にＰＣＲサイクル数、縦軸に測定される蛍光強度を設定して曲線作成する場合、測定される蛍光強度が急激に増加する時のＰＣＲサイクル数（Ｃｔ値）が検体中に含まれる検査対象ＤＮＡの個数（コピー数）に依存して変化するため、種々のコピー数既知の標準分子（標準核酸）でのＰＣＲの結果から標準曲線を作成し、検体を照合することで検体中の検査対象ＤＮＡの数を測定することができる。
【０００４】
なお、リアルタイムＰＣＲ機器は、同一ＰＣＲ条件で実施できるプライマー／プローブセットが設計できれば、検出に使用する蛍光色素を違えることで同時に、複数のＤＮＡ分子を検出できるという特徴を有する。
【０００５】
このように、リアルタイムＰＣＲ検査法により検体中の検査対象ＤＮＡの数を測定するためには、核酸コピー数既知の標準分子が必要となる。またこの標準分子は、検査の精度を安定的に保つために、安定的に供給可能であることが望まれている。
【０００６】
また、リアルタイムＰＣＲ検査については、コンベンショナルタイプのＰＣＲ検査を含む他の検査方法と同様に、偽陰性、偽陽性の結果を生じる場合があるという問題点がある。
【０００７】
リアルタイムＰＣＲ検査の偽陰性結果の原因の多くは、ＰＣＲ反応の失敗による。ＤＮＡを対象とするＰＣＲの場合、検体ＤＮＡの精製度の不足などにより検体中にＰＣＲ反応阻害因子が混入していることで、ＰＣＲ反応が阻害される場合がある。従って、偽陰性結果の判別は、多くの生物に保持されているＤＮＡ領域（共通ＤＮＡ領域）を標的としたＰＣＲを実施することで確認できる。すなわち、共通ＤＮＡ領域を標的としたＰＣＲにおいて目的サイズのＤＮＡの増幅が認められた場合、ＰＣＲ反応が問題なく実施されたと判断し、目的検査の結果から陽性又は陰性の判断を行う。一方、共通ＤＮＡ領域を標的としたＰＣＲにおいて目的サイズのＤＮＡの増幅が認められなかった場合、この検体はＰＣＲ検査に適さないと判断でき、検査結果としては検知不能となる。この場合の原因は検体の精製度不足であることが多く、別の手法によるＤＮＡ抽出を行うなどの対応が必要となる（非特許文献８）。
【０００８】
リアルタイムＰＣＲ検査の偽陽性結果の原因はコンタミネーションによることがほとんどであり、これによる偽陽性結果の判別が重大な問題となる。コンタミネーションの主な原因としては、標準分子を試薬、検体等に混入させてしまうこと、以前に増幅させたＰＣＲ産物（アンプリコン）を試薬、検体等に混入させてしまうこと、の２つがある。
【０００９】
なお、ＰＣＲ検査時の偽陽性結果判定方法については、既に開示されている文献がある（特許文献１）。この文献の方法においては、ＰＣＲに使用するプライマーに標的領域と非相補的なタグ配列を付加し、ＰＣＲサイクル中にアンプリコン検出フェーズとしてのアニーリング段階を加えている。これにより、ＰＣＲ検査と同時にアンプリコン混入による偽陽性結果の判定が可能である。
【００１０】
但し、リアルタイムＰＣＲでは、ＰＣＲに用いる試薬が既に混合されている形態で試薬が販売されており、またＤＮＡの増幅確認は蛍光光度の増幅をリアルタイムに検出することで実施されるため、コンベンショナルタイプのＰＣＲと異なりアンプリコンの電気泳動による確認を必要としない。つまり、試薬、プライマー、プローブ、検体を混合し、試験チューブを機械にセットした後は、試験チューブを開封することはない。よって、増幅後の試験チューブの廃棄を確実に行えば、アンプリコンのコンタミネーションは防ぐことが可能である。
【００１１】
従って、リアルタイムＰＣＲにおいては、検査操作中の標準分子の試薬、検体等への意図しない混入が最も頻繁でかつ有力な偽陽性原因であり、これを防ぐことが最も重要である。しかし、この検査操作中の標準分子混入は検査作業者の注意力や操作能力に大きく依存する部分であるため、これを確実に防ぐことは非常に困難である。
【００１２】
さらに、操作中の標準分子混入を確実に防ぐことが困難なだけでなく、得られた結果が標準分子の混入による偽陽性か否かをすぐに判断できないため、正確で迅速な偽陽性判別が困難となっている。なお、上記文献（特許文献１）には標準分子混入による偽陽性結果の判定に関しては何ら示されておらず、また、リアルタイムＰＣＲ検査法や、標準分子等について既に開示されている文献についても、例えばＢｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，３１３１−３１３５（２００７）（上述の食品検査法、非特許文献７）など、検査操作中の標準分子混入による偽陽性結果判別に関して示されているものは全くない。従って、リアルタイムＰＣＲ検査における、標準分子混入が原因による偽陽性結果の迅速な判別については、この検査に関する基本的な知識を有していても容易なことではなく、非常に困難な課題となっている。
【特許文献１】特表２００７−５３７７４６号公報
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１（１９８８）
【非特許文献２】ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３２，３６６−３７２（２００２）
【非特許文献３】Ｃａｎｃｅｒ，８２，１４１９−１４４２（１９９８）
【非特許文献４】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，９，２６３−２７３（２００３）
【非特許文献５】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，８３，３９−４８（２００３）
【非特許文献６】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，７２７６−７２８０（１９９１）
【非特許文献７】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，３１３１−３１３５（２００７）
【非特許文献８】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，２１５−２３３（２００６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、リアルタイムＰＣＲ検査において、標準分子の試薬、検体等への意図しない混入による偽陽性結果の判別を検査結果の判定時に同時に確認することができる、天然に存在しない人為的ＤＮＡ配列を設計、導入した標準分子、ならびにこれを特異的に増幅、検出するプライマー、プローブの提供、及びこれらを用いた検査方法を提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究の結果、リアルタイムＰＣＲ検査の検査対象となるＤＮＡの標的領域（種特異的領域）と同じ温度でプライマー及びプローブがアニーリングすることで検査対象ＤＮＡと同一のＰＣＲ条件及び同一の反応容器内で増幅することができる、天然に存在しない人為的ＤＮＡ配列、及びこのＤＮＡ配列のみをリアルタイムＰＣＲにより増幅、検出するためのＦ−プライマー、Ｒ−プライマー及びプローブを設計し、このＤＮＡ配列と上記検査対象ＤＮＡの標的領域の両方を同一分子上に含むリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子、及び上記プライマー及びプローブを検査に使用することで、検査操作中の意図しない標準分子混入による偽陽性を検査と同時に判別することができることを見いだし、本発明に至った。
【００１５】
すなわち、本発明の実施形態を例示すれば次のとおりである。
【００１６】
（１）リアルタイムＰＣＲ検査において、検査対象となるＤＮＡの標的領域と同一のＰＣＲ条件及び同一の反応容器内で増幅、検出することができる人為的ＤＮＡ配列、及び検査対象となるＤＮＡの標的領域の両方を同一分子上に含むことを特徴とするリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子（標準核酸）、及び当該ＤＮＡ配列のみをリアルタイムＰＣＲ検査で増幅、検出することができることを特徴とするプライマー（Ｆ−プライマー及びＲ−プライマー）及びプローブ。
（２）配列番号１で示される塩基配列を有することを特徴とする（１）に記載の人為的ＤＮＡ配列を含む（１）に記載のリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子、配列番号２で示される塩基配列を有することを特徴とする（１）に記載のＦ−プライマー、配列番号３で示される塩基配列を有することを特徴とする（１）に記載のＲ−プライマー及び配列番号４で示される塩基配列を有することを特徴とする（１）に記載のプローブ。
（３）配列番号１〜４で示される塩基配列において、配列中の塩基が１個若しくは数個欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなることを特徴とする（２）に記載のリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子、Ｆ−プライマー、Ｒ−プライマー及びプローブ。
（４）リアルタイムＰＣＲ検査の検体ＤＮＡが、食肉（豚肉、鶏肉、牛肉、羊肉、馬肉）、又は少なくとも１種以上の食肉を原材料として使用した加工食品、又は食肉の原材料表示を含まない加工食品のいずれかから得られたものであり、これらの検体ＤＮＡ中の食肉ＤＮＡの定量検査に使用する、食肉ＤＮＡの標的領域を含むことを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１項に記載のリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子。
（５）（１）〜（４）のいずれか１項に記載のリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子、プライマー及びプローブを使用することで、リアルタイムＰＣＲ検査操作中の、検体ＤＮＡ又は試薬への標準分子混入による偽陽性結果を検査と同時に判定することができることを特徴とするリアルタイムＰＣＲ検査方法。
（６）リアルタイムＰＣＲ検査の検体ＤＮＡが、食肉（豚肉、鶏肉、牛肉、羊肉、馬肉）、又は少なくとも１種以上の食肉を原材料として使用した加工食品、又は食肉の原材料表示を含まない加工食品のいずれかから得られたものであり、（４）に記載のリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子を用いてこれらの検体ＤＮＡ中の食肉ＤＮＡの定量検査を行うことを特徴とする、（５）に記載のリアルタイムＰＣＲ検査方法。
【００１７】
本発明においては、配列番号１及び図４、図５で示される塩基配列を有することを特徴とする天然には存在しない人為的ＤＮＡ配列、配列番号２及び図６で示される塩基配列を有し、当該ＤＮＡ配列のみをリアルタイムＰＣＲで増幅することができることを特徴とするＦ−プライマー、配列番号３及び図６で示される塩基配列を有し、当該ＤＮＡ配列のみをリアルタイムＰＣＲで増幅することができることを特徴とするＲ−プライマー、配列番号４及び図６で示される塩基配列を有し、当該ＤＮＡ配列のみをリアルタイムＰＣＲで検出することができることを特徴とするプローブを提供している。
【００１８】
さらに本発明は、上記ＤＮＡ配列がリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子中に検査対象となるＤＮＡの標的領域と共に含まれ、リアルタイムＰＣＲ検査において検査対象ＤＮＡの標的領域と同じ温度で上記プライマー／プローブセットがアニーリングすることにより、検査対象ＤＮＡと同一ＰＣＲ条件及び同一反応容器内で増幅、検出することができることを特徴とする。なお本発明には、配列番号１〜４で示される塩基配列において、配列中の塩基が１個若しくは数個欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなることを特徴し、上記ＤＮＡ配列と同様に検査対象ＤＮＡと同一のＰＣＲ条件及び同一の反応容器内で増幅することができるＤＮＡ配列、プライマー、プローブを含む。なお、これらの標準分子、プライマー、プローブは、全てが混合された状態の試薬として提供されてもよい。
【００１９】
また上記標準分子は、これに限定されるものではないが、上記ＤＮＡ配列、検査対象ＤＮＡの標的領域と共に、リアルタイムＰＣＲ検査が正しく実施されたことの判定に使用される共通ＤＮＡ領域（例えば１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡの部分塩基配列など）を含有することが好ましい。
【００２０】
また本発明は、これに限定されるものではないが、リアルタイムＰＣＲ検査の検体ＤＮＡが、食肉（豚肉、鶏肉、牛肉、羊肉、馬肉）、又は少なくとも１種以上の食肉を原材料として使用した加工食品から得られたものであり、この検体ＤＮＡ中に含まれる食肉ＤＮＡの定量検出検査に対して特に有効であることを特徴とする。さらに、肉類アレルゲン検出など、食肉の原材料表示を含まない加工食品から得られた検体ＤＮＡ中の、微量食肉ＤＮＡの存在の有無を検査する高感度定量検出検査に対しても特に有効であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、リアルタイムＰＣＲ検査、特に検体ＤＮＡが食肉（豚肉、鶏肉、牛肉、羊肉、馬肉）、又は少なくとも１種以上の食肉を原材料として使用した加工食品、又は食肉の原材料表示を含まない加工食品のいずれかから得られたものの検出検査において、標準分子の試薬、検体等への意図しない混入による偽陽性結果の判別を、同一反応容器内で、検査結果の判定時に同時に確認することができ、検査の信頼性を保障することができる。また、標準分子の混入が認められた場合には、検査に使用した試薬、検体等を、標準分子を増幅、検出するためのプライマー／プローブを用いて検査することで、その混入源の確認も容易となり、検査環境の適正化を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の人為的ＤＮＡ配列は、多くの生物が共通に保持している１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡの部分塩基配列で、リアルタイムＰＣＲ検査が正しく実施されたことの判定に使用される領域を含む馬の１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡ増幅プライマー／プローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐａｎ（ＡＢＩ）社製品）の標的領域を含む塩基配列と、大腸菌インサーション配列ｉｓｏ−ＩＳ１ゲノムの部分塩基配列を、クローニングベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）に導入した際の、この２つのゲノムをまたぐ領域に設計した。
【００２３】
さらに、このＤＮＡ配列を増幅、検出するためのＦ−プライマーを馬の１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡ上、Ｒ−プライマー及びプローブを大腸菌インサーション配列ｉｓｏ−ＩＳ１ゲノム上に設計することで、当該ＤＮＡ配列のみを増幅、検出できることを見いだした。すなわち、ここで設計したＤＮＡ配列は通常、自然界には存在しない塩基配列となり、上記増幅、検出用プライマー／プローブセットで検出されるのはこのＤＮＡ配列のみである。
【００２４】
また、上記クローニングベクター中の当該ＤＮＡ配列にリアルタイムＰＣＲ検査対象ＤＮＡの標的領域を結合したプラスミドをリアルタイムＰＣＲ検査の標準分子とし、リアルタイムＰＣＲ検査に使用する蛍光色素と異なった励起波長を有する蛍光色素を当該ＤＮＡ配列検出プローブに標識し、リアルタイムＰＣＲ検査と同時に当該ＤＮＡ配列の検出を行うことで、同一容器内で同時に当該標準分子の検出反応が可能となり、試薬調製時の標準分子のコンタミネーションを迅速にチェックできる。なお、ここで当該ＤＮＡ配列に結合するリアルタイムＰＣＲ検査対象ＤＮＡの標的領域に関しては、単一でも複数種であっても構わない。さらに、共通ＤＮＡ領域として馬の１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡを使用し、その検出プローブを上記２種類のプローブに標識された蛍光色素と異なった励起波長を有する蛍光色素で標識することで、リアルタイムＰＣＲ検査が正しく実施されたかどうかも同時に判定することが可能である。
【００２５】
リアルタイムＰＣＲ検査においては、複数施設で同じ検査を実施する場合、同一の品質を有する安定な物質での精度管理が必要となるが、当該標準分子はプラスミド化をしていることから安定供給が可能となる。よって、リアルタイムＰＣＲ検査のための精度管理試料としても有効である。
【００２６】
当該ＤＮＡ配列に結合させるリアルタイムＰＣＲ検査対象ＤＮＡの標的領域としては、リアルタイムＰＣＲ検査が実施できる塩基配列であれば特に限定はされないが、例えば、上述のＢｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，３１３１−３１３５（２００７）（非特許文献７）に示された食肉のリアルタイムＰＣＲ検査に使用するチトクロームＢ（ＣｙｔＢ）部分塩基配列を挙げることができる（図４）。これらが結合された標準分子は、食品中の食肉検出検査においての偽陽性結果の判定に特に有効である。
【００２７】
この検査には、反応中にＰＣＲ産物の蛍光検出が可能な、リアルタイムＰＣＲ検査に適した任意のＰＣＲ装置（サーマルサイクラー）を使用できる。また、ＰＣＲ反応温度条件は、例えば上記食肉検査では、酵素活性化及び初期変性として５０℃２分、９５℃１０分反応を行った後、９５℃１５秒のＤＮＡ変性反応−６０℃１分のアニーリング／伸長反応を４５サイクル行う条件などを用いることができる。検体等の条件により、アニーリング温度を伸長反応温度と変えた別の温度ステップとしてもよく、反応サイクル数も適宜増減させてよい。このＰＣＲ反応温度条件の調整は、リアルタイムＰＣＲに関する基本的な知識を有していれば、検体ＤＮＡ等に応じてすることは容易に行えるため、特に限定されるものではない。
【００２８】
また、ＰＣＲ反応温度条件に関して、上記で設計したＤＮＡ配列の検出条件と検査対象ＤＮＡの標的領域の検出条件が異なっていた場合、当該ＤＮＡ配列、プライマー、プローブのいずれか、又はいくつかの塩基配列中の塩基を１個若しくは数個欠失、置換若しくは付加し、プライマー、プローブのアニーリング温度条件を調整して当該ＤＮＡ配列の検出条件を検査対象ＤＮＡの標的領域の検出条件と合わせることで、検査に用いる標準分子とすることもできる。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００３０】
（実施例１：人為的ＤＮＡ配列（以下、キメラ核酸と呼ぶ）を含むリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子（以下、ＣＯＮＣＨＥ（コンチェ）標準分子、及びＣＯＮＣＨＥ Ｖ （コンチェ ファイブ）標準分子と呼ぶ）の構築）
リアルタイムＰＣＲ検査が正しく実施されたことの判定に使用される１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡとして、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている馬の１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＪ３１１６７３）の４０９番目−６５９番目（２５１ｂｐ断片）の塩基配列をＰＣＲにより増幅させた後、その増幅産物をＴＡクローニング技術によりクローニングベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にクローン化した。これをシークエンシングにより、目的塩基配列が挿入されたことを確認した。
【００３１】
次に、大腸菌インサーション配列ｉｓｏ−ＩＳ１ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃Ｄ６３５６９）の４６２８番目−４６８４番目（５７ｂｐ断片）の塩基配列の３´末端側に制限酵素ＮｏｔＩの切断部位を導入したトップストランドＤＮＡ（塩基配列：ＴＴＡＡＧＴＧＡＣＧＴＡＡＡＡＴＣＧＴＧＴＴＧＡＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＡＡＴＧＣＧＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＣＧＧＣＧＣ）と、これと相補するボトムストランドＤＮＡ（塩基配列：ＧＧＣＣＧＣＧＣＣＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＧＣＡＴＴＡＴＧＧＧＣＧＴＴＧＧＣＣＴＣＡＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴＡＣＧＴＣＡＣＴＴＡＡ）を合成した。これらを等量混合し、９５℃５分反応後、９４℃から２５℃まで１℃下げる毎に各１分ずつ反応し、最後に１５℃でホールドする反応条件により二本鎖ＤＮＡにした後、先のベクター中の制限酵素切断サイトＥｃｏＲＶ−ＮｏｔＩ部分に挿入し、キメラ核酸を構築した。さらに、キメラ核酸の下流に、食肉検査用のプライマー／プローブセットの標的領域（ＣｙｔＢ部分塩基配列）を導入し、ＣＯＮＣＨＥ標準分子（プラスミド）、ＣＯＮＣＨＥ Ｖ 標準分子（プラスミド）を構築した。それぞれのプラスミドの構築図（構造図）を図１、２に、それぞれのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）塩基配列を図４、５に示す。
【００３２】
（実施例２：ＣＯＮＣＨＥ標準分子の増幅、検出プライマー／プローブの設計）
１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡ増幅プライマー／プローブセット（１８ＳｒＲＮＡ内在性コントロールＭｉｘ（ＶＩＣ）：ＡＢＩ社製品）及び各種肉類検出用プライマー／プローブセット（非特許文献７に記載：ＡＢＩ社製品）と同一のＰＣＲ条件で使用できるＣＯＮＣＨＥ標準分子の増幅、検出プライマー／プローブとして、Ｆ−プライマーを馬の１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡ上、Ｒ−プライマー及びプローブを大腸菌インサーション配列ｉｓｏ−ＩＳ１ゲノム上に設計した。各種プライマー／プローブセットの位置を示す構造図を図３に、塩基配列を図６に示した。
【００３３】
（実施例３：リアルタイムＰＣＲ検査条件の設計）
リアルタイムＰＣＲ検査条件として、同一容器内で検出反応（以下、Ｄｕｐｌｅｘと呼ぶ）するための反応溶液組成及び反応温度条件を設計した。使用するＰＣＲ装置として、ＡＢＩ社製品であるＡＢＩ７５００を用いるため、同時に検出できる蛍光色素は最大２種類の波長までとなる。したがって、プローブにラベルする蛍光色素の関係から、ＣｙｔＢ部分塩基配列とキメラ核酸のＤｕｐｌｅｘ、及びＣｙｔＢ部分塩基配列と１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡのＤｕｐｌｅｘ反応溶液組成、それぞれに用いる反応温度条件を図７の通り設計した。
【００３４】
（実施例４：各種プライマー／プローブの動作確認）
ＣＯＮＣＨＥ標準分子及びその検出用プライマー／プローブの基本性能を確認するため、５種類のＣＯＮＣＨＥ標準分子（それぞれの食肉ＣｙｔＢ部分塩基配列を含む）を検体（ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅ）としたリアルタイムＰＣＲ検査を実施した（図８）。反応溶液組成としては、図７のうちＣｙｔＢ部分塩基配列とキメラ核酸のＤｕｐｌｅｘを用い、１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡは単独での検出反応（以下、Ｓｉｎｇｌｅと呼ぶ）を行った。反応温度条件としては、図７の条件を用いた。
また、ＣｙｔＢ部分塩基配列と１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡのＤｕｐｌｅｘについても別にリアルタイムＰＣＲ検査を実施した（図９）。
すべてのＰＣＲ反応は問題なく実施されており、いずれの結果からも、ＣＯＮＣＨＥ標準分子のキメラ核酸及びその検出用プライマー／プローブは、Ｄｕｐｌｅｘでの検出が可能であり、かつ他の標的領域、共通ＤＮＡ領域の検出に影響を与えないことが確認できた。
【００３５】
（実施例５：ＣＯＮＣＨＥ標準分子検出用プライマー／プローブの特異性確認）
ウシ、ブタ、ニワトリ、ヒツジ、ウマ、大腸菌、サケのゲノムＤＮＡならびにＣｏｌＥ１プラスミドを検体（ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅ）とした、ＣＯＮＣＨＥ標準分子検出用プライマー／プローブを用いたリアルタイムＰＣＲ検査を実施した（図１０）。結果から明らかなように、ＣＯＮＣＨＥ標準分子検出用プライマー／プローブは、ＣＯＮＣＨＥ標準分子は検出するが他の検体とは反応しないことが示された。すなわち、このプライマー／プローブ領域は通常自然界には存在しない塩基配列となっているため、ＣＯＮＣＨＥ標準分子検出用プライマー／プローブで検出されるのはこのＣＯＮＣＨＥ標準分子のみであることが実証できた。
【００３６】
（実施例６：ブタ標的領域を含むＣＯＮＣＨＥ標準分子の、精製ブタゲノム、精製ウシゲノム、精製ショルダーベーコンゲノムでの実用試験）
生豚肉より精製したブタゲノムＤＮＡ、生牛肉より精製したウシゲノムＤＮＡ、及びこれらに意図的にブタ標的領域を含むＣＯＮＣＨＥ標準分子を５，０００コピー添加した検体を、ＣＯＮＣＨＥ標準分子、ＣｙｔＢ部分塩基配列、１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡそれぞれの検出用プライマー／プローブでリアルタイムＰＣＲ検査した結果を図１１に示した。スタンダードは、ブタ標的領域を含むＣＯＮＣＨＥ標準分子１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００コピーを用いた。リアルタイムＰＣＲは、ＣｙｔＢ部分塩基配列検出とキメラ核酸検出のＤｕｐｌｅｘ、１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡのＳｉｎｇｌｅで同一プレートにて実施した。同様の条件で、精製ブタゲノムＤＮＡ及び市販ショルダーベーコンより精製したショルダーベーコンＤＮＡでも検査を実施した（図１２）。結果としては、意図的にＣＯＮＣＨＥ標準分子を添加したすべての検体において、ＣＯＮＣＨＥ標準分子検出用プライマー／プローブにてＣＯＮＣＨＥ標準分子を検出できること、及び他の反応には影響を与えていないことを実証できた。
以上のことから、ＣＯＮＣＨＥ標準分子及びその検出用プライマー／プローブは、検査中の検体ＤＮＡ等への標準分子コンタミネーション確認に充分使用できるものであることが確認できた。
【００３７】
（実施例７：５種食肉ＣｙｔＢ部分塩基配列を含むＣＯＮＣＨＥ Ｖ 標準分子の動作確認）
図２に示した、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、ウシ、ウマの５種類のＣｙｔＢ部分塩基配列を同一プラスミド上に挿入したＣＯＮＣＨＥ Ｖ 標準分子の基本性能を確認した（図１３）。リアルタイムＰＣＲ検査は、ＣＯＮＣＨＥ Ｖ 標準分子を検体とし、ＣｙｔＢ部分塩基配列検出とキメラ核酸検出のＤｕｐｌｅｘ、１８ＳリボゾームＲＮＡゲノムＤＮＡのＳｉｎｇｌｅで同一プレートにて実施した。図１３は、それぞれの肉種毎に３種類のプライマー／プローブでの検査結果を同一グラフ上に重ねて表示している。図１３の結果からわかるように、すべてのＰＣＲ反応は問題なく実施されており、いずれの結果からも、５種類のＣｙｔＢ部分塩基配列を同一プラスミド上に挿入したＣＯＮＣＨＥ Ｖ 標準分子についても、各領域の検出反応に影響を与えないことが確認できた。
以上のことから、ＣＯＮＣＨＥ Ｖ 標準分子についても、検体ＤＮＡ等への標準分子コンタミネーションチェックに充分使用できるものであることが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ＣＯＮＣＨＥ標準分子（プラスミド）の構築図を示す。検査対象ＤＮＡの標的領域としては、肉類ＣｙｔＢ部分塩基配列を１種類のみ導入した場合を示している。
【図２】ＣＯＮＣＨＥ Ｖ 標準分子（プラスミド）の構築図を示す。検査対象ＤＮＡの標的領域としては、５種類の肉類ＣｙｔＢ部分塩基配列をすべて導入した場合を示している。
【図３】図１及び図２で示す標準分子の、キメラ核酸、検査対象ＤＮＡの標的領域、共通ＤＮＡ領域の増幅、検出用プライマー／プローブの位置詳細を示す。
【図４】図１に示したＣＯＮＣＨＥ標準分子のＭＣＳの塩基配列を示す。上はブタ検知用標準分子の場合の塩基配列、下はニワトリ、ウシ、ヒツジ、ウマの肉類ＣｙｔＢ部分塩基配列を示す。
【図５】図２に示したＣＯＮＣＨＥ Ｖ 標準分子のＭＣＳの塩基配列を示す。ここでは５種の肉類ＣｙｔＢ部分塩基配列をすべて導入している。
【図６】本発明に用いるプライマー及びプローブの塩基配列を示す。上は５種の肉類ＣｙｔＢ部分塩基配列、下はキメラ核酸の塩基配列増幅、検出用プライマー／プローブを示す。
【図７】図６に示すプライマー及びプローブを用いたＰＣＲ反応溶液組成、ＰＣＲ反応温度条件を示す。
【図８】ＣＯＮＣＨＥ標準分子及びＣＯＮＣＨＥ標準分子検出用プライマー／プローブの動作確認試験結果を示す。ここでは、５種の各肉種標準分子に対する、キメラ核酸検出とＣｙｔＢ検出のＤｕｐｌｅｘでの各プライマー／プローブの動作確認試験結果を示す。各グラフの横軸はＰＣＲサイクル数、横軸は蛍光強度を表す（以下の図も同様）。
【図９】ＣＯＮＣＨＥ標準分子及びＣＯＮＣＨＥ標準分子検出用プライマー／プローブの動作確認試験結果を示す。ここでは、ＣｙｔＢ検出と共通ＤＮＡ領域検出のＤｕｐｌｅｘでの動作確認試験結果及びＰＣＲ反応溶液組成、ＰＣＲ反応温度条件を示す。
【図１０】ＣＯＮＣＨＥ標準分子及びＣＯＮＣＨＥ標準分子検出用プライマー／プローブの動作確認試験結果を示す。ここでは、ＣＯＮＣＨＥ標準分子検出用プライマー／プローブの特異性確認試験結果を示す。
【図１１】ブタ標的領域を含むＣＯＮＣＨＥ標準分子の、精製ブタゲノム、精製ウシゲノムでの実用試験結果を示す。
【図１２】ブタ標的領域を含むＣＯＮＣＨＥ標準分子の、精製ブタゲノム、精製ショルダーベーコンゲノムでの実用試験結果を示す。
【図１３】５種食肉標的領域をすべて含むＣＯＮＣＨＥ V 標準分子の各プライマー／プローブでの動作確認試験結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リアルタイムＰＣＲ検査において、検査対象となるＤＮＡの標的領域と同一のＰＣＲ条件及び同一の反応容器内で増幅、検出することができる人為的ＤＮＡ配列、及び検査対象となるＤＮＡの標的領域の両方を同一分子上に含むことを特徴とするリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子、及び当該ＤＮＡ配列のみをリアルタイムＰＣＲ検査で増幅、検出することができることを特徴とするプライマー及びプローブ。
【請求項２】
配列番号１で示される塩基配列を有することを特徴とする請求項１に記載の人為的ＤＮＡ配列を含む請求項１に記載のリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子、配列番号２及び３で示される塩基配列を有することを特徴とする請求項１に記載のプライマー、及び配列番号４で示される塩基配列を有することを特徴とする請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
配列番号１〜４で示される塩基配列において、配列中の塩基が１個若しくは数個欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなることを特徴とする請求項２に記載のリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子、プライマー及びプローブ。
【請求項４】
リアルタイムＰＣＲ検査の検体ＤＮＡが、食肉（豚肉、鶏肉、牛肉、羊肉、馬肉）、又は少なくとも１種以上の食肉を原材料として使用した加工食品、又は食肉の原材料表示を含まない加工食品のいずれかから得られたものであり、これらの検体ＤＮＡ中の食肉ＤＮＡの定量検査に使用する、食肉ＤＮＡの標的領域を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子、プライマー及びプローブを使用することで、リアルタイムＰＣＲ検査操作中の、検体ＤＮＡ又は試薬への標準分子混入による偽陽性結果を検査と同時に判定することができることを特徴とするリアルタイムＰＣＲ検査方法。
【請求項６】
リアルタイムＰＣＲ検査の検体ＤＮＡが、食肉（豚肉、鶏肉、牛肉、羊肉、馬肉）、又は少なくとも１種以上の食肉を原材料として使用した加工食品、又は食肉の原材料表示を含まない加工食品のいずれかから得られたものであり、請求項４に記載のリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子を用いてこれらの検体ＤＮＡ中の食肉ＤＮＡの定量検査を行うことを特徴とする、請求項５に記載のリアルタイムＰＣＲ検査方法。
【請求項１】
リアルタイムＰＣＲ検査において、検査対象となるＤＮＡの標的領域と同一のＰＣＲ条件及び同一の反応容器内で増幅、検出することができる人為的ＤＮＡ配列、及び検査対象となるＤＮＡの標的領域の両方を同一分子上に含むことを特徴とするリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子、及び当該ＤＮＡ配列のみをリアルタイムＰＣＲ検査で増幅、検出することができることを特徴とするプライマー及びプローブ。
【請求項２】
配列番号１で示される塩基配列を有することを特徴とする請求項１に記載の人為的ＤＮＡ配列を含む請求項１に記載のリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子、配列番号２及び３で示される塩基配列を有することを特徴とする請求項１に記載のプライマー、及び配列番号４で示される塩基配列を有することを特徴とする請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
配列番号１〜４で示される塩基配列において、配列中の塩基が１個若しくは数個欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなることを特徴とする請求項２に記載のリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子、プライマー及びプローブ。
【請求項４】
リアルタイムＰＣＲ検査の検体ＤＮＡが、食肉（豚肉、鶏肉、牛肉、羊肉、馬肉）、又は少なくとも１種以上の食肉を原材料として使用した加工食品、又は食肉の原材料表示を含まない加工食品のいずれかから得られたものであり、これらの検体ＤＮＡ中の食肉ＤＮＡの定量検査に使用する、食肉ＤＮＡの標的領域を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子、プライマー及びプローブを使用することで、リアルタイムＰＣＲ検査操作中の、検体ＤＮＡ又は試薬への標準分子混入による偽陽性結果を検査と同時に判定することができることを特徴とするリアルタイムＰＣＲ検査方法。
【請求項６】
リアルタイムＰＣＲ検査の検体ＤＮＡが、食肉（豚肉、鶏肉、牛肉、羊肉、馬肉）、又は少なくとも１種以上の食肉を原材料として使用した加工食品、又は食肉の原材料表示を含まない加工食品のいずれかから得られたものであり、請求項４に記載のリアルタイムＰＣＲ検査用標準分子を用いてこれらの検体ＤＮＡ中の食肉ＤＮＡの定量検査を行うことを特徴とする、請求項５に記載のリアルタイムＰＣＲ検査方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１０−４７７３（Ｐ２０１０−４７７３Ａ）
【公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１６５７７５（Ｐ２００８−１６５７７５）
【出願日】平成２０年６月２５日（２００８．６．２５）
【出願人】（０００１０３８４０）オリエンタル酵母工業株式会社 (60)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月２５日（２００８．６．２５）
【出願人】（０００１０３８４０）オリエンタル酵母工業株式会社 (60)
【Ｆターム（参考）】
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