リンパ球の抗原特異的インターロイキンー２反応性の測定法
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はアレルギー性疾患における原因抗原の検索や病勢の指標として有用なリンパ球の抗原特異的インターロイキン−２反応性を簡便かつ迅速に測定する方法に関する。
〔従来の技術〕
IgEを主体とする即時型（Ｉ型）アレルギー反応系あるいはＴ細胞から分泌されるサイトカインによって惹起される遅延型（IV型）過敏反応系は、抗原刺激によって活性化されたＴ細胞を介して行なわれる。すなわち、抗原提示細胞により活性化されたＴ細胞は、インターロイキン−２（以下IL−２という）を吸収することによって増殖し、IgE産生細胞の分化増殖を促進するIL4、IL5などのリンホカインを分泌する。また活性化Ｔ細胞は、IgEを結合することによって脱顆粒をひきおこし即時型アレルギー反応の原因となる肥満細胞の増殖を促進するIL3、IL4のリンホカインを分泌する。さらに、同様にして活性化されたＴ細胞は遅延型過敏反応におけるヘルパーＴ細胞として働き、遅延型過敏反応を誘導する。このようにアレルゲンによりIL−２を介して活性化されたＴ細胞は少なくともＩ型あるいはIV型アレルギー反応を促進すると考えられている。
一方、臨床的に観ても、アレルギー患者のリンパ球のIL−２反応性は抗原に特異的であることが知られている。すなわち、例えば卵白アルブミンを原因抗原とする患者のリンパ球は、卵白アルブミンで刺激した場合のみIL−２反応性が誘導され、他の抗原で刺激した場合にはIL−２反応性は誘導されない。
またリンパ球のIL−２反応性はアレルギー性患者の病勢とも深い関わりを有している。すなわち、アレルギー疾患患者が自然治癒していくに従ってその患者のリンパ球のIL−２反応性が減衰していくことから、リンパ球のIL−２反応性を測定することはアレルギー患者の病勢を把握し、治療指針を企図するうえでも極めて重要である〔臨床免疫,19（Suppl.12）,170（1987），アレルギー,36,1075（1987）等〕。
このようにアレルギー性疾患における原因抗原の検索や病勢の指標として有用なリンパ球のIL−２反応性の測定法としては、被検リンパ球に抗原を反応させ、次いで該反応液をIL−２を加えて培養し、これにトリパンブルーを加えて生細胞数を血算板を用いて算定する方法があった（トリパンブルー法）〔アレルギー,36,1075（1987）等〕。
〔発明が解決しようとする課題〕
しかしながら、従来のトリパンブルー法は顕微鏡下で染色された細胞と非染色細胞を分別して生細胞数を算定する方法であることから、その測定には長時間を要し、操作が煩雑であり、かつ大量の検体を処理することができないという欠点があった。
従って、簡便かつ迅速なリンパ球の抗原特異的IL−２反応性の測定法の開発が望まれていた。
〔課題を解決するための手段〕
かかる実情において、本発明者は種々研究を重ねた結果、リンパ球、抗原及びIL−２を一定時間反応させた後の生細胞数を、蛍光色素であるヨウ化プロピジウムを利用して蛍光色素量として定量すれば、リンパ球の抗原特異的IL−２反応性が簡便、迅速かつ正確に測定できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は被検リンパ球に抗原を反応させ、次いで該反応液にIL−２を加えて３〜４日間培養し、さらにヨウ化プロピジウム含有液を加えた後該培養液の蛍光色素量を測定することを特徴とする、リンパ球の抗原特異的IL−２反応性の測定法を提供するものである。
本発明を実施するには、まず被検リンパ球に抗原を反応させるが、用いられるリンパ球としてはヒト末梢血リンパ球、特に単核球画分が好ましい。反応させる抗原としては、アレルギー性疾患患者の原因抗原が判明している場合には、その原因抗原を用いればよい。一方、原因抗原が不明の場合には、種々のアレルゲンが用いられる。通常用いられるアレルゲンとしては、卵白アルブミン（OVA）、カゼイン、ダニ抗原、スギ花粉抗原、ブタクサ抗原、ハウスダスト等が挙げられる。被検リンパ球と抗原との反応は、通常被検リンパ球をヒト保存AB血清含有RPMI1640培地等の培地に加え、これに抗原を添加して37℃で５〜６日間培養することにより行なう。
次に該反応液にIL−２を加えて３〜４日間培養する。ここで用いられるIL−２としては、ヒトから抽出されたものでもよいが遺伝子組み換えIL−２（ｒ−IL−２）を用いてもよい。IL−２の添加量は、リンパ球に対するIL−２の反応性がリンパ球２×105個当り0.1単位で平衡に達するため、これ以上が好ましい。IL−２添加後の培養は、リンパ球に対するIL−２の反応性が培養３日目にピークとなるので、37℃３日間余とするのが好ましい。
次に培養液にヨウ化プロピジウム含有液を加えた後、該培養液の蛍光色素量を測定する。本発明において用いるヨウ化プロピジウムは、蛍光色素であり、２本鎖DNAに特異的に結合し、１本鎖DNAには結合しないという特性を有する。一方、生細胞のDNAの多くは２本鎖であるが、死細胞ではそのほとんどが１本鎖DNAとなっている。従って、２本鎖DNAに結合した蛍光色素量を測定すれば、生細胞数を容易に定量できる。
ヨウ化プロピジウム含有液には、ヨウ化プロピジウム以外に細胞膜破壊剤（例えばトリトン−Ｘ）及び色素（例えばインク）を添加するのが望ましい。細胞膜破壊剤は細胞膜を破壊してDNAをヨウ化プロピジウムと反応しやすくするものであり、色素は未反応のヨウ化プロピジウムの蛍光を減量せしめることによりバックグランドとなる蛍光量を低下させるものである。好ましいヨウ化プロピジウム含有液は、ヨウ化プロビジウム約３〜15重量％（好ましくは５〜10重量％）を含有し、トリトン−Ｘ及びバックグランド蛍光量を５％以下とする量のインクを含有するEDTA水溶液である。
ヨウ化プロピジウム含有液を添加後、遠心（例えば1000rpm、５分）して細胞沈渣をつくり、37℃、約30分間静置後蛍光色素量を測定するのが好ましい。蛍光色素量の測定には顕微光度計を用いるのが好ましい。
得られた蛍光色素量を例えば次式の如くしてIL−２非添加群と比較することにより、IL−２反応性（SI）を算出することができる。
〔作用及び発明の効果〕
本発明によれば、リンパ球のIL−２反応性を簡便な操作で、迅速かつ正確に測定することができる。すなわち、従来のトリパンブルー法においては生細胞数を顕微鏡下に直接算定するため、煩雑であるばかりでなく熟練者が長時間を要し、大量の検体を処理することは困難であったが、本発明方法では蛍光光学計を用い、通常の病院等でも大量の検体を迅速に処理することができ、アレルギー疾患の原因抗原の検索及び病勢の把握が容易となった。
〔実施例〕
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
実施例１リンパ球の抗原特異的IL−２反応性の測定 ヒト末梢血より比重遠心法〔Scand.J.Clin.Lab.Invest.,21,51（1968）〕にて分離した単核細胞（１×106/ml）に抗原〔ダニ抗原（Df,10μg/ml,鳥居薬品）〕を加え、5mlの培養チューブ（Falcon）を用いて10％ヒトプールAB血清加RPMI1640培地にて、10％CO2条件下5.5日間培養した。培養後再度細胞数を２×105/150μ■／穴に調整した後、組み換えIL−２（武田薬品）0.1単位／穴添加し、96穴平底マイクロプレートにて前記と同様の条件で3.5日間培養した。次いでヨウ化プロピジウム含有液50μ■〔各種濃度のヨウ化プロピジウム液1.5μ■（4.9％EDTA中に1mg/mlのヨウ化プロピジウム含有液（シグマ）を希釈して使用）、トリトンＸ−100（８％v/v,和光純薬）1.5ml、各種濃度のインク（LEIZ社のdrawing inkを希釈して使用）0.1ml及びEDTA液（4.9％EDTA,pH7.0,和光純薬）7.5mlより調製〕を添加し、遠心（1000rpm,5分）し、37℃、30分間静置した後顕微光度計（ZEISS,MPM−03）を用いて各穴中の検体の蛍光を測定することにより生細胞数を定量した。その結果を図１及び図２に示す。その結果、生細胞数と蛍光色素量との間には直線的正の相関が得られ、本発明方法が生細胞数を定量するのに良好であることが判明した。また、測定光量を一定にして、染色するヨウ化プロピジウム濃度とインク濃度を変化させた時の（図１）、あるいは細胞を添加しない場合の測定蛍光色素量（バックグランド）を一定（10）にした時の（図２）測定蛍光色素量と生細胞数との関係を検討したところ、ヨウ化プロピジウム濃度を原液の２倍希釈（約７重量％）、インク濃度を1010倍希釈したとき、測定値が一定となりまたその数値が大きかった（図１及び図２）。また細胞を添加しない場合の測定蛍光色素量（バックグランド）は全体の５％以下であった。
なお、以下の実施例においてはヨウ化プロピジウム濃度を原液の２倍希釈、インク濃度を1010倍希釈とした、ヨウ化プロピジウム含有液を用いた。
実施例２リンパ球の抗原特異的IL−２反応性と添加IL−２濃度との関係 抗原としてダニ抗原（Df）の他に卵白アルブミン（OVA,100μg/ml,シグマ）及びコンカナバリンＡ（ConA,5μg/ml,シグマ）を用い、添加IL−２濃度を0.0025〜1.0単位／穴に変化させる以外は、実施例１と同様にして蛍光を測定した。そして、次式に従い、IL−２反応性（SI）を算出した。
その結果、図３から明らかなようにIL−２濃度に応じて蛍光量が増加し、0.1単位／穴にてほぼ平衡状態に達した。
よって、以下の実施例ではIL−２濃度を0.1単位／穴として行なった。
実施例３IL−２反応性とIL−２添加後の培養期間との関係 IL−２添加後の培養期間を変化させる以外は実施例１と同様にしてIL−２反応性（SI）を測定した。
その結果、IL−２添加後３日目において最大の染色色素量（IL−２反応性）を示した（図４）。よってIL−２反応性の評価はIL−２添加後３日目が適している。
実施例４アレルギー患者リンパ球におけるIL−２反応性の抗原特異性の検討 各種アレルギー患者のリンパ球を用いて、実施例１と同様にしてIL−２反応性（SI）を測定した。その結果を表１及び図５に示す。なお、抗原としては、、ダニ抗原（Df）、卵白アルブミン（OVA）、コンカナバリンＡ（ConA）及びカゼイン（α−Casein,100μg/ml,シグマ）を用いた。
また、表１には抗原特異性を示すIgE RAST値も示した。IgE RAST値は、in vitroアレルゲン検索用キット、RASTシオノギアイソトープ試薬を用いて測定した。
その結果、ConAで刺激した場合はSIが2.01±0.23（SE）（ｎ＝10）のIL−２反応性が得られた。
卵アレルギー患者末梢血リンパ球を用いてOVA刺激にて誘導されるIL−２反応性（SI）は、1.91±0.14（ｎ＝６）であった。ダニに感作されている小児気管支喘息児末梢血リンパ球を用いてDf刺激により誘導されるIL−２反応性（SI）は、1.69±0.10（ｎ＝６）であった。これに対し、健康人のリンパ球ではこれらのOVA,Dfで刺激した場合IL−２反応性は1.05±0.02（SE）（ｎ＝10）で反応の誘導は認められなかった。またダニ抗原感作のすすんでいない卵アレルギー患者の末梢血リンパ球をDfで刺激した場合にもIL−２反応性は誘導されなかった。一方卵に感作されていない気管支喘息小児ではOVAで刺激した場合IL−２反応性同様に誘導されなかった。また牛乳により症状の出現する症例においてもα−caseinで刺激した場合に得意的にIL−２反応性の誘導が認められた。よって特異抗原刺激リンパ球において誘導されるIL−２反応性は本発明方法で測定した場合、抗原特異的である。
比較例トリパンブルー法を用いたリンパ球のIL−２反応性の測定 比重遠心法にて分離した単核細胞（１×106/ml）に100μg/mlのOVAあるいは10μg/ml Dfを添加し、5mlの培養チューブを用いて10％ヒトプールAB血清加RPMI1640にて５日間培養後、再度細胞数を２×105/0.2mlに調製したのち、組み換えIL−２（武田）を添加し、96穴平底マイクロプレート（ヌンク）にて３日間培養後、測定直前に１％トリパンブルー50μ■を添加し、よく撹拌後顕微鏡下に生細胞数を血算板にて算定した（生細胞数の比率は90％以上）。IL−２反応性の評価として、IL−２非添加群との比率をSIとして求めた。
同一の検体について、本発明方法（実施例１の方法）とトリパンブルー法にてIL−２反応性を求めた結果を、図６に示す。その結果、本発明方法とトリパンブルー法とはその値がよく一致した。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１においてヨウ化プロピジウム（PI）及びインク（ink）の濃度を変化させた場合の生細胞数と蛍光色素量との関係を示す図面である。図２は実施例１において、細胞を添加しない場合の測定蛍光色素量（バックグランド）を一定（10）にしたときの生細胞数と蛍光色素量との関係を示す図面である。図３は添加IL−２濃度とIL−２反応性（SI）との関係を示す図面である。図４はIL−２添加後の培養時間とIL−２反応性（SI）との関係を示す図面である。図５はアレルギー患者（●）又は健常人（○）由来リンパ球のIL−２反応性（SI）を示す図面である。図６は本発明方法とトリパンブルー法との相関性を示す図面である。
〔産業上の利用分野〕
本発明はアレルギー性疾患における原因抗原の検索や病勢の指標として有用なリンパ球の抗原特異的インターロイキン−２反応性を簡便かつ迅速に測定する方法に関する。
〔従来の技術〕
IgEを主体とする即時型（Ｉ型）アレルギー反応系あるいはＴ細胞から分泌されるサイトカインによって惹起される遅延型（IV型）過敏反応系は、抗原刺激によって活性化されたＴ細胞を介して行なわれる。すなわち、抗原提示細胞により活性化されたＴ細胞は、インターロイキン−２（以下IL−２という）を吸収することによって増殖し、IgE産生細胞の分化増殖を促進するIL4、IL5などのリンホカインを分泌する。また活性化Ｔ細胞は、IgEを結合することによって脱顆粒をひきおこし即時型アレルギー反応の原因となる肥満細胞の増殖を促進するIL3、IL4のリンホカインを分泌する。さらに、同様にして活性化されたＴ細胞は遅延型過敏反応におけるヘルパーＴ細胞として働き、遅延型過敏反応を誘導する。このようにアレルゲンによりIL−２を介して活性化されたＴ細胞は少なくともＩ型あるいはIV型アレルギー反応を促進すると考えられている。
一方、臨床的に観ても、アレルギー患者のリンパ球のIL−２反応性は抗原に特異的であることが知られている。すなわち、例えば卵白アルブミンを原因抗原とする患者のリンパ球は、卵白アルブミンで刺激した場合のみIL−２反応性が誘導され、他の抗原で刺激した場合にはIL−２反応性は誘導されない。
またリンパ球のIL−２反応性はアレルギー性患者の病勢とも深い関わりを有している。すなわち、アレルギー疾患患者が自然治癒していくに従ってその患者のリンパ球のIL−２反応性が減衰していくことから、リンパ球のIL−２反応性を測定することはアレルギー患者の病勢を把握し、治療指針を企図するうえでも極めて重要である〔臨床免疫,19（Suppl.12）,170（1987），アレルギー,36,1075（1987）等〕。
このようにアレルギー性疾患における原因抗原の検索や病勢の指標として有用なリンパ球のIL−２反応性の測定法としては、被検リンパ球に抗原を反応させ、次いで該反応液をIL−２を加えて培養し、これにトリパンブルーを加えて生細胞数を血算板を用いて算定する方法があった（トリパンブルー法）〔アレルギー,36,1075（1987）等〕。
〔発明が解決しようとする課題〕
しかしながら、従来のトリパンブルー法は顕微鏡下で染色された細胞と非染色細胞を分別して生細胞数を算定する方法であることから、その測定には長時間を要し、操作が煩雑であり、かつ大量の検体を処理することができないという欠点があった。
従って、簡便かつ迅速なリンパ球の抗原特異的IL−２反応性の測定法の開発が望まれていた。
〔課題を解決するための手段〕
かかる実情において、本発明者は種々研究を重ねた結果、リンパ球、抗原及びIL−２を一定時間反応させた後の生細胞数を、蛍光色素であるヨウ化プロピジウムを利用して蛍光色素量として定量すれば、リンパ球の抗原特異的IL−２反応性が簡便、迅速かつ正確に測定できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は被検リンパ球に抗原を反応させ、次いで該反応液にIL−２を加えて３〜４日間培養し、さらにヨウ化プロピジウム含有液を加えた後該培養液の蛍光色素量を測定することを特徴とする、リンパ球の抗原特異的IL−２反応性の測定法を提供するものである。
本発明を実施するには、まず被検リンパ球に抗原を反応させるが、用いられるリンパ球としてはヒト末梢血リンパ球、特に単核球画分が好ましい。反応させる抗原としては、アレルギー性疾患患者の原因抗原が判明している場合には、その原因抗原を用いればよい。一方、原因抗原が不明の場合には、種々のアレルゲンが用いられる。通常用いられるアレルゲンとしては、卵白アルブミン（OVA）、カゼイン、ダニ抗原、スギ花粉抗原、ブタクサ抗原、ハウスダスト等が挙げられる。被検リンパ球と抗原との反応は、通常被検リンパ球をヒト保存AB血清含有RPMI1640培地等の培地に加え、これに抗原を添加して37℃で５〜６日間培養することにより行なう。
次に該反応液にIL−２を加えて３〜４日間培養する。ここで用いられるIL−２としては、ヒトから抽出されたものでもよいが遺伝子組み換えIL−２（ｒ−IL−２）を用いてもよい。IL−２の添加量は、リンパ球に対するIL−２の反応性がリンパ球２×105個当り0.1単位で平衡に達するため、これ以上が好ましい。IL−２添加後の培養は、リンパ球に対するIL−２の反応性が培養３日目にピークとなるので、37℃３日間余とするのが好ましい。
次に培養液にヨウ化プロピジウム含有液を加えた後、該培養液の蛍光色素量を測定する。本発明において用いるヨウ化プロピジウムは、蛍光色素であり、２本鎖DNAに特異的に結合し、１本鎖DNAには結合しないという特性を有する。一方、生細胞のDNAの多くは２本鎖であるが、死細胞ではそのほとんどが１本鎖DNAとなっている。従って、２本鎖DNAに結合した蛍光色素量を測定すれば、生細胞数を容易に定量できる。
ヨウ化プロピジウム含有液には、ヨウ化プロピジウム以外に細胞膜破壊剤（例えばトリトン−Ｘ）及び色素（例えばインク）を添加するのが望ましい。細胞膜破壊剤は細胞膜を破壊してDNAをヨウ化プロピジウムと反応しやすくするものであり、色素は未反応のヨウ化プロピジウムの蛍光を減量せしめることによりバックグランドとなる蛍光量を低下させるものである。好ましいヨウ化プロピジウム含有液は、ヨウ化プロビジウム約３〜15重量％（好ましくは５〜10重量％）を含有し、トリトン−Ｘ及びバックグランド蛍光量を５％以下とする量のインクを含有するEDTA水溶液である。
ヨウ化プロピジウム含有液を添加後、遠心（例えば1000rpm、５分）して細胞沈渣をつくり、37℃、約30分間静置後蛍光色素量を測定するのが好ましい。蛍光色素量の測定には顕微光度計を用いるのが好ましい。
得られた蛍光色素量を例えば次式の如くしてIL−２非添加群と比較することにより、IL−２反応性（SI）を算出することができる。
〔作用及び発明の効果〕
本発明によれば、リンパ球のIL−２反応性を簡便な操作で、迅速かつ正確に測定することができる。すなわち、従来のトリパンブルー法においては生細胞数を顕微鏡下に直接算定するため、煩雑であるばかりでなく熟練者が長時間を要し、大量の検体を処理することは困難であったが、本発明方法では蛍光光学計を用い、通常の病院等でも大量の検体を迅速に処理することができ、アレルギー疾患の原因抗原の検索及び病勢の把握が容易となった。
〔実施例〕
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
実施例１リンパ球の抗原特異的IL−２反応性の測定 ヒト末梢血より比重遠心法〔Scand.J.Clin.Lab.Invest.,21,51（1968）〕にて分離した単核細胞（１×106/ml）に抗原〔ダニ抗原（Df,10μg/ml,鳥居薬品）〕を加え、5mlの培養チューブ（Falcon）を用いて10％ヒトプールAB血清加RPMI1640培地にて、10％CO2条件下5.5日間培養した。培養後再度細胞数を２×105/150μ
なお、以下の実施例においてはヨウ化プロピジウム濃度を原液の２倍希釈、インク濃度を1010倍希釈とした、ヨウ化プロピジウム含有液を用いた。
実施例２リンパ球の抗原特異的IL−２反応性と添加IL−２濃度との関係 抗原としてダニ抗原（Df）の他に卵白アルブミン（OVA,100μg/ml,シグマ）及びコンカナバリンＡ（ConA,5μg/ml,シグマ）を用い、添加IL−２濃度を0.0025〜1.0単位／穴に変化させる以外は、実施例１と同様にして蛍光を測定した。そして、次式に従い、IL−２反応性（SI）を算出した。
その結果、図３から明らかなようにIL−２濃度に応じて蛍光量が増加し、0.1単位／穴にてほぼ平衡状態に達した。
よって、以下の実施例ではIL−２濃度を0.1単位／穴として行なった。
実施例３IL−２反応性とIL−２添加後の培養期間との関係 IL−２添加後の培養期間を変化させる以外は実施例１と同様にしてIL−２反応性（SI）を測定した。
その結果、IL−２添加後３日目において最大の染色色素量（IL−２反応性）を示した（図４）。よってIL−２反応性の評価はIL−２添加後３日目が適している。
実施例４アレルギー患者リンパ球におけるIL−２反応性の抗原特異性の検討 各種アレルギー患者のリンパ球を用いて、実施例１と同様にしてIL−２反応性（SI）を測定した。その結果を表１及び図５に示す。なお、抗原としては、、ダニ抗原（Df）、卵白アルブミン（OVA）、コンカナバリンＡ（ConA）及びカゼイン（α−Casein,100μg/ml,シグマ）を用いた。
また、表１には抗原特異性を示すIgE RAST値も示した。IgE RAST値は、in vitroアレルゲン検索用キット、RASTシオノギアイソトープ試薬を用いて測定した。
その結果、ConAで刺激した場合はSIが2.01±0.23（SE）（ｎ＝10）のIL−２反応性が得られた。
卵アレルギー患者末梢血リンパ球を用いてOVA刺激にて誘導されるIL−２反応性（SI）は、1.91±0.14（ｎ＝６）であった。ダニに感作されている小児気管支喘息児末梢血リンパ球を用いてDf刺激により誘導されるIL−２反応性（SI）は、1.69±0.10（ｎ＝６）であった。これに対し、健康人のリンパ球ではこれらのOVA,Dfで刺激した場合IL−２反応性は1.05±0.02（SE）（ｎ＝10）で反応の誘導は認められなかった。またダニ抗原感作のすすんでいない卵アレルギー患者の末梢血リンパ球をDfで刺激した場合にもIL−２反応性は誘導されなかった。一方卵に感作されていない気管支喘息小児ではOVAで刺激した場合IL−２反応性同様に誘導されなかった。また牛乳により症状の出現する症例においてもα−caseinで刺激した場合に得意的にIL−２反応性の誘導が認められた。よって特異抗原刺激リンパ球において誘導されるIL−２反応性は本発明方法で測定した場合、抗原特異的である。
比較例トリパンブルー法を用いたリンパ球のIL−２反応性の測定 比重遠心法にて分離した単核細胞（１×106/ml）に100μg/mlのOVAあるいは10μg/ml Dfを添加し、5mlの培養チューブを用いて10％ヒトプールAB血清加RPMI1640にて５日間培養後、再度細胞数を２×105/0.2mlに調製したのち、組み換えIL−２（武田）を添加し、96穴平底マイクロプレート（ヌンク）にて３日間培養後、測定直前に１％トリパンブルー50μ
同一の検体について、本発明方法（実施例１の方法）とトリパンブルー法にてIL−２反応性を求めた結果を、図６に示す。その結果、本発明方法とトリパンブルー法とはその値がよく一致した。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１においてヨウ化プロピジウム（PI）及びインク（ink）の濃度を変化させた場合の生細胞数と蛍光色素量との関係を示す図面である。図２は実施例１において、細胞を添加しない場合の測定蛍光色素量（バックグランド）を一定（10）にしたときの生細胞数と蛍光色素量との関係を示す図面である。図３は添加IL−２濃度とIL−２反応性（SI）との関係を示す図面である。図４はIL−２添加後の培養時間とIL−２反応性（SI）との関係を示す図面である。図５はアレルギー患者（●）又は健常人（○）由来リンパ球のIL−２反応性（SI）を示す図面である。図６は本発明方法とトリパンブルー法との相関性を示す図面である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】被検リンパ球に抗原を反応させ、次いで該反応液にインターロイキン−２を加えて３〜４日間培養し、さらに細胞膜破壊剤及びヨウ化プロピジウム含有液を加えた後該培養系の蛍光色素量を測定することを特徴とする、リンパ球の抗原特異的インターロイキン−２反応性の測定法。
【請求項２】ヨウ化プロピジウム含有液添加後遠心して培養細胞を沈めたのち、得られた培養液を約30分間静置した後蛍光色素量を測定するものである請求項１記載のリンパ球の抗原特異的インターロイキン−２反応性の測定法。
【請求項３】インターロイキン−２の添加量が、リンパ球２×105個当り0.1単位以上である請求項１記載のリンパ球の抗原特異的インターロイキン−２反応性の測定法。
【請求項１】被検リンパ球に抗原を反応させ、次いで該反応液にインターロイキン−２を加えて３〜４日間培養し、さらに細胞膜破壊剤及びヨウ化プロピジウム含有液を加えた後該培養系の蛍光色素量を測定することを特徴とする、リンパ球の抗原特異的インターロイキン−２反応性の測定法。
【請求項２】ヨウ化プロピジウム含有液添加後遠心して培養細胞を沈めたのち、得られた培養液を約30分間静置した後蛍光色素量を測定するものである請求項１記載のリンパ球の抗原特異的インターロイキン−２反応性の測定法。
【請求項３】インターロイキン−２の添加量が、リンパ球２×105個当り0.1単位以上である請求項１記載のリンパ球の抗原特異的インターロイキン−２反応性の測定法。
【第１図】
【第２図】
【第３図】
【第４図】
【第５図】
【第６図】
【第２図】
【第３図】
【第４図】
【第５図】
【第６図】
【特許番号】第２５６１１７０号
【登録日】平成８年（１９９６）９月１９日
【発行日】平成８年（１９９６）１２月４日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平２−１８６１６３
【出願日】平成２年（１９９０）７月１３日
【公開番号】特開平４−７２５６３
【公開日】平成４年（１９９２）３月６日
【出願人】（９９９９９９９９９）
【参考文献】
【文献】特開 平１−２１０８６３（ＪＰ，Ａ）
【文献】アレルギー、３６［１２］（１９８７）野間他Ｐ．１０７５−１０８５
【登録日】平成８年（１９９６）９月１９日
【発行日】平成８年（１９９６）１２月４日
【国際特許分類】
【出願日】平成２年（１９９０）７月１３日
【公開番号】特開平４−７２５６３
【公開日】平成４年（１９９２）３月６日
【出願人】（９９９９９９９９９）
【参考文献】
【文献】特開 平１−２１０８６３（ＪＰ，Ａ）
【文献】アレルギー、３６［１２］（１９８７）野間他Ｐ．１０７５−１０８５
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