光走査型顕微鏡およびそれの使用
【課題】少なくとも２つの照明チャネルへのレーザ光の可変的分割のための装置が装備されていて、同じまたは異なった試料領域へ試料に対して共通の照明が行われる、少なくとも１つの照明モジュールを有する光走査型顕微鏡。
【解決手段】光学素子による制限なくフレキシブルな光源の分割、偏光ビームスプリッタ２４、前置接続された回転可能なλ／２板または個々のレーザ別に偏光の回転を可能にするその他素子（液晶、ポッケルセル、ファラデー回転子…）による、光源の２光路への分割
【解決手段】光学素子による制限なくフレキシブルな光源の分割、偏光ビームスプリッタ２４、前置接続された回転可能なλ／２板または個々のレーザ別に偏光の回転を可能にするその他素子（液晶、ポッケルセル、ファラデー回転子…）による、光源の２光路への分割
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００１】
発明の作用態様および長所の説明
２つまたはそれ以上の走査モジュールの本発明に基づく使用は、特に次の方法の組み合わせには有意である（列挙された文献はいずれも、共用レーザモジュールとの組み合わせシステムについて明確に特徴付けしている。それは、単独システムに比べてコスト、再現性およびフレキシビリティが明らかに最適化されるとしているからである）:
【０００２】
１. 撮像／迅速走査における方法の組み合せ（例えば、高分解性の点像スキャナおよび迅速型ディスクスキャナ）
Ｅｇｎｅｒ他がＪ． Ｍｉｃｒｏｓｃ． ２００２、２０６巻、２４〜３２ページでスピニングディスクとマルチフォーカル多光点顕微鏡の効率および分解能を比較している。プレパラートの如何によるが、両システムとも有意としている。
ＳｔｅｐｈｅｎｓおよびＡｌｌａｎ他が、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３、第３００巻、８２〜８６ページに生体細胞撮影用の様々な光学顕微鏡および共焦点顕微鏡の技術的長所を記述している。高価値システムの場合、検出方法に違いがあるものの殆どの場合光源としてレーザが使用されている。
【０００３】
２. 撮影／マニピュレーションにおける方法の組み合せ（例えば、アンケージング／ＮＬＯのためのＵＶ結合）
Ｋｎｉｇｈｔ他が、Ａｍ Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２００３、第２８４巻C、１０８３〜１０８９ページにレーザによる光活性化のもとでのＣａ２＋撮影のことを記述している。レーザは撮像にも利用できるとしている。
Ｄｅｎｋが、Ｊ． Ｎｅｕｒｉｓｃ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９７、第７２巻、３９〜４２ページに薬剤遊離用としてパルス化した水銀蒸気灯の使用について記述している。ここではレーザが利用されていて、位置設定および効率の点で明白な改良が得られるとしている。
ＷａｎｇおよびＡｕｇｕｓｔｉｎｅが、Ｎｅｕｒｏｎ １９９５、第１５巻、７５５〜７６０ページにレーザ光による薬剤の局部遊離を伴う迅速Ca２+撮影のことを記述している。レーザは撮像にも利用できるとしている。
【０００４】
３. 撮影／分光法ＦＣＳにおける方法の組み合せ（同じVISレーザの使用）
Ｑｕｉｎｇ他が、Ａｐｐｌ． Ｏｐｔ． ２００３、第４２巻、２９８７〜２９９４ページに水中ＦＣＳによる細菌検査のことを記述している。レーザは画像生成成分もFCS成分も供給するとしている。
Ｂｉｇｅｌｏｗ他が、Ｏｐｔ． Ｌｅｔｔ． ２００３、第２８巻、６９５〜６９７ページにコンフォカール蛍光分光法、蛍光異方性法による腫瘍細胞の検査について記述している。レーザは画像生成成分も分光法成分も供給するとしている。
【０００５】
４. 複数顕微鏡装置での平行的撮像（同一パルスＮＩＲレーザの使用）
ＭｃＬｅｌｌａｎ他が、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃ． ２００３、第２３巻２２１２〜２２１７ページにアミロイド斑表示のための生体内多光子顕微鏡法の適用について記述している。顕微鏡構造は特に動物モデル用として適合化されている。複数台数とレーザとの共同使用で検出量は明らかに増大するとしている。
Ｚｉｐｆｅｌ他が、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００３、第１００巻、７０７５〜７０８０ページに多光子顕微鏡法およびSHG顕微鏡法による生体組織内の自家蛍光検査について記述している。顕微鏡構成は特殊適合化されていてあまり汎用タイプではない。第２構造によりフレキシビリティが増すとしている。
【０００６】
５. 共焦点顕微鏡法とＴＩＲＦ顕微鏡法の組み合せ
ＰｏｌｌａｒｄおよびＡｐｐｓが、Ａｎｎ． Ｎ. Ｙ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ２００２、第９７１巻、６１７〜６１９ページにＴＩＲＦ顕微鏡法によるエキソサイトーシスおよびイオン運搬についての検査のための新技術のことを記述している。
ＲｕｃｋｓｔｕｈｌおよびＳｅｅｇｅｒが、Ａｐｐｌ． Ｏｐｔ． ２００３、第４２巻、３２７７〜３２８３ページにＴＩＲＦ顕微鏡法の新型ミラー対物レンズによるナノ粒子および分子の共焦点、分光法検査について記述している。特殊な光学系であり、あまり汎用タイプの構造ではない。第２撮像構造によりフレキシビリティが増すとしている。
Ｔｓｕｂｏｉ他が、Ｂｉｏｐｈｙｓ. Ｊ． ２００２、第８３巻、１７２〜１８３ページにレーザ顕微鏡強制法およびＴＩＲＦ顕微鏡法による内分泌細胞の検査について記述している。撮影用レーザはTIRF励起にも利用できるとしている。
【０００７】
この関係の中で、レーザモジュールにおける光路はそれぞれ、使用照明モジュール間で無段の／可変的なビーム分割が可能になるように形成することが有利であるし、あるいは必要でさえある。装置費用の引き下げおよびそれによるコスト節減には、レーザモジュールの使用台数を１台に限定するのが有意である。
【０００８】
可変的なビーム分割型式は、光源の個別波長または波長領域を、その他の波長に影響を与えることなく様々な光路に接続させて、同時に個別にラインの選択およびビームの減衰を確保するという目的に寄与している。これは以下のような様々な方法で行うことができる :
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１. 光学素子による、少なくとも２つに分離された光路への光源の分割。光学素子における分割比はアプリケーションの要求に対して制限なくフレキシブルに適合させることができる。その場合、両光路には方法の組み合せ１〜４の１つが適用される、あるいはそれに代わり、保有レーザ出力をアプリケーションの要求に適合させるため、
ａ．少なくとも１つのファイバ結合により、
ｂ．レーザ線別の選択的ビーム減衰のための少なくとも１つのＡＯＴＦにより
１つの光路を光の落降方向へ誘導する。
【００１０】
２. 偏光ビームスプリッタ、前置接続された回転可能なλ／２板または個々のレーザ別に偏光の回転を可能にするその他素子（液晶、ポッケルセル、ファラデー回転子…）による、光源の２光路への分割。λ／２板を通じて準無段に設定可能なEベクトルの方位（必要な場合は各レーザ別）により、偏光ビームスプリッタにおける分割比は準無段に調整可能であり、したがって、
ａ．少なくとも１つのファイバ結合により、
ｂ．レーザ線別の選択的ビーム減衰のための少なくとも１つのＡＯＴＦにより
アプリケーションの要求にフレキシブルに適合させることができる。
【００１１】
３. その反射特性または透過特性が手動式または動力式傾倒によって変更される１つまたは複数のダイクロイックビームスプリッタにより行なわれる、光源の２光路への分割。
シフト式の実施を構想とする、角度変更（例えば、４５°から５０°）がスペクトル特性に変化をもたらす。それは、シフト式（ファブリー・ペロ干渉計にほぼ一致）では波長に変化が生じるからである。それにより、建設的または破壊的な干渉領域も移動するが可変的に調整可能であり、したがって分割比は、
ａ．少なくとも１つのファイバ結合により、
ｂ．レーザ線別の選択的ビーム減衰のための少なくとも１つのＡＯＴＦにより
アプリケーションの要求にフレキシブルに適合させることができる。
【００１２】
４. 音響光学素子またはその他回折素子による、光源の２光路への分割。その場合、回折効率は次数０との比率で次数（+）１または（-）１に可変的に調整することができ、したがって次数０と次数（+）１または（-）１間の分割比は、
ａ．少なくとも１つのファイバ結合により、
ｂ．レーザ線別の選択的ビーム減衰のための少なくとも１つのＡＯＴＦにより
アプリケーションの要求にフレキシブルに適合させることができる。
【００１３】
５. 迅速に切換可能なミラーによる、光源の２光路への分割。その場合、切換頻度は撮像速度相応の範囲内とする。さらに、個別光路へ送られるエネルギーに影響を与えるため、ミラーの切換頻度に同期させた迅速切換可能なビーム減衰装置を液晶フィルタを通じて各レーザ用に統合させることができる。
【００１４】
６. 上記５と同様であるが、ビーム減衰装置をレーザに後続配置して、音響光学素子またはその他回折構成素子により行う光源分割。
【発明の効果】
【００１５】
方法１〜４の長所は、光路切換時に部品を動かす必要なく、したがって構成体の動力学的性能が完全に維持されるところにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
図面に基づく説明
以下では図１〜４を手掛かりにライン走査式ＲＴ（リアルタイム）スキャナについて詳細に説明する。
図１は、主要部が５つのコンポーネント、すなわち、レーザ走査型顕微鏡検査のための励起光を生成する光源モジュール２、励起光をコリメートして試料上の走査のため然るべき偏向を行なう走査モジュール３、走査モジュールによって用意された走査ビームを顕微鏡光路内で試料の方向に向ける顕微鏡モジュール４および試料からの光線を受け止め検出する検出モジュール５から成るレーザ走査型顕微鏡１の模式図である。その場合検出モジュール５は、図１に描かれているように、スペクトル別のマルチチャネル型に構成することができる。
点状走査式のレーザ走査型顕微鏡に関する一般事項についてはＤＥ １９７０２７５３Ａ１が参考になり、したがってその内容は本明細書の構成部分でもある。
【００１７】
光源モジュール２は、レーザ走査型顕微鏡検査に適した照明光、したがって特に蛍光を誘起し得るビームを生成する。適用法に対応させるため、光源モジュールは当目的用に複数の光源を有している。図示された実施態様では光源モジュール２に２つのレーザ６および７が配備されている。それらの後にはそれぞれ光バルブ８および減衰器９が接続されており、それらはビームを結合ポイント１０を通じて光ファイバ１１に連結させている。光バルブ８は、レーザユニット６または７のレーザ自体の作動を遮断しなくてもビームを遮断させることのできるビーム偏向器として機能する。光バルブ８は、例えば、ビーム遮断のためレーザビームを光ファイバ１１へ連結する手前で、図示されていない光の落下方向に偏向させるＡＯＴＦ（音響光学フィルタ）として形成されている。
【００１８】
図１のモデル例では、レーザユニット６は３つのレーザＢ、Ｃ、Ｄを有しているが、それに対しレーザユニット７はレーザＡを１つ持つのみである。したがって、図の６と７は単一波長用レーザと多種波長用レーザの組み合せモデルであり、個別に、または共同で１つまたは複数のファイバに連結されている。複数ファイバを通じてビームを同時連結することも可能であるが、その場合ではビームは後に、すなわち適合光学系の通過後にカラー結合器によって混合される。このようにして、励起光用に種々様々な波長または波長領域を使用することができる。
光ファイバ１１に通されたビームは、移動式のコリメーション光学系１２および１３によりビーム結合ミラー１４,１５を通じて合一化され、ビーム形成ユニット内でビームの特性が変更される。
【００１９】
コリメータ１２、１３は、光源モジュール２から走査モジュール３へ送られるビームが無限大光路にコリメートされるように作用する。これはそれぞれ、（図には描かれていない）中央制御ユニットの制御下のもと光軸に沿って移動することでフォーカシング機能を発揮する個別レンズで行うのが有利である。コリメータ１２、１３とそれぞれの光ファイバ末端との距離は変更可能なようになっている。
【００２０】
ビーム形成ユニットについては後にさらに詳しく説明するが、これは、ビーム結合ミラー１４、１５の後方に位置する回転対称なガウス型プロフィールのレーザビームから、もはや回転対称でない、長方形型照明フィールドの形成に適した横断面を持つ線形ビームを生成する。
線形ビームとも言われるこの照明光は、励起光として用いられ、メインカラースプリッタ１７を通じてスキャナ１８に誘導される。メインカラースプリッタについては後ほど詳しく述べるので、ここでは顕微鏡モジュール４から戻ってきた試料光を励起光から分離させる機能を持つことだけを指摘しておく。
【００２１】
スキャナ１８は線形ビームを１軸または２軸方向に偏向させるので、ビームは走査対物レンズ１９および顕微鏡モジュール４の鏡筒レンズ、対物レンズを通って、プレパラートまたは試料内にある焦点２２に集束する。その場合光学結像は、試料が励起光により焦点で照明されるように行なわれる。
線形フォーカスで励起されたこのような蛍光ビームは、顕微鏡モジュール４の対物レンズ、鏡筒レンズおよび走査対物レンズ１９を通ってスキャナ１８に戻るので、スキャナ１８に向かっての戻り過程の方向では再び定常ビームになっている。したがって、スキャナ１８は蛍光ビームをデスキャンするとも言われる。
【００２２】
メインカラースプリッタ１７は、励起光とは別な波長領域にある蛍光ビームを通すことができるので、蛍光ビームは検出モジュール５の転向ミラー２４で転向させた後分析することができる。検出モジュール５は、図１の実施態様では複数のスペクトルチャネルを有している。すなわち、転向ミラー２４のほうから来た蛍光ビームはサブカラースプリッタ２５により２つのスペクトルチャネルに分割される。
【００２３】
各スペクトルチャネルは、試料２３に対して共焦点結合あるいは部分共焦点結合を実現するスリット絞り２６を有しており、その大きさがビームの検出を可能にする焦点深度を決定する。したがって、スリット絞り２６の幾何学構造は、蛍光ビームの検出がなされる（厚みのある）プレパラート内の切断面を決定づける。
スリット絞り２６の後方には、さらに検出モジュール５に到達した歓迎されざる励起光をブロックするためのブロックフィルタ２７が配置されている。特定深度の切断面に由来する、このように分離され扇形に広がった線形ビームは、次に然るべき検出器２８によって分析される。上記のカラーチャネルと同様に、スリット絞り２６a、ブロックフィルタ２７aおよび検出器２８aを持つ第２スペクトル検出チャネルも構成されている。
【００２４】
検出モジュール５における共焦点スリット開口の使用はモデル例に過ぎない。もちろん、単点型スキャナの実現も可能である。その場合ではスリット絞り２６、２６aはホール型絞りに代えられ、ビーム形成ユニットは省くことができる。因みに、そのような構造様式にはすべての光学系が回転対称に構成される。もちろん、単点式の走査および検出に代えて、後に図３および４を手掛かりに改めて説明する点雲形式またはニポーディスク形式のコンセプトなど、原則として任意の多点型装置を使用することもできる。ただし、スキャナの通過時には複数の試料点が平行して捕捉されるので、検出器２８はスポット分解能を有していることが重要である。
【００２５】
図１から分かるように、可動式、すなわち移動可能なコリメータ１２および１３の後方にあるガウス光線束はビーム結合ミラー１４、１５形式のステップ型ミラーを通じて合一化され、続いて、図示された共焦点スリット絞り付き構造様式の場合では、長方形の横断面を持つ光線束に変換される。図１の実施例では、ビーム形成ユニット内には円筒型テレスコープ３７が使用されていて、その後ろには非球面ユニット３８、さらに円筒型光学系３９が配置されている。
【００２６】
ビーム変形後では、ビームはプロフィール平面にはほぼ長方形のフィールドを照らし出す。その場合フィールドの長軸に沿った強度分布はガウス形ではなくボックス形である。
非球面ユニット３８を持つ照明装置は、鏡筒レンズと対物レンズ間にあるひとみを均一充填させるのに用いられる。それによって、対物レンズの光学分解能を完全に発揮させることができる。したがって、このバリエーション法は単点走査式または多点走査式の顕微鏡システム、例えばライン走査システムにも有用である（後者の場合、当該軸に加えそれ以外にも、試料上または試料中にフォーカシングされる）。
【００２７】
例えば線形に整えられた励起光がメインカラースプリッタ１７の方向に偏向される。当カラースプリッタは、好ましい実施態様では分割ミラーとして、つまり本発明でもその内容を包括的に取り入れているＤＥ
１０２５７２３７ Ａ１記載のスペクトル中性な分割ミラーとして形成されている。したがって、「カラースプリッタ」の概念には非スペクトル的に作用する分割システムの意が含まれている。記述のスペクトル非依存型カラースプリッタの代わりに、均一型中性スプリッタ（例えば５０／５０、７０／３０、８０／２０タイプなど）またはダイクロイックスプリッタを使用することができる。それにより、適用別に選択することが可能になるので、メインカラースプリッタとしては、交換可能な個別スプリッタを含む、例えば然るべきスプリッタ切換ダイヤルにより簡易交換のできる機構の備わっているのが好ましい。
【００２８】
例えば、反射、ストークス／反ストークスラマン分光法、高次数のコヒーレントラマンプロセスや、第２高調波発生、第３高調波発生、和周波混合発生などの一般的パラメトリック非線光学プロセス、２光子、多光子吸収および蛍光におけるコヒーレントビーム、すなわち特に方向づけられたビームを検出すべき場合はダイクロイックメインカラースプリッタが有利である。これらの方法のうち、非線光学分光法のいくつかは、コリニヤ重畳をなす２つまたはそれ以上のレーザビームの使用を必要とする。この場合、図示されているような複数レーザビームの結合が特に有利であると実証されている。原則的には、蛍光顕微鏡検査で広く普及しているダイクロイックビームスプリッタであれば使用可能である。また、ラマン顕微鏡検査には、レイリー散乱成分の抑制のため検出器の前にホログラフィックノッチ・スプリッタまたはフィルタを設置するのが有利である。
【００２９】
図１の実施態様では、励起光または照明光はモータ制御式ズーム光学系４１を通じてスキャナ１８に送り込まれる。ズーム倍率は当方式で適合化させることができ、走査される視野は特定の調整領域内で連続的に変更することができる。ズーム光学系としては、連続的同調過程における焦点位置および結像倍率の適合化のあいだ、ひとみ位置が維持されたままであるようなタイプが特に有利である。
図１に矢印で示されたモータによるズーム光学系４１の自由移動度は、結像倍率、焦点位置、ひとみ位置の３つのパラメータの適合化に想定されている自由度の数値に精確に一致している。その出力側のひとみに固定式絞り４２の配置されたズーム光学系４１が特に好ましい。絞り４２を実地で簡単に実現するには、スキャナ１８鏡面幅の制限によって構成することもできる。
【００３０】
ズーム光学系４１を持つ出力側絞り４２により、ズーム倍率の設定如何に拘わらず常に一定したひとみ直径を走査対物レンズ１９上に結像させることが可能になる。このように、ズーム光学系４１を任意に設定した場合でも対物レンズのひとみは依然として完全に照らし出されたままである。スキャナ１８領域での願わしくない散乱光発生事態の阻止には独自型絞り４２の使用が好ましい。ズーム光学系４１と共同作用をする円筒型テレスコープ３７は、同じくモータ作動式であり、非球面ユニット３８の前に配置されている。図１の実施態様ではコンパクト構造の理由からこれが選ばれているが、そのようにする必要はない。
【００３１】
ズーム倍率１.０未満が望まれる場合、円筒型テレスコープ３７は自動的に光学光路内に旋回挿入される。これは、ズーム対物レンズ４１が縮小された場合に開口絞り４２への照明が不完全になるのを防止する。したがって、旋回挿入の可能なこの円筒型テレスコープ３７により、ズーム倍率１未満の場合でも、すなわちズーム対物レンズ４１の設定の如何に拘わらず、対物レンズひとみの位置では常に一定長の照明光線の到達が保証される。それにより、単式視野ズームに比較して、照明光におけるレーザ出力損失が避けられる。
円筒型テレスコープ３７の旋回挿入時には、照明光線による画像明度の急変が避けられないので、画像明度を一定に保つため、（図には描かれていない）制御ユニットでは、円筒型テレスコープ３７が作動している場合、スキャナ１８の送出し速度または検出モジュール５における検出器の増幅係数がそれ相応に適合するような設計がなされている。
【００３２】
図１のレーザ走査型顕微鏡では、モータ作動式ズーム光学系４１およびモータにより操作切換可能な円筒型テレスコープ３７のほか、検出モジュール５でも遠隔制御可能な調整素子が設置されている。例えば、色波長誤差の補正のため、スリット絞りの前に丸型光学系４４と円筒型光学系３９が、検出器２８の直前に円筒型光学系３９が設置されており、それらはモータによりそれぞれ軸方向に移動できるようになっている。
【００３３】
加えて、補償のため補正ユニット４０が配備されているが、それについては以下に簡単に説明する。
スリット絞り２６は、前方配置の丸型光学系４４、同様に前方配置の第１円筒型光学系３９および後方配置の第２円筒型光学系と共に検出システム５のピンホール対物レンズを形成するが、この場合のピンホールはスリット絞り２６によって実現される。システム内で反射した励起光の意図しない検出を避けるため、第２円筒型レンズ３９の前にはブロックフィルタ２７も設置されており、これは求める蛍光ビームだけを検出器２８、２８aに到達させるべく、それに適したスペクトル特性を有している。
【００３４】
カラースプリッタ２５またはブロックフィルタ２７を取り換えて旋回挿入した場合、幾分かの傾斜誤差または楔角誤差が発生するのは避けられない。カラースプリッタは、試料領域とスリット絞り２６間の誤差を、ブロックフィルタ２７はスリット絞り２６と検出器２８間の誤差を持ち込む可能性がある。その場合に、スリット絞り２６または検出器２８の新たな位置調整が必要になることがないように、丸型光学系４４とスリット絞り２６の間に、すなわち試料と検出器２８間の結像光路内に、コントローラの制御下で様々な傾斜位置に設定することのできるオプチカルフラットのプレート４０が配置されている。オプチカルフラットのプレート４０は、その目的のために然るべきホルダ内に位置調整可能なように設置されている。
【００３５】
図２は、ズーム光学系４１を利用すれば提供された最大限の視野SF内で如何にしてＲＯＩ（観察対象領域）が選択できるかを示している。例えば、共振型スキャナの場合では必ず必要なことであるが、振幅に変化が起きないようにスキャナ１８を持続的に制御すれば、ズーム光学系においてセットされた１.０以上の倍率により走査フィールドＳＦの光軸を中心として選択されるＲＯＩ領域が狭められる。
共振型スキャナに関しては、例えばＰａｗｌｅｙ著“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｒｅｓｓ社１９９４年刊、４６１ページ以降に記述されている。
スキャナがフィールドを、光軸に対し、すなわち走査ミラーの定常位置に対し非対称に走査するように、スキャナの制御を行えば、ズーム作用との関連性から選定ＲＯＩ領域の補正移動ＯＦが得られる。既に触れたスキャナ１８のデスキャン作用およびズーム光学系４１の再通過により、検出器方向への検出光路における観察対象領域ＲＯＩの選択が改めて中断される。それにより、走査画像ＳＦ内のＲＯＩ領域に対し任意の選択が可能になる。様々なＲＯＩ領域の選択毎に画像を追加獲得することができ、それらを高分解性画像に合成することができる。
【００３６】
選択ＲＯＩ領域を光軸に対する補正分ＯＦだけ移動させるのでなく、それに加えて回転もさせたい場合は、メインカラースプリッタ１７と試料２３間の光路のひとみに、周知のとおり画像フィールドに対して回転作用のあるアッベ・ケーニッヒプリズムを配置した実施態様が目的に適っている。この場合も検出器方向で作業の中断を行う。
【００３７】
それにより、様々な補正シフトOFおよび様々な回転角を持つ画像が測定でき、続いて、例えば文献
“Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ; Ｉｍａｇｅ
ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ VII” Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＳＰＩＥ第３９１９巻（２０００年）、１４１〜１５０ページのＧｕｓｔａｆｓｓｏｎ，
Ｍ．著“Ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｈｅ ｌａｔｅｒａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｄｅ−ｆｉｅｌｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｕｓｉｎｇ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ”に記載されているようなアルゴリズムに従って高分解性のある画像に修正することができる。
【００３８】
図３は、ニポーディスク方式を実現するレーザ走査型顕微鏡１として考えられる別な構造様式を示している。図３では極端に簡略描画されている光源モジュールが、ミニレンズアレー６５からメインカラースプリッタ１７を通過して、例えばＵＳ
６,０２８,３０６、ＷＯ ８８ ０７６９５またはＤＥ ２３６０１９７
Ａ１に記載されているようなニポーディスク６４を照明する。ミニレンズアレー６５を通じて照明されたニポーディスクのピンホールは顕微鏡モジュール４内の試料に結像する。ここでも試料側の画像サイズを変更できるように、ズーム光学系４１が設置されている。
ニポースキャナの場合、図１の構造様式からは変更部分があり、照明はメインカラースプリッタ１７を通過させて行われ、検出光は反射分離される。さらに、ニポーディスク６４による多点照明の場合では、それに対応した平行な走査が行われるように、図２に変更を加えて検出器２８はスポット分解能を持つように作られている。
【００３９】
そのほか、ニポーディスク６４とズーム光学系４１の間には、ニポーディスク６４のピンホールを通り抜ける発散光を適当な束直径に変換させる、正の屈折力を持った然るべき固定型光学系６３が配置されている。メインカラースプリッタ１７は、図３のニポー式構造の場合では旧来型のダイクロイックビームスプリッタであり、したがってスリット状または点状の反射領域を持つ上記ビームスプリッタではない。
ズーム光学系４１は上段で説明した構造様式に対応しているが、この場合はニポーディスク６４があるため、もちろんスキャナ１８は不要になる。しかし、図２を基に説明したＲＯＩ領域の選択を行いたい場合は、これを設置することができる。同じことがアッベ・ケーニッヒプリズムについても言える。
【００４０】
多点走査による別法が模式図として図４に示されているが、その方法では複数の光源がスキャナのひとみに対して斜めに照射される。この場合でもメインカラースプリッタ１７とスキャナ１８間での結像にズーム光学系４１を使用することにより、図２に描かれたようなズーム機能を実現することができる。ひとみに共役な平面に様々な角度から光線束を同時入射することにより、光点が対象物平面に共役な平面に形成され、それがスキャナ１８により同時に対象物フィールド全体のうちの一部領域上に誘導される。スポット分解性のあるマトリックス検出器２８では部分画像全体の評価を通して画像情報が生成される。
【００４１】
その他の実施態様としては、ＵＳ ６,０２８,３０６に記載されているような多点走査があるが、その開示内容の中で関連事項は本発明に包括的に取り入れられている。ここでもスポット分解性のある検出器２８を設置することができる。その場合では試料は多点光源によって照明されるが、それは、多点光源が実現されるようにマルチ開口プレートを照明する、マイクロレンズアレーの後続配置されたビームエキスパンダによってなされる。
【００４２】
以降の図面では次の素子が描かれ、次の名称が使用されている（説明についてはＥＰ ９７７０６９Ａ１参照）。
光源としてのレーザ １〜４またはＡ〜Ｇ、
レーザビーム転向のための転向ミラー ＵＳ、
遮光装置としてのフラップまたはシャッタ Ｖ、
回転可能なλ／２板、
偏光分離器 ＰＴ、
光伝送用光ファイバ、
ファイバカップリング用のファイバ結合ポート、
減衰器 Ａ（好ましくはＡＯＴＦまたはＡＯＭ）、
ビーム検出用モニタダイオード ＭＤ、
波長別の選択的ビーム検出のための検出器 ＰＭＴ １〜３、
透過ビーム検出のための検出器 Ｔ−ＰＭＴ、
ピンホール ＰＨ １〜４、
カラースプリッタ ＤＢＳ １〜３、
ピンホールへのフォーカシング用ピンホール光学系、
メインカラースプリッタ ＭＤＢ、
放出用フィルタ ＥＦ １〜３、
波長別調整のためのコリメータ、
スキャナ、
走査光学系または走査レンズ、
接眼レンズ、
鏡筒レンズ、
ビーム結合器、
対物レンズとスキャナ間のノンデスキャン検出器、
対物レンズ、
試料、
コンデンサ、
白色光源 ＨＢＯ、
透過照明用のハロゲンランプ ＨＡＬ、
テレスコープ光学系、
ズーム光学系、
照明光生成のためのビーム生成器、
円筒型テレスコープ、
円筒型光学系、
スリット、
ライン捕捉用のスリット絞り付き検出器、
迅速切換ミラー ＳＳ、
【００４３】
図５には異なった波長を持つ４つのレーザ１〜４が描かれている。光の進行順序で言えば、それらの後にシャッタおよび回転可能なλ／２板が、直線偏光レーザビームから成る定義付けされた偏光平面の調整のために配置されている。レーザ１〜３は転向ミラーおよびダイクロイックスプリッタを通じて合一化され、レーザ４と同様ダイス型偏光ビームスプリッタに達する。その場合ダイクロイックスプリッタは、その透過特性または反射特性が偏光平面の回転に依存しないような特別な構造に作られていなければならない。
【００４４】
レーザは、偏光平面のそれぞれの調整に対応して完全に、または一部だけ透過または反射し（レーザ４は本例では他のレーザと合一化せずに直接偏光分離器に導かれる）、選択したビーム減衰器（ＡＯＴＦ）を経由して光ファイバの方向へと到る。固定λ／２板は透過ビーム（ＶＩＳ）または反射ビーム（Ｖ）の場合にＡＯＴＦにとって正しい偏光平面を設定する。
様々な顕微鏡システムに向けた光ファイバ結合ポートが配備されているが、それについては後々詳細に説明する。
【００４５】
ダイス型偏光ビームスプリッタは２つの状態しか認識しない。透過光は常に取付板に平行に偏光し、反射光は常に取付板に垂直に偏光する。レーザ偏光（直線偏光、取付板に対して垂直）に対して２２.５°の光軸を持つλ／２板をレーザの前に設置すれば、偏光面は４５°回転する。これは、偏光ビームスプリッタが５０／５０スプリッタとして作用することを意味している。別な角度であれば別な分離状況になる。例えば４５°のλ／２板では偏光面の回転は９０°になり、理論的にはダイス型偏光スプリッタでは１００％反射される。さらに、反射路（偏光分離器の位置）のＡＯＴＦで常に垂直偏光であれば、ＡＯＴＦが正しく使用されていると言える。透過路では、「入射偏光ＡＯＴＦが取付板に対して垂直」という条件を満たすためには偏光面は固定回転角９０°が必要である。λ／２板に対する減結合はダイス型偏光スプリッタによって行われる。
【００４６】
本例では走査型顕微鏡ＲＴとスキャンマニピュレータが示されていて、それぞれに対し別な波長に分割できる。
これは、個々のλ／２板の電子コード化された然るべき回転によって無段で行われる。
それにより、また複数の独立した観察システムおよび／またはマニピュレーションシステムにより非常にバリエーション豊かな作動が可能である。
【００４７】
図６にはＡＯＭクリスタルが図解されている。これは入射光、例えば波長４０５ nmのレーザビームを相互に直交する、次数０と１の２つの直線偏光ビームに分割し、それぞれを異なった光路に結合させることができる。ＡＯＭの然るべき制御により成分比は変更される。
【００４８】
図７には２つのレーザが示されていて、それらは転向ミラーとビーム結合器を通じて合一化されるが、それらの後方には次数０と１のビームに調整分割するためのＡＯＴＦ
１が配置されている。
ＡＯＴＦの１次回折成分である本来の作業ビームは、定義付けされた全スペクトル領域（例えば４５０ 〜７００ nm）に対してコリニヤの関係にある。０次成分はクリスタルのプリズム作用により分割される。したがって、当装置は特定波長にしか利用することができない（確認の必要がある）。１次数のスペクトル分割を補償する配置も当然考えられる（変形ＡＯＴＦクリスタルに相当する逆分散第２プリズム）。
次数の異なる分岐における強度は波長別に調整可能である。設定制御電圧は１次数回折強度を制御し、残りは０次数のままである。
０次数のビームと１次数のビームは別々の観察システムおよび／またはマニピュレーションシステムに誘導することができる。
分岐路に、ここでは１次数側に、新たな分割が可能である別なＡＯＴＦ ２を配備することができる。
【００４９】
図８では、別な分岐路（０次数）に同様にＡＯＴＦ ３が配備されている。例えば、ＡＯＴＦ １がこの分岐路に完全な強度を持つ波長を導入すれば、ＡＯＴＦ
３により同じく分割を行うことができる。
図９では、照明部にはレーザＡが装備されていて、その光は偏光面方位に関してはλ／２板により調整可能であり、ダイス型偏光スプリッタではそれに対応して反射または透過され、図示された光ファイバを通って調整下別々のシステムに、例えばＬＳＭ５１０およびラインスキャナＲＴに送られる。
レーザＢ〜Ｄの光は、図１と同様に合一化されるが、それぞれその前にλ／２板を通じて偏光面の方位が調整される。
光は偏光分離器において反射または透過して、それぞれ光ファイバを通じてラインスキャナＲＴまたはレーザＥ〜Ｇを持つ別な照明モジュールに到達する。
【００５０】
レーザＥ〜Ｇの照明光路への連結は、例えば、当光路の接続、遮断を交互に行う迅速切換ミラーＳＳを通じてなされる。
切換ミラーは、反射セグメントと透過セグメントが交互に切換るダイヤルにすることもできる。
合一化のための固定式ビームスプリッタも同様に考えられる。
このように、レーザＢ〜Ｄの光はこの結合部によりレーザＥ〜Ｇの光と調整下で混合することができ、その後光ファイバを通じて、例えばＬＳＭ
５１０に達する。
【００５１】
図１０に描かれているのは、例えばＤＥ特許に記載されているようなレーザ走査型顕微鏡であり、光源Ｅ〜Ｇ、走査モジュール（ＬＳＭ）および顕微鏡モジュールが装備されている。
光源モジュールおよびマニピュレータモジュールから成るマニピュレーションシステムはビーム結合器を通じて連結される。マニピュレータのスキャナを通じて、例えば試料の照準領域をブリーチングしたり、生理学反応を惹起させることが可能である。その場合同時に、またはそれに代わり、ＬＳＭ
５１０により撮像を行うことができる。
マニピュレータの光源モジュールには、例えばレーザＡの後方には、レーザＡの光を、上記と同様調整下で、それぞれ光ファイバを通じてマニピュレーション光路とＬＳＭ
５１０光路とに分割するダイス型偏光ビームスプリッタと共同で作用するλ／２板が配置されている。
【００５２】
ＬＳＭには上記目的のためセパレート式の結合部が配備されている。なお、別々の結合部は（内部）ミラーおよびビームスプリッタを通じて改めて合一化される。
このようにレーザＡは両システムが利用できる。
さらに、図１１ではマニピュレータにおけるレーザＢ〜Ｄの比率もλ／２板およびダイス型偏光ビームスプリッタを通じて調整可能であり、そのほか、偏光分離器には光ファイバを通じてＬＳＭ方向へ到る別な連結路が存在する。その場合ＬＳＭには、例えば迅速切換可能なミラー（フラップ式ミラー）を通じて連結することができる。
このように、レーザＢ〜Ｇの光もレーザＡの光と共に調整下で両光路に到達する。
【００５３】
図１２ではマニピュレータのほかにラインスキャナＲＴも設置されていて、そこでは光はビーム形成器を通ってライン状で顕微鏡光路に達する。
ここでは共通の光源モジュールが配備されているが、やはりλ／２板と偏光分離器とでシステムへの分割を行うことができる。
このようにレーザＡ〜Ｄの光は両システムに提供されている。これは、本質的な簡易化およびコスト節減を意味している。
もう１つの光源Ｅは、その波長がＲＴスキャナには必要ないものなので、例えばマニピュレータ用など、オプショナルな設置に限定される。
【００５４】
図１３には、ＲＴスキャナおよび点像スキャナＬＳＭが配置されているが、それらは共通のビーム結合器を通じて試料の同じ領域、または異なった領域からそれぞれの画像を生成することができる。
様々なレーザモジュールＢ〜Ｄ、Ａ、Ｇ〜Ｅが配備されているが、それぞれ上記のように両システムに対して選択および調整の上、使用できるようになっている。
【００５５】
図１４では、下方および側方から連結される光路を切換ユニット（挿入可能なミラー）で切り換えることによりＲＴスキャナとマニピュレータとが選択的に、または交互に顕微鏡構成部へ連結される。
共通の光源が、上記と同様両システムに有効である。
【００５６】
図１５には、有利なことにそれぞれ複数のレーザから成る光源１および２の調整可能な結合が、例えば迅速切換ミラーSSによって行われることが示されている。レーザに対し、後続配置のλ／２板により少なくとも部分的にはその偏光に影響を与えることができる。共通の光路へ連結する前にその光成分に影響を与えるために行う、光源２からの光のλ／２板通過に関しては、光ファイバ通過後に初めて行うようにすることもできる。
共通光路の偏光分離器は、撮像および／またはマニピュレーションのための各走査装置用に設置された別々の照明モジュール１および２への再分割に用いられる。その場合、個別照明モジュールに達する光成分および強度は、有利なことに制御可能である。制御は、再分離された光路においてλ／２板の経由により、あるいはまた減衰器（ＡＯＴＦ）の利用により行われる。
【００５７】
図１６には図１５と同様に、ただし光ファイバの経由はなく、例えばケーシングチャネル内のモジュール２の光がビーム結合器に導かれる経緯が描かれている。
【００５８】
本発明は、迅速作業性のある共焦点レーザ走査型顕微鏡の適用可能性を大幅に拡大するものである。このような改良開発の重要性は、細胞生物学的に関する標準文献およびそこに記述されている細胞、副細胞の迅速な変化過程１、さらには多数の色素を用いた検査方法２を手掛かりに読み取ることができる。
例えば下記の文献が参考になる :
１ Ｂ． Ａｌｂｅｒｔｓ他著（２００２年）: Molecular
Biology of the Cell ; Garland Science刊
１,２ Ｇ． Ｋａｒｐ著（２００２年）: Cell and Molecular Biology ; Concepts and Experiments ; Wiley Text
Books刊
１,２ Ｒ． Ｙｕｓｔｅ他著（２０００年）: Imaging
neurons – a laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory Press刊、 ニューヨーク
２ Ｒ．Ｐ． Ｈａｕｇｌａｎｄ著（２００３年）:
Handbook of fluorescent Probes and research Products第１０版 ; Molecular Probes Inc. and Molecular Probes Europe BV刊
【００５９】
本発明は次のプロセスおよび変遷にとって非常に重要な意味を持っている :
有機体の生育
記述の本発明は、なかでも１／１０秒から時間レベルまでのダイナミックな変遷を特徴とする生育過程の研究に適している。ここでは細胞結合面および有機体全体への適用例について記述する :
【００６０】
・ Ａｂｄｕｌ−Ｋａｒｉｎ、Ｍ． Ａ．他は２００３年“Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ．”第６６巻、１１３〜１２５ページに動物生体における血管の変化に関する長期分析結果を記録した。その場合、蛍光画像は数日間隔で撮影された。運動の定角軌道を模式的に描くために、３次元のデータ記録が適合アルゴリズムで評価されている。
・ Ｓｏｌｌ、Ｄ． Ｒ．他は２００３年“Ｓｃｉｅｎｔｉｃ Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎ．”第３巻８２７〜８４１ページに３次元空間全体における生体細胞の核および偽足に関する顕微鏡データのソフトウェアベースによる運動分析について記述している。
・ Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ， Ｒ他は２００２年“Ｇｌｉａ”第３７巻２２９〜２４０ページにラットの微小神経膠細胞における運動の３次元分析について記述している。そのデータは１０時間以上に亘って記録されたものである。神経膠細胞にはトラウマ性傷害の後に同時に迅速反応が発現するので、高いデータ収得率およびそれ相応のデータ量が得られる。
これに関しては特に次のことが重要なポイントである :
・ その隣接細胞がレーザ照明に敏感に反応するので３次元ＲＯＩ照明から保護されねばならない３次元領域での生細胞の分析
・ 例えばＦＲＥＴ実験などにおいて、３次元のレーザ照準照明下で退色するマーカーによる生細胞の３次元領域での分析
・ 例えば３次元ＦＲＡＰ、ＦＬＩＰ実験などにおいて、レーザ照準照明下で退色する、同時にＲＯＩ外の観察も必要なマーカーによる生細胞の３次元領域での分析
・ 例えば３次元伝達物質の活性化など、レーザ照明下での操作原因により変化するマーカーおよび薬剤による生細胞の３次元領域での照準分析
・ 例えばｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析
・ 例えばコンフォーカル性と検出感度との最適バランスが要求される微弱マーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析
・ 例えばＣＦＰ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄなど可変性多重マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 機能に依存して変色する、例えばＣａ＋マーカーなどでマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 生育に起因して変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、例えばGFPによる形質転換動物
・ 例えばｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 検出感度に有利なようにコンフォーカル性の制限を要求する微弱マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 最終項目とそれ以前の項目との組み合せ
【００６１】
細胞内の運搬過程
記述の本発明は細胞内運搬過程の研究にはこの上なく適している。この場合では正しく非常に微小な運動構造体、例えばタンパク質を高速度で（殆どが１／１００秒の領域）描写しなければならないからである。複雑な運搬過程のダイナミックスを捕捉するためには、ＲＯＩブリーチングを伴うＦＲＡＰもしばしば適用される。そのような研究例として、ここでは以下のものを挙げておく :
・ Ｕｍｅｎｉｓｈｉ, Ｆ.他が２０００年“Ｂｉｏｐｈｙｓ
Ｊ．”第７８巻１０２４〜１０３５ページに、ＧＦＰ変換された培養細胞におけるアクアポリンの空間運動性についての分析結果を記述している。その場合、細胞膜の照準点を局部ブリーチングして、周辺における蛍光拡散の分析を行っている。
・ Ｇｉｍｐｌ， Ｇ．他が２００２年“Ｐｒｏｇ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．”第１３９巻４３〜５５ページに、ＲＯＩブリーチングによる実験、運動性分析のための蛍光撮像およびＧＦＰマーキングされたオキシトシン受容体の線維芽細胞内での分布について記述している。その場合、空間位置設定、分解能およびブリーチングと撮像との直接的な時間的連続性に関して高い要求が課されている。
・ Ｚｈａｎｇ他が２００１年“Ｎｅｕｒｏｎ”第３１巻２６１〜２７５ページに、ＧＦＰ変換された神経細胞における生細胞の撮像について記述している。その場合、顆粒の運動がブリーチングと蛍光撮像との組み合せにより分析された。神経細胞のダイナミックスに起因して、撮像速度には高い要求が課される。
【００６２】
分子間の相互作用
記述の本発明は、特に分子間およびその他副細胞間の相互作用の描写に適している。これらの場合では非常に微小な構造が高速度（１／１００秒レベル）で描出されねばならない。相互作用に必要な分子の空間ポジションの解明には、例えばＲＯＩブリーチングを伴うＦＲＥＴなどの間接的な技術を使用することもできる。適用される例として、ここでは以下のものを挙げておく :
・ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｍ． Ａ.およびＤａｌｌｅｙ， Ｍ． E.が２００４年“Ｇｌｉａ”第４６巻１９５〜２０６ページに、ラット海馬角の培養における２チャネル撮影について記述している。この場合は、マーカーとしてのレクチンとシトックスについて３次元空間において長時間に亘り２チャネルで記録される。
・ Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｎ．他が２００３年“Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ”第２０巻６３３〜６３８ページに、ヒトの線維肉腫細胞の２色撮影について記述している。この場合では緑色と赤色の蛍光タンパク質（ＧＦＰおよびＲＦＰ）が同時にリアルタイムで観察された。
・ Ｂｅｒｔｅｒａ, Ｓ.他が２００３年“Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”第３５巻７１８〜７２２ページに、合成後色が緑から赤に変化するタイムレポータプロテインによってマーキングされた転換マウスのマルチカラー撮影について記述している。撮像は生体動物の組織内３次元空間で迅速シリーズとして行われる。
【００６３】
細胞間の信号伝達
記述の本発明は、殆どが極端に迅速になる信号伝達過程の研究には他に抜きん出て適している。殆どが神経生理学に関するこの過程では経時的分解能に最大限の要求が課される。それは、イオンによって媒介される活動が１／１００秒から１／１０００秒以下の範囲で起こるからである。筋肉系または神経系の検査への適用例として、ここでは次のものを挙げておく :
・ Ｂｒｕｍ Ｇ他が２０００年“Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ”第５２８巻４１９〜４３３ページに、伝達物質としてのカフェインによる刺激後のカエルの筋肉細胞における迅速なＣａ＋活動の位置確認について記述している。この位置確認およびマイクロメータ単位の精度を持つ分解能は、迅速型の共焦点顕微鏡の使用下でないと達成されない。
・ Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｈ他が２００３年“Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ”第５５１巻１３〜３２ページに、転換マウスの神経細胞突起におけるＣａ＋イオンの分析について記述している。変化するＣａ＋に結合するタンパク質による、マウス内での迅速なＣａ＋変化状況についての研究は、高分解能を持つ共焦点顕微鏡により初めて行うことができた。それは、神経細胞内におけるCa+活動の位置確認およびその精確な経時的動力学が重要な役割を果たしているからである。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】レーザ走査型顕微鏡の模式図
【図２】最大限の視野SF内で如何にしてＲＯＩ（観察対象領域）が選択できるかを示している
【図３】ニポーディスク方式を実現するレーザ走査型顕微鏡として考えられる別な構造様式
【図４】多点走査による別法の模式図
【図５】異なった波長を持つ４つのレーザ
【図６】ＡＯＭクリスタルの図解
【図７】転向ミラーとビーム結合器を通じて合一化され、次数０と１のビームに調整分割するＡＯＴＦ １の配置
【図８】別な分岐路（０次数）に配置されたＡＯＴＦ ３の配備
【図９】レーザＡの光が偏光面方位に関してはλ／２板により調整され、ダイス型偏光スプリッタで反射または透過され、光ファイバを通って別々のシステムに送られる構造図
【図１０】公知のレーザ走査型顕微鏡
【図１１】マニピュレータにおけるレーザＢ〜Ｄが偏光分離器の光ファイバを通じてＬＳＭ方向への連結している
【図１２】マニピュレータのほかにラインスキャナが設置され、光がビーム形成器を通ってライン状で顕微鏡光路に達する
【図１３】ＲＴスキャナおよび点像スキャナＬＳＭが配置され、共通のビーム結合器を通じて試料の同じ領域、または異なった領域からそれぞれの画像を生成する
【図１４】下方および側方から連結される光路を切換ユニットで切り換え、ＲＴスキャナとマニピュレータとが選択的に、または交互に顕微鏡構成部へ連結
【図１５】複数のレーザから成る光源の調整可能な結合
【図１６】光がビーム結合器に導かれる経緯
【符号の説明】
【００６５】
１ レーザ走査型顕微鏡
２ 光源モジュール
３ 走査モジュール
４ 顕微鏡モジュール
５ 検出モジュール
６，７ レーザユニット
８ 光バルブ
１０ 結合ポイント
１１ 光ファイバ
１２，１３ コリメータ
１４，１５ ビーム結合ミラー
１７ メインカラースプリッタ
１８ スキャナ
１９ 走査対物レンズ
２０ 鏡筒レンズ
２１ 対物レンズ
２２ 焦点
２３ 試料
２４ 転向ミラー
２６ スリット絞り
２７ ブロックフィルタ
２８ 検出器
２９ ハロゲンランプ
３４ 水銀蒸気ランプ
３６ ビームスプリッタ
３７ 円筒形テレスコープ
３８ 非球面ユニット
４０ 補正ユニット
４１ ズーム光学系
４２ 絞り
６４ ニポーディスク
ＳＦ 視野（走査フィールド）
Ａ〜Ｇ レーザ
ＵＳ 転向ミラー
Ｖ フラップまたはシャッタ
ＰＴ 偏光分離器
Ａ，ＡＯＴＦ，ＡＯＭ 減衰器
ＭＤ ビーム検出用モニタダイオード
ＰＭＴ 波長別の選択的ビーム検出のための検出器、
Ｔ−ＰＭＴ 透過ビーム検出のための検出器
ＰＨ ピンホール、
ＤＢＳ カラースプリッタ
ＭＤＢ メインカラースプリッタ
ＥＦ 放出用フィルタ
ＬＳＭ スキャナ、
ＨＢＯ 白色光源、
ＨＡＬ 透過照明用のハロゲンランプ
ＳＳ 迅速切換ミラー
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００１】
発明の作用態様および長所の説明
２つまたはそれ以上の走査モジュールの本発明に基づく使用は、特に次の方法の組み合わせには有意である（列挙された文献はいずれも、共用レーザモジュールとの組み合わせシステムについて明確に特徴付けしている。それは、単独システムに比べてコスト、再現性およびフレキシビリティが明らかに最適化されるとしているからである）:
【０００２】
１. 撮像／迅速走査における方法の組み合せ（例えば、高分解性の点像スキャナおよび迅速型ディスクスキャナ）
Ｅｇｎｅｒ他がＪ． Ｍｉｃｒｏｓｃ． ２００２、２０６巻、２４〜３２ページでスピニングディスクとマルチフォーカル多光点顕微鏡の効率および分解能を比較している。プレパラートの如何によるが、両システムとも有意としている。
ＳｔｅｐｈｅｎｓおよびＡｌｌａｎ他が、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３、第３００巻、８２〜８６ページに生体細胞撮影用の様々な光学顕微鏡および共焦点顕微鏡の技術的長所を記述している。高価値システムの場合、検出方法に違いがあるものの殆どの場合光源としてレーザが使用されている。
【０００３】
２. 撮影／マニピュレーションにおける方法の組み合せ（例えば、アンケージング／ＮＬＯのためのＵＶ結合）
Ｋｎｉｇｈｔ他が、Ａｍ Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２００３、第２８４巻C、１０８３〜１０８９ページにレーザによる光活性化のもとでのＣａ２＋撮影のことを記述している。レーザは撮像にも利用できるとしている。
Ｄｅｎｋが、Ｊ． Ｎｅｕｒｉｓｃ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９７、第７２巻、３９〜４２ページに薬剤遊離用としてパルス化した水銀蒸気灯の使用について記述している。ここではレーザが利用されていて、位置設定および効率の点で明白な改良が得られるとしている。
ＷａｎｇおよびＡｕｇｕｓｔｉｎｅが、Ｎｅｕｒｏｎ １９９５、第１５巻、７５５〜７６０ページにレーザ光による薬剤の局部遊離を伴う迅速Ca２+撮影のことを記述している。レーザは撮像にも利用できるとしている。
【０００４】
３. 撮影／分光法ＦＣＳにおける方法の組み合せ（同じVISレーザの使用）
Ｑｕｉｎｇ他が、Ａｐｐｌ． Ｏｐｔ． ２００３、第４２巻、２９８７〜２９９４ページに水中ＦＣＳによる細菌検査のことを記述している。レーザは画像生成成分もFCS成分も供給するとしている。
Ｂｉｇｅｌｏｗ他が、Ｏｐｔ． Ｌｅｔｔ． ２００３、第２８巻、６９５〜６９７ページにコンフォカール蛍光分光法、蛍光異方性法による腫瘍細胞の検査について記述している。レーザは画像生成成分も分光法成分も供給するとしている。
【０００５】
４. 複数顕微鏡装置での平行的撮像（同一パルスＮＩＲレーザの使用）
ＭｃＬｅｌｌａｎ他が、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃ． ２００３、第２３巻２２１２〜２２１７ページにアミロイド斑表示のための生体内多光子顕微鏡法の適用について記述している。顕微鏡構造は特に動物モデル用として適合化されている。複数台数とレーザとの共同使用で検出量は明らかに増大するとしている。
Ｚｉｐｆｅｌ他が、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００３、第１００巻、７０７５〜７０８０ページに多光子顕微鏡法およびSHG顕微鏡法による生体組織内の自家蛍光検査について記述している。顕微鏡構成は特殊適合化されていてあまり汎用タイプではない。第２構造によりフレキシビリティが増すとしている。
【０００６】
５. 共焦点顕微鏡法とＴＩＲＦ顕微鏡法の組み合せ
ＰｏｌｌａｒｄおよびＡｐｐｓが、Ａｎｎ． Ｎ. Ｙ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ２００２、第９７１巻、６１７〜６１９ページにＴＩＲＦ顕微鏡法によるエキソサイトーシスおよびイオン運搬についての検査のための新技術のことを記述している。
ＲｕｃｋｓｔｕｈｌおよびＳｅｅｇｅｒが、Ａｐｐｌ． Ｏｐｔ． ２００３、第４２巻、３２７７〜３２８３ページにＴＩＲＦ顕微鏡法の新型ミラー対物レンズによるナノ粒子および分子の共焦点、分光法検査について記述している。特殊な光学系であり、あまり汎用タイプの構造ではない。第２撮像構造によりフレキシビリティが増すとしている。
Ｔｓｕｂｏｉ他が、Ｂｉｏｐｈｙｓ. Ｊ． ２００２、第８３巻、１７２〜１８３ページにレーザ顕微鏡強制法およびＴＩＲＦ顕微鏡法による内分泌細胞の検査について記述している。撮影用レーザはTIRF励起にも利用できるとしている。
【０００７】
この関係の中で、レーザモジュールにおける光路はそれぞれ、使用照明モジュール間で無段の／可変的なビーム分割が可能になるように形成することが有利であるし、あるいは必要でさえある。装置費用の引き下げおよびそれによるコスト節減には、レーザモジュールの使用台数を１台に限定するのが有意である。
【０００８】
可変的なビーム分割型式は、光源の個別波長または波長領域を、その他の波長に影響を与えることなく様々な光路に接続させて、同時に個別にラインの選択およびビームの減衰を確保するという目的に寄与している。これは以下のような様々な方法で行うことができる :
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１. 光学素子による、少なくとも２つに分離された光路への光源の分割。光学素子における分割比はアプリケーションの要求に対して制限なくフレキシブルに適合させることができる。その場合、両光路には方法の組み合せ１〜４の１つが適用される、あるいはそれに代わり、保有レーザ出力をアプリケーションの要求に適合させるため、
ａ．少なくとも１つのファイバ結合により、
ｂ．レーザ線別の選択的ビーム減衰のための少なくとも１つのＡＯＴＦにより
１つの光路を光の落降方向へ誘導する。
【００１０】
２. 偏光ビームスプリッタ、前置接続された回転可能なλ／２板または個々のレーザ別に偏光の回転を可能にするその他素子（液晶、ポッケルセル、ファラデー回転子…）による、光源の２光路への分割。λ／２板を通じて準無段に設定可能なEベクトルの方位（必要な場合は各レーザ別）により、偏光ビームスプリッタにおける分割比は準無段に調整可能であり、したがって、
ａ．少なくとも１つのファイバ結合により、
ｂ．レーザ線別の選択的ビーム減衰のための少なくとも１つのＡＯＴＦにより
アプリケーションの要求にフレキシブルに適合させることができる。
【００１１】
３. その反射特性または透過特性が手動式または動力式傾倒によって変更される１つまたは複数のダイクロイックビームスプリッタにより行なわれる、光源の２光路への分割。
シフト式の実施を構想とする、角度変更（例えば、４５°から５０°）がスペクトル特性に変化をもたらす。それは、シフト式（ファブリー・ペロ干渉計にほぼ一致）では波長に変化が生じるからである。それにより、建設的または破壊的な干渉領域も移動するが可変的に調整可能であり、したがって分割比は、
ａ．少なくとも１つのファイバ結合により、
ｂ．レーザ線別の選択的ビーム減衰のための少なくとも１つのＡＯＴＦにより
アプリケーションの要求にフレキシブルに適合させることができる。
【００１２】
４. 音響光学素子またはその他回折素子による、光源の２光路への分割。その場合、回折効率は次数０との比率で次数（+）１または（-）１に可変的に調整することができ、したがって次数０と次数（+）１または（-）１間の分割比は、
ａ．少なくとも１つのファイバ結合により、
ｂ．レーザ線別の選択的ビーム減衰のための少なくとも１つのＡＯＴＦにより
アプリケーションの要求にフレキシブルに適合させることができる。
【００１３】
５. 迅速に切換可能なミラーによる、光源の２光路への分割。その場合、切換頻度は撮像速度相応の範囲内とする。さらに、個別光路へ送られるエネルギーに影響を与えるため、ミラーの切換頻度に同期させた迅速切換可能なビーム減衰装置を液晶フィルタを通じて各レーザ用に統合させることができる。
【００１４】
６. 上記５と同様であるが、ビーム減衰装置をレーザに後続配置して、音響光学素子またはその他回折構成素子により行う光源分割。
【発明の効果】
【００１５】
方法１〜４の長所は、光路切換時に部品を動かす必要なく、したがって構成体の動力学的性能が完全に維持されるところにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
図面に基づく説明
以下では図１〜４を手掛かりにライン走査式ＲＴ（リアルタイム）スキャナについて詳細に説明する。
図１は、主要部が５つのコンポーネント、すなわち、レーザ走査型顕微鏡検査のための励起光を生成する光源モジュール２、励起光をコリメートして試料上の走査のため然るべき偏向を行なう走査モジュール３、走査モジュールによって用意された走査ビームを顕微鏡光路内で試料の方向に向ける顕微鏡モジュール４および試料からの光線を受け止め検出する検出モジュール５から成るレーザ走査型顕微鏡１の模式図である。その場合検出モジュール５は、図１に描かれているように、スペクトル別のマルチチャネル型に構成することができる。
点状走査式のレーザ走査型顕微鏡に関する一般事項についてはＤＥ １９７０２７５３Ａ１が参考になり、したがってその内容は本明細書の構成部分でもある。
【００１７】
光源モジュール２は、レーザ走査型顕微鏡検査に適した照明光、したがって特に蛍光を誘起し得るビームを生成する。適用法に対応させるため、光源モジュールは当目的用に複数の光源を有している。図示された実施態様では光源モジュール２に２つのレーザ６および７が配備されている。それらの後にはそれぞれ光バルブ８および減衰器９が接続されており、それらはビームを結合ポイント１０を通じて光ファイバ１１に連結させている。光バルブ８は、レーザユニット６または７のレーザ自体の作動を遮断しなくてもビームを遮断させることのできるビーム偏向器として機能する。光バルブ８は、例えば、ビーム遮断のためレーザビームを光ファイバ１１へ連結する手前で、図示されていない光の落下方向に偏向させるＡＯＴＦ（音響光学フィルタ）として形成されている。
【００１８】
図１のモデル例では、レーザユニット６は３つのレーザＢ、Ｃ、Ｄを有しているが、それに対しレーザユニット７はレーザＡを１つ持つのみである。したがって、図の６と７は単一波長用レーザと多種波長用レーザの組み合せモデルであり、個別に、または共同で１つまたは複数のファイバに連結されている。複数ファイバを通じてビームを同時連結することも可能であるが、その場合ではビームは後に、すなわち適合光学系の通過後にカラー結合器によって混合される。このようにして、励起光用に種々様々な波長または波長領域を使用することができる。
光ファイバ１１に通されたビームは、移動式のコリメーション光学系１２および１３によりビーム結合ミラー１４,１５を通じて合一化され、ビーム形成ユニット内でビームの特性が変更される。
【００１９】
コリメータ１２、１３は、光源モジュール２から走査モジュール３へ送られるビームが無限大光路にコリメートされるように作用する。これはそれぞれ、（図には描かれていない）中央制御ユニットの制御下のもと光軸に沿って移動することでフォーカシング機能を発揮する個別レンズで行うのが有利である。コリメータ１２、１３とそれぞれの光ファイバ末端との距離は変更可能なようになっている。
【００２０】
ビーム形成ユニットについては後にさらに詳しく説明するが、これは、ビーム結合ミラー１４、１５の後方に位置する回転対称なガウス型プロフィールのレーザビームから、もはや回転対称でない、長方形型照明フィールドの形成に適した横断面を持つ線形ビームを生成する。
線形ビームとも言われるこの照明光は、励起光として用いられ、メインカラースプリッタ１７を通じてスキャナ１８に誘導される。メインカラースプリッタについては後ほど詳しく述べるので、ここでは顕微鏡モジュール４から戻ってきた試料光を励起光から分離させる機能を持つことだけを指摘しておく。
【００２１】
スキャナ１８は線形ビームを１軸または２軸方向に偏向させるので、ビームは走査対物レンズ１９および顕微鏡モジュール４の鏡筒レンズ、対物レンズを通って、プレパラートまたは試料内にある焦点２２に集束する。その場合光学結像は、試料が励起光により焦点で照明されるように行なわれる。
線形フォーカスで励起されたこのような蛍光ビームは、顕微鏡モジュール４の対物レンズ、鏡筒レンズおよび走査対物レンズ１９を通ってスキャナ１８に戻るので、スキャナ１８に向かっての戻り過程の方向では再び定常ビームになっている。したがって、スキャナ１８は蛍光ビームをデスキャンするとも言われる。
【００２２】
メインカラースプリッタ１７は、励起光とは別な波長領域にある蛍光ビームを通すことができるので、蛍光ビームは検出モジュール５の転向ミラー２４で転向させた後分析することができる。検出モジュール５は、図１の実施態様では複数のスペクトルチャネルを有している。すなわち、転向ミラー２４のほうから来た蛍光ビームはサブカラースプリッタ２５により２つのスペクトルチャネルに分割される。
【００２３】
各スペクトルチャネルは、試料２３に対して共焦点結合あるいは部分共焦点結合を実現するスリット絞り２６を有しており、その大きさがビームの検出を可能にする焦点深度を決定する。したがって、スリット絞り２６の幾何学構造は、蛍光ビームの検出がなされる（厚みのある）プレパラート内の切断面を決定づける。
スリット絞り２６の後方には、さらに検出モジュール５に到達した歓迎されざる励起光をブロックするためのブロックフィルタ２７が配置されている。特定深度の切断面に由来する、このように分離され扇形に広がった線形ビームは、次に然るべき検出器２８によって分析される。上記のカラーチャネルと同様に、スリット絞り２６a、ブロックフィルタ２７aおよび検出器２８aを持つ第２スペクトル検出チャネルも構成されている。
【００２４】
検出モジュール５における共焦点スリット開口の使用はモデル例に過ぎない。もちろん、単点型スキャナの実現も可能である。その場合ではスリット絞り２６、２６aはホール型絞りに代えられ、ビーム形成ユニットは省くことができる。因みに、そのような構造様式にはすべての光学系が回転対称に構成される。もちろん、単点式の走査および検出に代えて、後に図３および４を手掛かりに改めて説明する点雲形式またはニポーディスク形式のコンセプトなど、原則として任意の多点型装置を使用することもできる。ただし、スキャナの通過時には複数の試料点が平行して捕捉されるので、検出器２８はスポット分解能を有していることが重要である。
【００２５】
図１から分かるように、可動式、すなわち移動可能なコリメータ１２および１３の後方にあるガウス光線束はビーム結合ミラー１４、１５形式のステップ型ミラーを通じて合一化され、続いて、図示された共焦点スリット絞り付き構造様式の場合では、長方形の横断面を持つ光線束に変換される。図１の実施例では、ビーム形成ユニット内には円筒型テレスコープ３７が使用されていて、その後ろには非球面ユニット３８、さらに円筒型光学系３９が配置されている。
【００２６】
ビーム変形後では、ビームはプロフィール平面にはほぼ長方形のフィールドを照らし出す。その場合フィールドの長軸に沿った強度分布はガウス形ではなくボックス形である。
非球面ユニット３８を持つ照明装置は、鏡筒レンズと対物レンズ間にあるひとみを均一充填させるのに用いられる。それによって、対物レンズの光学分解能を完全に発揮させることができる。したがって、このバリエーション法は単点走査式または多点走査式の顕微鏡システム、例えばライン走査システムにも有用である（後者の場合、当該軸に加えそれ以外にも、試料上または試料中にフォーカシングされる）。
【００２７】
例えば線形に整えられた励起光がメインカラースプリッタ１７の方向に偏向される。当カラースプリッタは、好ましい実施態様では分割ミラーとして、つまり本発明でもその内容を包括的に取り入れているＤＥ
１０２５７２３７ Ａ１記載のスペクトル中性な分割ミラーとして形成されている。したがって、「カラースプリッタ」の概念には非スペクトル的に作用する分割システムの意が含まれている。記述のスペクトル非依存型カラースプリッタの代わりに、均一型中性スプリッタ（例えば５０／５０、７０／３０、８０／２０タイプなど）またはダイクロイックスプリッタを使用することができる。それにより、適用別に選択することが可能になるので、メインカラースプリッタとしては、交換可能な個別スプリッタを含む、例えば然るべきスプリッタ切換ダイヤルにより簡易交換のできる機構の備わっているのが好ましい。
【００２８】
例えば、反射、ストークス／反ストークスラマン分光法、高次数のコヒーレントラマンプロセスや、第２高調波発生、第３高調波発生、和周波混合発生などの一般的パラメトリック非線光学プロセス、２光子、多光子吸収および蛍光におけるコヒーレントビーム、すなわち特に方向づけられたビームを検出すべき場合はダイクロイックメインカラースプリッタが有利である。これらの方法のうち、非線光学分光法のいくつかは、コリニヤ重畳をなす２つまたはそれ以上のレーザビームの使用を必要とする。この場合、図示されているような複数レーザビームの結合が特に有利であると実証されている。原則的には、蛍光顕微鏡検査で広く普及しているダイクロイックビームスプリッタであれば使用可能である。また、ラマン顕微鏡検査には、レイリー散乱成分の抑制のため検出器の前にホログラフィックノッチ・スプリッタまたはフィルタを設置するのが有利である。
【００２９】
図１の実施態様では、励起光または照明光はモータ制御式ズーム光学系４１を通じてスキャナ１８に送り込まれる。ズーム倍率は当方式で適合化させることができ、走査される視野は特定の調整領域内で連続的に変更することができる。ズーム光学系としては、連続的同調過程における焦点位置および結像倍率の適合化のあいだ、ひとみ位置が維持されたままであるようなタイプが特に有利である。
図１に矢印で示されたモータによるズーム光学系４１の自由移動度は、結像倍率、焦点位置、ひとみ位置の３つのパラメータの適合化に想定されている自由度の数値に精確に一致している。その出力側のひとみに固定式絞り４２の配置されたズーム光学系４１が特に好ましい。絞り４２を実地で簡単に実現するには、スキャナ１８鏡面幅の制限によって構成することもできる。
【００３０】
ズーム光学系４１を持つ出力側絞り４２により、ズーム倍率の設定如何に拘わらず常に一定したひとみ直径を走査対物レンズ１９上に結像させることが可能になる。このように、ズーム光学系４１を任意に設定した場合でも対物レンズのひとみは依然として完全に照らし出されたままである。スキャナ１８領域での願わしくない散乱光発生事態の阻止には独自型絞り４２の使用が好ましい。ズーム光学系４１と共同作用をする円筒型テレスコープ３７は、同じくモータ作動式であり、非球面ユニット３８の前に配置されている。図１の実施態様ではコンパクト構造の理由からこれが選ばれているが、そのようにする必要はない。
【００３１】
ズーム倍率１.０未満が望まれる場合、円筒型テレスコープ３７は自動的に光学光路内に旋回挿入される。これは、ズーム対物レンズ４１が縮小された場合に開口絞り４２への照明が不完全になるのを防止する。したがって、旋回挿入の可能なこの円筒型テレスコープ３７により、ズーム倍率１未満の場合でも、すなわちズーム対物レンズ４１の設定の如何に拘わらず、対物レンズひとみの位置では常に一定長の照明光線の到達が保証される。それにより、単式視野ズームに比較して、照明光におけるレーザ出力損失が避けられる。
円筒型テレスコープ３７の旋回挿入時には、照明光線による画像明度の急変が避けられないので、画像明度を一定に保つため、（図には描かれていない）制御ユニットでは、円筒型テレスコープ３７が作動している場合、スキャナ１８の送出し速度または検出モジュール５における検出器の増幅係数がそれ相応に適合するような設計がなされている。
【００３２】
図１のレーザ走査型顕微鏡では、モータ作動式ズーム光学系４１およびモータにより操作切換可能な円筒型テレスコープ３７のほか、検出モジュール５でも遠隔制御可能な調整素子が設置されている。例えば、色波長誤差の補正のため、スリット絞りの前に丸型光学系４４と円筒型光学系３９が、検出器２８の直前に円筒型光学系３９が設置されており、それらはモータによりそれぞれ軸方向に移動できるようになっている。
【００３３】
加えて、補償のため補正ユニット４０が配備されているが、それについては以下に簡単に説明する。
スリット絞り２６は、前方配置の丸型光学系４４、同様に前方配置の第１円筒型光学系３９および後方配置の第２円筒型光学系と共に検出システム５のピンホール対物レンズを形成するが、この場合のピンホールはスリット絞り２６によって実現される。システム内で反射した励起光の意図しない検出を避けるため、第２円筒型レンズ３９の前にはブロックフィルタ２７も設置されており、これは求める蛍光ビームだけを検出器２８、２８aに到達させるべく、それに適したスペクトル特性を有している。
【００３４】
カラースプリッタ２５またはブロックフィルタ２７を取り換えて旋回挿入した場合、幾分かの傾斜誤差または楔角誤差が発生するのは避けられない。カラースプリッタは、試料領域とスリット絞り２６間の誤差を、ブロックフィルタ２７はスリット絞り２６と検出器２８間の誤差を持ち込む可能性がある。その場合に、スリット絞り２６または検出器２８の新たな位置調整が必要になることがないように、丸型光学系４４とスリット絞り２６の間に、すなわち試料と検出器２８間の結像光路内に、コントローラの制御下で様々な傾斜位置に設定することのできるオプチカルフラットのプレート４０が配置されている。オプチカルフラットのプレート４０は、その目的のために然るべきホルダ内に位置調整可能なように設置されている。
【００３５】
図２は、ズーム光学系４１を利用すれば提供された最大限の視野SF内で如何にしてＲＯＩ（観察対象領域）が選択できるかを示している。例えば、共振型スキャナの場合では必ず必要なことであるが、振幅に変化が起きないようにスキャナ１８を持続的に制御すれば、ズーム光学系においてセットされた１.０以上の倍率により走査フィールドＳＦの光軸を中心として選択されるＲＯＩ領域が狭められる。
共振型スキャナに関しては、例えばＰａｗｌｅｙ著“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｒｅｓｓ社１９９４年刊、４６１ページ以降に記述されている。
スキャナがフィールドを、光軸に対し、すなわち走査ミラーの定常位置に対し非対称に走査するように、スキャナの制御を行えば、ズーム作用との関連性から選定ＲＯＩ領域の補正移動ＯＦが得られる。既に触れたスキャナ１８のデスキャン作用およびズーム光学系４１の再通過により、検出器方向への検出光路における観察対象領域ＲＯＩの選択が改めて中断される。それにより、走査画像ＳＦ内のＲＯＩ領域に対し任意の選択が可能になる。様々なＲＯＩ領域の選択毎に画像を追加獲得することができ、それらを高分解性画像に合成することができる。
【００３６】
選択ＲＯＩ領域を光軸に対する補正分ＯＦだけ移動させるのでなく、それに加えて回転もさせたい場合は、メインカラースプリッタ１７と試料２３間の光路のひとみに、周知のとおり画像フィールドに対して回転作用のあるアッベ・ケーニッヒプリズムを配置した実施態様が目的に適っている。この場合も検出器方向で作業の中断を行う。
【００３７】
それにより、様々な補正シフトOFおよび様々な回転角を持つ画像が測定でき、続いて、例えば文献
“Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ; Ｉｍａｇｅ
ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ VII” Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＳＰＩＥ第３９１９巻（２０００年）、１４１〜１５０ページのＧｕｓｔａｆｓｓｏｎ，
Ｍ．著“Ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｈｅ ｌａｔｅｒａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｄｅ−ｆｉｅｌｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｕｓｉｎｇ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ”に記載されているようなアルゴリズムに従って高分解性のある画像に修正することができる。
【００３８】
図３は、ニポーディスク方式を実現するレーザ走査型顕微鏡１として考えられる別な構造様式を示している。図３では極端に簡略描画されている光源モジュールが、ミニレンズアレー６５からメインカラースプリッタ１７を通過して、例えばＵＳ
６,０２８,３０６、ＷＯ ８８ ０７６９５またはＤＥ ２３６０１９７
Ａ１に記載されているようなニポーディスク６４を照明する。ミニレンズアレー６５を通じて照明されたニポーディスクのピンホールは顕微鏡モジュール４内の試料に結像する。ここでも試料側の画像サイズを変更できるように、ズーム光学系４１が設置されている。
ニポースキャナの場合、図１の構造様式からは変更部分があり、照明はメインカラースプリッタ１７を通過させて行われ、検出光は反射分離される。さらに、ニポーディスク６４による多点照明の場合では、それに対応した平行な走査が行われるように、図２に変更を加えて検出器２８はスポット分解能を持つように作られている。
【００３９】
そのほか、ニポーディスク６４とズーム光学系４１の間には、ニポーディスク６４のピンホールを通り抜ける発散光を適当な束直径に変換させる、正の屈折力を持った然るべき固定型光学系６３が配置されている。メインカラースプリッタ１７は、図３のニポー式構造の場合では旧来型のダイクロイックビームスプリッタであり、したがってスリット状または点状の反射領域を持つ上記ビームスプリッタではない。
ズーム光学系４１は上段で説明した構造様式に対応しているが、この場合はニポーディスク６４があるため、もちろんスキャナ１８は不要になる。しかし、図２を基に説明したＲＯＩ領域の選択を行いたい場合は、これを設置することができる。同じことがアッベ・ケーニッヒプリズムについても言える。
【００４０】
多点走査による別法が模式図として図４に示されているが、その方法では複数の光源がスキャナのひとみに対して斜めに照射される。この場合でもメインカラースプリッタ１７とスキャナ１８間での結像にズーム光学系４１を使用することにより、図２に描かれたようなズーム機能を実現することができる。ひとみに共役な平面に様々な角度から光線束を同時入射することにより、光点が対象物平面に共役な平面に形成され、それがスキャナ１８により同時に対象物フィールド全体のうちの一部領域上に誘導される。スポット分解性のあるマトリックス検出器２８では部分画像全体の評価を通して画像情報が生成される。
【００４１】
その他の実施態様としては、ＵＳ ６,０２８,３０６に記載されているような多点走査があるが、その開示内容の中で関連事項は本発明に包括的に取り入れられている。ここでもスポット分解性のある検出器２８を設置することができる。その場合では試料は多点光源によって照明されるが、それは、多点光源が実現されるようにマルチ開口プレートを照明する、マイクロレンズアレーの後続配置されたビームエキスパンダによってなされる。
【００４２】
以降の図面では次の素子が描かれ、次の名称が使用されている（説明についてはＥＰ ９７７０６９Ａ１参照）。
光源としてのレーザ １〜４またはＡ〜Ｇ、
レーザビーム転向のための転向ミラー ＵＳ、
遮光装置としてのフラップまたはシャッタ Ｖ、
回転可能なλ／２板、
偏光分離器 ＰＴ、
光伝送用光ファイバ、
ファイバカップリング用のファイバ結合ポート、
減衰器 Ａ（好ましくはＡＯＴＦまたはＡＯＭ）、
ビーム検出用モニタダイオード ＭＤ、
波長別の選択的ビーム検出のための検出器 ＰＭＴ １〜３、
透過ビーム検出のための検出器 Ｔ−ＰＭＴ、
ピンホール ＰＨ １〜４、
カラースプリッタ ＤＢＳ １〜３、
ピンホールへのフォーカシング用ピンホール光学系、
メインカラースプリッタ ＭＤＢ、
放出用フィルタ ＥＦ １〜３、
波長別調整のためのコリメータ、
スキャナ、
走査光学系または走査レンズ、
接眼レンズ、
鏡筒レンズ、
ビーム結合器、
対物レンズとスキャナ間のノンデスキャン検出器、
対物レンズ、
試料、
コンデンサ、
白色光源 ＨＢＯ、
透過照明用のハロゲンランプ ＨＡＬ、
テレスコープ光学系、
ズーム光学系、
照明光生成のためのビーム生成器、
円筒型テレスコープ、
円筒型光学系、
スリット、
ライン捕捉用のスリット絞り付き検出器、
迅速切換ミラー ＳＳ、
【００４３】
図５には異なった波長を持つ４つのレーザ１〜４が描かれている。光の進行順序で言えば、それらの後にシャッタおよび回転可能なλ／２板が、直線偏光レーザビームから成る定義付けされた偏光平面の調整のために配置されている。レーザ１〜３は転向ミラーおよびダイクロイックスプリッタを通じて合一化され、レーザ４と同様ダイス型偏光ビームスプリッタに達する。その場合ダイクロイックスプリッタは、その透過特性または反射特性が偏光平面の回転に依存しないような特別な構造に作られていなければならない。
【００４４】
レーザは、偏光平面のそれぞれの調整に対応して完全に、または一部だけ透過または反射し（レーザ４は本例では他のレーザと合一化せずに直接偏光分離器に導かれる）、選択したビーム減衰器（ＡＯＴＦ）を経由して光ファイバの方向へと到る。固定λ／２板は透過ビーム（ＶＩＳ）または反射ビーム（Ｖ）の場合にＡＯＴＦにとって正しい偏光平面を設定する。
様々な顕微鏡システムに向けた光ファイバ結合ポートが配備されているが、それについては後々詳細に説明する。
【００４５】
ダイス型偏光ビームスプリッタは２つの状態しか認識しない。透過光は常に取付板に平行に偏光し、反射光は常に取付板に垂直に偏光する。レーザ偏光（直線偏光、取付板に対して垂直）に対して２２.５°の光軸を持つλ／２板をレーザの前に設置すれば、偏光面は４５°回転する。これは、偏光ビームスプリッタが５０／５０スプリッタとして作用することを意味している。別な角度であれば別な分離状況になる。例えば４５°のλ／２板では偏光面の回転は９０°になり、理論的にはダイス型偏光スプリッタでは１００％反射される。さらに、反射路（偏光分離器の位置）のＡＯＴＦで常に垂直偏光であれば、ＡＯＴＦが正しく使用されていると言える。透過路では、「入射偏光ＡＯＴＦが取付板に対して垂直」という条件を満たすためには偏光面は固定回転角９０°が必要である。λ／２板に対する減結合はダイス型偏光スプリッタによって行われる。
【００４６】
本例では走査型顕微鏡ＲＴとスキャンマニピュレータが示されていて、それぞれに対し別な波長に分割できる。
これは、個々のλ／２板の電子コード化された然るべき回転によって無段で行われる。
それにより、また複数の独立した観察システムおよび／またはマニピュレーションシステムにより非常にバリエーション豊かな作動が可能である。
【００４７】
図６にはＡＯＭクリスタルが図解されている。これは入射光、例えば波長４０５ nmのレーザビームを相互に直交する、次数０と１の２つの直線偏光ビームに分割し、それぞれを異なった光路に結合させることができる。ＡＯＭの然るべき制御により成分比は変更される。
【００４８】
図７には２つのレーザが示されていて、それらは転向ミラーとビーム結合器を通じて合一化されるが、それらの後方には次数０と１のビームに調整分割するためのＡＯＴＦ
１が配置されている。
ＡＯＴＦの１次回折成分である本来の作業ビームは、定義付けされた全スペクトル領域（例えば４５０ 〜７００ nm）に対してコリニヤの関係にある。０次成分はクリスタルのプリズム作用により分割される。したがって、当装置は特定波長にしか利用することができない（確認の必要がある）。１次数のスペクトル分割を補償する配置も当然考えられる（変形ＡＯＴＦクリスタルに相当する逆分散第２プリズム）。
次数の異なる分岐における強度は波長別に調整可能である。設定制御電圧は１次数回折強度を制御し、残りは０次数のままである。
０次数のビームと１次数のビームは別々の観察システムおよび／またはマニピュレーションシステムに誘導することができる。
分岐路に、ここでは１次数側に、新たな分割が可能である別なＡＯＴＦ ２を配備することができる。
【００４９】
図８では、別な分岐路（０次数）に同様にＡＯＴＦ ３が配備されている。例えば、ＡＯＴＦ １がこの分岐路に完全な強度を持つ波長を導入すれば、ＡＯＴＦ
３により同じく分割を行うことができる。
図９では、照明部にはレーザＡが装備されていて、その光は偏光面方位に関してはλ／２板により調整可能であり、ダイス型偏光スプリッタではそれに対応して反射または透過され、図示された光ファイバを通って調整下別々のシステムに、例えばＬＳＭ５１０およびラインスキャナＲＴに送られる。
レーザＢ〜Ｄの光は、図１と同様に合一化されるが、それぞれその前にλ／２板を通じて偏光面の方位が調整される。
光は偏光分離器において反射または透過して、それぞれ光ファイバを通じてラインスキャナＲＴまたはレーザＥ〜Ｇを持つ別な照明モジュールに到達する。
【００５０】
レーザＥ〜Ｇの照明光路への連結は、例えば、当光路の接続、遮断を交互に行う迅速切換ミラーＳＳを通じてなされる。
切換ミラーは、反射セグメントと透過セグメントが交互に切換るダイヤルにすることもできる。
合一化のための固定式ビームスプリッタも同様に考えられる。
このように、レーザＢ〜Ｄの光はこの結合部によりレーザＥ〜Ｇの光と調整下で混合することができ、その後光ファイバを通じて、例えばＬＳＭ
５１０に達する。
【００５１】
図１０に描かれているのは、例えばＤＥ特許に記載されているようなレーザ走査型顕微鏡であり、光源Ｅ〜Ｇ、走査モジュール（ＬＳＭ）および顕微鏡モジュールが装備されている。
光源モジュールおよびマニピュレータモジュールから成るマニピュレーションシステムはビーム結合器を通じて連結される。マニピュレータのスキャナを通じて、例えば試料の照準領域をブリーチングしたり、生理学反応を惹起させることが可能である。その場合同時に、またはそれに代わり、ＬＳＭ
５１０により撮像を行うことができる。
マニピュレータの光源モジュールには、例えばレーザＡの後方には、レーザＡの光を、上記と同様調整下で、それぞれ光ファイバを通じてマニピュレーション光路とＬＳＭ
５１０光路とに分割するダイス型偏光ビームスプリッタと共同で作用するλ／２板が配置されている。
【００５２】
ＬＳＭには上記目的のためセパレート式の結合部が配備されている。なお、別々の結合部は（内部）ミラーおよびビームスプリッタを通じて改めて合一化される。
このようにレーザＡは両システムが利用できる。
さらに、図１１ではマニピュレータにおけるレーザＢ〜Ｄの比率もλ／２板およびダイス型偏光ビームスプリッタを通じて調整可能であり、そのほか、偏光分離器には光ファイバを通じてＬＳＭ方向へ到る別な連結路が存在する。その場合ＬＳＭには、例えば迅速切換可能なミラー（フラップ式ミラー）を通じて連結することができる。
このように、レーザＢ〜Ｇの光もレーザＡの光と共に調整下で両光路に到達する。
【００５３】
図１２ではマニピュレータのほかにラインスキャナＲＴも設置されていて、そこでは光はビーム形成器を通ってライン状で顕微鏡光路に達する。
ここでは共通の光源モジュールが配備されているが、やはりλ／２板と偏光分離器とでシステムへの分割を行うことができる。
このようにレーザＡ〜Ｄの光は両システムに提供されている。これは、本質的な簡易化およびコスト節減を意味している。
もう１つの光源Ｅは、その波長がＲＴスキャナには必要ないものなので、例えばマニピュレータ用など、オプショナルな設置に限定される。
【００５４】
図１３には、ＲＴスキャナおよび点像スキャナＬＳＭが配置されているが、それらは共通のビーム結合器を通じて試料の同じ領域、または異なった領域からそれぞれの画像を生成することができる。
様々なレーザモジュールＢ〜Ｄ、Ａ、Ｇ〜Ｅが配備されているが、それぞれ上記のように両システムに対して選択および調整の上、使用できるようになっている。
【００５５】
図１４では、下方および側方から連結される光路を切換ユニット（挿入可能なミラー）で切り換えることによりＲＴスキャナとマニピュレータとが選択的に、または交互に顕微鏡構成部へ連結される。
共通の光源が、上記と同様両システムに有効である。
【００５６】
図１５には、有利なことにそれぞれ複数のレーザから成る光源１および２の調整可能な結合が、例えば迅速切換ミラーSSによって行われることが示されている。レーザに対し、後続配置のλ／２板により少なくとも部分的にはその偏光に影響を与えることができる。共通の光路へ連結する前にその光成分に影響を与えるために行う、光源２からの光のλ／２板通過に関しては、光ファイバ通過後に初めて行うようにすることもできる。
共通光路の偏光分離器は、撮像および／またはマニピュレーションのための各走査装置用に設置された別々の照明モジュール１および２への再分割に用いられる。その場合、個別照明モジュールに達する光成分および強度は、有利なことに制御可能である。制御は、再分離された光路においてλ／２板の経由により、あるいはまた減衰器（ＡＯＴＦ）の利用により行われる。
【００５７】
図１６には図１５と同様に、ただし光ファイバの経由はなく、例えばケーシングチャネル内のモジュール２の光がビーム結合器に導かれる経緯が描かれている。
【００５８】
本発明は、迅速作業性のある共焦点レーザ走査型顕微鏡の適用可能性を大幅に拡大するものである。このような改良開発の重要性は、細胞生物学的に関する標準文献およびそこに記述されている細胞、副細胞の迅速な変化過程１、さらには多数の色素を用いた検査方法２を手掛かりに読み取ることができる。
例えば下記の文献が参考になる :
１ Ｂ． Ａｌｂｅｒｔｓ他著（２００２年）: Molecular
Biology of the Cell ; Garland Science刊
１,２ Ｇ． Ｋａｒｐ著（２００２年）: Cell and Molecular Biology ; Concepts and Experiments ; Wiley Text
Books刊
１,２ Ｒ． Ｙｕｓｔｅ他著（２０００年）: Imaging
neurons – a laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory Press刊、 ニューヨーク
２ Ｒ．Ｐ． Ｈａｕｇｌａｎｄ著（２００３年）:
Handbook of fluorescent Probes and research Products第１０版 ; Molecular Probes Inc. and Molecular Probes Europe BV刊
【００５９】
本発明は次のプロセスおよび変遷にとって非常に重要な意味を持っている :
有機体の生育
記述の本発明は、なかでも１／１０秒から時間レベルまでのダイナミックな変遷を特徴とする生育過程の研究に適している。ここでは細胞結合面および有機体全体への適用例について記述する :
【００６０】
・ Ａｂｄｕｌ−Ｋａｒｉｎ、Ｍ． Ａ．他は２００３年“Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ．”第６６巻、１１３〜１２５ページに動物生体における血管の変化に関する長期分析結果を記録した。その場合、蛍光画像は数日間隔で撮影された。運動の定角軌道を模式的に描くために、３次元のデータ記録が適合アルゴリズムで評価されている。
・ Ｓｏｌｌ、Ｄ． Ｒ．他は２００３年“Ｓｃｉｅｎｔｉｃ Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎ．”第３巻８２７〜８４１ページに３次元空間全体における生体細胞の核および偽足に関する顕微鏡データのソフトウェアベースによる運動分析について記述している。
・ Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ， Ｒ他は２００２年“Ｇｌｉａ”第３７巻２２９〜２４０ページにラットの微小神経膠細胞における運動の３次元分析について記述している。そのデータは１０時間以上に亘って記録されたものである。神経膠細胞にはトラウマ性傷害の後に同時に迅速反応が発現するので、高いデータ収得率およびそれ相応のデータ量が得られる。
これに関しては特に次のことが重要なポイントである :
・ その隣接細胞がレーザ照明に敏感に反応するので３次元ＲＯＩ照明から保護されねばならない３次元領域での生細胞の分析
・ 例えばＦＲＥＴ実験などにおいて、３次元のレーザ照準照明下で退色するマーカーによる生細胞の３次元領域での分析
・ 例えば３次元ＦＲＡＰ、ＦＬＩＰ実験などにおいて、レーザ照準照明下で退色する、同時にＲＯＩ外の観察も必要なマーカーによる生細胞の３次元領域での分析
・ 例えば３次元伝達物質の活性化など、レーザ照明下での操作原因により変化するマーカーおよび薬剤による生細胞の３次元領域での照準分析
・ 例えばｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析
・ 例えばコンフォーカル性と検出感度との最適バランスが要求される微弱マーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析
・ 例えばＣＦＰ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄなど可変性多重マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 機能に依存して変色する、例えばＣａ＋マーカーなどでマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 生育に起因して変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、例えばGFPによる形質転換動物
・ 例えばｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 検出感度に有利なようにコンフォーカル性の制限を要求する微弱マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 最終項目とそれ以前の項目との組み合せ
【００６１】
細胞内の運搬過程
記述の本発明は細胞内運搬過程の研究にはこの上なく適している。この場合では正しく非常に微小な運動構造体、例えばタンパク質を高速度で（殆どが１／１００秒の領域）描写しなければならないからである。複雑な運搬過程のダイナミックスを捕捉するためには、ＲＯＩブリーチングを伴うＦＲＡＰもしばしば適用される。そのような研究例として、ここでは以下のものを挙げておく :
・ Ｕｍｅｎｉｓｈｉ, Ｆ.他が２０００年“Ｂｉｏｐｈｙｓ
Ｊ．”第７８巻１０２４〜１０３５ページに、ＧＦＰ変換された培養細胞におけるアクアポリンの空間運動性についての分析結果を記述している。その場合、細胞膜の照準点を局部ブリーチングして、周辺における蛍光拡散の分析を行っている。
・ Ｇｉｍｐｌ， Ｇ．他が２００２年“Ｐｒｏｇ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．”第１３９巻４３〜５５ページに、ＲＯＩブリーチングによる実験、運動性分析のための蛍光撮像およびＧＦＰマーキングされたオキシトシン受容体の線維芽細胞内での分布について記述している。その場合、空間位置設定、分解能およびブリーチングと撮像との直接的な時間的連続性に関して高い要求が課されている。
・ Ｚｈａｎｇ他が２００１年“Ｎｅｕｒｏｎ”第３１巻２６１〜２７５ページに、ＧＦＰ変換された神経細胞における生細胞の撮像について記述している。その場合、顆粒の運動がブリーチングと蛍光撮像との組み合せにより分析された。神経細胞のダイナミックスに起因して、撮像速度には高い要求が課される。
【００６２】
分子間の相互作用
記述の本発明は、特に分子間およびその他副細胞間の相互作用の描写に適している。これらの場合では非常に微小な構造が高速度（１／１００秒レベル）で描出されねばならない。相互作用に必要な分子の空間ポジションの解明には、例えばＲＯＩブリーチングを伴うＦＲＥＴなどの間接的な技術を使用することもできる。適用される例として、ここでは以下のものを挙げておく :
・ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｍ． Ａ.およびＤａｌｌｅｙ， Ｍ． E.が２００４年“Ｇｌｉａ”第４６巻１９５〜２０６ページに、ラット海馬角の培養における２チャネル撮影について記述している。この場合は、マーカーとしてのレクチンとシトックスについて３次元空間において長時間に亘り２チャネルで記録される。
・ Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｎ．他が２００３年“Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ”第２０巻６３３〜６３８ページに、ヒトの線維肉腫細胞の２色撮影について記述している。この場合では緑色と赤色の蛍光タンパク質（ＧＦＰおよびＲＦＰ）が同時にリアルタイムで観察された。
・ Ｂｅｒｔｅｒａ, Ｓ.他が２００３年“Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”第３５巻７１８〜７２２ページに、合成後色が緑から赤に変化するタイムレポータプロテインによってマーキングされた転換マウスのマルチカラー撮影について記述している。撮像は生体動物の組織内３次元空間で迅速シリーズとして行われる。
【００６３】
細胞間の信号伝達
記述の本発明は、殆どが極端に迅速になる信号伝達過程の研究には他に抜きん出て適している。殆どが神経生理学に関するこの過程では経時的分解能に最大限の要求が課される。それは、イオンによって媒介される活動が１／１００秒から１／１０００秒以下の範囲で起こるからである。筋肉系または神経系の検査への適用例として、ここでは次のものを挙げておく :
・ Ｂｒｕｍ Ｇ他が２０００年“Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ”第５２８巻４１９〜４３３ページに、伝達物質としてのカフェインによる刺激後のカエルの筋肉細胞における迅速なＣａ＋活動の位置確認について記述している。この位置確認およびマイクロメータ単位の精度を持つ分解能は、迅速型の共焦点顕微鏡の使用下でないと達成されない。
・ Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｈ他が２００３年“Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ”第５５１巻１３〜３２ページに、転換マウスの神経細胞突起におけるＣａ＋イオンの分析について記述している。変化するＣａ＋に結合するタンパク質による、マウス内での迅速なＣａ＋変化状況についての研究は、高分解能を持つ共焦点顕微鏡により初めて行うことができた。それは、神経細胞内におけるCa+活動の位置確認およびその精確な経時的動力学が重要な役割を果たしているからである。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】レーザ走査型顕微鏡の模式図
【図２】最大限の視野SF内で如何にしてＲＯＩ（観察対象領域）が選択できるかを示している
【図３】ニポーディスク方式を実現するレーザ走査型顕微鏡として考えられる別な構造様式
【図４】多点走査による別法の模式図
【図５】異なった波長を持つ４つのレーザ
【図６】ＡＯＭクリスタルの図解
【図７】転向ミラーとビーム結合器を通じて合一化され、次数０と１のビームに調整分割するＡＯＴＦ １の配置
【図８】別な分岐路（０次数）に配置されたＡＯＴＦ ３の配備
【図９】レーザＡの光が偏光面方位に関してはλ／２板により調整され、ダイス型偏光スプリッタで反射または透過され、光ファイバを通って別々のシステムに送られる構造図
【図１０】公知のレーザ走査型顕微鏡
【図１１】マニピュレータにおけるレーザＢ〜Ｄが偏光分離器の光ファイバを通じてＬＳＭ方向への連結している
【図１２】マニピュレータのほかにラインスキャナが設置され、光がビーム形成器を通ってライン状で顕微鏡光路に達する
【図１３】ＲＴスキャナおよび点像スキャナＬＳＭが配置され、共通のビーム結合器を通じて試料の同じ領域、または異なった領域からそれぞれの画像を生成する
【図１４】下方および側方から連結される光路を切換ユニットで切り換え、ＲＴスキャナとマニピュレータとが選択的に、または交互に顕微鏡構成部へ連結
【図１５】複数のレーザから成る光源の調整可能な結合
【図１６】光がビーム結合器に導かれる経緯
【符号の説明】
【００６５】
１ レーザ走査型顕微鏡
２ 光源モジュール
３ 走査モジュール
４ 顕微鏡モジュール
５ 検出モジュール
６，７ レーザユニット
８ 光バルブ
１０ 結合ポイント
１１ 光ファイバ
１２，１３ コリメータ
１４，１５ ビーム結合ミラー
１７ メインカラースプリッタ
１８ スキャナ
１９ 走査対物レンズ
２０ 鏡筒レンズ
２１ 対物レンズ
２２ 焦点
２３ 試料
２４ 転向ミラー
２６ スリット絞り
２７ ブロックフィルタ
２８ 検出器
２９ ハロゲンランプ
３４ 水銀蒸気ランプ
３６ ビームスプリッタ
３７ 円筒形テレスコープ
３８ 非球面ユニット
４０ 補正ユニット
４１ ズーム光学系
４２ 絞り
６４ ニポーディスク
ＳＦ 視野（走査フィールド）
Ａ〜Ｇ レーザ
ＵＳ 転向ミラー
Ｖ フラップまたはシャッタ
ＰＴ 偏光分離器
Ａ，ＡＯＴＦ，ＡＯＭ 減衰器
ＭＤ ビーム検出用モニタダイオード
ＰＭＴ 波長別の選択的ビーム検出のための検出器、
Ｔ−ＰＭＴ 透過ビーム検出のための検出器
ＰＨ ピンホール、
ＤＢＳ カラースプリッタ
ＭＤＢ メインカラースプリッタ
ＥＦ 放出用フィルタ
ＬＳＭ スキャナ、
ＨＢＯ 白色光源、
ＨＡＬ 透過照明用のハロゲンランプ
ＳＳ 迅速切換ミラー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの照明チャネルへのレーザ光の可変的分割のための装置が装備されていて、同じまたは異なった試料領域へ試料に対して共通の照明が行われる、少なくとも１つの照明モジュールを有する光走査型顕微鏡。
【請求項２】
共通の照明が、同時に、または交互に行なわれる、請求項１に記載の光走査型顕微鏡。
【請求項３】
照明モジュールに少なくとも１つのレーザが装備されている、請求項１または２に記載の光走査型顕微鏡。
【請求項４】
分割された照明の強度および／または波長および／または偏光が変更される、請求項１、２または３に記載の光走査型顕微鏡。
【請求項５】
波長の異なる複数のレーザが配備されている、請求項１〜４の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項６】
分割装置の配置されている共通の光路内で複数のレーザが合一化される、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項７】
好ましくは、調整可能なレーザが少なくとも２つのチャネルに分割される、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項８】
分割の前に、少なくとも１つの別なレーザとの合一化が行われる、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項９】
強度および／または波長が調整可能である、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項１０】
分割された照明チャネルの１つが別な光走査型顕微鏡および／または光学マニピュレーションユニットと光学的に結合している、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項１１】
ラインスキャナが第２の光走査型顕微鏡として配備されている、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項１２】
試料を同時に、および／または交互に照明する第１の、および少なくとも１つの第２の光走査型顕微鏡および／または光学マニピュレーションユニットからの組み合せであって、第１および／または第２の光走査型顕微鏡および／またはマニピュレーションユニットからの照明光が、光学的に分割され、それらがそれぞれ別な光走査型顕微鏡および／またはマニピュレーションユニットの照明に用いられる組み合せ。
【請求項１３】
光ファイバを通じて、それぞれ別なシステムへ光学的結合がなされる、請求項１２に記載の組み合せ。
【請求項１４】
試料に対しラスタ状に照明する独立した複数のシステム用として、少なくとも１つ共通の照明モジュールが配備されている、請求項１１〜１３の１つに記載の組み合せ。
【請求項１５】
分割装置が音響光学特性を有している、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項１６】
分割装置が回折特性を有している、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項１７】
分割装置が偏光光学特性を有している、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項１８】
分割装置が分割ミラーである、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項１９】
分割装置が旋回可能なミラーである、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項２０】
分割において強度および／または波長が調整可能である、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項２１】
分割装置が迅速切換装置である、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項２２】
特に細胞結合面および有機体全体における、なかでも１／１０秒から時間単位までのダイナミックなプロセス等の生育過程、それも特に下記諸点、すなわち
・ その隣接細胞がレーザ照明に敏感に反応するので３次元ＲＯＩ照明から保護されねばならない３次元領域での生細胞の分析
・ 例えばFRET実験などにおいて、３次元のレーザ照準照明下で退色するマーカーによる生細胞の３次元領域での分析
・ 例えば３次元ＦＲＡＰ、ＦＬＩＰ実験などにおいて、レーザ照準照明下で退色する、同時にＲＯＩ外の観察も必要なマーカーによる生細胞の３次元領域での分析
・ 例えば３次元伝達物質の活性化など、レーザ照明下での操作原因により変化するマーカーおよび薬剤による生細胞の３次元領域での照準分析
・ 例えばＰａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析
・ 例えばコンフォーカル性と検出感度との最適バランスが要求される微弱マーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析
・ 例えばＣＦＰ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄなど可変性多重マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 機能に依存して変色する、例えばＣａ＋マーカーなどでマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 生育に起因して変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、例えばＧＦＰによる形質転換動物
・ 例えばｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 検出感度に有利なようにコンフォーカル性の制限を要求する微弱マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 最終項目とそれ以前の項目との組み合せ
のうちの少なくとも１つの研究のための、先行請求項の少なくとも１つに記載の装置および／または方法の使用。
【請求項２３】
特に、微小な運動構造体、例えばタンパク質の高速度描写に（殆どが１／１００秒の領域）、それも特にＲＯＩブリーチングを伴うＦＲＡＰなどに適用される、細胞内運搬過程の研究のための先行請求項の少なくとも１つに記載の装置および／または方法の使用。
【請求項２４】
例えば、副分子構造解明のためのＲＯＩブリーチングを伴うＦＲＥＴなど、好ましくは間接的技術の使用下における、特に、非常に微小な構造の高速度描写など、分子およびその他副細胞の描写のための先行請求項の少なくとも１つに記載の装置および／または方法の使用。
【請求項２５】
特に筋肉系または神経系に関する研究における迅速な信号伝達過程のための、特に、１／１００秒から１／１０００秒以下に到るまでの領域で展開されるイオン介在活動に関係する、高い経時的分解能による神経生理学過程のための、先行請求項の少なくとも１つに記載の装置および／または方法の使用。
【請求項１】
少なくとも２つの照明チャネルへのレーザ光の可変的分割のための装置が装備されていて、同じまたは異なった試料領域へ試料に対して共通の照明が行われる、少なくとも１つの照明モジュールを有する光走査型顕微鏡。
【請求項２】
共通の照明が、同時に、または交互に行なわれる、請求項１に記載の光走査型顕微鏡。
【請求項３】
照明モジュールに少なくとも１つのレーザが装備されている、請求項１または２に記載の光走査型顕微鏡。
【請求項４】
分割された照明の強度および／または波長および／または偏光が変更される、請求項１、２または３に記載の光走査型顕微鏡。
【請求項５】
波長の異なる複数のレーザが配備されている、請求項１〜４の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項６】
分割装置の配置されている共通の光路内で複数のレーザが合一化される、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項７】
好ましくは、調整可能なレーザが少なくとも２つのチャネルに分割される、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項８】
分割の前に、少なくとも１つの別なレーザとの合一化が行われる、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項９】
強度および／または波長が調整可能である、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項１０】
分割された照明チャネルの１つが別な光走査型顕微鏡および／または光学マニピュレーションユニットと光学的に結合している、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項１１】
ラインスキャナが第２の光走査型顕微鏡として配備されている、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項１２】
試料を同時に、および／または交互に照明する第１の、および少なくとも１つの第２の光走査型顕微鏡および／または光学マニピュレーションユニットからの組み合せであって、第１および／または第２の光走査型顕微鏡および／またはマニピュレーションユニットからの照明光が、光学的に分割され、それらがそれぞれ別な光走査型顕微鏡および／またはマニピュレーションユニットの照明に用いられる組み合せ。
【請求項１３】
光ファイバを通じて、それぞれ別なシステムへ光学的結合がなされる、請求項１２に記載の組み合せ。
【請求項１４】
試料に対しラスタ状に照明する独立した複数のシステム用として、少なくとも１つ共通の照明モジュールが配備されている、請求項１１〜１３の１つに記載の組み合せ。
【請求項１５】
分割装置が音響光学特性を有している、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項１６】
分割装置が回折特性を有している、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項１７】
分割装置が偏光光学特性を有している、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項１８】
分割装置が分割ミラーである、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項１９】
分割装置が旋回可能なミラーである、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項２０】
分割において強度および／または波長が調整可能である、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項２１】
分割装置が迅速切換装置である、先行請求項の１つに記載の光走査型顕微鏡。
【請求項２２】
特に細胞結合面および有機体全体における、なかでも１／１０秒から時間単位までのダイナミックなプロセス等の生育過程、それも特に下記諸点、すなわち
・ その隣接細胞がレーザ照明に敏感に反応するので３次元ＲＯＩ照明から保護されねばならない３次元領域での生細胞の分析
・ 例えばFRET実験などにおいて、３次元のレーザ照準照明下で退色するマーカーによる生細胞の３次元領域での分析
・ 例えば３次元ＦＲＡＰ、ＦＬＩＰ実験などにおいて、レーザ照準照明下で退色する、同時にＲＯＩ外の観察も必要なマーカーによる生細胞の３次元領域での分析
・ 例えば３次元伝達物質の活性化など、レーザ照明下での操作原因により変化するマーカーおよび薬剤による生細胞の３次元領域での照準分析
・ 例えばＰａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析
・ 例えばコンフォーカル性と検出感度との最適バランスが要求される微弱マーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析
・ 例えばＣＦＰ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄなど可変性多重マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 機能に依存して変色する、例えばＣａ＋マーカーなどでマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 生育に起因して変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、例えばＧＦＰによる形質転換動物
・ 例えばｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 検出感度に有利なようにコンフォーカル性の制限を要求する微弱マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・ 最終項目とそれ以前の項目との組み合せ
のうちの少なくとも１つの研究のための、先行請求項の少なくとも１つに記載の装置および／または方法の使用。
【請求項２３】
特に、微小な運動構造体、例えばタンパク質の高速度描写に（殆どが１／１００秒の領域）、それも特にＲＯＩブリーチングを伴うＦＲＡＰなどに適用される、細胞内運搬過程の研究のための先行請求項の少なくとも１つに記載の装置および／または方法の使用。
【請求項２４】
例えば、副分子構造解明のためのＲＯＩブリーチングを伴うＦＲＥＴなど、好ましくは間接的技術の使用下における、特に、非常に微小な構造の高速度描写など、分子およびその他副細胞の描写のための先行請求項の少なくとも１つに記載の装置および／または方法の使用。
【請求項２５】
特に筋肉系または神経系に関する研究における迅速な信号伝達過程のための、特に、１／１００秒から１／１０００秒以下に到るまでの領域で展開されるイオン介在活動に関係する、高い経時的分解能による神経生理学過程のための、先行請求項の少なくとも１つに記載の装置および／または方法の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２００６−３１０１８（Ｐ２００６−３１０１８Ａ）
【公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２０７９３７（Ｐ２００５−２０７９３７）
【出願日】平成１７年７月１９日（２００５．７．１９）
【出願人】（３９６０００４５５）カール ツァイス イエナ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (44)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月１９日（２００５．７．１９）
【出願人】（３９６０００４５５）カール ツァイス イエナ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (44)
【Ｆターム（参考）】
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