動物型糖鎖をもつ糖タンパク質の生産方法
【課題】動物型糖鎖をもつ糖タンパク質を生産する植物を提供する。
【解決手段】糖タンパク質の糖鎖の非還元末端にシアル酸を付加し得る糖付加機構を備えた植物細胞であって、シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコ−ドする遺伝子で形質転換された、植物細胞。上記動物型糖鎖をもつ糖タンパク質は、代表的には、異種糖タンパク質であって、その糖鎖はコア糖鎖および外部糖鎖を含み、上記コア糖鎖は複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンから本質的になり、上記外部糖鎖は非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分を含む。
【解決手段】糖タンパク質の糖鎖の非還元末端にシアル酸を付加し得る糖付加機構を備えた植物細胞であって、シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコ−ドする遺伝子で形質転換された、植物細胞。上記動物型糖鎖をもつ糖タンパク質は、代表的には、異種糖タンパク質であって、その糖鎖はコア糖鎖および外部糖鎖を含み、上記コア糖鎖は複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンから本質的になり、上記外部糖鎖は非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分を含む。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動物型糖鎖糖鎖をもつ糖タンパク質の生産方法に関する。本発明はまた、動物型糖鎖付加機能をもつ植物細胞および植物、より詳細には、糖タンパク質の末端糖鎖部分にシアル酸を付加し得る糖付加機構をもつ植物細胞および植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子組換え植物細胞を利用したバイオ医薬品などの有用タンパク質生産が注目を浴びて来ている。外来タンパク質を生産する宿主として植物細胞を利用する利点は、遺伝子操作が比較的容易であること、動物病原の汚染を回避出来ること、スケ−ルアップに関して低コスト化が見込めること、真核生物翻訳後修飾機構を有することなどである。
【０００３】
翻訳後修飾のなかで、Ｎ−結合型糖タンパク質糖鎖の合成および付加は、生物にとって重要な反応の一つである。生物における糖鎖の役割として、タンパク質の血中クリアランスからの保護、細胞間接着への関与、タンパク質のフォ−ルディング、タンパク質生理活性への関与などが挙げられる。植物細胞を利用した動物由来タンパク質の生産を考えた場合、目的タンパク質には植物型糖鎖が付加されてしまうため、本来有する生理活性を示さない場合がほとんどである。そこで、植物細胞のＮ−結合型糖鎖合成経路を改変し、オリジナルの動物由来タンパク質がもつ糖鎖の構造と類似の構造の糖鎖を有するタンパク質を生産させることは有効な手段の一つである。植物細胞と動物細胞ではＮ−結合型糖鎖合成機構は類似する部分もあるが、細部は異なっている。すなわち、植物および動物両細胞においてＧＮ２Ｍ３という糖鎖コア構造（ＧＮはアセチルグルコサミン、およびＭはマンノ−スをそれぞれ表す）が合成されるが、その後、動物細胞では糖鎖の非還元末端にガラクト−スおよびシアル酸が付加することにより糖鎖はさらに伸長する。これに対し、植物細胞では、還元末端Ｎ−アセチルグルコサミンへのα１,３−フコ−ス結合あるいはコアマンノ−スへのβ１，２−キシロ−ス結合が起こる。また、植物型糖鎖に見られるこれらの結合様式を示す糖が、生体内において免疫原性を示す報告もある。
【０００４】
動物型糖鎖において付加されるシアル酸（ＮｅｕＡｃ）は、糖タンパク質の機能にとって重要である。シアル酸は、インビボにおける糖タンパク質の分解を防ぐことが知られている。例えば、エリスロポエチンのような糖タンパク質の糖鎖から、シアル酸が除去されてガラクト−ス残基が露出すると、この糖タンパク質は、血中のクリアランス機構に探知され、肝臓において速やかに分解されてしまう。また、動物型糖鎖において付加されるシアル酸は、セレクチンなどの関与する白血球ホ−ミングもしくはその他の細胞間接着、ウイルスなどの病原の感染とも深く関わっていることが知られている。
【０００５】
しかし、植物細胞には、糖タンパク質糖鎖へのシアル酸付加機能はないと考えられている。さらに、植物細胞は、シアル酸を合成する機能さえも備えていないといわれている。したがって、植物細胞を利用した有用糖タンパク質の生産を考えた場合、宿主が目的タンパク質糖鎖へのシアル酸付加機能を有することが望まれる。植物細胞がその糖タンパク質糖鎖へシアル酸を付加するためには、少なくとも、シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＭＰは５’−シチジル酸を表す）、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターおよびシアル酸転移酵素が必要である。また、動物と微生物は、それぞれ異なるシアル酸生合成経路をもつことが知られている（図１）。図１の左に示されるのが動物におけるシアル酸生合成経路である。図示されるように、動物においては、Ｎ−アセチルマンノサミンから、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸−９−ホスフェートシンターゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホスファターゼによってＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）が生成される。これに対し、大腸菌では、Ｎ−アセチルマンノサミンから、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ（ｎｅｕＢ）によってシアル酸が生成される。
【０００６】
一般に、以下の文献に示されるように、遺伝子組換え植物細胞を得るための手法は、マイクロインジョクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙら）、エレクトロポ−レ−ション（Ｒｉｇｇｓら）、アグロバクテリウム媒介形質転換（Ｈｉｎｃｈｅｅら、Ｉｓｈｉｄａら（トウモロコシ））、直接遺伝子移入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら（イネ）、Ａｇｒａｃｅｔｕｓ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．およびＤｕｐｏｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌ．社製のデバイスを用いた衝撃粒子加速（Ｓａｎｆｏｒｄら）などが知られているが、シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーターを導入した植物細胞は知られていない。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：３２０−３３４（１９８６）。
【０００８】
【非特許文献２】
Ｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５６０２−５６０６（１９８６）
【０００９】
【非特許文献３】
Ｈｉｎｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９１５−９２１（１９８８）
【００１０】
【非特許文献４】
Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：７４５−７５０（Ｊｕｎｅ １９９６）
【００１１】
【非特許文献５】
Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７１７−２７２２（１９８４）
【００１２】
【非特許文献６】
Ｈａｙａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ９３：８５７−８６３（１９９０）（イネ））、
【００１３】
【特許文献１】
Ｓａｎｆｏｒｄら、米国特許第４，９４５，０５０号
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記従来の課題を解決し、動物型糖鎖構造をもつ糖タンパク質を生産するために、糖タンパク質の糖鎖の非還元末端にシアル酸を付加し、動物型糖鎖構造をもつ糖タンパク質を産生し得る植物細胞を提供する。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、シアル酸合成酵素、そしてＣＴＰおよびＮ−アセチルノイラミン酸から、シアル酸転移酵素の基質であるＣＭＰ−シアル酸を合成するＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、および糖鎖合成の場であるゴルジ体内へＣＭＰ−シアル酸を細胞質側から輸送する役割を担うＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）に注目した。シアル酸合成酵素およびＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）を生産する植物培養細胞を構築することが出来れば、培養液中にシアル酸合成酵素（ＣＳＳ）の基質（前駆体）を添加することで植物細胞内においてシアル酸およびＣＭＰ−シアル酸が合成され、さらには、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）生産能を有する植物細胞において、ＣＭＰ−シアル酸がゴルジ体内へ取り込まれることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
本発明は、シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコ−ドする遺伝子を植物に導入し、植物内の糖鎖付加経路を改変し、植物内で動物型糖鎖構造を発現する方法、それによって得られる植物細胞および植物を提供する。
【００１７】
本発明は、動物型糖鎖をもつ糖タンパク質の生産方法に関し、この方法は、糖鎖の非還元末端にシアル酸を付加し得る酵素の遺伝子、および異種糖タンパク質の遺伝子を導入して形質転換された植物細胞を得る工程、該植物細胞を培養する工程、および 該植物細胞の培養液を回収する工程を包含する。
【００１８】
上記動物型糖鎖をもつ糖タンパク質は、コア糖鎖および外部糖鎖を含み、該コア糖鎖が複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンから本質的になり、該外部糖鎖が非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分を含み得る。
【００１９】
上記外部糖鎖は直鎖状構造を備え得る。
【００２０】
上記外部糖鎖は分岐状構造を備え得る。
【００２１】
上記分岐糖鎖部分は、モノ、バイ、トリ、またはテトラ構造を備え得る。
【００２２】
本発明はまた、糖タンパク質の糖鎖の非還元末端にシアル酸を付加し得る糖付加機構を備えた植物細胞に関し、この植物細胞は、シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコ−ドする遺伝子で形質転換されている。
【００２３】
本発明はまた、シアル酸の前駆体を取り込み得る植物細胞に関し、この植物細胞は、シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコ−ドする遺伝子で形質転換されている。
【００２４】
本発明はまた、シアル酸を取り込み得る植物細胞に関し、この植物細胞は、シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコ−ドする遺伝子で形質転換されている。
【００２５】
本発明はまた、シアル酸を取り込み得るベシクルを有する植物細胞に関し、この植物細胞は、シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコ−ドする遺伝子で形質転換されている。
【００２６】
本発明はまた、上記植物細胞から再生された植物に関し、この植物は、動物型糖鎖付加機能をもち、より詳細には、糖タンパク質の末端糖鎖部分にシアル酸を付加し得る糖付加機構をもつ。
【００２７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２８】
本発明では、当該分野で公知の遺伝子工学的手法、生化学的手法、免疫学的手法などを用い得る。これらの手法は、市販のキット、抗体、標識物質などを使用して行い得る。
【００２９】
本発明の方法は、動物型糖鎖付加機能をもつ植物細胞に関する。本明細書で用いる用語「動物型糖鎖」は、シアル酸を含む糖鎖を意味する。好ましくは、動物型糖鎖は分岐構造を有する。
【００３０】
植物細胞は、任意の植物細胞であり得る。植物細胞は、培養細胞、培養組織、培養器官、または植物体のいずれの形態であってもよい。好ましくは、培養細胞、培養組織、または培養器官であり、より好ましくは培養細胞である。本発明の生産方法に使用され得る植物種は、遺伝子導入を行い得る任意の植物種であり得る。 本発明の生産方法に使用され得る植物種の例としては、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科の植物が挙げられる。
【００３１】
ナス科の植物の例としては、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ、またはＰｅｔｕｎｉａに属する植物が挙げられ、例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、トウガラシ、ペチュニアなどを含む。
【００３２】
イネ科の植物の例としては、Ｏｒｙｚａ、Ｈｏｒｄｅｎｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｃｃｃｈａｒｕｍ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、またはＺｅａに属する植物が挙げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシなどを含む。
【００３３】
アブラナ科の植物の例としては、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｗａｓａｂｉａ、またはＣａｐｓｅｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、大根、アブラナ、シロイヌナズナ、ワサビ、ナズナなどを含む。
【００３４】
バラ科の植物の例としては、Ｏｒｕｎｕｓ、Ｍａｌｕｓ、Ｐｙｎｕｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、またはＲｏｓａに属する植物が挙げられ、例えば、ウメ、モモ、リンゴ、ナシ、オランダイチゴ、バラなどを含む。
【００３５】
マメ科の植物の例としては、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｖｉｇｎａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｕｍ、Ｖｉｃｉａ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ａｌｐｈａｌｆａ、またはＭｅｄｉｃａｇｏに属する植物が挙げられ、例えば、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、クロ−バ、ウマゴヤシなどを含む。
【００３６】
ウリ科の植物の例としては、Ｌｕｆｆａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、またはＣｕｃｕｍｉｓに属する植物が挙げられ、例えば、ヘチマ、カボチャ、キュウリ、メロンなどを含む。
【００３７】
シソ科の植物の例としては、Ｌａｖａｎｄｕｌａ、Ｍｅｎｔｈａ、またはＰｅｒｉｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、ラベンダ−、ハッカ、シソなどを含む。
【００３８】
ユリ科に属する植物の例としては、Ａｌｌｉｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ、またはＴｕｌｉｐａに属する植物が挙げられ、例えば、ネギ、ニンニク、ユリ、チュ−リップなどを含む。
【００３９】
アカザ科の植物の例としては、Ｓｐｉｎａｃｉａに属する植物が挙げられ、例えば、ホウレンソウを含む。
【００４０】
セリ科の植物の例としては、Ａｎｇｅｌｉｃａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｔａｅｎｉａ、またはＡｐｉｔｕｍに属する植物が挙げられ、例えば、シシウド、ニンジン、ミツバ、セロリなどを含む。
【００４１】
本発明の生産方法に用いられる植物は、好ましくはタバコ、トマト、ジャガイモ、イネ、トウモロコシ、ダイコン、ダイズ、エンドウ、ウマゴヤシ、およびホウレンソウであり、より好ましくは、タバコ、トマト、ジャガイモ、トウモロコシ、およびダイズである。
【００４２】
本発明で用いられる用語「シアル酸合成酵素をコードする遺伝子」は、Ｎ−アセチルマンノサミンからＮ−アセチルムラミル酸（シアル酸）を生成し得る任意の酵素をコードする遺伝子を意味する。このような酵素をコードする遺伝子は任意の生物に由来し得る。このような酵素は、大腸菌（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０５２４８．１およびＡＦ３６１３７１．１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００２３６６、ＮＭＭ９５０５３、およびＮＭＵ４０７４０）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１２６２５６）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ０３４０８４およびＡＦ２１５６５９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４９８４１９．１）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＺ＿ＡＡＢＩ０１００００４０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＳＵＢ００２０）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＲＣＵ５７６８２）、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎｉｉ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＺ＿ＡＡＢＥ０１００００６４．１）、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ０１２８５０．１）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ０１１４２５．１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ａ３（２）およびＡＬ９３９１２１）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＨＰＹ４１８３５２およびＨＰＹ４１８３５４）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ０８３９０５．１）、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＺ＿ＡＡＡＧ０１００００１７．１）などに存在することが知られている。これらアミノ酸配列はそれぞれ約３３％以上の相同性を有している。その他に、Ｎ−アセチルマンノサミンからＮ−アセチルムラミル酸（シアル酸）を生成し得る酵素については、例えば、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９７ Ｊｕｌ．７（５）：６９７−７０１頁、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１ ｎｅｕＢ ｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ．、Ｖａｎｎ ＷＦ，Ｔａｖａｒｅｚ ＪＪ，Ｃｒｏｗｌｅｙ Ｊ，Ｖｉｍｒ Ｅ，Ｓｉｌｖｅｒ ＲＰ．を参照のこと。なお、「シアル酸合成酵素をコードする遺伝子」は、市販のものを購入してもよいし、これら植物での発現に適切なように改変して用いてもよい。このような方法は当業者に周知である。
【００４３】
本発明で用いられる「ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）をコードする遺伝子」もまた同様に、ＣＴＰとＮ−アセチルノイラミン酸とからＣＭＰ−シアル酸を生成し得る任意の酵素をコードする遺伝子を意味する。このような酵素は、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００９９０８）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１６８８２８）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ０１１３３９．１およびＡＥ０１１３３８．１）、Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２７４１４．１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２８８９６．２）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０５０２３）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２１５６５９．１およびＡＦ１６７３４４．１、ＡＦ１３０９８４）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ６０１４６）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ ｓｔｒ．（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｃ２Ａ ＡＥ０１１０８８）に存在することが知られている。本発明で用いるＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）をコードする遺伝子もまた、任意の動物種に由来し得、哺乳動物に由来することが好ましく、ヒトに由来することがより好ましい。ＣＳＳをコードする遺伝子は、この酵素をコ−ドすることが知られているヌクレオチド配列を用いて任意の動物細胞から単離してもよいし、市販のものを購入してもよいし、これらを植物での発現に適切なように改変して用いてもよい。このような方法は当業者に周知である。
【００４４】
本発明で用いられる用語「ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）をコードする遺伝子」もまた同様に、植物細胞の細胞質からコルジ体中にＣＭ−シアル酸を輸送し得る任意のタンパク質をコードする遺伝子を意味する。このような酵素は、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｙ１２０７４）、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ７１２６８）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０１２２５２．１およびＮＭ＿０１１８９５．１）、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０７００４７．１およびＮＭ＿０７００４６．１）、Ｏｒｙｚｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ５１０１９７．４）、Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＭ４２７６０９．１およびＡＹ０６４４０７．１）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＩ３７１９２５、１、ＢＩ６３５０６５．１、およびＢＩ６４０１０１．１）、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＧ７１３４６８．１、ＢＭ４２７６０９、およびＢＱ１２６１１４．１）、Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＥ５５７５２３．１）、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＷ７３８９９１）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＷ１４１１１２およびＡＡ９２５６１１．１）、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｕｒｏｎｅｃｔｅｓ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＷ０１３２０８．１）に存在することが知られている。ＣＳＴをコードする遺伝子もまた、この酵素をコ−ドすることが知られているヌクレオチド配列を用いて任意の動物細胞から単離してもよいし、市販のものを購入してもよいし、これらを植物での発現に適切なように改変して用いてもよい。このような方法は当業者に周知である。
【００４５】
本明細書で用いる用語「遺伝子」は、通常、構造遺伝子部分を意味する。遺伝子には、植物での発現に適切なように、プロモ−タ−、オペレ−タ−、およびタ−ミネ−タ−などの制御配列が連結され得る。
【００４６】
本明細書で用いる用語「異種糖タンパク質」は、本発明に用いられる植物において本来発現されない糖タンパク質を意味する。
【００４７】
異種糖タンパク質の例としては、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗体、ワクチン、レセプタ−、血清タンパク質などが挙げられる。酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダ−ゼ、キナ−ゼ、グルコセレブロシダ−ゼ（ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）、アルファ−ガラクトシダ−ゼ、フィタ−ゼ、ＴＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクタ−ゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）などが挙げられる。ホルモンおよびサイトカインの例としては、エンケファリン、インタ−フェロンα、β、γ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、絨毛性性腺刺激ホルモン、インタ−ロイキン−２、４、６、１２、インタ−フェロン−ベ−タ、インタ−フェロン−ガンマ、エリスロポイエチン、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、プロラクチン、卵胞刺激ホルモンなどが挙げられる。抗体の例としては、ＩｇＧ、ｓｃＦｖなどが挙げられる。ワクチンの例としては、Ｂ型肝炎表面抗原、ロタウイルス抗原、大腸菌エンテロトキシン、マラリア抗原、狂犬病ウイルスｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓのＧタンパク質、ＨＩＶウイルス糖タンパク質（例えば、ｇｐ１２０）などが挙げられる。レセプタ−およびマトリックスタンパク質の例としては、ＥＧＦレセプタ−、フィブロネクチン、α１−アンチトリプシン、凝固因子ＶＩＩＩなどが挙げられる。血清タンパク質の例としては、アルブミン、補体系タンパク質、プラスミノ−ゲン、コルチコステロイド結合グロブリン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｌｏｂｕｌｉｎ）、スロキシン結合グロブリン（Ｔｈｒｏｘｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｌｏｂｕｌｉｎ）、プロテインＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ）などが挙げられる。
【００４８】
「異種糖タンパク質の遺伝子」は、目的の異種糖タンパク質をコ−ドすることが知られているヌクレオチド配列を用いて任意の細胞から単離してもよいし、市販のものを購入してもよいし、これらを植物での発現に適切なように改変して用いてもよい。
【００４９】
シアル酸合成酵素、ＣＳＳおよびＣＳＴをコ−ドする遺伝子、ならびに異種糖タンパク質の遺伝子は、当該分野で公知の方法により、植物細胞へ導入される。これらの遺伝子は、別々に導入してもよいし、同時に導入してもよい。前述の文献に加え、以下の文献が、種々の植物に遺伝子を導入する方法を開示している。
【００５０】
Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７（１９８８）；Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５．２７−３７ ９１９８７）(タマネギ); Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８５２６−８５３０（１９９０） (タバコクロロプラスト)；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（１９８８）(ダイズ)；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６．９２３−９２６（１９８８）(ダイズ);Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：４３０５−４３０９（１９８８）(トウモロコシ)；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：５５９−５６３（１９８８）(トウモロコシ)；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４（１９８８）（トウモロコシ)；Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３−８３９（１９９０）；およびＧｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：６０３−６１８（１９９０）(トウモロコシ)；Ｋｏｚｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１９４−２００（１９９３）(トウモロコシ)；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２７４−２７７（１９８９）(イネ)；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７−９６２（１９９１）(イネ)；Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：７３６−７４０（１９９０）(イネ)；Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＥＰ ０ ３３２ ５８１(カモガヤなどのイネ科の植物）；Ｖａｓｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１５５３−１５５８（１９９３）（コムギ）；Ｗｅｅｋｓ ｅｔａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１０７７−１０８４（１９９３）（コムギ）；Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：３７−４８（１９９４）（オオムギ）；Ｊａｈｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８９：５２５−５３３（１９９４）（オオムギ）；Ｕｍｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：２６３−２６６（１９８７）（コットン）；Ｃａｓａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１２１２−１１２１６（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３）（ソルガム）；Ｓｏｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１５８９−１５９４（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９２）（オ−トムギ）；Ｔｏｒｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １４：６３５−６４０（１９９５）（オ−トムギ）；Ｗｅｅｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１０７７−１０８４（１９９３）（コムギ）；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９４／１３８２２（コムギ）およびＮｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ５：２８５−２９７（１９９４）（コムギ）。
【００５１】
微粒子銃によって、トウモロコシ中に組換えＤＮＡ分子を導入するために特に好適な実施形態は、Ｋｏｚｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：１９４−２００（１９９３），Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ ８５：１１９−１２３（１９９５）およびＫｏｚｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ７９２：１６４−１７１（１９９６）に記載されている。トウモロコシについて別の好適な実施形態であるプロトプラスト形質転換法は、ＥＰ０ ２９２ ４３５に記載されている。植物の形質転換は、単一のＤＮＡ種または複数のＤＮＡ種（すなわち同時形質転換）を用いて行うことができる。
【００５２】
遺伝子が導入された植物においては、当該分野で公知の方法により、導入された遺伝子の発現が確認され得る。このような方法として、銀染色、ウェスタンブロッティング、ノザンハイブリダイゼ−ション、酵素活性の検出などが挙げられる。導入された遺伝子を発現する細胞は、形質転換細胞である。
【００５３】
得られた形質転換植物細胞は、培養細胞の状態で維持されてもよいし、特定の組織または器官へと分化させてもよいし、完全な植物体に再生させてもよい。あるいは、完全な植物体から得られる、種子、果実、葉、根、茎、花などの部分であってもよい。
【００５４】
形質転換植物細胞の培養、分化および再生のためには、当該分野で公知の手法および培地が用いられる。このような培地には、例えば、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地、ＧａＭｂｏｒｇ Ｂ５（Ｂ）培地、Ｗｈｉｔｅ培地、Ｎｉｔｓｃｈ＆Ｎｉｔｓｃｈ（Ｎｉｔｓｃｈ）培地などが含まれるが、これらに限定されるわけではない。これらの培地は、通常、植物生長調節物質（植物ホルモン）などが適当量添加されて用いられる。
【００５５】
また、動物型糖鎖を持つ糖タンパク質の生産のためには、形質転換植物細胞が増殖し、そして所望の遺伝子産物を生産する限り、基本的には、炭素源、窒素源、およびビタミン類、塩類のような植物細胞の生育に必要な微量栄養素を含む任意の組成の培養培地を用いることができる。生産された異種タンパク質の安定化、および異種タンパク質を効率良く分泌するために、ポリビニルピロリドン、タンパク質分解酵素阻害剤などを添加してもよい。
【００５６】
形質転換植物細胞により生産された植物型の糖鎖をもつ糖タンパク質は、培養された植物細胞、植物体、または植物細胞の培養液から単離され得る。
【００５７】
植物細胞の培養液からの糖タンパク質の単離は、当業者に周知の方法を用いて実施され得る。例えば、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノ−ルなどによるタンパク質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相等のカラムクロマトグラフィ−、限外濾過、高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）等の手法を単独で、または組み合わせて用いて、培養液から糖タンパク質を精製して単離し得る。
【００５８】
あるいは、本発明の糖タンパク質は、植物細胞または植物体から単離または抽出されてもよい。植物細胞または植物体から単離または抽出する方法は、当該分野で周知である。
【００５９】
さらには、本発明の糖タンパク質は、形質転換細胞中に含まれたままの状態で食用に供され得る。本発明の糖タンパク質は、動物型の糖鎖構造を有するので、抗原性を有さず、それゆえ、ヒトを含む動物への投与に適している。
【００６０】
以下に、本発明の植物細胞を得るための代表的な手法を例示する。
【００６１】
１．シアル酸合成酵素をコードする遺伝子を植物に導入する植物感染用ベクターの構築。
【００６２】
本発明の植物細胞を得るために、まず、シアル酸合成酵素を植物細胞にクローニングする。シアル酸合成酵素をコードする遺伝子として、当業者に公知である大腸菌由来のシアル酸合成酵素、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１株のｎｅｕＢ遺伝子を用いることができる。ｎｅｕＢ遺伝子を、例えば、植物発現用プロモーターであるカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下に配置することにより構築した植物外来遺伝子発現用カセットを、既存のベクターｐＢＩ１２１に導入し、植物感染用ベクターｐＢＩ１２１−ＣＮを得る。なお、本明細書で用いる用語「既存」は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＣＡなどの製造会社から市販されているか、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）などの寄託機関などから入手可能であることを意味する。本明細書で用いる用語「既存」はまた、これら既存のものから、当業者に公知の方法を用いて改変されたものをも包含する意味で用いられる。
【００６３】
２．ＣＳＳをコードする遺伝子、およびＣＳＴをコードする遺伝子を植物に導入する植物感染用ベクターの構築。
【００６４】
次いで、ＣＳＳおよびＣＳＴをコードする遺伝子を植物細胞に導入する。ＣＳＳおよびＣＳＴをコードする遺伝子として、例えば、公知であるヒト腎臓由来ＣＳＳ（以下ｈＣＳＳと称する）遺伝子およびヒト腎臓由来ＣＳＴ（以下ｈＣＳＴと称する）遺伝子を用いることができる。これら遺伝子を、それぞれ、植物発現用プロモーターであるカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下に配置し、抗生物質ハイグロマイシン耐性遺伝子を保持する既存のプラスミドｐＧＰＴＶ−ＨＰＴにそれぞれ導入し、プラスミドｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＳおよびｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＴを得る。
【００６５】
３．シアル酸合成系遺伝子群を保持するベクターの構築。
【００６６】
a２，６−シアル酸合成酵素（ＳＴ）遺伝子（例えばヒト由来ＳＴ）を、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下に配置した既存のカセットを、上記のヒト由来ｈＣＳＳ遺伝子を導入した植物感染用ベクターに挿入し、植物発現用ベクターｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴを構築する。次いで、このｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴから、上記の大腸菌由来ｎｅｕＢ遺伝子の植物感染用ベクターｐＢＩ１２１−ＣＮ、および上記のｈＣＳＴ遺伝子植物感染用ベクターｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＴ−ＣＮを用い、ｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮまたはｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮ−ｈＣＳＴを構築する。なお、ここで、ＨＰＴ、ｈＣＳＳ、ｈＳＴ、ＣＮ、ｈＣＳＴは、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒト由来ＣＭＰ−シアル酸合成酵素遺伝子、ヒト由来α２，６−シアル酸合成酵素遺伝子、シアル酸合成酵素遺伝子、ヒト由来ＣＭＴ−シアル酸トランスポーター遺伝子をそれぞれ表し、記載の順序に従って、植物感染用ベクター中に導入されている。
【００６７】
４．シアル酸合成系遺伝子群を発現する植物体の構築。
【００６８】
上記の植物感染用ベクターｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮまたはｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮ−ｈＣＳＴを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４株に導入し、植物感染用アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４−ＨＰＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮあるいはＬＢＡ４４０４−ＨＰＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮ−ｈＣＳＴを得る。
【００６９】
次いで、これらの植物感染用アグロバクテリウムを用い、タバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＳＲ１）またはb１，４−ガラクトース転移酵素（以下ｈＧＴ）遺伝子を導入し糖鎖構造が改変していることが確認されている既存のこのタバコ植物の形質転換体Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍｃｖ ＳＲ１−ｈＧＴをさらに形質転換する。
【００７０】
すなわち、１００ｍｇ／ｌのリファンピシン、５０ｍｇ／ｌのストレプトマイシンおよび５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて培養した上記感染用アグロバクテリウムを、上記タバコ植物の葉の切片と混合し、２５℃明所にて３日間、改変ＭＳ（０．１ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、０．１ｍｇ／ｌベンジルアデニン、１０ｍｇ／ｌチアミン塩酸塩、１ｍｇ／ｌニコチン酸、１ｍｇ／ｌ塩酸ピリドキシン、１０ｍｇ／ｌミオイノシトールを含むムラシゲ スクーグ培地用混合塩類（和光純薬））寒天培地上で共存培養する。
【００７１】
次いで、得られた感染葉を滅菌水で洗浄し、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含む改変ＭＳ寒天培地上に静置し、２５℃明所にて1週間除菌培養を行う。次いで、この感染葉を、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンおよび５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含む改変ＭＳ寒天培地に移して静置し、２５℃明所にて茎葉の誘導を行う。
【００７２】
得られた茎葉を切り取り、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンおよび５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含むＭＳ寒天培地（１０ｍｇ／ｌチアミン塩酸塩、１ｍｇ／ｌニコチン酸、１ｍｇ／ｌ塩酸ピリドキシン、１０ｍｇ／ｌミオイノシトールを含むムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（和光純薬））に継代し、２５℃明所にて発根させる。
【００７３】
発根の確認された形質転換植物体から、ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡを調製し、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ法を用いることで目的遺伝子の導入および発現の確認を行う。
【００７４】
次いで、ｍＲＮＡの産生が確認されたクローンについて鉢上げし、植物体の再生を行う。得られた形質転換植物は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＳＲ１−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮ、ＳＲ１−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮ−ｈＣＳＴ、またはＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＳＲ１−ｈＧＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮ、ＳＲ１−ｈＧＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮ−ｈＣＳＴである。
【００７５】
５．糖鎖へのシアル酸付加の確認。
【００７６】
ｈＧＴで形質転換した植物体における、糖タンパク質にシアル酸が付加していることの確認を、この植物体の細胞を破砕した後、細胞内糖タンパク質の調製を行い、得られた細胞内糖タンパク質からヒドラジン分解法を利用し糖鎖を切り出すことにより行う。すなわち、まず、植物体の破砕物をＴＳＫゲルカラムにかけ、糖鎖を精製する。精製された糖鎖を、２-アミノピリジン（ＰＡ）と反応させることによって糖鎖の還元末端をＰＡ化標識する。得られたＰＡ化糖鎖を逆相（ＲＰ−）ＨＰＬＣおよびサイズ分画（ＳＦ−）ＨＰＬＣを用いて精製し、既知糖鎖との比較、シアリダーゼ（例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）消化およびβ１，４−ガラクトシダーゼ（例えばＤｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）消化と、マススペクトル分析とを組み合わせ、糖鎖の構造を決定する。シアリダーゼ消化によって、非還元末端にシアル酸残基を有するＰＡ化糖鎖の存在が確認されたならば、これらの糖鎖をマススペクトルで分析する。
【００７７】
マススペクトルは、例えば、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥＴＭ ＲＰ ＢｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙＴＭ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ （ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施することができる。
【００７８】
上記シアリダーゼ消化およびβ１，４−ガラクトシダーゼ消化の反応生成物は、蛍光検出器を備えたＨＩＴＡＣＨＩ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ(日立)を用いる逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣで分析され得る。ＲＰ−ＨＰＬＣにおいては、励起および蛍光波長をそれぞれ３１０ｎｍおよび３８０ｎｍとして蛍光強度を測定する。分析カラムとしては、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲ ｃｏｌｕｍｎ（６×２５０ｍｍ、ナカライテスク）が用いられ、通常、流速１．２ｍｌ／分の下で、０．０２％ＴＦＡ水溶液中のアセトニトリル濃度を４０分間で０％から６％に増加させることでＰＡ化糖鎖を溶出することができる。
【００７９】
６．外来タンパク質の糖鎖へのシアル酸付加の確認。
【００８０】
外来タンパク質の例として、マウスモノクローナル抗体タンパク質を構成するＨ鎖およびＬ鎖を植物細胞で発現させる。この目的のために、Ｈ鎖およびＬ鎖をそれぞれコードする遺伝子を、植物感染用プロモーターであるカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下に配置し、抗生物質ハイグロマイシン耐性遺伝子を保持するプラスミドｐＧＰＴＶ−ＨＰＴにそれぞれ導入し、発現カセットを作成する。本発明者らは、これら２つの遺伝子の発現カセットを同一ベクター上にもつプラスミドｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ＩｇＧを既に得ている。このプラスミドｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ＩｇＧから、Ｈ鎖およびＬ鎖発現用カセットを切り出し、抗生物質ビアラホス耐性遺伝子とを保持する既存のプラスミドｐＧＰＴＶ−ＢＡＲに導入し、ベクターｐＧＰＴＶ−ＢＡＲ−ＩｇＧを構築する。これを用い、タバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＳＲ１）、またはb１，４−ガラクトース転移酵素（ｈＧＴ）遺伝子が導入され糖鎖構造が改変されていることが確認された形質転換体Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍｃｖ ＳＲ１−ｈＧＴをさらに形質転換する。１００ｍｇ／ｌのリファンピシン、５０ｍｇ／ｌのストレプトマイシンおよび５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地中で培養した感染用アグロバクテリウムを、タバコの葉の切片と混合し、２５℃明所にて３日間、改変ＭＳ寒天培地上で共存培養する。この感染葉を滅菌水で洗浄した後、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含む改変ＭＳ寒天培地上に移して静置し、さらに２５℃明所にて１週間除菌培養を行う。次いで、得られた感染葉を、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンおよび１０ｍｇ／ｌのビアラホス（明治製菓）を含む改変ＬＳ寒天培地に移して静置し、２５℃明所にて茎葉の誘導を行う。
【００８１】
得られた茎葉を切り取り、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンおよび１０ｍｇ／ｌのビアラホスを含むＭＳ寒天培地に継代し、２５℃明所にて発根させる。この結果、発根の確認された形質転換植物体よりゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡを調製し、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ法を用いることで目的遺伝子の導入および発現の確認を行う。ｍＲＮＡの産生が確認されたクローンに関して、鉢上げし植物体の再生を行う。
【００８２】
得られた植物体Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＳＲ１− ＩｇＧあるいはＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＳＲ１−ｈＧＴ−ＩｇＧについて、抗体タンパク質の発現を、抗マウス二次抗体を用いて確認し、プロテインＡ（アマシャム）あるいはプロテインＧ（アマシャム）カラムを用いて精製し、糖鎖構造を確認する。
【００８３】
鎖構造解析は、以下の方法で行う。精製した目的糖タンパク質よりヒドラジン分解法を利用し糖鎖を切り出す。ＴＳＫゲルカラムにて糖鎖を精製し、２−アミノピリジン（ＰＡ）と反応させることで糖鎖の還元末端をＰＡ化標識する。得られたＰＡ化糖鎖を逆相（ＲＰ−）ＨＰＬＣとサイズ分画（ＳＦ−）ＨＰＬＣで精製し、既知糖鎖との比較、β１，４−ガラクトシダーゼ消化、マススペクトル分析を行い糖鎖の構造を決定する。β１，４−ガラクトシダーゼ消化の結果、非還元末端にガラクトース残基を有するＰＡ化糖鎖の存在を確認し、さらに、これらの糖鎖をマススペクトルで分析する。
【００８４】
７．シアル酸が付加された外来タンパク質を発現する植物体の構築。
【００８５】
上記で得られた形質転換植物Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＳＲ１−ｈＧＴ−ＩｇＧと、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＳＲ１−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮまたはＳＲ１−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮ−ｈＣＳＴとを交配する。あるいはＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＳＲ１−ＩｇＧとＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＳＲ１−ｈＧＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮまたはＳＲ１−ｈＧＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮ−ｈＣＳＴとを交配する。
【００８６】
交配することにより得られた多重形質転換体は、ｈＧＴ遺伝子、ｈＣＳＳ遺伝子、ｈＳＴ遺伝子、ＣＮ遺伝子、ＩｇＧ遺伝子および、ｈＧＴ遺伝子、ｈＣＳＳ遺伝子、ｈＳＴ遺伝子、ＣＮ遺伝子、ｈＣＳＴ遺伝子、ＩｇＧ遺伝子をもつ植物体である。この多重形質転換体について、先と同様に、ＩｇＧ抗体タンパク質の発現を、抗マウス二次抗体を用いて確認する。発現した抗体を、プロテインＡまたはプロテインＧカラムを用いて精製した後、その糖鎖構造を確認する。このために、精製抗体をヒドラジン分解し、得られた分解液から、ＴＳＫゲルカラムを用いて糖鎖を精製する。得られた糖鎖を２-アミノピリジン（ＰＡ）と反応させ糖鎖の還元末端をＰＡ化標識する。得られたＰＡ化糖鎖を、逆相（ＲＰ−）ＨＰＬＣとサイズ分画（ＳＦ−）ＨＰＬＣで精製し、既知糖鎖との比較、シアリダーゼ消化、およびマススペクトル分析によって糖鎖構造を決定する。シアリダーゼ消化によって、非還元末端にシアル酸残基を有するＰＡ化糖鎖の存在が確認され、これらの糖鎖構造がマススペクトルによって分析される。
【００８７】
以下に実施例を用いて本発明を詳細に説明する。以下の実施例は本発明の例示であって、本発明を制限するものではない。
【００８８】
【実施例】
本実施例を要約すると、本実施例は、モデル植物細胞であるタバコ培養細胞ＢＹ２株において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１株由来のシアル酸合成酵素（ｎｅｕＢ）遺伝子を、タバコＮ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ（ＧｎＴ−Ｉ）のＣＴＳ（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｔｅｍ）領域との融合タンパク質（ＣＴＳ−ｎｅｕＢ）として発現させ、さらに、ヒト由来ｈＣＳＳ遺伝子およびヒト由来ｈＣＳＴ遺伝子をタバコ培養細胞ＢＹ２株に各々導入して発現させ、各タンパク質が植物細胞内において活性をもつことを示したものである。
【００８９】
本実施例では、本発明に用いる宿主の代表例としてタバコ培養細胞ＢＹ２株を用いた。ＢＹ２株（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．ｃｖ．Ｂｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ ２）は、理化学研究所ライフサイエンス筑波研究センタ−、ジ−ンバンク室植物細胞開発銀行のカタログ番号ＲＰＣ１から細胞株名ＢＹ２として入手可能である。
【００９０】
方法
１．ＣＴＳ−ｎｅｕＢ遺伝子の取得および植物感染用ベクターの構築。
【００９１】
ｎｅｕＢ遺伝子はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１株よりＰＣＲ法を用いて増幅した。用いたプライマーは以下の通りである：
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ配列；ｎｅｕＢ５’（５’−ＴＴＴＡＧＣＴＣＧＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＴＡＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ−３’）（配列番号７）；
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ配列はｎｅｕＢ３’（５’−ＴＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＣＣＣＣＣＴＧＡＴＴＴＴＴＡＡＡＴＴＣ−３’）（配列番号８）。なお、下線部はＸｈｏＩ制限部位を示す。
【００９２】
一方、ＣＴＳ領域のＰＣＲ増幅には、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ． ＳＲ１株のｃＤＮＡを鋳型とし以下のプライマーを用いて行った：
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ配列；ＣＴＳ−５ＳａｌＩ（５’−ＴＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＧ−３’）（配列番号９）；
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ配列；ＣＴＳ−３ＳａｌＩ（５’−ＡＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＣＴＴＡＡＣＴＧＴＣ−３’）（配列番号１０）。なお、下線部はＳａｌＩサイトを示す。
【００９３】
得られたｎｅｕＢ（配列番号１）およびＣＴＳ遺伝子を、ＸｈｏＩおよびＳａｌＩ部位で連結し、目的とするＣＴＳ−ｎｅｕＢ遺伝子を取得した。得られた遺伝子をプラスミドｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＣＡ）に導入し、植物発現用プロモーターであるカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下に置いた。構築した植物外来遺伝子発現用カセットをｐＢＩ１２１に導入し、植物感染用ベクターｐＢＩ１２１−ＣＮを得た。ｐＢＩ１２１−ＣＮを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４株に導入し、植物感染用アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４−ＣＮを構築した。
【００９４】
２．ヒト由来ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ｈＣＳＳ）遺伝子、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ｈＣＳＴ）遺伝子のクローニングおよび植物感染用ベクターの構築。
【００９５】
ヒト腎臓由来ｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法を用いて目的遺伝子の増幅を試みた。用いたプライマー配列は以下の通りである。
【００９６】
ｈＣＳＳ遺伝子関して：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２７１３８８ Ｂｏｕｑｕｉｎ，Ｔ．ａｎｄ Ｍｕｎｄｙ，Ｊ．を参考にした。
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ配列；ｈＣＳＳ−１（５’−ＧＴＴＡＣＴＡＧＴＡＴＧＧＡＣＴＣＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＧＣＣＧ ＣＣＡＣＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＡＡＣＣＣＧＣＧＧＧＧＧＣＧＡＣＣＧＴＣＣＣ−３’）（配列番号１１）；
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ配列；ｈＣＳＳ−２（５’−ＴＧＧＧＡＧＣＴＣＣＴＡＴＴＴＴＴＧＧＣＡＴＧＡＡＴＴＡＴＴ−３’）（配列番号１２）。
【００９７】
ｈＣＳＴ遺伝子に関して：Ｉｓｈｉａ、Ｎ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０、１０７４−１０７８（１９９６を参考にした。
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ配列；ｈＣＳＴ−１（５’−ＧＴＴＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＡＣＡＡＴ−３’）（配列番号１３）；
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ配列；ｈＣＳＴ−２（５’−ＴＴＧＧＡＧＣＴＣＴＣＡＣＡＣＡＣＣＡＡＴＡＡＣＴ ＣＴＣＴＣ−３’）（配列番号１４）。
【００９８】
各々得られたＰＣＲ産物（ｈＣＳＳ：配列番号２およびｈＣＳＴ：配列番号３）をプラスミドｐＢＩ２２１に導入し、植物発現用プロモーターであるカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下に置いた。構築した植物外来遺伝子発現用カセットを、抗生物質ハイグロマイシン耐性遺伝子を保持するプラスミドｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ（ＡＴＣＣ ７７３８８）に導入した。この結果得られたプラスミドｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＳおよびｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＴを、それぞれ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４株に導入し、植物感染用アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４−ＨＰＴ−ｈＣＳＳおよびＬＢＡ４４０４−ＨＰＴ−ｈＣＳＴを構築した。
【００９９】
３．形質転換タバコ培養細胞の調製。
【０１００】
改変ＬＳ液体培地中で４日目培養したタバコＢＹ２細胞の培養液４ｍｌに対し、１００ｍｇ／ｌのリファンピシン、５０ｍｇ／ｌのストレプトマイシンおよび５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地で２日目培養した上記感染用アグロバクテリウムの培養液を１００μｌ加えて混合し、３日間共存培養した。
【０１０１】
次いで、感染細胞を、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンおよび３０％のスクロースを含む改変ＬＳ液体培地で洗浄した後、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４−ＣＮによる感染細胞は、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンおよび１００ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む改変ＬＳ寒天培地に、そしてアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４−ＨＰＴ−ｈＣＳＳおよびｈＣＳＴによる感染細胞は、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンおよび５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含む改変ＬＳ寒天培地にそれぞれ播種し、カルス形成の誘導を行った。この結果、得られたカルスから、ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡを調製し、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ法を用いることで目的遺伝子の導入および発現の確認を行った。
【０１０２】
次いで、ｍＲＮＡの産生が確認されたクローンについて、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリン、５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンまたは１００ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび３０％のスクロースを含む改変ＬＳ液体培地で培養を行った。
【０１０３】
４．ｎｅｕＢ活性の測定。
【０１０４】
４．１．粗酵素液の調製。
【０１０５】
培養７日目の細胞培養液を、２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって培養液から細胞を分離した。回収した細胞に、２分の１容量の０．２５Ｍスクロース、１ｍＭ塩化マンガン、５０ｍＭ塩化カリウムを含む、２０ｍＭビシン緩衝液ｐＨ８．５を加え、手動ホモジナイザーを用いて破砕した。
【０１０６】
次いで、得られた溶液を、４℃、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって細胞抽出液を調製した。得られた細胞抽出液を、４℃、１００，０００ｒｐｍで１時間超遠心分離し、ミクロソーム画分を得た。
【０１０７】
得られたミクロソーム画分を、１０ｍＭ塩化マンガン、１Ｍ塩化ナトリウム、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む、２０ｍＭビシン緩衝液ｐＨ８．５に懸濁し、粗酵素液とした。
【０１０８】
４．２．酵素反応。
【０１０９】
得られた粗酵素液に、１０ｍＭ塩化マンガン、１０ｍＭＮ−アセチルマンノサミン一水和物、１０ｍＭホスホエノールピルビン酸三水和物を含む、２０ｍＭビシン緩衝液ｐＨ８．５となる様に反応液を加え、３７℃で２４時間反応させた。酵素反応は２０Ｎのリン酸を加え停止させた。
【０１１０】
４．３．シアル酸のＤＭＢ（１，２−ｄｉａｍｉｎｏ−４，５−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅ）蛍光標識。
【０１１１】
上記酵素反応液に、終濃度が７ｍＭＤＭＢ、１．４Ｍ２−メルカプトエタノール、１．４Ｍ酢酸、１８ｍＭハイドロサルファイトナトリウムとなる様に蛍光標識試薬を混合し、５０℃で、２．５時間反応させた。反応は氷冷することで停止させた。
【０１１２】
４．４．ＨＰＬＣ分析。
【０１１３】
シアル酸の蛍光標識産物は、蛍光検出器を有するＨＩＴＡＣＨＩ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（日立）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣ法で分析した。蛍光強度は、励起波長３７３ｎｍおよび蛍光波長４４８ｎｍで測定した。ＲＰ−ＨＰＬＣ法では、分析カラムとしてＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲ ｃｏｌｕｍｎ（６×２５０ｍｍ；ナカライテスク）を用い、流速１．２ｍｌ／分の下で、溶液Ａ（アセトニトリル：メタノール：水＝４：７：８９）および溶液Ｂ（アセトニトリル：メタノール：水＝２０：３５：４５）について、１サイクル８０分間として溶液Ｂを５０分間から６５分間の間１００％流すことによりＤＭＢ化されたシアル酸の溶出を行った。
【０１１４】
４．５．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ （Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）分析。
【０１１５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析は、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥＴＭ ＲＰ ＢｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙＴＭ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。
【０１１６】
５．ｈＣＳＳ活性測定。
【０１１７】
５．１．形質転換体からのｈＣＳＳ粗酵素液の調製。
【０１１８】
培養７日目の形質転換培養細胞培養液から、室温で３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって、形質転換細胞を回収した。得られた形質転換細胞に、等量の、２０ｍＭＭｇＣｌ２を含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を加えてホモジナイザーで細胞を粉砕した。得られた細胞破砕物を、４℃、８，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。
【０１１９】
５．２．ＣＭＰ−シアル酸の合成。
【０１２０】
酵素反応は、４０μｌの粗酵素液、２０ｍＭＭｇＣｌ２、５ｍＭＮｅｕＡｃ、５ｍＭＣＴＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｋ．Ｋ．）を含む、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．５）５０μｌ中、３７℃で５時間反応させて行った。
【０１２１】
また、ドナー基質としてＮｅｕＡｃの代わりに２−ｋｅｔｏ−３−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏ−ｎｏｎｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＫＤＮ）および２−ｋｅｔｏ−３−ｄｅｏｘｙｏｃｔｏｎａｔｅ（ＫＤＯ）もまた用いた。を用いて同様の反応を行った。
【０１２２】
５．３．インビトロシアル酸転移反応。
【０１２３】
ＣＭＰ−シアル酸合成反応後、上記反応液に１００ｐｍｏｌ／ｍｌのＰＡ化糖鎖（Ｔａｋａｒａ ｓｈｕｚｏ）、１０ｍＵ／ｍｌのヒト由来α２，６−シアル酸転移酵素、および、終濃度が１００ｍＭとなるようにＨＥＰＥＳｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）を加え、３７℃で１６時間インキュベートした。
【０１２４】
５．４．ＨＰＬＣ分析。
【０１２５】
酵素反応産物を蛍光検出器を有するＨＩＴＡＣＨＩ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（日立）を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を行った。励起および蛍光波長は３１０ｎｍ、３８０ｎｍとし、蛍光強度を測定した。分析カラムにはＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲ ｃｏｌｕｍｎ（６×２５０ｍｍ；ナカライテスク）を用い、流速１．２ｍｌ／分の下で０．０２％ＴＦＡ水溶液中のアセトニトリル濃度を４０分間で０％から６％に増加させることでＰＡ化糖鎖を溶出させた。
【０１２６】
５．５．ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）を利用したＣＭＰ−シアル酸合成酵素活性測定。
【０１２７】
酵素反応は、１６μｌの粗酵素液、２０ｍＭＭｇＣｌ２、９０μＭ〔１４Ｃ〕ＮｅｕＡｃ、５ｍＭＣＴＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ （Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｋ．Ｋ．）を含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．５）２０μｌで、３７℃で３時間反応を行った。反応液０．５μｌを、ＴＬＣアルミニウムプレートｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０（ＭＥＲＣＫ）にスポットし、展開溶媒液（エタノール：１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ７．５＝７：３）で１０時間展開した。展開後のプレートを１ｃｍ間隔に切断し、各断片の放射能活性を、シンチレーションカウンターを用いて測定した。
【０１２８】
５．６．糖タンパク質糖鎖へのインビトロシアル酸転移酵素反応。
【０１２９】
１６μｌの植物細胞抽出粗酵素液、２０ｍＭＭｇＣｌ２、９０μＭ〔１４Ｃ〕ＮｅｕＡｃ、５ｍＭＣＴＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ （Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｋ．Ｋ．）を含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．５）２０μｌの反応系で３７℃で３時間反応を行った後、２５μｌの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．４、１μｌの１ｍＵヒト由来α２，６−シアル酸転移酵素、そして５μｌの１０ｍｇ／ｍｌアシアロフェツインを添加し、３７℃で１６時間インキュベートした。その後、反応液に１ｍｌのｃｏｌｄ−ｗａｔｅｒを加え反応を停止させた。得られたサンプルをＡｄｖａｎｔｅｃ Ｔｏｙｏ Ａ０４５Ａ０２５Ａニトロセルロースフィルターに通し、さらに１ｍｌのｃｏｌｄ−ｗａｔｅｒでフィルターを３回洗浄した。洗浄後のフィルターを乾燥し、フィルター上の残存１４Ｃ放射能活性値を測定した。
【０１３０】
６．ｈＣＳＴ活性測定。
【０１３１】
６．１．ミクロソーム画分の調製。
【０１３２】
培養７日目の細胞培養液を２，０００ｒｐｍで１０分間遠心することで、培地より細胞を分離した。回収した細胞に２分の１量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．１を加え、手動ホモジナイザーを用いて破砕し４℃、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心することで細胞抽出液を調製した。得られた細胞抽出液を４℃、１００，０００ｒｐｍで１時間超遠心し、ミクロソーム画分の調製を行った。ミクロソーム画分は終濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなる様に、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．１に懸濁した。
【０１３３】
６．２．抗ヒト由来ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター抗体の作成。
【０１３４】
抗体作成に利用したアミノ酸配列はＣＴＳＩＱＱＧＥＴＡＳＫＥＲＶＩＧＶである。この内、Ｃ末端側より１７アミノ酸残基はヒト由来ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターＣ末端からの１７アミノ酸残基に一致する。抗体作成はシグマジェノシスジャパンに依頼し、抗体（ａｎｔｉ ＣＭＰ−Ｓｉａ）はウサギを免疫化することで得た。
【０１３５】
６．３．ウエスタンブロッティング解析。
【０１３６】
ミクロソーム画分を、１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いて１２０Ｖで２時間ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、１ｍＡ／ｃｍ２の定電流下で４５分間ニトロセルロース膜への転移を行った。イムノブロッティングでは、一次抗体としてＲａｂｂｉｔ ａｎｔｉ ＣＭＰ−Ｓｉａ、二次抗体としてｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧを用い、染色にはＰＯＤイムノステインキット（Ｗａｋｏ）を利用した。
【０１３７】
６．４．植物培養細胞由来ベシクルの調製。
【０１３８】
培養７日目の植物細胞培養液を２，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、細胞と培地を分離した。回収した培養細胞を２５０ｍＭスクロース、１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で１回洗浄し、２，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、再度細胞を回収した。洗浄後の細胞に対し３倍量のｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭスクロース、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｔａｂｌｅｔ／５０ｍｌＣｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４））を加え、手動ホモジナイザーを用いて細胞を破砕した。４℃、８，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、得られた上清を細胞抽出液とした。細胞抽出液を４℃、１００，０００ｒｐｍで１時間超遠心分離し、得られたペレットをベシクルとした。ベシクルは１０ｍｇ／ｍｌとなる様に２５０ｍＭスクロース、１ｍＭＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジメルカプトプロパノールを含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｄｅｒ（ｐＨ７．０）に懸濁した。
【０１３９】
６．５．．ヒト由来ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター活性の測定。
【０１４０】
先に調製したベシクル溶液５０μｌに対し、反応基質溶液（２５０ｍＭスクロース、１ｍＭＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジメルカプトプロパノール、１ｔａｂｌｅｔ／５０ｍｌＣｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼインヒビターおよび１μＭＣＭＰ−［３Ｈ］シアル酸（３３，６００Ｃｉ／ｍｏｌ）を含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０））を５０μｌ加えることで反応を開始した。ＣＭＰ−シアル酸取り込み反応は３０℃で３分間行った。ただし、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌの反応は０℃で０分間のものである。反応液中にｃｏｌｄ ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２５０ｍＭスクロース、１ｍＭＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジメルカプトプロパノールおよび１μＭＣＭＰ−シアル酸を含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０））を１ｍｌ加えることで反応を停止した。得られたサンプルをＡｄｖａｎｔｅｃ Ｔｏｙｏ Ａ０４５Ａ０２５Ａニトロセルロースフィルターに通し、さらに１ｍｌのｃｏｌｄ ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎでフィルターを３回洗浄した。洗浄後のフィルターを乾燥し、フィルター上の残存３Ｈ放射能活性値を測定した。
【０１４１】
また、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２５０ｍＭスクロース、１ｍＭＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジメルカプトプロパノールを含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｄｅｒ（ｐＨ７．０）に懸濁し、４℃で１時間インキュベートした１０ｍｇ／ｍｌベシクル溶液についても、同様にトランスポーター活性の測定を行った。
【０１４２】
次に、植物細胞のＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター活性を測定した。先に調製したベシクル溶液５０μｌに対し、反応基質溶液（２５０ｍＭスクロース、１ｍＭＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジメルカプトプロパノール、１ｔａｂｌｅｔ／５０ｍｌＣｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）および１μＭＵＤＰ−［１４Ｃ］ガラクトース（３０５Ｃｉ／ｍｏｌ）を含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０））を５０μｌ加えることで反応を開始した。ＵＤＰ−ガラクトース取り込み反応は３０℃で３分間行った。ただし、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌの反応は０℃で０分間のものである。反応液中にｃｏｌｄ ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２５０ｍＭスクロース、１ｍＭＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジメルカプトプロパノールおよび１μＭＵＤＰ−ガラクトースを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０））を１ｍｌ加えることで反応を停止した。得られたサンプルをＡｄｖａｎｔｅｃ Ｔｏｙｏ Ａ０４５Ａ０２５Ａニトロセルロースフィルターに通し、さらに１ｍｌのｃｏｌｄ ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎでフィルターを３回洗浄した。洗浄後のフィルターを乾燥し、フィルター上の残存１４Ｃ放射能活性値を測定した。
【０１４３】
結果
１．ｎｅｕＢを生産するタバコ培養細胞の解析。
【０１４４】
ｎｅｕＢ遺伝子の発現が確認された形質転換体の１つであるＣＮ−Ｌ株、および野生型ＢＹ２株の培養細胞から調製した粗酵素溶液について、上記４．１〜４．３の記載方法に従って、各々シアル酸合成反応を行った後ＤＭＢ化し、上記４．４の記載の方法に従ってＨＰＬＣによる解析を行った。図２にＨＰＬＣ分析結果を示す。
【０１４５】
図２に見られるように、ＣＮ−Ｌ株については、標準のＤＭＢ−ＮｅｕＡｃ（シアル酸）と同様の溶出位置に期待されるピークが得られた（図２の真中のチャート）。しかしながら、一方でｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌのＢＹ２株についても極微量ではあるが同様のピークが得られた（図２の一番下のチャート）。なお、図２の一番上のチャートが標準のＤＭＢ−ＮｅｕＡｃのＨＰＬＣ溶出位置である。
【０１４６】
また、これらのピークを回収しマススペクトル分析を行ったところ、図３に示すように、ＣＮ−Ｌ株由来のピークの分子量４２５．４３（図３の真中）およびＢＹ２株由来のピークの分子量４２５．５１（図３の右）はともに、計算されたＤＭＢ−ＮｅｕＡｃの分子量（図３の左）に一致した。
【０１４７】
２．ヒト由来ｈＣＳＳを生産するタバコ培養細胞の解析。
【０１４８】
２．１．Ｉｎ ｖｉｔｒｏシアル酸転移酵素反応。
【０１４９】
タバコＢＹ２株、およびｈＣＳＳ遺伝子が導入された形質転換体の１つｈＣＳＳ１５株の培養細胞から上記５．１．に記載のように調製した細胞抽出液を粗酵素液として、上記５．２．〜５．３．に記載のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＣＭＰ−シアル酸合成反応を行った後、得られた酵素反応産物を基質としてＰＡ化糖鎖へのシアル酸転移酵素反応を行った。その結果、ｈＣＳＳ１５株の抽出物を用いた反応系において、ＰＡ化糖鎖へのシアル酸転移が認められた（図４ＡのＩＩＩに示されるようにＳｉａ１Ｇａｌ２ＧＮ２Ｍ３−ＰＡが検出された）。図４のＡはシアル酸転移酵素反応後の反応液の、そして図４のＢはシアル酸転移酵素反応前の反応液のＨＰＬＣ分析結果である。このようにして得られたＰＡ化糖鎖（Ｓｉａ１Ｇａｌ２ＧＮ２Ｍ３−ＰＡ）を回収し、マススペクトル解析を行った結果、得られた分子量２０１１．２５は、推定される計算値の分子量（図５）と一致した。さらに、これを、Ｎアセチルノイラミニダーゼで消化しＨＰＬＣ分析を行うと、Ｇａｌ２ＧＮ２Ｍ３−ＰＡが得られた（データは示さず）。これらの結果は、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素反応においてＣＴＰおよびシアル酸から、目的とするＣＭＰ−シアル酸が合成されたことを示している。これは、ｈＣＳＳ１５株において、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素が生産され、かつ活性を有していたことを示す。
【０１５０】
その一方、ＫＤＮおよびＫＤＯを基質として同様のＣＭＰ−シアル酸合成酵素反応およびシアル酸転移酵素反応を試みたが、ＰＡ化糖鎖へのシアル酸の転移は確認できなかった（図４のＡのＩＩおよびＩＶ）。
【０１５１】
３．ＴＬＣ分析。
【０１５２】
ｈＣＳＳ１５株およびＢＹ２株の抽出物を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＭＰ−シアル酸合成酵素反応産物を、さらに、上記５．５．に記載のようにＴＬＣを用いて解析した。図６に結果を示す。ｈＣＳＳ１５株の抽出物を粗酵素液として用いた反応産物中には、コントロールＣＭＰ−〔３Ｈ〕ＮｅｕＡｃ（図６のＡ）と同じ展開位置（Ｆｒａｃｔｉｏｎ１２）に、ＣＭＰ−〔１４Ｃ〕ＮｅｕＡｃのピークが存在した（図６のＣ）。一方、このピークはＢＹ２株の抽出物を粗酵素液として用いた反応産物中には存在しなかった（図６のＢおよびＤ）。これは、ｈＣＳＳ１５株においてＣＭＰ−シアル酸合成酵素が生産され、かつ活性を有していたことを示す。
【０１５３】
４．アシアロフェツインへのｉｎ ｖｉｔｒｏシアル酸転移酵素反応。
【０１５４】
上記５．６．に記載の方法に従って、ニトロセルロース膜を用いて洗浄濾過した酵素反応産物の残存放射能活性を測定したところ、ｈＣＳＳ１５株の抽出物を粗酵素液として用いた反応産物中に、反応時間の増加とともに、アクセプター基質であるアシアロフェツインへ〔１４Ｃ〕ＮｅｕＡｃが転移したことが示された（図７）。
【０１５５】
５．ｈＣＳＴを生産するタバコ培養細胞の解析（ウエスタンブロッティング解析）。
【０１５６】
ｍＲＮＡの生産が確認された（データは示さず）５つの形質転換体（Ｂ１９、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２６およびＢ２８）の培養細胞から、上記６．１．に記載の方法に従ってミクロソーム画分を調製し、上記６．３．に記載のように抗ｈＣＳＴ抗体を用いてウエスタンブロッティング解析を行った。結果を図８に示す。図８に示されるように、これらの形質転換体のミクロソーム画分に、約２４．２ｋＤａのバンドが確認された（Ｂ１９〜２８）。その一方、野生型ＢＹ２株の細胞のミクロソーム画分では、このバンドは存在しなかった。この結果は、これら形質転換体でｈＣＳＴが生産されたことを示す。
【０１５７】
６．トランスポーター活性の測定。
【０１５８】
上記の形質転換体Ｂ２１、Ｂ２６およびＢ２８株について、上記６．４．に記載の手順に従ってベシクルを調製し、上記６．５．に記載の方法によってそれらのトランスポーター活性を測定した。結果を図９のＡに示す。図９のＡに示されるように、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして用いた野生型ＢＹ２株では、０℃、０分と３０℃、３分のデータを比較してもトランスポート活性は見られなかったが、形質転換体では、Ｂ２１およびＢ２６株において、３分間で約２０ｆｍｏｌ−ＣＭＰ−［３Ｈ］シアル酸／ｍｇ−ベシクル、Ｂ２８株では約１０ｆｍｏｌ−ＣＭＰ−［３Ｈ］シアル酸／ｍｇ−ベシクルのトランスポート活性が確認された。なお、図９のＡにおいて、横軸は各形質転換体を示し、各形質転換体のトランスポーター活性は、棒グラフと隣接する矩形領域で表され、棒グラフは、３０℃、３分の活性を、そして矩形領域は０℃、０分の活性を示している。これらの結果は、形質転換体Ｂ２１、Ｂ２６およびＢ２８株で発現したｈＣＳＴが活性を保持していることを示す。
【０１５９】
ｈＣＳＴは、本来、膜タンパク質である。そこで、形質転換体Ｂ２１、Ｂ２６およびＢ２８株で発現したｈＣＳＴが、実際に膜に局在しているかどうかを調べた。このため、これら形質転換体から得られたベシクル溶液を、界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理し、上記と同様にトランスポーター活性を測定した。この結果、各形質転換体の処理試料では、いずれもトランスポーター活性は認められなかった。従って、これら形質転換体で発現したｈＣＳＴは、いずれも膜タンパク質として存在し、界面活性剤処理によりベシクルから除去されたと考えられる。
【０１６０】
その一方で、各株から調製されたベシクル試料が活性を損なうことなく調製されていることを示すｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ実験として、各株のベシクル試料について、上記６．５．に示す手順に従って、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター活性を測定した。基質は、ＵＤＰ−［１４Ｃ］ガラクトースである。図９のＢに結果を示す。図９のＢに示されるように、野生型のＢＹ２株では、３分間で約８５ｆｍｏｌのＵＤＰ−［１４Ｃ］ガラクトースの取り込みが確認されたのに対し、形質転換体Ｂ２１株で約４００ｆｍｏｌ、Ｂ２６株で約２４０ｆｍｏｌ、そしてＢ２８株では約２００ｆｍｏｌの取り込み活性が確認された。
【０１６１】
まとめ
本実施例において、本発明者らは、シアル酸合成能をもつ植物細胞を構築するために、タバコ培養細胞ＢＹ２株において、大腸菌由来のシアル酸合成酵素、ヒト由来ＣＭＰ−シアル酸合成酵素、そしてヒト由来ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターを発現させた。
【０１６２】
１．ＣＴＢ−ｎｅｕＢ融合タンパク質を植物細胞で発現させた結果、その形質転換体ＣＮ−Ｌ株は、シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を合成する能力をもつに至った。ところが、興味深いことに、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌの野生型ＢＹ２株においても、その抽出物を粗酵素溶液としてシアル酸合成反応を行ったところ、シアル酸を合成する能力をもっている可能性が示唆された（図２および３）。植物細胞は、一般に、シアル酸を合成する機能はないと考えられているので、植物においても、シアル酸合成酵素に類似の酵素群が存在する可能性がある。その遺伝子クローニングまたはタンパク質機能の解明が待たれる。
【０１６３】
２．ＣＭＰ−シアル酸合成酵素は、糖タンパク質の糖鎖にシアル酸を転移するシアル酸転移酵素の基質であるＣＭＰ−シアル酸を、ＣＴＰとシアル酸とから合成する酵素である。本発明者らは、タバコ培養細胞ＢＹ２株において生産させたＣＭＰ−シアル酸合成酵素を用いてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを合成した。図４Ａおよび図５の結果から、この様にして生産されたＣＭＰ−ＮｅｕＡｃが、実際に、シアル酸含有動物型糖鎖の合成に利用されたこと、すなわち、動物由来のシアル酸転移酵素の基質となることが示された。
【０１６４】
その一方、ＮｅｕＡｃのアナログであるＫＤＮあるいはＫＤＯは、ニジマス精子由来のＣＭＰ−シアル酸合成酵素の基質となるが、動物由来のＣＭＰ−シアル酸合成酵素の基質として利用されにくいという報告がある（Ｔｅｒａｄａ ｅｔａｌ）。また、ラット由来のα２，６−シアル酸転移酵素は、糖鎖非還元末端β１，４−ガラクトース結合にＫＤＮをシアル酸転移することが知られている（Ａｎｇａｔａ ｅｔ ａｌ）。そこで、本発明者らはこれらシアル酸のアナログを基質として、同様に、糖鎖への付加を試みが、シアル酸の付加を確認することはできなかった（図４Ｂ）。このことは、ＫＤＮおよびＫＤＯが、植物細胞において生産されたヒト由来ＣＭＰ−シアル酸合成酵素の基質とはならなかったことを示す。さらに、ＴＬＣにおいて、形質転換体が、ＣＴＰおよび［１４Ｃ］ＮｅｕＡｃからＣＭＰ−［１４Ｃ］ＮｅｕＡｃを合成する能力を有することを確認した後、本発明者らは、実際に、ＣＭＰ−［１４Ｃ］ＮｅｕＡｃが糖タンパク質上に存在するアシアロ糖鎖に付加されることを証明した。これは、β１，４−ガラクトース転移酵素を発現する植物細胞ＧＴ６株の様なモデル植物細胞に、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素を導入すれば、植物細胞内で糖タンパク質糖鎖にシアル酸を付加し得る有用植物細胞の構築が可能であるということを示す。
【０１６５】
３．また、本発明者らは、植物細胞におけるヒト由来ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターの発現も試みた。糖ヌクレオチドトランスポーターは、糖鎖修飾の場であるゴルジ体内に存在する糖転移酵素の基質である糖ヌクレオチドを、細胞質側からゴルジ体内へ輸送するために必要とされるタンパク質である。抗ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター抗体を用いたウエスタンブロッティング解析の結果を考慮して、形質転換体Ｂ２１、Ｂ２６およびＢ２８株におけるトランスポーター活性を測定した。その結果、ベシクル１ｍｇあたりＢ２１およびＢ２６株では、酵素反応時間３分間の間に約２０ｆｍｏｌの、そしてＢ２８では約１０ｆｍｏｌのＣＭＰ−シアル酸取り込み活性を有することが示された。
【０１６６】
さらに、ベシクルを界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理し、同様のトランスポート活性を測定すると、見かけ上の活性は確認されなかった。このことは、発現させたＣＭＰ−シアル酸トランスポーターが、ベシクル膜に存在することを示している。
【０１６７】
また、本発明者らが、先に、植物細胞での糖鎖合成経路改変を期待して、タバコＢＹ２株に、ヒト由来β１，４−ガラクトース転移酵素を導入した際、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターを発現させなくとも、糖鎖にガラクトースが付加された。また、ＢＹ２株を含むいくつかの植物において、β１，３−ガラクトース結合を含むいわゆるルイスＡ構造をもつ糖鎖が存在することが報告されていることから、少なくともＢＹ２株にはＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターが存在していると考えられた。これは、今回のＣＭＰ−シアル酸トランスポーター活性測定条件の指標として利用できる。そこで、我々は、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター活性の測定を行った。野生型ＢＹ２株おいて、ＵＤＰ−ガラクトースのトランスポート活性３分間の反応において、ベシクル１ｍｇあたり約８５ｆｍｏｌの取り込み活性が確認された。その一方、形質転換体についても、同様に、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポート活性を有することが示された。
【０１６８】
４．本発明者らは、植物に、シアル酸およびＣＭＰ−シアル酸合成能を付加させることができた。植物を利用した動物由来糖タンパク質の生産が盛んに行われている現在、より本物に近いタンパク質の生産へ向けて、糖鎖へのシアル酸付加機能を有する植物細胞の構築は、有用物質生産への有効な手段を提供する。
【０１６９】
【発明の効果】
動物型糖鎖付加機能をもつ植物細胞が提供される。シアル酸を取り込み、糖タンパク質に含まれる糖鎖のガラクト−ス残基にシアル酸を付加し得る植物細胞およびそれを用いる方法が提供される。本発明の植物細胞により産生される糖タンパク質は、動物型の糖鎖を有するので、動物特にヒトに対して抗原性を有さず、それゆえ、ヒトを含む動物への投与に適する糖タンパク質が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】動物と微生物におけるシアル酸生合成経路を示す図である。
【図２】本発明のシアル酸合成酵素が導入された植物において合成されたシアル酸を示す図である。
【図３】本発明のシアル酸合成酵素が導入された植物において合成されたシアル酸を示す図である。
【図４Ａ】本発明のＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）が導入された植物におけるＣＭＰ−シアル酸の合成を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ａと組み合わせて、本発明のＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）が導入された植物におけるＣＭＰ−シアル酸の合成を示す図である。
【図５】本発明のＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）が導入された植物におけるＣＭＰ−シアル酸の合成を示す図である。
【図６】本発明のＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）が導入された植物におけるＣＭＰ−シアル酸の合成を示す図である。
【図７】本発明のＣＭＰ−シアル酸合成酵素が導入された植物における、糖タンパク質へのシアル酸の転移を示す図である。同位体標識したシアル酸を基質として合成されたＣＭＰ−シアル酸を、市販のヒト由来シアル酸転移酵素を用いてアシアロフェツインに転移させた。
【図８】本発明のＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）が導入された植物における、ＣＳＴの発現を示す図である。
【図９】本発明のＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）が導入された植物における、トランスポーターの発現を示す図である。Ａは、ＣＳＴの発現を、そしてＢは、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターの発現をそれぞれ示す。
【配列表】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動物型糖鎖糖鎖をもつ糖タンパク質の生産方法に関する。本発明はまた、動物型糖鎖付加機能をもつ植物細胞および植物、より詳細には、糖タンパク質の末端糖鎖部分にシアル酸を付加し得る糖付加機構をもつ植物細胞および植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子組換え植物細胞を利用したバイオ医薬品などの有用タンパク質生産が注目を浴びて来ている。外来タンパク質を生産する宿主として植物細胞を利用する利点は、遺伝子操作が比較的容易であること、動物病原の汚染を回避出来ること、スケ−ルアップに関して低コスト化が見込めること、真核生物翻訳後修飾機構を有することなどである。
【０００３】
翻訳後修飾のなかで、Ｎ−結合型糖タンパク質糖鎖の合成および付加は、生物にとって重要な反応の一つである。生物における糖鎖の役割として、タンパク質の血中クリアランスからの保護、細胞間接着への関与、タンパク質のフォ−ルディング、タンパク質生理活性への関与などが挙げられる。植物細胞を利用した動物由来タンパク質の生産を考えた場合、目的タンパク質には植物型糖鎖が付加されてしまうため、本来有する生理活性を示さない場合がほとんどである。そこで、植物細胞のＮ−結合型糖鎖合成経路を改変し、オリジナルの動物由来タンパク質がもつ糖鎖の構造と類似の構造の糖鎖を有するタンパク質を生産させることは有効な手段の一つである。植物細胞と動物細胞ではＮ−結合型糖鎖合成機構は類似する部分もあるが、細部は異なっている。すなわち、植物および動物両細胞においてＧＮ２Ｍ３という糖鎖コア構造（ＧＮはアセチルグルコサミン、およびＭはマンノ−スをそれぞれ表す）が合成されるが、その後、動物細胞では糖鎖の非還元末端にガラクト−スおよびシアル酸が付加することにより糖鎖はさらに伸長する。これに対し、植物細胞では、還元末端Ｎ−アセチルグルコサミンへのα１,３−フコ−ス結合あるいはコアマンノ−スへのβ１，２−キシロ−ス結合が起こる。また、植物型糖鎖に見られるこれらの結合様式を示す糖が、生体内において免疫原性を示す報告もある。
【０００４】
動物型糖鎖において付加されるシアル酸（ＮｅｕＡｃ）は、糖タンパク質の機能にとって重要である。シアル酸は、インビボにおける糖タンパク質の分解を防ぐことが知られている。例えば、エリスロポエチンのような糖タンパク質の糖鎖から、シアル酸が除去されてガラクト−ス残基が露出すると、この糖タンパク質は、血中のクリアランス機構に探知され、肝臓において速やかに分解されてしまう。また、動物型糖鎖において付加されるシアル酸は、セレクチンなどの関与する白血球ホ−ミングもしくはその他の細胞間接着、ウイルスなどの病原の感染とも深く関わっていることが知られている。
【０００５】
しかし、植物細胞には、糖タンパク質糖鎖へのシアル酸付加機能はないと考えられている。さらに、植物細胞は、シアル酸を合成する機能さえも備えていないといわれている。したがって、植物細胞を利用した有用糖タンパク質の生産を考えた場合、宿主が目的タンパク質糖鎖へのシアル酸付加機能を有することが望まれる。植物細胞がその糖タンパク質糖鎖へシアル酸を付加するためには、少なくとも、シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＭＰは５’−シチジル酸を表す）、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターおよびシアル酸転移酵素が必要である。また、動物と微生物は、それぞれ異なるシアル酸生合成経路をもつことが知られている（図１）。図１の左に示されるのが動物におけるシアル酸生合成経路である。図示されるように、動物においては、Ｎ−アセチルマンノサミンから、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸−９−ホスフェートシンターゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホスファターゼによってＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）が生成される。これに対し、大腸菌では、Ｎ−アセチルマンノサミンから、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ（ｎｅｕＢ）によってシアル酸が生成される。
【０００６】
一般に、以下の文献に示されるように、遺伝子組換え植物細胞を得るための手法は、マイクロインジョクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙら）、エレクトロポ−レ−ション（Ｒｉｇｇｓら）、アグロバクテリウム媒介形質転換（Ｈｉｎｃｈｅｅら、Ｉｓｈｉｄａら（トウモロコシ））、直接遺伝子移入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら（イネ）、Ａｇｒａｃｅｔｕｓ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．およびＤｕｐｏｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌ．社製のデバイスを用いた衝撃粒子加速（Ｓａｎｆｏｒｄら）などが知られているが、シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーターを導入した植物細胞は知られていない。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：３２０−３３４（１９８６）。
【０００８】
【非特許文献２】
Ｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５６０２−５６０６（１９８６）
【０００９】
【非特許文献３】
Ｈｉｎｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９１５−９２１（１９８８）
【００１０】
【非特許文献４】
Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：７４５−７５０（Ｊｕｎｅ １９９６）
【００１１】
【非特許文献５】
Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７１７−２７２２（１９８４）
【００１２】
【非特許文献６】
Ｈａｙａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ９３：８５７−８６３（１９９０）（イネ））、
【００１３】
【特許文献１】
Ｓａｎｆｏｒｄら、米国特許第４，９４５，０５０号
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記従来の課題を解決し、動物型糖鎖構造をもつ糖タンパク質を生産するために、糖タンパク質の糖鎖の非還元末端にシアル酸を付加し、動物型糖鎖構造をもつ糖タンパク質を産生し得る植物細胞を提供する。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、シアル酸合成酵素、そしてＣＴＰおよびＮ−アセチルノイラミン酸から、シアル酸転移酵素の基質であるＣＭＰ−シアル酸を合成するＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、および糖鎖合成の場であるゴルジ体内へＣＭＰ−シアル酸を細胞質側から輸送する役割を担うＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）に注目した。シアル酸合成酵素およびＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）を生産する植物培養細胞を構築することが出来れば、培養液中にシアル酸合成酵素（ＣＳＳ）の基質（前駆体）を添加することで植物細胞内においてシアル酸およびＣＭＰ−シアル酸が合成され、さらには、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）生産能を有する植物細胞において、ＣＭＰ−シアル酸がゴルジ体内へ取り込まれることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
本発明は、シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコ−ドする遺伝子を植物に導入し、植物内の糖鎖付加経路を改変し、植物内で動物型糖鎖構造を発現する方法、それによって得られる植物細胞および植物を提供する。
【００１７】
本発明は、動物型糖鎖をもつ糖タンパク質の生産方法に関し、この方法は、糖鎖の非還元末端にシアル酸を付加し得る酵素の遺伝子、および異種糖タンパク質の遺伝子を導入して形質転換された植物細胞を得る工程、該植物細胞を培養する工程、および 該植物細胞の培養液を回収する工程を包含する。
【００１８】
上記動物型糖鎖をもつ糖タンパク質は、コア糖鎖および外部糖鎖を含み、該コア糖鎖が複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンから本質的になり、該外部糖鎖が非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分を含み得る。
【００１９】
上記外部糖鎖は直鎖状構造を備え得る。
【００２０】
上記外部糖鎖は分岐状構造を備え得る。
【００２１】
上記分岐糖鎖部分は、モノ、バイ、トリ、またはテトラ構造を備え得る。
【００２２】
本発明はまた、糖タンパク質の糖鎖の非還元末端にシアル酸を付加し得る糖付加機構を備えた植物細胞に関し、この植物細胞は、シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコ−ドする遺伝子で形質転換されている。
【００２３】
本発明はまた、シアル酸の前駆体を取り込み得る植物細胞に関し、この植物細胞は、シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコ−ドする遺伝子で形質転換されている。
【００２４】
本発明はまた、シアル酸を取り込み得る植物細胞に関し、この植物細胞は、シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコ−ドする遺伝子で形質転換されている。
【００２５】
本発明はまた、シアル酸を取り込み得るベシクルを有する植物細胞に関し、この植物細胞は、シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコ−ドする遺伝子で形質転換されている。
【００２６】
本発明はまた、上記植物細胞から再生された植物に関し、この植物は、動物型糖鎖付加機能をもち、より詳細には、糖タンパク質の末端糖鎖部分にシアル酸を付加し得る糖付加機構をもつ。
【００２７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２８】
本発明では、当該分野で公知の遺伝子工学的手法、生化学的手法、免疫学的手法などを用い得る。これらの手法は、市販のキット、抗体、標識物質などを使用して行い得る。
【００２９】
本発明の方法は、動物型糖鎖付加機能をもつ植物細胞に関する。本明細書で用いる用語「動物型糖鎖」は、シアル酸を含む糖鎖を意味する。好ましくは、動物型糖鎖は分岐構造を有する。
【００３０】
植物細胞は、任意の植物細胞であり得る。植物細胞は、培養細胞、培養組織、培養器官、または植物体のいずれの形態であってもよい。好ましくは、培養細胞、培養組織、または培養器官であり、より好ましくは培養細胞である。本発明の生産方法に使用され得る植物種は、遺伝子導入を行い得る任意の植物種であり得る。 本発明の生産方法に使用され得る植物種の例としては、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科の植物が挙げられる。
【００３１】
ナス科の植物の例としては、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ、またはＰｅｔｕｎｉａに属する植物が挙げられ、例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、トウガラシ、ペチュニアなどを含む。
【００３２】
イネ科の植物の例としては、Ｏｒｙｚａ、Ｈｏｒｄｅｎｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｃｃｃｈａｒｕｍ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、またはＺｅａに属する植物が挙げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシなどを含む。
【００３３】
アブラナ科の植物の例としては、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｗａｓａｂｉａ、またはＣａｐｓｅｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、大根、アブラナ、シロイヌナズナ、ワサビ、ナズナなどを含む。
【００３４】
バラ科の植物の例としては、Ｏｒｕｎｕｓ、Ｍａｌｕｓ、Ｐｙｎｕｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、またはＲｏｓａに属する植物が挙げられ、例えば、ウメ、モモ、リンゴ、ナシ、オランダイチゴ、バラなどを含む。
【００３５】
マメ科の植物の例としては、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｖｉｇｎａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｕｍ、Ｖｉｃｉａ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ａｌｐｈａｌｆａ、またはＭｅｄｉｃａｇｏに属する植物が挙げられ、例えば、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、クロ−バ、ウマゴヤシなどを含む。
【００３６】
ウリ科の植物の例としては、Ｌｕｆｆａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、またはＣｕｃｕｍｉｓに属する植物が挙げられ、例えば、ヘチマ、カボチャ、キュウリ、メロンなどを含む。
【００３７】
シソ科の植物の例としては、Ｌａｖａｎｄｕｌａ、Ｍｅｎｔｈａ、またはＰｅｒｉｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、ラベンダ−、ハッカ、シソなどを含む。
【００３８】
ユリ科に属する植物の例としては、Ａｌｌｉｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ、またはＴｕｌｉｐａに属する植物が挙げられ、例えば、ネギ、ニンニク、ユリ、チュ−リップなどを含む。
【００３９】
アカザ科の植物の例としては、Ｓｐｉｎａｃｉａに属する植物が挙げられ、例えば、ホウレンソウを含む。
【００４０】
セリ科の植物の例としては、Ａｎｇｅｌｉｃａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｔａｅｎｉａ、またはＡｐｉｔｕｍに属する植物が挙げられ、例えば、シシウド、ニンジン、ミツバ、セロリなどを含む。
【００４１】
本発明の生産方法に用いられる植物は、好ましくはタバコ、トマト、ジャガイモ、イネ、トウモロコシ、ダイコン、ダイズ、エンドウ、ウマゴヤシ、およびホウレンソウであり、より好ましくは、タバコ、トマト、ジャガイモ、トウモロコシ、およびダイズである。
【００４２】
本発明で用いられる用語「シアル酸合成酵素をコードする遺伝子」は、Ｎ−アセチルマンノサミンからＮ−アセチルムラミル酸（シアル酸）を生成し得る任意の酵素をコードする遺伝子を意味する。このような酵素をコードする遺伝子は任意の生物に由来し得る。このような酵素は、大腸菌（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０５２４８．１およびＡＦ３６１３７１．１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００２３６６、ＮＭＭ９５０５３、およびＮＭＵ４０７４０）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１２６２５６）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ０３４０８４およびＡＦ２１５６５９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４９８４１９．１）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＺ＿ＡＡＢＩ０１００００４０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＳＵＢ００２０）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＲＣＵ５７６８２）、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎｉｉ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＺ＿ＡＡＢＥ０１００００６４．１）、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ０１２８５０．１）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ０１１４２５．１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ａ３（２）およびＡＬ９３９１２１）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＨＰＹ４１８３５２およびＨＰＹ４１８３５４）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ０８３９０５．１）、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＺ＿ＡＡＡＧ０１００００１７．１）などに存在することが知られている。これらアミノ酸配列はそれぞれ約３３％以上の相同性を有している。その他に、Ｎ−アセチルマンノサミンからＮ−アセチルムラミル酸（シアル酸）を生成し得る酵素については、例えば、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９７ Ｊｕｌ．７（５）：６９７−７０１頁、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１ ｎｅｕＢ ｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ．、Ｖａｎｎ ＷＦ，Ｔａｖａｒｅｚ ＪＪ，Ｃｒｏｗｌｅｙ Ｊ，Ｖｉｍｒ Ｅ，Ｓｉｌｖｅｒ ＲＰ．を参照のこと。なお、「シアル酸合成酵素をコードする遺伝子」は、市販のものを購入してもよいし、これら植物での発現に適切なように改変して用いてもよい。このような方法は当業者に周知である。
【００４３】
本発明で用いられる「ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）をコードする遺伝子」もまた同様に、ＣＴＰとＮ−アセチルノイラミン酸とからＣＭＰ−シアル酸を生成し得る任意の酵素をコードする遺伝子を意味する。このような酵素は、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００９９０８）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１６８８２８）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ０１１３３９．１およびＡＥ０１１３３８．１）、Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２７４１４．１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２８８９６．２）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０５０２３）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２１５６５９．１およびＡＦ１６７３４４．１、ＡＦ１３０９８４）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ６０１４６）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ ｓｔｒ．（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｃ２Ａ ＡＥ０１１０８８）に存在することが知られている。本発明で用いるＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）をコードする遺伝子もまた、任意の動物種に由来し得、哺乳動物に由来することが好ましく、ヒトに由来することがより好ましい。ＣＳＳをコードする遺伝子は、この酵素をコ−ドすることが知られているヌクレオチド配列を用いて任意の動物細胞から単離してもよいし、市販のものを購入してもよいし、これらを植物での発現に適切なように改変して用いてもよい。このような方法は当業者に周知である。
【００４４】
本発明で用いられる用語「ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）をコードする遺伝子」もまた同様に、植物細胞の細胞質からコルジ体中にＣＭ−シアル酸を輸送し得る任意のタンパク質をコードする遺伝子を意味する。このような酵素は、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｙ１２０７４）、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ７１２６８）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０１２２５２．１およびＮＭ＿０１１８９５．１）、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０７００４７．１およびＮＭ＿０７００４６．１）、Ｏｒｙｚｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ５１０１９７．４）、Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＭ４２７６０９．１およびＡＹ０６４４０７．１）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＩ３７１９２５、１、ＢＩ６３５０６５．１、およびＢＩ６４０１０１．１）、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＧ７１３４６８．１、ＢＭ４２７６０９、およびＢＱ１２６１１４．１）、Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＥ５５７５２３．１）、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＷ７３８９９１）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＷ１４１１１２およびＡＡ９２５６１１．１）、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｕｒｏｎｅｃｔｅｓ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＷ０１３２０８．１）に存在することが知られている。ＣＳＴをコードする遺伝子もまた、この酵素をコ−ドすることが知られているヌクレオチド配列を用いて任意の動物細胞から単離してもよいし、市販のものを購入してもよいし、これらを植物での発現に適切なように改変して用いてもよい。このような方法は当業者に周知である。
【００４５】
本明細書で用いる用語「遺伝子」は、通常、構造遺伝子部分を意味する。遺伝子には、植物での発現に適切なように、プロモ−タ−、オペレ−タ−、およびタ−ミネ−タ−などの制御配列が連結され得る。
【００４６】
本明細書で用いる用語「異種糖タンパク質」は、本発明に用いられる植物において本来発現されない糖タンパク質を意味する。
【００４７】
異種糖タンパク質の例としては、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗体、ワクチン、レセプタ−、血清タンパク質などが挙げられる。酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダ−ゼ、キナ−ゼ、グルコセレブロシダ−ゼ（ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）、アルファ−ガラクトシダ−ゼ、フィタ−ゼ、ＴＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクタ−ゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）などが挙げられる。ホルモンおよびサイトカインの例としては、エンケファリン、インタ−フェロンα、β、γ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、絨毛性性腺刺激ホルモン、インタ−ロイキン−２、４、６、１２、インタ−フェロン−ベ−タ、インタ−フェロン−ガンマ、エリスロポイエチン、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、プロラクチン、卵胞刺激ホルモンなどが挙げられる。抗体の例としては、ＩｇＧ、ｓｃＦｖなどが挙げられる。ワクチンの例としては、Ｂ型肝炎表面抗原、ロタウイルス抗原、大腸菌エンテロトキシン、マラリア抗原、狂犬病ウイルスｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓのＧタンパク質、ＨＩＶウイルス糖タンパク質（例えば、ｇｐ１２０）などが挙げられる。レセプタ−およびマトリックスタンパク質の例としては、ＥＧＦレセプタ−、フィブロネクチン、α１−アンチトリプシン、凝固因子ＶＩＩＩなどが挙げられる。血清タンパク質の例としては、アルブミン、補体系タンパク質、プラスミノ−ゲン、コルチコステロイド結合グロブリン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｌｏｂｕｌｉｎ）、スロキシン結合グロブリン（Ｔｈｒｏｘｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｌｏｂｕｌｉｎ）、プロテインＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ）などが挙げられる。
【００４８】
「異種糖タンパク質の遺伝子」は、目的の異種糖タンパク質をコ−ドすることが知られているヌクレオチド配列を用いて任意の細胞から単離してもよいし、市販のものを購入してもよいし、これらを植物での発現に適切なように改変して用いてもよい。
【００４９】
シアル酸合成酵素、ＣＳＳおよびＣＳＴをコ−ドする遺伝子、ならびに異種糖タンパク質の遺伝子は、当該分野で公知の方法により、植物細胞へ導入される。これらの遺伝子は、別々に導入してもよいし、同時に導入してもよい。前述の文献に加え、以下の文献が、種々の植物に遺伝子を導入する方法を開示している。
【００５０】
Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７（１９８８）；Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５．２７−３７ ９１９８７）(タマネギ); Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８５２６−８５３０（１９９０） (タバコクロロプラスト)；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（１９８８）(ダイズ)；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６．９２３−９２６（１９８８）(ダイズ);Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：４３０５−４３０９（１９８８）(トウモロコシ)；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：５５９−５６３（１９８８）(トウモロコシ)；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４（１９８８）（トウモロコシ)；Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３−８３９（１９９０）；およびＧｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：６０３−６１８（１９９０）(トウモロコシ)；Ｋｏｚｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１９４−２００（１９９３）(トウモロコシ)；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２７４−２７７（１９８９）(イネ)；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７−９６２（１９９１）(イネ)；Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：７３６−７４０（１９９０）(イネ)；Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＥＰ ０ ３３２ ５８１(カモガヤなどのイネ科の植物）；Ｖａｓｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１５５３−１５５８（１９９３）（コムギ）；Ｗｅｅｋｓ ｅｔａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１０７７−１０８４（１９９３）（コムギ）；Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：３７−４８（１９９４）（オオムギ）；Ｊａｈｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８９：５２５−５３３（１９９４）（オオムギ）；Ｕｍｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：２６３−２６６（１９８７）（コットン）；Ｃａｓａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１２１２−１１２１６（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３）（ソルガム）；Ｓｏｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１５８９−１５９４（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９２）（オ−トムギ）；Ｔｏｒｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １４：６３５−６４０（１９９５）（オ−トムギ）；Ｗｅｅｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１０７７−１０８４（１９９３）（コムギ）；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９４／１３８２２（コムギ）およびＮｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ５：２８５−２９７（１９９４）（コムギ）。
【００５１】
微粒子銃によって、トウモロコシ中に組換えＤＮＡ分子を導入するために特に好適な実施形態は、Ｋｏｚｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：１９４−２００（１９９３），Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ ８５：１１９−１２３（１９９５）およびＫｏｚｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ７９２：１６４−１７１（１９９６）に記載されている。トウモロコシについて別の好適な実施形態であるプロトプラスト形質転換法は、ＥＰ０ ２９２ ４３５に記載されている。植物の形質転換は、単一のＤＮＡ種または複数のＤＮＡ種（すなわち同時形質転換）を用いて行うことができる。
【００５２】
遺伝子が導入された植物においては、当該分野で公知の方法により、導入された遺伝子の発現が確認され得る。このような方法として、銀染色、ウェスタンブロッティング、ノザンハイブリダイゼ−ション、酵素活性の検出などが挙げられる。導入された遺伝子を発現する細胞は、形質転換細胞である。
【００５３】
得られた形質転換植物細胞は、培養細胞の状態で維持されてもよいし、特定の組織または器官へと分化させてもよいし、完全な植物体に再生させてもよい。あるいは、完全な植物体から得られる、種子、果実、葉、根、茎、花などの部分であってもよい。
【００５４】
形質転換植物細胞の培養、分化および再生のためには、当該分野で公知の手法および培地が用いられる。このような培地には、例えば、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地、ＧａＭｂｏｒｇ Ｂ５（Ｂ）培地、Ｗｈｉｔｅ培地、Ｎｉｔｓｃｈ＆Ｎｉｔｓｃｈ（Ｎｉｔｓｃｈ）培地などが含まれるが、これらに限定されるわけではない。これらの培地は、通常、植物生長調節物質（植物ホルモン）などが適当量添加されて用いられる。
【００５５】
また、動物型糖鎖を持つ糖タンパク質の生産のためには、形質転換植物細胞が増殖し、そして所望の遺伝子産物を生産する限り、基本的には、炭素源、窒素源、およびビタミン類、塩類のような植物細胞の生育に必要な微量栄養素を含む任意の組成の培養培地を用いることができる。生産された異種タンパク質の安定化、および異種タンパク質を効率良く分泌するために、ポリビニルピロリドン、タンパク質分解酵素阻害剤などを添加してもよい。
【００５６】
形質転換植物細胞により生産された植物型の糖鎖をもつ糖タンパク質は、培養された植物細胞、植物体、または植物細胞の培養液から単離され得る。
【００５７】
植物細胞の培養液からの糖タンパク質の単離は、当業者に周知の方法を用いて実施され得る。例えば、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノ−ルなどによるタンパク質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相等のカラムクロマトグラフィ−、限外濾過、高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）等の手法を単独で、または組み合わせて用いて、培養液から糖タンパク質を精製して単離し得る。
【００５８】
あるいは、本発明の糖タンパク質は、植物細胞または植物体から単離または抽出されてもよい。植物細胞または植物体から単離または抽出する方法は、当該分野で周知である。
【００５９】
さらには、本発明の糖タンパク質は、形質転換細胞中に含まれたままの状態で食用に供され得る。本発明の糖タンパク質は、動物型の糖鎖構造を有するので、抗原性を有さず、それゆえ、ヒトを含む動物への投与に適している。
【００６０】
以下に、本発明の植物細胞を得るための代表的な手法を例示する。
【００６１】
１．シアル酸合成酵素をコードする遺伝子を植物に導入する植物感染用ベクターの構築。
【００６２】
本発明の植物細胞を得るために、まず、シアル酸合成酵素を植物細胞にクローニングする。シアル酸合成酵素をコードする遺伝子として、当業者に公知である大腸菌由来のシアル酸合成酵素、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１株のｎｅｕＢ遺伝子を用いることができる。ｎｅｕＢ遺伝子を、例えば、植物発現用プロモーターであるカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下に配置することにより構築した植物外来遺伝子発現用カセットを、既存のベクターｐＢＩ１２１に導入し、植物感染用ベクターｐＢＩ１２１−ＣＮを得る。なお、本明細書で用いる用語「既存」は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＣＡなどの製造会社から市販されているか、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）などの寄託機関などから入手可能であることを意味する。本明細書で用いる用語「既存」はまた、これら既存のものから、当業者に公知の方法を用いて改変されたものをも包含する意味で用いられる。
【００６３】
２．ＣＳＳをコードする遺伝子、およびＣＳＴをコードする遺伝子を植物に導入する植物感染用ベクターの構築。
【００６４】
次いで、ＣＳＳおよびＣＳＴをコードする遺伝子を植物細胞に導入する。ＣＳＳおよびＣＳＴをコードする遺伝子として、例えば、公知であるヒト腎臓由来ＣＳＳ（以下ｈＣＳＳと称する）遺伝子およびヒト腎臓由来ＣＳＴ（以下ｈＣＳＴと称する）遺伝子を用いることができる。これら遺伝子を、それぞれ、植物発現用プロモーターであるカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下に配置し、抗生物質ハイグロマイシン耐性遺伝子を保持する既存のプラスミドｐＧＰＴＶ−ＨＰＴにそれぞれ導入し、プラスミドｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＳおよびｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＴを得る。
【００６５】
３．シアル酸合成系遺伝子群を保持するベクターの構築。
【００６６】
a２，６−シアル酸合成酵素（ＳＴ）遺伝子（例えばヒト由来ＳＴ）を、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下に配置した既存のカセットを、上記のヒト由来ｈＣＳＳ遺伝子を導入した植物感染用ベクターに挿入し、植物発現用ベクターｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴを構築する。次いで、このｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴから、上記の大腸菌由来ｎｅｕＢ遺伝子の植物感染用ベクターｐＢＩ１２１−ＣＮ、および上記のｈＣＳＴ遺伝子植物感染用ベクターｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＴ−ＣＮを用い、ｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮまたはｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮ−ｈＣＳＴを構築する。なお、ここで、ＨＰＴ、ｈＣＳＳ、ｈＳＴ、ＣＮ、ｈＣＳＴは、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒト由来ＣＭＰ−シアル酸合成酵素遺伝子、ヒト由来α２，６−シアル酸合成酵素遺伝子、シアル酸合成酵素遺伝子、ヒト由来ＣＭＴ−シアル酸トランスポーター遺伝子をそれぞれ表し、記載の順序に従って、植物感染用ベクター中に導入されている。
【００６７】
４．シアル酸合成系遺伝子群を発現する植物体の構築。
【００６８】
上記の植物感染用ベクターｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮまたはｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮ−ｈＣＳＴを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４株に導入し、植物感染用アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４−ＨＰＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮあるいはＬＢＡ４４０４−ＨＰＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮ−ｈＣＳＴを得る。
【００６９】
次いで、これらの植物感染用アグロバクテリウムを用い、タバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＳＲ１）またはb１，４−ガラクトース転移酵素（以下ｈＧＴ）遺伝子を導入し糖鎖構造が改変していることが確認されている既存のこのタバコ植物の形質転換体Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍｃｖ ＳＲ１−ｈＧＴをさらに形質転換する。
【００７０】
すなわち、１００ｍｇ／ｌのリファンピシン、５０ｍｇ／ｌのストレプトマイシンおよび５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて培養した上記感染用アグロバクテリウムを、上記タバコ植物の葉の切片と混合し、２５℃明所にて３日間、改変ＭＳ（０．１ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、０．１ｍｇ／ｌベンジルアデニン、１０ｍｇ／ｌチアミン塩酸塩、１ｍｇ／ｌニコチン酸、１ｍｇ／ｌ塩酸ピリドキシン、１０ｍｇ／ｌミオイノシトールを含むムラシゲ スクーグ培地用混合塩類（和光純薬））寒天培地上で共存培養する。
【００７１】
次いで、得られた感染葉を滅菌水で洗浄し、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含む改変ＭＳ寒天培地上に静置し、２５℃明所にて1週間除菌培養を行う。次いで、この感染葉を、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンおよび５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含む改変ＭＳ寒天培地に移して静置し、２５℃明所にて茎葉の誘導を行う。
【００７２】
得られた茎葉を切り取り、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンおよび５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含むＭＳ寒天培地（１０ｍｇ／ｌチアミン塩酸塩、１ｍｇ／ｌニコチン酸、１ｍｇ／ｌ塩酸ピリドキシン、１０ｍｇ／ｌミオイノシトールを含むムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（和光純薬））に継代し、２５℃明所にて発根させる。
【００７３】
発根の確認された形質転換植物体から、ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡを調製し、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ法を用いることで目的遺伝子の導入および発現の確認を行う。
【００７４】
次いで、ｍＲＮＡの産生が確認されたクローンについて鉢上げし、植物体の再生を行う。得られた形質転換植物は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＳＲ１−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮ、ＳＲ１−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮ−ｈＣＳＴ、またはＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＳＲ１−ｈＧＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮ、ＳＲ１−ｈＧＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮ−ｈＣＳＴである。
【００７５】
５．糖鎖へのシアル酸付加の確認。
【００７６】
ｈＧＴで形質転換した植物体における、糖タンパク質にシアル酸が付加していることの確認を、この植物体の細胞を破砕した後、細胞内糖タンパク質の調製を行い、得られた細胞内糖タンパク質からヒドラジン分解法を利用し糖鎖を切り出すことにより行う。すなわち、まず、植物体の破砕物をＴＳＫゲルカラムにかけ、糖鎖を精製する。精製された糖鎖を、２-アミノピリジン（ＰＡ）と反応させることによって糖鎖の還元末端をＰＡ化標識する。得られたＰＡ化糖鎖を逆相（ＲＰ−）ＨＰＬＣおよびサイズ分画（ＳＦ−）ＨＰＬＣを用いて精製し、既知糖鎖との比較、シアリダーゼ（例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）消化およびβ１，４−ガラクトシダーゼ（例えばＤｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）消化と、マススペクトル分析とを組み合わせ、糖鎖の構造を決定する。シアリダーゼ消化によって、非還元末端にシアル酸残基を有するＰＡ化糖鎖の存在が確認されたならば、これらの糖鎖をマススペクトルで分析する。
【００７７】
マススペクトルは、例えば、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥＴＭ ＲＰ ＢｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙＴＭ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ （ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施することができる。
【００７８】
上記シアリダーゼ消化およびβ１，４−ガラクトシダーゼ消化の反応生成物は、蛍光検出器を備えたＨＩＴＡＣＨＩ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ(日立)を用いる逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣで分析され得る。ＲＰ−ＨＰＬＣにおいては、励起および蛍光波長をそれぞれ３１０ｎｍおよび３８０ｎｍとして蛍光強度を測定する。分析カラムとしては、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲ ｃｏｌｕｍｎ（６×２５０ｍｍ、ナカライテスク）が用いられ、通常、流速１．２ｍｌ／分の下で、０．０２％ＴＦＡ水溶液中のアセトニトリル濃度を４０分間で０％から６％に増加させることでＰＡ化糖鎖を溶出することができる。
【００７９】
６．外来タンパク質の糖鎖へのシアル酸付加の確認。
【００８０】
外来タンパク質の例として、マウスモノクローナル抗体タンパク質を構成するＨ鎖およびＬ鎖を植物細胞で発現させる。この目的のために、Ｈ鎖およびＬ鎖をそれぞれコードする遺伝子を、植物感染用プロモーターであるカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下に配置し、抗生物質ハイグロマイシン耐性遺伝子を保持するプラスミドｐＧＰＴＶ−ＨＰＴにそれぞれ導入し、発現カセットを作成する。本発明者らは、これら２つの遺伝子の発現カセットを同一ベクター上にもつプラスミドｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ＩｇＧを既に得ている。このプラスミドｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ＩｇＧから、Ｈ鎖およびＬ鎖発現用カセットを切り出し、抗生物質ビアラホス耐性遺伝子とを保持する既存のプラスミドｐＧＰＴＶ−ＢＡＲに導入し、ベクターｐＧＰＴＶ−ＢＡＲ−ＩｇＧを構築する。これを用い、タバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＳＲ１）、またはb１，４−ガラクトース転移酵素（ｈＧＴ）遺伝子が導入され糖鎖構造が改変されていることが確認された形質転換体Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍｃｖ ＳＲ１−ｈＧＴをさらに形質転換する。１００ｍｇ／ｌのリファンピシン、５０ｍｇ／ｌのストレプトマイシンおよび５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地中で培養した感染用アグロバクテリウムを、タバコの葉の切片と混合し、２５℃明所にて３日間、改変ＭＳ寒天培地上で共存培養する。この感染葉を滅菌水で洗浄した後、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含む改変ＭＳ寒天培地上に移して静置し、さらに２５℃明所にて１週間除菌培養を行う。次いで、得られた感染葉を、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンおよび１０ｍｇ／ｌのビアラホス（明治製菓）を含む改変ＬＳ寒天培地に移して静置し、２５℃明所にて茎葉の誘導を行う。
【００８１】
得られた茎葉を切り取り、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンおよび１０ｍｇ／ｌのビアラホスを含むＭＳ寒天培地に継代し、２５℃明所にて発根させる。この結果、発根の確認された形質転換植物体よりゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡを調製し、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ法を用いることで目的遺伝子の導入および発現の確認を行う。ｍＲＮＡの産生が確認されたクローンに関して、鉢上げし植物体の再生を行う。
【００８２】
得られた植物体Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＳＲ１− ＩｇＧあるいはＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＳＲ１−ｈＧＴ−ＩｇＧについて、抗体タンパク質の発現を、抗マウス二次抗体を用いて確認し、プロテインＡ（アマシャム）あるいはプロテインＧ（アマシャム）カラムを用いて精製し、糖鎖構造を確認する。
【００８３】
鎖構造解析は、以下の方法で行う。精製した目的糖タンパク質よりヒドラジン分解法を利用し糖鎖を切り出す。ＴＳＫゲルカラムにて糖鎖を精製し、２−アミノピリジン（ＰＡ）と反応させることで糖鎖の還元末端をＰＡ化標識する。得られたＰＡ化糖鎖を逆相（ＲＰ−）ＨＰＬＣとサイズ分画（ＳＦ−）ＨＰＬＣで精製し、既知糖鎖との比較、β１，４−ガラクトシダーゼ消化、マススペクトル分析を行い糖鎖の構造を決定する。β１，４−ガラクトシダーゼ消化の結果、非還元末端にガラクトース残基を有するＰＡ化糖鎖の存在を確認し、さらに、これらの糖鎖をマススペクトルで分析する。
【００８４】
７．シアル酸が付加された外来タンパク質を発現する植物体の構築。
【００８５】
上記で得られた形質転換植物Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＳＲ１−ｈＧＴ−ＩｇＧと、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＳＲ１−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮまたはＳＲ１−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮ−ｈＣＳＴとを交配する。あるいはＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＳＲ１−ＩｇＧとＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ ＳＲ１−ｈＧＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮまたはＳＲ１−ｈＧＴ−ｈＣＳＳ−ｈＳＴ−ＣＮ−ｈＣＳＴとを交配する。
【００８６】
交配することにより得られた多重形質転換体は、ｈＧＴ遺伝子、ｈＣＳＳ遺伝子、ｈＳＴ遺伝子、ＣＮ遺伝子、ＩｇＧ遺伝子および、ｈＧＴ遺伝子、ｈＣＳＳ遺伝子、ｈＳＴ遺伝子、ＣＮ遺伝子、ｈＣＳＴ遺伝子、ＩｇＧ遺伝子をもつ植物体である。この多重形質転換体について、先と同様に、ＩｇＧ抗体タンパク質の発現を、抗マウス二次抗体を用いて確認する。発現した抗体を、プロテインＡまたはプロテインＧカラムを用いて精製した後、その糖鎖構造を確認する。このために、精製抗体をヒドラジン分解し、得られた分解液から、ＴＳＫゲルカラムを用いて糖鎖を精製する。得られた糖鎖を２-アミノピリジン（ＰＡ）と反応させ糖鎖の還元末端をＰＡ化標識する。得られたＰＡ化糖鎖を、逆相（ＲＰ−）ＨＰＬＣとサイズ分画（ＳＦ−）ＨＰＬＣで精製し、既知糖鎖との比較、シアリダーゼ消化、およびマススペクトル分析によって糖鎖構造を決定する。シアリダーゼ消化によって、非還元末端にシアル酸残基を有するＰＡ化糖鎖の存在が確認され、これらの糖鎖構造がマススペクトルによって分析される。
【００８７】
以下に実施例を用いて本発明を詳細に説明する。以下の実施例は本発明の例示であって、本発明を制限するものではない。
【００８８】
【実施例】
本実施例を要約すると、本実施例は、モデル植物細胞であるタバコ培養細胞ＢＹ２株において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１株由来のシアル酸合成酵素（ｎｅｕＢ）遺伝子を、タバコＮ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ（ＧｎＴ−Ｉ）のＣＴＳ（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｔｅｍ）領域との融合タンパク質（ＣＴＳ−ｎｅｕＢ）として発現させ、さらに、ヒト由来ｈＣＳＳ遺伝子およびヒト由来ｈＣＳＴ遺伝子をタバコ培養細胞ＢＹ２株に各々導入して発現させ、各タンパク質が植物細胞内において活性をもつことを示したものである。
【００８９】
本実施例では、本発明に用いる宿主の代表例としてタバコ培養細胞ＢＹ２株を用いた。ＢＹ２株（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．ｃｖ．Ｂｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ ２）は、理化学研究所ライフサイエンス筑波研究センタ−、ジ−ンバンク室植物細胞開発銀行のカタログ番号ＲＰＣ１から細胞株名ＢＹ２として入手可能である。
【００９０】
方法
１．ＣＴＳ−ｎｅｕＢ遺伝子の取得および植物感染用ベクターの構築。
【００９１】
ｎｅｕＢ遺伝子はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１株よりＰＣＲ法を用いて増幅した。用いたプライマーは以下の通りである：
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ配列；ｎｅｕＢ５’（５’−ＴＴＴＡＧＣＴＣＧＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＴＡＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ−３’）（配列番号７）；
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ配列はｎｅｕＢ３’（５’−ＴＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＣＣＣＣＣＴＧＡＴＴＴＴＴＡＡＡＴＴＣ−３’）（配列番号８）。なお、下線部はＸｈｏＩ制限部位を示す。
【００９２】
一方、ＣＴＳ領域のＰＣＲ増幅には、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ． ＳＲ１株のｃＤＮＡを鋳型とし以下のプライマーを用いて行った：
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ配列；ＣＴＳ−５ＳａｌＩ（５’−ＴＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＧ−３’）（配列番号９）；
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ配列；ＣＴＳ−３ＳａｌＩ（５’−ＡＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＣＴＴＡＡＣＴＧＴＣ−３’）（配列番号１０）。なお、下線部はＳａｌＩサイトを示す。
【００９３】
得られたｎｅｕＢ（配列番号１）およびＣＴＳ遺伝子を、ＸｈｏＩおよびＳａｌＩ部位で連結し、目的とするＣＴＳ−ｎｅｕＢ遺伝子を取得した。得られた遺伝子をプラスミドｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＣＡ）に導入し、植物発現用プロモーターであるカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下に置いた。構築した植物外来遺伝子発現用カセットをｐＢＩ１２１に導入し、植物感染用ベクターｐＢＩ１２１−ＣＮを得た。ｐＢＩ１２１−ＣＮを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４株に導入し、植物感染用アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４−ＣＮを構築した。
【００９４】
２．ヒト由来ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ｈＣＳＳ）遺伝子、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ｈＣＳＴ）遺伝子のクローニングおよび植物感染用ベクターの構築。
【００９５】
ヒト腎臓由来ｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法を用いて目的遺伝子の増幅を試みた。用いたプライマー配列は以下の通りである。
【００９６】
ｈＣＳＳ遺伝子関して：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２７１３８８ Ｂｏｕｑｕｉｎ，Ｔ．ａｎｄ Ｍｕｎｄｙ，Ｊ．を参考にした。
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ配列；ｈＣＳＳ−１（５’−ＧＴＴＡＣＴＡＧＴＡＴＧＧＡＣＴＣＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＧＣＣＧ ＣＣＡＣＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＡＡＣＣＣＧＣＧＧＧＧＧＣＧＡＣＣＧＴＣＣＣ−３’）（配列番号１１）；
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ配列；ｈＣＳＳ−２（５’−ＴＧＧＧＡＧＣＴＣＣＴＡＴＴＴＴＴＧＧＣＡＴＧＡＡＴＴＡＴＴ−３’）（配列番号１２）。
【００９７】
ｈＣＳＴ遺伝子に関して：Ｉｓｈｉａ、Ｎ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０、１０７４−１０７８（１９９６を参考にした。
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ配列；ｈＣＳＴ−１（５’−ＧＴＴＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＡＣＡＡＴ−３’）（配列番号１３）；
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ配列；ｈＣＳＴ−２（５’−ＴＴＧＧＡＧＣＴＣＴＣＡＣＡＣＡＣＣＡＡＴＡＡＣＴ ＣＴＣＴＣ−３’）（配列番号１４）。
【００９８】
各々得られたＰＣＲ産物（ｈＣＳＳ：配列番号２およびｈＣＳＴ：配列番号３）をプラスミドｐＢＩ２２１に導入し、植物発現用プロモーターであるカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下に置いた。構築した植物外来遺伝子発現用カセットを、抗生物質ハイグロマイシン耐性遺伝子を保持するプラスミドｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ（ＡＴＣＣ ７７３８８）に導入した。この結果得られたプラスミドｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＳおよびｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−ｈＣＳＴを、それぞれ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４株に導入し、植物感染用アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４−ＨＰＴ−ｈＣＳＳおよびＬＢＡ４４０４−ＨＰＴ−ｈＣＳＴを構築した。
【００９９】
３．形質転換タバコ培養細胞の調製。
【０１００】
改変ＬＳ液体培地中で４日目培養したタバコＢＹ２細胞の培養液４ｍｌに対し、１００ｍｇ／ｌのリファンピシン、５０ｍｇ／ｌのストレプトマイシンおよび５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地で２日目培養した上記感染用アグロバクテリウムの培養液を１００μｌ加えて混合し、３日間共存培養した。
【０１０１】
次いで、感染細胞を、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンおよび３０％のスクロースを含む改変ＬＳ液体培地で洗浄した後、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４−ＣＮによる感染細胞は、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンおよび１００ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む改変ＬＳ寒天培地に、そしてアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４−ＨＰＴ−ｈＣＳＳおよびｈＣＳＴによる感染細胞は、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンおよび５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含む改変ＬＳ寒天培地にそれぞれ播種し、カルス形成の誘導を行った。この結果、得られたカルスから、ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡを調製し、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ法を用いることで目的遺伝子の導入および発現の確認を行った。
【０１０２】
次いで、ｍＲＮＡの産生が確認されたクローンについて、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリン、５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンまたは１００ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび３０％のスクロースを含む改変ＬＳ液体培地で培養を行った。
【０１０３】
４．ｎｅｕＢ活性の測定。
【０１０４】
４．１．粗酵素液の調製。
【０１０５】
培養７日目の細胞培養液を、２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって培養液から細胞を分離した。回収した細胞に、２分の１容量の０．２５Ｍスクロース、１ｍＭ塩化マンガン、５０ｍＭ塩化カリウムを含む、２０ｍＭビシン緩衝液ｐＨ８．５を加え、手動ホモジナイザーを用いて破砕した。
【０１０６】
次いで、得られた溶液を、４℃、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって細胞抽出液を調製した。得られた細胞抽出液を、４℃、１００，０００ｒｐｍで１時間超遠心分離し、ミクロソーム画分を得た。
【０１０７】
得られたミクロソーム画分を、１０ｍＭ塩化マンガン、１Ｍ塩化ナトリウム、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む、２０ｍＭビシン緩衝液ｐＨ８．５に懸濁し、粗酵素液とした。
【０１０８】
４．２．酵素反応。
【０１０９】
得られた粗酵素液に、１０ｍＭ塩化マンガン、１０ｍＭＮ−アセチルマンノサミン一水和物、１０ｍＭホスホエノールピルビン酸三水和物を含む、２０ｍＭビシン緩衝液ｐＨ８．５となる様に反応液を加え、３７℃で２４時間反応させた。酵素反応は２０Ｎのリン酸を加え停止させた。
【０１１０】
４．３．シアル酸のＤＭＢ（１，２−ｄｉａｍｉｎｏ−４，５−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅ）蛍光標識。
【０１１１】
上記酵素反応液に、終濃度が７ｍＭＤＭＢ、１．４Ｍ２−メルカプトエタノール、１．４Ｍ酢酸、１８ｍＭハイドロサルファイトナトリウムとなる様に蛍光標識試薬を混合し、５０℃で、２．５時間反応させた。反応は氷冷することで停止させた。
【０１１２】
４．４．ＨＰＬＣ分析。
【０１１３】
シアル酸の蛍光標識産物は、蛍光検出器を有するＨＩＴＡＣＨＩ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（日立）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣ法で分析した。蛍光強度は、励起波長３７３ｎｍおよび蛍光波長４４８ｎｍで測定した。ＲＰ−ＨＰＬＣ法では、分析カラムとしてＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲ ｃｏｌｕｍｎ（６×２５０ｍｍ；ナカライテスク）を用い、流速１．２ｍｌ／分の下で、溶液Ａ（アセトニトリル：メタノール：水＝４：７：８９）および溶液Ｂ（アセトニトリル：メタノール：水＝２０：３５：４５）について、１サイクル８０分間として溶液Ｂを５０分間から６５分間の間１００％流すことによりＤＭＢ化されたシアル酸の溶出を行った。
【０１１４】
４．５．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ （Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）分析。
【０１１５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析は、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥＴＭ ＲＰ ＢｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙＴＭ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。
【０１１６】
５．ｈＣＳＳ活性測定。
【０１１７】
５．１．形質転換体からのｈＣＳＳ粗酵素液の調製。
【０１１８】
培養７日目の形質転換培養細胞培養液から、室温で３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって、形質転換細胞を回収した。得られた形質転換細胞に、等量の、２０ｍＭＭｇＣｌ２を含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を加えてホモジナイザーで細胞を粉砕した。得られた細胞破砕物を、４℃、８，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。
【０１１９】
５．２．ＣＭＰ−シアル酸の合成。
【０１２０】
酵素反応は、４０μｌの粗酵素液、２０ｍＭＭｇＣｌ２、５ｍＭＮｅｕＡｃ、５ｍＭＣＴＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｋ．Ｋ．）を含む、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．５）５０μｌ中、３７℃で５時間反応させて行った。
【０１２１】
また、ドナー基質としてＮｅｕＡｃの代わりに２−ｋｅｔｏ−３−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏ−ｎｏｎｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＫＤＮ）および２−ｋｅｔｏ−３−ｄｅｏｘｙｏｃｔｏｎａｔｅ（ＫＤＯ）もまた用いた。を用いて同様の反応を行った。
【０１２２】
５．３．インビトロシアル酸転移反応。
【０１２３】
ＣＭＰ−シアル酸合成反応後、上記反応液に１００ｐｍｏｌ／ｍｌのＰＡ化糖鎖（Ｔａｋａｒａ ｓｈｕｚｏ）、１０ｍＵ／ｍｌのヒト由来α２，６−シアル酸転移酵素、および、終濃度が１００ｍＭとなるようにＨＥＰＥＳｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）を加え、３７℃で１６時間インキュベートした。
【０１２４】
５．４．ＨＰＬＣ分析。
【０１２５】
酵素反応産物を蛍光検出器を有するＨＩＴＡＣＨＩ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（日立）を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を行った。励起および蛍光波長は３１０ｎｍ、３８０ｎｍとし、蛍光強度を測定した。分析カラムにはＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲ ｃｏｌｕｍｎ（６×２５０ｍｍ；ナカライテスク）を用い、流速１．２ｍｌ／分の下で０．０２％ＴＦＡ水溶液中のアセトニトリル濃度を４０分間で０％から６％に増加させることでＰＡ化糖鎖を溶出させた。
【０１２６】
５．５．ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）を利用したＣＭＰ−シアル酸合成酵素活性測定。
【０１２７】
酵素反応は、１６μｌの粗酵素液、２０ｍＭＭｇＣｌ２、９０μＭ〔１４Ｃ〕ＮｅｕＡｃ、５ｍＭＣＴＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ （Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｋ．Ｋ．）を含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．５）２０μｌで、３７℃で３時間反応を行った。反応液０．５μｌを、ＴＬＣアルミニウムプレートｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０（ＭＥＲＣＫ）にスポットし、展開溶媒液（エタノール：１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ７．５＝７：３）で１０時間展開した。展開後のプレートを１ｃｍ間隔に切断し、各断片の放射能活性を、シンチレーションカウンターを用いて測定した。
【０１２８】
５．６．糖タンパク質糖鎖へのインビトロシアル酸転移酵素反応。
【０１２９】
１６μｌの植物細胞抽出粗酵素液、２０ｍＭＭｇＣｌ２、９０μＭ〔１４Ｃ〕ＮｅｕＡｃ、５ｍＭＣＴＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ （Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｋ．Ｋ．）を含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．５）２０μｌの反応系で３７℃で３時間反応を行った後、２５μｌの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．４、１μｌの１ｍＵヒト由来α２，６−シアル酸転移酵素、そして５μｌの１０ｍｇ／ｍｌアシアロフェツインを添加し、３７℃で１６時間インキュベートした。その後、反応液に１ｍｌのｃｏｌｄ−ｗａｔｅｒを加え反応を停止させた。得られたサンプルをＡｄｖａｎｔｅｃ Ｔｏｙｏ Ａ０４５Ａ０２５Ａニトロセルロースフィルターに通し、さらに１ｍｌのｃｏｌｄ−ｗａｔｅｒでフィルターを３回洗浄した。洗浄後のフィルターを乾燥し、フィルター上の残存１４Ｃ放射能活性値を測定した。
【０１３０】
６．ｈＣＳＴ活性測定。
【０１３１】
６．１．ミクロソーム画分の調製。
【０１３２】
培養７日目の細胞培養液を２，０００ｒｐｍで１０分間遠心することで、培地より細胞を分離した。回収した細胞に２分の１量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．１を加え、手動ホモジナイザーを用いて破砕し４℃、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心することで細胞抽出液を調製した。得られた細胞抽出液を４℃、１００，０００ｒｐｍで１時間超遠心し、ミクロソーム画分の調製を行った。ミクロソーム画分は終濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなる様に、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．１に懸濁した。
【０１３３】
６．２．抗ヒト由来ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター抗体の作成。
【０１３４】
抗体作成に利用したアミノ酸配列はＣＴＳＩＱＱＧＥＴＡＳＫＥＲＶＩＧＶである。この内、Ｃ末端側より１７アミノ酸残基はヒト由来ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターＣ末端からの１７アミノ酸残基に一致する。抗体作成はシグマジェノシスジャパンに依頼し、抗体（ａｎｔｉ ＣＭＰ−Ｓｉａ）はウサギを免疫化することで得た。
【０１３５】
６．３．ウエスタンブロッティング解析。
【０１３６】
ミクロソーム画分を、１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いて１２０Ｖで２時間ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、１ｍＡ／ｃｍ２の定電流下で４５分間ニトロセルロース膜への転移を行った。イムノブロッティングでは、一次抗体としてＲａｂｂｉｔ ａｎｔｉ ＣＭＰ−Ｓｉａ、二次抗体としてｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧを用い、染色にはＰＯＤイムノステインキット（Ｗａｋｏ）を利用した。
【０１３７】
６．４．植物培養細胞由来ベシクルの調製。
【０１３８】
培養７日目の植物細胞培養液を２，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、細胞と培地を分離した。回収した培養細胞を２５０ｍＭスクロース、１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で１回洗浄し、２，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、再度細胞を回収した。洗浄後の細胞に対し３倍量のｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭスクロース、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｔａｂｌｅｔ／５０ｍｌＣｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４））を加え、手動ホモジナイザーを用いて細胞を破砕した。４℃、８，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、得られた上清を細胞抽出液とした。細胞抽出液を４℃、１００，０００ｒｐｍで１時間超遠心分離し、得られたペレットをベシクルとした。ベシクルは１０ｍｇ／ｍｌとなる様に２５０ｍＭスクロース、１ｍＭＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジメルカプトプロパノールを含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｄｅｒ（ｐＨ７．０）に懸濁した。
【０１３９】
６．５．．ヒト由来ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター活性の測定。
【０１４０】
先に調製したベシクル溶液５０μｌに対し、反応基質溶液（２５０ｍＭスクロース、１ｍＭＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジメルカプトプロパノール、１ｔａｂｌｅｔ／５０ｍｌＣｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼインヒビターおよび１μＭＣＭＰ−［３Ｈ］シアル酸（３３，６００Ｃｉ／ｍｏｌ）を含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０））を５０μｌ加えることで反応を開始した。ＣＭＰ−シアル酸取り込み反応は３０℃で３分間行った。ただし、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌの反応は０℃で０分間のものである。反応液中にｃｏｌｄ ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２５０ｍＭスクロース、１ｍＭＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジメルカプトプロパノールおよび１μＭＣＭＰ−シアル酸を含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０））を１ｍｌ加えることで反応を停止した。得られたサンプルをＡｄｖａｎｔｅｃ Ｔｏｙｏ Ａ０４５Ａ０２５Ａニトロセルロースフィルターに通し、さらに１ｍｌのｃｏｌｄ ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎでフィルターを３回洗浄した。洗浄後のフィルターを乾燥し、フィルター上の残存３Ｈ放射能活性値を測定した。
【０１４１】
また、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２５０ｍＭスクロース、１ｍＭＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジメルカプトプロパノールを含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｄｅｒ（ｐＨ７．０）に懸濁し、４℃で１時間インキュベートした１０ｍｇ／ｍｌベシクル溶液についても、同様にトランスポーター活性の測定を行った。
【０１４２】
次に、植物細胞のＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター活性を測定した。先に調製したベシクル溶液５０μｌに対し、反応基質溶液（２５０ｍＭスクロース、１ｍＭＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジメルカプトプロパノール、１ｔａｂｌｅｔ／５０ｍｌＣｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）および１μＭＵＤＰ−［１４Ｃ］ガラクトース（３０５Ｃｉ／ｍｏｌ）を含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０））を５０μｌ加えることで反応を開始した。ＵＤＰ−ガラクトース取り込み反応は３０℃で３分間行った。ただし、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌの反応は０℃で０分間のものである。反応液中にｃｏｌｄ ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２５０ｍＭスクロース、１ｍＭＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジメルカプトプロパノールおよび１μＭＵＤＰ−ガラクトースを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０））を１ｍｌ加えることで反応を停止した。得られたサンプルをＡｄｖａｎｔｅｃ Ｔｏｙｏ Ａ０４５Ａ０２５Ａニトロセルロースフィルターに通し、さらに１ｍｌのｃｏｌｄ ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎでフィルターを３回洗浄した。洗浄後のフィルターを乾燥し、フィルター上の残存１４Ｃ放射能活性値を測定した。
【０１４３】
結果
１．ｎｅｕＢを生産するタバコ培養細胞の解析。
【０１４４】
ｎｅｕＢ遺伝子の発現が確認された形質転換体の１つであるＣＮ−Ｌ株、および野生型ＢＹ２株の培養細胞から調製した粗酵素溶液について、上記４．１〜４．３の記載方法に従って、各々シアル酸合成反応を行った後ＤＭＢ化し、上記４．４の記載の方法に従ってＨＰＬＣによる解析を行った。図２にＨＰＬＣ分析結果を示す。
【０１４５】
図２に見られるように、ＣＮ−Ｌ株については、標準のＤＭＢ−ＮｅｕＡｃ（シアル酸）と同様の溶出位置に期待されるピークが得られた（図２の真中のチャート）。しかしながら、一方でｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌのＢＹ２株についても極微量ではあるが同様のピークが得られた（図２の一番下のチャート）。なお、図２の一番上のチャートが標準のＤＭＢ−ＮｅｕＡｃのＨＰＬＣ溶出位置である。
【０１４６】
また、これらのピークを回収しマススペクトル分析を行ったところ、図３に示すように、ＣＮ−Ｌ株由来のピークの分子量４２５．４３（図３の真中）およびＢＹ２株由来のピークの分子量４２５．５１（図３の右）はともに、計算されたＤＭＢ−ＮｅｕＡｃの分子量（図３の左）に一致した。
【０１４７】
２．ヒト由来ｈＣＳＳを生産するタバコ培養細胞の解析。
【０１４８】
２．１．Ｉｎ ｖｉｔｒｏシアル酸転移酵素反応。
【０１４９】
タバコＢＹ２株、およびｈＣＳＳ遺伝子が導入された形質転換体の１つｈＣＳＳ１５株の培養細胞から上記５．１．に記載のように調製した細胞抽出液を粗酵素液として、上記５．２．〜５．３．に記載のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＣＭＰ−シアル酸合成反応を行った後、得られた酵素反応産物を基質としてＰＡ化糖鎖へのシアル酸転移酵素反応を行った。その結果、ｈＣＳＳ１５株の抽出物を用いた反応系において、ＰＡ化糖鎖へのシアル酸転移が認められた（図４ＡのＩＩＩに示されるようにＳｉａ１Ｇａｌ２ＧＮ２Ｍ３−ＰＡが検出された）。図４のＡはシアル酸転移酵素反応後の反応液の、そして図４のＢはシアル酸転移酵素反応前の反応液のＨＰＬＣ分析結果である。このようにして得られたＰＡ化糖鎖（Ｓｉａ１Ｇａｌ２ＧＮ２Ｍ３−ＰＡ）を回収し、マススペクトル解析を行った結果、得られた分子量２０１１．２５は、推定される計算値の分子量（図５）と一致した。さらに、これを、Ｎアセチルノイラミニダーゼで消化しＨＰＬＣ分析を行うと、Ｇａｌ２ＧＮ２Ｍ３−ＰＡが得られた（データは示さず）。これらの結果は、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素反応においてＣＴＰおよびシアル酸から、目的とするＣＭＰ−シアル酸が合成されたことを示している。これは、ｈＣＳＳ１５株において、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素が生産され、かつ活性を有していたことを示す。
【０１５０】
その一方、ＫＤＮおよびＫＤＯを基質として同様のＣＭＰ−シアル酸合成酵素反応およびシアル酸転移酵素反応を試みたが、ＰＡ化糖鎖へのシアル酸の転移は確認できなかった（図４のＡのＩＩおよびＩＶ）。
【０１５１】
３．ＴＬＣ分析。
【０１５２】
ｈＣＳＳ１５株およびＢＹ２株の抽出物を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＭＰ−シアル酸合成酵素反応産物を、さらに、上記５．５．に記載のようにＴＬＣを用いて解析した。図６に結果を示す。ｈＣＳＳ１５株の抽出物を粗酵素液として用いた反応産物中には、コントロールＣＭＰ−〔３Ｈ〕ＮｅｕＡｃ（図６のＡ）と同じ展開位置（Ｆｒａｃｔｉｏｎ１２）に、ＣＭＰ−〔１４Ｃ〕ＮｅｕＡｃのピークが存在した（図６のＣ）。一方、このピークはＢＹ２株の抽出物を粗酵素液として用いた反応産物中には存在しなかった（図６のＢおよびＤ）。これは、ｈＣＳＳ１５株においてＣＭＰ−シアル酸合成酵素が生産され、かつ活性を有していたことを示す。
【０１５３】
４．アシアロフェツインへのｉｎ ｖｉｔｒｏシアル酸転移酵素反応。
【０１５４】
上記５．６．に記載の方法に従って、ニトロセルロース膜を用いて洗浄濾過した酵素反応産物の残存放射能活性を測定したところ、ｈＣＳＳ１５株の抽出物を粗酵素液として用いた反応産物中に、反応時間の増加とともに、アクセプター基質であるアシアロフェツインへ〔１４Ｃ〕ＮｅｕＡｃが転移したことが示された（図７）。
【０１５５】
５．ｈＣＳＴを生産するタバコ培養細胞の解析（ウエスタンブロッティング解析）。
【０１５６】
ｍＲＮＡの生産が確認された（データは示さず）５つの形質転換体（Ｂ１９、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２６およびＢ２８）の培養細胞から、上記６．１．に記載の方法に従ってミクロソーム画分を調製し、上記６．３．に記載のように抗ｈＣＳＴ抗体を用いてウエスタンブロッティング解析を行った。結果を図８に示す。図８に示されるように、これらの形質転換体のミクロソーム画分に、約２４．２ｋＤａのバンドが確認された（Ｂ１９〜２８）。その一方、野生型ＢＹ２株の細胞のミクロソーム画分では、このバンドは存在しなかった。この結果は、これら形質転換体でｈＣＳＴが生産されたことを示す。
【０１５７】
６．トランスポーター活性の測定。
【０１５８】
上記の形質転換体Ｂ２１、Ｂ２６およびＢ２８株について、上記６．４．に記載の手順に従ってベシクルを調製し、上記６．５．に記載の方法によってそれらのトランスポーター活性を測定した。結果を図９のＡに示す。図９のＡに示されるように、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして用いた野生型ＢＹ２株では、０℃、０分と３０℃、３分のデータを比較してもトランスポート活性は見られなかったが、形質転換体では、Ｂ２１およびＢ２６株において、３分間で約２０ｆｍｏｌ−ＣＭＰ−［３Ｈ］シアル酸／ｍｇ−ベシクル、Ｂ２８株では約１０ｆｍｏｌ−ＣＭＰ−［３Ｈ］シアル酸／ｍｇ−ベシクルのトランスポート活性が確認された。なお、図９のＡにおいて、横軸は各形質転換体を示し、各形質転換体のトランスポーター活性は、棒グラフと隣接する矩形領域で表され、棒グラフは、３０℃、３分の活性を、そして矩形領域は０℃、０分の活性を示している。これらの結果は、形質転換体Ｂ２１、Ｂ２６およびＢ２８株で発現したｈＣＳＴが活性を保持していることを示す。
【０１５９】
ｈＣＳＴは、本来、膜タンパク質である。そこで、形質転換体Ｂ２１、Ｂ２６およびＢ２８株で発現したｈＣＳＴが、実際に膜に局在しているかどうかを調べた。このため、これら形質転換体から得られたベシクル溶液を、界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理し、上記と同様にトランスポーター活性を測定した。この結果、各形質転換体の処理試料では、いずれもトランスポーター活性は認められなかった。従って、これら形質転換体で発現したｈＣＳＴは、いずれも膜タンパク質として存在し、界面活性剤処理によりベシクルから除去されたと考えられる。
【０１６０】
その一方で、各株から調製されたベシクル試料が活性を損なうことなく調製されていることを示すｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ実験として、各株のベシクル試料について、上記６．５．に示す手順に従って、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター活性を測定した。基質は、ＵＤＰ−［１４Ｃ］ガラクトースである。図９のＢに結果を示す。図９のＢに示されるように、野生型のＢＹ２株では、３分間で約８５ｆｍｏｌのＵＤＰ−［１４Ｃ］ガラクトースの取り込みが確認されたのに対し、形質転換体Ｂ２１株で約４００ｆｍｏｌ、Ｂ２６株で約２４０ｆｍｏｌ、そしてＢ２８株では約２００ｆｍｏｌの取り込み活性が確認された。
【０１６１】
まとめ
本実施例において、本発明者らは、シアル酸合成能をもつ植物細胞を構築するために、タバコ培養細胞ＢＹ２株において、大腸菌由来のシアル酸合成酵素、ヒト由来ＣＭＰ−シアル酸合成酵素、そしてヒト由来ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターを発現させた。
【０１６２】
１．ＣＴＢ−ｎｅｕＢ融合タンパク質を植物細胞で発現させた結果、その形質転換体ＣＮ−Ｌ株は、シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を合成する能力をもつに至った。ところが、興味深いことに、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌの野生型ＢＹ２株においても、その抽出物を粗酵素溶液としてシアル酸合成反応を行ったところ、シアル酸を合成する能力をもっている可能性が示唆された（図２および３）。植物細胞は、一般に、シアル酸を合成する機能はないと考えられているので、植物においても、シアル酸合成酵素に類似の酵素群が存在する可能性がある。その遺伝子クローニングまたはタンパク質機能の解明が待たれる。
【０１６３】
２．ＣＭＰ−シアル酸合成酵素は、糖タンパク質の糖鎖にシアル酸を転移するシアル酸転移酵素の基質であるＣＭＰ−シアル酸を、ＣＴＰとシアル酸とから合成する酵素である。本発明者らは、タバコ培養細胞ＢＹ２株において生産させたＣＭＰ−シアル酸合成酵素を用いてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを合成した。図４Ａおよび図５の結果から、この様にして生産されたＣＭＰ−ＮｅｕＡｃが、実際に、シアル酸含有動物型糖鎖の合成に利用されたこと、すなわち、動物由来のシアル酸転移酵素の基質となることが示された。
【０１６４】
その一方、ＮｅｕＡｃのアナログであるＫＤＮあるいはＫＤＯは、ニジマス精子由来のＣＭＰ−シアル酸合成酵素の基質となるが、動物由来のＣＭＰ−シアル酸合成酵素の基質として利用されにくいという報告がある（Ｔｅｒａｄａ ｅｔａｌ）。また、ラット由来のα２，６−シアル酸転移酵素は、糖鎖非還元末端β１，４−ガラクトース結合にＫＤＮをシアル酸転移することが知られている（Ａｎｇａｔａ ｅｔ ａｌ）。そこで、本発明者らはこれらシアル酸のアナログを基質として、同様に、糖鎖への付加を試みが、シアル酸の付加を確認することはできなかった（図４Ｂ）。このことは、ＫＤＮおよびＫＤＯが、植物細胞において生産されたヒト由来ＣＭＰ−シアル酸合成酵素の基質とはならなかったことを示す。さらに、ＴＬＣにおいて、形質転換体が、ＣＴＰおよび［１４Ｃ］ＮｅｕＡｃからＣＭＰ−［１４Ｃ］ＮｅｕＡｃを合成する能力を有することを確認した後、本発明者らは、実際に、ＣＭＰ−［１４Ｃ］ＮｅｕＡｃが糖タンパク質上に存在するアシアロ糖鎖に付加されることを証明した。これは、β１，４−ガラクトース転移酵素を発現する植物細胞ＧＴ６株の様なモデル植物細胞に、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素を導入すれば、植物細胞内で糖タンパク質糖鎖にシアル酸を付加し得る有用植物細胞の構築が可能であるということを示す。
【０１６５】
３．また、本発明者らは、植物細胞におけるヒト由来ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターの発現も試みた。糖ヌクレオチドトランスポーターは、糖鎖修飾の場であるゴルジ体内に存在する糖転移酵素の基質である糖ヌクレオチドを、細胞質側からゴルジ体内へ輸送するために必要とされるタンパク質である。抗ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター抗体を用いたウエスタンブロッティング解析の結果を考慮して、形質転換体Ｂ２１、Ｂ２６およびＢ２８株におけるトランスポーター活性を測定した。その結果、ベシクル１ｍｇあたりＢ２１およびＢ２６株では、酵素反応時間３分間の間に約２０ｆｍｏｌの、そしてＢ２８では約１０ｆｍｏｌのＣＭＰ−シアル酸取り込み活性を有することが示された。
【０１６６】
さらに、ベシクルを界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理し、同様のトランスポート活性を測定すると、見かけ上の活性は確認されなかった。このことは、発現させたＣＭＰ−シアル酸トランスポーターが、ベシクル膜に存在することを示している。
【０１６７】
また、本発明者らが、先に、植物細胞での糖鎖合成経路改変を期待して、タバコＢＹ２株に、ヒト由来β１，４−ガラクトース転移酵素を導入した際、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターを発現させなくとも、糖鎖にガラクトースが付加された。また、ＢＹ２株を含むいくつかの植物において、β１，３−ガラクトース結合を含むいわゆるルイスＡ構造をもつ糖鎖が存在することが報告されていることから、少なくともＢＹ２株にはＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターが存在していると考えられた。これは、今回のＣＭＰ−シアル酸トランスポーター活性測定条件の指標として利用できる。そこで、我々は、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター活性の測定を行った。野生型ＢＹ２株おいて、ＵＤＰ−ガラクトースのトランスポート活性３分間の反応において、ベシクル１ｍｇあたり約８５ｆｍｏｌの取り込み活性が確認された。その一方、形質転換体についても、同様に、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポート活性を有することが示された。
【０１６８】
４．本発明者らは、植物に、シアル酸およびＣＭＰ−シアル酸合成能を付加させることができた。植物を利用した動物由来糖タンパク質の生産が盛んに行われている現在、より本物に近いタンパク質の生産へ向けて、糖鎖へのシアル酸付加機能を有する植物細胞の構築は、有用物質生産への有効な手段を提供する。
【０１６９】
【発明の効果】
動物型糖鎖付加機能をもつ植物細胞が提供される。シアル酸を取り込み、糖タンパク質に含まれる糖鎖のガラクト−ス残基にシアル酸を付加し得る植物細胞およびそれを用いる方法が提供される。本発明の植物細胞により産生される糖タンパク質は、動物型の糖鎖を有するので、動物特にヒトに対して抗原性を有さず、それゆえ、ヒトを含む動物への投与に適する糖タンパク質が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】動物と微生物におけるシアル酸生合成経路を示す図である。
【図２】本発明のシアル酸合成酵素が導入された植物において合成されたシアル酸を示す図である。
【図３】本発明のシアル酸合成酵素が導入された植物において合成されたシアル酸を示す図である。
【図４Ａ】本発明のＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）が導入された植物におけるＣＭＰ−シアル酸の合成を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ａと組み合わせて、本発明のＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）が導入された植物におけるＣＭＰ−シアル酸の合成を示す図である。
【図５】本発明のＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）が導入された植物におけるＣＭＰ−シアル酸の合成を示す図である。
【図６】本発明のＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）が導入された植物におけるＣＭＰ−シアル酸の合成を示す図である。
【図７】本発明のＣＭＰ−シアル酸合成酵素が導入された植物における、糖タンパク質へのシアル酸の転移を示す図である。同位体標識したシアル酸を基質として合成されたＣＭＰ−シアル酸を、市販のヒト由来シアル酸転移酵素を用いてアシアロフェツインに転移させた。
【図８】本発明のＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）が導入された植物における、ＣＳＴの発現を示す図である。
【図９】本発明のＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）が導入された植物における、トランスポーターの発現を示す図である。Ａは、ＣＳＴの発現を、そしてＢは、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターの発現をそれぞれ示す。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物型糖鎖をもつ糖タンパク質の生産方法であって、
糖鎖の非還元末端にシアル酸を付加し得る酵素の遺伝子、および異種糖タンパク質の遺伝子を導入して形質転換された植物細胞を得る工程、
該植物細胞を培養する工程、および
該植物細胞の培養液を回収する工程、を包含する、方法。
【請求項２】
前記動物型糖鎖をもつ糖タンパク質が、コア糖鎖および外部糖鎖を含み、該コア糖鎖が複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンから本質的になり、該外部糖鎖が非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記外部糖鎖が直鎖状構造をもつ、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記外部糖鎖が分岐状構造をもつ、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記分岐糖鎖部分が、モノ、バイ、トリ、またはテトラ構造である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
糖タンパク質の糖鎖の非還元末端にシアル酸を付加し得る糖付加機構を備えた植物細胞であって、
シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコ−ドする遺伝子で形質転換された、植物細胞。
【請求項７】
シアル酸の前駆体を取り込み得る植物細胞であって、
シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコ−ドする遺伝子で形質転換された、植物細胞。
【請求項８】
シアル酸を取り込み得る植物細胞であって、
シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコ−ドする遺伝子で形質転換された、植物細胞。
【請求項９】
シアル酸を取り込み得るベシクルを有する植物細胞であって、
シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコ−ドする遺伝子で形質転換された、植物細胞。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれかに記載の植物細胞から再生された植物体。
【請求項１】
動物型糖鎖をもつ糖タンパク質の生産方法であって、
糖鎖の非還元末端にシアル酸を付加し得る酵素の遺伝子、および異種糖タンパク質の遺伝子を導入して形質転換された植物細胞を得る工程、
該植物細胞を培養する工程、および
該植物細胞の培養液を回収する工程、を包含する、方法。
【請求項２】
前記動物型糖鎖をもつ糖タンパク質が、コア糖鎖および外部糖鎖を含み、該コア糖鎖が複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンから本質的になり、該外部糖鎖が非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記外部糖鎖が直鎖状構造をもつ、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記外部糖鎖が分岐状構造をもつ、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記分岐糖鎖部分が、モノ、バイ、トリ、またはテトラ構造である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
糖タンパク質の糖鎖の非還元末端にシアル酸を付加し得る糖付加機構を備えた植物細胞であって、
シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコ−ドする遺伝子で形質転換された、植物細胞。
【請求項７】
シアル酸の前駆体を取り込み得る植物細胞であって、
シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコ−ドする遺伝子で形質転換された、植物細胞。
【請求項８】
シアル酸を取り込み得る植物細胞であって、
シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコ−ドする遺伝子で形質転換された、植物細胞。
【請求項９】
シアル酸を取り込み得るベシクルを有する植物細胞であって、
シアル酸合成酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＣＳＳ）、およびＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（ＣＳＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコ−ドする遺伝子で形質転換された、植物細胞。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれかに記載の植物細胞から再生された植物体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００６−３３３７０１（Ｐ２００６−３３３７０１Ａ）
【公開日】平成１８年１２月１４日（２００６．１２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００３−７６８７（Ｐ２００３−７６８７）
【出願日】平成１５年１月１５日（２００３．１．１５）
【出願人】（５９８１６９６９７）
【出願人】（５９８１６９６８６）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月１４日（２００６．１２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１月１５日（２００３．１．１５）
【出願人】（５９８１６９６９７）
【出願人】（５９８１６９６８６）
【Ｆターム（参考）】
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