微生物増殖方法
【目的】 流加の指標としてＤＯを採用して装置を簡素化する。
【構成】 培地中の溶存酸素量が設定値以上となった際に、培地にグルコース栄養液を添加する。培地のグルコース濃度は一定範囲に保持されるので、増殖の効率が向上する。ＤＯは検出が、迅速かつ簡単であり、装置は特別なものとならず、複雑化しない。
【構成】 培地中の溶存酸素量が設定値以上となった際に、培地にグルコース栄養液を添加する。培地のグルコース濃度は一定範囲に保持されるので、増殖の効率が向上する。ＤＯは検出が、迅速かつ簡単であり、装置は特別なものとならず、複雑化しない。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、流加培養による微生物の増殖方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】微生物を増殖するにあたり、培地を貯留する培養槽中へ培養時間の経過に応じて連続または間欠的に栄養液を流加する流加培養が知られている。この流加培養では、培地中の特定成分の濃度を任意に制御可能であり、例えば糖濃度を培養する微生物に好適な一定範囲に保持することができる。このため目的とする微生物を効率よく増殖できることから広く採用されている。
【０００３】流加培養における栄養液の流加のタイミングを制御するに際して、１）糖濃度（特にグルコース濃度）をバイオセンサ（グルコースセンサ）で検出して、この検出値に応じて栄養液を流加する方法、２）溶存酸素量を指標とする方法、３）ｐＨ値、４）酸化還元電位、５）呼吸商（ＣＯ2ガス量とＯ2消費量との比）、６）排気中のエタノール濃度および７）菌体濃度をそれぞれ指標とする方法等が提案されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記の各方法中では、１）のグルコースセンサによる方法が広く用いられているが、この方法にはグルコースセンサの検出速度が迅速ではないことや、装置が複雑化するなどの問題があった。また、他の２）〜７）の方法においてもいまだ満足するものはなかった。このため、指標の検出速度が迅速で装置を簡素化できる方法が求められていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段および作用】発明者は、微生物を培養している培地中のグルコース濃度の増減と溶存酸素量の増減との間にきわめて密接な関係が存在することから、グルコース濃度に代えて溶存酸素量を栄養液添加の指標とするための研究を重ね、本発明を完成したものである。
【０００６】上記課題を解決するためになされた本発明の要旨は、流加培養による微生物増殖方法において、培地中の溶存酸素量が増加した際に、前記培地に栄養液を添加することを特徴とする微生物増殖方法にある。以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【０００７】本発明における増殖の対象となる微生物の種類に制限はなく、流加培養が可能な微生物であればよい。栄養液は、例えばグルコース、酵母エキス、リン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）等の一種または数種を含有する、周知の栄養液を使用すればよく、特に制限はない。また、栄養液の濃度や添加量も、対象とされる微生物に応じて適宜選択されればよい。例えば酵母を増殖する場合であれば、グルコースを含有する栄養液を、培地中のグルコース濃度が０．５％以下程度となるように添加するとよい。これは、培地のグルコース濃度が０．５％を越えると、アルコールの生成量が増加して菌体の増殖が抑制される傾向になるためである。したがって培地の栄養濃度は、このような代謝産物の生成をできるだけ抑制し、菌体を増殖させる濃度範囲とすることが好ましい。さらに、培地、培養温度、空気供給量、培地の攪拌などの諸条件も、対象とされる微生物の増殖条件に応じて設定されればよく、特に制限はない。
【０００８】培地中の溶存酸素量（ＤＯ）の検出には、周知のＤＯセンサを使用できる。培地中の微生物は、栄養物、例えばグルコースを消費しつつ増殖するが、この際、通常は空気として培地中に吐出、供給されている酸素も消費される。培地中の栄養物が消費されて不足してくると微生物の増殖は抑制されるので、酸素消費量も減少する。したがって、酸素に余剰が生ずることになり培地中のＤＯは増加する。このＤＯの増加に合わせて栄養液を流加すれば、培地の栄養物濃度を増殖に好適な濃度範囲に保持することができる。このため、微生物の増殖は抑制されることはなく、増殖効率は向上する。
【０００９】特に、栄養物不足の初期に栄養物を流加すれば、栄養物不足の状態を短時間で解消できる。この栄養物不足の初期にＤＯは急激に増加するが、この際のＤＯの増加率は増加傾向にあり二次微分値は正である。したがって、ＤＯの増加率が増加傾向（＝二次微分値が正）にある際に、栄養液を流加すれば栄養物濃度を一層好適な範囲に保持することができる。
【００１０】ＤＯセンサによるＤＯ値の検出は、ほぼリアルタイムで迅速になされる。また、ＤＯセンサによるＤＯの検出には特別な装置構成を必要としないので、例えば検出値を指標として栄養液の流加をオンライン制御する際にも、増殖装置が複雑化することはない。
【００１１】
【実施例】次に、図面を参照して本発明の実施例を説明する。図１に本実施例において使用した増殖装置１０を示す。ステンレス製の培養槽１２の頭部１２ａ中央には、モータ１４にて駆動される攪拌機１６が設置されており、培養槽１２の内部に挿通された攪拌軸１８に設けられた複数の攪拌翼２０で、培養槽１２内容物を攪拌可能である。また、頭部１２ａには、培養対象となる微生物を植菌するための植菌口２２、培養槽１２内の発泡状態を検出する泡センサ２４、培養槽１２から気体を排出するためのベント２６およびスチーム配管２８が、それぞれ接続されている。さらに、頭部１２ａに設けられた流加ノズル３０には、ポンプ３２を介して栄養液槽３４が接続されており、栄養液槽３４からの栄養液を培養槽１２へ供給可能である。
【００１２】栄養液槽３４はボールバルブ３６を介してアルカリ槽３８に接続されている。また、栄養液槽３４およびアルカリ槽３８は電磁弁４０を介して、培養槽１２の胴１２ｂ上部に設けられているアルカリノズル４２に接続されており、栄養液、アルカリ液を個別または同時に培養槽１２へ供給可能である。このアルカリノズル４２の下方に設けられている消泡ノズル４４には、電磁弁４６を介して消泡液槽４８が接続されており、培養槽１２へ消泡液を供給可能となっている。
【００１３】培養槽１２の胴１２ｂには、アルカリノズル４２および消泡ノズル４４とほぼ同レベルに、一対の空気ノズル５０、５２が設けられており、図示省略したフィルタ機構にて無菌状態とされた無菌空気が供給される空気配管５４に接続されている。空気ノズル５２は、さらに培養槽１２内に設置されているスパージャ５６に接続されており、空気配管５４からの空気を培養槽１２内に吐出可能となっている。
【００１４】培養槽１２は、胴１２ｂから底部１２ｃにかけてジャケット５８が設けられており、図示省略したヒータ、ポンプ等を備えた温調ユニット６０から温水配管６２を介して供給される温水によって温度調節可能である。また、ジャケット５８へは水配管６４から水を、スチーム配管２８からスチームを供給して冷却または加熱可能である。また培養槽１２の胴１２ｂには、ジャケット５８を貫通して温度計６６、ＤＯセンサ６８（インゴールド社製）およびｐＨ計７０が設置されており、それぞれ培養槽１２内の温度、溶存酸素量およびｐＨを測定して出力可能である。さらに胴１２ｂには同様に、サンプリングノズル７２が設置されており、培養槽１２内からサンプリング可能である。他方、培養槽１２の底部１２ｃには、ジャケット５８を外れて吐出ノズル７４が設置されており、培養槽１２の内容物を排出可能である。
【００１５】なお、図示を省略したが、培養槽１２にはマンホール、ハンドホール、レベルゲージ、プレッシャーゲージなどが備えられており、同様に他の槽や各配管にはゲージ類、ベント、ドレン、スチームトラップ等が備えられている。図２に示すように、増殖装置１０には、制御機構８０、オートプロッタ８２他を備えた操作パネル８４が設けられている。この制御機構８０は周知のマイクロコンピュータ（図示略）を備えており、キー８６やスイッチ８８等を介して各種の指示の入力が可能である。制御機構８０は、これらキー８６等を介しての入力や泡センサ２４、温度計６６、ＤＯセンサ６８、ｐＨ計７０をはじめとする計装機器類の検出値等が入力されると、予め記憶しているプログラムに従って演算処理し、該入力に応じてポンプ３２、電磁弁４０、４６、温調ユニット６０等の作動を制御可能である。また、前記温度計６６他の出力値は制御機構８０を介してオートプロッタ８２に送信され、記録紙にプロットされる。
【００１６】次に、上記構成の増殖装置１０を用いて微生物を増殖する際の操作について説明する。まず培養槽１２内に培地および栄養液を注入し、攪拌、通気して所定のグルコース濃度の培地とする。なお、培地は増殖期間を通じて攪拌および通気が継続される。培地温度、ｐＨ値を調整後、培養槽１２に微生物を植菌する。
【００１７】この後、微生物は培地中の栄養物、例えばグルコースを消費して増殖する。消費によって低下するグルコース濃度を適正範囲に保持するために、グルコースを含有する栄養液が流加される。栄養液流加のタイミングは、ＤＯセンサ６８によって検出されて制御機構８０へ入力されるＤＯ値を指標として決定される。図３に流加ルーチンを示すが、制御機構８０は、所定の時間を経過する毎に流加ルーチンを繰り返し実行する。
【００１８】まずＤＯセンサ６８の検出値（ＤK）が入力されると、制御機構８０は、ＤＯセンサ６８の検出値（ＤK）とＤＯの設定値（ＤS）とを比較し（ステップ２００）、ＤKがＤS以上であれば次のステップ３００へ進み、ＤKがＤS未満であればリターンへ抜けて所定の時間経過を待つ。ステップ３００では、制御機構８０は、ポンプ３２を予め設定された時間だけ稼働させて、設定量の栄養液を培養槽１２へ流加させる。その後リターンへ抜けて、所定の時間を経過する毎に流加ルーチンを繰り返し実行する。このように設定値以上にＤＯが増加した際にグルコースを流加すればグルコース濃度を適切な範囲に保持できる。この場合のＤＯとグルコース濃度の変化を図４に示す。
【００１９】また、１）ＤＯセンサ６８の検出値ＤKの単位時間当りの増加率を算出して、これが設定値以上となった際にグルコースを流加したり、２）ＤKの単位時間当りの増加率と直前の同増加率とを比較して、これが設定比率以上に増加した際にグルコースを流加する等のグルコース流加制御も可能である。
【００２０】次に、上記構成の増殖装置１０を用いた微生物増殖の実施例を、比較例と共に示す。なお、実施例、比較例ともに、培地は次の組成によった。
培地組成本醸醤油 １０％食塩 １０％滅菌水 残余（実施例１）
微生物種類：酵母（Z.rouxii(S-012)）
初発菌体数：４．０ｘ１０6cells/ml培地量：５０l（植菌時グルコース濃度０．５％）
培地温度：３０℃培地ｐＨ：５．２通気量：３０l/min攪拌：２００rpm栄養液：グルコース濃度５０％、培地に対して０．３％となる分量で流加増殖時間：４３時間最終菌体数：２．７ｘ１０9cells/ml（比較例１）比較例１は、バッチ培養による増殖実験の例であり、培養中のグルコースの追加はない。
【００２１】微生物種類：酵母（Z.rouxii(S-012)）
初発菌体数：２．５ｘ１０6cells/ml培地量：５０l（植菌時グルコース濃度２．６％）
培地温度：３０℃培地ｐＨ：５．２通気量：３０l/min攪拌：１００rpm増殖時間：４３時間最高菌体数：２．８ｘ１０8cells/ml（開始後１８時間）
（比較例２）比較例２は、比較例１と同様、バッチ培養による増殖実験の例であり、培養中のグルコースの追加はないが、攪拌数を変化させてＤＯを一定（３ppm)に保持した。
【００２２】微生物種類：酵母（Z.rouxii(S-012)）
初発菌体数：３．８ｘ１０6cells/ml培地量：５０l（植菌時グルコース濃度２．６％）
培地温度：３０℃培地ｐＨ：５．２通気量：３０l/min攪拌：１００〜４００rpm増殖時間：４３時間最終菌体数：５．５ｘ１０8cells/ml図５は、上記実施例１、比較例１および２における培地の濁度、菌体数（生菌）およびアルコール濃度を経過時間毎にプロットしたグラフである。実施例１の菌体数は、比較例１、２の菌体数がほぼ頭打ちとなる２４時間経過後においても増加し、最終菌体数においては比較例１、２の約５〜１０倍となっている。また、実施例１では、アルコール濃度の増加がほとんどなく、グルコースが菌体増殖に有効に消費されていることがわかる。
【００２３】次に、培地量を１０００ｌとした場合の微生物増殖の例（実施例２および比較例３）を示す。
（実施例２）
微生物種類：酵母（Z.rouxii(S-012)）
初発菌体数：６．０ｘ１０6cells/ml培地量：１０００l（植菌時グルコース濃度０．５％）
培地温度：３０℃培地ｐＨ：５．２通気量：５００l/min攪拌：１１０rpm栄養液：グルコース濃度５０％、培地に対して０．２５％となる分量で流加、ただし、総流加糖量は培地に対して３．０％となる量増殖時間：６０時間最終菌体数：３．５ｘ１０8cells/ml（比較例３）比較例３は、バッチ培養による増殖実験の例であり、培養中のグルコースの追加はない。
【００２４】微生物種類：酵母（Z.rouxii(S-012)）
初発菌体数：５．９ｘ１０6cells/ml培地量：１０００l（植菌時グルコース濃度３．５％）
培地温度：３０℃培地ｐＨ：５．２通気量：５００l/min攪拌：１１０rpm増殖時間：６０時間最終菌体数：１．５ｘ１０8cells/ml図６〜８は、上記実施例２および比較例３における培地の濁度、菌体数（生菌）およびグルコース濃度を、それぞれ経過時間毎にプロットしたグラフである。実施例２の最終菌体数は、比較例３の約２．３倍となっており、実施例２は、微生物増殖の効率が優れている。
【００２５】以上、実施例に従って本発明の微生物増殖方法を説明したが、本発明はこのような実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲でさまざまに実施できる。
【００２６】
【発明の効果】本発明の微生物増殖方法においては、流加のタイミングを決定する指標として溶存酸素量（ＤＯ）を採用しているので、検出速度は迅速でありしかも装置を簡素化できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例の増殖装置の構成を示すフロー図である。
【図２】 実施例の増殖装置の操作パネルの説明図である。
【図３】 実施例の増殖装置の制御機構における流加制御のフローチャートである。
【図４】 実施例の増殖装置を用いた微生物の増殖におけるグルコースの流加とＤＯの変化、グルコース濃度の変化との関係を表すグラフである。
【図５】 実施例１および比較例１、２の酵母増殖における経時変化を表すグラフであり、（ａ）は培地の濁度、（ｂ）は菌体数、（ｃ）は培地のアルコール濃度を表す。
【図６】 実施例２および比較例３の酵母増殖における培地の濁度の経時変化を表すグラフである。
【図７】 実施例２および比較例３の酵母増殖における菌体数の経時変化を表すグラフである。
【図８】 実施例２および比較例３の酵母増殖における培地のグルコース濃度の経時変化を表すグラフである。
【符号の説明】
１０・・・増殖装置、１２・・・培養槽、２２・・・植菌口、３０・・・流加ノズル、３２・・・ポンプ、３４・・・栄養液槽、６８・・・ＤＯセンサ。
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、流加培養による微生物の増殖方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】微生物を増殖するにあたり、培地を貯留する培養槽中へ培養時間の経過に応じて連続または間欠的に栄養液を流加する流加培養が知られている。この流加培養では、培地中の特定成分の濃度を任意に制御可能であり、例えば糖濃度を培養する微生物に好適な一定範囲に保持することができる。このため目的とする微生物を効率よく増殖できることから広く採用されている。
【０００３】流加培養における栄養液の流加のタイミングを制御するに際して、１）糖濃度（特にグルコース濃度）をバイオセンサ（グルコースセンサ）で検出して、この検出値に応じて栄養液を流加する方法、２）溶存酸素量を指標とする方法、３）ｐＨ値、４）酸化還元電位、５）呼吸商（ＣＯ2ガス量とＯ2消費量との比）、６）排気中のエタノール濃度および７）菌体濃度をそれぞれ指標とする方法等が提案されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記の各方法中では、１）のグルコースセンサによる方法が広く用いられているが、この方法にはグルコースセンサの検出速度が迅速ではないことや、装置が複雑化するなどの問題があった。また、他の２）〜７）の方法においてもいまだ満足するものはなかった。このため、指標の検出速度が迅速で装置を簡素化できる方法が求められていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段および作用】発明者は、微生物を培養している培地中のグルコース濃度の増減と溶存酸素量の増減との間にきわめて密接な関係が存在することから、グルコース濃度に代えて溶存酸素量を栄養液添加の指標とするための研究を重ね、本発明を完成したものである。
【０００６】上記課題を解決するためになされた本発明の要旨は、流加培養による微生物増殖方法において、培地中の溶存酸素量が増加した際に、前記培地に栄養液を添加することを特徴とする微生物増殖方法にある。以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【０００７】本発明における増殖の対象となる微生物の種類に制限はなく、流加培養が可能な微生物であればよい。栄養液は、例えばグルコース、酵母エキス、リン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）等の一種または数種を含有する、周知の栄養液を使用すればよく、特に制限はない。また、栄養液の濃度や添加量も、対象とされる微生物に応じて適宜選択されればよい。例えば酵母を増殖する場合であれば、グルコースを含有する栄養液を、培地中のグルコース濃度が０．５％以下程度となるように添加するとよい。これは、培地のグルコース濃度が０．５％を越えると、アルコールの生成量が増加して菌体の増殖が抑制される傾向になるためである。したがって培地の栄養濃度は、このような代謝産物の生成をできるだけ抑制し、菌体を増殖させる濃度範囲とすることが好ましい。さらに、培地、培養温度、空気供給量、培地の攪拌などの諸条件も、対象とされる微生物の増殖条件に応じて設定されればよく、特に制限はない。
【０００８】培地中の溶存酸素量（ＤＯ）の検出には、周知のＤＯセンサを使用できる。培地中の微生物は、栄養物、例えばグルコースを消費しつつ増殖するが、この際、通常は空気として培地中に吐出、供給されている酸素も消費される。培地中の栄養物が消費されて不足してくると微生物の増殖は抑制されるので、酸素消費量も減少する。したがって、酸素に余剰が生ずることになり培地中のＤＯは増加する。このＤＯの増加に合わせて栄養液を流加すれば、培地の栄養物濃度を増殖に好適な濃度範囲に保持することができる。このため、微生物の増殖は抑制されることはなく、増殖効率は向上する。
【０００９】特に、栄養物不足の初期に栄養物を流加すれば、栄養物不足の状態を短時間で解消できる。この栄養物不足の初期にＤＯは急激に増加するが、この際のＤＯの増加率は増加傾向にあり二次微分値は正である。したがって、ＤＯの増加率が増加傾向（＝二次微分値が正）にある際に、栄養液を流加すれば栄養物濃度を一層好適な範囲に保持することができる。
【００１０】ＤＯセンサによるＤＯ値の検出は、ほぼリアルタイムで迅速になされる。また、ＤＯセンサによるＤＯの検出には特別な装置構成を必要としないので、例えば検出値を指標として栄養液の流加をオンライン制御する際にも、増殖装置が複雑化することはない。
【００１１】
【実施例】次に、図面を参照して本発明の実施例を説明する。図１に本実施例において使用した増殖装置１０を示す。ステンレス製の培養槽１２の頭部１２ａ中央には、モータ１４にて駆動される攪拌機１６が設置されており、培養槽１２の内部に挿通された攪拌軸１８に設けられた複数の攪拌翼２０で、培養槽１２内容物を攪拌可能である。また、頭部１２ａには、培養対象となる微生物を植菌するための植菌口２２、培養槽１２内の発泡状態を検出する泡センサ２４、培養槽１２から気体を排出するためのベント２６およびスチーム配管２８が、それぞれ接続されている。さらに、頭部１２ａに設けられた流加ノズル３０には、ポンプ３２を介して栄養液槽３４が接続されており、栄養液槽３４からの栄養液を培養槽１２へ供給可能である。
【００１２】栄養液槽３４はボールバルブ３６を介してアルカリ槽３８に接続されている。また、栄養液槽３４およびアルカリ槽３８は電磁弁４０を介して、培養槽１２の胴１２ｂ上部に設けられているアルカリノズル４２に接続されており、栄養液、アルカリ液を個別または同時に培養槽１２へ供給可能である。このアルカリノズル４２の下方に設けられている消泡ノズル４４には、電磁弁４６を介して消泡液槽４８が接続されており、培養槽１２へ消泡液を供給可能となっている。
【００１３】培養槽１２の胴１２ｂには、アルカリノズル４２および消泡ノズル４４とほぼ同レベルに、一対の空気ノズル５０、５２が設けられており、図示省略したフィルタ機構にて無菌状態とされた無菌空気が供給される空気配管５４に接続されている。空気ノズル５２は、さらに培養槽１２内に設置されているスパージャ５６に接続されており、空気配管５４からの空気を培養槽１２内に吐出可能となっている。
【００１４】培養槽１２は、胴１２ｂから底部１２ｃにかけてジャケット５８が設けられており、図示省略したヒータ、ポンプ等を備えた温調ユニット６０から温水配管６２を介して供給される温水によって温度調節可能である。また、ジャケット５８へは水配管６４から水を、スチーム配管２８からスチームを供給して冷却または加熱可能である。また培養槽１２の胴１２ｂには、ジャケット５８を貫通して温度計６６、ＤＯセンサ６８（インゴールド社製）およびｐＨ計７０が設置されており、それぞれ培養槽１２内の温度、溶存酸素量およびｐＨを測定して出力可能である。さらに胴１２ｂには同様に、サンプリングノズル７２が設置されており、培養槽１２内からサンプリング可能である。他方、培養槽１２の底部１２ｃには、ジャケット５８を外れて吐出ノズル７４が設置されており、培養槽１２の内容物を排出可能である。
【００１５】なお、図示を省略したが、培養槽１２にはマンホール、ハンドホール、レベルゲージ、プレッシャーゲージなどが備えられており、同様に他の槽や各配管にはゲージ類、ベント、ドレン、スチームトラップ等が備えられている。図２に示すように、増殖装置１０には、制御機構８０、オートプロッタ８２他を備えた操作パネル８４が設けられている。この制御機構８０は周知のマイクロコンピュータ（図示略）を備えており、キー８６やスイッチ８８等を介して各種の指示の入力が可能である。制御機構８０は、これらキー８６等を介しての入力や泡センサ２４、温度計６６、ＤＯセンサ６８、ｐＨ計７０をはじめとする計装機器類の検出値等が入力されると、予め記憶しているプログラムに従って演算処理し、該入力に応じてポンプ３２、電磁弁４０、４６、温調ユニット６０等の作動を制御可能である。また、前記温度計６６他の出力値は制御機構８０を介してオートプロッタ８２に送信され、記録紙にプロットされる。
【００１６】次に、上記構成の増殖装置１０を用いて微生物を増殖する際の操作について説明する。まず培養槽１２内に培地および栄養液を注入し、攪拌、通気して所定のグルコース濃度の培地とする。なお、培地は増殖期間を通じて攪拌および通気が継続される。培地温度、ｐＨ値を調整後、培養槽１２に微生物を植菌する。
【００１７】この後、微生物は培地中の栄養物、例えばグルコースを消費して増殖する。消費によって低下するグルコース濃度を適正範囲に保持するために、グルコースを含有する栄養液が流加される。栄養液流加のタイミングは、ＤＯセンサ６８によって検出されて制御機構８０へ入力されるＤＯ値を指標として決定される。図３に流加ルーチンを示すが、制御機構８０は、所定の時間を経過する毎に流加ルーチンを繰り返し実行する。
【００１８】まずＤＯセンサ６８の検出値（ＤK）が入力されると、制御機構８０は、ＤＯセンサ６８の検出値（ＤK）とＤＯの設定値（ＤS）とを比較し（ステップ２００）、ＤKがＤS以上であれば次のステップ３００へ進み、ＤKがＤS未満であればリターンへ抜けて所定の時間経過を待つ。ステップ３００では、制御機構８０は、ポンプ３２を予め設定された時間だけ稼働させて、設定量の栄養液を培養槽１２へ流加させる。その後リターンへ抜けて、所定の時間を経過する毎に流加ルーチンを繰り返し実行する。このように設定値以上にＤＯが増加した際にグルコースを流加すればグルコース濃度を適切な範囲に保持できる。この場合のＤＯとグルコース濃度の変化を図４に示す。
【００１９】また、１）ＤＯセンサ６８の検出値ＤKの単位時間当りの増加率を算出して、これが設定値以上となった際にグルコースを流加したり、２）ＤKの単位時間当りの増加率と直前の同増加率とを比較して、これが設定比率以上に増加した際にグルコースを流加する等のグルコース流加制御も可能である。
【００２０】次に、上記構成の増殖装置１０を用いた微生物増殖の実施例を、比較例と共に示す。なお、実施例、比較例ともに、培地は次の組成によった。
培地組成本醸醤油 １０％食塩 １０％滅菌水 残余（実施例１）
微生物種類：酵母（Z.rouxii(S-012)）
初発菌体数：４．０ｘ１０6cells/ml培地量：５０l（植菌時グルコース濃度０．５％）
培地温度：３０℃培地ｐＨ：５．２通気量：３０l/min攪拌：２００rpm栄養液：グルコース濃度５０％、培地に対して０．３％となる分量で流加増殖時間：４３時間最終菌体数：２．７ｘ１０9cells/ml（比較例１）比較例１は、バッチ培養による増殖実験の例であり、培養中のグルコースの追加はない。
【００２１】微生物種類：酵母（Z.rouxii(S-012)）
初発菌体数：２．５ｘ１０6cells/ml培地量：５０l（植菌時グルコース濃度２．６％）
培地温度：３０℃培地ｐＨ：５．２通気量：３０l/min攪拌：１００rpm増殖時間：４３時間最高菌体数：２．８ｘ１０8cells/ml（開始後１８時間）
（比較例２）比較例２は、比較例１と同様、バッチ培養による増殖実験の例であり、培養中のグルコースの追加はないが、攪拌数を変化させてＤＯを一定（３ppm)に保持した。
【００２２】微生物種類：酵母（Z.rouxii(S-012)）
初発菌体数：３．８ｘ１０6cells/ml培地量：５０l（植菌時グルコース濃度２．６％）
培地温度：３０℃培地ｐＨ：５．２通気量：３０l/min攪拌：１００〜４００rpm増殖時間：４３時間最終菌体数：５．５ｘ１０8cells/ml図５は、上記実施例１、比較例１および２における培地の濁度、菌体数（生菌）およびアルコール濃度を経過時間毎にプロットしたグラフである。実施例１の菌体数は、比較例１、２の菌体数がほぼ頭打ちとなる２４時間経過後においても増加し、最終菌体数においては比較例１、２の約５〜１０倍となっている。また、実施例１では、アルコール濃度の増加がほとんどなく、グルコースが菌体増殖に有効に消費されていることがわかる。
【００２３】次に、培地量を１０００ｌとした場合の微生物増殖の例（実施例２および比較例３）を示す。
（実施例２）
微生物種類：酵母（Z.rouxii(S-012)）
初発菌体数：６．０ｘ１０6cells/ml培地量：１０００l（植菌時グルコース濃度０．５％）
培地温度：３０℃培地ｐＨ：５．２通気量：５００l/min攪拌：１１０rpm栄養液：グルコース濃度５０％、培地に対して０．２５％となる分量で流加、ただし、総流加糖量は培地に対して３．０％となる量増殖時間：６０時間最終菌体数：３．５ｘ１０8cells/ml（比較例３）比較例３は、バッチ培養による増殖実験の例であり、培養中のグルコースの追加はない。
【００２４】微生物種類：酵母（Z.rouxii(S-012)）
初発菌体数：５．９ｘ１０6cells/ml培地量：１０００l（植菌時グルコース濃度３．５％）
培地温度：３０℃培地ｐＨ：５．２通気量：５００l/min攪拌：１１０rpm増殖時間：６０時間最終菌体数：１．５ｘ１０8cells/ml図６〜８は、上記実施例２および比較例３における培地の濁度、菌体数（生菌）およびグルコース濃度を、それぞれ経過時間毎にプロットしたグラフである。実施例２の最終菌体数は、比較例３の約２．３倍となっており、実施例２は、微生物増殖の効率が優れている。
【００２５】以上、実施例に従って本発明の微生物増殖方法を説明したが、本発明はこのような実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲でさまざまに実施できる。
【００２６】
【発明の効果】本発明の微生物増殖方法においては、流加のタイミングを決定する指標として溶存酸素量（ＤＯ）を採用しているので、検出速度は迅速でありしかも装置を簡素化できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例の増殖装置の構成を示すフロー図である。
【図２】 実施例の増殖装置の操作パネルの説明図である。
【図３】 実施例の増殖装置の制御機構における流加制御のフローチャートである。
【図４】 実施例の増殖装置を用いた微生物の増殖におけるグルコースの流加とＤＯの変化、グルコース濃度の変化との関係を表すグラフである。
【図５】 実施例１および比較例１、２の酵母増殖における経時変化を表すグラフであり、（ａ）は培地の濁度、（ｂ）は菌体数、（ｃ）は培地のアルコール濃度を表す。
【図６】 実施例２および比較例３の酵母増殖における培地の濁度の経時変化を表すグラフである。
【図７】 実施例２および比較例３の酵母増殖における菌体数の経時変化を表すグラフである。
【図８】 実施例２および比較例３の酵母増殖における培地のグルコース濃度の経時変化を表すグラフである。
【符号の説明】
１０・・・増殖装置、１２・・・培養槽、２２・・・植菌口、３０・・・流加ノズル、３２・・・ポンプ、３４・・・栄養液槽、６８・・・ＤＯセンサ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 流加培養による微生物増殖方法において、培地中の溶存酸素量が増加した際に、前記培地に栄養液を添加することを特徴とする微生物増殖方法。
【請求項２】 前記溶存酸素量の単位時間当りの増加率が増加傾向にある際に前記培地に栄養液を添加することを特徴とする請求項１記載の微生物増殖方法。
【請求項３】 微生物が酵母であることを特徴とする請求項１または２記載の微生物増殖方法。
【請求項４】 微生物が乳酸菌であることを特徴とする請求項１または２記載の微生物増殖方法。
【請求項１】 流加培養による微生物増殖方法において、培地中の溶存酸素量が増加した際に、前記培地に栄養液を添加することを特徴とする微生物増殖方法。
【請求項２】 前記溶存酸素量の単位時間当りの増加率が増加傾向にある際に前記培地に栄養液を添加することを特徴とする請求項１記載の微生物増殖方法。
【請求項３】 微生物が酵母であることを特徴とする請求項１または２記載の微生物増殖方法。
【請求項４】 微生物が乳酸菌であることを特徴とする請求項１または２記載の微生物増殖方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開平６−２６１７４１
【公開日】平成６年（１９９４）９月２０日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平５−５０７１０
【出願日】平成５年（１９９３）３月１１日
【出願人】（０００００４６１７）日本車輌製造株式会社 (722)
【出願人】（５９１１１２０６１）サンビシ株式会社 (1)
【公開日】平成６年（１９９４）９月２０日
【国際特許分類】
【出願日】平成５年（１９９３）３月１１日
【出願人】（０００００４６１７）日本車輌製造株式会社 (722)
【出願人】（５９１１１２０６１）サンビシ株式会社 (1)
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