撮像装置、検出装置および撮像方法
【課題】複数のウェルを形成されたサンプルプレートの各ウェルを高い計測精度で、しかも高速に撮像することのできる技術を提供する。
【解決手段】マイクロプレートＭの上方から光を入射させ、マイクロプレートＭの下面に沿って走査移動する撮像手段１３（ラインセンサ１３１、結像光学系１３２）で透過光を受光することにより、マイクロプレートＭに設けられたウェルＷの画像を撮像する。ラインセンサ１３１による撮像範囲は少なくとも１つのウェルＷの直径よりも大きく、より好ましくは複数のウェルを撮像範囲に含む。光学系１３２の被写界深度を６００μｍ以下とすることで、ウェルの側壁面が映り込むことによる画像への影響を低減する。
【解決手段】マイクロプレートＭの上方から光を入射させ、マイクロプレートＭの下面に沿って走査移動する撮像手段１３（ラインセンサ１３１、結像光学系１３２）で透過光を受光することにより、マイクロプレートＭに設けられたウェルＷの画像を撮像する。ラインセンサ１３１による撮像範囲は少なくとも１つのウェルＷの直径よりも大きく、より好ましくは複数のウェルを撮像範囲に含む。光学系１３２の被写界深度を６００μｍ以下とすることで、ウェルの側壁面が映り込むことによる画像への影響を低減する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、液体等が注入された複数のウェルを有するサンプルプレートを撮像する技術に関するものである。なお、本明細書において「液体等」の語は、液体、ゲル状のまたは半流動性を有する固体、および、流動性を有する状態でウェルに注入されその後固化するものの総称として用いられる。
【背景技術】
【０００２】
医療や生物科学の実験においては、ウェルと称される窪みを多数配列して設けたプレート状の器具（例えばマイクロプレート、マイクロタイタープレート等と呼ばれる）の各ウェルに液体等（例えば培養液）を注入し、ここで培養した細胞等を観察することが行われる。例えば抗癌剤の創薬過程においては、複数の薬剤について濃度を変えながら細胞に作用させ、細胞の生死を判断することが行われる。そして、このような観察を支援するための種々の光学装置が従来より提案されている。
【０００３】
例えば特許文献１に記載の光学装置では、ウェルの上方から光を入射させ、下方に透過した光を受光することでウェルの撮像を行っている。この技術においては、レンズにより収束させた光を入射させることに起因してウェルの側壁面の影が画像に映り込むという問題に対応するために、光の入射の態様を異ならせて複数回撮像した部分画像から１つのウェルの画像を再構成している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第７７１８１３１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記した従来技術においては１つのウェルを撮像するのに時間がかかるため、多数のウェルを形成されたプレート全体の画像を得るのに長い時間を必要とする。特に近年では、１つのプレートに数百から千以上のウェルが設けられたものも使用されており、それらのウェルを高い計測精度で、しかも高速に撮像することが要求されてきているが、上記従来技術ではこのような要求に十分に応えることができなかった。
【０００６】
この発明は上記課題に鑑みなされたものであり、複数のウェルを形成されたサンプルプレートの各ウェルを高い計測精度で、しかも高速に撮像することのできる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この発明にかかる撮像装置は、液体を保持可能なウェルとしての窪部がプレートの表面に複数設けられたサンプルプレートを撮像する撮像装置において、上記目的を達成するため、略水平状態の前記サンプルプレートの上方から光を照射する照射手段と、前記サンプルプレートの下方に透過してくる透過光を受光して、少なくとも１つの前記ウェルを含む画像を撮像する撮像手段とを備え、前記撮像手段は、撮像素子と、前記透過光を前記撮像素子に結像させる光学系とを有し、前記光学系の被写界深度が０．６ｍｍ以下であることを特徴としている。
【０００８】
詳しくは後述するが、本願発明者の知見によれば、サンプルプレートからの透過光を、上記のように被写界深度が０．６ｍｍ以下である光学系を介して撮像素子に入射させ撮像することで、ウェル側壁面の影の影響が少ない画像を得ることが可能である。より具体的には、ウェル側壁面の影が観察に影響を及ぼさない程度にまで低濃度化される。特に、１つまたは複数のウェル全体を撮像範囲に含むような撮像条件で撮像を行う際に、その効果が大きい。すなわち、上記のように構成された発明では、ウェルの撮像を高い計測精度で、しかも高速に行うことが可能である。
【０００９】
この発明においては、例えば、撮像素子がラインセンサであり、撮像手段は、サンプルプレートの下面に沿ってサンプルプレートに対し相対的に光学系とラインセンサとを一体的に移動させる移動機構を備えてもよい。ラインセンサを用いることで、一次元方向に高精細な画像を得ることができ、これを撮像対象に対して相対移動させることにより、高精細な二次元画像を得ることができる。
【００１０】
この場合において、被写界深度をＤof、光学系の主点とウェル底面との距離をｓ、光学系の撮像素子側の焦点距離をｆ、光学系のＦナンバーをＦ、ラインセンサの画素ピッチをδとしたとき、被写界深度Ｄofは例えば次式：
Ｄof ＝ ２ｓｆ２δＦ（ｆ＋ｓ）／｛ｆ４−δ２Ｆ２（ｆ＋ｓ）２｝
によって定義することができる。
【００１１】
また、例えば、光学系を介したウェルの底面に対応する結像面が、撮像素子の受光面と一致するように、言い換えれば、撮像手段のピントがウェルの底面に合うように構成されてもよい。このようにした場合、ウェルの底面に対応する像を撮像素子の受光面に鮮明に結像させることができ、撮像素子の分解能を最大限に活用して高精細な画像を撮像することが可能となる。
【００１２】
先にも述べたように、この発明は、例えば撮像手段が複数のウェルを含む画像を撮像するように構成されている場合にその効果が顕著である。１つのウェルの一部のみを撮像する場合には、ウェル壁面の影のない部分のみを撮像範囲に収めて撮像することで、その影響を排除することが可能である。しかしながら、複数のウェル全体を一度に撮像する場合にはウェル壁面の影が映り込むことは避けられない。
【００１３】
また、例えば、照射手段は、白色光をサンプルプレートに照射するように構成されてもよい。この種のサンプルの撮像には、例えば紫外線のような波長の限定された光を用いて特定の分子を蛍光発光させる方法も広く行われるが、本願発明では白色光を用いた可視域での撮像が可能であり、これにより、より簡便性が高く低コストでの観察環境を使用者に提供することができる。
【００１４】
また、この発明にかかる検出装置は、上記したいずれかの撮像装置と同じ構造を有する撮像部と、前記撮像部により撮像された画像に基づき、前記ウェルに保持された液体状または固体状の培地中に含まれる該培地とは光学的特性の異なる特異部位を検出する検出部とを備えることを特徴としている。このように構成された発明では、撮像されたウェルの画像からウェル側壁面の影響が低減されており、そのような画像に基づいて培地中の特異部位を効率よく検出することができる。具体的には、培地と特異部位とはそれらの光学的特性の差異に起因して画像への現れ方が異なるので、これを利用して画像から特異部位を判別し検出することができる。例えば医療や生物科学の分野において用いられる検出装置においては、培地中の細胞や細胞集塊、ウィルス等が「特異部位」に相当し、ウェルに貯留された培地中からこれらを検出するための技術に本発明を好適に適用することが可能である。なお、以下の説明において「培地」とは、ウェル内に保持された液体状あるいは固体状（固化した寒天等も含む）の物質をいい、また、適宜、液体状の培地を「培養液」とも表現する。
【００１５】
また、この発明にかかる撮像方法は、液体状または固体状の培地を保持するウェルとしての窪部がプレートの表面に複数設けられたサンプルプレートを撮像する撮像方法であって、上記目的を達成するため、略水平状態の前記サンプルプレートの上方から光を照射し、前記サンプルプレートの下方に透過してくる透過光を光学系を介して撮像素子に結像させて、少なくとも１つの前記ウェルを含む画像を撮像し、しかも、前記光学系の被写界深度が０．６ｍｍ以下であることを特徴としている。このように構成された発明では、上記した撮像装置と同様に、ウェルの撮像を高い計測精度で、しかも高速に行うことが可能である。
【００１６】
この撮像方法においては、上記した撮像装置の発明と同様の原理により、被写界深度をＤof、光学系の主点とウェル内の培地に含まれる撮像対象物との距離をｓ、光学系の撮像素子側の焦点距離をｆ、光学系のＦナンバーをＦ、ラインセンサの画素ピッチをδとしたとき、被写界深度Ｄofが例えば次式：
Ｄof ＝ ２ｓｆ２δＦ（ｆ＋ｓ）／｛ｆ４−δ２Ｆ２（ｆ＋ｓ）２｝
となるようにすることが好ましい。また、光学系を介した撮像対象物に対応する結像面が、撮像素子の受光面と一致するようにすることがより好ましい。撮像対象物は培地内の表面、底面および内部など種々の位置に存在しうるが、その位置に応じて上記関係を満足するように光学系を設定することにより、任意の位置にある撮像対象物について撮像素子の分解能を最大限に活用して高精細な画像を撮像することが可能となる。なお、特に撮像対象物がウェル底面に存在する場合には、上記距離ｓは光学系の主点とウェル底面との距離とすることができる。
【発明の効果】
【００１７】
この発明によれば、サンプルプレートに形成された１つまたは複数のウェルの画像を、壁面の影響を抑制して高い計測精度で、しかも高速に撮像することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】この発明にかかる撮像装置の一実施形態の概略構成を示す図である。
【図２】撮像部のより詳細な構成を示す図である。
【図３】１つのウェルについての撮像結果を例示する図である。
【図４】ウェル壁面の影が画像に映り込む現象を説明する図である。
【図５】被写界深度と各部の寸法との対応関係を示す図である。
【図６】実験結果の一例を示す図である。
【図７】実験に用いた光学系の構成例を示す図である。
【図８】実験結果の代表例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
図１はこの発明にかかる撮像装置の一実施形態の概略構成を示す図である。この撮像装置１は、図１（ａ）に示すように、それぞれに例えば培養液、培地、試薬などの液体等（図示せず）が注入された複数の、例えば９６個（１２×８のマトリクス配列）のウェルＷを形成されたサンプル（マイクロプレート）Ｍの下面周縁部に当接して該マイクロプレートＭを略水平状態に保持するホルダ１１と、該ホルダ１１の上部に設けられた光源１２と、ホルダ１１の下部に設けられた撮像ユニット１３と、これらを司って所定の動作を実行させる制御部１０とを備えている。以下の説明のために図１に示す通りに座標軸を設定する。Ｘ−Ｙ平面は水平面であり、Ｚ軸は鉛直軸である。
【００２０】
マイクロプレートＭにおける各ウェルＷの直径および深さは代表的には数ｍｍ程度である。一例として、後述する実験において用いられたマイクロプレートＭの各部の寸法を示す。図１（ｂ）に示すように、各ウェルＷの上部における開口Ｗｔの直径Ｄｔが６．６９ｍｍである一方、ウェル底面Ｗｂの内径Ｄｂが６．５８ｍｍである。これからわかるように、ウェルＷの内壁面Ｗｓは単純な円筒面ではなく、側面が斜めに傾斜したテーパー形状となっている。また、ウェルＷの深さＤｄは１０．９ｍｍであり、複数ウェルＷの配列ピッチＤｐは９ｍｍである。なお、各部の寸法は単なる例であって、この撮像装置１が対象とするマイクロプレートのサイズはこれらに限定されるものではなく任意である。
【００２１】
光源１２は、制御部１０に設けられた光源制御部１１２によって制御され、光源制御部１１２からの制御指令に応じてホルダ１１に保持されたマイクロプレートＭの上方から複数のウェルＷに対して一括して光Ｌを照射する。照射される光は可視光であり、特に白色光が好ましい。
【００２２】
撮像ユニット１３は、光源１２から出射されてホルダ１１に保持されたマイクロプレートＭの下方に透過してくる透過光Ｌｔを受光することでマイクロプレートＭの画像を撮像するカメラとして機能するものである。撮像ユニット１３は制御部１０に設けられたカメラ駆動機構１１３に連結されており、カメラ駆動機構１１３は、ホルダ１１に保持されたマイクロプレートＭの下面に沿って撮像ユニット１３を水平面（Ｘ−Ｙ平面）内で走査移動させる。
【００２３】
すなわち、この実施形態では、撮像ユニット１３がマイクロプレートＭの下面に沿って走査移動可能となっている。なお、ここでは撮像ユニット１３がマイクロプレートＭに対して移動するが、撮像ユニット１３とマイクロプレートＭとの間の相対移動が実現されれば足り、この意味でマイクロプレートＭを撮像ユニット１３に対して移動させるようにしてもよい。
【００２４】
撮像ユニット１３により撮像された画像データは画像処理部１１４に与えられる。画像処理部１１４は、撮像ユニット１３からの画像データに対して適宜画像処理を施したり、画像データに基づく所定の演算処理を実行する。処理前後のデータは必要に応じて記憶部１１５に記憶保存される。
【００２５】
この撮像装置１は、各ウェルＷに保持された液体等（本明細書では、液体、ゲル状のまたは半流動性を有する固体、および、例えば軟寒天のように流動性を有する状態でウェルに注入されその後固化するものの総称である）およびその中に含まれる細胞等の撮像対象物の光学像を撮像したり、その光学像から所定の光学的特徴を有する、より具体的にはウェルＷに保持された液体等とは異なる光学的特性を有する特異な部分をその光学的特性の差異を利用して検出するという用途に適用することができる。例えば、培地中の細胞や細胞集塊（スフェロイド）を撮像対象物として撮像したり、さらに画像処理によりそのような細胞等を自動的に検出する目的に好適に使用することができる。
【００２６】
図２は撮像部のより詳細な構成を示す図である。図２（ａ）に示すように、撮像ユニット１３は、入射光に応じた電気信号を出力する例えばＣＣＤによるラインセンサ１３１と、ホルダ１１に保持されたマイクロプレートＭの底面から出射される光をラインセンサ１３１の受光面に結像させる結像光学系１３２とを備えている。結像光学系１３２はレンズ等の光学部品を複数備えるものであってよいが、ここでは理解を容易にするために代表的に単一のレンズによって示している。
【００２７】
ラインセンサ１３１は多数の微細な撮像素子１３１ａをＹ方向に一次元配列したものであり、その長手方向には結像光学系１３２を介して少なくとも１つのウェルＷ全体、より望ましくは複数の（同図では３つの）ウェルＷを一度に撮像範囲ＳＲに含めることができるよう構成されている。図では、ラインセンサ１３１のＹ方向長さを符号ｗ、これによるマイクロプレートＭの底面における視野のＹ方向長さを符号ｗ’により表している。
【００２８】
また、図２（ｂ）に示すように、カメラ駆動機構１１３によるラインセンサ１３１の走査移動方向はＸ方向である。このように、Ｙ方向に沿って撮像素子が配列されたラインセンサ１３１をマイクロプレートＭの底面に沿ってＸ方向に走査移動させることで、底面側から見たマイクロプレートＭの二次元画像を撮像することが可能である。また、ラインセンサ１３１のＹ方向位置を異ならせて上記走査移動を繰り返すことで、マイクロプレートＭに形成された多数のウェルＷを順次撮像することができる。
【００２９】
ラインセンサ１３１は各撮像素子の画素サイズが小さいため高精彩の画像を得ることが可能である。また、多数の撮像素子をライン状に配列するとともに各撮像素子にウェルＷ各部の光学像を結像させるように結像光学系１３２を構成してそれらを適切な位置に配置し、１つまたはそれ以上のウェルＷからの光をラインセンサ１３１に入射させるようにすることで、１つのウェルＷを撮像するのに必要な時間が短くなる。これにより、多数のウェルＷについての撮像を高速で行うことができる。
【００３０】
図３は１つのウェルについての撮像結果を例示する図である。上記のように、この実施形態ではウェルＷの上方から光を入射させ、ウェルＷの底面から下方に透過してくる光を受光して撮像を行う。また、ラインセンサ１３１は１つまたはそれ以上のウェルＷの全体を撮像範囲に収めている。この場合において、図３（ａ）に示すように、１つのウェルに対応する画像のウェル領域内にウェルＷの側壁面、特にウェルＷに注入された液体表面のメニスカスによる屈折の影響による液面よりも上部のウェル側壁面の影が、画像に映り込んでしまうことがある。特にウェル壁面が不透明な材料で構成されている場合にその影響が顕著である。このような影が検出対象たる細胞集塊Ｓｐの画像と重なることにより、細胞集塊Ｓｐが隠蔽されて検出精度が低下するおそれがある。
【００３１】
ウェル領域内の各部を微視的に撮像する場合には、例えば前述の特許文献１に記載されているように、このような影の影響を排除することは比較的容易である。しかしながら、このような撮像方法ではウェル領域全体の撮像に長時間を要する。この問題を解決するために、本実施形態では、ウェル側壁面が撮像結果に映り込むことを完全に排除することを求めず、図３（ｂ）に示すように、例えば細胞集塊Ｓｐのような検出対象物の検出に支障がない程度にウェル壁面の影の影響を低減すべく、以下のような対応を採っている。
【００３２】
図４はウェル壁面の影が画像に映り込む現象を説明する図である。まずウェルＷの底面Ｗｂ内の一点Ｐ1の像については、結像光学系１３２によりラインセンサ１３１表面の受光面に結像される。言い換えると、ウェル底面Ｗｂに対応する像の結像面が撮像素子１３１の受光面となるように、結像光学系１３２のパラメータおよびマイクロプレートＭやラインセンサ１３１との位置関係が設定されている。図において符号Ｑ1は、光学系１３２を介した点Ｐ1の共役点を示している。
【００３３】
一方、液面より上部のウェル側壁面Ｗｓ上の一点Ｐ2からの出射光は、液面のメニスカスにより屈折して光学系１３２を介し共役点Ｑ2に像を結ぶ。この像がラインセンサ１３１内の撮像素子の受光面に投影されると、ウェル側壁面Ｗｓが撮像結果に映り込むことになる。ここで、ラインセンサ１３１の受光面上においてウェル側壁面Ｗｓからの光にピントが合っていなければ、ウェル側壁面Ｗｓの映り込みはよりぼやけたものとなる。本願発明者は、このことを利用して撮像結果へのウェル側壁面Ｗｓの影響を低減することを考案した。具体的には、上記原理に基づいて結像光学系１３２の被写界深度を適切に設定することによって、撮像結果へのウェル側壁面Ｗｓの影響を低減する。これを実現するための考察および検討の結果について次に説明する。
【００３４】
図５は被写界深度と各部の寸法との対応関係を示す図である。より詳しくは、図５（ａ）はウェル底面付近に存在する撮像対象物を撮像することを想定した場合における各部の寸法を示す図である。また、図５（ｂ）は撮像対象物の分布の他の態様を示す図である。図５（ａ）において、
ｓ：レンズ主点と撮像対象物（ウェル底面Ｗｂ）との距離
ｔ：レンズ主点とラインセンサ１３１の受光面との距離
Ｄ：レンズ有効径（無限遠から入射する光線の有効光束の直径）
ｆ：焦点距離
|ａ1'|：後側焦点深度
|ａ2'|：前側焦点深度
Ｄof：被写界深度（＝ａ2−ａ1）
|ａ1|：後側被写界深度
|ａ2|：前側被写界深度
ｓ1：レンズ主点と被写界深度後端との距離
ｓ2：レンズ主点と被写界深度前端との距離
である。
【００３５】
図５（ｂ）に示すように、液体等の表面付近に存在する物体Ｏb1、あるいは液体等の内部に存在する物体Ｏb2を撮像対象物とする場合には、その撮像対象物にピントが合うように光学系を調整した上で、上記定義における距離ｓをレンズ主点と当該撮像対象物（より厳密には当該撮像対象物を含む水平面）との距離と読み替えて以下の考え方を適用することができる。撮像対象物が液体等の内部に存在するケースとしては、培地と撮像対象物との比重に大きな差がない場合のほか、例えば、ウェルＷの内部にいったん軟寒天のような培地を薄く敷き、その上で細胞等を培養するとともにさらに培地を注入して封入（包埋培養）した場合などが考え得る。
【００３６】
なお、図では下向きを正方向とし、図において片矢印を付した寸法については正負の方向に応じた符号を付して表すものとする。すなわち、下向き片矢印で表される寸法は正の値、上向き片矢印で表される寸法は負の値を取る。次に示す計算式では各値の符号も考慮した記載としている。
【００３７】
また、図において符号δが表すのは結像光学系１３２の錯乱円直径であるが、ラインセンサ１３１の持つ分解能を最大限に活用して高精細な画像を得るためには、この錯乱円直径の許容値、すなわち許容錯乱円の大きさをラインセンサ１３１における撮像素子の配列ピッチと同程度にするのが望ましい。ここでは、このような条件に合致する許容錯乱円の大きさを符号δによって表すものとする。
【００３８】
以下、図の符号を考慮しつつ被写界深度Ｄofの計算式を導出する。レンズのＦナンバーの定義（Ｆ＝ｆ／Ｄ）と図における相似関係とから、以下のように表せる。
【数１】
【００３９】
また、ガウスの結像公式：
（１／ｔ）−（１／ｓ）＝１／ｆ
から、以下のように表せる。
【数２】
【００４０】
これらからａ1'、ａ2'を削除してｓ1とｓ2とで整理すると、次式を得る。
【数３】
【００４１】
これより、被写界深度Ｄofは次式で表すことができる。
【数４】
【００４２】
次に、ウェル側壁面の映り込みの影響を低減するという目的を達成するための被写界深度の好ましい範囲について検討する。本願発明者が行った実験は以下の通りである。９６穴のマイクロプレートのウェルに、培養液の量として一般的な１００マイクロリットルのアルコールを注入し、多数のドットを均等ピッチでマトリクス配列したグリッド図票をプレート底面に貼り付け、図１に示す撮像装置１により撮像し、このとき撮像結果からグリッド図票のドットをどれだけ検出できるかを計測した。撮像手段１３の分解能は２４００ｄｐｉである。
【００４３】
この撮像装置１の適用対象となる医療や生物科学の分野においては、ユーザーの作業を支援するために、撮像された画像に対して、細胞や細胞集塊の濃度、面積、個数などを自動的に計測するための画像処理が行われる。この実験は、このような処理を擬似的に再現し、良好な検出精度を確保することのできる条件を見出そうとするものである。
【００４４】
図６は実験結果の一例を示す図である。また図７は実験に用いた光学系の構成例を示す図である。図６（ａ）に示されるように、撮像された原画像にはグリッド図票のドットが多数含まれる。ウェル領域の中央部分では輝度の高い背景部分とより輝度の低いドットとのコントラストが鮮明であるが、ウェル領域の周縁部に近づくにつれてウェル側壁面の映り込みが顕著となり、ドットと背景とのコントラストが小さくなっている。
【００４５】
このように局所的な輝度変化を持つ画像から、例えばグリッド図票におけるドットのような輝度の低い領域を検出する方法としては、原画像を平滑化してバックグラウンド画像を作成し（図６（ｂ））、各画素ごとに原画像からバックグラウンド画像を減算するとともに適当な閾値を用いて二値化する方法が一般的である。
【００４６】
しかしながら、ウェル領域の周縁部ではドットと背景とのコントラスト差が小さい一方で、ウェル側壁面が映り込んだ周縁領域とそうでない中央部分との境界で大きな輝度変化があるため、二値化の結果として、図６（ｃ）に「境界領域エラー」として示す部位のように本来の検出対象でないものが検出されてしまうことがある。このような検出エラーは、局所輝度変化が大きいほど、平滑化度合いが大きいほど、また二値化閾値が低いほど発生しやすいものである。
【００４７】
図６（ｃ）に示した境界領域の検出エラーはウェル壁面の映り込みの影響を受ける周縁領域と中央部分との境界領域で発生しているもので、結像光学系１３２の被写界深度Ｄofを下げて境界領域の輝度変化を緩やかにすることで解消を図ることができる。そこで、被写界深度の大きさと境界領域エラーとの関係を定量的に調べる実験を行った。
【００４８】
実験では、上記と同様のサンプルを用いて、被写界深度が互いに異なる複数種の光学系を使い分けて撮像を行い、境界領域エラーによる損失（検出できなかったドット数）の発生頻度を計測した。被写界深度としては例えば、６１２μｍ、２３５μｍ、１６８μｍおよび１１８μｍのものを用意した。これらの光学系の具体的な構成例は図７に示す通りである。平滑化の方法は平均値フィルタとし、フィルタサイズについては、この装置が想定する検出対象である細胞や細胞集塊を２４００ｄｐｉの分解能で撮像したときの平均的サイズが３０ピクセル程度にわたることが実験的にわかっていることから、これらを十分な精度で検出可能な５０ピクセルとした。
【００４９】
平滑化および二値化の後、所定の輝度値を持つとして検出された個々の領域について真円度によるフィルタリングを行い、真円度が０．４未満であるものは本来の検出対象であるドットではないものとみなし、エラーとしてその発生数をカウントした。
【００５０】
撮像データに基づく計測は二値化閾値を変えながら被写界深度の各値ごとに複数回行い、ウェル領域全体でのドット検出数を基準とした場合の上位３つの二値化閾値（これらが最適な閾値と考えられる）での結果の平均値を最終的な検出エラー数とした。また、全ドットに対するエラー数の割合を算出した。
【００５１】
図８は実験結果の代表例を示す図である。図８（ａ）は上記計測の結果を表にまとめたものであり、図８（ｂ）はそれをグラフにしたものである。これらの図に示すように、被写界深度を小さくすることによってエラーを低減することができる。ここで、検出エラー数については次式：
ｙ＝０．０００１５１１１ｘ２−０．０５０５１６ｘ＋３．９８０９ …（式１）
により、また検出エラー割合については次式：
ｙ＝０．０００００７２５１ｘ２−０．００２４２４ｘ＋０．１９１０２ …（式２）
により、それぞれよく近似される。
【００５２】
ここで、例えば検出エラーが生じないようにしたい場合には、（式１）においてｙ＝１としてｘについて解くことにより、被写界深度を２５７．８μｍ以下とすればよいことがわかる。また、例えば検出エラー割合を１％以下としたい場合には、（式２）においてｙ＝１としてｘについて解くことにより、被写界深度を５４０．７μｍ以下とすればよいことがわかる。
【００５３】
撮像時の諸条件が上記結果に及ぼす影響について検討する。ウェルに保持される液量の違いについては、これによりウェル領域においてウェル壁面の影響が及ぶ範囲の幅が変化するものの、光学系とウェル上端との物理的な位置関係には変化がないため境界領域での輝度レベルの変化自体には差異がない。そのため、上記結果には影響しない。
【００５４】
また、撮像手段１３の分解能については、これにより検出対象物（細胞集塊）のサイズに対応するピクセル数が変化するため、十分な検出精度を確保するためには平均値フィルタのサイズを変更する必要が生じる場合がある。しかしながら、境界領域エラーが発生する領域における局所的な輝度変化の態様も同様に変動するため、被写界深度とエラーとの相関性は維持される。
【００５５】
これらのことから、被写界深度を概ね０．６ｍｍ以下とすることにより、二値化閾値を適切に設定した条件ではウェル側壁面の映り込みの影響による検出エラーを１％以下、あるいは実質的にエラーなしとすることが可能である。このように、この実施形態では、マイクロプレートの下面に透過してくる光を撮像素子に結像させる結像光学系１３２の被写界深度を適宜に設定することにより、ウェル側壁面の影響を抑えて高精細な画像を撮像することができる。また、１つまたは複数のウェル領域を撮像範囲に収めた状態（図７における「視野ｗ’」はいずれもウェルの配列ピッチＤｐの３倍以上である）でもウェル側壁面の影響を抑えることができるので、ウェル１つ当たりの撮像に要する時間を短くすることができる。このため、各ウェルを高い計測精度で、しかも高速に撮像することが可能である。また、こうして撮像された画像に基づき、検出対象となる塊状の物体、例えば細胞集塊を精度よく検出することが可能である。
【００５６】
また、マイクロプレートおよびウェルのサイズとしては種々のものが用いられうるが、図７に例示したように、各部のサイズとラインセンサ１３１および結像光学系１３２のパラメータとの組み合わせを適宜に設定することで、任意のマイクロプレートについて複数ウェルの効率的な撮像を行いつつ、しかもウェル側壁面の影響の少ない画像を撮像することが可能である。
【００５７】
以上説明したように、この実施形態では、光源１２が本発明の「照射手段」として機能しており、撮像ユニット１３が本発明の「撮像手段」として機能している。そして、結像光学系１３２が本発明の「光学系」として機能している。また、カメラ駆動機構１１３が本発明の「移動機構」として機能している。また、この実施形態では、マイクロプレートＭが本発明の「サンプルプレート」に相当している。
【００５８】
なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて上述したもの以外に種々の変更を行うことが可能である。例えば、上記実施形態はマイクロプレートに形成されたウェルを撮像する撮像装置であるが、単に撮像を行うのみならず、撮像された画像データに基づき所定の特徴部分を抽出する適宜の検出処理アルゴリズムを画像処理部１１４に実行させることにより、本発明の「検出装置」として機能させることが可能である。この場合、光源１２、ホルダ１１および撮像ユニット１３が一体として検出装置の構成要素である本発明の「撮像部」として機能する一方、画像処理部１１４が本発明の「検出部」として機能することとなる。
【００５９】
また、例えば、本実施形態の撮像装置によって撮像された画像データを所定のインターフェースを介して外部の検出装置に送出し、該検出装置で検出処理を行うようにしてもよい。
【００６０】
また、例えば、上記実施形態では撮像素子を一次元配列してなるラインセンサ１３１をマイクロプレートＭに対し相対移動させることで撮像を行っているが、撮像素子を二次元にマトリクス配列したＣＣＤアレイを用いて撮像を行うようにしてもよい。
【００６１】
また、上記実施形態の説明では結像光学系１３２を１つのレンズとして表記しているがこれに限定されるものではなく、複数の光学部品からなる光学系を用いる場合においても本実施形態と同様の考え方に基づきその被写界深度を設定することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
この発明は、例えば医療・生物科学分野で用いられるマイクロプレートのような、多数のウェルを有するサンプルプレートの各ウェルを高精細かつ高速に撮像する技術に特に好適に適用することができるが、その応用分野は医療・生物科学分野に限定されない。
【符号の説明】
【００６３】
１ 撮像装置（撮像装置、検出装置）
１１ ホルダ
１２ 光源（照射手段）
１３ 撮像ユニット（撮像手段）
１３１ ラインセンサ（撮像手段）
１３２ 結像光学系（光学系、撮像手段）
１１３ カメラ駆動機構（移動機構）
Ｍ マイクロプレート（サンプルプレート）
Ｗ ウェル
【技術分野】
【０００１】
この発明は、液体等が注入された複数のウェルを有するサンプルプレートを撮像する技術に関するものである。なお、本明細書において「液体等」の語は、液体、ゲル状のまたは半流動性を有する固体、および、流動性を有する状態でウェルに注入されその後固化するものの総称として用いられる。
【背景技術】
【０００２】
医療や生物科学の実験においては、ウェルと称される窪みを多数配列して設けたプレート状の器具（例えばマイクロプレート、マイクロタイタープレート等と呼ばれる）の各ウェルに液体等（例えば培養液）を注入し、ここで培養した細胞等を観察することが行われる。例えば抗癌剤の創薬過程においては、複数の薬剤について濃度を変えながら細胞に作用させ、細胞の生死を判断することが行われる。そして、このような観察を支援するための種々の光学装置が従来より提案されている。
【０００３】
例えば特許文献１に記載の光学装置では、ウェルの上方から光を入射させ、下方に透過した光を受光することでウェルの撮像を行っている。この技術においては、レンズにより収束させた光を入射させることに起因してウェルの側壁面の影が画像に映り込むという問題に対応するために、光の入射の態様を異ならせて複数回撮像した部分画像から１つのウェルの画像を再構成している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第７７１８１３１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記した従来技術においては１つのウェルを撮像するのに時間がかかるため、多数のウェルを形成されたプレート全体の画像を得るのに長い時間を必要とする。特に近年では、１つのプレートに数百から千以上のウェルが設けられたものも使用されており、それらのウェルを高い計測精度で、しかも高速に撮像することが要求されてきているが、上記従来技術ではこのような要求に十分に応えることができなかった。
【０００６】
この発明は上記課題に鑑みなされたものであり、複数のウェルを形成されたサンプルプレートの各ウェルを高い計測精度で、しかも高速に撮像することのできる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この発明にかかる撮像装置は、液体を保持可能なウェルとしての窪部がプレートの表面に複数設けられたサンプルプレートを撮像する撮像装置において、上記目的を達成するため、略水平状態の前記サンプルプレートの上方から光を照射する照射手段と、前記サンプルプレートの下方に透過してくる透過光を受光して、少なくとも１つの前記ウェルを含む画像を撮像する撮像手段とを備え、前記撮像手段は、撮像素子と、前記透過光を前記撮像素子に結像させる光学系とを有し、前記光学系の被写界深度が０．６ｍｍ以下であることを特徴としている。
【０００８】
詳しくは後述するが、本願発明者の知見によれば、サンプルプレートからの透過光を、上記のように被写界深度が０．６ｍｍ以下である光学系を介して撮像素子に入射させ撮像することで、ウェル側壁面の影の影響が少ない画像を得ることが可能である。より具体的には、ウェル側壁面の影が観察に影響を及ぼさない程度にまで低濃度化される。特に、１つまたは複数のウェル全体を撮像範囲に含むような撮像条件で撮像を行う際に、その効果が大きい。すなわち、上記のように構成された発明では、ウェルの撮像を高い計測精度で、しかも高速に行うことが可能である。
【０００９】
この発明においては、例えば、撮像素子がラインセンサであり、撮像手段は、サンプルプレートの下面に沿ってサンプルプレートに対し相対的に光学系とラインセンサとを一体的に移動させる移動機構を備えてもよい。ラインセンサを用いることで、一次元方向に高精細な画像を得ることができ、これを撮像対象に対して相対移動させることにより、高精細な二次元画像を得ることができる。
【００１０】
この場合において、被写界深度をＤof、光学系の主点とウェル底面との距離をｓ、光学系の撮像素子側の焦点距離をｆ、光学系のＦナンバーをＦ、ラインセンサの画素ピッチをδとしたとき、被写界深度Ｄofは例えば次式：
Ｄof ＝ ２ｓｆ２δＦ（ｆ＋ｓ）／｛ｆ４−δ２Ｆ２（ｆ＋ｓ）２｝
によって定義することができる。
【００１１】
また、例えば、光学系を介したウェルの底面に対応する結像面が、撮像素子の受光面と一致するように、言い換えれば、撮像手段のピントがウェルの底面に合うように構成されてもよい。このようにした場合、ウェルの底面に対応する像を撮像素子の受光面に鮮明に結像させることができ、撮像素子の分解能を最大限に活用して高精細な画像を撮像することが可能となる。
【００１２】
先にも述べたように、この発明は、例えば撮像手段が複数のウェルを含む画像を撮像するように構成されている場合にその効果が顕著である。１つのウェルの一部のみを撮像する場合には、ウェル壁面の影のない部分のみを撮像範囲に収めて撮像することで、その影響を排除することが可能である。しかしながら、複数のウェル全体を一度に撮像する場合にはウェル壁面の影が映り込むことは避けられない。
【００１３】
また、例えば、照射手段は、白色光をサンプルプレートに照射するように構成されてもよい。この種のサンプルの撮像には、例えば紫外線のような波長の限定された光を用いて特定の分子を蛍光発光させる方法も広く行われるが、本願発明では白色光を用いた可視域での撮像が可能であり、これにより、より簡便性が高く低コストでの観察環境を使用者に提供することができる。
【００１４】
また、この発明にかかる検出装置は、上記したいずれかの撮像装置と同じ構造を有する撮像部と、前記撮像部により撮像された画像に基づき、前記ウェルに保持された液体状または固体状の培地中に含まれる該培地とは光学的特性の異なる特異部位を検出する検出部とを備えることを特徴としている。このように構成された発明では、撮像されたウェルの画像からウェル側壁面の影響が低減されており、そのような画像に基づいて培地中の特異部位を効率よく検出することができる。具体的には、培地と特異部位とはそれらの光学的特性の差異に起因して画像への現れ方が異なるので、これを利用して画像から特異部位を判別し検出することができる。例えば医療や生物科学の分野において用いられる検出装置においては、培地中の細胞や細胞集塊、ウィルス等が「特異部位」に相当し、ウェルに貯留された培地中からこれらを検出するための技術に本発明を好適に適用することが可能である。なお、以下の説明において「培地」とは、ウェル内に保持された液体状あるいは固体状（固化した寒天等も含む）の物質をいい、また、適宜、液体状の培地を「培養液」とも表現する。
【００１５】
また、この発明にかかる撮像方法は、液体状または固体状の培地を保持するウェルとしての窪部がプレートの表面に複数設けられたサンプルプレートを撮像する撮像方法であって、上記目的を達成するため、略水平状態の前記サンプルプレートの上方から光を照射し、前記サンプルプレートの下方に透過してくる透過光を光学系を介して撮像素子に結像させて、少なくとも１つの前記ウェルを含む画像を撮像し、しかも、前記光学系の被写界深度が０．６ｍｍ以下であることを特徴としている。このように構成された発明では、上記した撮像装置と同様に、ウェルの撮像を高い計測精度で、しかも高速に行うことが可能である。
【００１６】
この撮像方法においては、上記した撮像装置の発明と同様の原理により、被写界深度をＤof、光学系の主点とウェル内の培地に含まれる撮像対象物との距離をｓ、光学系の撮像素子側の焦点距離をｆ、光学系のＦナンバーをＦ、ラインセンサの画素ピッチをδとしたとき、被写界深度Ｄofが例えば次式：
Ｄof ＝ ２ｓｆ２δＦ（ｆ＋ｓ）／｛ｆ４−δ２Ｆ２（ｆ＋ｓ）２｝
となるようにすることが好ましい。また、光学系を介した撮像対象物に対応する結像面が、撮像素子の受光面と一致するようにすることがより好ましい。撮像対象物は培地内の表面、底面および内部など種々の位置に存在しうるが、その位置に応じて上記関係を満足するように光学系を設定することにより、任意の位置にある撮像対象物について撮像素子の分解能を最大限に活用して高精細な画像を撮像することが可能となる。なお、特に撮像対象物がウェル底面に存在する場合には、上記距離ｓは光学系の主点とウェル底面との距離とすることができる。
【発明の効果】
【００１７】
この発明によれば、サンプルプレートに形成された１つまたは複数のウェルの画像を、壁面の影響を抑制して高い計測精度で、しかも高速に撮像することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】この発明にかかる撮像装置の一実施形態の概略構成を示す図である。
【図２】撮像部のより詳細な構成を示す図である。
【図３】１つのウェルについての撮像結果を例示する図である。
【図４】ウェル壁面の影が画像に映り込む現象を説明する図である。
【図５】被写界深度と各部の寸法との対応関係を示す図である。
【図６】実験結果の一例を示す図である。
【図７】実験に用いた光学系の構成例を示す図である。
【図８】実験結果の代表例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
図１はこの発明にかかる撮像装置の一実施形態の概略構成を示す図である。この撮像装置１は、図１（ａ）に示すように、それぞれに例えば培養液、培地、試薬などの液体等（図示せず）が注入された複数の、例えば９６個（１２×８のマトリクス配列）のウェルＷを形成されたサンプル（マイクロプレート）Ｍの下面周縁部に当接して該マイクロプレートＭを略水平状態に保持するホルダ１１と、該ホルダ１１の上部に設けられた光源１２と、ホルダ１１の下部に設けられた撮像ユニット１３と、これらを司って所定の動作を実行させる制御部１０とを備えている。以下の説明のために図１に示す通りに座標軸を設定する。Ｘ−Ｙ平面は水平面であり、Ｚ軸は鉛直軸である。
【００２０】
マイクロプレートＭにおける各ウェルＷの直径および深さは代表的には数ｍｍ程度である。一例として、後述する実験において用いられたマイクロプレートＭの各部の寸法を示す。図１（ｂ）に示すように、各ウェルＷの上部における開口Ｗｔの直径Ｄｔが６．６９ｍｍである一方、ウェル底面Ｗｂの内径Ｄｂが６．５８ｍｍである。これからわかるように、ウェルＷの内壁面Ｗｓは単純な円筒面ではなく、側面が斜めに傾斜したテーパー形状となっている。また、ウェルＷの深さＤｄは１０．９ｍｍであり、複数ウェルＷの配列ピッチＤｐは９ｍｍである。なお、各部の寸法は単なる例であって、この撮像装置１が対象とするマイクロプレートのサイズはこれらに限定されるものではなく任意である。
【００２１】
光源１２は、制御部１０に設けられた光源制御部１１２によって制御され、光源制御部１１２からの制御指令に応じてホルダ１１に保持されたマイクロプレートＭの上方から複数のウェルＷに対して一括して光Ｌを照射する。照射される光は可視光であり、特に白色光が好ましい。
【００２２】
撮像ユニット１３は、光源１２から出射されてホルダ１１に保持されたマイクロプレートＭの下方に透過してくる透過光Ｌｔを受光することでマイクロプレートＭの画像を撮像するカメラとして機能するものである。撮像ユニット１３は制御部１０に設けられたカメラ駆動機構１１３に連結されており、カメラ駆動機構１１３は、ホルダ１１に保持されたマイクロプレートＭの下面に沿って撮像ユニット１３を水平面（Ｘ−Ｙ平面）内で走査移動させる。
【００２３】
すなわち、この実施形態では、撮像ユニット１３がマイクロプレートＭの下面に沿って走査移動可能となっている。なお、ここでは撮像ユニット１３がマイクロプレートＭに対して移動するが、撮像ユニット１３とマイクロプレートＭとの間の相対移動が実現されれば足り、この意味でマイクロプレートＭを撮像ユニット１３に対して移動させるようにしてもよい。
【００２４】
撮像ユニット１３により撮像された画像データは画像処理部１１４に与えられる。画像処理部１１４は、撮像ユニット１３からの画像データに対して適宜画像処理を施したり、画像データに基づく所定の演算処理を実行する。処理前後のデータは必要に応じて記憶部１１５に記憶保存される。
【００２５】
この撮像装置１は、各ウェルＷに保持された液体等（本明細書では、液体、ゲル状のまたは半流動性を有する固体、および、例えば軟寒天のように流動性を有する状態でウェルに注入されその後固化するものの総称である）およびその中に含まれる細胞等の撮像対象物の光学像を撮像したり、その光学像から所定の光学的特徴を有する、より具体的にはウェルＷに保持された液体等とは異なる光学的特性を有する特異な部分をその光学的特性の差異を利用して検出するという用途に適用することができる。例えば、培地中の細胞や細胞集塊（スフェロイド）を撮像対象物として撮像したり、さらに画像処理によりそのような細胞等を自動的に検出する目的に好適に使用することができる。
【００２６】
図２は撮像部のより詳細な構成を示す図である。図２（ａ）に示すように、撮像ユニット１３は、入射光に応じた電気信号を出力する例えばＣＣＤによるラインセンサ１３１と、ホルダ１１に保持されたマイクロプレートＭの底面から出射される光をラインセンサ１３１の受光面に結像させる結像光学系１３２とを備えている。結像光学系１３２はレンズ等の光学部品を複数備えるものであってよいが、ここでは理解を容易にするために代表的に単一のレンズによって示している。
【００２７】
ラインセンサ１３１は多数の微細な撮像素子１３１ａをＹ方向に一次元配列したものであり、その長手方向には結像光学系１３２を介して少なくとも１つのウェルＷ全体、より望ましくは複数の（同図では３つの）ウェルＷを一度に撮像範囲ＳＲに含めることができるよう構成されている。図では、ラインセンサ１３１のＹ方向長さを符号ｗ、これによるマイクロプレートＭの底面における視野のＹ方向長さを符号ｗ’により表している。
【００２８】
また、図２（ｂ）に示すように、カメラ駆動機構１１３によるラインセンサ１３１の走査移動方向はＸ方向である。このように、Ｙ方向に沿って撮像素子が配列されたラインセンサ１３１をマイクロプレートＭの底面に沿ってＸ方向に走査移動させることで、底面側から見たマイクロプレートＭの二次元画像を撮像することが可能である。また、ラインセンサ１３１のＹ方向位置を異ならせて上記走査移動を繰り返すことで、マイクロプレートＭに形成された多数のウェルＷを順次撮像することができる。
【００２９】
ラインセンサ１３１は各撮像素子の画素サイズが小さいため高精彩の画像を得ることが可能である。また、多数の撮像素子をライン状に配列するとともに各撮像素子にウェルＷ各部の光学像を結像させるように結像光学系１３２を構成してそれらを適切な位置に配置し、１つまたはそれ以上のウェルＷからの光をラインセンサ１３１に入射させるようにすることで、１つのウェルＷを撮像するのに必要な時間が短くなる。これにより、多数のウェルＷについての撮像を高速で行うことができる。
【００３０】
図３は１つのウェルについての撮像結果を例示する図である。上記のように、この実施形態ではウェルＷの上方から光を入射させ、ウェルＷの底面から下方に透過してくる光を受光して撮像を行う。また、ラインセンサ１３１は１つまたはそれ以上のウェルＷの全体を撮像範囲に収めている。この場合において、図３（ａ）に示すように、１つのウェルに対応する画像のウェル領域内にウェルＷの側壁面、特にウェルＷに注入された液体表面のメニスカスによる屈折の影響による液面よりも上部のウェル側壁面の影が、画像に映り込んでしまうことがある。特にウェル壁面が不透明な材料で構成されている場合にその影響が顕著である。このような影が検出対象たる細胞集塊Ｓｐの画像と重なることにより、細胞集塊Ｓｐが隠蔽されて検出精度が低下するおそれがある。
【００３１】
ウェル領域内の各部を微視的に撮像する場合には、例えば前述の特許文献１に記載されているように、このような影の影響を排除することは比較的容易である。しかしながら、このような撮像方法ではウェル領域全体の撮像に長時間を要する。この問題を解決するために、本実施形態では、ウェル側壁面が撮像結果に映り込むことを完全に排除することを求めず、図３（ｂ）に示すように、例えば細胞集塊Ｓｐのような検出対象物の検出に支障がない程度にウェル壁面の影の影響を低減すべく、以下のような対応を採っている。
【００３２】
図４はウェル壁面の影が画像に映り込む現象を説明する図である。まずウェルＷの底面Ｗｂ内の一点Ｐ1の像については、結像光学系１３２によりラインセンサ１３１表面の受光面に結像される。言い換えると、ウェル底面Ｗｂに対応する像の結像面が撮像素子１３１の受光面となるように、結像光学系１３２のパラメータおよびマイクロプレートＭやラインセンサ１３１との位置関係が設定されている。図において符号Ｑ1は、光学系１３２を介した点Ｐ1の共役点を示している。
【００３３】
一方、液面より上部のウェル側壁面Ｗｓ上の一点Ｐ2からの出射光は、液面のメニスカスにより屈折して光学系１３２を介し共役点Ｑ2に像を結ぶ。この像がラインセンサ１３１内の撮像素子の受光面に投影されると、ウェル側壁面Ｗｓが撮像結果に映り込むことになる。ここで、ラインセンサ１３１の受光面上においてウェル側壁面Ｗｓからの光にピントが合っていなければ、ウェル側壁面Ｗｓの映り込みはよりぼやけたものとなる。本願発明者は、このことを利用して撮像結果へのウェル側壁面Ｗｓの影響を低減することを考案した。具体的には、上記原理に基づいて結像光学系１３２の被写界深度を適切に設定することによって、撮像結果へのウェル側壁面Ｗｓの影響を低減する。これを実現するための考察および検討の結果について次に説明する。
【００３４】
図５は被写界深度と各部の寸法との対応関係を示す図である。より詳しくは、図５（ａ）はウェル底面付近に存在する撮像対象物を撮像することを想定した場合における各部の寸法を示す図である。また、図５（ｂ）は撮像対象物の分布の他の態様を示す図である。図５（ａ）において、
ｓ：レンズ主点と撮像対象物（ウェル底面Ｗｂ）との距離
ｔ：レンズ主点とラインセンサ１３１の受光面との距離
Ｄ：レンズ有効径（無限遠から入射する光線の有効光束の直径）
ｆ：焦点距離
|ａ1'|：後側焦点深度
|ａ2'|：前側焦点深度
Ｄof：被写界深度（＝ａ2−ａ1）
|ａ1|：後側被写界深度
|ａ2|：前側被写界深度
ｓ1：レンズ主点と被写界深度後端との距離
ｓ2：レンズ主点と被写界深度前端との距離
である。
【００３５】
図５（ｂ）に示すように、液体等の表面付近に存在する物体Ｏb1、あるいは液体等の内部に存在する物体Ｏb2を撮像対象物とする場合には、その撮像対象物にピントが合うように光学系を調整した上で、上記定義における距離ｓをレンズ主点と当該撮像対象物（より厳密には当該撮像対象物を含む水平面）との距離と読み替えて以下の考え方を適用することができる。撮像対象物が液体等の内部に存在するケースとしては、培地と撮像対象物との比重に大きな差がない場合のほか、例えば、ウェルＷの内部にいったん軟寒天のような培地を薄く敷き、その上で細胞等を培養するとともにさらに培地を注入して封入（包埋培養）した場合などが考え得る。
【００３６】
なお、図では下向きを正方向とし、図において片矢印を付した寸法については正負の方向に応じた符号を付して表すものとする。すなわち、下向き片矢印で表される寸法は正の値、上向き片矢印で表される寸法は負の値を取る。次に示す計算式では各値の符号も考慮した記載としている。
【００３７】
また、図において符号δが表すのは結像光学系１３２の錯乱円直径であるが、ラインセンサ１３１の持つ分解能を最大限に活用して高精細な画像を得るためには、この錯乱円直径の許容値、すなわち許容錯乱円の大きさをラインセンサ１３１における撮像素子の配列ピッチと同程度にするのが望ましい。ここでは、このような条件に合致する許容錯乱円の大きさを符号δによって表すものとする。
【００３８】
以下、図の符号を考慮しつつ被写界深度Ｄofの計算式を導出する。レンズのＦナンバーの定義（Ｆ＝ｆ／Ｄ）と図における相似関係とから、以下のように表せる。
【数１】
【００３９】
また、ガウスの結像公式：
（１／ｔ）−（１／ｓ）＝１／ｆ
から、以下のように表せる。
【数２】
【００４０】
これらからａ1'、ａ2'を削除してｓ1とｓ2とで整理すると、次式を得る。
【数３】
【００４１】
これより、被写界深度Ｄofは次式で表すことができる。
【数４】
【００４２】
次に、ウェル側壁面の映り込みの影響を低減するという目的を達成するための被写界深度の好ましい範囲について検討する。本願発明者が行った実験は以下の通りである。９６穴のマイクロプレートのウェルに、培養液の量として一般的な１００マイクロリットルのアルコールを注入し、多数のドットを均等ピッチでマトリクス配列したグリッド図票をプレート底面に貼り付け、図１に示す撮像装置１により撮像し、このとき撮像結果からグリッド図票のドットをどれだけ検出できるかを計測した。撮像手段１３の分解能は２４００ｄｐｉである。
【００４３】
この撮像装置１の適用対象となる医療や生物科学の分野においては、ユーザーの作業を支援するために、撮像された画像に対して、細胞や細胞集塊の濃度、面積、個数などを自動的に計測するための画像処理が行われる。この実験は、このような処理を擬似的に再現し、良好な検出精度を確保することのできる条件を見出そうとするものである。
【００４４】
図６は実験結果の一例を示す図である。また図７は実験に用いた光学系の構成例を示す図である。図６（ａ）に示されるように、撮像された原画像にはグリッド図票のドットが多数含まれる。ウェル領域の中央部分では輝度の高い背景部分とより輝度の低いドットとのコントラストが鮮明であるが、ウェル領域の周縁部に近づくにつれてウェル側壁面の映り込みが顕著となり、ドットと背景とのコントラストが小さくなっている。
【００４５】
このように局所的な輝度変化を持つ画像から、例えばグリッド図票におけるドットのような輝度の低い領域を検出する方法としては、原画像を平滑化してバックグラウンド画像を作成し（図６（ｂ））、各画素ごとに原画像からバックグラウンド画像を減算するとともに適当な閾値を用いて二値化する方法が一般的である。
【００４６】
しかしながら、ウェル領域の周縁部ではドットと背景とのコントラスト差が小さい一方で、ウェル側壁面が映り込んだ周縁領域とそうでない中央部分との境界で大きな輝度変化があるため、二値化の結果として、図６（ｃ）に「境界領域エラー」として示す部位のように本来の検出対象でないものが検出されてしまうことがある。このような検出エラーは、局所輝度変化が大きいほど、平滑化度合いが大きいほど、また二値化閾値が低いほど発生しやすいものである。
【００４７】
図６（ｃ）に示した境界領域の検出エラーはウェル壁面の映り込みの影響を受ける周縁領域と中央部分との境界領域で発生しているもので、結像光学系１３２の被写界深度Ｄofを下げて境界領域の輝度変化を緩やかにすることで解消を図ることができる。そこで、被写界深度の大きさと境界領域エラーとの関係を定量的に調べる実験を行った。
【００４８】
実験では、上記と同様のサンプルを用いて、被写界深度が互いに異なる複数種の光学系を使い分けて撮像を行い、境界領域エラーによる損失（検出できなかったドット数）の発生頻度を計測した。被写界深度としては例えば、６１２μｍ、２３５μｍ、１６８μｍおよび１１８μｍのものを用意した。これらの光学系の具体的な構成例は図７に示す通りである。平滑化の方法は平均値フィルタとし、フィルタサイズについては、この装置が想定する検出対象である細胞や細胞集塊を２４００ｄｐｉの分解能で撮像したときの平均的サイズが３０ピクセル程度にわたることが実験的にわかっていることから、これらを十分な精度で検出可能な５０ピクセルとした。
【００４９】
平滑化および二値化の後、所定の輝度値を持つとして検出された個々の領域について真円度によるフィルタリングを行い、真円度が０．４未満であるものは本来の検出対象であるドットではないものとみなし、エラーとしてその発生数をカウントした。
【００５０】
撮像データに基づく計測は二値化閾値を変えながら被写界深度の各値ごとに複数回行い、ウェル領域全体でのドット検出数を基準とした場合の上位３つの二値化閾値（これらが最適な閾値と考えられる）での結果の平均値を最終的な検出エラー数とした。また、全ドットに対するエラー数の割合を算出した。
【００５１】
図８は実験結果の代表例を示す図である。図８（ａ）は上記計測の結果を表にまとめたものであり、図８（ｂ）はそれをグラフにしたものである。これらの図に示すように、被写界深度を小さくすることによってエラーを低減することができる。ここで、検出エラー数については次式：
ｙ＝０．０００１５１１１ｘ２−０．０５０５１６ｘ＋３．９８０９ …（式１）
により、また検出エラー割合については次式：
ｙ＝０．０００００７２５１ｘ２−０．００２４２４ｘ＋０．１９１０２ …（式２）
により、それぞれよく近似される。
【００５２】
ここで、例えば検出エラーが生じないようにしたい場合には、（式１）においてｙ＝１としてｘについて解くことにより、被写界深度を２５７．８μｍ以下とすればよいことがわかる。また、例えば検出エラー割合を１％以下としたい場合には、（式２）においてｙ＝１としてｘについて解くことにより、被写界深度を５４０．７μｍ以下とすればよいことがわかる。
【００５３】
撮像時の諸条件が上記結果に及ぼす影響について検討する。ウェルに保持される液量の違いについては、これによりウェル領域においてウェル壁面の影響が及ぶ範囲の幅が変化するものの、光学系とウェル上端との物理的な位置関係には変化がないため境界領域での輝度レベルの変化自体には差異がない。そのため、上記結果には影響しない。
【００５４】
また、撮像手段１３の分解能については、これにより検出対象物（細胞集塊）のサイズに対応するピクセル数が変化するため、十分な検出精度を確保するためには平均値フィルタのサイズを変更する必要が生じる場合がある。しかしながら、境界領域エラーが発生する領域における局所的な輝度変化の態様も同様に変動するため、被写界深度とエラーとの相関性は維持される。
【００５５】
これらのことから、被写界深度を概ね０．６ｍｍ以下とすることにより、二値化閾値を適切に設定した条件ではウェル側壁面の映り込みの影響による検出エラーを１％以下、あるいは実質的にエラーなしとすることが可能である。このように、この実施形態では、マイクロプレートの下面に透過してくる光を撮像素子に結像させる結像光学系１３２の被写界深度を適宜に設定することにより、ウェル側壁面の影響を抑えて高精細な画像を撮像することができる。また、１つまたは複数のウェル領域を撮像範囲に収めた状態（図７における「視野ｗ’」はいずれもウェルの配列ピッチＤｐの３倍以上である）でもウェル側壁面の影響を抑えることができるので、ウェル１つ当たりの撮像に要する時間を短くすることができる。このため、各ウェルを高い計測精度で、しかも高速に撮像することが可能である。また、こうして撮像された画像に基づき、検出対象となる塊状の物体、例えば細胞集塊を精度よく検出することが可能である。
【００５６】
また、マイクロプレートおよびウェルのサイズとしては種々のものが用いられうるが、図７に例示したように、各部のサイズとラインセンサ１３１および結像光学系１３２のパラメータとの組み合わせを適宜に設定することで、任意のマイクロプレートについて複数ウェルの効率的な撮像を行いつつ、しかもウェル側壁面の影響の少ない画像を撮像することが可能である。
【００５７】
以上説明したように、この実施形態では、光源１２が本発明の「照射手段」として機能しており、撮像ユニット１３が本発明の「撮像手段」として機能している。そして、結像光学系１３２が本発明の「光学系」として機能している。また、カメラ駆動機構１１３が本発明の「移動機構」として機能している。また、この実施形態では、マイクロプレートＭが本発明の「サンプルプレート」に相当している。
【００５８】
なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて上述したもの以外に種々の変更を行うことが可能である。例えば、上記実施形態はマイクロプレートに形成されたウェルを撮像する撮像装置であるが、単に撮像を行うのみならず、撮像された画像データに基づき所定の特徴部分を抽出する適宜の検出処理アルゴリズムを画像処理部１１４に実行させることにより、本発明の「検出装置」として機能させることが可能である。この場合、光源１２、ホルダ１１および撮像ユニット１３が一体として検出装置の構成要素である本発明の「撮像部」として機能する一方、画像処理部１１４が本発明の「検出部」として機能することとなる。
【００５９】
また、例えば、本実施形態の撮像装置によって撮像された画像データを所定のインターフェースを介して外部の検出装置に送出し、該検出装置で検出処理を行うようにしてもよい。
【００６０】
また、例えば、上記実施形態では撮像素子を一次元配列してなるラインセンサ１３１をマイクロプレートＭに対し相対移動させることで撮像を行っているが、撮像素子を二次元にマトリクス配列したＣＣＤアレイを用いて撮像を行うようにしてもよい。
【００６１】
また、上記実施形態の説明では結像光学系１３２を１つのレンズとして表記しているがこれに限定されるものではなく、複数の光学部品からなる光学系を用いる場合においても本実施形態と同様の考え方に基づきその被写界深度を設定することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
この発明は、例えば医療・生物科学分野で用いられるマイクロプレートのような、多数のウェルを有するサンプルプレートの各ウェルを高精細かつ高速に撮像する技術に特に好適に適用することができるが、その応用分野は医療・生物科学分野に限定されない。
【符号の説明】
【００６３】
１ 撮像装置（撮像装置、検出装置）
１１ ホルダ
１２ 光源（照射手段）
１３ 撮像ユニット（撮像手段）
１３１ ラインセンサ（撮像手段）
１３２ 結像光学系（光学系、撮像手段）
１１３ カメラ駆動機構（移動機構）
Ｍ マイクロプレート（サンプルプレート）
Ｗ ウェル
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体を保持可能なウェルとしての窪部がプレートの表面に複数設けられたサンプルプレートを撮像する撮像装置において、
略水平状態の前記サンプルプレートの上方から光を照射する照射手段と、
前記サンプルプレートの下方に透過してくる透過光を受光して、少なくとも１つの前記ウェルを含む画像を撮像する撮像手段と
を備え、
前記撮像手段は、撮像素子と、前記透過光を前記撮像素子に結像させる光学系とを有し、前記光学系の被写界深度が０．６ｍｍ以下である
ことを特徴とする撮像装置。
【請求項２】
前記撮像素子はラインセンサであり、前記撮像手段は、前記サンプルプレートの下面に沿って前記サンプルプレートに対し相対的に前記光学系と前記ラインセンサとを一体的に移動させる移動機構を備える請求項１に記載の撮像装置。
【請求項３】
前記被写界深度をＤof、前記光学系の主点と前記ウェル底面との距離をｓ、前記光学系の前記撮像素子側の焦点距離をｆ、前記光学系のＦナンバーをＦ、前記ラインセンサの画素ピッチをδとしたとき、被写界深度Ｄofが次式：
Ｄof ＝ ２ｓｆ２δＦ（ｆ＋ｓ）／｛ｆ４−δ２Ｆ２（ｆ＋ｓ）２｝
で定義される請求項２に記載の撮像装置。
【請求項４】
前記光学系を介した前記ウェルの底面に対応する結像面が、前記撮像素子の受光面と一致する請求項１ないし３のいずれかに記載の撮像装置。
【請求項５】
前記撮像手段は、複数の前記ウェルを含む画像を撮像する請求項１ないし４のいずれかに記載の撮像装置。
【請求項６】
前記照射手段は、白色光を前記サンプルプレートに照射する請求項１ないし５のいずれかに記載の撮像装置。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載の撮像装置と同じ構造を有する撮像部と、
前記撮像部により撮像された画像に基づき、前記ウェルに保持された液体状または固体状の培地中に含まれる該培地とは光学的特性の異なる特異部位を検出する検出部と
を備えることを特徴とする検出装置。
【請求項８】
液体状または固体状の培地を保持するウェルとしての窪部がプレートの表面に複数設けられたサンプルプレートを撮像する撮像方法において、
略水平状態の前記サンプルプレートの上方から光を照射し、
前記サンプルプレートの下方に透過してくる透過光を光学系を介して撮像素子に結像させて、少なくとも１つの前記ウェルを含む画像を撮像し、しかも、
前記光学系の被写界深度が０．６ｍｍ以下である
ことを特徴とする撮像方法。
【請求項９】
前記被写界深度をＤof、前記光学系の主点と前記ウェル内の培地に含まれる撮像対象物との距離をｓ、前記光学系の前記撮像素子側の焦点距離をｆ、前記光学系のＦナンバーをＦ、前記ラインセンサの画素ピッチをδとしたとき、被写界深度Ｄofが次式：
Ｄof ＝ ２ｓｆ２δＦ（ｆ＋ｓ）／｛ｆ４−δ２Ｆ２（ｆ＋ｓ）２｝
で定義される請求項８に記載の撮像方法。
【請求項１０】
前記光学系を介した前記撮像対象物に対応する結像面が、前記撮像素子の受光面と一致する請求項８または９に記載の撮像方法。
【請求項１】
液体を保持可能なウェルとしての窪部がプレートの表面に複数設けられたサンプルプレートを撮像する撮像装置において、
略水平状態の前記サンプルプレートの上方から光を照射する照射手段と、
前記サンプルプレートの下方に透過してくる透過光を受光して、少なくとも１つの前記ウェルを含む画像を撮像する撮像手段と
を備え、
前記撮像手段は、撮像素子と、前記透過光を前記撮像素子に結像させる光学系とを有し、前記光学系の被写界深度が０．６ｍｍ以下である
ことを特徴とする撮像装置。
【請求項２】
前記撮像素子はラインセンサであり、前記撮像手段は、前記サンプルプレートの下面に沿って前記サンプルプレートに対し相対的に前記光学系と前記ラインセンサとを一体的に移動させる移動機構を備える請求項１に記載の撮像装置。
【請求項３】
前記被写界深度をＤof、前記光学系の主点と前記ウェル底面との距離をｓ、前記光学系の前記撮像素子側の焦点距離をｆ、前記光学系のＦナンバーをＦ、前記ラインセンサの画素ピッチをδとしたとき、被写界深度Ｄofが次式：
Ｄof ＝ ２ｓｆ２δＦ（ｆ＋ｓ）／｛ｆ４−δ２Ｆ２（ｆ＋ｓ）２｝
で定義される請求項２に記載の撮像装置。
【請求項４】
前記光学系を介した前記ウェルの底面に対応する結像面が、前記撮像素子の受光面と一致する請求項１ないし３のいずれかに記載の撮像装置。
【請求項５】
前記撮像手段は、複数の前記ウェルを含む画像を撮像する請求項１ないし４のいずれかに記載の撮像装置。
【請求項６】
前記照射手段は、白色光を前記サンプルプレートに照射する請求項１ないし５のいずれかに記載の撮像装置。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載の撮像装置と同じ構造を有する撮像部と、
前記撮像部により撮像された画像に基づき、前記ウェルに保持された液体状または固体状の培地中に含まれる該培地とは光学的特性の異なる特異部位を検出する検出部と
を備えることを特徴とする検出装置。
【請求項８】
液体状または固体状の培地を保持するウェルとしての窪部がプレートの表面に複数設けられたサンプルプレートを撮像する撮像方法において、
略水平状態の前記サンプルプレートの上方から光を照射し、
前記サンプルプレートの下方に透過してくる透過光を光学系を介して撮像素子に結像させて、少なくとも１つの前記ウェルを含む画像を撮像し、しかも、
前記光学系の被写界深度が０．６ｍｍ以下である
ことを特徴とする撮像方法。
【請求項９】
前記被写界深度をＤof、前記光学系の主点と前記ウェル内の培地に含まれる撮像対象物との距離をｓ、前記光学系の前記撮像素子側の焦点距離をｆ、前記光学系のＦナンバーをＦ、前記ラインセンサの画素ピッチをδとしたとき、被写界深度Ｄofが次式：
Ｄof ＝ ２ｓｆ２δＦ（ｆ＋ｓ）／｛ｆ４−δ２Ｆ２（ｆ＋ｓ）２｝
で定義される請求項８に記載の撮像方法。
【請求項１０】
前記光学系を介した前記撮像対象物に対応する結像面が、前記撮像素子の受光面と一致する請求項８または９に記載の撮像方法。
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図３】
【図６】
【図２】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図３】
【図６】
【公開番号】特開２０１３−７２６８４（Ｐ２０１３−７２６８４Ａ）
【公開日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２１０５５５（Ｐ２０１１−２１０５５５）
【出願日】平成２３年９月２７日（２０１１．９．２７）
【出願人】（０００２０７５５１）大日本スクリーン製造株式会社 (2,640)
【出願人】（０００１１１２４７）ニューリー株式会社 (29)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月２７日（２０１１．９．２７）
【出願人】（０００２０７５５１）大日本スクリーン製造株式会社 (2,640)
【出願人】（０００１１１２４７）ニューリー株式会社 (29)
【Ｆターム（参考）】
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