新規タンニン及びこれを有効成分とするリパーゼ阻害剤
【課題】リパーゼ阻害作用を有する抗肥満剤の提供。
【解決手段】カワラケツメイ地上部乾燥物をエタノールで抽出し、得られた抽出液をエバポレータで濃縮後、残渣をゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム）に供し得られる新規タンニン（フラバン−カテキン−フラバンの３量体）。
【解決手段】カワラケツメイ地上部乾燥物をエタノールで抽出し、得られた抽出液をエバポレータで濃縮後、残渣をゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム）に供し得られる新規タンニン（フラバン−カテキン−フラバンの３量体）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規タンニン及びこれを有効成分とするリパーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本人の生活様式の欧米化に伴い、高脂肪食の摂取量が年々増加している。平成１９年国民健康・栄養調査によると、エネルギー摂取量の平均値の年次推移は、男女ともに減少傾向であるが、脂肪エネルギー比率が２５％以上の者の割合は、男女ともに増加傾向にある。また、脂質異常症が疑われる人の割合は、５０歳以上で５０〜６０％に認められるとの報告がある（厚生労働省平成１９年国民健康・栄養調査報告 ２０１０年、６８ページ、２２３ページ）。
【０００３】
肥満は現代社会における最も重大な疾患の一つであるが、その主な要因は脂肪の過剰摂取による。また、脂肪の過剰摂取は、肥満のみならず、糖尿病、動脈硬化、高血圧等の生活習慣病の原因となっている。この肥満に対する治療薬として、「マジンドール（ＭＡＺＩＮＤＯＬ）」が食欲抑制薬として国内で唯一承認されているが、主な副作用として、口渇感、便秘、悪心、嘔吐、睡眠障害、胃部不快感、発疹、そう痒感などが報告されている。（臨床評価、１９８５、１３（２）、ｐ.４１９〜４５９；臨床評価、１９８５、１３（２）、ｐ．４６１〜５１５）。また、海外では、リパーゼ阻害活性により腸管からの脂肪吸収抑制を持つ「ゼニカル（ＸＥＮＩＣＡＬ）」（アメリカＲＯＣＨＥ社の登録商標 ）が肥満改善薬として市販されているが、やはり、脂肪便、排便回数の増加、軟便、下痢、腹痛などの副作用が報告されている。（Ｔｈｅ
Ｌａｎｃｅｔ，１９９８，３５２，ｐ．６７−１７２）。
【０００４】
一方、肥満を予防するために他の方法として、食事制限により摂取カロリーを減らすことが有効であることが知られている。しかし、この手段においては厳密な栄養指導と管理が必要とされ、日常生活において実行することは困難である。従って、安全、且つ健康的に食事由来の脂肪の体内吸収を抑制することができれば、肥満及びそれに関連する疾患の治療、あるいは健康増進のための現実的で有用な方策となる。
【０００５】
このような背景のもと、安全で、且つヒトに対する有効性が証明されている特定保健用食品の開発が注目されている。これまでに、食後の血清中性脂肪値の上昇を抑える特定保健用食品として、膵リパーゼの阻害により脂肪吸収を抑制するグロビン蛋白分解物（Ｊ．Ｎｕｔｒ．１９８８，１２８，ｐ．５６−６０；日本臨床・食糧学会誌、１９９９、５２（２）、ｐ．７１〜７７；健康・栄養食品研究、２００２、５（３）、ｐ．１３１〜１４４）、トリアシルグリセロールとは異なる消化吸収特性を有するジアシルグリセロール（Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｎｕｔｒ．２０００，１９（６），ｐ．７８９−７９６；Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．２００１，１１（２），ｐ．１０９−１１７）、及び、魚油より精製されたエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などが発売されている。
【０００６】
また、リパーゼの阻害に関して、いくつかのポリフェノールが活性を有することが知られている。例えば、植物樹皮由来のタンニン（特公昭６０−１１９１２）、緑茶中の主要な成分エピガロカテキンガレート及びエピカテキンガレートを配合した脂質吸収抑制食品（特開平３−２２８６６４）、ピーマン、シメジ、かぼちゃ、まいたけ、ひじき、緑茶、ウーロン茶などの水抽出物からなるリパーゼ阻害剤（特開平３−２１９８７２）、フラボノール類（特開平７−６１９２７）、ヒドロキシ安息香酸類（没食子酸）（特開平１−１０２０２２）、トリテルペン類化合物及びその誘導体（特開平９−４０６８９）、タマリンドのプロシアニジンを有効成分とする抗肥満剤（特開平９−２９１０３９）などが報告されており、また、ブドウ種子抽出物のリパーゼ阻害作用（Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２００３, Ｖｏｌ．１９．（１０），ｐ．８７６−８７９）、サラシア由来ポリフェノールによるリパーゼ阻害作用とラットの抗肥満作用（Ｊ．Ｎｕｔｒ．，２００２，１３２，ｐ．１８１９−１８２４）、ウーロン茶抽出物によるマウスの抗肥満作用（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．，１９９９，２３，ｐ．９８−１０５）なども知られている。
【０００７】
一方、マメ科の植物であるカワラケツメイ（Ｃａｓｓｉａ ｍｉｍｏｓｏｉｄｅｓ Ｌ．ｖａｒ． ｎｏｍａｍｅ Ｍａｋｉｎｏ）は、その全草が生薬として、利尿、整腸、健胃などの目的で利用されており、また茶の代用としても飲用されている。また、本植物の抽出物は、膵リパーゼの阻害作用が高いことが示されている。
【０００８】
そして、カワケツメイから抽出したフラボノイド類及び該成分を有効成分とするリパーゼ阻害剤につき、過去の特許文献を遡及検索したところ、フラボン単量体及びタンニンに関する下記の特許文献１、２及び３に開示された発明が公知である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平７−６１９２７号公報
【特許文献２】特開平７−６１９８１号公報
【特許文献３】特開平８−２５９５５７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
前記特許文献１記載の発明は、カワラケツメイに含まれるリパーゼ阻害剤の有効成分として新規フラボノイド（フラボン単量体）を、前記特許文献２記載の発明では２つの新規タンニン（フラバン−カテキン２量体）を、前記特許文献３記載の発明では新規タンニン（フラバン４量体）をそれぞれ明らかにしている。しかしながら、これらの新規成分以外にもリパーゼ阻害活性をもつ成分が存在することが予想されるが、同定されていないという課題があった。
【００１１】
本発明は、前記課題を解決すべくなされたものであって、カワラケツメイ地上部乾燥物をエタノールで抽出した抽出エキスから生成された新規タンニン及びこれを有効成分とするリパーゼ阻害剤を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、カワラケツメイ抽出エキスから酵素阻害活性の高い成分について研究、開発及び種々テストの結果、
式
【化１】
で表される新規タンニン（フラバン−カテキン−フラバンの３量体）が有効であることを確認した。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る新規タンニンは、体内酵素タンパク質と結合することによってその活性化を低下させる性質を有し、代謝調節剤として有用である。また、種々の酵素作用を抑制し、食品などの酵素作用に起因する劣化を防止するのに利用することができる。
【００１４】
本発明に係る新規タンニンは、飲用にも供されるカワラケツメイから採取したもので、安全性が高い。
【００１５】
本発明に係る新規タンニンは、カワラケツメイからエタノールによる抽出、分取カラムクロマトグラフィーなどの通常の分離方法により単離することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】カワラケツメイのエタノール抽出物の作成手順を示す図である。
【図２】エタノール抽出物からのリパーゼ阻害試験結果を示す図である。
【図３】Ｆｒ２８−３５およびＦｒ４３−７０のＨＰＬＣクロマトグラム（ゲルろ過カラム）である。
【図４】成分１および成分２のＨＰＬＣクロマトグラム（ＯＤＳカラム）である。
【図５】成分１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図６】成分１のＨ−Ｈ ＣＯＳＹスペクトルである。
【図７】成分１の化学構造式である。
【図８】成分２のＬＣ／ＭＳスペクトルである。
【図９】成分２のＬＣ／ＭＳ／ＭＳスペクトルである。
【図１０】成分２の化学構造式である。
【図１１】成分１および成分２の濃度とリパーゼ阻害活性の関係を示す図である。
【実施例】
【００１７】
以下、実施例により、本発明を更に詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例にのみ限定されるものではない。
【００１８】
［カワラケツメイからの抽出と分画］
本物質はカワラケツメイ等から、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー等、公知の方法により分離、採取することが可能である。具体的には、図1に示すように、カワラケツメイ地上部乾燥物からエタノールで抽出し、得られた抽出液をエバポレータで濃縮後、室温下で減圧乾燥した。次に、図２に示すように、エタノール抽出物をゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム）に供し、一段目は１００％エタノールで溶出し、続いて二段目を７０％エタノールで溶出し、分画した。このときの２つの画分（Ｆｒ２８−３５及びＦｒ４３−７０）のＨＰＬＣクロマトグラムを図３に示す。
【００１９】
更に、図２に示すように、リパーゼ阻害活性を示した２つの画分（Ｆｒ２８−３５及びＦｒ４３−７０）を分取ＨＰＬＣ（Ｕｎｉｓｏｎ ＵＫ−Ｃ１８ カラム）に供し、０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／アセトニトリル混液（９０：１０）から（２０：８０）までのグラディエントで溶出し、成分１及び成分２を得た。このときのＨＰＬＣクロマトグラムを図４に示す。なお、これらの収量は、０．７％及び０．６％であった。
【００２０】
［成分１の化学構造解析］
前記方法で採取した成分１は、そのＨＰＬＣクロマトグラムから少なくとも２成分から成る混合物であった。この成分１について、１Ｈ−ＮＭＲ及びＨ−ＨＣＯＳＹ測定を行った。それぞれのスペクトルを図３及び４に示す。更に、成分１についてＬＣ／ＭＳ測定を行ったところ、含まれる成分全ての分子量は５４６であったことから、これは異性体であると考えられた。これらのデータ解析と併せて、カワラケツメイの成分研究に関する文献調査を行い、得られた文献データと成分１の１Ｈ−ＮＭＲ実測値を比較した。その比較結果を表１に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】
前記比較の結果、成分１は、図５に示す構造を有する既知物質のタンニンで、２成分（１−１、１−２）の混合物と考えられた。参考文献（特開平７−６１９８１号公報及びＴ．ＨＡＴＡＮＯ, Ａ．ＹＡＭＡＳＨＩＴＡ, Ｔ．ＨＡＳＩＭＯＴＯ, Ｈ．ＩＴＯ, Ｎ．ＫＵＢＯ, Ｍ．ＹＯＳＨＩＹＡＭＡ，Ｓ．ＳＨＩＭＵＲＡ, Ｙ．ＩＴＯＨ, Ｔ．ＯＫＵＤＡ ａｎｄ Ｔ．ＹＯＳＨＩＤＡ, Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ.５，ｐ．８９３−９００，１９９７）
【００２３】
［成分２の化学構造解析］
前記方法で採取した成分２は、そのＨＰＬＣクロマトグラムから少なくとも２〜３成分からなる混合物であった。この成分２について、ＬＣ／ＭＳ分析を行ったところ、含まれる成分全ての分子量は８０２であったことから、これらは異性体であると考えられた（図６）。また、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定を行い、図７に示すデータが得られた。データ解析と併せて類似成分のＬＣ／ＭＳ／ＭＳに関する論文（参考文献 Ａ．Ｉ．ＣＡＬＤＥＲＳＯＮ，Ｂ．Ｊ．ＷＲＩＧＨＴ，Ｗ．Ｊ．ＨＵＲＳＴ ＡＮＤ Ｒ．Ｂ．ＢＲＥＥＭＡＮ, Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ.５７, ｐ.５６９３−５６９９, ２００９）を調査した結果、成分２は、図８に示す構造を有する新規タンニン（フラバン−カテキン−フラバンの３量体）であると考えられた。
【００２４】
［成分１、２リパーゼ阻害活性の測定］
リパーゼ活性の測定は、基質に蛍光性の４−メチルウンベリフェロンのオレイン酸エステル（４−ＵＭＯ）を使用し、反応によって生成した４−メチルウンベリフェロン
の蛍光を測定することにより実施した。測定にあたり、緩衝液は１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１．３６ｍＭＣａＣｌ２を含む１３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いた。基質である４−ＵＭＯ（シグマ製）は、０．１ＭのＤＭＳＯ溶液として調整したものを、前記緩衝液を用いて１０００倍に希釈したものを酵素測定に供した。またリパーゼは、ブタ膵リパーゼ（コスモバイオ製）を、前記緩衝液を用いて４００Ｕ／ｍｌ溶液として調製したものを酵素測定に供した。試料は、実施例で得た成分１及び２をＤＭＳＯで各濃度の溶液に調製し、更に、前記緩衝液で２５倍希釈したものを試料溶液とした。
【００２５】
酵素反応は、２５℃条件下において、９６穴マイクロプレートに５０μＬの４−ＵＭＯ緩衝溶液、２５μＬの試料溶液（及び試料溶解溶媒）を添加し混合した後に、２５μＬのリパーゼ緩衝液を添加することにより開始した。３０分間反応させた後に、１００μＬの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）を添加して反応を停止させ、反応によって生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光（励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４６５ｎｍ）を蛍光プレートリーダーで測定した。なお、酵素反応は全てｎ＝２で行った。
【００２６】
成分１および成分２の濃度とリパーゼ阻害活性の関係を図９に、このときのＩＣ５０（μｇ/ｍｌ）を表２に示す。このように成分１と比較して、成分２はリパーゼ阻害活性が１２．５倍高いことが判明した。
【００２７】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規タンニン及びこれを有効成分とするリパーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本人の生活様式の欧米化に伴い、高脂肪食の摂取量が年々増加している。平成１９年国民健康・栄養調査によると、エネルギー摂取量の平均値の年次推移は、男女ともに減少傾向であるが、脂肪エネルギー比率が２５％以上の者の割合は、男女ともに増加傾向にある。また、脂質異常症が疑われる人の割合は、５０歳以上で５０〜６０％に認められるとの報告がある（厚生労働省平成１９年国民健康・栄養調査報告 ２０１０年、６８ページ、２２３ページ）。
【０００３】
肥満は現代社会における最も重大な疾患の一つであるが、その主な要因は脂肪の過剰摂取による。また、脂肪の過剰摂取は、肥満のみならず、糖尿病、動脈硬化、高血圧等の生活習慣病の原因となっている。この肥満に対する治療薬として、「マジンドール（ＭＡＺＩＮＤＯＬ）」が食欲抑制薬として国内で唯一承認されているが、主な副作用として、口渇感、便秘、悪心、嘔吐、睡眠障害、胃部不快感、発疹、そう痒感などが報告されている。（臨床評価、１９８５、１３（２）、ｐ.４１９〜４５９；臨床評価、１９８５、１３（２）、ｐ．４６１〜５１５）。また、海外では、リパーゼ阻害活性により腸管からの脂肪吸収抑制を持つ「ゼニカル（ＸＥＮＩＣＡＬ）」（アメリカＲＯＣＨＥ社の登録商標 ）が肥満改善薬として市販されているが、やはり、脂肪便、排便回数の増加、軟便、下痢、腹痛などの副作用が報告されている。（Ｔｈｅ
Ｌａｎｃｅｔ，１９９８，３５２，ｐ．６７−１７２）。
【０００４】
一方、肥満を予防するために他の方法として、食事制限により摂取カロリーを減らすことが有効であることが知られている。しかし、この手段においては厳密な栄養指導と管理が必要とされ、日常生活において実行することは困難である。従って、安全、且つ健康的に食事由来の脂肪の体内吸収を抑制することができれば、肥満及びそれに関連する疾患の治療、あるいは健康増進のための現実的で有用な方策となる。
【０００５】
このような背景のもと、安全で、且つヒトに対する有効性が証明されている特定保健用食品の開発が注目されている。これまでに、食後の血清中性脂肪値の上昇を抑える特定保健用食品として、膵リパーゼの阻害により脂肪吸収を抑制するグロビン蛋白分解物（Ｊ．Ｎｕｔｒ．１９８８，１２８，ｐ．５６−６０；日本臨床・食糧学会誌、１９９９、５２（２）、ｐ．７１〜７７；健康・栄養食品研究、２００２、５（３）、ｐ．１３１〜１４４）、トリアシルグリセロールとは異なる消化吸収特性を有するジアシルグリセロール（Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｎｕｔｒ．２０００，１９（６），ｐ．７８９−７９６；Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．２００１，１１（２），ｐ．１０９−１１７）、及び、魚油より精製されたエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などが発売されている。
【０００６】
また、リパーゼの阻害に関して、いくつかのポリフェノールが活性を有することが知られている。例えば、植物樹皮由来のタンニン（特公昭６０−１１９１２）、緑茶中の主要な成分エピガロカテキンガレート及びエピカテキンガレートを配合した脂質吸収抑制食品（特開平３−２２８６６４）、ピーマン、シメジ、かぼちゃ、まいたけ、ひじき、緑茶、ウーロン茶などの水抽出物からなるリパーゼ阻害剤（特開平３−２１９８７２）、フラボノール類（特開平７−６１９２７）、ヒドロキシ安息香酸類（没食子酸）（特開平１−１０２０２２）、トリテルペン類化合物及びその誘導体（特開平９−４０６８９）、タマリンドのプロシアニジンを有効成分とする抗肥満剤（特開平９−２９１０３９）などが報告されており、また、ブドウ種子抽出物のリパーゼ阻害作用（Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２００３, Ｖｏｌ．１９．（１０），ｐ．８７６−８７９）、サラシア由来ポリフェノールによるリパーゼ阻害作用とラットの抗肥満作用（Ｊ．Ｎｕｔｒ．，２００２，１３２，ｐ．１８１９−１８２４）、ウーロン茶抽出物によるマウスの抗肥満作用（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．，１９９９，２３，ｐ．９８−１０５）なども知られている。
【０００７】
一方、マメ科の植物であるカワラケツメイ（Ｃａｓｓｉａ ｍｉｍｏｓｏｉｄｅｓ Ｌ．ｖａｒ． ｎｏｍａｍｅ Ｍａｋｉｎｏ）は、その全草が生薬として、利尿、整腸、健胃などの目的で利用されており、また茶の代用としても飲用されている。また、本植物の抽出物は、膵リパーゼの阻害作用が高いことが示されている。
【０００８】
そして、カワケツメイから抽出したフラボノイド類及び該成分を有効成分とするリパーゼ阻害剤につき、過去の特許文献を遡及検索したところ、フラボン単量体及びタンニンに関する下記の特許文献１、２及び３に開示された発明が公知である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平７−６１９２７号公報
【特許文献２】特開平７−６１９８１号公報
【特許文献３】特開平８−２５９５５７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
前記特許文献１記載の発明は、カワラケツメイに含まれるリパーゼ阻害剤の有効成分として新規フラボノイド（フラボン単量体）を、前記特許文献２記載の発明では２つの新規タンニン（フラバン−カテキン２量体）を、前記特許文献３記載の発明では新規タンニン（フラバン４量体）をそれぞれ明らかにしている。しかしながら、これらの新規成分以外にもリパーゼ阻害活性をもつ成分が存在することが予想されるが、同定されていないという課題があった。
【００１１】
本発明は、前記課題を解決すべくなされたものであって、カワラケツメイ地上部乾燥物をエタノールで抽出した抽出エキスから生成された新規タンニン及びこれを有効成分とするリパーゼ阻害剤を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、カワラケツメイ抽出エキスから酵素阻害活性の高い成分について研究、開発及び種々テストの結果、
式
【化１】
で表される新規タンニン（フラバン−カテキン−フラバンの３量体）が有効であることを確認した。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る新規タンニンは、体内酵素タンパク質と結合することによってその活性化を低下させる性質を有し、代謝調節剤として有用である。また、種々の酵素作用を抑制し、食品などの酵素作用に起因する劣化を防止するのに利用することができる。
【００１４】
本発明に係る新規タンニンは、飲用にも供されるカワラケツメイから採取したもので、安全性が高い。
【００１５】
本発明に係る新規タンニンは、カワラケツメイからエタノールによる抽出、分取カラムクロマトグラフィーなどの通常の分離方法により単離することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】カワラケツメイのエタノール抽出物の作成手順を示す図である。
【図２】エタノール抽出物からのリパーゼ阻害試験結果を示す図である。
【図３】Ｆｒ２８−３５およびＦｒ４３−７０のＨＰＬＣクロマトグラム（ゲルろ過カラム）である。
【図４】成分１および成分２のＨＰＬＣクロマトグラム（ＯＤＳカラム）である。
【図５】成分１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図６】成分１のＨ−Ｈ ＣＯＳＹスペクトルである。
【図７】成分１の化学構造式である。
【図８】成分２のＬＣ／ＭＳスペクトルである。
【図９】成分２のＬＣ／ＭＳ／ＭＳスペクトルである。
【図１０】成分２の化学構造式である。
【図１１】成分１および成分２の濃度とリパーゼ阻害活性の関係を示す図である。
【実施例】
【００１７】
以下、実施例により、本発明を更に詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例にのみ限定されるものではない。
【００１８】
［カワラケツメイからの抽出と分画］
本物質はカワラケツメイ等から、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー等、公知の方法により分離、採取することが可能である。具体的には、図1に示すように、カワラケツメイ地上部乾燥物からエタノールで抽出し、得られた抽出液をエバポレータで濃縮後、室温下で減圧乾燥した。次に、図２に示すように、エタノール抽出物をゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム）に供し、一段目は１００％エタノールで溶出し、続いて二段目を７０％エタノールで溶出し、分画した。このときの２つの画分（Ｆｒ２８−３５及びＦｒ４３−７０）のＨＰＬＣクロマトグラムを図３に示す。
【００１９】
更に、図２に示すように、リパーゼ阻害活性を示した２つの画分（Ｆｒ２８−３５及びＦｒ４３−７０）を分取ＨＰＬＣ（Ｕｎｉｓｏｎ ＵＫ−Ｃ１８ カラム）に供し、０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／アセトニトリル混液（９０：１０）から（２０：８０）までのグラディエントで溶出し、成分１及び成分２を得た。このときのＨＰＬＣクロマトグラムを図４に示す。なお、これらの収量は、０．７％及び０．６％であった。
【００２０】
［成分１の化学構造解析］
前記方法で採取した成分１は、そのＨＰＬＣクロマトグラムから少なくとも２成分から成る混合物であった。この成分１について、１Ｈ−ＮＭＲ及びＨ−ＨＣＯＳＹ測定を行った。それぞれのスペクトルを図３及び４に示す。更に、成分１についてＬＣ／ＭＳ測定を行ったところ、含まれる成分全ての分子量は５４６であったことから、これは異性体であると考えられた。これらのデータ解析と併せて、カワラケツメイの成分研究に関する文献調査を行い、得られた文献データと成分１の１Ｈ−ＮＭＲ実測値を比較した。その比較結果を表１に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】
前記比較の結果、成分１は、図５に示す構造を有する既知物質のタンニンで、２成分（１−１、１−２）の混合物と考えられた。参考文献（特開平７−６１９８１号公報及びＴ．ＨＡＴＡＮＯ, Ａ．ＹＡＭＡＳＨＩＴＡ, Ｔ．ＨＡＳＩＭＯＴＯ, Ｈ．ＩＴＯ, Ｎ．ＫＵＢＯ, Ｍ．ＹＯＳＨＩＹＡＭＡ，Ｓ．ＳＨＩＭＵＲＡ, Ｙ．ＩＴＯＨ, Ｔ．ＯＫＵＤＡ ａｎｄ Ｔ．ＹＯＳＨＩＤＡ, Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ.５，ｐ．８９３−９００，１９９７）
【００２３】
［成分２の化学構造解析］
前記方法で採取した成分２は、そのＨＰＬＣクロマトグラムから少なくとも２〜３成分からなる混合物であった。この成分２について、ＬＣ／ＭＳ分析を行ったところ、含まれる成分全ての分子量は８０２であったことから、これらは異性体であると考えられた（図６）。また、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定を行い、図７に示すデータが得られた。データ解析と併せて類似成分のＬＣ／ＭＳ／ＭＳに関する論文（参考文献 Ａ．Ｉ．ＣＡＬＤＥＲＳＯＮ，Ｂ．Ｊ．ＷＲＩＧＨＴ，Ｗ．Ｊ．ＨＵＲＳＴ ＡＮＤ Ｒ．Ｂ．ＢＲＥＥＭＡＮ, Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ.５７, ｐ.５６９３−５６９９, ２００９）を調査した結果、成分２は、図８に示す構造を有する新規タンニン（フラバン−カテキン−フラバンの３量体）であると考えられた。
【００２４】
［成分１、２リパーゼ阻害活性の測定］
リパーゼ活性の測定は、基質に蛍光性の４−メチルウンベリフェロンのオレイン酸エステル（４−ＵＭＯ）を使用し、反応によって生成した４−メチルウンベリフェロン
の蛍光を測定することにより実施した。測定にあたり、緩衝液は１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１．３６ｍＭＣａＣｌ２を含む１３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いた。基質である４−ＵＭＯ（シグマ製）は、０．１ＭのＤＭＳＯ溶液として調整したものを、前記緩衝液を用いて１０００倍に希釈したものを酵素測定に供した。またリパーゼは、ブタ膵リパーゼ（コスモバイオ製）を、前記緩衝液を用いて４００Ｕ／ｍｌ溶液として調製したものを酵素測定に供した。試料は、実施例で得た成分１及び２をＤＭＳＯで各濃度の溶液に調製し、更に、前記緩衝液で２５倍希釈したものを試料溶液とした。
【００２５】
酵素反応は、２５℃条件下において、９６穴マイクロプレートに５０μＬの４−ＵＭＯ緩衝溶液、２５μＬの試料溶液（及び試料溶解溶媒）を添加し混合した後に、２５μＬのリパーゼ緩衝液を添加することにより開始した。３０分間反応させた後に、１００μＬの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）を添加して反応を停止させ、反応によって生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光（励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４６５ｎｍ）を蛍光プレートリーダーで測定した。なお、酵素反応は全てｎ＝２で行った。
【００２６】
成分１および成分２の濃度とリパーゼ阻害活性の関係を図９に、このときのＩＣ５０（μｇ/ｍｌ）を表２に示す。このように成分１と比較して、成分２はリパーゼ阻害活性が１２．５倍高いことが判明した。
【００２７】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化２】
で表される新規タンニン。
【請求項２】
式
【化３】
で表される新規タンニンを有効成分とするリパーゼ阻害剤。
【請求項１】
式
【化２】
で表される新規タンニン。
【請求項２】
式
【化３】
で表される新規タンニンを有効成分とするリパーゼ阻害剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１２−２４０９２８（Ｐ２０１２−２４０９２８Ａ）
【公開日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０９５１０（Ｐ２０１１−１０９５１０）
【出願日】平成２３年５月１６日（２０１１．５．１６）
【出願人】（５９２００１３００）ミナト製薬株式会社 (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月１６日（２０１１．５．１６）
【出願人】（５９２００１３００）ミナト製薬株式会社 (3)
【Ｆターム（参考）】
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