新規フラボバクテリア属細菌および新規シュードモナス属細菌ならびにそれを含有する飼料
【課題】本発明は、動物の飼育に際し、病原性微生物および病原性ウイルスによる疾病を予防する素材を提供すること、ならびに、動物の飼育環境を改善する素材を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、フラボバクテリア属またはシュードモナス属に属し、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有する細菌に関する。本発明はまたこの細菌の培養物、菌体またはそれらの処理物を含有する飼料、飼料添加剤、飼育環境浄化剤、病原性微生物の増殖抑制剤、病原性ウイルスの増殖抑制剤、有機物の分解剤、動物の成長促進剤に関する。
【解決手段】本発明は、フラボバクテリア属またはシュードモナス属に属し、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有する細菌に関する。本発明はまたこの細菌の培養物、菌体またはそれらの処理物を含有する飼料、飼料添加剤、飼育環境浄化剤、病原性微生物の増殖抑制剤、病原性ウイルスの増殖抑制剤、有機物の分解剤、動物の成長促進剤に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規フラボバクテリア属細菌および新規シュードモナス属細菌、ならびに、魚類の養殖及び家畜の飼育に際して疾病を防除し、飼育環境の向上を図るための飼料、飼料添加剤または飼育環境浄化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
魚類の養殖及び家畜の飼育においては、病原性微生物または病原性ウイルスの増殖による疾病の発生により甚大な損害が発生することがある。これらの疾病防除には、抗生物質や抗菌性の薬剤が多用されているが、抗生物質はウイルス抑制能に乏しく、また薬剤耐性細菌の出現等の理由により、これらの薬剤の効果が期待できない事態が起きている。また、飼料に添加された抗生物質等の効果は一時的であり、魚類の養殖及び家畜の飼育において、特に持続的に疫病防除作用を発揮する方法が求められている。
【０００３】
一方、養殖底土には、残存した配合飼料や魚類の糞が沈降し蓄積して、有毒ガス（硫化水素等）の生産や赤潮発生の原因となっており、それらの現象により魚類の成長不良、病原性細菌または病原性ウイルスによる感染、大量斃死などが引き起こされる。また、家畜の飼育においても飼育環境の浄化、すなわち、飼育環境中での病原性微生物または病原性ウイルスの侵入及び家畜の糞尿の悪臭の軽減が課題となっている。
【０００４】
上記の養殖及び家畜の飼育において、細菌等の微生物が有する抗菌性を利用して病原性微生物またはウイルスを防除すると同時にその微生物が有する有機物を分解する能力を利用して飼育環境を浄化することができれば、抗生物質等を添加する従来技術と比較して、より持続的且つ多面的な作用が期待できる。
【０００５】
これまでに、魚類の養殖及び家畜の飼育においてフラボバクテリア属細菌を用いて病原性微生物または病原性ウイルスの増殖を抑制する技術は開示されていない。
【０００６】
更に、フラボバクテリア属の細菌は炭化水素類を分解すること(特許文献４参照)、排水処理における難分解性化合物の低減に役立つこと（特許文献５参照）は開示されているが、養殖底土の改善及び家畜の飼育環境の浄化に関しては知見を見いだすことができない。
【０００７】
また、これまでに、魚類の養殖及び家畜の飼育においてシュードモナス属細菌を添加して免疫力を増強する方法、赤潮を防除する方法、抗生物質の製造方法（特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７参照）は開示されているが、動物の飼育過程で利用して病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する技術は開示されていない。
【０００８】
更に、シュードモナス属の細菌は有機物の分解能が強く、環状脂肪族炭化水素類を分解すること(特許文献８参照)、排水処理における脱窒に役立つこと（特許文献９参照）、家畜等の排泄物の処理を行う方法は開示されているが（特許文献１０参照）、養殖底土の改善及び家畜の飼育環境の浄化に関しては知見を見いだすことができない。
【０００９】
【特許文献１】特開平６−８０号公報
【特許文献２】特開平１０−１６５９８３号公報
【特許文献３】特開２００５−５８１３７号公報
【特許文献４】特開平０５−１１２４１６号公報
【特許文献５】特開平０５−１１２４１７号公報
【特許文献６】特公平０６−６７９４８号公報
【特許文献７】特開平０６−９２８１５号公報
【特許文献８】特開２００４−３３０４５号公報
【特許文献９】特開２００１−２５９６８６号公報
【特許文献１０】特開２００３−９５７７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明が解決しようとする課題は、動物（家畜、ペット、家禽、魚類等）の飼育に際し、病原性微生物および病原性ウイルスによる疾病を予防する素材を提供することである。
【００１１】
本発明が解決しようとする課題はまた、動物（家畜、ペット、家禽、魚類等）の飼育環境を改善する（具体的には、魚類の養殖水槽や養殖水域の底土に蓄積した有機物や、家畜の飼育環境に蓄積する有機物を分解する）素材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、自然界、魚類の養殖環境、家畜の飼育環境から多数の細菌を分離し、病原性細菌（ビブリオ・アンギララム及びエドワジェラ・タルダ）の増殖を抑制する細菌の検索を行った。
【００１３】
次に、病原性細菌の増殖を抑える細菌の培養液の上清に関して、病原性ウイルス（伝染性造血器壊死症ウイルス、インフルエンザウイルス）の増殖を抑える細菌の検索を行った。
【００１４】
上記の広範な検索の結果、病原性細菌と病原性ウイルスに対して強い抑制作用を持つ菌株として分離番号ＢＣ−０７株およびＢＣ−０８株を得た。
【００１５】
ＢＣ−０７株またはＢＣ−０８株の培養物を飼料に添加して魚類に与えることによって魚病の抑制効果と飼育水槽底土の全有機物の低減を確認した。更に、菌株ＢＣ−０７またはＢＣ−０８の培養物を飼料に添加して家畜に与えることによって疾病の抑制効果を確認した。また菌株ＢＣ−０７はフラボバクテリア属に属する新規株であることが確認された。菌株ＢＣ−０８はシュードモナス属に属する新規株であることが確認された。こうして本発明は完成された。
【００１６】
すなわち本発明は、以下の発明を包含する。
（１）フラボバクテリア属またはシュードモナス属に属し、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有する細菌。
（２）フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０７３８）またはその変異株である（１）記載の細菌。
（３）シュードモナス・コレンシス (Pseudomonas koreensis) に属し、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有する（１）記載の細菌。
（４）シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１１２０）またはその変異株である（３）記載の細菌。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する飼料。
（６）（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する飼料添加剤。
（７）（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する動物の飼育環境の浄化剤。
（８）（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する病原性微生物の増殖抑制剤。
（９）（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する病原性ウイルスの増殖抑制剤。
（１０）（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する有機物の分解剤。
（１１）（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する動物の成長促進剤。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、動物の飼育に際し病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制することによって、動物の疾病を予防できる素材が提供される。更に、本発明により、動物の飼育環境における有機物の分解を促進し、動物の飼育環境を浄化する素材が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１９】
本発明に用いることができる微生物は、フラボバクテリア属に属し、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有する細菌であれば特に限定されないが、具体的にはフラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７またはその変異株が好ましい。フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０７３８として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００５年１２月２１日付で寄託されている。本微生物は当初シュードモナス属に属すると分類されたため、本出願人は識別のための表示として「シュードモナス・エスピーＢＣ−０７」を付し上記寄託機関に寄託した。しかしながらその後の研究により本微生物はフラボバクテリア属に分類することがより適切であると判明した。本明細書中で「フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７」と称する微生物は、本願の基礎出願（特願２００６−１７５４２号）における「シュードモナス・エスピーＢＣ−０７」と称する微生物と同一である。本発明にはまた、フラボバクテリア属に属し、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有する細菌であって、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列が配列番号１の塩基配列を含む細菌を用いてもよい。
【００２０】
フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７は実施例１に記載した菌学的性質を有し、フラボバクテリア属に分類されるが、既存の種とは一致しない。通常、フラボバクテリア属以外の細菌およびフラボバクテリア属の他の菌株のほとんどが抗病性を持たないかまたは抗病性が低い。本発明者らは、驚くべきことに、フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７が、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を強力に抑制することができることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明にはまた、フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７が有する病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力が維持されている限り、フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７が変異誘発処理された変異株を用いることができる。変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行われ得る。ここで、「変異原」なる語は、その広義において、例えば変異原効果を有する薬剤のみならずＵＶ照射のごとき変異原効果を有する処理をも含むものと理解すべきである。適当な変異原の例としてエチルメタンスルホネート、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアクリジン類が挙げられるが、他の任意の効果的な変異原もまた使用され得る。
【００２１】
ＢＣ−０７株の培養には、一般的な細菌用の培地を適用することができ、特に組成を限定するものではない。例えば、ペプトン１０ｇ、酵母エキス２ｇ、クエン酸鉄０．０３３ｇ、リン酸一カリウム０．１６７ｇ、硫酸マグネシウム０．１６７ｇ、塩化カルシウム０．０３４ｇ、水道水１０００ｍｌ、ｐＨ７．０の培地を作製し、１２１℃、１５分間の加熱滅菌を行って使用することができる。また、上記液体培地のほかに固体培地によっても培養が可能であり、米ぬか、魚粉、配合飼料などに少量の水分を加えた培地を用いて良好に培養することができる。
【００２２】
ＢＣ−０７を培養するときの培養容器は、一般的な微生物の培養に用いられる装置を用いることができ、特に方法を限定するものではない。例えば、小規模の培養では試験管、フラスコ、シャーレなどを用いることができ、大規模の培養にはジャーファメンター、通気攪拌できるタンク、固体培養装置などを使用することができる。
【００２３】
本発明に用いることができる他の微生物は、シュードモナス属（なかでもシュードモナス・コレンシス）に属し、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有する細菌であれば特に限定されないが、具体的にはシュードモナス・コレンシスＢＣ−０８またはその変異株が好ましい。シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１１２０として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００６年１２月１日付で寄託されている。本発明にはまた、シュードモナス属に属し、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有する細菌であって、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列が配列番号２の塩基配列を含む細菌を用いてもよい。
【００２４】
シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８は実施例４に記載した菌学的性質を有し、シュードモナス属コレンシス種に分類されるが、既存の株と完全には一致しない。通常、シュードモナス属以外の細菌およびコレンシス種を含むシュードモナス属の他の菌株のほとんどが抗病性を持たないか又は抗病性が低い。本発明者らは、驚くべきことに、シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８が、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を強力に抑制することができることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明にはまた、シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８が有する病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力が維持されている限り、シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８が変異誘発処理された変異株を用いることができる。変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行われ得る。ここで、「変異原」なる語は、その広義において、例えば変異原効果を有する薬剤のみならずＵＶ照射のごとき変異原効果を有する処理をも含むものと理解すべきである。適当な変異原の例としてエチルメタンスルホネート、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアクリジン類が挙げられるが、他の任意の効果的な変異原もまた使用され得る。
【００２５】
ＢＣ−０８株の培養には、一般的な細菌用の培地を適用することができ、特に組成を限定するものではない。例えば、ペプトン２ｇ、酵母エキス０．５ｇ、肉エキス０．２ｇ、クエン酸鉄０．０３３ｇ、リン酸一カリウム０．１６７ｇ、硫酸マグネシウム０．１６７ｇ、塩化カルシウム０．２ｇ、酢酸ナトリウム０．２ｇ、水道水１０００ｍｌ、ｐＨ７．２〜７．４の培地を作製し、１２１℃、１５分間の加熱滅菌を行って使用することができる。また、上記液体培地のほかに固体培地によっても培養が可能であり、米ぬか、魚粉、配合飼料などに少量の水分を加えた培地を用いて良好に培養することができる。
【００２６】
ＢＣ−０８を培養するときの培養容器は、一般的な微生物の培養に用いられる装置を用いることができ、特に方法を限定するものではない。例えば、小規模の培養では試験管、フラスコ、シャーレなどを用いることができ、大規模の培養にはジャーファメンター、通気攪拌できるタンク、固体培養装置などを使用することができる。
【００２７】
以下の説明は特に断りのない限りフラボバクテリア属細菌およびシュードモナス属細菌のどちらにも当てはまる。
【００２８】
本発明の細菌は培養物、菌体、培養物または菌体の処理物として本発明の目的に使用できる。ここで「培養物」とは固体または液体培地中で細菌を培養して生じる、菌体の分離を行っていない培養物（液体培地の場合は培養液）である。「菌体」とは培養後に前記培養物から菌体を遠心分離や膜分離の手法により単離（高濃度化を含む概念）して得られたものである。培養物または菌体の「処理物」とは、培養物または菌体を常法により処理したもの全てを包含する概念であり、例えば、培養物または菌体の希釈物、濃縮物、乾燥物、凍結物や、培養液の上清や、培養液の上清の希釈物、濃縮物、乾燥物、凍結物を指す。
【００２９】
本発明の細菌の培養物、菌体、またはそれらの処理物として特に好ましい実施形態について以下に説明する。
【００３０】
本発明の目的には、培養を終了した菌体培養液を菌を含む培養液そのままの状態で使用できる。保存温度５℃以下で２〜３週間程度の期間有効に保管できるため、低温輸送、冷蔵庫保管することによって魚類や家畜の飼育に際して有効に利用することができる。
【００３１】
培養を終了した菌体培養液を小分けして凍結して保管するのもまた、長期保存の観点から有効である。菌の活力維持の観点から、凍結前に、グリセロール、脱脂粉乳、糖類などの保護剤を加えるのが好ましく、保護剤の添加濃度は１〜６０％（保護剤の重量/培養液の容積）の範囲であり、より好ましくは５〜３０％（保護剤の重量/培養液の容積）の範囲である。凍結した培養液は、そのまま−２０℃以下で保管することによって６月以上の保管が可能であり、長期にわたって魚類や家畜の飼育のために有効に利用することができる。
【００３２】
培養を終了した菌体培養液は乾燥して用いることもできる。菌の活力が低下するため効力が低下する欠点はあるが、長期に保管して魚類や家畜の飼育に使用できる観点から適している。乾燥方法は、特に限定するものではないが、例えば、噴霧乾燥、真空乾燥、真空凍結乾燥などを用いることができる。
【００３３】
培養を終了した培養液は、菌体と培養液上清を分離して使用することができる。菌体と培養液上清の分離方法に制限はないが、例えば、遠心分離、膜分離によって菌体と培養液上清のそれぞれを回収することができる。培養液上清は必要に応じて加熱減圧濃縮、限外ろ過などによって濃縮することもできる。得られた菌体または培養液上清は、冷蔵、冷凍、乾燥品のいずれの形態にも加工することができ、それぞれが魚類や家畜の飼育のために利用することができる。
【００３４】
本発明の細菌の培養物、菌体、またはそれらの処理物は、他の任意の成分との混合物として用いることも可能である。例えば、混合できる物質として、配合飼料、乳酸菌、バチルス菌、クロレラ、朝鮮人参、クロレラエキス、ローヤルゼリー、魚粉、穀物粉末、海藻粉末、ゼオライトが挙げられ、飼料として利用できるものまたは飼料に添加できるものであれば種類を問わない。
【００３５】
本発明の細菌の培養物、菌体、またはそれらの処理物は、他の任意の物質に吸着させることが可能である。例えば、ゼオライト、活性炭、米ぬか、魚粉などに吸着させることによって、飼育環境中に散布したときに、安定して飼育環境中に維持され、長期にわたって効果を期待することができる。
【００３６】
本発明の細菌は動物飼育用の飼料、飼料添加物または飼育環境の浄化剤に使用することが可能である。
【００３７】
本発明において「動物」とは魚類、家畜、ペット、家禽などを指す。
【００３８】
本発明において「魚類」とは当業者にとって自明である任意の魚類を意味するが、例えば、アユ、ニジマス、ウナギ、ヤマメ、アマゴ、イワナ、ワカサギ等の淡水魚、またはタイ、ハマチ、ヒラメ、カンパチ、シマアジ、ギンザケ、フグ等の海水魚が挙げられる。
【００３９】
本発明において「家畜」とは当業者にとって自明である任意の動物を意味するが、例えば、ブタ、ブロイラー、養鶏、牛、家兎などが挙げられる。
【００４０】
本発明において「ペット」とは当業者にとって自明である任意の動物を意味するが、例えば、マウス、ハムスター、モルモット、うさぎなどが挙げられる。
【００４１】
本発明において「病原性微生物」とは、例えば病原性の細菌が挙げられ、ビブリオ・アンギララム(Vibrio anguillarum)、エドワジエラ・タルダ（Edwardsiella tarda）、サルモネラ・エンテリチディス（Salmonella enteritidis）、サプロレジナ・ディクリナ(Saprolegina diclina)、デルモシスティディウム・アンギラ(Dermocystidium anguillae)などが挙げられる。
【００４２】
本発明において「病原性ウイルス」とは、例えば伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）、インフルエンザウイルス（Influenza Virus）、イリドウイルス（LCDV）、ノダウイルス（SJNNV）、ビルナウイルス(YAV)、ラブドウイルス (HIRRV) 等が挙げられる。
【００４３】
本発明において飼育環境の浄化剤とは、動物の飼育環境に散布することによって、環境中に存在する病原菌や病原性ウイルスの低減に役立つと共に、養殖底土に蓄積する有機物や飼育環境中に排泄される有機物を分解する資材を指す。
【００４４】
本発明の細菌の培養物、菌体、またはそれらの処理物はまた、病原性微生物の増殖抑制剤、病原性ウイルスの増殖抑制剤、あるいは有機物の分解剤として用いることができる。これらの実施形態においては、本発明の細菌の培養物、菌体、またはそれらの処理物は、使用目的（例えば医薬用途、獣医学的用途、水産養殖用途）において許容される賦形剤または担体とともに使用することができる。
【００４５】
本発明の細菌の培養物、菌体、またはそれらの処理物はまた、動物の成長促進剤として用いることもできる。この用途では、本発明の細菌の培養物、菌体、またはそれらの処理物を動物飼育用の飼料、飼料添加物等の形態で動物に摂食させることにより、動物の成長を促進する。ここで「動物」とは上記で定義した通りである。これらの実施形態においては、本発明の細菌の培養物、菌体、またはそれらの処理物は、使用目的（例えば医薬用途、獣医学的用途、水産養殖用途）において許容される賦形剤または担体とともに使用することができる
【実施例１】
【００４６】
フラボバクテリア・エスピーBC-07株の単離および同定
本実施例に使用するフラボバクテリア・エスピーＢＣ-０７株は淡水魚飼育環境より単離された菌株であり、以下のような特徴を持つ。
ア）：長さ1〜3ミクロンで、形状は短桿菌。コロニーの色は黄白色である。
イ）：培地：ペプトン培地組成：Bacto-peptone (Difco Co. Ltd.) 2 g、 Bacto-yeast extracts (同上) 1 g 、クエン酸鉄（同上） 0.1 g、 純水 1 L、 ｐＨ 7.2においてよく増殖する。
【００４７】
フラボバクテリア・エスピーBC-07株の菌学的性状
１−１. 細胞の形：短桿状。 細胞の大きさ ：１〜３（μｍ）。１−２. 多形性 ：長さの異なる種々の細胞が通常の培養で多々存在する。１−３. 運動性 ：なし、 鞭毛 ：なし、胞子 ：なし、グラム染色性 ：陰性、抗酸性 ：なし。
２−１． 生育程度 ：３日間培養で数mmのコロニーを形成する、 色 ：薄い黄白色、 光沢 ：特になし、表面は平滑、 拡散性色素 ：なし。
３−１. 硝酸塩還元 ：＋。 ３−２. 脱窒反応 ： ＋。 ３−３. ＭＲテスト ： −。 ３−４. ＶＰテスト ： −。 ３−５. インドール ： −。 ３−６．硫化水素 ： −。 ３−７．デンプン水解 ： ＋。３−８． クエン酸 ：−。 ３−９．硝酸塩利用 ： −、 アンモニウム塩利用 ： ＋。３−１０．色素生成 ： ＋。３−１１．ウレアーゼ ： −。３−１２．オキシダーゼ ：＋。３−１３．カタラーゼ ： ＋。３−１４．pH ：5.0(-), 5.6(+), 8.6(+), 9.0(−) 。３−１５．温度 ：中温性 ５−３０℃．酸素要求性 ：好気性。 ３−１６． ＯＦテスト ：−。
4−１. NaCl濃度と生育 ：０−２％で生育、至適範囲 ０−１％。
【００４８】
（１）核酸の抽出
"Sepa Gene"キット（三光純薬（株）製）を用いて核酸の抽出を行った後、エタノール沈殿により核酸を回収した。
（２）PCR
１６SrRNAに特異的なユニバーサルプライマー２種（５’ 末端側及び３’ 末端側）を用いて増幅を行った。
（３）PCR増幅産物の精製
増幅終了後、スピンカラム（ファルマシア社製）を用いて精製を行った。
（４）１６SrRNA塩基配列の解析
精製したPCR増幅産物をアプライド バイオシステムズ 377DNAシークエンサー（パーキンエルマー社製）により５’ 末端側の塩基配列解析を行った。
（５）１６SrRNAデータベース検索による相同解析
ジーンバンクのデータベースよりオンラインで検索を行った。
フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株の１６ＳｒＲＮＡの部分塩基配列を配列番号１に示す。
【００４９】
本発明菌を産業別審査基準応用微生物工業改訂版（特許庁編）の新種細菌の記載例に従って、その性状を調べ、Baumann 等(1984)に基づきその分類学上の位置を検討した結果、本菌株は、フラボバクテリア属と同定されたが、既存の種とは一致しなかった。なお本願基礎出願時には本菌株はシュードモナス属に分類されたが、その後の検討によりフラボバクテリア属に分類するほうがより適切であることが明らかとなった。
【００５０】
本発明者らは該菌株を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０７３８として寄託した。本発明者らは該菌株をフラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株と命名した。
【００５１】
抗細菌試験
上記のフラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株が病原性細菌の増殖を抑制する能力を有することを以下のように確認した。
寒天培地にあらかじめ塗沫した2本の上記菌株のスミアの間に、魚類疾病原因細菌であるビブリオ・アンギララムまたはエドワジエラ・タルダを移植して25℃下にて10日間培養後のスミアの間の病原菌のコロニーの大きさを、病原菌のみを対照区として培養した場合のコロニーの大きさと比較したところ、表１に示すとおり、ビブリオ・アンギララムおよびエドワジエラ・タルダの増殖が抑制された。表１中の「阻害率」は、対照区培地上のビブリオ・アンギララム（またはエドワジエラ・タルダ）のコロニーの横幅の大きさと試験区の同菌のコロニーの同大きさとの比を百分率で表したものである。
【００５２】
【表１】
【００５３】
抗ウイルス試験
上記の菌株フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株が病原性ウイルスの増殖を抑制する能力を有することを以下のように確認した。
【００５４】
マスノスケの細胞 CHSE-214の培養系において、上記菌株の培養上澄液が伝染性造血器壊死症の原因ウイルスである伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）の作用を抑制するか否かについて検定した。作用抑制効果はマスノスケ細胞の変性効果 (CPE) を抑制する度合いを指標として判定した。
【００５５】
マスノスケ細胞 CHSE-214を、1 mLの液体培地（10％ウシ血清成分、0．075％NaHCO3、100 IU／mLペニシリン、100μg／mLストレプトマイシン、1.6％Tris-HCl(pH 7.8) 含有）中で15℃にて培養し、その培養系に、IHNV培養液および上記フラボバクテリア属細菌の培養上清液（0.1 mL）を加えた。対照実験として、前記培養系にIHNVの培養液のみ（0.1 mL）を添加した。ここで、上記フラボバクテリア属細菌の培養上清液とは、該細菌をニュートリエントブロス培地中で3日間25℃で培養した後に遠沈 (4000rpm)して菌体を沈澱させ、0.22μmのフィルターでろ過して得られた濾液を指す。またIHNVの培養液とは、同様の上記培養液およびCHSE-214を用いてIHNVを増殖させた後、0.45μmのフィルターで濾過して得られた濾液を指す。
【００５６】
上記の菌体培養上清液を添加した後のCPEを経時的に測定した。CPEが低いということは、すなわちウイルスの増殖が抑制されていることを意味すると考えられる。結果を図１に示す。図１に示すとおり、フラボバクテリア・エスピーＢＣ-０７株の培養上清を添加した場合にIHNVの増殖が抑制された。
【００５７】
更に、上記の方法を一部改変し、菌株フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株がインフルエンザウイルスの増殖を抑制する能力を有することを確認した。すなわち、上記の方法においてマスノスケ細胞(IHV)の替わりにヒト結腸腺由来細胞（Caco-2）を用い、伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）の替りにインフルエンザウイルス（H3N2弱病原性）を用いて調べた結果、ＢＣ−０７株培養上清液はインフルエンザウイルスの増殖を抑制した(図２)。
【実施例２】
【００５８】
タイに対するウイルス攻撃試験
本発明の飼料（実験区）は、市販の粉末配合飼料（日本水産株式会社製）に、フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株の培養液（ヘプトン１０ｇ、酵母エキス２ｇ、リン酸一カリウム１．６７ｇ、硫酸マグネシウム１．６７ｇ、クエン酸鉄３３ｍｇ、塩化カルシウム３４ｍｇを水道水１０００ｍｌに溶解させｐＨ７．２に調整して得られた液体培地中で同菌株を培養した菌体を含む培養液）を２０％（Ｖ／Ｗ）の割合で添加し、よく混合することにより調製した。また、従来法の飼料（対照区）は、市販の粉末配合飼料（日本水産株式会社製）に細菌用の液体培地だけ（菌株は含まず）を２０％（Ｖ／Ｗ）の割合で添加し、よく混合することにより調製した。
【００５９】
上記のフラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株を含有した飼料（実験区）、またはフラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株を含有しない飼料（対照区）を、タイ（体長約8cm、各実験区につき20個体）に、100 L容量の水槽中で0.2個体／Lの飼育密度で、25℃において、5g／個体／日の割合で10日間投与した後、タイの致死濃度に設定したイリドウイルス液を腹腔内注射した。なお上記のイリドウイルス液は、予めタイ腹腔内でウイルスを培養させ、タイの死亡後に腹腔内より取り出したウイルス液を致死濃度に希釈したものである。ここで、致死濃度は、タイの死亡後に腹腔内より取り出したウイルス液を種々の割合で希釈したものをタイに投与して実際に感染して死亡する濃度を確認することにより決定した。
【００６０】
その後、両実験区のタイを対照実験で使用したのと同じフラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株を含有しない飼料で飼育し、両実験区における魚体生残率を経時的に測定した。結果を図３に示す。フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株無添加区のタイは全て死滅したが、フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株添加実験区のタイは７０％が生残した。
【実施例３】
【００６１】
アユ飼育槽底砂の栄養塩の定量
砂を底面に敷き詰めた水槽（100 L容量）において、アユ（実験当初の体長約１０ｃｍ）を１０個体／ｍ２の密度で、２０℃において１ｇ／個体／日の割合で市販の飼料を投与して約３ヶ月間飼育した。試験区には実施例２に記載したフラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７の培養液を、飼育水当たりの菌数が１０５〜１０６／ｍｌとなるように毎日散布した。飼育終了後に、砂に蓄積した栄養物質の中で全硫化物量、全窒素量、全リン量および全有機物量（灼熱減量）を測定した。
【００６２】
全硫化物量はヨウ素滴定法により測定した。全窒素量はペルオキソ２硫酸カリウム酸化法により測定した。全リン量はアスコルビン酸還元法により測定した。灼熱減量は、試料有機物を600℃で熱することにより測定した。これらの測定はいずれも当業者にとって周知の標準的な測定手順に従って行った。
【００６３】
結果を図４に示す。フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株を含有する飼料をアユに投与した場合に全硫化物量、全窒素量、全リン量および全有機物量が低減した。このように、養殖水域底土中の有機物分解が進行したことが示された。
【実施例４】
【００６４】
シュードモナス・コレンシスBC-08株の単離および同定
本実施例に使用するシュードモナス・コレンシスＢＣ‐０８株は淡水魚飼育環境より単離された菌株であり、以下のような特徴を持つ。
ア）：長さ1〜3ミクロンで、形状は短桿菌。鞭毛を持ち、運動を行う。コロニーの色は白色である。
イ）：培地：ペプトン２ｇ、酵母エキス０．５ｇ、肉エキス０．２ｇ、クエン酸鉄０．０３３ｇ、リン酸一カリウム０．１６７ｇ、硫酸マグネシウム０．１６７ｇ、塩化カルシウム０．２ｇ、酢酸ナトリウム０．２ｇ、水道水１０００ｍｌ、ｐＨ７．２〜７．４においてよく増殖する。
【００６５】
シュードモナス・コレンシスBC-08株の菌学的性状
１−１. 細胞の形：短桿状。 細胞の大きさ ：１〜３（μｍ）。１−２. 運動性 ：あり、 鞭毛 ：あり、胞子 ：なし、グラム染色性 ：陰性、抗酸性 ：なし。
２−１． 生育程度 ：３日間培養で数mmのコロニーを形成する、 色 ：白色、 光沢 ：特になし、表面は平滑、 拡散性色素 ：なし。
３−１. 硝酸塩還元 ：−。 ３−２. 脱窒反応 ： −。 ３−３. ＭＲテスト ： −。 ３−４. ＶＰテスト ： −。 ３−５. インドール ： −。 ３−６．硫化水素 ： −。３−７． クエン酸 ： −。 ３−８．硝酸塩利用 ： −、３−９．色素生成 ： −。３−１０．ウレアーゼ ： −。３−１１．オキシダーゼ ：−。３−１２．カタラーゼ ：＋。３−１３．pH ：5.0(-), 5.6(+), 8.6(+), 9.0(＋) 。３−１４．温度 ：中温性 ５−３５℃。３−１５． ＯＦテスト ：−。
４−１. NaCl濃度と生育 ：０−３％で生育、至適範囲 ０−３％。
【００６６】
（１）核酸の抽出
"Sepa Gene"キット（三光純薬（株）製）を用いて核酸の抽出を行った後、エタノール沈殿により核酸を回収した。
（２）PCR
１６SrRNAに特異的なユニバーサルプライマー２種（５’ 末端側及び３’ 末端側）を用いて増幅を行った。
（３）PCR増幅産物の精製
増幅終了後、スピンカラム（ファルマシア社製）を用いて精製を行った。
（４）１６SrRNA塩基配列の解析
精製したPCR増幅産物をアプライド バイオシステムズ 377DNAシークエンサー（パーキンエルマー社製）により５’ 末端側の塩基配列解析を行った。
（５）１６SrRNAデータベース検索による相同解析
ジーンバンクのデータベースよりオンラインで検索を行った。
【００６７】
シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。
【００６８】
本発明菌を産業別審査基準応用微生物工業改訂版（特許庁編）の新種細菌の記載例に従って、その性状を調べ、Baumann 等(1984)に基づきその分類学上の位置を検討した結果、本菌株は、シュードモナス・コレンシスと同定された。
【００６９】
本発明者らは該菌株をシュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株と命名し、平成１８年１２月１日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭＰ−２１１２０として寄託した。
【００７０】
抗細菌試験
上記のシュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株が病原性細菌の増殖を抑制する能力を有することを以下のように確認した。
寒天培地にあらかじめ塗沫した2本の上記菌株のスミアの間に、魚類疾病原因細菌であるビブリオ・アンギララムまたはエドワジエラ・タルダを移植して25℃下にて10日間培養後のスミアの間の病原菌のコロニーの大きさを、病原菌のみを対照区として培養した場合のコロニーの大きさと比較したところ、表２に示すとおり、ビブリオ・アンギララムおよびエドワジエラ・タルダの増殖が抑制された。表２中の「阻害率」は、対照区培地上のビブリオ・アンギララム（またはエドワジエラ・タルダ）のコロニーの横幅の大きさと試験区の同菌のコロニーの同大きさとの比を百分率で表したものである。
【００７１】
【表２】
【００７２】
抗ウイルス試験
上記の菌株シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株が病原性ウイルスの増殖を抑制する能力を有することを以下のように確認した。
【００７３】
マスノスケの細胞CHSE-214の培養系において、上記菌株の培養上澄液が伝染性造血器壊死症の原因ウイルスである伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）の作用を抑制するか否かについて検定した。作用抑制効果はマスノスケ細胞の変性効果 (CPE) を抑制する度合いを指標として判定した。
【００７４】
マスノスケ細胞 CHSE-214を、1 mLの液体培地（10％ウシ血清成分、0．075％NaHCO3、100 IU／mLペニシリン、100μg／mLストレプトマイシン、1.6％Tris-HCl(pH 7.8) 含有）中で15℃にて培養し、その培養系に、IHNV培養液および上記シュードモナス属細菌の培養上清液（0.1 mL）を加えた。対照実験として、前記培養系にIHNVの培養液のみ（0.1 mL）を添加した。ここで、上記シュードモナス属細菌の培養上清液とは、該細菌をニュートリエントブロス培地中で3日間25℃で培養した後に遠沈 (4000rpm)して菌体を沈澱させ、0.22μmのフィルターでろ過して得られた濾液を指す。またIHNVの培養液とは、同様の上記培養液およびCHSE-214を用いてIHNVを増殖させた後、0.45μmのフィルターで濾過して得られた濾液を指す。
【００７５】
上記の菌体培養上清液を添加した後のCPEを経時的に測定した。CPEが低いということは、すなわちウイルスの増殖が抑制されていることを意味すると考えられる。結果を図５に示す。図５に示すとおり、シュードモナス・コレンシスＢＣ-０８株の培養上清を添加した場合にIHNVの増殖が抑制された。
【００７６】
更に、上記の方法を一部改変し、菌株シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株がインフルエンザウイルスの増殖を抑制する能力を有することを確認した。すなわち、上記の方法においてマスノスケ細胞(IHV)の替わりにヒト結腸腺由来細胞（Caco-2）を用い、伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）の替りにインフルエンザウイルス（H3N2弱病原性）を用いて調べた結果、ＢＣ−０８株培養上清液はインフルエンザウイルスの増殖を抑制した(図６)。
【実施例５】
【００７７】
タイに対するウイルス攻撃試験
本発明の飼料（実験区）は、市販の粉末配合飼料（日本水産株式会社製）に、シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株の培養液（ペプトン２ｇ、酵母エキス０．５ｇ、肉エキス０．２ｇ、クエン酸鉄０．０３３ｇ、リン酸一カリウム０．１６７ｇ、硫酸マグネシウム０．１６７ｇ、塩化カルシウム０．２ｇ、酢酸ナトリウム０．２ｇ、水道水１０００ｍｌ、ｐＨ７．２〜７．４に調整して得られた液体培地中で同菌株を培養した菌体を含む培養液）を２０％（Ｖ／Ｗ）の割合で添加し、よく混合することにより調製した。また、従来法の飼料（対照区）は、市販の粉末配合飼料（日本水産株式会社製）に細菌用の液体培地だけ（菌株は含まず）を２０％（Ｖ／Ｗ）の割合で添加し、よく混合することにより調製した。
【００７８】
上記のシュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株を含有した飼料（実験区）、またはシュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株を含有しない飼料（対照区）を、タイ（体長約8cm、各実験区につき20個体）に、100 L容量の水槽中で0.2個体／Lの飼育密度で、25℃において、5g／個体／日の割合で10日間投与した後、タイの致死濃度に設定したイリドウイルス液を腹腔内注射した。なお上記のイリドウイルス液は、予めタイ腹腔内でウイルスを培養させ、タイの死亡後に腹腔内より取り出したウイルス液を致死濃度に希釈したものである。ここで、致死濃度は、タイの死亡後に腹腔内より取り出したウイルス液を種々の割合で希釈したものをタイに投与して実際に感染して死亡する濃度を確認することにより決定した。
【００７９】
その後、両実験区のタイを対照実験で使用したのと同じシュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株を含有しない飼料で飼育し、両実験区における魚体生残率を経時的に測定した。結果を図７に示す。シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株無添加区のタイは全て死滅したが、シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株添加実験区のタイは８０％が生残した。
【実施例６】
【００８０】
アユ飼育槽底砂の栄養塩の定量
砂を底面に敷き詰めた水槽（100 L容量）において、アユ（実験当初の体長約１０ｃｍ）を１０個体／ｍ２の密度で、２０℃において１ｇ／個体／日の割合で市販の飼料を投与して約３ヶ月間飼育した。試験区には実施例５に記載したシュードモナス・コレンシスＢＣ−０７の培養液を、飼育水当たりの菌数が１０５〜１０６／ｍｌとなるように毎日散布した。飼育終了後に、砂に蓄積した栄養物質の中で全硫化物量、全窒素量、全リン量および全有機物量（灼熱減量）を測定した。
【００８１】
全硫化物量はヨウ素滴定法により測定した。全窒素量はペルオキソ２硫酸カリウム酸化法により測定した。全リン量はアスコルビン酸還元法により測定した。灼熱減量は、試料有機物を600℃で熱することにより測定した。これらの測定はいずれも当業者にとって周知の標準的な測定手順に従って行った。
【００８２】
結果を図８に示す。シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株を含有する飼料をアユに投与した場合に全硫化物量、全窒素量、全リン量および全有機物量が低減した。このように、養殖水域底土中の有機物分解が進行したことが示された。
【実施例７】
【００８３】
家兎の飼育実験
対照区及び試験区それぞれ3羽の家兎（開始時の平均体重２．１ｋｇ）を用いて飼育実験を行った。餌は家兎用飼料（オリエンタル酵母工業製）を用い、試験区の飼料はシュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株の培養液（ペプトン２ｇ、酵母エキス０．５ｇ、肉エキス０．２ｇ、クエン酸鉄０．０３３ｇ、リン酸一カリウム０．１６７ｇ、硫酸マグネシウム０．１６７ｇ、塩化カルシウム０．２ｇ、酢酸ナトリウム０．２ｇ、水道水１０００ｍｌ、ｐＨ７．２〜７．４に調整して得られた液体培地中で同菌株を培養した菌体を含む培養液）を１０％（Ｖ／Ｗ）の割合で配合飼料に添加し、よく混合することにより調製した。飼料は１日に１００ｇ程度を与え、６週間の飼育を行った。
【００８４】
その結果、対照区では下痢症状を起こす個体が認められたのに対して試験区の個体は健全であり、実験終了時の体重も対照区では平均体重２．８kgであったのに対して試験区では平均体重３．３kgと成長がすぐれていた。更に、対照区に比べて試験区では糞尿の悪臭も軽減された。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】フラボバクテリア・エスピーBC-07株の培養上清を添加した場合にIHNVの増殖が抑制されたことを示す図である。
【図２】フラボバクテリア・エスピーBC-07株の培養上清を添加した場合にインフルエンザウイルスの増殖が抑制されたことを示す図である。
【図３】抗ウイルス細菌フラボバクテリア・エスピーを添加した、或いは無添加の配合飼料の投与によるタイの飼育結果を示す図である。
【図４】飼料中にフラボバクテリア・エスピーBC-07株を添加した場合と、無添加の場合における、アユ飼育水槽底砂中の栄養塩濃度を示す図である。
【図５】シュードモナス・コレンシスBC-08株の培養上清を添加した場合にIHNVの増殖が抑制されたことを示す図である。
【図６】シュードモナス・コレンシスBC-08株の培養上清を添加した場合にインフルエンザウイルスの増殖が抑制されたことを示す図である。
【図７】抗ウイルス細菌シュードモナス・コレンシスを添加した、或いは無添加の配合飼料の投与によるタイの飼育結果を示す図である。
【図８】飼料中にシュードモナス・コレンシスBC-08株を添加した場合と、無添加の場合における、アユ飼育水槽底砂中の栄養塩濃度を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規フラボバクテリア属細菌および新規シュードモナス属細菌、ならびに、魚類の養殖及び家畜の飼育に際して疾病を防除し、飼育環境の向上を図るための飼料、飼料添加剤または飼育環境浄化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
魚類の養殖及び家畜の飼育においては、病原性微生物または病原性ウイルスの増殖による疾病の発生により甚大な損害が発生することがある。これらの疾病防除には、抗生物質や抗菌性の薬剤が多用されているが、抗生物質はウイルス抑制能に乏しく、また薬剤耐性細菌の出現等の理由により、これらの薬剤の効果が期待できない事態が起きている。また、飼料に添加された抗生物質等の効果は一時的であり、魚類の養殖及び家畜の飼育において、特に持続的に疫病防除作用を発揮する方法が求められている。
【０００３】
一方、養殖底土には、残存した配合飼料や魚類の糞が沈降し蓄積して、有毒ガス（硫化水素等）の生産や赤潮発生の原因となっており、それらの現象により魚類の成長不良、病原性細菌または病原性ウイルスによる感染、大量斃死などが引き起こされる。また、家畜の飼育においても飼育環境の浄化、すなわち、飼育環境中での病原性微生物または病原性ウイルスの侵入及び家畜の糞尿の悪臭の軽減が課題となっている。
【０００４】
上記の養殖及び家畜の飼育において、細菌等の微生物が有する抗菌性を利用して病原性微生物またはウイルスを防除すると同時にその微生物が有する有機物を分解する能力を利用して飼育環境を浄化することができれば、抗生物質等を添加する従来技術と比較して、より持続的且つ多面的な作用が期待できる。
【０００５】
これまでに、魚類の養殖及び家畜の飼育においてフラボバクテリア属細菌を用いて病原性微生物または病原性ウイルスの増殖を抑制する技術は開示されていない。
【０００６】
更に、フラボバクテリア属の細菌は炭化水素類を分解すること(特許文献４参照)、排水処理における難分解性化合物の低減に役立つこと（特許文献５参照）は開示されているが、養殖底土の改善及び家畜の飼育環境の浄化に関しては知見を見いだすことができない。
【０００７】
また、これまでに、魚類の養殖及び家畜の飼育においてシュードモナス属細菌を添加して免疫力を増強する方法、赤潮を防除する方法、抗生物質の製造方法（特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７参照）は開示されているが、動物の飼育過程で利用して病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する技術は開示されていない。
【０００８】
更に、シュードモナス属の細菌は有機物の分解能が強く、環状脂肪族炭化水素類を分解すること(特許文献８参照)、排水処理における脱窒に役立つこと（特許文献９参照）、家畜等の排泄物の処理を行う方法は開示されているが（特許文献１０参照）、養殖底土の改善及び家畜の飼育環境の浄化に関しては知見を見いだすことができない。
【０００９】
【特許文献１】特開平６−８０号公報
【特許文献２】特開平１０−１６５９８３号公報
【特許文献３】特開２００５−５８１３７号公報
【特許文献４】特開平０５−１１２４１６号公報
【特許文献５】特開平０５−１１２４１７号公報
【特許文献６】特公平０６−６７９４８号公報
【特許文献７】特開平０６−９２８１５号公報
【特許文献８】特開２００４−３３０４５号公報
【特許文献９】特開２００１−２５９６８６号公報
【特許文献１０】特開２００３−９５７７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明が解決しようとする課題は、動物（家畜、ペット、家禽、魚類等）の飼育に際し、病原性微生物および病原性ウイルスによる疾病を予防する素材を提供することである。
【００１１】
本発明が解決しようとする課題はまた、動物（家畜、ペット、家禽、魚類等）の飼育環境を改善する（具体的には、魚類の養殖水槽や養殖水域の底土に蓄積した有機物や、家畜の飼育環境に蓄積する有機物を分解する）素材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、自然界、魚類の養殖環境、家畜の飼育環境から多数の細菌を分離し、病原性細菌（ビブリオ・アンギララム及びエドワジェラ・タルダ）の増殖を抑制する細菌の検索を行った。
【００１３】
次に、病原性細菌の増殖を抑える細菌の培養液の上清に関して、病原性ウイルス（伝染性造血器壊死症ウイルス、インフルエンザウイルス）の増殖を抑える細菌の検索を行った。
【００１４】
上記の広範な検索の結果、病原性細菌と病原性ウイルスに対して強い抑制作用を持つ菌株として分離番号ＢＣ−０７株およびＢＣ−０８株を得た。
【００１５】
ＢＣ−０７株またはＢＣ−０８株の培養物を飼料に添加して魚類に与えることによって魚病の抑制効果と飼育水槽底土の全有機物の低減を確認した。更に、菌株ＢＣ−０７またはＢＣ−０８の培養物を飼料に添加して家畜に与えることによって疾病の抑制効果を確認した。また菌株ＢＣ−０７はフラボバクテリア属に属する新規株であることが確認された。菌株ＢＣ−０８はシュードモナス属に属する新規株であることが確認された。こうして本発明は完成された。
【００１６】
すなわち本発明は、以下の発明を包含する。
（１）フラボバクテリア属またはシュードモナス属に属し、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有する細菌。
（２）フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０７３８）またはその変異株である（１）記載の細菌。
（３）シュードモナス・コレンシス (Pseudomonas koreensis) に属し、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有する（１）記載の細菌。
（４）シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１１２０）またはその変異株である（３）記載の細菌。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する飼料。
（６）（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する飼料添加剤。
（７）（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する動物の飼育環境の浄化剤。
（８）（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する病原性微生物の増殖抑制剤。
（９）（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する病原性ウイルスの増殖抑制剤。
（１０）（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する有機物の分解剤。
（１１）（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する動物の成長促進剤。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、動物の飼育に際し病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制することによって、動物の疾病を予防できる素材が提供される。更に、本発明により、動物の飼育環境における有機物の分解を促進し、動物の飼育環境を浄化する素材が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１９】
本発明に用いることができる微生物は、フラボバクテリア属に属し、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有する細菌であれば特に限定されないが、具体的にはフラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７またはその変異株が好ましい。フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０７３８として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００５年１２月２１日付で寄託されている。本微生物は当初シュードモナス属に属すると分類されたため、本出願人は識別のための表示として「シュードモナス・エスピーＢＣ−０７」を付し上記寄託機関に寄託した。しかしながらその後の研究により本微生物はフラボバクテリア属に分類することがより適切であると判明した。本明細書中で「フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７」と称する微生物は、本願の基礎出願（特願２００６−１７５４２号）における「シュードモナス・エスピーＢＣ−０７」と称する微生物と同一である。本発明にはまた、フラボバクテリア属に属し、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有する細菌であって、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列が配列番号１の塩基配列を含む細菌を用いてもよい。
【００２０】
フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７は実施例１に記載した菌学的性質を有し、フラボバクテリア属に分類されるが、既存の種とは一致しない。通常、フラボバクテリア属以外の細菌およびフラボバクテリア属の他の菌株のほとんどが抗病性を持たないかまたは抗病性が低い。本発明者らは、驚くべきことに、フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７が、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を強力に抑制することができることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明にはまた、フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７が有する病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力が維持されている限り、フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７が変異誘発処理された変異株を用いることができる。変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行われ得る。ここで、「変異原」なる語は、その広義において、例えば変異原効果を有する薬剤のみならずＵＶ照射のごとき変異原効果を有する処理をも含むものと理解すべきである。適当な変異原の例としてエチルメタンスルホネート、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアクリジン類が挙げられるが、他の任意の効果的な変異原もまた使用され得る。
【００２１】
ＢＣ−０７株の培養には、一般的な細菌用の培地を適用することができ、特に組成を限定するものではない。例えば、ペプトン１０ｇ、酵母エキス２ｇ、クエン酸鉄０．０３３ｇ、リン酸一カリウム０．１６７ｇ、硫酸マグネシウム０．１６７ｇ、塩化カルシウム０．０３４ｇ、水道水１０００ｍｌ、ｐＨ７．０の培地を作製し、１２１℃、１５分間の加熱滅菌を行って使用することができる。また、上記液体培地のほかに固体培地によっても培養が可能であり、米ぬか、魚粉、配合飼料などに少量の水分を加えた培地を用いて良好に培養することができる。
【００２２】
ＢＣ−０７を培養するときの培養容器は、一般的な微生物の培養に用いられる装置を用いることができ、特に方法を限定するものではない。例えば、小規模の培養では試験管、フラスコ、シャーレなどを用いることができ、大規模の培養にはジャーファメンター、通気攪拌できるタンク、固体培養装置などを使用することができる。
【００２３】
本発明に用いることができる他の微生物は、シュードモナス属（なかでもシュードモナス・コレンシス）に属し、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有する細菌であれば特に限定されないが、具体的にはシュードモナス・コレンシスＢＣ−０８またはその変異株が好ましい。シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１１２０として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００６年１２月１日付で寄託されている。本発明にはまた、シュードモナス属に属し、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有する細菌であって、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列が配列番号２の塩基配列を含む細菌を用いてもよい。
【００２４】
シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８は実施例４に記載した菌学的性質を有し、シュードモナス属コレンシス種に分類されるが、既存の株と完全には一致しない。通常、シュードモナス属以外の細菌およびコレンシス種を含むシュードモナス属の他の菌株のほとんどが抗病性を持たないか又は抗病性が低い。本発明者らは、驚くべきことに、シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８が、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を強力に抑制することができることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明にはまた、シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８が有する病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力が維持されている限り、シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８が変異誘発処理された変異株を用いることができる。変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行われ得る。ここで、「変異原」なる語は、その広義において、例えば変異原効果を有する薬剤のみならずＵＶ照射のごとき変異原効果を有する処理をも含むものと理解すべきである。適当な変異原の例としてエチルメタンスルホネート、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアクリジン類が挙げられるが、他の任意の効果的な変異原もまた使用され得る。
【００２５】
ＢＣ−０８株の培養には、一般的な細菌用の培地を適用することができ、特に組成を限定するものではない。例えば、ペプトン２ｇ、酵母エキス０．５ｇ、肉エキス０．２ｇ、クエン酸鉄０．０３３ｇ、リン酸一カリウム０．１６７ｇ、硫酸マグネシウム０．１６７ｇ、塩化カルシウム０．２ｇ、酢酸ナトリウム０．２ｇ、水道水１０００ｍｌ、ｐＨ７．２〜７．４の培地を作製し、１２１℃、１５分間の加熱滅菌を行って使用することができる。また、上記液体培地のほかに固体培地によっても培養が可能であり、米ぬか、魚粉、配合飼料などに少量の水分を加えた培地を用いて良好に培養することができる。
【００２６】
ＢＣ−０８を培養するときの培養容器は、一般的な微生物の培養に用いられる装置を用いることができ、特に方法を限定するものではない。例えば、小規模の培養では試験管、フラスコ、シャーレなどを用いることができ、大規模の培養にはジャーファメンター、通気攪拌できるタンク、固体培養装置などを使用することができる。
【００２７】
以下の説明は特に断りのない限りフラボバクテリア属細菌およびシュードモナス属細菌のどちらにも当てはまる。
【００２８】
本発明の細菌は培養物、菌体、培養物または菌体の処理物として本発明の目的に使用できる。ここで「培養物」とは固体または液体培地中で細菌を培養して生じる、菌体の分離を行っていない培養物（液体培地の場合は培養液）である。「菌体」とは培養後に前記培養物から菌体を遠心分離や膜分離の手法により単離（高濃度化を含む概念）して得られたものである。培養物または菌体の「処理物」とは、培養物または菌体を常法により処理したもの全てを包含する概念であり、例えば、培養物または菌体の希釈物、濃縮物、乾燥物、凍結物や、培養液の上清や、培養液の上清の希釈物、濃縮物、乾燥物、凍結物を指す。
【００２９】
本発明の細菌の培養物、菌体、またはそれらの処理物として特に好ましい実施形態について以下に説明する。
【００３０】
本発明の目的には、培養を終了した菌体培養液を菌を含む培養液そのままの状態で使用できる。保存温度５℃以下で２〜３週間程度の期間有効に保管できるため、低温輸送、冷蔵庫保管することによって魚類や家畜の飼育に際して有効に利用することができる。
【００３１】
培養を終了した菌体培養液を小分けして凍結して保管するのもまた、長期保存の観点から有効である。菌の活力維持の観点から、凍結前に、グリセロール、脱脂粉乳、糖類などの保護剤を加えるのが好ましく、保護剤の添加濃度は１〜６０％（保護剤の重量/培養液の容積）の範囲であり、より好ましくは５〜３０％（保護剤の重量/培養液の容積）の範囲である。凍結した培養液は、そのまま−２０℃以下で保管することによって６月以上の保管が可能であり、長期にわたって魚類や家畜の飼育のために有効に利用することができる。
【００３２】
培養を終了した菌体培養液は乾燥して用いることもできる。菌の活力が低下するため効力が低下する欠点はあるが、長期に保管して魚類や家畜の飼育に使用できる観点から適している。乾燥方法は、特に限定するものではないが、例えば、噴霧乾燥、真空乾燥、真空凍結乾燥などを用いることができる。
【００３３】
培養を終了した培養液は、菌体と培養液上清を分離して使用することができる。菌体と培養液上清の分離方法に制限はないが、例えば、遠心分離、膜分離によって菌体と培養液上清のそれぞれを回収することができる。培養液上清は必要に応じて加熱減圧濃縮、限外ろ過などによって濃縮することもできる。得られた菌体または培養液上清は、冷蔵、冷凍、乾燥品のいずれの形態にも加工することができ、それぞれが魚類や家畜の飼育のために利用することができる。
【００３４】
本発明の細菌の培養物、菌体、またはそれらの処理物は、他の任意の成分との混合物として用いることも可能である。例えば、混合できる物質として、配合飼料、乳酸菌、バチルス菌、クロレラ、朝鮮人参、クロレラエキス、ローヤルゼリー、魚粉、穀物粉末、海藻粉末、ゼオライトが挙げられ、飼料として利用できるものまたは飼料に添加できるものであれば種類を問わない。
【００３５】
本発明の細菌の培養物、菌体、またはそれらの処理物は、他の任意の物質に吸着させることが可能である。例えば、ゼオライト、活性炭、米ぬか、魚粉などに吸着させることによって、飼育環境中に散布したときに、安定して飼育環境中に維持され、長期にわたって効果を期待することができる。
【００３６】
本発明の細菌は動物飼育用の飼料、飼料添加物または飼育環境の浄化剤に使用することが可能である。
【００３７】
本発明において「動物」とは魚類、家畜、ペット、家禽などを指す。
【００３８】
本発明において「魚類」とは当業者にとって自明である任意の魚類を意味するが、例えば、アユ、ニジマス、ウナギ、ヤマメ、アマゴ、イワナ、ワカサギ等の淡水魚、またはタイ、ハマチ、ヒラメ、カンパチ、シマアジ、ギンザケ、フグ等の海水魚が挙げられる。
【００３９】
本発明において「家畜」とは当業者にとって自明である任意の動物を意味するが、例えば、ブタ、ブロイラー、養鶏、牛、家兎などが挙げられる。
【００４０】
本発明において「ペット」とは当業者にとって自明である任意の動物を意味するが、例えば、マウス、ハムスター、モルモット、うさぎなどが挙げられる。
【００４１】
本発明において「病原性微生物」とは、例えば病原性の細菌が挙げられ、ビブリオ・アンギララム(Vibrio anguillarum)、エドワジエラ・タルダ（Edwardsiella tarda）、サルモネラ・エンテリチディス（Salmonella enteritidis）、サプロレジナ・ディクリナ(Saprolegina diclina)、デルモシスティディウム・アンギラ(Dermocystidium anguillae)などが挙げられる。
【００４２】
本発明において「病原性ウイルス」とは、例えば伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）、インフルエンザウイルス（Influenza Virus）、イリドウイルス（LCDV）、ノダウイルス（SJNNV）、ビルナウイルス(YAV)、ラブドウイルス (HIRRV) 等が挙げられる。
【００４３】
本発明において飼育環境の浄化剤とは、動物の飼育環境に散布することによって、環境中に存在する病原菌や病原性ウイルスの低減に役立つと共に、養殖底土に蓄積する有機物や飼育環境中に排泄される有機物を分解する資材を指す。
【００４４】
本発明の細菌の培養物、菌体、またはそれらの処理物はまた、病原性微生物の増殖抑制剤、病原性ウイルスの増殖抑制剤、あるいは有機物の分解剤として用いることができる。これらの実施形態においては、本発明の細菌の培養物、菌体、またはそれらの処理物は、使用目的（例えば医薬用途、獣医学的用途、水産養殖用途）において許容される賦形剤または担体とともに使用することができる。
【００４５】
本発明の細菌の培養物、菌体、またはそれらの処理物はまた、動物の成長促進剤として用いることもできる。この用途では、本発明の細菌の培養物、菌体、またはそれらの処理物を動物飼育用の飼料、飼料添加物等の形態で動物に摂食させることにより、動物の成長を促進する。ここで「動物」とは上記で定義した通りである。これらの実施形態においては、本発明の細菌の培養物、菌体、またはそれらの処理物は、使用目的（例えば医薬用途、獣医学的用途、水産養殖用途）において許容される賦形剤または担体とともに使用することができる
【実施例１】
【００４６】
フラボバクテリア・エスピーBC-07株の単離および同定
本実施例に使用するフラボバクテリア・エスピーＢＣ-０７株は淡水魚飼育環境より単離された菌株であり、以下のような特徴を持つ。
ア）：長さ1〜3ミクロンで、形状は短桿菌。コロニーの色は黄白色である。
イ）：培地：ペプトン培地組成：Bacto-peptone (Difco Co. Ltd.) 2 g、 Bacto-yeast extracts (同上) 1 g 、クエン酸鉄（同上） 0.1 g、 純水 1 L、 ｐＨ 7.2においてよく増殖する。
【００４７】
フラボバクテリア・エスピーBC-07株の菌学的性状
１−１. 細胞の形：短桿状。 細胞の大きさ ：１〜３（μｍ）。１−２. 多形性 ：長さの異なる種々の細胞が通常の培養で多々存在する。１−３. 運動性 ：なし、 鞭毛 ：なし、胞子 ：なし、グラム染色性 ：陰性、抗酸性 ：なし。
２−１． 生育程度 ：３日間培養で数mmのコロニーを形成する、 色 ：薄い黄白色、 光沢 ：特になし、表面は平滑、 拡散性色素 ：なし。
３−１. 硝酸塩還元 ：＋。 ３−２. 脱窒反応 ： ＋。 ３−３. ＭＲテスト ： −。 ３−４. ＶＰテスト ： −。 ３−５. インドール ： −。 ３−６．硫化水素 ： −。 ３−７．デンプン水解 ： ＋。３−８． クエン酸 ：−。 ３−９．硝酸塩利用 ： −、 アンモニウム塩利用 ： ＋。３−１０．色素生成 ： ＋。３−１１．ウレアーゼ ： −。３−１２．オキシダーゼ ：＋。３−１３．カタラーゼ ： ＋。３−１４．pH ：5.0(-), 5.6(+), 8.6(+), 9.0(−) 。３−１５．温度 ：中温性 ５−３０℃．酸素要求性 ：好気性。 ３−１６． ＯＦテスト ：−。
4−１. NaCl濃度と生育 ：０−２％で生育、至適範囲 ０−１％。
【００４８】
（１）核酸の抽出
"Sepa Gene"キット（三光純薬（株）製）を用いて核酸の抽出を行った後、エタノール沈殿により核酸を回収した。
（２）PCR
１６SrRNAに特異的なユニバーサルプライマー２種（５’ 末端側及び３’ 末端側）を用いて増幅を行った。
（３）PCR増幅産物の精製
増幅終了後、スピンカラム（ファルマシア社製）を用いて精製を行った。
（４）１６SrRNA塩基配列の解析
精製したPCR増幅産物をアプライド バイオシステムズ 377DNAシークエンサー（パーキンエルマー社製）により５’ 末端側の塩基配列解析を行った。
（５）１６SrRNAデータベース検索による相同解析
ジーンバンクのデータベースよりオンラインで検索を行った。
フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株の１６ＳｒＲＮＡの部分塩基配列を配列番号１に示す。
【００４９】
本発明菌を産業別審査基準応用微生物工業改訂版（特許庁編）の新種細菌の記載例に従って、その性状を調べ、Baumann 等(1984)に基づきその分類学上の位置を検討した結果、本菌株は、フラボバクテリア属と同定されたが、既存の種とは一致しなかった。なお本願基礎出願時には本菌株はシュードモナス属に分類されたが、その後の検討によりフラボバクテリア属に分類するほうがより適切であることが明らかとなった。
【００５０】
本発明者らは該菌株を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０７３８として寄託した。本発明者らは該菌株をフラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株と命名した。
【００５１】
抗細菌試験
上記のフラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株が病原性細菌の増殖を抑制する能力を有することを以下のように確認した。
寒天培地にあらかじめ塗沫した2本の上記菌株のスミアの間に、魚類疾病原因細菌であるビブリオ・アンギララムまたはエドワジエラ・タルダを移植して25℃下にて10日間培養後のスミアの間の病原菌のコロニーの大きさを、病原菌のみを対照区として培養した場合のコロニーの大きさと比較したところ、表１に示すとおり、ビブリオ・アンギララムおよびエドワジエラ・タルダの増殖が抑制された。表１中の「阻害率」は、対照区培地上のビブリオ・アンギララム（またはエドワジエラ・タルダ）のコロニーの横幅の大きさと試験区の同菌のコロニーの同大きさとの比を百分率で表したものである。
【００５２】
【表１】
【００５３】
抗ウイルス試験
上記の菌株フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株が病原性ウイルスの増殖を抑制する能力を有することを以下のように確認した。
【００５４】
マスノスケの細胞 CHSE-214の培養系において、上記菌株の培養上澄液が伝染性造血器壊死症の原因ウイルスである伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）の作用を抑制するか否かについて検定した。作用抑制効果はマスノスケ細胞の変性効果 (CPE) を抑制する度合いを指標として判定した。
【００５５】
マスノスケ細胞 CHSE-214を、1 mLの液体培地（10％ウシ血清成分、0．075％NaHCO3、100 IU／mLペニシリン、100μg／mLストレプトマイシン、1.6％Tris-HCl(pH 7.8) 含有）中で15℃にて培養し、その培養系に、IHNV培養液および上記フラボバクテリア属細菌の培養上清液（0.1 mL）を加えた。対照実験として、前記培養系にIHNVの培養液のみ（0.1 mL）を添加した。ここで、上記フラボバクテリア属細菌の培養上清液とは、該細菌をニュートリエントブロス培地中で3日間25℃で培養した後に遠沈 (4000rpm)して菌体を沈澱させ、0.22μmのフィルターでろ過して得られた濾液を指す。またIHNVの培養液とは、同様の上記培養液およびCHSE-214を用いてIHNVを増殖させた後、0.45μmのフィルターで濾過して得られた濾液を指す。
【００５６】
上記の菌体培養上清液を添加した後のCPEを経時的に測定した。CPEが低いということは、すなわちウイルスの増殖が抑制されていることを意味すると考えられる。結果を図１に示す。図１に示すとおり、フラボバクテリア・エスピーＢＣ-０７株の培養上清を添加した場合にIHNVの増殖が抑制された。
【００５７】
更に、上記の方法を一部改変し、菌株フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株がインフルエンザウイルスの増殖を抑制する能力を有することを確認した。すなわち、上記の方法においてマスノスケ細胞(IHV)の替わりにヒト結腸腺由来細胞（Caco-2）を用い、伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）の替りにインフルエンザウイルス（H3N2弱病原性）を用いて調べた結果、ＢＣ−０７株培養上清液はインフルエンザウイルスの増殖を抑制した(図２)。
【実施例２】
【００５８】
タイに対するウイルス攻撃試験
本発明の飼料（実験区）は、市販の粉末配合飼料（日本水産株式会社製）に、フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株の培養液（ヘプトン１０ｇ、酵母エキス２ｇ、リン酸一カリウム１．６７ｇ、硫酸マグネシウム１．６７ｇ、クエン酸鉄３３ｍｇ、塩化カルシウム３４ｍｇを水道水１０００ｍｌに溶解させｐＨ７．２に調整して得られた液体培地中で同菌株を培養した菌体を含む培養液）を２０％（Ｖ／Ｗ）の割合で添加し、よく混合することにより調製した。また、従来法の飼料（対照区）は、市販の粉末配合飼料（日本水産株式会社製）に細菌用の液体培地だけ（菌株は含まず）を２０％（Ｖ／Ｗ）の割合で添加し、よく混合することにより調製した。
【００５９】
上記のフラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株を含有した飼料（実験区）、またはフラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株を含有しない飼料（対照区）を、タイ（体長約8cm、各実験区につき20個体）に、100 L容量の水槽中で0.2個体／Lの飼育密度で、25℃において、5g／個体／日の割合で10日間投与した後、タイの致死濃度に設定したイリドウイルス液を腹腔内注射した。なお上記のイリドウイルス液は、予めタイ腹腔内でウイルスを培養させ、タイの死亡後に腹腔内より取り出したウイルス液を致死濃度に希釈したものである。ここで、致死濃度は、タイの死亡後に腹腔内より取り出したウイルス液を種々の割合で希釈したものをタイに投与して実際に感染して死亡する濃度を確認することにより決定した。
【００６０】
その後、両実験区のタイを対照実験で使用したのと同じフラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株を含有しない飼料で飼育し、両実験区における魚体生残率を経時的に測定した。結果を図３に示す。フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株無添加区のタイは全て死滅したが、フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株添加実験区のタイは７０％が生残した。
【実施例３】
【００６１】
アユ飼育槽底砂の栄養塩の定量
砂を底面に敷き詰めた水槽（100 L容量）において、アユ（実験当初の体長約１０ｃｍ）を１０個体／ｍ２の密度で、２０℃において１ｇ／個体／日の割合で市販の飼料を投与して約３ヶ月間飼育した。試験区には実施例２に記載したフラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７の培養液を、飼育水当たりの菌数が１０５〜１０６／ｍｌとなるように毎日散布した。飼育終了後に、砂に蓄積した栄養物質の中で全硫化物量、全窒素量、全リン量および全有機物量（灼熱減量）を測定した。
【００６２】
全硫化物量はヨウ素滴定法により測定した。全窒素量はペルオキソ２硫酸カリウム酸化法により測定した。全リン量はアスコルビン酸還元法により測定した。灼熱減量は、試料有機物を600℃で熱することにより測定した。これらの測定はいずれも当業者にとって周知の標準的な測定手順に従って行った。
【００６３】
結果を図４に示す。フラボバクテリア・エスピーＢＣ−０７株を含有する飼料をアユに投与した場合に全硫化物量、全窒素量、全リン量および全有機物量が低減した。このように、養殖水域底土中の有機物分解が進行したことが示された。
【実施例４】
【００６４】
シュードモナス・コレンシスBC-08株の単離および同定
本実施例に使用するシュードモナス・コレンシスＢＣ‐０８株は淡水魚飼育環境より単離された菌株であり、以下のような特徴を持つ。
ア）：長さ1〜3ミクロンで、形状は短桿菌。鞭毛を持ち、運動を行う。コロニーの色は白色である。
イ）：培地：ペプトン２ｇ、酵母エキス０．５ｇ、肉エキス０．２ｇ、クエン酸鉄０．０３３ｇ、リン酸一カリウム０．１６７ｇ、硫酸マグネシウム０．１６７ｇ、塩化カルシウム０．２ｇ、酢酸ナトリウム０．２ｇ、水道水１０００ｍｌ、ｐＨ７．２〜７．４においてよく増殖する。
【００６５】
シュードモナス・コレンシスBC-08株の菌学的性状
１−１. 細胞の形：短桿状。 細胞の大きさ ：１〜３（μｍ）。１−２. 運動性 ：あり、 鞭毛 ：あり、胞子 ：なし、グラム染色性 ：陰性、抗酸性 ：なし。
２−１． 生育程度 ：３日間培養で数mmのコロニーを形成する、 色 ：白色、 光沢 ：特になし、表面は平滑、 拡散性色素 ：なし。
３−１. 硝酸塩還元 ：−。 ３−２. 脱窒反応 ： −。 ３−３. ＭＲテスト ： −。 ３−４. ＶＰテスト ： −。 ３−５. インドール ： −。 ３−６．硫化水素 ： −。３−７． クエン酸 ： −。 ３−８．硝酸塩利用 ： −、３−９．色素生成 ： −。３−１０．ウレアーゼ ： −。３−１１．オキシダーゼ ：−。３−１２．カタラーゼ ：＋。３−１３．pH ：5.0(-), 5.6(+), 8.6(+), 9.0(＋) 。３−１４．温度 ：中温性 ５−３５℃。３−１５． ＯＦテスト ：−。
４−１. NaCl濃度と生育 ：０−３％で生育、至適範囲 ０−３％。
【００６６】
（１）核酸の抽出
"Sepa Gene"キット（三光純薬（株）製）を用いて核酸の抽出を行った後、エタノール沈殿により核酸を回収した。
（２）PCR
１６SrRNAに特異的なユニバーサルプライマー２種（５’ 末端側及び３’ 末端側）を用いて増幅を行った。
（３）PCR増幅産物の精製
増幅終了後、スピンカラム（ファルマシア社製）を用いて精製を行った。
（４）１６SrRNA塩基配列の解析
精製したPCR増幅産物をアプライド バイオシステムズ 377DNAシークエンサー（パーキンエルマー社製）により５’ 末端側の塩基配列解析を行った。
（５）１６SrRNAデータベース検索による相同解析
ジーンバンクのデータベースよりオンラインで検索を行った。
【００６７】
シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。
【００６８】
本発明菌を産業別審査基準応用微生物工業改訂版（特許庁編）の新種細菌の記載例に従って、その性状を調べ、Baumann 等(1984)に基づきその分類学上の位置を検討した結果、本菌株は、シュードモナス・コレンシスと同定された。
【００６９】
本発明者らは該菌株をシュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株と命名し、平成１８年１２月１日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭＰ−２１１２０として寄託した。
【００７０】
抗細菌試験
上記のシュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株が病原性細菌の増殖を抑制する能力を有することを以下のように確認した。
寒天培地にあらかじめ塗沫した2本の上記菌株のスミアの間に、魚類疾病原因細菌であるビブリオ・アンギララムまたはエドワジエラ・タルダを移植して25℃下にて10日間培養後のスミアの間の病原菌のコロニーの大きさを、病原菌のみを対照区として培養した場合のコロニーの大きさと比較したところ、表２に示すとおり、ビブリオ・アンギララムおよびエドワジエラ・タルダの増殖が抑制された。表２中の「阻害率」は、対照区培地上のビブリオ・アンギララム（またはエドワジエラ・タルダ）のコロニーの横幅の大きさと試験区の同菌のコロニーの同大きさとの比を百分率で表したものである。
【００７１】
【表２】
【００７２】
抗ウイルス試験
上記の菌株シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株が病原性ウイルスの増殖を抑制する能力を有することを以下のように確認した。
【００７３】
マスノスケの細胞CHSE-214の培養系において、上記菌株の培養上澄液が伝染性造血器壊死症の原因ウイルスである伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）の作用を抑制するか否かについて検定した。作用抑制効果はマスノスケ細胞の変性効果 (CPE) を抑制する度合いを指標として判定した。
【００７４】
マスノスケ細胞 CHSE-214を、1 mLの液体培地（10％ウシ血清成分、0．075％NaHCO3、100 IU／mLペニシリン、100μg／mLストレプトマイシン、1.6％Tris-HCl(pH 7.8) 含有）中で15℃にて培養し、その培養系に、IHNV培養液および上記シュードモナス属細菌の培養上清液（0.1 mL）を加えた。対照実験として、前記培養系にIHNVの培養液のみ（0.1 mL）を添加した。ここで、上記シュードモナス属細菌の培養上清液とは、該細菌をニュートリエントブロス培地中で3日間25℃で培養した後に遠沈 (4000rpm)して菌体を沈澱させ、0.22μmのフィルターでろ過して得られた濾液を指す。またIHNVの培養液とは、同様の上記培養液およびCHSE-214を用いてIHNVを増殖させた後、0.45μmのフィルターで濾過して得られた濾液を指す。
【００７５】
上記の菌体培養上清液を添加した後のCPEを経時的に測定した。CPEが低いということは、すなわちウイルスの増殖が抑制されていることを意味すると考えられる。結果を図５に示す。図５に示すとおり、シュードモナス・コレンシスＢＣ-０８株の培養上清を添加した場合にIHNVの増殖が抑制された。
【００７６】
更に、上記の方法を一部改変し、菌株シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株がインフルエンザウイルスの増殖を抑制する能力を有することを確認した。すなわち、上記の方法においてマスノスケ細胞(IHV)の替わりにヒト結腸腺由来細胞（Caco-2）を用い、伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）の替りにインフルエンザウイルス（H3N2弱病原性）を用いて調べた結果、ＢＣ−０８株培養上清液はインフルエンザウイルスの増殖を抑制した(図６)。
【実施例５】
【００７７】
タイに対するウイルス攻撃試験
本発明の飼料（実験区）は、市販の粉末配合飼料（日本水産株式会社製）に、シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株の培養液（ペプトン２ｇ、酵母エキス０．５ｇ、肉エキス０．２ｇ、クエン酸鉄０．０３３ｇ、リン酸一カリウム０．１６７ｇ、硫酸マグネシウム０．１６７ｇ、塩化カルシウム０．２ｇ、酢酸ナトリウム０．２ｇ、水道水１０００ｍｌ、ｐＨ７．２〜７．４に調整して得られた液体培地中で同菌株を培養した菌体を含む培養液）を２０％（Ｖ／Ｗ）の割合で添加し、よく混合することにより調製した。また、従来法の飼料（対照区）は、市販の粉末配合飼料（日本水産株式会社製）に細菌用の液体培地だけ（菌株は含まず）を２０％（Ｖ／Ｗ）の割合で添加し、よく混合することにより調製した。
【００７８】
上記のシュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株を含有した飼料（実験区）、またはシュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株を含有しない飼料（対照区）を、タイ（体長約8cm、各実験区につき20個体）に、100 L容量の水槽中で0.2個体／Lの飼育密度で、25℃において、5g／個体／日の割合で10日間投与した後、タイの致死濃度に設定したイリドウイルス液を腹腔内注射した。なお上記のイリドウイルス液は、予めタイ腹腔内でウイルスを培養させ、タイの死亡後に腹腔内より取り出したウイルス液を致死濃度に希釈したものである。ここで、致死濃度は、タイの死亡後に腹腔内より取り出したウイルス液を種々の割合で希釈したものをタイに投与して実際に感染して死亡する濃度を確認することにより決定した。
【００７９】
その後、両実験区のタイを対照実験で使用したのと同じシュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株を含有しない飼料で飼育し、両実験区における魚体生残率を経時的に測定した。結果を図７に示す。シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株無添加区のタイは全て死滅したが、シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株添加実験区のタイは８０％が生残した。
【実施例６】
【００８０】
アユ飼育槽底砂の栄養塩の定量
砂を底面に敷き詰めた水槽（100 L容量）において、アユ（実験当初の体長約１０ｃｍ）を１０個体／ｍ２の密度で、２０℃において１ｇ／個体／日の割合で市販の飼料を投与して約３ヶ月間飼育した。試験区には実施例５に記載したシュードモナス・コレンシスＢＣ−０７の培養液を、飼育水当たりの菌数が１０５〜１０６／ｍｌとなるように毎日散布した。飼育終了後に、砂に蓄積した栄養物質の中で全硫化物量、全窒素量、全リン量および全有機物量（灼熱減量）を測定した。
【００８１】
全硫化物量はヨウ素滴定法により測定した。全窒素量はペルオキソ２硫酸カリウム酸化法により測定した。全リン量はアスコルビン酸還元法により測定した。灼熱減量は、試料有機物を600℃で熱することにより測定した。これらの測定はいずれも当業者にとって周知の標準的な測定手順に従って行った。
【００８２】
結果を図８に示す。シュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株を含有する飼料をアユに投与した場合に全硫化物量、全窒素量、全リン量および全有機物量が低減した。このように、養殖水域底土中の有機物分解が進行したことが示された。
【実施例７】
【００８３】
家兎の飼育実験
対照区及び試験区それぞれ3羽の家兎（開始時の平均体重２．１ｋｇ）を用いて飼育実験を行った。餌は家兎用飼料（オリエンタル酵母工業製）を用い、試験区の飼料はシュードモナス・コレンシスＢＣ−０８株の培養液（ペプトン２ｇ、酵母エキス０．５ｇ、肉エキス０．２ｇ、クエン酸鉄０．０３３ｇ、リン酸一カリウム０．１６７ｇ、硫酸マグネシウム０．１６７ｇ、塩化カルシウム０．２ｇ、酢酸ナトリウム０．２ｇ、水道水１０００ｍｌ、ｐＨ７．２〜７．４に調整して得られた液体培地中で同菌株を培養した菌体を含む培養液）を１０％（Ｖ／Ｗ）の割合で配合飼料に添加し、よく混合することにより調製した。飼料は１日に１００ｇ程度を与え、６週間の飼育を行った。
【００８４】
その結果、対照区では下痢症状を起こす個体が認められたのに対して試験区の個体は健全であり、実験終了時の体重も対照区では平均体重２．８kgであったのに対して試験区では平均体重３．３kgと成長がすぐれていた。更に、対照区に比べて試験区では糞尿の悪臭も軽減された。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】フラボバクテリア・エスピーBC-07株の培養上清を添加した場合にIHNVの増殖が抑制されたことを示す図である。
【図２】フラボバクテリア・エスピーBC-07株の培養上清を添加した場合にインフルエンザウイルスの増殖が抑制されたことを示す図である。
【図３】抗ウイルス細菌フラボバクテリア・エスピーを添加した、或いは無添加の配合飼料の投与によるタイの飼育結果を示す図である。
【図４】飼料中にフラボバクテリア・エスピーBC-07株を添加した場合と、無添加の場合における、アユ飼育水槽底砂中の栄養塩濃度を示す図である。
【図５】シュードモナス・コレンシスBC-08株の培養上清を添加した場合にIHNVの増殖が抑制されたことを示す図である。
【図６】シュードモナス・コレンシスBC-08株の培養上清を添加した場合にインフルエンザウイルスの増殖が抑制されたことを示す図である。
【図７】抗ウイルス細菌シュードモナス・コレンシスを添加した、或いは無添加の配合飼料の投与によるタイの飼育結果を示す図である。
【図８】飼料中にシュードモナス・コレンシスBC-08株を添加した場合と、無添加の場合における、アユ飼育水槽底砂中の栄養塩濃度を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラボバクテリア属またはシュードモナス属に属し、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有する細菌。
【請求項２】
フラボバクテリア・エスピー ＢＣ−０７（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０７３８）またはその変異株である請求項１記載の細菌。
【請求項３】
シュードモナス・コレンシス (Pseudomonas koreensis) に属し、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有する請求項１記載の細菌。
【請求項４】
シュードモナス・コレンシス ＢＣ−０８（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１１２０）またはその変異株である請求項３記載の細菌。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する飼料。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する飼料添加剤。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する動物の飼育環境の浄化剤。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する病原性微生物の増殖抑制剤。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する病原性ウイルスの増殖抑制剤。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する有機物の分解剤。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する動物の成長促進剤。
【請求項１】
フラボバクテリア属またはシュードモナス属に属し、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有する細菌。
【請求項２】
フラボバクテリア・エスピー ＢＣ−０７（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０７３８）またはその変異株である請求項１記載の細菌。
【請求項３】
シュードモナス・コレンシス (Pseudomonas koreensis) に属し、病原性微生物および病原性ウイルスの増殖を抑制する能力ならびに有機物を分解する能力を有する請求項１記載の細菌。
【請求項４】
シュードモナス・コレンシス ＢＣ−０８（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１１２０）またはその変異株である請求項３記載の細菌。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する飼料。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する飼料添加剤。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する動物の飼育環境の浄化剤。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する病原性微生物の増殖抑制剤。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する病原性ウイルスの増殖抑制剤。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する有機物の分解剤。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項記載の微生物の培養物、菌体、またはそれらの処理物を含有する動物の成長促進剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００７−２２２１６２（Ｐ２００７−２２２１６２Ａ）
【公開日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１３０５６（Ｐ２００７−１３０５６）
【出願日】平成１９年１月２３日（２００７．１．２３）
【出願人】（５０６０３００８８）バイオプロジェクト株式会社 (2)
【出願人】（０００１０５０５１）クロレラ工業株式会社 (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月２３日（２００７．１．２３）
【出願人】（５０６０３００８８）バイオプロジェクト株式会社 (2)
【出願人】（０００１０５０５１）クロレラ工業株式会社 (8)
【Ｆターム（参考）】
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