新規人工核酸を用いた標的核酸の検出方法
【課題】一本鎖核酸の迅速、簡便かつ高精度な検出方法およびそれに用いられる新規人工核酸を提供すること。
【解決手段】式（Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素原子、−Ｐ（Ｒ６）Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、置換されていてもよいアミノ基等を示す。］で表される基等、Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよいリン酸基等、Ｒ４およびＲ５は、同一または異なって、水素原子等、Ｂは、置換されていてもよいプリン−９−イルまたは２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を示す。）で表される化合物またはその塩、該化合物を単位構造として含むオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドを用いた標的核酸の検出方法。
【解決手段】式（Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素原子、−Ｐ（Ｒ６）Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、置換されていてもよいアミノ基等を示す。］で表される基等、Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよいリン酸基等、Ｒ４およびＲ５は、同一または異なって、水素原子等、Ｂは、置換されていてもよいプリン−９−イルまたは２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を示す。）で表される化合物またはその塩、該化合物を単位構造として含むオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドを用いた標的核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規人工核酸、該核酸を含有するオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドを用いた標的核酸の検出方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
膨大なゲノムの塩基配列情報を研究や医療の現場で幅広く活用するために、ＤＮＡやＲＮＡの配列解析方法の開発が望まれている。中でも、病気のマーカー遺伝子の発現状況や、ウイルスなどの病原微生物感染を検査するための遺伝子検査方法は、健康の維持管理や病気のリスクマネージメント、最適治療法の選択などにおいて重要な役割を果たす。
しかしながら、従来から用いられている遺伝子検査方法は、遺伝子の検出感度が十分でない；遺伝子の検出感度を上げるために、煩雑な遺伝子増幅過程を要する；あるいは、遺伝子増幅過程を単純化させるために、特殊なプライマー設計（例、ループプライマー、キメラプライマー）を要し、特殊な酵素を使用する；実験系が複雑である；などの多くの改良すべき問題点がある。特に、現在遺伝子検査の場において多用されているＰＣＲ法は、その原理的な制約から反応温度を大きく上下に変化させつつ、酵素反応を数十ステップ繰り返すことを要するため、操作が煩雑であり、速やかに遺伝子を検出することが困難である。
したがって、これらの方法に代わる迅速簡便な遺伝子検査方法が切望されている。
【０００３】
本発明者らは、５’−アミノ−２’，４’−ＢＮＡと称する下記化学式：
【０００４】
【化１】
【０００５】
（式中、Ａは、直接結合、炭素数１〜４のアルキレン基、−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−（ここで、酸素原子は４’位のメチレン基と結合している。ｍは１〜３の整数を示す。）、または、−Ｎ（Ｒ４）−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、窒素原子は４’位のメチレン基と結合している。ｎは１〜３の整数を示す。）を示す。Ｂは、置換基を有していてもよい芳香族複素環基もしくは芳香族炭化水素基を示す。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、同一または異なって、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アラルキル基、アリール基、アシル基、シリル基、リン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ７）Ｒ８［式中、Ｒ７およびＲ８は、同一または異なって、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、炭素数１〜６のシアノアルコキシ基、または、炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基を示す。］を示す。）で示されるヌクレオシド類縁体（特許文献１）、または５’−アミノ−ＤＮＡを用いてＰ３’→Ｎ５’ホスホロアミダート結合を有する人工核酸プローブを開発し、かかる人工核酸プローブを用いた三重鎖核酸形成を基盤とした標的核酸の検出方法を確立した（特許文献２）。特許文献２の検出方法は、用いる人工核酸の特性により、二重鎖核酸に優先的に結合し、ｄｓＤＮＡ，ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡなど）の検出に好適に用いられる。また、別の研究グループは、Ｐ３’−Ｎ５’ホスホロアミダート結合を有する人工核酸を用いて、ゲノム配列の多型のハイスループット解析（非特許文献１参照）や細胞内での配列特異的転写阻害（非特許文献２参照）を報告している。
【０００６】
他方、従来のセントラルドグマ（ＤＮＡ→ＲＮＡ→タンパク質）で定義付けられていた転写産物であるｍＲＮＡ以外にも、多数のｎｃＲＮＡ（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）の存在が知られており、これらの一本鎖核酸も遺伝子の発現制御やタンパク質の機能発現に関与していることが近年の研究で判明している。これにより、プロモーターの再定義の必要性や、触媒機能を有するＲＮＡや他の遺伝子の転写、翻訳に関与するＲＮＡを発見することなど、細胞内における一本鎖核酸の配列とその役割を解明する重要性が高まってきている。
【０００７】
しかしながら、例えば、ＰＣＲの原理に基づく方法でこれら一本鎖核酸を検出するためには、ＲＮＡの場合は逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、二本鎖のＤＮＡを鋳型として増幅して検出するという迂遠な操作が必要であった。従って、一本鎖核酸を簡便かつ迅速に検出可能な新規な方法論も求められている。
【特許文献１】国際公開第０３／０６８７９５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００７／０２６８２３号パンフレット
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．９７，３８６２−３８６７（２０００）
【非特許文献２】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９，３８６４−３８７２（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、一本鎖核酸の迅速、簡便かつ高精度な検出方法およびそれに用いられる新規人工核酸を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、５’位の窒素原子によりホスホロアミダート結合を、２’位でリン酸エステル結合を形成可能な人工核酸を合成し、かかる人工核酸を含むオリゴヌクレオチドをプローブとして用いることにより、標的核酸ではなく標的核酸と結合するプローブを検出する、すなわち、標的核酸を増幅せずに検出プローブを増幅するという方法論を確立させることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］式（Ｉ）
【００１１】
【化２】
【００１２】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、アシル基、シリル基、核酸合成の保護基、置換されていてもよいリン酸基、または−Ｐ（Ｒ６）Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいメルカプト基もしくは置換されていてもよいアミノ基を示す。］で表される基を示し、
Ｒ３は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、アシル基、シリル基、Ｃ１−６アルキル基で置換されていてもよいアミノ基、核酸合成の保護基、置換されていてもよいリン酸基、または−Ｐ（Ｒ６）Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、前記と同義を示す］で表される基を示し、
Ｒ４およびＲ５は、同一または異なって、水素原子、置換されていてもよい水酸基またはＣ１−６アルキル基を示すか、あるいはＲ４およびＲ５は、一緒になって、オキシＣ１−４アルキレン基を形成し、
Ｂは、下記α群から選択される置換基で置換されていてもよいプリン−９−イルまたは２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を示す。）
で表される化合物（以下、化合物（Ｉ）と記載する）またはその塩、
（α群）
ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキルチオ基、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいメルカプト基および置換されていてもよいアミノ基。
［２］Ｒ１およびＲ２が、同一または異なって、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ７−１６アラルキル基または核酸合成の保護基を示し、
Ｒ３が、水素原子または−ＰＲ６Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、置換されていてもよい水酸基もしくは置換されていてもよいアミノ基を示す。］で表される基を示し、
Ｒ４およびＲ５が、水素原子を示すか、あるいはＲ４およびＲ５が、一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成する、［１］記載の化合物、
［３］式（ＩＩ）
【００１３】
【化３】
【００１４】
（式中、
Ｒ８は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、アシル基、シリル基、核酸合成の保護基、置換されていてもよいリン酸基、または−Ｐ（Ｒ６）Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいメルカプト基もしくは置換されていてもよいアミノ基を示す。］で表される基を示し、
Ｒ９およびＲ１０は、同一または異なって、水素原子、置換されていてもよい水酸基またはＣ１−６アルキル基を示すか、あるいはＲ９およびＲ１０は、一緒になって、オキシＣ１−４アルキレン基を形成し、
Ｂは、下記α群から選択される置換基で置換されていてもよいプリン−９−イルまたは２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を示す。）
で表される核酸単位構造を少なくとも一つ含有する、オリゴヌクレオチド類縁体（以下、核酸単位構造（ＩＩ）と記載する）またはその塩、
（α群）
ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキルチオ基、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいメルカプト基および置換されていてもよいアミノ基。
［４］Ｒ８が、水素原子、Ｃ１−６アルキル基またはＣ７−１６アラルキル基を示し、
Ｒ９およびＲ１０が、同一または異なって、水素原子を示すか、あるいはＲ９およびＲ１０が、一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成する、［３］記載のオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩、
［５］２’，４’−ＢＮＡ、３’，４’−ＢＮＡ、２’−ｄｅｏｘｙ−３’−Ｎ−３’，４’−ＢＮＡ、３’−Ｎ−２’，４’−ＢＮＡ、５’−Ｎ−２’，４’−ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＣＯＣおよび２’，４’−ＢＮＡＮＣからなる群から選択される架橋された人工核酸がさらに少なくとも一つ組み込まれている、［３］または［４］に記載のオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩、
［６］一つ以上の核酸単位構造または核酸が標識されている、［３］〜［５］のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩。
［７］標識が蛍光基および消光基の組み合わせである、［３］〜［６］のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩、
［８］［３］〜［７］のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド類縁体をプローブとして用いることを特徴とする標的核酸の検出方法、
［９］［３］〜［７］のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド類縁体をプローブとして、標的核酸とハイブリダイズさせる工程、
ハイブリダイズした標的核酸−プローブ複合体を酸性条件下で処理する工程、および
処理工程で切断されたプローブを検出する工程
を含む標的核酸の検出方法、
［１０］ハイブリダイズさせる工程と処理工程が同一の工程で行われる、［９］に記載の検出方法、
［１１］標的核酸が一本鎖核酸である［８］〜［１０］のいずれか１項に記載の検出方法、
などに関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の化合物（Ｉ）は、５’位の窒素原子によりホスホロアミダート結合を、２’位でリン酸エステル結合を形成可能な人工核酸として機能する。かかる化合物を用いて、オリゴヌクレオチド類縁体を容易に合成することができる。
【００１６】
本発明のオリゴヌクレオチド類縁体によれば、化合物（Ｉ）を用いて形成された核酸単位構造（ＩＩ）を含むことから、ＲＮＡ等の一本鎖核酸との結合力に優れ、一本鎖核酸とハイブリダイズした際に、２’→５’エステル結合に起因する構造上のひずみを大きくさせることにより、５’位のホスホロアミダート結合の切断を酸性条件下で容易に進行させることができる。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、一本鎖核酸との二重鎖形成中に酸性条件下で自己切断が可能である。
【００１７】
本発明の標的核酸の検出方法によると、前記オリゴヌクレオチド類縁体をプローブとして用いることにより、標的核酸ではなく標的核酸と結合するプローブを検出する、すなわち、標的核酸を増幅せずに切断されたプローブが検出対象のプローブとして増幅される原理を利用して、核酸増幅工程や特殊な酵素を用いることなく、簡便、迅速かつ高精度な核酸の配列情報を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本明細書中において使用する各置換基および各記号などの定義は次の通りである。なお、本明細書中、「置換されていてもよい」とは、単に種々の置換基（例えば、置換基Ｘと記載する）で置換されていてもよいことを示すだけでなく、種々の保護基（例えば、保護基Ｙと記載する。）で「保護」されていてもよいことを含むものである。よって、本明細書中、「置換基Ｘで置換されていてもよい」なる記載が意図する概念には、「保護基Ｙで保護されていてもよい」概念が包含される。具体的には、
「置換基Ｘで置換されていてもよい水酸基」には、例えば、「保護基Ｙで保護されていてもよい水酸基」が含まれる。
「置換基Ｘで置換されていてもよいメルカプト基」には、例えば、「保護基Ｙで保護されていてもよいメルカプト基」が含まれる。
「置換基Ｘで置換されていてもよいアミノ基」には、例えば、「保護基Ｙで保護されていてもよいアミノ基」が含まれる。
【００１９】
「ハロゲン原子」としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子が挙げられる。
「Ｃ１−６アルキル基」としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などの直鎖または分枝鎖のＣ１−６アルキル基が挙げられる。
「Ｃ２−６アルケニル基」としては、例えば、ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基（アリル基）、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、１−ペンテニル基、１−ヘキセニル基などの直鎖または分枝鎖のＣ２−６アルケニル基が挙げられる。
「Ｃ２−６アルキニル基」としては、例えば、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基、１−ペンチニル基、１−ヘキシニル基などの直鎖または分枝鎖のＣ２−６アルキニル基が挙げられる。
「Ｃ３−１０シクロアルキル基」としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、ビシクロ［３．１．１］ヘプチル基、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル基、ビシクロ［２．２．２］オクチル基、ビシクロ［３．２．１］オクチル基、ビシクロ［３．２．２］ノニル基、ビシクロ［３．３．１］ノニル基、ビシクロ［４．２．１］ノニル基、ビシクロ［４．３．１］デシル基、アダマンチル基等が挙げられる。
【００２０】
「Ｃ６−１４アリール基」としては、例えば、フェニル基、ナフチル基などが挙げられる。
「Ｃ７−１６アラルキル基」としては、例えば、ベンジル基、１−フェニルエチル基、２−フェニルエチル基などが挙げられる。
「Ｃ７−１６アラルキルオキシ基」としては、例えば、ベンジルオキシ基、１−フェニルエチルオキシ基、２−フェニルエチルオキシ基などが挙げられる。
【００２１】
「Ｃ１−６アルコキシ基」としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基などの直鎖または分枝鎖のＣ１−６アルコキシ基が挙げられる。
「Ｃ２−６アルケニルオキシ基」としては、例えば、エテニルオキシ基、ｎ−プロピニルオキシ基、イソプロピニルオキシ基、ｎ−ブテニルオキシ基、イソブテニルオキシ基、ｓｅｃ−ブテニルオキシ基、ｔｅｒｔ−ブテニルオキシ基、ペンテニルオキシ基、ヘキシニルオキシ基などの直鎖または分枝鎖のＣ２−６アルケニルオキシ基が挙げられる。
「Ｃ１−６アルキルチオ基」としては、例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ−プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ｎ−ブチルチオ基、イソブチルチオ基、ｓｅｃ−ブチルチオ基、ｔｅｒｔ−ブチルチオ基、ペンチルチオ基、ヘキシルチオ基などの直鎖または分枝鎖のＣ１−６アルキルチオ基が挙げられる。
「Ｃ６−１４アリールチオ基」としては、例えば、フェニルチオ基、ナフチルチオ基が挙げられる。
【００２２】
「Ｃ１−４アルキレン基」としては、例えばメチレン基、エチレン基、ｎ−プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ−ブチレン基、イソブチレン基、ｓｅｃ−ブチレン基、ｔｅｒｔ−ブチレン基等のＣ１−４アルキレン基が挙げられる。
「オキシＣ１−４アルキレン基」としては、例えばオキシメチレン基、オキシエチレン基、オキシ−ｎ−プロピレン基、オキシイソプロピレン基、オキシ−ｎ−ブチレン基、オキシイソブチレン基、オキシ−ｓｅｃ−ブチレン基、オキシ−ｔｅｒｔ−ブチレン基等のオキシＣ１−４アルキレン基が挙げられる。
【００２３】
「シリル基」としては、例えば、トリＣ１−６アルキル−シリル基（例、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ−ｔ−ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジフェニルメチルシリル基、ジフェニルｔ−ブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリル基等）が挙げられる。これらの基は、ハロゲン原子およびＣ６−１４アリール基から選択される１〜３個の置換基でさらに置換されていてもよい
【００２４】
「アシル基」としては、例えば、ホルミル基、カルボキシル基、Ｃ１−２１アルキル−カルボニル基（例、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、デカノイル基、８−メチルノナノイル基、３−エチルオクタノイル基、３，７−ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、トリデカノイル基、ヘキサデカノイル基、１４−メチルペンタデカノイル基、１３，１３−ジメチルテトラデカノイル基、１−メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、イコサノイル基、ヘンイコサノイル基等）、Ｃ２−６アルケニル−カルボニル基（例、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノイル基等）、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基（例、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基等）、カルボキシ−Ｃ１−６アルキル−カルボニル基（例、スクシニル基、グルタリル基、アジポイル基等）、Ｃ３−８シクロアルキル−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基（例、ベンゾイル基、α−ナフトイル基、β−ナフトイル基等）、Ｃ２−６アルケニルオキシ−カルボニル基（例、ビニルオキシ−カルボニル基、アリルオキシ−カルボニル基等）、Ｃ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル基（例、ベンジルオキシカルボニル基等）、カルバモイル基、Ｃ１−６アルキル−スルホニル基などが挙げられる。これらの基は、ハロゲン原子、カルボキシル基、ニトロ基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基およびシリル基から選択される１〜５個の置換基でさらに置換されていてもよい。
ここで、「カルボキシ−Ｃ１−６アルキル−カルボニル基」および「Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル−カルボニル基」における「Ｃ１−６アルキル」、「Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基」および「Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル−カルボニル基」における「Ｃ１−６アルコキシ」、「Ｃ３−８シクロアルキル−カルボニル基」における「Ｃ３−８シクロアルキル」、「Ｃ６−１４アリール−カルボニル基」における「Ｃ６−１４アリール」、「Ｃ１−６アルキル−スルホニル基」における「Ｃ１−６アルキル」、「Ｃ２−６アルケニルオキシ−カルボニル基」における「Ｃ２−６アルケニルオキシ」、「Ｃ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル基」における「Ｃ７−１６アラルキルオキシ」としては、それぞれ、上記「Ｃ１−６アルキル基」、「Ｃ１−６アルコキシ基」、「Ｃ３−１０シクロアルキル基」、「Ｃ６−１４アリール基」、「Ｃ２−６アルケニルオキシ基」、「Ｃ７−１６アラルキルオキシ基」が例示される。
また、上記「アシル基」として例示される基が置換されていてもよい置換基として挙げられた、「Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基」における「Ｃ１−６アルコキシ」としては、上記「Ｃ１−６アルコキシ基」が例示される。
【００２５】
「核酸合成の保護基」としては、核酸、好ましくは式（Ｉ）で表される化合物や式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチド類縁体を合成する際に安定に各置換基を保護し得るものであれば、特に限定されないが、例えば、
（１）核酸合成の際に水酸基を安定に保護し得る基（本明細書中、「水酸基の核酸合成の保護基」と記載する）、
（２）核酸合成の際にアミノ基を安定に保護し得る基（本明細書中、「アミノ基の核酸合成の保護基」と記載する）、
（３）核酸合成の際にリン酸基を安定に保護し得る基（本明細書中、「リン酸基の核酸合成の保護基」と記載する）、
（４）核酸合成の際にメルカプト基を安定に保護し得る基（本明細書中、「メルカプト基の核酸合成の保護基」と記載する）
が挙げられる。
【００２６】
上記（１）〜（４）の基は、それぞれが保護対象とする置換基に対してのみ適用されるわけではなく、可能であれば別の欄に記載された置換基を用いてもよい。例えば、（２）の基が保護対象とする「アミノ基」を保護するために（１）の「水酸基の核酸合成の保護基」を用いてもよいし、（１）の基が保護対象とする「水酸基」の保護に（２）の「アミノ基の核酸合成の保護基」を用いてもよい。
【００２７】
上記（１）の「水酸基の核酸合成の保護基」としては、例えば、アシル基；テトラヒドロピラニル基またはテトラヒドロチオピラニル基（例、テトラヒドロピラン−２−イル基、３−ブロモテトラヒドロピラン−２−イル基、４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル基、テトラヒドロチオピラン−２−イル基、４−メトキシテトラヒドロチオピラン−４−イル基等）；テトラヒドロフラニル基またはテトラヒドロチオフラニル基（例、テトラヒドロフラン−２−イル基、テトラヒドロチオフラン−２−イル基等）；シリル基；Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル基（例、メトキシメチル基、１，１−ジメチル−１−メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、ｔ−ブトキシメチル基、１−エトキシエチル基、１−（イソプロポキシ）エチル基等）；Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルコキシ−メチル基（例、２−メトキシエトキシメチル基等）；ハロゲン原子で置換されたアルコキシメチル基（例、２，２，２−トリクロロエトキシメチル基、ビス（２−クロロエトキシ）メチル基）；１〜３個のハロゲン原子で置換されたエチル基（例、２，２，２−トリクロロエチル基）；１〜３個のＣ６−１４アリール基で置換されたメチル基（例、ベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、９−アンスリルメチル基）；Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ハロゲン原子およびシアノ基から選択される置換基でアリール環が置換された１〜３個のＣ６−１４アリール基で置換されたメチル基（例、４−メチルベンジル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、３，４，５−トリメチルベンジル基、４−メトキシベンジル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、２−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、４−クロロベンジル基、４−ブロモベンジル基、４−シアノベンジル基等）；Ｃ１−６アルケニルオキシ−カルボニル基（例、ビニルオキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基等）；等が挙げられる。
なお、本明細書中、「トリフェニルメチル基」を「トリチル基」と記載する場合がある。またトリチル基の置換基は、特に記載のない限り、フェニル部分のパラ位に位置する。
【００２８】
上記（２）の「アミノ基の核酸合成の保護基」としては、例えばアシル基が挙げられる。該基は、ハロゲン原子、カルボキシル基、ニトロ基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基およびシリル基から選択される１〜５個の置換基でさらに置換されていてもよい。
【００２９】
上記（３）の「リン酸基の核酸合成の保護基」としては、例えば、Ｃ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルケニル基；Ｃ６−１４アリール基；Ｃ７−１６アラルキル基等が挙げられる。これらの基は、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基およびＣ１−６アルキル基から選択される１〜５個の置換基でさらに置換されていてもよい。
【００３０】
上記（４）の「メルカプト基の核酸合成の保護基」としては、例えば、前記（１）「水酸基の核酸合成の保護基」の定義において挙げられた基に加え、Ｃ１−６アルキルチオ基、Ｃ６−１４アリールチオ基等の「ジスルフィド結合を形成可能な基」が挙げられ、好ましくはアシル基であり、さらに好ましくはベンゾイル基である。
【００３１】
本明細書中、「オキシＣ１−４アルキレン基」とは、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−〔式中、ｎは、１〜４の整数を示す〕で表される基のことをいい、例えば、−Ｏ−（ＣＨ２）−〔オキシメチレン基〕、−Ｏ−（ＣＨ２）２−〔オキシエチレン基〕等が挙げられる。
【００３２】
本明細書中、「ホスホロアミダイト基」とは、式−Ｐ（ＯＲ’）（Ｎ〔Ｒ’’〕２）（式中、Ｒ’は、シアノ基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基を示し、Ｒ’’は、Ｃ１−６アルキル基を示す）で表される基のことをいう。なかでも、式−Ｐ（ＯＣ２Ｈ４ＣＮ）（Ｎ〔ＣＨ（ＣＨ３）２〕２）で表される基または式−Ｐ（ＯＣＨ３）（Ｎ〔ＣＨ（ＣＨ３）２〕２）で表される基が好ましく用いられる。
【００３３】
本明細書中、「ホスホロアミダート結合」とは、リン酸基中のリン原子と窒素原子により形成された結合（以下、Ｐ−Ｎ結合と記載する場合がある）のことをいい、特に限定されないが、好ましくは、前記ホスホロアミダイト基中のＰ−Ｎ結合が例示される。
本発明の化合物およびオリゴヌクレオチドは、当該ホスホロアミダート結合を含む場合、後述する標的核酸とのハイブリダイズの後、後述する酸性条件下で切断され、標的核酸から脱離する。
【００３４】
本発明は、化合物（Ｉ）またはその塩を提供する。
【００３５】
化合物（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３で示される「核酸合成の保護基」としては、好ましくは、水酸基の核酸合成の保護基である。
当該「水酸基の核酸合成の保護基」につき、Ｒ１およびＲ２においては、アシル基、シリル基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、１〜３個のＣ６−１４アリール基で置換されたメチル基、ハロゲン原子およびシアノ基から選択される置換基でアリール環が置換された１〜３個のＣ６−１４アリール基で置換されたメチル基が好ましく、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基またはｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基がさらに好ましい。
一方、Ｒ３においては、アシル基、シリル基、１〜３個のＣ６−１４アリール基で置換されたメチル基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ハロゲン原子およびシアノ基から選択される置換基でアリール環が置換された１〜３個のＣ６−１４アリール基で置換されたメチル基が好ましく、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基がさらに好ましい。
【００３６】
化合物（Ｉ）において、Ｒ１およびＲ３で示される「置換されていてもよいリン酸基」の「リン酸基」が有していてもよい置換基としては、例えば、核酸合成の保護基が挙げられる。
当該保護基としては、好ましくはリン酸基の核酸合成の保護基が挙げられ、特に好ましくは、ハロゲン原子およびシアノ基から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、ハロゲン原子およびニトロ基から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいＣ７−１６アラルキル基、またはハロゲン原子、ニトロ基およびＣ１−６アルキル基から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいＣ６−１４アリール基が挙げられる。最も好ましくは、２−シアノエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、ベンジル基、２−クロロフェニル基または４−クロロフェニル基が挙げられる。
【００３７】
化合物（Ｉ）において、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびα群で示される「置換されていてもよい水酸基」の「水酸基」が有していてもよい置換基としては、例えば、シアノ基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、核酸合成の保護基が挙げられる。
上記「核酸合成の保護基」としては、好ましくはアミノ基の核酸合成の保護基または水酸基の核酸合成の保護基が挙げられ、特に好ましくは水酸基の核酸合成の保護基が挙げられる。
当該「水酸基の核酸合成の保護基」としては、好ましくは、アシル基、シリル基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ハロゲン原子、シアノ基およびＣ１−６アルコキシ基から選択される１〜５個の置換基でアリール環が置換されていてもよい１〜３個のＣ６−１４アリール基で置換されたメチル基が挙げられ、さらに好ましくは、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基（特に好ましくは、４−メトキシトリチル基）、ジメトキシトリチル基またはｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基が挙げられる。
また、「シアノ基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基」としては、好ましくは、メチル基、エチル基、シアノメチル基、シアノエチル基が挙げられ、より好ましくは、メチル基、シアノエチル基が挙げられる。
【００３８】
化合物（Ｉ）において、Ｒ６、Ｒ７およびα群で示される「置換されていてもよいメルカプト基」の「メルカプト基」が有していてもよい置換基としては、核酸合成の保護基が挙げられる。
上記「核酸合成の保護基」としては、Ｒ１およびＲ２で示される核酸合成の保護基の好ましい例として挙げられた「水酸基の核酸合成の保護基」で例示された基と同様の基が挙げられる。
【００３９】
化合物（Ｉ）において、Ｒ６、Ｒ７およびα群で示される「置換されていてもよいアミノ基」の「アミノ基」が有していてもよい置換基としては、Ｃ１−６アルキル基、核酸合成の保護基が挙げられる。置換基の数は１または２であり、置換基の数が２の場合、各置換基は同一または異なっていてもよい。
上記「核酸合成の保護基」としては、好ましくはアミノ基の核酸合成の保護基が挙げられ、より好ましくは、ハロゲン原子、カルボキシル基、ニトロ基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基およびシリル基から選択される１〜５個の置換基でさらに置換されていてもよいＣ１−２１アルキル−カルボニル基、Ｃ２−６アルケニル−カルボニル基またはＣ６−１４アリール−カルボニル基、あるいはＣ１−６アルコキシ基およびニトロ基から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよいＣ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル基が挙げられる。また、さらに好ましくは、ハロゲン原子、カルボキシル基、Ｃ１−６アルコキシ基およびＣ６−１４アリール基から選択される１〜５個の置換基でさらに置換されていてもよいＣ１−２１アルキル−カルボニル基、またはＣ２−６アルケニル−カルボニル基、あるいはＣ１−６アルコキシ基およびニトロ基から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよいＣ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル基が挙げられ、最も好ましくは、トリフルオロアセチル基またはベンジルオキシカルボニル基が挙げられる。
【００４０】
化合物（Ｉ）において、Ｒ４およびＲ５が、一緒になって形成する、「オキシＣ１−４アルキレン基」中の酸素原子は、化合物（Ｉ）中の五単糖部分の３位に結合してもよい（３’−Ｏ，４’−Ｃ−アルキレン架橋を形成してもよい）し、４位に結合してもよい（４’−Ｏ，３’−Ｃ−アルキレン架橋を形成してもよい）が、３位に結合することが好ましい。
「オキシＣ１−４アルキレン基」としては、好ましくはオキシメチレン基、オキシエチレン基である。
【００４１】
化合物（Ｉ）において、Ｂで示される「プリン−９−イル基」としては、特に限定されないが、好ましくは、６−アミノプリン−９−イル基（すなわち、アデニニル基）、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された６−アミノプリン−９−イル基、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基（すなわち、グアニニル基）、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、アミノ基および水酸基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基が挙げられ、より好ましくは、６−ベンゾイルアミノプリン−９−イル基、アデニニル基、２−イソブチリルアミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、グアニニル基が挙げられる。
【００４２】
化合物（Ｉ）において、Ｂで示される「２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基」としては、特に限定されないが、好ましくは、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（すなわち、シトシニル基）、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−アミノ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−オキソ−４−アミノ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（すなわち、ウラシニル基）、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（すなわち、チミニル基）、４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（すなわち、５−メチルシトシニル基）またはアミノ基が核酸合成の保護基で保護された４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基が挙げられ、より好ましくは、２−オキソ−４−ベンゾイルアミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、シトシニル基、２−オキソ−５−メチル−４−ベンゾイルアミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、５−メチルシトシニル基、ウラシニル基またはチミニル基が挙げられる。
【００４３】
化合物（Ｉ）において、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ７−１６アラルキル基または水酸基の核酸合成の保護基であることが好ましく、なかでも、水素原子、メチル基、エチル基、ベンジル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基であることがさらに好ましい。
【００４４】
化合物（Ｉ）において、Ｒ３は、水素原子または−Ｐ（Ｒ６）Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、置換されていてもよい水酸基もしくは置換されていてもよいアミノ基を示す。］で表される基であることが好ましく、なかでも、水素原子または−Ｐ（Ｒ６）Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、シアノ基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基で置換されていてもよい水酸基、もしくはＣ１−６アルキル基で置換されていてもよいアミノ基を示す。］であることがさらに好ましく、水素原子またはホスホロアミダイト基であることが特に好ましく、水素原子または式−Ｐ（ＯＣ２Ｈ４ＣＮ）（Ｎ〔ＣＨ（ＣＨ３）２〕２）で表される基または式−Ｐ（ＯＣＨ３）（Ｎ〔ＣＨ（ＣＨ３）２〕２）で表される基であることが最も好ましい。
【００４５】
化合物（Ｉ）において、Ｒ４およびＲ５は、いずれも水素原子であるか、あるいは一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成することが好ましい。
【００４６】
化合物（Ｉ）は、種々の塩を形成することができる。
化合物（Ｉ）の塩としては、例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩等があげられる。
【００４７】
金属塩の好適な例としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩等があげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、トロメタミン〔すなわち、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン〕、ｔｅｒｔ−ブチルアミン等との塩があげられる。
無機酸との塩の好適な例としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等との塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等との塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えば、アルギニン、リジン、オルニチン等との塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等との塩があげられる。
【００４８】
化合物（Ｉ）は水和物および非水和物のいずれであってもよい。化合物（Ｉ）の水和物としては、例えば、０．５水和物、１水和物、１．５水和物および２水和物等があげられる。また、自体公知の溶媒との溶媒和物であってもよい。
【００４９】
化合物（Ｉ）は同位元素（例、２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３３Ｐ、３５Ｓなど）などで標識されていてもよい。
本発明の化合物（Ｉ）は、上記の水和物、溶媒和物等の種々の化合物をも包含する。
【００５０】
本発明の化合物（Ｉ）としては、
Ｒ１およびＲ２が、同一または異なって、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ７−１６アラルキル基または水酸基の核酸合成の保護基を示し、
Ｒ３が、水素原子または−ＰＲ６Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、置換されていてもよい水酸基もしくは置換されていてもよいアミノ基を示す。］で表される基を示し、かつ
Ｒ４およびＲ５が、水素原子を示すか、あるいはＲ４およびＲ５が、一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成する、化合物（Ｉ）が好ましい。
【００５１】
さらに、本発明の化合物（Ｉ）としては、
Ｒ１およびＲ２が、同一または異なって、水素原子、メチル基、エチル基、ベンジル基、トリチル基またはモノメトキシトリチル基を示し、
Ｒ３が、水素原子またはホスホロアミダイト基を示し、かつ
Ｒ４およびＲ５が、水素原子を示すか、あるいはＲ４およびＲ５が、一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成する、化合物（Ｉ）がより好ましい。
【００５２】
また、本発明の化合物（Ｉ）としては、
Ｒ１およびＲ２のいずれか一方が、メチル基、エチル基またはベンジル基を示し、もう一方が、トリチル基またはモノメトキシトリチル基を示し、
Ｒ３が、ホスホロアミダイト基を示し、かつ
Ｒ４およびＲ５が、水素原子を示すか、あるいはＲ４およびＲ５が、一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成する、化合物（Ｉ）が最も特に好ましい。
【００５３】
本発明の化合物（Ｉ）は、例えば、以下の方法で製造することが可能である。
【００５４】
【化４】
【００５５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＢは、前記と同義であり、Ｒ’は、アシル基を示す。）
【００５６】
なお、本明細書中、「室温」とは、特に記載されない限り、１０℃〜４０℃の範囲内の温度、好ましくは１５℃〜３５℃の範囲内の温度をいう。
【００５７】
工程１
工程１は、化合物（１）に、式Ｒ１ＮＨ２（式中、Ｒ１は、前記と同義である）で表される化合物を付すことで、化合物（２）を得る反応である。
【００５８】
化合物（１）は、自体公知の方法を利用することで製造することができる。当該製造方法としては、例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９２，３３，４１４９に記載の方法や、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００１，６６，８５０４−８５１２に記載の方法などが挙げられる。
【００５９】
化合物（１）中、Ｒ’で表される基としては、好ましくは、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ１−６アルキル−スルホニル基である。より好ましくはＣ１−６アルキル−スルホニル基であり、特に好ましくはメシル基（メタンスルホニル基）である。
【００６０】
式Ｒ１ＮＨ２で表される化合物中、Ｒ１で表される基としては、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ７−１６アラルキル基または水酸基の核酸合成の保護基が好ましく、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ７−１６アラルキル基がより好ましく、メチル基、エチル基、ベンジル基が特に好ましい。当該化合物は、化合物（１）１モルに対し、通常１モル〜２０００モル用いるが、４モル〜１０００モル用いることが好ましい。
【００６１】
本工程による反応は、溶媒中で行っても無溶媒で行ってもよい。使用できる溶媒としては、本工程に影響を与えない限り特に限定されないが、好ましくは自体公知の極性溶媒であり、特に好ましくは、イソプロパノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、アセトンなどである。溶媒の使用量は、化合物（１）１ｇに対して５ｍＬ〜３０ｍＬ、好ましくは１０ｍＬ〜２０ｍＬである。
【００６２】
また、本工程は密閉した空間内で行うことが好ましい。
本工程の反応温度は特に限定されないが、０℃〜５０℃で行うことが好ましく、室温で行うことがさらに好ましい。反応時間は、使用する試薬や溶媒の量、反応温度によっても異なるが、通常１時間〜１００時間、好ましくは２４時間〜４８時間である。
【００６３】
本工程で得られた化合物（２）は、反応混合物から自体公知の手段、例えば抽出、濃縮、中和、濾過、蒸留、再結晶、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、分取用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、中圧分取液体クロマトグラフィー（中圧分取ＬＣ）等の手段を用いることによって単離・精製することができるが、反応混合物のまま次工程２に付すこともできる。
【００６４】
上記反応により、目的物が遊離の状態で得られる場合には、常法に従って塩に変換してもよく、また塩として得られる場合には、常法に従って遊離体または他の塩に変換することもできる。
さらに、化合物（２）は、化合物（２）の水和物、溶媒和物、立体異性体、光学異性体等の種々の化合物をも包含する。
【００６５】
工程２
工程２は、化合物（２）に、式Ｒ２Ｘ（式中、Ｒ２は、前記と同義であり、Ｘは、ハロゲン原子を示す）で表される化合物を付すことで、化合物（３）を得る反応である。
【００６６】
式Ｒ２Ｘで表される化合物中、Ｒ２で表される基としては、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ７−１６アラルキル基または水酸基の核酸合成の保護基が好ましく、水酸基の核酸合成の保護基がより好ましく、シアノ基およびＣ１−６アルコキシ基から選択される１〜５個の置換基でアリール環が置換されていてもよい１〜３個のＣ６−１４アリール基で置換されたメチル基が特に好ましい。当該化合物は、化合物（２）１モルに対し、通常０．５モル〜２モル用いるが、０．８モル〜１．２モル用いることが好ましい。
【００６７】
本工程による反応は、溶媒中で行っても無溶媒で行ってもよいが、通常、溶媒中で行われる。使用可能な溶媒としては反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、トリエチルアミン、ピリジンなど、またはこれらの混合溶媒が挙げられる。溶媒の使用量は、化合物（２）１ｇに対して５ｍＬ〜２０ｍＬ、好ましくは８ｍＬ〜１２ｍＬである。反応温度は、通常０℃〜５０℃、好ましくは室温である。反応時間は、使用する試薬や溶媒の量、反応温度によっても異なるが、通常１時間〜１２時間、好ましくは２時間〜６時間である。
【００６８】
本工程で得られた化合物（３）は、反応混合物から自体公知の手段、例えば抽出、濃縮、中和、濾過、蒸留、再結晶、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、分取用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、中圧分取液体クロマトグラフィー（中圧分取ＬＣ）等の手段を用いることによって単離・精製することができるが、反応混合物のまま次工程２に付すこともできる。
【００６９】
上記反応により、目的物が遊離の状態で得られる場合には、常法に従って塩に変換してもよく、また塩として得られる場合には、常法に従って遊離体または他の塩に変換することもできる。
【００７０】
本化合物（３）は、化合物（２）で説明したものと同様に、化合物（３）の水和物、溶媒和物、立体異性体、光学異性体等の種々の化合物をも包含する。
【００７１】
工程３
工程３は、化合物（３）から化合物（Ｉ）を得る反応である。化合物（３）中、Ｒ３は前記と同義である。上記反応において化合物（３）と反応する化合物は、当業者であれば適宜選択することが可能である。当該化合物としては、２−シアノエチル Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホジアミダイトが好ましく用いられる。
当該化合物は、化合物（３）１モルに対し、通常０．５モル〜２モル用いるが、０．８モル〜１．２モル用いることが好ましい。
【００７２】
本工程による反応は、溶媒中で行っても無溶媒で行ってもよいが、通常、溶媒中で行われる。使用可能な溶媒としては反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼン、アニソール、トルエン、メシチレン、キシレン、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸イソプロピル、アセトニトリル、プロピオニトリル、ジエチルエーテルなど、またはこれらの混合溶媒が挙げられる。溶媒の使用量は、化合物（３）１ｇに対して、通常１０ｍＬ〜４０ｍＬ、好ましくは２０ｍＬ〜３０ｍＬである。反応温度は、通常０℃〜５０℃、好ましくは室温である。反応時間は、使用する試薬や溶媒の量、反応温度によっても異なるが、通常１時間〜２４時間、好ましくは６時間〜１２時間である。
【００７３】
また、本工程には反応促進剤として、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリドなどを用いることができる。当該反応促進剤の使用量は、化合物（３）１モルに対して、通常０．５モル〜２モルである。
【００７４】
本工程で得られた化合物（Ｉ）は、反応混合物から自体公知の手段、例えば抽出、濃縮、中和、濾過、蒸留、再結晶、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、分取用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、中圧分取液体クロマトグラフィー（中圧分取ＬＣ）等の手段を用いることによって単離・精製することができる。
上記反応により、目的物が遊離の状態で得られる場合には、常法に従って塩に変換してもよく、また塩として得られる場合には、常法に従って遊離体または他の塩に変換することもできる。
【００７５】
化合物（Ｉ）を、オリゴヌクレオチドを製造するための核酸単位とすることで、核酸単位構造（ＩＩ）を含むオリゴヌクレオチドを製造することができる。
【００７６】
上記オリゴヌクレオチド類縁体は、化合物（Ｉ）を通常のオリゴヌクレオチド合成に用いられる核酸と同様に、ＤＮＡ合成機などに付し、合成することができる。ＤＮＡ合成機としては特に限定されず、自体公知のＤＮＡ合成機であればいずれであってもよい。
また、そのオリゴヌクレオチド類縁体合成に適用されるオリゴヌクレオチドの合成法についても自体公知のものが適用され、例えば、ホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法等が挙げられる。
【００７７】
本発明は、上記方法によって製造された、核酸単位構造（ＩＩ）を含むオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩を提供する。
【００７８】
核酸単位構造（ＩＩ）において、Ｒ８で示される「核酸合成の保護基」としては、好ましくは、水酸基の核酸合成の保護基であり、さらに好ましくは、アシル基、シリル基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、１〜３個のＣ６−１４アリール基で置換されたメチル基、ハロゲン原子およびシアノ基から選択される置換基でアリール環が置換された１〜３個のＣ６−１４アリール基で置換されたメチル基であり、特に好ましくは、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基またはｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基である。
【００７９】
核酸単位構造（ＩＩ）において、Ｒ８で示される「置換されていてもよいリン酸基」の「リン酸基」が有していてもよい置換基としては、例えば、核酸合成の保護基が挙げられる。
当該保護基としては、好ましくはリン酸基の核酸合成の保護基が挙げられ、特に好ましくは、ハロゲン原子およびシアノ基から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、ハロゲン原子およびニトロ基から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいＣ７−１６アラルキル基、またはハロゲン原子、ニトロ基およびＣ１−６アルキル基から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいＣ６−１４アリール基が挙げられる。最も好ましくは、２−シアノエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、ベンジル基、２−クロロフェニル基または４−クロロフェニル基が挙げられる。
【００８０】
核酸単位構造（ＩＩ）において、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０およびα群で示される「置換されていてもよい水酸基」としては、化合物（Ｉ）において、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびα群で示される「置換されていてもよい水酸基」と同様のものが例示される。
また核酸単位構造（ＩＩ）において、Ｒ６、Ｒ７およびα群で示される「置換されていてもよいメルカプト基」、「置換されていてもよいアミノ基」としては、化合物（Ｉ）において、Ｒ６、Ｒ７およびα群で示される「置換されていてもよいメルカプト基」、「置換されていてもよいアミノ基」と同じものがそれぞれ例示される。
【００８１】
核酸単位構造（ＩＩ）において、Ｒ９およびＲ１０が、一緒になって形成する、「オキシＣ１−４アルキレン基」中の酸素原子は、核酸単位構造（ＩＩ）中の五単糖部分の４位に結合してもよい（４’−Ｏ，３’−Ｃ−アルキレン架橋を形成してもよい）し、３位に結合してもよい（３’−Ｏ，４’−Ｃ−アルキレン架橋を形成してもよい）が、４位に結合することが好ましい。
【００８２】
核酸単位構造（ＩＩ）において、Ｂで示される「プリン−９−イル基」、「２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基」としては、化合物（Ｉ）において、Ｂで示される「プリン−９−イル基」、「２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基」と同じものがそれぞれ例示される。
【００８３】
核酸単位構造（ＩＩ）において、Ｒ８は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ７−１６アラルキル基であることが好ましく、なかでも、水素原子、メチル基、エチル基、ベンジル基であることがさらに好ましい。
【００８４】
核酸単位構造（ＩＩ）において、Ｒ９およびＲ１０は、いずれも水素原子であるか、あるいは一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成することが好ましい。
【００８５】
核酸単位構造（ＩＩ）を含むオリゴヌクレオチド類縁体は、種々の塩を形成することができる。
核酸単位構造（ＩＩ）を含むオリゴヌクレオチド類縁体の塩としては、例えば、化合物（Ｉ）の塩として例示した塩が挙げられる。
【００８６】
核酸単位構造（ＩＩ）は、同位元素（例、２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３３Ｐ、３５Ｓなど）などで標識されていてもよい。
【００８７】
本発明のオリゴヌクレオチド類縁体としては、
Ｒ８が、水素原子、Ｃ１−６アルキル基またはＣ７−１６アラルキル基を示し、かつ
Ｒ９およびＲ１０が、水素原子を示すか、あるいはＲ９およびＲ１０が、一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成する、核酸単位構造（ＩＩ）を含むオリゴヌクレオチド類縁体が好ましい。
【００８８】
さらに、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体としては、
Ｒ８が、水素原子、メチル基、エチル基またはベンジル基を示し、かつ
Ｒ９およびＲ１０が、水素原子を示すか、あるいはＲ９およびＲ１０が、一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成する、核酸単位構造（ＩＩ）を含むオリゴヌクレオチド類縁体がより好ましい。
【００８９】
本発明において「核酸単位構造」とは、「結合部分」−「糖部分」−「塩基部分」からなり、天然の核酸中のヌクレオチドに相当する部分である。
【００９０】
「結合部分」とは、天然の核酸中のホスホジエステル結合に相当する部分である。本発明のオリゴヌクレオチド類縁体においては、天然核酸が有するホスホジエステル結合の少なくとも１つが、隣接する核酸（単位）中のリン酸基中のリン原子と共に形成するＰ３’→Ｎ５’ホスホロアミダート結合、または隣接する核酸（単位）中のリン酸基中のリン原子と共に形成するＰ２’→Ｎ５’ホスホロアミダート結合に置き換わり、かつ、天然核酸が有する３’→５’ホスホジエステル結合の少なくとも別の１つが２’→５’結合に置き換わっている。すなわち本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、５’位におけるＰ２’→Ｎ５’ホスホロアミダート結合またはＰ３’→Ｎ５’ホスホロアミダート結合と、２’位における２’→５’ホスホジエステル結合とによりそれぞれ隣接する核酸（単位）と結合し、形成されるものである。
前記２’→５’結合は、２’→５’ホスホジエステル結合および２’→５’ホスホロアミダート結合のいずれの結合であってもよい。
【００９１】
「糖部分」とは、天然の核酸中の糖に相当する部分であり、前記化合物（Ｉ）で定義した五単糖部分である。本発明のオリゴヌクレオチド類縁体において、前記化合物（Ｉ）に由来しない「糖部分」としては、天然核酸中に存在するもの（好ましくはデオキシリボースまたはリボース）であってもよく、天然核酸中に存在しないもの、例えば、アラビノース、２’−Ｏ−アミノエチルリボース、２’位と４’位の間を架橋した五単糖、またはこれらの糖の修飾体などであってもよい。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体の糖部分の一部または全部が天然核酸中に存在しないものであってもよい。
【００９２】
「塩基部分」とは、前記化合物（Ｉ）で示すＢに相当する部分である。本発明のオリゴヌクレオチド類縁体において、前記化合物（Ｉ）に由来しない「塩基部分」としては、天然核酸中に存在するもの（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ））であってもよく、天然核酸中に存在しないもの、例えば、イノシン、５−メチルシトシン、５−プロピニルシトシン、ピリドンなどであってもよい。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体の塩基部分の一部または全部が天然核酸中に存在しないものであってもよい。
【００９３】
本発明のオリゴヌクレオチド類縁体において、「塩基部分」の塩基配列は、標的核酸の塩基配列に相補的となるように決定することができる。相補性は、高いほど好ましいが、検出目的に応じて相補性の程度を適宜設定すればよく、必ずしも１００％である必要はない。
【００９４】
これらの糖部分および塩基部分を含むヌクレオシドまたはヌクレオチドの製造方法ならびに結合部分の形成方法は、当業者に公知である。
【００９５】
本発明のオリゴヌクレオチド類縁体の長さは、標的核酸配列の長さ、その塩基配列、二重鎖または三重鎖形成条件、所望の検出感度や選択性、さらには後述する検出方法などの要因により様々であるが、一般には５〜５０塩基、好ましくは１０〜４０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基である。
【００９６】
本発明のオリゴヌクレオチド類縁体中の核酸単位構造（ＩＩ）の挿入数は、少なくとも１つであり、上限はオリゴヌクレオチド類縁体の全塩基数である。核酸単位構造（ＩＩ）の結合部分であるＰ３’→Ｎ５’ホスホロアミダート結合またはＰ２’→Ｎ５’ホスホロアミダート結合は、標的核酸とハイブリダイズした場合、後述する酸性条件下で容易に切断され、標的核酸から脱離する。この性質を利用して、後述する本発明の標的核酸の検出方法にプローブとして用いられる。したがって、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体を切断する目的で使用する場合は、核酸単位構造（ＩＩ）の５’側が切断部位となり、生じる断片が標的核酸から脱離するように、挿入数とその位置を決定すればよい。
【００９７】
本発明のオリゴヌクレオチド類縁体中の核酸単位構造（ＩＩ）以外の核酸としては、天然の核酸または他の人工核酸を限定なく用いることができる。標的一本鎖核酸との結合性を高めるためには、本発明者らがこれまでに開発してきた、糖部分が架橋された人工核酸（以下、「ＢＮＡ」と称する）を用いることが好ましい。このような人工核酸としては、２’，４’−ＢＮＡ（ＷＯ９８／３９３５２）、３’，４’−ＢＮＡ（ＷＯ９８／２２４８９）、２’−ｄｅｏｘｙ−３’−Ｎ−３’，４’−ＢＮＡ（ＷＯ０１／０００６４１）、３’−Ｎ−２’，４’−ＢＮＡ（特開２００１−８９４９６号公報）、塩基部分がピリドン体である２’，４’−ＢＮＡ（ＷＯ０２／１８３８８）、５’−Ｎ−２’，４’−ＢＮＡ（ＷＯ０３／０６８７９５）、２’，４’−ＢＮＡＣＯＣ（ＷＯ０３／０６８７９５）、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（ＷＯ２００５／０２１５７０）などがあげられる。
【００９８】
前記ＢＮＡを用いる場合、オリゴヌクレオチド類縁体中のＢＮＡの位置は特に限定されず、核酸単位構造（ＩＩ）に隣接していてもよく、隣接していなくてもよい。
【００９９】
本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、検出を容易ならしめるために、検出可能な標識、例えば、放射性基、酵素、蛍光基、蛍光基と消光基等で標識されていてもよい。
放射性基としては、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉなどがあげられる。酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどがあげられる。
蛍光基としては、Ａｃｒｉｄｉｎｅ、ＡＭＣＡＴＭ、ＢＯＤＩＰＹＴＭ、Ｃａｓｃａｄｅ ＢｌｕｅＴＭ、Ｃｙ２ＴＭ、Ｃｙ３ＴＭ、Ｃｙ５ＴＭ、Ｃｙ７ＴＭ、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｄａｎｓ、Ｅｏｓｉｎ、Ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｎ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、６−ＦＡＭＴＭ、ＴＥＴＴＭ、ＪＯＥ、ＨＥＸＴＭ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ、ＮＢＤＴＭ、Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ６ＧＴＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＧｒｅｅｎＴＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＲｅｄＴＭ、Ｒｈｏｄｏｌ ＧｒｅｅｎＴＭ、ＴＡＭＲＡＴＭ、ＲＯＸＴＭ、Ｔｅｘａｓ ＲｅｄＴＭ、ＮＥＤＴＭ、ＶＩＣＴＭ、ベンズイミダゾール系骨格を有する蛍光物質（ＷＯ２００７／０９４３２５）などがあげられる。
蛍光基と消光基の組合せとしては、
１）Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８ＴＭ−Ｘ、６−ＦＡＭＴＭ、ＴＥＴＴＭ、ＪＯＥ、ＨＥＸＴＭまたはＣｙ３ｖの蛍光基とＤａｂｃｙｌ消光基の組合せ；
２）Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８ＴＭ−Ｘ、６−ＦＡＭＴＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＧｒｅｅｎＴＭ−Ｘ、Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ ５１４、ＴＥＴＴＭ、ＪＯＥ、ＨＥＸＴＭ、Ｃｙ３ＴＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＲｅｄＴＭ−ＸまたはＴＡＭＲＡＴＭの蛍光基とＢＨＱＴＭ−１消光基の組合せ；
３）ＨＥＸＴＭ、Ｃｙ３ＴＭ、６−ＦＡＭＴＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＧｒｅｅｎＴＭ−Ｘ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＲｅｄＴＭ−Ｘ、ＴＡＭＲＡＴＭ、ＲＯＸＴＭ、Ｔｅｘａｓ ＲｅｄＴＭ-Ｘ、Ｂｏｄｉｐｙ ６３０／６５０ＴＭ−ＸまたはＢｏｄｉｐｙ ６５０／６６５ＴＭ−Ｘの蛍光基とＢＨＱＴＭ−２消光基の組合せ；
４）６−ＦＡＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ−Ｘ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ-Ｘ、ＴＡＭＲＡ、Ｂｏｄｉｐｙ ６３０／６５０−Ｘ、Ｂｏｄｉｐｙ ６５０／６６５−ＸまたはＣｙ５の蛍光基とＢＨＱ−１消光基の組合せ
などがあげられる。
【０１００】
前記蛍光基および消光基の結合位置は当業者が適宜設定できるが、後述する本発明の標的核酸の検出方法において処理工程で切断されたプローブを検出するためには、核酸単位構造（ＩＩ）（すなわち、プローブの切断部位）をはさむように、かつ当該部位のなるべく近くに配置して、切断した検出プローブが標的核酸から脱離して、蛍光基と消光基の距離が離れたときに蛍光を発するようにすることが必要である。これにより、検出を簡便かつ高感度に行うことができる。前記蛍光基および消光基は、核酸単位構造（ＩＩ）の両隣に位置する塩基部分にそれぞれ結合していることが好ましい。
【０１０１】
本発明は、前記オリゴヌクレオチド類縁体をプローブとして用いることを特徴とする標的核酸の検出方法を提供する。検出対象の標的核酸は、一本鎖核酸または二本鎖核酸のいずれでも可能であるが、本発明のプローブの特性上、一本鎖核酸との結合能力に優れる点、および一本鎖核酸を二本鎖にする工程を省略できる点から、一本鎖核酸が好ましい。また、標的核酸の種類は特に限定されず、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、天然由来の核酸であっても合成核酸であってもよい。本発明の検出方法の概念図を図１に示す。本発明の検出方法は、具体的には下記工程（１）〜（３）を含む。
【０１０２】
（１）本発明のオリゴヌクレオチド類縁体をプローブとして、標的核酸とハイブリダイズさせる工程
ハイブリダイゼーションの条件は、標的核酸の塩基配列、プローブの構造およびその塩基配列などに応じて適宜設定することができる。ハイブリダイゼーションは、液相中、または標的核酸もしくはプローブが固相に固定された固−液中のいずれで行ってもよい。例えば、反応温度は、標的核酸の塩基配列から算出したＴｍ値から約５〜１０℃低い温度が好ましい。ハイブリダイゼーションの時間は、通常１〜６０分程度である。また、ハイブリダイズさせる工程を省くこともできる。
【０１０３】
（２）ハイブリダイズした標的核酸−プローブ複合体を酸性条件下で処理する工程
本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、標的核酸の非存在下に比べて、標的核酸とハイブリダイズして二重鎖または三重鎖を形成した場合に、酸性条件下でホスホロアミダート結合の切断が顕著に促進される。かかる知見に基づいて、本工程では、標的核酸にハイブリダイズしたプローブのみが切断される。他方、標的核酸にハイブリダイズしないプローブは、本工程ではホスホロアミダート結合の切断が実質的に生じない。酸性条件は、通常ｐＨ約２〜約５、好ましくはｐＨ約３〜約４であり、処理時間は、通常約５分以上であり、好ましくは１０〜３０分である。ハイブリダイゼーション溶液のｐＨを上記のように調整するため、プロトン酸またはルイス酸を添加する。プロトン酸の例としては、酢酸、クエン酸、リン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、塩酸、硫酸等があげられる。
本処理工程において、プローブの切断が進行し、それに伴い、切断されたプローブが標的核酸から脱離する。プローブフリーとなった標的核酸は、新たなプローブとハイブリダイズすることができる。この過程を繰り返すことにより、検出対象のプローブが増幅される。したがって、処理工程中にハイブリダイズ工程も同時に進行させることができる。この目的のためには、処理温度をハイブリダイゼーション温度と同じにすることが好ましい。
【０１０４】
本発明の検出方法では、前記工程（１）と工程（２）を同一の工程で行うことができる。したがって、本発明の検出方法では、工程（１）を省略して工程（２）から開始することも可能である。
【０１０５】
（３）処理工程で切断されたプローブを検出する工程
切断されたプローブの検出方法は、用いるプローブの種類に応じて適宜選択することができる。標識されていないプローブまたは同位体で標識したプローブを用いた場合、質量分析法または高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）法、キャピラリーゲル電気泳動法などにより切断されたプローブを検出することができる。蛍光基または蛍光基と消光基の組合せで標識されたプローブを用いた場合、蛍光分析法により検出する。例えば、蛍光マイクロプレートリーダーを用いることにより、多検体の同時解析を行うことができる。さらに、標識が放射性基または酵素の場合も、常法に従って切断されたプローブを検出することができる。
【０１０６】
本発明の検出方法は、遺伝子に関する研究、遺伝子診断、遺伝子治療などの遺伝子に関連する様々な技術分野において利用可能である。
【実施例】
【０１０７】
以下、実施例を示してさらに具体的に本発明を説明する。以下は代表的な実施例を示すものでこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
【０１０８】
実施例１ ５’−アミノ−３’，４’−ＢＮＡの製造
【０１０９】
（１）ジオール体の製造
【０１１０】
【化５】
【０１１１】
共通中間体１（１．０ｇ，１．７３ｍｍｏｌ）のエタノール（２５ｍＬ）溶液に、２０％ Ｐｄ（ＯＨ）２−Ｃ（２５０ｍｇ）およびシクロヘキサン（３．５ｍＬ，３４．７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を２時間還流した。混合物をろ過した後、ろ液を減圧濃縮して粗製物を得た。残渣（８４０ｍｇ）のメタノール（２５ｍＬ）溶液に炭酸カリウム（１４３ｍｇ，１．０４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１５分間攪拌した。反応混合物を３７％ＨＣｌ溶液で中和し、減圧下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝５：１）で精製し、表題化合物（６２１ｍｇ，８１％ ｏｖｅｒ ２ｓｔｅｐｓ）を無色固体として得た。なお、共通中間体１は、当業者であれば自体公知の方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６６，８５０４−８５１２（２００１））で入手可能である。
Ｍｐ ９８−１０１℃．
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ １．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ），３．１３（３Ｈ，ｓ），３．１９（３Ｈ，ｓ），４．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ），４．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），４．４５，４．５４（２Ｈ，ＡＢ，Ｊ＝１１Ｈｚ），４．４５（２Ｈ，ｓ），６．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），７．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ）．
Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ ４４５（ＭＨ＋）．
【０１１２】
（２）化合物２ｂの製造
【０１１３】
【化６】
【０１１４】
ジオール体（４２６ｍｇ，０．９６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１５ｍｌ）溶液にＮａＨＭＤＳ（ＴＨＦ２．１１ｍＬ中２．１１ｍｍｏｌ，１Ｍ）を室温で加えた。混合物を１．５時間攪拌した。１０％ＨＣｌ溶液で中和した後、組成物を留去した。得られた残渣をシリカゲル（−ＮＨ）カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝１０：１）で精製し、ＤＭＦを含む目的のヌクレオシド溶液（３３１ｍｇ）を得た。ＣＨ３ＮＨ（１５ｍＬ）の該ヌクレオシド溶液を封管中、室温で１７時間攪拌し、過剰のＣＨ３ＮＨを揮発させた。残渣をシリカゲル（−ＮＨ）カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ＝１０：１）で精製して、２ｂ（２０８ｍｇ，７６％ ｏｖｅｒ ２ ｓｔｅｐｓ）を無色固体として得た。
Ｍｐ １０２−１０４℃．
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ １．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ），２．４１（３Ｈ，ｓ），２．９４，３．０２（２Ｈ，ＡＢ，Ｊ＝１３Ｈｚ），４．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５，８Ｈｚ），５．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ），６．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ）．
Ｍａｓｓ（ＥＩ）：ｍ／ｚ ２８３（Ｍ＋）．
【０１１５】
（３）化合物２ｃの製造
【０１１６】
【化７】
【０１１７】
２ｂ（２０５ｍｇ，０．７２ｍｍｏｌ）のピリジン（２．０ｍＬ）溶液にＥｔ３Ｎ（０．２ｍＬ，１．４４ｍｍｏｌ）および塩化４−メチルトリチル（２４５ｍｇ，０．７９ｍｍｏｌ）を室温で加え、混合物を１６時間攪拌した。ＡｃＯＥｔで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。混合物を減圧下で留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ｎ−ｈｅｘａｎｅ＝１：２→２：１）で精製して、２ｃ（３１０ｍｇ，７７％）を無色固体として得た。
Ｍｐ １０５−１０７℃．
［a］Ｄ２４ −５６．９（ｃ ０．５，ＣＨＣｌ３）．
ＩＲ（ＫＢｒ）nｍａｘ ３２０１，３０６０，２９２５，２８５１，１６９４，１４６１，１２４９ｃｍ−１．
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ２．０３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ），２．０５（３Ｈ，ｓ），２．５８，２．７７（２Ｈ，ＡＢ，Ｊ＝１４Ｈｚ），４．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５，７Ｈｚ），４．７０，４．９５（２Ｈ，ＡＢ，Ｊ＝８Ｈｚ），４．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ），６．３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），６．８１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），７．１３−７．４９（１２Ｈ，ｍ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ １２．８，２９．８，３８．５，５５．１，５５．２，７４．５，７７．２，８０．６，８４．４，８６．８，８７．７，１１２．１，１１２．９，１２６．１，１２７．６，１２９．１，１２９．１，１３０．５，１３５．０，１５０．９，１５７．６，１６３．３．
Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ ５５６（ＭＨ＋）．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）：Ｃ３２Ｈ３４Ｏ６Ｎ３（ＭＨ＋）からの計算値：５５６．２４４８．実測値：５５６．２４５６．
【０１１８】
（４）５’−アミノ−３’，４’−ＢＮＡ（化合物２ｄ）の製造
【０１１９】
【化８】
【０１２０】
２ｃ（２８４ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ−ＴＨＦ（３：１，４ｍＬ）溶液に、２−シアノエチル Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホジアミダイト（０．１８ｍＬ，０．５６ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルアンモニウム テトラゾリド（１２３ｍｇ，０．７２ｍｍｏｌ）を室温で加え、１７時間攪拌した。反応混合物をＡｃＯＥｔで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。次いで、減圧下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ｎ−ｈｅｘａｎｅ ｗｉｔｈ １％Ｅｔ３Ｎ＝１：２）で精製して、２ｄ（３４０ｍｇ，８８％）を無色固体として与えた。
Ｍｐ ９５−９８℃．
Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）：７５６（ＭＨ＋）．
３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ １５０．２，１５０．４．
【０１２１】
実施例２ ５’−アミノ−２’，５’−ＤＮＡの製造
（１）化合物７ａの製造
【０１２２】
【化９】
【０１２３】
３’−デオキシチミジン（１１８ｍｇ，０．４９ｍｍｏｌ）のピリジン（１．５ｍＬ）溶液に、塩化メタンスルホニル（５０．４μＬ，０．６５ｍｍｏｌ）を氷冷下で加えた。反応混合物を室温で３．５時間攪拌した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液を加えたのち、混合物を留去して粗製物を得た。該残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ｎ−ｈｅｘａｎｅ＝１：１）で精製して、７ａ（１０６ｍｇ，７２％）を無色固体として得た。
Ｍｐ ８７−８９℃．
［a］Ｄ２６ −１０．３（ｃ ０．５，ＥｔＯＨ）．
ＩＲ （ＫＢｒ）nｍａｘ ３２４４，３０１８，２８３３，１６８５，１４７９，１４３２，１３４７ｃｍ−１．
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ １．８８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ），２．０１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３，６，１３Ｈｚ），２．１５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝６，９，１３Ｈｚ），３．１４（３Ｈ，ｓ），４．３６−４．４５（２Ｈ，ｍ），４．５３−４．６２（２Ｈ，ｍ），５．７７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），７．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ），．
１３Ｃ ＮＭＲ（Ｃ５Ｄ５Ｎ）δ １２．９，３４．８，３７．４，７１．０，７５．４，７８．１，９３．６，１１０．５，１０９．４，１５１．８，１６４．８．
Ｍａｓｓ（ＥＩ）： ｍ／ｚ ３２０（Ｍ＋）．
Ｃ１１Ｈ１６Ｎ２Ｏ７Ｓ・Ｈ２Ｏからの分析値：Ｃ，３９．０５；Ｈ，５．３６；Ｎ，８．２３．実測値：Ｃ，３９．１９；Ｈ，５．２０；Ｎ，４．２９．
【０１２４】
（２）化合物７ｂの製造
【０１２５】
【化１０】
【０１２６】
７ａ（１．５０ｇ，４．６８ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＮＨ（２０ｍＬ）溶液を密封管中で６３時間静置し、過剰のＣＨ３ＮＨを揮発させた。残渣をショートシリカゲル（−ＮＨ）カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ＝２０：１→１０：１）で精製して、粗製物（８５２ｍｇ）を得た。粗製物（８５２ｍｇ）のピリジン溶液に塩化４−メトキシトリチル（１．０３ｇ，３・３４ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（０．９３ｍＬ，６．６８ｍｍｏｌ）を室温で加え、１６時間室温で攪拌した。反応混合物をＡｃＯＥｔで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液、水および飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ｎ−ｈｅｘａｎｅ ｗｉｔｈ １％Ｅｔ３Ｎ＝０：１→１：１）で精製し、７ｂ（７４２ｍｇ，３０％ ｏｖｅｒ ２ｓｔｅｐｓ）を無色固体として得た。
Ｍｐ １０７−１０９℃．
［a］Ｄ２４ −４．１（ｃ ０．５，ＣＨＣｌ３）．
ＩＲ（ＫＢｒ）nｍａｘ ３０５８，２９５８，２８３７，１６９４，１５０２，１４６７，１２５５ｃｍ−１．
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ １．７６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ），２．１９（３Ｈ，ｓ），１．９６−２．０９（２Ｈ，ｍ），２．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，１３Ｈｚ），２．６９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８，１３Ｈｚ），４．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ），４．８５（１Ｈ，ｍ），５．７７（１Ｈ，ｓ），６．８０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），７．１３−７．５５（１３Ｈ，ｍ），９．７６（１Ｈ，ｂｒｓ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（Ｃ５Ｄ５Ｎ）δ １２．７，３６．４，３８．３，５５．１，５７．０，７６．２，７７．２，８０．５，９４．０，１１０．３，１１２．７，１２５．９，１２７．４，１２９．３，１３０．６，１３４．７，１４２．８，１４２．８，１５０．９，１５７．５，１６４．２．
Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ ５５０（ＭＮａ＋）．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）：Ｃ３１Ｈ３３Ｏ５Ｎ３Ｎａ（ＭＮａ＋）からの計算値：５５０．２３１８．実測値：５５０．２３３８．
【０１２７】
（３）５’−アミノ−２’，５’−ＤＮＡ（化合物７ｃ）の製造
【０１２８】
【化１１】
【０１２９】
７ｂのＣＨ３ＣＮ−ＴＨＦ（３：１，８ｍＬ）溶液に２−シアノエチル Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホジアミダイト（０．４０ｍＬ，１．２５ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルアンモニウム テトラゾリドを室温で加え、１６時間室温で攪拌した。反応混合物をＡｃＯＥｔで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液、水および飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄した。ついで、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ｎ−ｈｅｘａｎｅ ｗｉｔｈ １％Ｅｔ３Ｎ＝１：３→１：２）で精製し、少量の不純物を含む所望の化合物を得た。残渣をＡｃＯＥｔおよびｎ−ヘキサンで再沈殿させ、無色固体として７ｃ（６６０ｍｇ，８７％）を得た。
Ｍｐ ９３−９５℃．
Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）：７５０（ＭＮａ＋）．
３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ １４９．５，１５０．５．
【０１３０】
実施例３ 核酸プローブの酸加水分解
標的となるシングルストランドＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）およびｓｓＲＮＡと相補的な配列を有し、かつ本発明の核酸単位構造を含む核酸プローブ（配列番号１）を合成した。ついで、この標識核酸プローブ（３３３ｐｍｏｌ）を同モルの標的ｓｓＤＮＡ（配列番号２）またはｓｓＲＮＡ（配列番号３）にハイブリダイズさせ、その後酸加水分解を行った。酸加水分解反応は、１００ｍＭクエン酸ナトリウム−塩酸緩衝液（ｐＨ４．０）８．５ μＬを加えてｐＨを４．０±０．１とすることで開始した。一定時間経過後、反応液１５ μＬを分取し、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１１５ μＬにより中和し、完全長のオリゴヌクレオチド残量を逆相ＨＰＬＣにより分析し、定量することで切断されていない標識核酸プローブ（図２中、オリゴヌクレオチドと記載）の割合を計算した。コントロールとして、ハイブリダイズさせない場合についても実験を行った。結果を図２に示す。ＨＰＬＣは島津ＬＣ−２０システム（ＬＣ−２０ＡＢ，ＳＰＤ−２０Ａ，ＣＴＯ−２０Ａ，ＳＩＬ−２０Ａ）を用いた。
〔ＨＰＬＣ定量条件〕
溶解液：Ａ液（０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液：ｐＨ７．０）
Ｂ液（０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液：アセトニトリル＝１：１，ｐＨ７．０）
グラジエント：６−１２％ Ｂ液（１５ｍｉｎ）
使用カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ（登録商標）ＭＳ Ｃ１８ ２．５μｍ（４．６×５０ｍｍ）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：５０℃
検出：ＵＶ（２５４ｎｍ）
【０１３１】
配列番号１ ５’−ｄ（ＴＴＴＴＴｍＣＴＸＹｍＣＴｍＣＴｍＣＴ）−３’
（但し、ｍＣは２’−デオキシ−５−メチルシチジンを、Ｘは核酸単位構造（ＩＩ）（Ｒ８＝Ｍｅ，Ｒ９＝Ｈ，Ｒ１０＝Ｈ，Ｂ＝Ｔ）を、Ｙは２’，４’−ＢＮＡ−Ｔをそれぞれ示す）
配列番号２ ５’−ｄ（ＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡ）−３’
配列番号３ ５’−ｒ（ＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡ）−３’
【０１３２】
この結果、例えば反応後１０分の時点でｓｓＲＮＡとハイブリダイズした本発明の核酸単位構造を含むプローブは約６０％の分解が認められた。また、ｓｓＤＮＡとハイブリダイズした本発明の核酸単位構造を含むプローブでは約４０％の分解が認められた。一方で、ハイブリダイズさせていない場合では全く分解が認められていない。このように、本発明の核酸単位構造を含むプローブはｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡとハイブリダイズすることで、酸加水分解されやすくなることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明の標的核酸の検出方法によれば、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体をプローブとして用いることにより、標的核酸を増幅することなく、標的核酸に結合することにより切断されたプローブを検出することができる。そのため、従来の核酸増幅工程や特殊な酵素を利用する必要がある核酸検出方法に比べて、簡便、迅速かつ高精度な核酸検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】本発明の標的核酸の検出方法の概念図である。
【図２】一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡを標的としたオリゴヌクレオチド類縁体の酸加水分解を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規人工核酸、該核酸を含有するオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドを用いた標的核酸の検出方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
膨大なゲノムの塩基配列情報を研究や医療の現場で幅広く活用するために、ＤＮＡやＲＮＡの配列解析方法の開発が望まれている。中でも、病気のマーカー遺伝子の発現状況や、ウイルスなどの病原微生物感染を検査するための遺伝子検査方法は、健康の維持管理や病気のリスクマネージメント、最適治療法の選択などにおいて重要な役割を果たす。
しかしながら、従来から用いられている遺伝子検査方法は、遺伝子の検出感度が十分でない；遺伝子の検出感度を上げるために、煩雑な遺伝子増幅過程を要する；あるいは、遺伝子増幅過程を単純化させるために、特殊なプライマー設計（例、ループプライマー、キメラプライマー）を要し、特殊な酵素を使用する；実験系が複雑である；などの多くの改良すべき問題点がある。特に、現在遺伝子検査の場において多用されているＰＣＲ法は、その原理的な制約から反応温度を大きく上下に変化させつつ、酵素反応を数十ステップ繰り返すことを要するため、操作が煩雑であり、速やかに遺伝子を検出することが困難である。
したがって、これらの方法に代わる迅速簡便な遺伝子検査方法が切望されている。
【０００３】
本発明者らは、５’−アミノ−２’，４’−ＢＮＡと称する下記化学式：
【０００４】
【化１】
【０００５】
（式中、Ａは、直接結合、炭素数１〜４のアルキレン基、−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−（ここで、酸素原子は４’位のメチレン基と結合している。ｍは１〜３の整数を示す。）、または、−Ｎ（Ｒ４）−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、窒素原子は４’位のメチレン基と結合している。ｎは１〜３の整数を示す。）を示す。Ｂは、置換基を有していてもよい芳香族複素環基もしくは芳香族炭化水素基を示す。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、同一または異なって、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アラルキル基、アリール基、アシル基、シリル基、リン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ７）Ｒ８［式中、Ｒ７およびＲ８は、同一または異なって、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、炭素数１〜６のシアノアルコキシ基、または、炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基を示す。］を示す。）で示されるヌクレオシド類縁体（特許文献１）、または５’−アミノ−ＤＮＡを用いてＰ３’→Ｎ５’ホスホロアミダート結合を有する人工核酸プローブを開発し、かかる人工核酸プローブを用いた三重鎖核酸形成を基盤とした標的核酸の検出方法を確立した（特許文献２）。特許文献２の検出方法は、用いる人工核酸の特性により、二重鎖核酸に優先的に結合し、ｄｓＤＮＡ，ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡなど）の検出に好適に用いられる。また、別の研究グループは、Ｐ３’−Ｎ５’ホスホロアミダート結合を有する人工核酸を用いて、ゲノム配列の多型のハイスループット解析（非特許文献１参照）や細胞内での配列特異的転写阻害（非特許文献２参照）を報告している。
【０００６】
他方、従来のセントラルドグマ（ＤＮＡ→ＲＮＡ→タンパク質）で定義付けられていた転写産物であるｍＲＮＡ以外にも、多数のｎｃＲＮＡ（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）の存在が知られており、これらの一本鎖核酸も遺伝子の発現制御やタンパク質の機能発現に関与していることが近年の研究で判明している。これにより、プロモーターの再定義の必要性や、触媒機能を有するＲＮＡや他の遺伝子の転写、翻訳に関与するＲＮＡを発見することなど、細胞内における一本鎖核酸の配列とその役割を解明する重要性が高まってきている。
【０００７】
しかしながら、例えば、ＰＣＲの原理に基づく方法でこれら一本鎖核酸を検出するためには、ＲＮＡの場合は逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、二本鎖のＤＮＡを鋳型として増幅して検出するという迂遠な操作が必要であった。従って、一本鎖核酸を簡便かつ迅速に検出可能な新規な方法論も求められている。
【特許文献１】国際公開第０３／０６８７９５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００７／０２６８２３号パンフレット
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．９７，３８６２−３８６７（２０００）
【非特許文献２】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９，３８６４−３８７２（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、一本鎖核酸の迅速、簡便かつ高精度な検出方法およびそれに用いられる新規人工核酸を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、５’位の窒素原子によりホスホロアミダート結合を、２’位でリン酸エステル結合を形成可能な人工核酸を合成し、かかる人工核酸を含むオリゴヌクレオチドをプローブとして用いることにより、標的核酸ではなく標的核酸と結合するプローブを検出する、すなわち、標的核酸を増幅せずに検出プローブを増幅するという方法論を確立させることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］式（Ｉ）
【００１１】
【化２】
【００１２】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、アシル基、シリル基、核酸合成の保護基、置換されていてもよいリン酸基、または−Ｐ（Ｒ６）Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいメルカプト基もしくは置換されていてもよいアミノ基を示す。］で表される基を示し、
Ｒ３は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、アシル基、シリル基、Ｃ１−６アルキル基で置換されていてもよいアミノ基、核酸合成の保護基、置換されていてもよいリン酸基、または−Ｐ（Ｒ６）Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、前記と同義を示す］で表される基を示し、
Ｒ４およびＲ５は、同一または異なって、水素原子、置換されていてもよい水酸基またはＣ１−６アルキル基を示すか、あるいはＲ４およびＲ５は、一緒になって、オキシＣ１−４アルキレン基を形成し、
Ｂは、下記α群から選択される置換基で置換されていてもよいプリン−９−イルまたは２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を示す。）
で表される化合物（以下、化合物（Ｉ）と記載する）またはその塩、
（α群）
ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキルチオ基、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいメルカプト基および置換されていてもよいアミノ基。
［２］Ｒ１およびＲ２が、同一または異なって、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ７−１６アラルキル基または核酸合成の保護基を示し、
Ｒ３が、水素原子または−ＰＲ６Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、置換されていてもよい水酸基もしくは置換されていてもよいアミノ基を示す。］で表される基を示し、
Ｒ４およびＲ５が、水素原子を示すか、あるいはＲ４およびＲ５が、一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成する、［１］記載の化合物、
［３］式（ＩＩ）
【００１３】
【化３】
【００１４】
（式中、
Ｒ８は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、アシル基、シリル基、核酸合成の保護基、置換されていてもよいリン酸基、または−Ｐ（Ｒ６）Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいメルカプト基もしくは置換されていてもよいアミノ基を示す。］で表される基を示し、
Ｒ９およびＲ１０は、同一または異なって、水素原子、置換されていてもよい水酸基またはＣ１−６アルキル基を示すか、あるいはＲ９およびＲ１０は、一緒になって、オキシＣ１−４アルキレン基を形成し、
Ｂは、下記α群から選択される置換基で置換されていてもよいプリン−９−イルまたは２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を示す。）
で表される核酸単位構造を少なくとも一つ含有する、オリゴヌクレオチド類縁体（以下、核酸単位構造（ＩＩ）と記載する）またはその塩、
（α群）
ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキルチオ基、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいメルカプト基および置換されていてもよいアミノ基。
［４］Ｒ８が、水素原子、Ｃ１−６アルキル基またはＣ７−１６アラルキル基を示し、
Ｒ９およびＲ１０が、同一または異なって、水素原子を示すか、あるいはＲ９およびＲ１０が、一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成する、［３］記載のオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩、
［５］２’，４’−ＢＮＡ、３’，４’−ＢＮＡ、２’−ｄｅｏｘｙ−３’−Ｎ−３’，４’−ＢＮＡ、３’−Ｎ−２’，４’−ＢＮＡ、５’−Ｎ−２’，４’−ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＣＯＣおよび２’，４’−ＢＮＡＮＣからなる群から選択される架橋された人工核酸がさらに少なくとも一つ組み込まれている、［３］または［４］に記載のオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩、
［６］一つ以上の核酸単位構造または核酸が標識されている、［３］〜［５］のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩。
［７］標識が蛍光基および消光基の組み合わせである、［３］〜［６］のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩、
［８］［３］〜［７］のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド類縁体をプローブとして用いることを特徴とする標的核酸の検出方法、
［９］［３］〜［７］のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド類縁体をプローブとして、標的核酸とハイブリダイズさせる工程、
ハイブリダイズした標的核酸−プローブ複合体を酸性条件下で処理する工程、および
処理工程で切断されたプローブを検出する工程
を含む標的核酸の検出方法、
［１０］ハイブリダイズさせる工程と処理工程が同一の工程で行われる、［９］に記載の検出方法、
［１１］標的核酸が一本鎖核酸である［８］〜［１０］のいずれか１項に記載の検出方法、
などに関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の化合物（Ｉ）は、５’位の窒素原子によりホスホロアミダート結合を、２’位でリン酸エステル結合を形成可能な人工核酸として機能する。かかる化合物を用いて、オリゴヌクレオチド類縁体を容易に合成することができる。
【００１６】
本発明のオリゴヌクレオチド類縁体によれば、化合物（Ｉ）を用いて形成された核酸単位構造（ＩＩ）を含むことから、ＲＮＡ等の一本鎖核酸との結合力に優れ、一本鎖核酸とハイブリダイズした際に、２’→５’エステル結合に起因する構造上のひずみを大きくさせることにより、５’位のホスホロアミダート結合の切断を酸性条件下で容易に進行させることができる。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、一本鎖核酸との二重鎖形成中に酸性条件下で自己切断が可能である。
【００１７】
本発明の標的核酸の検出方法によると、前記オリゴヌクレオチド類縁体をプローブとして用いることにより、標的核酸ではなく標的核酸と結合するプローブを検出する、すなわち、標的核酸を増幅せずに切断されたプローブが検出対象のプローブとして増幅される原理を利用して、核酸増幅工程や特殊な酵素を用いることなく、簡便、迅速かつ高精度な核酸の配列情報を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本明細書中において使用する各置換基および各記号などの定義は次の通りである。なお、本明細書中、「置換されていてもよい」とは、単に種々の置換基（例えば、置換基Ｘと記載する）で置換されていてもよいことを示すだけでなく、種々の保護基（例えば、保護基Ｙと記載する。）で「保護」されていてもよいことを含むものである。よって、本明細書中、「置換基Ｘで置換されていてもよい」なる記載が意図する概念には、「保護基Ｙで保護されていてもよい」概念が包含される。具体的には、
「置換基Ｘで置換されていてもよい水酸基」には、例えば、「保護基Ｙで保護されていてもよい水酸基」が含まれる。
「置換基Ｘで置換されていてもよいメルカプト基」には、例えば、「保護基Ｙで保護されていてもよいメルカプト基」が含まれる。
「置換基Ｘで置換されていてもよいアミノ基」には、例えば、「保護基Ｙで保護されていてもよいアミノ基」が含まれる。
【００１９】
「ハロゲン原子」としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子が挙げられる。
「Ｃ１−６アルキル基」としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などの直鎖または分枝鎖のＣ１−６アルキル基が挙げられる。
「Ｃ２−６アルケニル基」としては、例えば、ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基（アリル基）、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、１−ペンテニル基、１−ヘキセニル基などの直鎖または分枝鎖のＣ２−６アルケニル基が挙げられる。
「Ｃ２−６アルキニル基」としては、例えば、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基、１−ペンチニル基、１−ヘキシニル基などの直鎖または分枝鎖のＣ２−６アルキニル基が挙げられる。
「Ｃ３−１０シクロアルキル基」としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、ビシクロ［３．１．１］ヘプチル基、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル基、ビシクロ［２．２．２］オクチル基、ビシクロ［３．２．１］オクチル基、ビシクロ［３．２．２］ノニル基、ビシクロ［３．３．１］ノニル基、ビシクロ［４．２．１］ノニル基、ビシクロ［４．３．１］デシル基、アダマンチル基等が挙げられる。
【００２０】
「Ｃ６−１４アリール基」としては、例えば、フェニル基、ナフチル基などが挙げられる。
「Ｃ７−１６アラルキル基」としては、例えば、ベンジル基、１−フェニルエチル基、２−フェニルエチル基などが挙げられる。
「Ｃ７−１６アラルキルオキシ基」としては、例えば、ベンジルオキシ基、１−フェニルエチルオキシ基、２−フェニルエチルオキシ基などが挙げられる。
【００２１】
「Ｃ１−６アルコキシ基」としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基などの直鎖または分枝鎖のＣ１−６アルコキシ基が挙げられる。
「Ｃ２−６アルケニルオキシ基」としては、例えば、エテニルオキシ基、ｎ−プロピニルオキシ基、イソプロピニルオキシ基、ｎ−ブテニルオキシ基、イソブテニルオキシ基、ｓｅｃ−ブテニルオキシ基、ｔｅｒｔ−ブテニルオキシ基、ペンテニルオキシ基、ヘキシニルオキシ基などの直鎖または分枝鎖のＣ２−６アルケニルオキシ基が挙げられる。
「Ｃ１−６アルキルチオ基」としては、例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ−プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ｎ−ブチルチオ基、イソブチルチオ基、ｓｅｃ−ブチルチオ基、ｔｅｒｔ−ブチルチオ基、ペンチルチオ基、ヘキシルチオ基などの直鎖または分枝鎖のＣ１−６アルキルチオ基が挙げられる。
「Ｃ６−１４アリールチオ基」としては、例えば、フェニルチオ基、ナフチルチオ基が挙げられる。
【００２２】
「Ｃ１−４アルキレン基」としては、例えばメチレン基、エチレン基、ｎ−プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ−ブチレン基、イソブチレン基、ｓｅｃ−ブチレン基、ｔｅｒｔ−ブチレン基等のＣ１−４アルキレン基が挙げられる。
「オキシＣ１−４アルキレン基」としては、例えばオキシメチレン基、オキシエチレン基、オキシ−ｎ−プロピレン基、オキシイソプロピレン基、オキシ−ｎ−ブチレン基、オキシイソブチレン基、オキシ−ｓｅｃ−ブチレン基、オキシ−ｔｅｒｔ−ブチレン基等のオキシＣ１−４アルキレン基が挙げられる。
【００２３】
「シリル基」としては、例えば、トリＣ１−６アルキル−シリル基（例、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ−ｔ−ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジフェニルメチルシリル基、ジフェニルｔ−ブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリル基等）が挙げられる。これらの基は、ハロゲン原子およびＣ６−１４アリール基から選択される１〜３個の置換基でさらに置換されていてもよい
【００２４】
「アシル基」としては、例えば、ホルミル基、カルボキシル基、Ｃ１−２１アルキル−カルボニル基（例、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、デカノイル基、８−メチルノナノイル基、３−エチルオクタノイル基、３，７−ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、トリデカノイル基、ヘキサデカノイル基、１４−メチルペンタデカノイル基、１３，１３−ジメチルテトラデカノイル基、１−メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、イコサノイル基、ヘンイコサノイル基等）、Ｃ２−６アルケニル−カルボニル基（例、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノイル基等）、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基（例、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基等）、カルボキシ−Ｃ１−６アルキル−カルボニル基（例、スクシニル基、グルタリル基、アジポイル基等）、Ｃ３−８シクロアルキル−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基（例、ベンゾイル基、α−ナフトイル基、β−ナフトイル基等）、Ｃ２−６アルケニルオキシ−カルボニル基（例、ビニルオキシ−カルボニル基、アリルオキシ−カルボニル基等）、Ｃ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル基（例、ベンジルオキシカルボニル基等）、カルバモイル基、Ｃ１−６アルキル−スルホニル基などが挙げられる。これらの基は、ハロゲン原子、カルボキシル基、ニトロ基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基およびシリル基から選択される１〜５個の置換基でさらに置換されていてもよい。
ここで、「カルボキシ−Ｃ１−６アルキル−カルボニル基」および「Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル−カルボニル基」における「Ｃ１−６アルキル」、「Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基」および「Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル−カルボニル基」における「Ｃ１−６アルコキシ」、「Ｃ３−８シクロアルキル−カルボニル基」における「Ｃ３−８シクロアルキル」、「Ｃ６−１４アリール−カルボニル基」における「Ｃ６−１４アリール」、「Ｃ１−６アルキル−スルホニル基」における「Ｃ１−６アルキル」、「Ｃ２−６アルケニルオキシ−カルボニル基」における「Ｃ２−６アルケニルオキシ」、「Ｃ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル基」における「Ｃ７−１６アラルキルオキシ」としては、それぞれ、上記「Ｃ１−６アルキル基」、「Ｃ１−６アルコキシ基」、「Ｃ３−１０シクロアルキル基」、「Ｃ６−１４アリール基」、「Ｃ２−６アルケニルオキシ基」、「Ｃ７−１６アラルキルオキシ基」が例示される。
また、上記「アシル基」として例示される基が置換されていてもよい置換基として挙げられた、「Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基」における「Ｃ１−６アルコキシ」としては、上記「Ｃ１−６アルコキシ基」が例示される。
【００２５】
「核酸合成の保護基」としては、核酸、好ましくは式（Ｉ）で表される化合物や式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチド類縁体を合成する際に安定に各置換基を保護し得るものであれば、特に限定されないが、例えば、
（１）核酸合成の際に水酸基を安定に保護し得る基（本明細書中、「水酸基の核酸合成の保護基」と記載する）、
（２）核酸合成の際にアミノ基を安定に保護し得る基（本明細書中、「アミノ基の核酸合成の保護基」と記載する）、
（３）核酸合成の際にリン酸基を安定に保護し得る基（本明細書中、「リン酸基の核酸合成の保護基」と記載する）、
（４）核酸合成の際にメルカプト基を安定に保護し得る基（本明細書中、「メルカプト基の核酸合成の保護基」と記載する）
が挙げられる。
【００２６】
上記（１）〜（４）の基は、それぞれが保護対象とする置換基に対してのみ適用されるわけではなく、可能であれば別の欄に記載された置換基を用いてもよい。例えば、（２）の基が保護対象とする「アミノ基」を保護するために（１）の「水酸基の核酸合成の保護基」を用いてもよいし、（１）の基が保護対象とする「水酸基」の保護に（２）の「アミノ基の核酸合成の保護基」を用いてもよい。
【００２７】
上記（１）の「水酸基の核酸合成の保護基」としては、例えば、アシル基；テトラヒドロピラニル基またはテトラヒドロチオピラニル基（例、テトラヒドロピラン−２−イル基、３−ブロモテトラヒドロピラン−２−イル基、４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル基、テトラヒドロチオピラン−２−イル基、４−メトキシテトラヒドロチオピラン−４−イル基等）；テトラヒドロフラニル基またはテトラヒドロチオフラニル基（例、テトラヒドロフラン−２−イル基、テトラヒドロチオフラン−２−イル基等）；シリル基；Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル基（例、メトキシメチル基、１，１−ジメチル−１−メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、ｔ−ブトキシメチル基、１−エトキシエチル基、１−（イソプロポキシ）エチル基等）；Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルコキシ−メチル基（例、２−メトキシエトキシメチル基等）；ハロゲン原子で置換されたアルコキシメチル基（例、２，２，２−トリクロロエトキシメチル基、ビス（２−クロロエトキシ）メチル基）；１〜３個のハロゲン原子で置換されたエチル基（例、２，２，２−トリクロロエチル基）；１〜３個のＣ６−１４アリール基で置換されたメチル基（例、ベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、９−アンスリルメチル基）；Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ハロゲン原子およびシアノ基から選択される置換基でアリール環が置換された１〜３個のＣ６−１４アリール基で置換されたメチル基（例、４−メチルベンジル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、３，４，５−トリメチルベンジル基、４−メトキシベンジル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、２−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、４−クロロベンジル基、４−ブロモベンジル基、４−シアノベンジル基等）；Ｃ１−６アルケニルオキシ−カルボニル基（例、ビニルオキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基等）；等が挙げられる。
なお、本明細書中、「トリフェニルメチル基」を「トリチル基」と記載する場合がある。またトリチル基の置換基は、特に記載のない限り、フェニル部分のパラ位に位置する。
【００２８】
上記（２）の「アミノ基の核酸合成の保護基」としては、例えばアシル基が挙げられる。該基は、ハロゲン原子、カルボキシル基、ニトロ基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基およびシリル基から選択される１〜５個の置換基でさらに置換されていてもよい。
【００２９】
上記（３）の「リン酸基の核酸合成の保護基」としては、例えば、Ｃ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルケニル基；Ｃ６−１４アリール基；Ｃ７−１６アラルキル基等が挙げられる。これらの基は、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基およびＣ１−６アルキル基から選択される１〜５個の置換基でさらに置換されていてもよい。
【００３０】
上記（４）の「メルカプト基の核酸合成の保護基」としては、例えば、前記（１）「水酸基の核酸合成の保護基」の定義において挙げられた基に加え、Ｃ１−６アルキルチオ基、Ｃ６−１４アリールチオ基等の「ジスルフィド結合を形成可能な基」が挙げられ、好ましくはアシル基であり、さらに好ましくはベンゾイル基である。
【００３１】
本明細書中、「オキシＣ１−４アルキレン基」とは、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−〔式中、ｎは、１〜４の整数を示す〕で表される基のことをいい、例えば、−Ｏ−（ＣＨ２）−〔オキシメチレン基〕、−Ｏ−（ＣＨ２）２−〔オキシエチレン基〕等が挙げられる。
【００３２】
本明細書中、「ホスホロアミダイト基」とは、式−Ｐ（ＯＲ’）（Ｎ〔Ｒ’’〕２）（式中、Ｒ’は、シアノ基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基を示し、Ｒ’’は、Ｃ１−６アルキル基を示す）で表される基のことをいう。なかでも、式−Ｐ（ＯＣ２Ｈ４ＣＮ）（Ｎ〔ＣＨ（ＣＨ３）２〕２）で表される基または式−Ｐ（ＯＣＨ３）（Ｎ〔ＣＨ（ＣＨ３）２〕２）で表される基が好ましく用いられる。
【００３３】
本明細書中、「ホスホロアミダート結合」とは、リン酸基中のリン原子と窒素原子により形成された結合（以下、Ｐ−Ｎ結合と記載する場合がある）のことをいい、特に限定されないが、好ましくは、前記ホスホロアミダイト基中のＰ−Ｎ結合が例示される。
本発明の化合物およびオリゴヌクレオチドは、当該ホスホロアミダート結合を含む場合、後述する標的核酸とのハイブリダイズの後、後述する酸性条件下で切断され、標的核酸から脱離する。
【００３４】
本発明は、化合物（Ｉ）またはその塩を提供する。
【００３５】
化合物（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３で示される「核酸合成の保護基」としては、好ましくは、水酸基の核酸合成の保護基である。
当該「水酸基の核酸合成の保護基」につき、Ｒ１およびＲ２においては、アシル基、シリル基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、１〜３個のＣ６−１４アリール基で置換されたメチル基、ハロゲン原子およびシアノ基から選択される置換基でアリール環が置換された１〜３個のＣ６−１４アリール基で置換されたメチル基が好ましく、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基またはｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基がさらに好ましい。
一方、Ｒ３においては、アシル基、シリル基、１〜３個のＣ６−１４アリール基で置換されたメチル基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ハロゲン原子およびシアノ基から選択される置換基でアリール環が置換された１〜３個のＣ６−１４アリール基で置換されたメチル基が好ましく、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基がさらに好ましい。
【００３６】
化合物（Ｉ）において、Ｒ１およびＲ３で示される「置換されていてもよいリン酸基」の「リン酸基」が有していてもよい置換基としては、例えば、核酸合成の保護基が挙げられる。
当該保護基としては、好ましくはリン酸基の核酸合成の保護基が挙げられ、特に好ましくは、ハロゲン原子およびシアノ基から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、ハロゲン原子およびニトロ基から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいＣ７−１６アラルキル基、またはハロゲン原子、ニトロ基およびＣ１−６アルキル基から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいＣ６−１４アリール基が挙げられる。最も好ましくは、２−シアノエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、ベンジル基、２−クロロフェニル基または４−クロロフェニル基が挙げられる。
【００３７】
化合物（Ｉ）において、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびα群で示される「置換されていてもよい水酸基」の「水酸基」が有していてもよい置換基としては、例えば、シアノ基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、核酸合成の保護基が挙げられる。
上記「核酸合成の保護基」としては、好ましくはアミノ基の核酸合成の保護基または水酸基の核酸合成の保護基が挙げられ、特に好ましくは水酸基の核酸合成の保護基が挙げられる。
当該「水酸基の核酸合成の保護基」としては、好ましくは、アシル基、シリル基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、ハロゲン原子、シアノ基およびＣ１−６アルコキシ基から選択される１〜５個の置換基でアリール環が置換されていてもよい１〜３個のＣ６−１４アリール基で置換されたメチル基が挙げられ、さらに好ましくは、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基（特に好ましくは、４−メトキシトリチル基）、ジメトキシトリチル基またはｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基が挙げられる。
また、「シアノ基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基」としては、好ましくは、メチル基、エチル基、シアノメチル基、シアノエチル基が挙げられ、より好ましくは、メチル基、シアノエチル基が挙げられる。
【００３８】
化合物（Ｉ）において、Ｒ６、Ｒ７およびα群で示される「置換されていてもよいメルカプト基」の「メルカプト基」が有していてもよい置換基としては、核酸合成の保護基が挙げられる。
上記「核酸合成の保護基」としては、Ｒ１およびＲ２で示される核酸合成の保護基の好ましい例として挙げられた「水酸基の核酸合成の保護基」で例示された基と同様の基が挙げられる。
【００３９】
化合物（Ｉ）において、Ｒ６、Ｒ７およびα群で示される「置換されていてもよいアミノ基」の「アミノ基」が有していてもよい置換基としては、Ｃ１−６アルキル基、核酸合成の保護基が挙げられる。置換基の数は１または２であり、置換基の数が２の場合、各置換基は同一または異なっていてもよい。
上記「核酸合成の保護基」としては、好ましくはアミノ基の核酸合成の保護基が挙げられ、より好ましくは、ハロゲン原子、カルボキシル基、ニトロ基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基およびシリル基から選択される１〜５個の置換基でさらに置換されていてもよいＣ１−２１アルキル−カルボニル基、Ｃ２−６アルケニル−カルボニル基またはＣ６−１４アリール−カルボニル基、あるいはＣ１−６アルコキシ基およびニトロ基から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよいＣ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル基が挙げられる。また、さらに好ましくは、ハロゲン原子、カルボキシル基、Ｃ１−６アルコキシ基およびＣ６−１４アリール基から選択される１〜５個の置換基でさらに置換されていてもよいＣ１−２１アルキル−カルボニル基、またはＣ２−６アルケニル−カルボニル基、あるいはＣ１−６アルコキシ基およびニトロ基から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよいＣ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル基が挙げられ、最も好ましくは、トリフルオロアセチル基またはベンジルオキシカルボニル基が挙げられる。
【００４０】
化合物（Ｉ）において、Ｒ４およびＲ５が、一緒になって形成する、「オキシＣ１−４アルキレン基」中の酸素原子は、化合物（Ｉ）中の五単糖部分の３位に結合してもよい（３’−Ｏ，４’−Ｃ−アルキレン架橋を形成してもよい）し、４位に結合してもよい（４’−Ｏ，３’−Ｃ−アルキレン架橋を形成してもよい）が、３位に結合することが好ましい。
「オキシＣ１−４アルキレン基」としては、好ましくはオキシメチレン基、オキシエチレン基である。
【００４１】
化合物（Ｉ）において、Ｂで示される「プリン−９−イル基」としては、特に限定されないが、好ましくは、６−アミノプリン−９−イル基（すなわち、アデニニル基）、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された６−アミノプリン−９−イル基、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基（すなわち、グアニニル基）、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、アミノ基および水酸基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基が挙げられ、より好ましくは、６−ベンゾイルアミノプリン−９−イル基、アデニニル基、２−イソブチリルアミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、グアニニル基が挙げられる。
【００４２】
化合物（Ｉ）において、Ｂで示される「２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基」としては、特に限定されないが、好ましくは、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（すなわち、シトシニル基）、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−アミノ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−オキソ−４−アミノ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（すなわち、ウラシニル基）、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（すなわち、チミニル基）、４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（すなわち、５−メチルシトシニル基）またはアミノ基が核酸合成の保護基で保護された４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基が挙げられ、より好ましくは、２−オキソ−４−ベンゾイルアミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、シトシニル基、２−オキソ−５−メチル−４−ベンゾイルアミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、５−メチルシトシニル基、ウラシニル基またはチミニル基が挙げられる。
【００４３】
化合物（Ｉ）において、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ７−１６アラルキル基または水酸基の核酸合成の保護基であることが好ましく、なかでも、水素原子、メチル基、エチル基、ベンジル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基であることがさらに好ましい。
【００４４】
化合物（Ｉ）において、Ｒ３は、水素原子または−Ｐ（Ｒ６）Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、置換されていてもよい水酸基もしくは置換されていてもよいアミノ基を示す。］で表される基であることが好ましく、なかでも、水素原子または−Ｐ（Ｒ６）Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、シアノ基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基で置換されていてもよい水酸基、もしくはＣ１−６アルキル基で置換されていてもよいアミノ基を示す。］であることがさらに好ましく、水素原子またはホスホロアミダイト基であることが特に好ましく、水素原子または式−Ｐ（ＯＣ２Ｈ４ＣＮ）（Ｎ〔ＣＨ（ＣＨ３）２〕２）で表される基または式−Ｐ（ＯＣＨ３）（Ｎ〔ＣＨ（ＣＨ３）２〕２）で表される基であることが最も好ましい。
【００４５】
化合物（Ｉ）において、Ｒ４およびＲ５は、いずれも水素原子であるか、あるいは一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成することが好ましい。
【００４６】
化合物（Ｉ）は、種々の塩を形成することができる。
化合物（Ｉ）の塩としては、例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩等があげられる。
【００４７】
金属塩の好適な例としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩等があげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、トロメタミン〔すなわち、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン〕、ｔｅｒｔ−ブチルアミン等との塩があげられる。
無機酸との塩の好適な例としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等との塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等との塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えば、アルギニン、リジン、オルニチン等との塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等との塩があげられる。
【００４８】
化合物（Ｉ）は水和物および非水和物のいずれであってもよい。化合物（Ｉ）の水和物としては、例えば、０．５水和物、１水和物、１．５水和物および２水和物等があげられる。また、自体公知の溶媒との溶媒和物であってもよい。
【００４９】
化合物（Ｉ）は同位元素（例、２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３３Ｐ、３５Ｓなど）などで標識されていてもよい。
本発明の化合物（Ｉ）は、上記の水和物、溶媒和物等の種々の化合物をも包含する。
【００５０】
本発明の化合物（Ｉ）としては、
Ｒ１およびＲ２が、同一または異なって、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ７−１６アラルキル基または水酸基の核酸合成の保護基を示し、
Ｒ３が、水素原子または−ＰＲ６Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、置換されていてもよい水酸基もしくは置換されていてもよいアミノ基を示す。］で表される基を示し、かつ
Ｒ４およびＲ５が、水素原子を示すか、あるいはＲ４およびＲ５が、一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成する、化合物（Ｉ）が好ましい。
【００５１】
さらに、本発明の化合物（Ｉ）としては、
Ｒ１およびＲ２が、同一または異なって、水素原子、メチル基、エチル基、ベンジル基、トリチル基またはモノメトキシトリチル基を示し、
Ｒ３が、水素原子またはホスホロアミダイト基を示し、かつ
Ｒ４およびＲ５が、水素原子を示すか、あるいはＲ４およびＲ５が、一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成する、化合物（Ｉ）がより好ましい。
【００５２】
また、本発明の化合物（Ｉ）としては、
Ｒ１およびＲ２のいずれか一方が、メチル基、エチル基またはベンジル基を示し、もう一方が、トリチル基またはモノメトキシトリチル基を示し、
Ｒ３が、ホスホロアミダイト基を示し、かつ
Ｒ４およびＲ５が、水素原子を示すか、あるいはＲ４およびＲ５が、一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成する、化合物（Ｉ）が最も特に好ましい。
【００５３】
本発明の化合物（Ｉ）は、例えば、以下の方法で製造することが可能である。
【００５４】
【化４】
【００５５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＢは、前記と同義であり、Ｒ’は、アシル基を示す。）
【００５６】
なお、本明細書中、「室温」とは、特に記載されない限り、１０℃〜４０℃の範囲内の温度、好ましくは１５℃〜３５℃の範囲内の温度をいう。
【００５７】
工程１
工程１は、化合物（１）に、式Ｒ１ＮＨ２（式中、Ｒ１は、前記と同義である）で表される化合物を付すことで、化合物（２）を得る反応である。
【００５８】
化合物（１）は、自体公知の方法を利用することで製造することができる。当該製造方法としては、例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９２，３３，４１４９に記載の方法や、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００１，６６，８５０４−８５１２に記載の方法などが挙げられる。
【００５９】
化合物（１）中、Ｒ’で表される基としては、好ましくは、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ１−６アルキル−スルホニル基である。より好ましくはＣ１−６アルキル−スルホニル基であり、特に好ましくはメシル基（メタンスルホニル基）である。
【００６０】
式Ｒ１ＮＨ２で表される化合物中、Ｒ１で表される基としては、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ７−１６アラルキル基または水酸基の核酸合成の保護基が好ましく、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ７−１６アラルキル基がより好ましく、メチル基、エチル基、ベンジル基が特に好ましい。当該化合物は、化合物（１）１モルに対し、通常１モル〜２０００モル用いるが、４モル〜１０００モル用いることが好ましい。
【００６１】
本工程による反応は、溶媒中で行っても無溶媒で行ってもよい。使用できる溶媒としては、本工程に影響を与えない限り特に限定されないが、好ましくは自体公知の極性溶媒であり、特に好ましくは、イソプロパノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、アセトンなどである。溶媒の使用量は、化合物（１）１ｇに対して５ｍＬ〜３０ｍＬ、好ましくは１０ｍＬ〜２０ｍＬである。
【００６２】
また、本工程は密閉した空間内で行うことが好ましい。
本工程の反応温度は特に限定されないが、０℃〜５０℃で行うことが好ましく、室温で行うことがさらに好ましい。反応時間は、使用する試薬や溶媒の量、反応温度によっても異なるが、通常１時間〜１００時間、好ましくは２４時間〜４８時間である。
【００６３】
本工程で得られた化合物（２）は、反応混合物から自体公知の手段、例えば抽出、濃縮、中和、濾過、蒸留、再結晶、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、分取用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、中圧分取液体クロマトグラフィー（中圧分取ＬＣ）等の手段を用いることによって単離・精製することができるが、反応混合物のまま次工程２に付すこともできる。
【００６４】
上記反応により、目的物が遊離の状態で得られる場合には、常法に従って塩に変換してもよく、また塩として得られる場合には、常法に従って遊離体または他の塩に変換することもできる。
さらに、化合物（２）は、化合物（２）の水和物、溶媒和物、立体異性体、光学異性体等の種々の化合物をも包含する。
【００６５】
工程２
工程２は、化合物（２）に、式Ｒ２Ｘ（式中、Ｒ２は、前記と同義であり、Ｘは、ハロゲン原子を示す）で表される化合物を付すことで、化合物（３）を得る反応である。
【００６６】
式Ｒ２Ｘで表される化合物中、Ｒ２で表される基としては、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ７−１６アラルキル基または水酸基の核酸合成の保護基が好ましく、水酸基の核酸合成の保護基がより好ましく、シアノ基およびＣ１−６アルコキシ基から選択される１〜５個の置換基でアリール環が置換されていてもよい１〜３個のＣ６−１４アリール基で置換されたメチル基が特に好ましい。当該化合物は、化合物（２）１モルに対し、通常０．５モル〜２モル用いるが、０．８モル〜１．２モル用いることが好ましい。
【００６７】
本工程による反応は、溶媒中で行っても無溶媒で行ってもよいが、通常、溶媒中で行われる。使用可能な溶媒としては反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、トリエチルアミン、ピリジンなど、またはこれらの混合溶媒が挙げられる。溶媒の使用量は、化合物（２）１ｇに対して５ｍＬ〜２０ｍＬ、好ましくは８ｍＬ〜１２ｍＬである。反応温度は、通常０℃〜５０℃、好ましくは室温である。反応時間は、使用する試薬や溶媒の量、反応温度によっても異なるが、通常１時間〜１２時間、好ましくは２時間〜６時間である。
【００６８】
本工程で得られた化合物（３）は、反応混合物から自体公知の手段、例えば抽出、濃縮、中和、濾過、蒸留、再結晶、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、分取用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、中圧分取液体クロマトグラフィー（中圧分取ＬＣ）等の手段を用いることによって単離・精製することができるが、反応混合物のまま次工程２に付すこともできる。
【００６９】
上記反応により、目的物が遊離の状態で得られる場合には、常法に従って塩に変換してもよく、また塩として得られる場合には、常法に従って遊離体または他の塩に変換することもできる。
【００７０】
本化合物（３）は、化合物（２）で説明したものと同様に、化合物（３）の水和物、溶媒和物、立体異性体、光学異性体等の種々の化合物をも包含する。
【００７１】
工程３
工程３は、化合物（３）から化合物（Ｉ）を得る反応である。化合物（３）中、Ｒ３は前記と同義である。上記反応において化合物（３）と反応する化合物は、当業者であれば適宜選択することが可能である。当該化合物としては、２−シアノエチル Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホジアミダイトが好ましく用いられる。
当該化合物は、化合物（３）１モルに対し、通常０．５モル〜２モル用いるが、０．８モル〜１．２モル用いることが好ましい。
【００７２】
本工程による反応は、溶媒中で行っても無溶媒で行ってもよいが、通常、溶媒中で行われる。使用可能な溶媒としては反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼン、アニソール、トルエン、メシチレン、キシレン、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸イソプロピル、アセトニトリル、プロピオニトリル、ジエチルエーテルなど、またはこれらの混合溶媒が挙げられる。溶媒の使用量は、化合物（３）１ｇに対して、通常１０ｍＬ〜４０ｍＬ、好ましくは２０ｍＬ〜３０ｍＬである。反応温度は、通常０℃〜５０℃、好ましくは室温である。反応時間は、使用する試薬や溶媒の量、反応温度によっても異なるが、通常１時間〜２４時間、好ましくは６時間〜１２時間である。
【００７３】
また、本工程には反応促進剤として、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリドなどを用いることができる。当該反応促進剤の使用量は、化合物（３）１モルに対して、通常０．５モル〜２モルである。
【００７４】
本工程で得られた化合物（Ｉ）は、反応混合物から自体公知の手段、例えば抽出、濃縮、中和、濾過、蒸留、再結晶、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、分取用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、中圧分取液体クロマトグラフィー（中圧分取ＬＣ）等の手段を用いることによって単離・精製することができる。
上記反応により、目的物が遊離の状態で得られる場合には、常法に従って塩に変換してもよく、また塩として得られる場合には、常法に従って遊離体または他の塩に変換することもできる。
【００７５】
化合物（Ｉ）を、オリゴヌクレオチドを製造するための核酸単位とすることで、核酸単位構造（ＩＩ）を含むオリゴヌクレオチドを製造することができる。
【００７６】
上記オリゴヌクレオチド類縁体は、化合物（Ｉ）を通常のオリゴヌクレオチド合成に用いられる核酸と同様に、ＤＮＡ合成機などに付し、合成することができる。ＤＮＡ合成機としては特に限定されず、自体公知のＤＮＡ合成機であればいずれであってもよい。
また、そのオリゴヌクレオチド類縁体合成に適用されるオリゴヌクレオチドの合成法についても自体公知のものが適用され、例えば、ホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法等が挙げられる。
【００７７】
本発明は、上記方法によって製造された、核酸単位構造（ＩＩ）を含むオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩を提供する。
【００７８】
核酸単位構造（ＩＩ）において、Ｒ８で示される「核酸合成の保護基」としては、好ましくは、水酸基の核酸合成の保護基であり、さらに好ましくは、アシル基、シリル基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、１〜３個のＣ６−１４アリール基で置換されたメチル基、ハロゲン原子およびシアノ基から選択される置換基でアリール環が置換された１〜３個のＣ６−１４アリール基で置換されたメチル基であり、特に好ましくは、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基またはｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基である。
【００７９】
核酸単位構造（ＩＩ）において、Ｒ８で示される「置換されていてもよいリン酸基」の「リン酸基」が有していてもよい置換基としては、例えば、核酸合成の保護基が挙げられる。
当該保護基としては、好ましくはリン酸基の核酸合成の保護基が挙げられ、特に好ましくは、ハロゲン原子およびシアノ基から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、ハロゲン原子およびニトロ基から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいＣ７−１６アラルキル基、またはハロゲン原子、ニトロ基およびＣ１−６アルキル基から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいＣ６−１４アリール基が挙げられる。最も好ましくは、２−シアノエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、ベンジル基、２−クロロフェニル基または４−クロロフェニル基が挙げられる。
【００８０】
核酸単位構造（ＩＩ）において、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０およびα群で示される「置換されていてもよい水酸基」としては、化合物（Ｉ）において、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびα群で示される「置換されていてもよい水酸基」と同様のものが例示される。
また核酸単位構造（ＩＩ）において、Ｒ６、Ｒ７およびα群で示される「置換されていてもよいメルカプト基」、「置換されていてもよいアミノ基」としては、化合物（Ｉ）において、Ｒ６、Ｒ７およびα群で示される「置換されていてもよいメルカプト基」、「置換されていてもよいアミノ基」と同じものがそれぞれ例示される。
【００８１】
核酸単位構造（ＩＩ）において、Ｒ９およびＲ１０が、一緒になって形成する、「オキシＣ１−４アルキレン基」中の酸素原子は、核酸単位構造（ＩＩ）中の五単糖部分の４位に結合してもよい（４’−Ｏ，３’−Ｃ−アルキレン架橋を形成してもよい）し、３位に結合してもよい（３’−Ｏ，４’−Ｃ−アルキレン架橋を形成してもよい）が、４位に結合することが好ましい。
【００８２】
核酸単位構造（ＩＩ）において、Ｂで示される「プリン−９−イル基」、「２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基」としては、化合物（Ｉ）において、Ｂで示される「プリン−９−イル基」、「２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基」と同じものがそれぞれ例示される。
【００８３】
核酸単位構造（ＩＩ）において、Ｒ８は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ７−１６アラルキル基であることが好ましく、なかでも、水素原子、メチル基、エチル基、ベンジル基であることがさらに好ましい。
【００８４】
核酸単位構造（ＩＩ）において、Ｒ９およびＲ１０は、いずれも水素原子であるか、あるいは一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成することが好ましい。
【００８５】
核酸単位構造（ＩＩ）を含むオリゴヌクレオチド類縁体は、種々の塩を形成することができる。
核酸単位構造（ＩＩ）を含むオリゴヌクレオチド類縁体の塩としては、例えば、化合物（Ｉ）の塩として例示した塩が挙げられる。
【００８６】
核酸単位構造（ＩＩ）は、同位元素（例、２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３３Ｐ、３５Ｓなど）などで標識されていてもよい。
【００８７】
本発明のオリゴヌクレオチド類縁体としては、
Ｒ８が、水素原子、Ｃ１−６アルキル基またはＣ７−１６アラルキル基を示し、かつ
Ｒ９およびＲ１０が、水素原子を示すか、あるいはＲ９およびＲ１０が、一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成する、核酸単位構造（ＩＩ）を含むオリゴヌクレオチド類縁体が好ましい。
【００８８】
さらに、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体としては、
Ｒ８が、水素原子、メチル基、エチル基またはベンジル基を示し、かつ
Ｒ９およびＲ１０が、水素原子を示すか、あるいはＲ９およびＲ１０が、一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成する、核酸単位構造（ＩＩ）を含むオリゴヌクレオチド類縁体がより好ましい。
【００８９】
本発明において「核酸単位構造」とは、「結合部分」−「糖部分」−「塩基部分」からなり、天然の核酸中のヌクレオチドに相当する部分である。
【００９０】
「結合部分」とは、天然の核酸中のホスホジエステル結合に相当する部分である。本発明のオリゴヌクレオチド類縁体においては、天然核酸が有するホスホジエステル結合の少なくとも１つが、隣接する核酸（単位）中のリン酸基中のリン原子と共に形成するＰ３’→Ｎ５’ホスホロアミダート結合、または隣接する核酸（単位）中のリン酸基中のリン原子と共に形成するＰ２’→Ｎ５’ホスホロアミダート結合に置き換わり、かつ、天然核酸が有する３’→５’ホスホジエステル結合の少なくとも別の１つが２’→５’結合に置き換わっている。すなわち本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、５’位におけるＰ２’→Ｎ５’ホスホロアミダート結合またはＰ３’→Ｎ５’ホスホロアミダート結合と、２’位における２’→５’ホスホジエステル結合とによりそれぞれ隣接する核酸（単位）と結合し、形成されるものである。
前記２’→５’結合は、２’→５’ホスホジエステル結合および２’→５’ホスホロアミダート結合のいずれの結合であってもよい。
【００９１】
「糖部分」とは、天然の核酸中の糖に相当する部分であり、前記化合物（Ｉ）で定義した五単糖部分である。本発明のオリゴヌクレオチド類縁体において、前記化合物（Ｉ）に由来しない「糖部分」としては、天然核酸中に存在するもの（好ましくはデオキシリボースまたはリボース）であってもよく、天然核酸中に存在しないもの、例えば、アラビノース、２’−Ｏ−アミノエチルリボース、２’位と４’位の間を架橋した五単糖、またはこれらの糖の修飾体などであってもよい。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体の糖部分の一部または全部が天然核酸中に存在しないものであってもよい。
【００９２】
「塩基部分」とは、前記化合物（Ｉ）で示すＢに相当する部分である。本発明のオリゴヌクレオチド類縁体において、前記化合物（Ｉ）に由来しない「塩基部分」としては、天然核酸中に存在するもの（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ））であってもよく、天然核酸中に存在しないもの、例えば、イノシン、５−メチルシトシン、５−プロピニルシトシン、ピリドンなどであってもよい。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体の塩基部分の一部または全部が天然核酸中に存在しないものであってもよい。
【００９３】
本発明のオリゴヌクレオチド類縁体において、「塩基部分」の塩基配列は、標的核酸の塩基配列に相補的となるように決定することができる。相補性は、高いほど好ましいが、検出目的に応じて相補性の程度を適宜設定すればよく、必ずしも１００％である必要はない。
【００９４】
これらの糖部分および塩基部分を含むヌクレオシドまたはヌクレオチドの製造方法ならびに結合部分の形成方法は、当業者に公知である。
【００９５】
本発明のオリゴヌクレオチド類縁体の長さは、標的核酸配列の長さ、その塩基配列、二重鎖または三重鎖形成条件、所望の検出感度や選択性、さらには後述する検出方法などの要因により様々であるが、一般には５〜５０塩基、好ましくは１０〜４０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基である。
【００９６】
本発明のオリゴヌクレオチド類縁体中の核酸単位構造（ＩＩ）の挿入数は、少なくとも１つであり、上限はオリゴヌクレオチド類縁体の全塩基数である。核酸単位構造（ＩＩ）の結合部分であるＰ３’→Ｎ５’ホスホロアミダート結合またはＰ２’→Ｎ５’ホスホロアミダート結合は、標的核酸とハイブリダイズした場合、後述する酸性条件下で容易に切断され、標的核酸から脱離する。この性質を利用して、後述する本発明の標的核酸の検出方法にプローブとして用いられる。したがって、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体を切断する目的で使用する場合は、核酸単位構造（ＩＩ）の５’側が切断部位となり、生じる断片が標的核酸から脱離するように、挿入数とその位置を決定すればよい。
【００９７】
本発明のオリゴヌクレオチド類縁体中の核酸単位構造（ＩＩ）以外の核酸としては、天然の核酸または他の人工核酸を限定なく用いることができる。標的一本鎖核酸との結合性を高めるためには、本発明者らがこれまでに開発してきた、糖部分が架橋された人工核酸（以下、「ＢＮＡ」と称する）を用いることが好ましい。このような人工核酸としては、２’，４’−ＢＮＡ（ＷＯ９８／３９３５２）、３’，４’−ＢＮＡ（ＷＯ９８／２２４８９）、２’−ｄｅｏｘｙ−３’−Ｎ−３’，４’−ＢＮＡ（ＷＯ０１／０００６４１）、３’−Ｎ−２’，４’−ＢＮＡ（特開２００１−８９４９６号公報）、塩基部分がピリドン体である２’，４’−ＢＮＡ（ＷＯ０２／１８３８８）、５’−Ｎ−２’，４’−ＢＮＡ（ＷＯ０３／０６８７９５）、２’，４’−ＢＮＡＣＯＣ（ＷＯ０３／０６８７９５）、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（ＷＯ２００５／０２１５７０）などがあげられる。
【００９８】
前記ＢＮＡを用いる場合、オリゴヌクレオチド類縁体中のＢＮＡの位置は特に限定されず、核酸単位構造（ＩＩ）に隣接していてもよく、隣接していなくてもよい。
【００９９】
本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、検出を容易ならしめるために、検出可能な標識、例えば、放射性基、酵素、蛍光基、蛍光基と消光基等で標識されていてもよい。
放射性基としては、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉなどがあげられる。酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどがあげられる。
蛍光基としては、Ａｃｒｉｄｉｎｅ、ＡＭＣＡＴＭ、ＢＯＤＩＰＹＴＭ、Ｃａｓｃａｄｅ ＢｌｕｅＴＭ、Ｃｙ２ＴＭ、Ｃｙ３ＴＭ、Ｃｙ５ＴＭ、Ｃｙ７ＴＭ、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｄａｎｓ、Ｅｏｓｉｎ、Ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｎ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、６−ＦＡＭＴＭ、ＴＥＴＴＭ、ＪＯＥ、ＨＥＸＴＭ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ、ＮＢＤＴＭ、Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ６ＧＴＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＧｒｅｅｎＴＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＲｅｄＴＭ、Ｒｈｏｄｏｌ ＧｒｅｅｎＴＭ、ＴＡＭＲＡＴＭ、ＲＯＸＴＭ、Ｔｅｘａｓ ＲｅｄＴＭ、ＮＥＤＴＭ、ＶＩＣＴＭ、ベンズイミダゾール系骨格を有する蛍光物質（ＷＯ２００７／０９４３２５）などがあげられる。
蛍光基と消光基の組合せとしては、
１）Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８ＴＭ−Ｘ、６−ＦＡＭＴＭ、ＴＥＴＴＭ、ＪＯＥ、ＨＥＸＴＭまたはＣｙ３ｖの蛍光基とＤａｂｃｙｌ消光基の組合せ；
２）Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８ＴＭ−Ｘ、６−ＦＡＭＴＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＧｒｅｅｎＴＭ−Ｘ、Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ ５１４、ＴＥＴＴＭ、ＪＯＥ、ＨＥＸＴＭ、Ｃｙ３ＴＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＲｅｄＴＭ−ＸまたはＴＡＭＲＡＴＭの蛍光基とＢＨＱＴＭ−１消光基の組合せ；
３）ＨＥＸＴＭ、Ｃｙ３ＴＭ、６−ＦＡＭＴＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＧｒｅｅｎＴＭ−Ｘ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＲｅｄＴＭ−Ｘ、ＴＡＭＲＡＴＭ、ＲＯＸＴＭ、Ｔｅｘａｓ ＲｅｄＴＭ-Ｘ、Ｂｏｄｉｐｙ ６３０／６５０ＴＭ−ＸまたはＢｏｄｉｐｙ ６５０／６６５ＴＭ−Ｘの蛍光基とＢＨＱＴＭ−２消光基の組合せ；
４）６−ＦＡＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ−Ｘ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ-Ｘ、ＴＡＭＲＡ、Ｂｏｄｉｐｙ ６３０／６５０−Ｘ、Ｂｏｄｉｐｙ ６５０／６６５−ＸまたはＣｙ５の蛍光基とＢＨＱ−１消光基の組合せ
などがあげられる。
【０１００】
前記蛍光基および消光基の結合位置は当業者が適宜設定できるが、後述する本発明の標的核酸の検出方法において処理工程で切断されたプローブを検出するためには、核酸単位構造（ＩＩ）（すなわち、プローブの切断部位）をはさむように、かつ当該部位のなるべく近くに配置して、切断した検出プローブが標的核酸から脱離して、蛍光基と消光基の距離が離れたときに蛍光を発するようにすることが必要である。これにより、検出を簡便かつ高感度に行うことができる。前記蛍光基および消光基は、核酸単位構造（ＩＩ）の両隣に位置する塩基部分にそれぞれ結合していることが好ましい。
【０１０１】
本発明は、前記オリゴヌクレオチド類縁体をプローブとして用いることを特徴とする標的核酸の検出方法を提供する。検出対象の標的核酸は、一本鎖核酸または二本鎖核酸のいずれでも可能であるが、本発明のプローブの特性上、一本鎖核酸との結合能力に優れる点、および一本鎖核酸を二本鎖にする工程を省略できる点から、一本鎖核酸が好ましい。また、標的核酸の種類は特に限定されず、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、天然由来の核酸であっても合成核酸であってもよい。本発明の検出方法の概念図を図１に示す。本発明の検出方法は、具体的には下記工程（１）〜（３）を含む。
【０１０２】
（１）本発明のオリゴヌクレオチド類縁体をプローブとして、標的核酸とハイブリダイズさせる工程
ハイブリダイゼーションの条件は、標的核酸の塩基配列、プローブの構造およびその塩基配列などに応じて適宜設定することができる。ハイブリダイゼーションは、液相中、または標的核酸もしくはプローブが固相に固定された固−液中のいずれで行ってもよい。例えば、反応温度は、標的核酸の塩基配列から算出したＴｍ値から約５〜１０℃低い温度が好ましい。ハイブリダイゼーションの時間は、通常１〜６０分程度である。また、ハイブリダイズさせる工程を省くこともできる。
【０１０３】
（２）ハイブリダイズした標的核酸−プローブ複合体を酸性条件下で処理する工程
本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、標的核酸の非存在下に比べて、標的核酸とハイブリダイズして二重鎖または三重鎖を形成した場合に、酸性条件下でホスホロアミダート結合の切断が顕著に促進される。かかる知見に基づいて、本工程では、標的核酸にハイブリダイズしたプローブのみが切断される。他方、標的核酸にハイブリダイズしないプローブは、本工程ではホスホロアミダート結合の切断が実質的に生じない。酸性条件は、通常ｐＨ約２〜約５、好ましくはｐＨ約３〜約４であり、処理時間は、通常約５分以上であり、好ましくは１０〜３０分である。ハイブリダイゼーション溶液のｐＨを上記のように調整するため、プロトン酸またはルイス酸を添加する。プロトン酸の例としては、酢酸、クエン酸、リン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、塩酸、硫酸等があげられる。
本処理工程において、プローブの切断が進行し、それに伴い、切断されたプローブが標的核酸から脱離する。プローブフリーとなった標的核酸は、新たなプローブとハイブリダイズすることができる。この過程を繰り返すことにより、検出対象のプローブが増幅される。したがって、処理工程中にハイブリダイズ工程も同時に進行させることができる。この目的のためには、処理温度をハイブリダイゼーション温度と同じにすることが好ましい。
【０１０４】
本発明の検出方法では、前記工程（１）と工程（２）を同一の工程で行うことができる。したがって、本発明の検出方法では、工程（１）を省略して工程（２）から開始することも可能である。
【０１０５】
（３）処理工程で切断されたプローブを検出する工程
切断されたプローブの検出方法は、用いるプローブの種類に応じて適宜選択することができる。標識されていないプローブまたは同位体で標識したプローブを用いた場合、質量分析法または高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）法、キャピラリーゲル電気泳動法などにより切断されたプローブを検出することができる。蛍光基または蛍光基と消光基の組合せで標識されたプローブを用いた場合、蛍光分析法により検出する。例えば、蛍光マイクロプレートリーダーを用いることにより、多検体の同時解析を行うことができる。さらに、標識が放射性基または酵素の場合も、常法に従って切断されたプローブを検出することができる。
【０１０６】
本発明の検出方法は、遺伝子に関する研究、遺伝子診断、遺伝子治療などの遺伝子に関連する様々な技術分野において利用可能である。
【実施例】
【０１０７】
以下、実施例を示してさらに具体的に本発明を説明する。以下は代表的な実施例を示すものでこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
【０１０８】
実施例１ ５’−アミノ−３’，４’−ＢＮＡの製造
【０１０９】
（１）ジオール体の製造
【０１１０】
【化５】
【０１１１】
共通中間体１（１．０ｇ，１．７３ｍｍｏｌ）のエタノール（２５ｍＬ）溶液に、２０％ Ｐｄ（ＯＨ）２−Ｃ（２５０ｍｇ）およびシクロヘキサン（３．５ｍＬ，３４．７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を２時間還流した。混合物をろ過した後、ろ液を減圧濃縮して粗製物を得た。残渣（８４０ｍｇ）のメタノール（２５ｍＬ）溶液に炭酸カリウム（１４３ｍｇ，１．０４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１５分間攪拌した。反応混合物を３７％ＨＣｌ溶液で中和し、減圧下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝５：１）で精製し、表題化合物（６２１ｍｇ，８１％ ｏｖｅｒ ２ｓｔｅｐｓ）を無色固体として得た。なお、共通中間体１は、当業者であれば自体公知の方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６６，８５０４−８５１２（２００１））で入手可能である。
Ｍｐ ９８−１０１℃．
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ １．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ），３．１３（３Ｈ，ｓ），３．１９（３Ｈ，ｓ），４．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ），４．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），４．４５，４．５４（２Ｈ，ＡＢ，Ｊ＝１１Ｈｚ），４．４５（２Ｈ，ｓ），６．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），７．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ）．
Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ ４４５（ＭＨ＋）．
【０１１２】
（２）化合物２ｂの製造
【０１１３】
【化６】
【０１１４】
ジオール体（４２６ｍｇ，０．９６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１５ｍｌ）溶液にＮａＨＭＤＳ（ＴＨＦ２．１１ｍＬ中２．１１ｍｍｏｌ，１Ｍ）を室温で加えた。混合物を１．５時間攪拌した。１０％ＨＣｌ溶液で中和した後、組成物を留去した。得られた残渣をシリカゲル（−ＮＨ）カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝１０：１）で精製し、ＤＭＦを含む目的のヌクレオシド溶液（３３１ｍｇ）を得た。ＣＨ３ＮＨ（１５ｍＬ）の該ヌクレオシド溶液を封管中、室温で１７時間攪拌し、過剰のＣＨ３ＮＨを揮発させた。残渣をシリカゲル（−ＮＨ）カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ＝１０：１）で精製して、２ｂ（２０８ｍｇ，７６％ ｏｖｅｒ ２ ｓｔｅｐｓ）を無色固体として得た。
Ｍｐ １０２−１０４℃．
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ １．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ），２．４１（３Ｈ，ｓ），２．９４，３．０２（２Ｈ，ＡＢ，Ｊ＝１３Ｈｚ），４．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５，８Ｈｚ），５．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ），６．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ）．
Ｍａｓｓ（ＥＩ）：ｍ／ｚ ２８３（Ｍ＋）．
【０１１５】
（３）化合物２ｃの製造
【０１１６】
【化７】
【０１１７】
２ｂ（２０５ｍｇ，０．７２ｍｍｏｌ）のピリジン（２．０ｍＬ）溶液にＥｔ３Ｎ（０．２ｍＬ，１．４４ｍｍｏｌ）および塩化４−メチルトリチル（２４５ｍｇ，０．７９ｍｍｏｌ）を室温で加え、混合物を１６時間攪拌した。ＡｃＯＥｔで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。混合物を減圧下で留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ｎ−ｈｅｘａｎｅ＝１：２→２：１）で精製して、２ｃ（３１０ｍｇ，７７％）を無色固体として得た。
Ｍｐ １０５−１０７℃．
［a］Ｄ２４ −５６．９（ｃ ０．５，ＣＨＣｌ３）．
ＩＲ（ＫＢｒ）nｍａｘ ３２０１，３０６０，２９２５，２８５１，１６９４，１４６１，１２４９ｃｍ−１．
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ２．０３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ），２．０５（３Ｈ，ｓ），２．５８，２．７７（２Ｈ，ＡＢ，Ｊ＝１４Ｈｚ），４．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５，７Ｈｚ），４．７０，４．９５（２Ｈ，ＡＢ，Ｊ＝８Ｈｚ），４．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ），６．３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），６．８１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），７．１３−７．４９（１２Ｈ，ｍ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ １２．８，２９．８，３８．５，５５．１，５５．２，７４．５，７７．２，８０．６，８４．４，８６．８，８７．７，１１２．１，１１２．９，１２６．１，１２７．６，１２９．１，１２９．１，１３０．５，１３５．０，１５０．９，１５７．６，１６３．３．
Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ ５５６（ＭＨ＋）．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）：Ｃ３２Ｈ３４Ｏ６Ｎ３（ＭＨ＋）からの計算値：５５６．２４４８．実測値：５５６．２４５６．
【０１１８】
（４）５’−アミノ−３’，４’−ＢＮＡ（化合物２ｄ）の製造
【０１１９】
【化８】
【０１２０】
２ｃ（２８４ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ−ＴＨＦ（３：１，４ｍＬ）溶液に、２−シアノエチル Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホジアミダイト（０．１８ｍＬ，０．５６ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルアンモニウム テトラゾリド（１２３ｍｇ，０．７２ｍｍｏｌ）を室温で加え、１７時間攪拌した。反応混合物をＡｃＯＥｔで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。次いで、減圧下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ｎ−ｈｅｘａｎｅ ｗｉｔｈ １％Ｅｔ３Ｎ＝１：２）で精製して、２ｄ（３４０ｍｇ，８８％）を無色固体として与えた。
Ｍｐ ９５−９８℃．
Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）：７５６（ＭＨ＋）．
３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ １５０．２，１５０．４．
【０１２１】
実施例２ ５’−アミノ−２’，５’−ＤＮＡの製造
（１）化合物７ａの製造
【０１２２】
【化９】
【０１２３】
３’−デオキシチミジン（１１８ｍｇ，０．４９ｍｍｏｌ）のピリジン（１．５ｍＬ）溶液に、塩化メタンスルホニル（５０．４μＬ，０．６５ｍｍｏｌ）を氷冷下で加えた。反応混合物を室温で３．５時間攪拌した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液を加えたのち、混合物を留去して粗製物を得た。該残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ｎ−ｈｅｘａｎｅ＝１：１）で精製して、７ａ（１０６ｍｇ，７２％）を無色固体として得た。
Ｍｐ ８７−８９℃．
［a］Ｄ２６ −１０．３（ｃ ０．５，ＥｔＯＨ）．
ＩＲ （ＫＢｒ）nｍａｘ ３２４４，３０１８，２８３３，１６８５，１４７９，１４３２，１３４７ｃｍ−１．
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ １．８８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ），２．０１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３，６，１３Ｈｚ），２．１５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝６，９，１３Ｈｚ），３．１４（３Ｈ，ｓ），４．３６−４．４５（２Ｈ，ｍ），４．５３−４．６２（２Ｈ，ｍ），５．７７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），７．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ），．
１３Ｃ ＮＭＲ（Ｃ５Ｄ５Ｎ）δ １２．９，３４．８，３７．４，７１．０，７５．４，７８．１，９３．６，１１０．５，１０９．４，１５１．８，１６４．８．
Ｍａｓｓ（ＥＩ）： ｍ／ｚ ３２０（Ｍ＋）．
Ｃ１１Ｈ１６Ｎ２Ｏ７Ｓ・Ｈ２Ｏからの分析値：Ｃ，３９．０５；Ｈ，５．３６；Ｎ，８．２３．実測値：Ｃ，３９．１９；Ｈ，５．２０；Ｎ，４．２９．
【０１２４】
（２）化合物７ｂの製造
【０１２５】
【化１０】
【０１２６】
７ａ（１．５０ｇ，４．６８ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＮＨ（２０ｍＬ）溶液を密封管中で６３時間静置し、過剰のＣＨ３ＮＨを揮発させた。残渣をショートシリカゲル（−ＮＨ）カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ＝２０：１→１０：１）で精製して、粗製物（８５２ｍｇ）を得た。粗製物（８５２ｍｇ）のピリジン溶液に塩化４−メトキシトリチル（１．０３ｇ，３・３４ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（０．９３ｍＬ，６．６８ｍｍｏｌ）を室温で加え、１６時間室温で攪拌した。反応混合物をＡｃＯＥｔで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液、水および飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ｎ−ｈｅｘａｎｅ ｗｉｔｈ １％Ｅｔ３Ｎ＝０：１→１：１）で精製し、７ｂ（７４２ｍｇ，３０％ ｏｖｅｒ ２ｓｔｅｐｓ）を無色固体として得た。
Ｍｐ １０７−１０９℃．
［a］Ｄ２４ −４．１（ｃ ０．５，ＣＨＣｌ３）．
ＩＲ（ＫＢｒ）nｍａｘ ３０５８，２９５８，２８３７，１６９４，１５０２，１４６７，１２５５ｃｍ−１．
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ １．７６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ），２．１９（３Ｈ，ｓ），１．９６−２．０９（２Ｈ，ｍ），２．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，１３Ｈｚ），２．６９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８，１３Ｈｚ），４．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ），４．８５（１Ｈ，ｍ），５．７７（１Ｈ，ｓ），６．８０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），７．１３−７．５５（１３Ｈ，ｍ），９．７６（１Ｈ，ｂｒｓ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（Ｃ５Ｄ５Ｎ）δ １２．７，３６．４，３８．３，５５．１，５７．０，７６．２，７７．２，８０．５，９４．０，１１０．３，１１２．７，１２５．９，１２７．４，１２９．３，１３０．６，１３４．７，１４２．８，１４２．８，１５０．９，１５７．５，１６４．２．
Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ ５５０（ＭＮａ＋）．
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）：Ｃ３１Ｈ３３Ｏ５Ｎ３Ｎａ（ＭＮａ＋）からの計算値：５５０．２３１８．実測値：５５０．２３３８．
【０１２７】
（３）５’−アミノ−２’，５’−ＤＮＡ（化合物７ｃ）の製造
【０１２８】
【化１１】
【０１２９】
７ｂのＣＨ３ＣＮ−ＴＨＦ（３：１，８ｍＬ）溶液に２−シアノエチル Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホジアミダイト（０．４０ｍＬ，１．２５ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルアンモニウム テトラゾリドを室温で加え、１６時間室温で攪拌した。反応混合物をＡｃＯＥｔで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液、水および飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄した。ついで、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ｎ−ｈｅｘａｎｅ ｗｉｔｈ １％Ｅｔ３Ｎ＝１：３→１：２）で精製し、少量の不純物を含む所望の化合物を得た。残渣をＡｃＯＥｔおよびｎ−ヘキサンで再沈殿させ、無色固体として７ｃ（６６０ｍｇ，８７％）を得た。
Ｍｐ ９３−９５℃．
Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）：７５０（ＭＮａ＋）．
３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ １４９．５，１５０．５．
【０１３０】
実施例３ 核酸プローブの酸加水分解
標的となるシングルストランドＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）およびｓｓＲＮＡと相補的な配列を有し、かつ本発明の核酸単位構造を含む核酸プローブ（配列番号１）を合成した。ついで、この標識核酸プローブ（３３３ｐｍｏｌ）を同モルの標的ｓｓＤＮＡ（配列番号２）またはｓｓＲＮＡ（配列番号３）にハイブリダイズさせ、その後酸加水分解を行った。酸加水分解反応は、１００ｍＭクエン酸ナトリウム−塩酸緩衝液（ｐＨ４．０）８．５ μＬを加えてｐＨを４．０±０．１とすることで開始した。一定時間経過後、反応液１５ μＬを分取し、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１１５ μＬにより中和し、完全長のオリゴヌクレオチド残量を逆相ＨＰＬＣにより分析し、定量することで切断されていない標識核酸プローブ（図２中、オリゴヌクレオチドと記載）の割合を計算した。コントロールとして、ハイブリダイズさせない場合についても実験を行った。結果を図２に示す。ＨＰＬＣは島津ＬＣ−２０システム（ＬＣ−２０ＡＢ，ＳＰＤ−２０Ａ，ＣＴＯ−２０Ａ，ＳＩＬ−２０Ａ）を用いた。
〔ＨＰＬＣ定量条件〕
溶解液：Ａ液（０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液：ｐＨ７．０）
Ｂ液（０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液：アセトニトリル＝１：１，ｐＨ７．０）
グラジエント：６−１２％ Ｂ液（１５ｍｉｎ）
使用カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ（登録商標）ＭＳ Ｃ１８ ２．５μｍ（４．６×５０ｍｍ）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：５０℃
検出：ＵＶ（２５４ｎｍ）
【０１３１】
配列番号１ ５’−ｄ（ＴＴＴＴＴｍＣＴＸＹｍＣＴｍＣＴｍＣＴ）−３’
（但し、ｍＣは２’−デオキシ−５−メチルシチジンを、Ｘは核酸単位構造（ＩＩ）（Ｒ８＝Ｍｅ，Ｒ９＝Ｈ，Ｒ１０＝Ｈ，Ｂ＝Ｔ）を、Ｙは２’，４’−ＢＮＡ−Ｔをそれぞれ示す）
配列番号２ ５’−ｄ（ＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡ）−３’
配列番号３ ５’−ｒ（ＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡ）−３’
【０１３２】
この結果、例えば反応後１０分の時点でｓｓＲＮＡとハイブリダイズした本発明の核酸単位構造を含むプローブは約６０％の分解が認められた。また、ｓｓＤＮＡとハイブリダイズした本発明の核酸単位構造を含むプローブでは約４０％の分解が認められた。一方で、ハイブリダイズさせていない場合では全く分解が認められていない。このように、本発明の核酸単位構造を含むプローブはｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡとハイブリダイズすることで、酸加水分解されやすくなることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明の標的核酸の検出方法によれば、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体をプローブとして用いることにより、標的核酸を増幅することなく、標的核酸に結合することにより切断されたプローブを検出することができる。そのため、従来の核酸増幅工程や特殊な酵素を利用する必要がある核酸検出方法に比べて、簡便、迅速かつ高精度な核酸検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】本発明の標的核酸の検出方法の概念図である。
【図２】一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡを標的としたオリゴヌクレオチド類縁体の酸加水分解を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、アシル基、シリル基、核酸合成の保護基、置換されていてもよいリン酸基、または−Ｐ（Ｒ６）Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいメルカプト基もしくは置換されていてもよいアミノ基を示す。］で表される基を示し、
Ｒ３は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、アシル基、シリル基、Ｃ１−６アルキル基で置換されていてもよいアミノ基、核酸合成の保護基、置換されていてもよいリン酸基、または−Ｐ（Ｒ６）Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、前記と同義を示す］で表される基を示し、
Ｒ４およびＲ５は、同一または異なって、水素原子、置換されていてもよい水酸基またはＣ１−６アルキル基を示すか、あるいはＲ４およびＲ５は、一緒になって、オキシＣ１−４アルキレン基を形成し、
Ｂは、下記α群から選択される置換基で置換されていてもよいプリン−９−イルまたは２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を示す。）
で表される化合物またはその塩。
（α群）
ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキルチオ基、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいメルカプト基および置換されていてもよいアミノ基。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ２が、同一または異なって、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ７−１６アラルキル基または核酸合成の保護基を示し、
Ｒ３が、水素原子または−ＰＲ６Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、置換されていてもよい水酸基もしくは置換されていてもよいアミノ基を示す。］で表される基を示し、
Ｒ４およびＲ５が、水素原子を示すか、あるいはＲ４およびＲ５が、一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成する、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
式（ＩＩ）
【化２】
（式中、
Ｒ８は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、アシル基、シリル基、核酸合成の保護基、置換されていてもよいリン酸基、または−Ｐ（Ｒ６）Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいメルカプト基もしくは置換されていてもよいアミノ基を示す。］で表される基を示し、
Ｒ９およびＲ１０は、同一または異なって、水素原子、置換されていてもよい水酸基またはＣ１−６アルキル基を示すか、あるいはＲ９およびＲ１０は、一緒になって、オキシＣ１−４アルキレン基を形成し、
Ｂは、下記α群から選択される置換基で置換されていてもよいプリン−９−イルまたは２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を示す。）
で表される核酸単位構造を少なくとも一つ含有する、オリゴヌクレオチド類縁体またはその塩。
（α群）
ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキルチオ基、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいメルカプト基および置換されていてもよいアミノ基。
【請求項４】
Ｒ８が、水素原子、Ｃ１−６アルキル基またはＣ７−１６アラルキル基を示し、
Ｒ９およびＲ１０が、同一または異なって、水素原子を示すか、あるいはＲ９およびＲ１０が、一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成する、請求項３記載のオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩。
【請求項５】
２’，４’−ＢＮＡ、３’，４’−ＢＮＡ、２’−ｄｅｏｘｙ−３’−Ｎ−３’，４’−ＢＮＡ、３’−Ｎ−２’，４’−ＢＮＡ、５’−Ｎ−２’，４’−ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＣＯＣおよび２’，４’−ＢＮＡＮＣからなる群から選択される架橋された人工核酸がさらに少なくとも一つ組み込まれている、請求項３または４に記載のオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩。
【請求項６】
一つ以上の核酸単位構造または核酸が標識されている、請求項３〜５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩。
【請求項７】
標識が蛍光基および消光基の組み合わせである、請求項３〜６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩。
【請求項８】
請求項３〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド類縁体をプローブとして用いることを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項９】
請求項３〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド類縁体をプローブとして、標的核酸とハイブリダイズさせる工程、
ハイブリダイズした標的核酸−プローブ複合体を酸性条件下で処理する工程、および
処理工程で切断されたプローブを検出する工程
を含む標的核酸の検出方法。
【請求項１０】
ハイブリダイズさせる工程と処理工程が同一の工程で行われる、請求項９に記載の検出方法。
【請求項１１】
標的核酸が一本鎖核酸である請求項８〜１０のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、アシル基、シリル基、核酸合成の保護基、置換されていてもよいリン酸基、または−Ｐ（Ｒ６）Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいメルカプト基もしくは置換されていてもよいアミノ基を示す。］で表される基を示し、
Ｒ３は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、アシル基、シリル基、Ｃ１−６アルキル基で置換されていてもよいアミノ基、核酸合成の保護基、置換されていてもよいリン酸基、または−Ｐ（Ｒ６）Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、前記と同義を示す］で表される基を示し、
Ｒ４およびＲ５は、同一または異なって、水素原子、置換されていてもよい水酸基またはＣ１−６アルキル基を示すか、あるいはＲ４およびＲ５は、一緒になって、オキシＣ１−４アルキレン基を形成し、
Ｂは、下記α群から選択される置換基で置換されていてもよいプリン−９−イルまたは２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を示す。）
で表される化合物またはその塩。
（α群）
ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキルチオ基、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいメルカプト基および置換されていてもよいアミノ基。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ２が、同一または異なって、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ７−１６アラルキル基または核酸合成の保護基を示し、
Ｒ３が、水素原子または−ＰＲ６Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、置換されていてもよい水酸基もしくは置換されていてもよいアミノ基を示す。］で表される基を示し、
Ｒ４およびＲ５が、水素原子を示すか、あるいはＲ４およびＲ５が、一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成する、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
式（ＩＩ）
【化２】
（式中、
Ｒ８は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、アシル基、シリル基、核酸合成の保護基、置換されていてもよいリン酸基、または−Ｐ（Ｒ６）Ｒ７［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいメルカプト基もしくは置換されていてもよいアミノ基を示す。］で表される基を示し、
Ｒ９およびＲ１０は、同一または異なって、水素原子、置換されていてもよい水酸基またはＣ１−６アルキル基を示すか、あるいはＲ９およびＲ１０は、一緒になって、オキシＣ１−４アルキレン基を形成し、
Ｂは、下記α群から選択される置換基で置換されていてもよいプリン−９−イルまたは２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を示す。）
で表される核酸単位構造を少なくとも一つ含有する、オリゴヌクレオチド類縁体またはその塩。
（α群）
ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキルチオ基、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいメルカプト基および置換されていてもよいアミノ基。
【請求項４】
Ｒ８が、水素原子、Ｃ１−６アルキル基またはＣ７−１６アラルキル基を示し、
Ｒ９およびＲ１０が、同一または異なって、水素原子を示すか、あるいはＲ９およびＲ１０が、一緒になって、オキシメチレン基またはオキシエチレン基を形成する、請求項３記載のオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩。
【請求項５】
２’，４’−ＢＮＡ、３’，４’−ＢＮＡ、２’−ｄｅｏｘｙ−３’−Ｎ−３’，４’−ＢＮＡ、３’−Ｎ−２’，４’−ＢＮＡ、５’−Ｎ−２’，４’−ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＣＯＣおよび２’，４’−ＢＮＡＮＣからなる群から選択される架橋された人工核酸がさらに少なくとも一つ組み込まれている、請求項３または４に記載のオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩。
【請求項６】
一つ以上の核酸単位構造または核酸が標識されている、請求項３〜５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩。
【請求項７】
標識が蛍光基および消光基の組み合わせである、請求項３〜６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩。
【請求項８】
請求項３〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド類縁体をプローブとして用いることを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項９】
請求項３〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド類縁体をプローブとして、標的核酸とハイブリダイズさせる工程、
ハイブリダイズした標的核酸−プローブ複合体を酸性条件下で処理する工程、および
処理工程で切断されたプローブを検出する工程
を含む標的核酸の検出方法。
【請求項１０】
ハイブリダイズさせる工程と処理工程が同一の工程で行われる、請求項９に記載の検出方法。
【請求項１１】
標的核酸が一本鎖核酸である請求項８〜１０のいずれか１項に記載の検出方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−１８４９３１（Ｐ２００９−１８４９３１Ａ）
【公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２３２８８（Ｐ２００８−２３２８８）
【出願日】平成２０年２月１日（２００８．２．１）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１日（２００８．２．１）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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