異種由来単一染色体の次世代伝達能を備えた異種染色体添加植物
【課題】
本発明は、異種染色体が添加された２倍体植物細胞において、前記異種染色体を安定に分配し、付与した形質を世代を超えて安定化させるための技術及びこれを用いて作出された植物細胞を提供することを課題とする。
【解決手段】
上記課題の解決のために、本発明は異種染色体が添加された２倍体植物細胞の染色体をアルカロイド処理によって倍加させることにより、異種染色体が発現する形質を安定して保持し、かつ異種染色体を次世代に伝達することを可能とした異種染色体添加４倍体細胞及びその作出方法、ならびに前記４倍体細胞の簡便で効果的なスクリーニング方法を提供する。
本発明は、異種染色体が添加された２倍体植物細胞において、前記異種染色体を安定に分配し、付与した形質を世代を超えて安定化させるための技術及びこれを用いて作出された植物細胞を提供することを課題とする。
【解決手段】
上記課題の解決のために、本発明は異種染色体が添加された２倍体植物細胞の染色体をアルカロイド処理によって倍加させることにより、異種染色体が発現する形質を安定して保持し、かつ異種染色体を次世代に伝達することを可能とした異種染色体添加４倍体細胞及びその作出方法、ならびに前記４倍体細胞の簡便で効果的なスクリーニング方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用植物の品種改良方法に関し、より詳しくは、異種生物の細胞に由来する染色体（以下「異種染色体」という）を有する２倍体の植物細胞において、染色体の倍加により前記異種染色体の次世代伝達能を付与することを特徴とする、４倍体植物細胞の作出方法及び異種染色体添加４倍体植物細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
有用植物の品種改良方法には、かけ合わせによる有用形質の選抜や遺伝子組み換えによる改良など、様々な手法が用いられている。それらの手法の一つとして、有用植物に異種細胞由来の染色体を添加して有用な形質を付与するといった染色体レベルでの品種改良手法も開発され、その利用も少しずつ広がって来ている。異種ゲノムから特定の染色体を一本だけ導入した系統を単一異種染色体添加系統といい、Ｌｅｉｇｈｔｙ＆Ｔａｙｌｏｒ（１９２４）がコムギの単一異種染色体添加系統をはじめて育成して以来、多くの植物種でその作出が行われてきた。１９７０年代迄は、食用作物、工業原料作物、飼料作物等に限れていた研究も、１９８０年代以降、園芸作物においてそれらを育成する試みがなされ始めている（非特許文献１−７）。
【０００３】
しかしながら染色体添加による品種改良法においては、作出方法の都合上２倍体（２ｎ）の細胞に対して半数（ｘ）本の染色体のみが添加され、減数分裂時にこれが生殖細胞に均等分配されない事から、形質が安定しないという大きな問題があった。すなわち、有用な形質を細胞に付与し、かつ、この形質を世代を超えて安定化させるための技術開発が切望されていた。
【特許文献１】特開平７−００５９４６ アリウム属に属する新規植物及びその育種・増殖方法
【特許文献２】特表２０００−５１４６６４ ハイブリッドコムギの生産方法
【特許文献３】特開平６−１５３７３１ 薬用ニンジンの４倍体誘導法
【特許文献４】特開２００１−３２０９９４ ユーカリ属４倍体の作成方法及び生長性かつ発根能力に優れたユーカリ属４倍体
【非特許文献１】Ｌｅｉｇｈｔｙ Ｃ．Ｅ．＆ Ｔａｙｌｏｒ Ｊ．Ｗ．（１９２４）Ｊ．Ａｇｒ．Ｒｅｓ．２８，５６７−５７６．
【非特許文献２】Ｐｅｆｆｌｅｙ Ｅ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７１，１７６−１８４．
【非特許文献３】Ｔａｓｈｉｒｏ Ｙ．Ｔｓｕｔｓｕｍｉ Ｍ．ａｎｄ Ｓｈｉｇｙｏ Ｍ．（２０００）Ａｃｔａ Ｈｒｔｃｕｌｔｕｒａｅ ５２１，２１１−２１７．
【非特許文献４】Ｊａｈｉｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｏｍｅ ３２，４０８−４１３．
【非特許文献５】ＭｃＧｒａｔｈ Ｊ．Ｍ．（１９８９）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ， Ｕｎｉｖ．Ｃａｌｉｆ．
【非特許文献６】Ｗｅｅｄｅｎ Ｎ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｈｏｒｔｓｃｉｅｎｃｅ ２１，１４３１−３３．
【非特許文献７】Ｓｈｉｇｙｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｓ＆Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ ７１，３６３−３７１．
【非特許文献８】北海道ホームページ内「ハイブリッドライグラス テトリライト」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｇｒｉ．ｐｒｅｆ．ｈｏｋｋａｉｄｏ．ｊｐ／ｃｅｎｔｅｒ／ｋｅｎｋｙｕｓｅｉｋａ／ｇａｉｙｏｓｈｏ／Ｓ５９ｇａｉｙｏ／１９８３２４４．ｈｔｍ）
【非特許文献９】Ｓｈｉｇｙｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｊａｐａｎ． Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ． ６８（１），１８−２２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は上記の現状に鑑み、異種染色体が添加された植物細胞において、前記異種染色体を安定に分配し、付与した形質を世代を超えて安定化させるための技術及びこれを用いて作出された植物細胞を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題の解決のため、本発明者らは研究を進め、異種染色体が添加された植物細胞における異種染色体の安定化手法として、ゲノムの倍数性に着目した。形質安定化の阻害要因である「添加染色体の半数性」を解決できれば、品種改良法としてきわめて有効である。植物においては、倍数体個体も正常に成長・繁殖できる例が多く知られている事から、本発明者らは異種染色体添加植物細胞におけるゲノムの倍加を試みた。
【０００６】
有用植物の倍数性については、古くはコムギの品種改良などをはじめ多くの植物で利用されてきた。中でも通常２倍体（２ｎ）を示す細胞の染色体を倍加して４倍体を得る技術は、有用形質の増幅、種間雑種植物への稔性の付与、４倍体植物と２倍体植物とを掛け合わせた３倍体植物作出など、多くの有用植物で活用されてきている。一般的な方法としては、細胞分裂時にコルヒチンなどの有糸分裂阻害物質を添加することで、複製された染色体の娘細胞への分配を阻害し、細胞内の染色体数を倍加させる方法が挙げられる。実際この手法を用い、有用植物の品種改良方法及び改良された有用植物が多くの文献で開示されている（特許文献１−４、非特許文献８）。
【０００７】
本発明者らは上記観点に基づく解析を進め、異種染色体倍加系統の植物体をアルカロイド含有培地において後述の特定条件下で組織培養することにより、ゲノムの核相が４ｎを示しかつ異種染色体が倍加された細胞を作出する事に成功した。また本発明者らは、これらの細胞に由来する植物個体を作出し、この個体が正常に減数分裂を行い異種染色体の次世代伝達能を有している事を確認して、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明の第１の態様は、異種染色体を１対または複数対有し、染色体が４倍性を示す植物細胞を提供する。
【０００９】
本発明の第２の態様は、異種染色体が１本添加された２倍体植物種細胞において、染色体を倍加して得られることを特徴とする、異種染色体添加４倍体植物細胞を提供する。
【００１０】
本発明の第３の態様は、２倍体植物種細胞がユリ科植物由来の細胞である、請求項２に記載の異種染色体添加４倍体植物細胞を提供する。
【００１１】
本発明の第４の態様は、２倍体植物種細胞がユリ科ネギ属植物由来の細胞である、請求項３に記載の異種染色体添加４倍体植物細胞を提供する。
【００１２】
本発明の第５の態様は、２倍体植物種細胞がネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）由来の細胞であって、シャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）由来の染色体を添加されたものであることを特徴とする、請求項４に記載の異種染色体添加４倍体植物細胞を提供する。
【００１３】
本発明の第６の態様は、添加された染色体が、シャロット第１染色体である事を特徴とする、請求項５に記載の異種染色体添加４倍体植物細胞を提供する。
【００１４】
本発明の第７の態様は、異種染色体が１本添加された２倍体植物から組織培養によって得られる事を特徴とする、請求項１から請求項６のうちいずれか１項に記載の異種染色体添加４倍体植物細胞を提供する。
【００１５】
本発明の第８の態様は、請求項１から請求項７のうちいずれか１項に記載の植物細胞に由来する、１対または複数対の異種染色体を有し、前記異種染色体の次世代伝達能を有する事を特徴とする、４倍体植物を提供する。
【００１６】
本発明の第９の態様は、下記工程を含むことを特徴とする、請求項８に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法−（ａ）１本の異種染色体を添加した２倍体植物の組織を単離し、染色体の倍加処理を行う工程。（ｂ）当該組織の組織培養により異種染色体を２本有する４倍体植物組織を発生させる工程。（ｃ）前記４倍体組織から植物個体を発生させる工程（個体再生工程）−を提供する。
【００１７】
本発明の第１０の態様は、１ないし２枚の葉原基を含む成長点を組織培養に用いる、請求項９に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法を提供する。
【００１８】
本発明の第１１の態様は、染色体倍加処理としてアルカロイドを用いる事を特徴とする、請求項９または請求項１０に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法を提供する。
【００１９】
本発明の第１２の態様は、アルカロイドがコルヒチンである、請求項１１に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法を提供する。
【００２０】
本発明の第１３の態様は、染色体倍加処理の反応補助剤として、ジメチルスルホキシドを用いることを特徴とする、請求項１１または請求項１２に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法を提供する。
【００２１】
本発明の第１４の態様は、染色体倍加処理の反応補助用植物ホルモンとして、ショ糖を用いることを特徴とする、請求項１１から請求項１３のうちいずれか１項に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法を提供する。
【００２２】
本発明の第１５の態様は、染色体倍加処理に用いる培地が、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ培地（ＭＳ培地）である、請求項９から請求項１４に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法を提供する。
【００２３】
本発明の第１６の態様は、ＭＳ培地が、寒天及び／またはジェランガムを添加した固体培地である、請求項１５に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法を提供する。
【００２４】
本発明の第１７の態様は、染色体の倍加処理工程における培養条件が、（ｄ）暗黒条件、（ｅ）温度条件２０℃±５℃、（ｆ）培養期間が３日間から５日間、のうち少なくとも１つを満たす、請求項１０から請求項１６のうちいずれか１項に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法を提供する。
【００２５】
本発明の第１８の態様は、染色体倍加後における組織からの個体再生工程に、ジェランガムで凝固したＭＳ培地を用いることを特徴とする、請求項１７に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法を提供する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の提供する異種染色体添加４倍体細胞及びその作出方法を利用する事により、異種間交配などに由来する有用植物の形質を遺伝的に安定化させ、これらの有用植物を特殊な設備や高度な技術を用いること無く、通常の２倍体植物と同様に扱うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下に本発明を詳細に説明する。本発明の第１の態様は、異種染色体を１対または複数対有し、染色体が４倍性を示す植物細胞を提供する。前述のように、異種染色体添加系統では付与した形質の次世代への伝達が、大きな問題であった。本発明はこれを、ゲノムの倍加によって解決するものである。
【００２８】
本発明の第２から第７の態様においては、異種染色体が１本添加された２倍体植物種細胞において、染色体を倍加して得られることを特徴とする、異種染色体添加４倍体植物細胞を提供する。ここにおいて２倍体植物細胞とは、好ましくはユリ科植物、更に好ましくはネギ属植物の細胞であって、好適にはネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）細胞にシャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）由来の第１染色体を添加した細胞である。またこれらの細胞は、好ましくは２倍体植物体から組織培養によって得られる細胞である。本発明は、異種染色体が添加された植物細胞であればどの様な細胞でも応用可能であるが、後述の実施例ではその中でもネギ細胞にシャロット（どちらも食用）の染色体を添加したものを示した。単一染色体添加系統については、その発現する形質についても本発明者らによる解析が進んでおり、シャロットの第１染色体を添加したネギ植物体の一部を組織培養し、染色体倍加処理を行うことによって、ビタミンを高生産でき、かつこの形質が有性生殖を経ても失われないネギ細個体を作出できる事が実証された。
【００２９】
本発明の第８の態様においては、第１から第７の態様に記載した異種染色体添加４倍体植物細胞に由来する４倍体植物を提供する。本発明によって得られた４倍体細胞は、実施例に示す様に、適当な培地と培養条件下において植物体へと成長させる事が可能である。こうして得られた植物体は稔性を持ち、２倍体植物と同様の手法によって子孫を得ることが出来、また添加した染色体の示す形質も問題なく次世代へと伝達される。すなわち、本態様の提供する植物を利用する事によって、高度な技能や複雑な装置を用いることなく、有用な形質を付与した作物を扱うことが可能となる。現時点では、植物体の簡便な再生のために、組織培養による染色体倍加処理が行われているが、再生植物体の遺伝的背景の安定化の観点から、将来的には単一細胞に由来する植物体を用いるのが望ましい。
【００３０】
本発明の第９から第１８の態様においては、第８の態様に記載の植物体を得るための作出方法を提供する。本作出方法は主要な工程３つ、すなわち（ａ）１本の異種染色体を添加した２倍体植物の組織を単離し、染色体の倍加処理を行う工程、（ｂ）当該組織の組織培養により異種染色体を２本有する４倍体植物組織を発生させる工程、（ｃ）前記４倍体組織から植物個体を発生させる工程（個体再生工程）を内包する。（ａ）工程の組織培養は、好ましくは１ないし２枚の葉原基を含む成長点を用いるものであり、また染色体倍化処理としてはアルカロイド、好適にはコルヒチンによる処理を行うものである。前記処理の補助成分としてはジメチルスルホキシド及び／またはショ糖が好ましい。コルヒチンによる染色体倍化処理は、倍数体の植物作成にこれまでも用いられてきたものであるが、ここに補助剤としてジメチルスルホキシドやショ糖を加えることによって、染色体倍加の効率を上げている。（ｂ）工程における組織培養には、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｃｏｏｇ培地（ＭＳ培地）が好ましく、更に好ましくは寒天やジェランガムで固化した培地を用いるのが良い。（ｃ）工程における個体再生工程は、好ましくは（ｄ）暗黒条件、（ｅ）温度条件２０℃±５℃、（ｆ）培養期間が３日間から５日間、のうち少なくとも１つの条件を満たす工程であり、より好ましくは土などに植えられるようになるまでジェランガムで凝固したＭＳ培地上で培養する工程である。植物の組織培養には無菌的な操作が必要であり、かつ培養組織から効率的に植物体を成長させる必要がある。本発明者らは、滅菌処理したＭＳ培地に植えた染色体倍加処理後の組織を、前記（ｄ）から（ｆ）までの条件下で培養することによって効率よく植物体を成長させられる事実を見出し、これを提供するものである。
【実施例１】
【００３１】
（単一異種染色体添加ネギ系統の作出） 本発明の実施例を以下に示すが、本発明は下記実施例に限定されるものでは無い。本発明に係る単一異種染色体添加ネギ系統は、非特許文献７に記載の方法で作出した（Ｓｈｉｇｙｏ ｅｔ ａｌ． １９９６）。作出方法の概要を表１に示す。２倍体のネギ（ＦＦ，２ｎ＝１６）とシャロット（ＡＡ，２ｎ＝１６）を掛け合わせ、雑種第一代（ＡＦ，ｎ＋ｎ＝１６）を得た。染色体の倍加によりＡｍｐｈｉｄｉｐｌｏｉｄ（ＡＡＦＦ，２ｎ＝３２）を得、これにネギ（ＦＦ）を掛け合わせて次代（ＡＦＦ，２ｎ＋ｎ＝２４）を得た。更にこれにネギ（ＦＦ）を掛け合わせると、シャロットゲノムＡに由来する染色体の不均等分配がおこり、この中から染色体１本を含む子孫の系統（Ａｌｉｅｎ ｍｏｎｏｓｏｍｉｃ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｌｉｎｅ）をそれぞれの染色体（第１〜第８）について作出した。
【表１】
【００３２】
（４倍体細胞の作出） 本発明の実施例として、前述の方法で作出したシャロット第１染色体を１本持つネギ系統（ＦＦ＋１Ａ，２ｎ＝１６＋１）を材料に用いた。前記植物体の１ないし２枚の葉原基を含む茎頂部成長点（１ｍｍ以下）を切り出し、０．０５％（ｗ／ｖ）コルヒチン、２％（ｗ／ｖ）ジメチルスルホキシド、３％ショ糖（ｗ／ｖ）を含むＭＳ固形培地（ジェランガムまたは寒天で固化）に置床して、２５℃、暗条件で４日間培養した（倍加処理）。その後、培養した前記組織をホルモンフリーショ糖３％（ｗ／ｖ）ＭＳ寒天培地上に無菌的に移し、２５℃、１６時間日長で３ヶ月間培養して、シャロット第１染色体を１対有する４倍体のネギ単一染色体添加植物細胞（ＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａ，２ｎ＝３４）に由来する植物体（再生植物体）を得た（表２）。
【表２】
【実施例２】
【００３３】
（再生植物体の倍数性調査１） 組織培養に由来する再生植物体では、染色体倍加の確認が重要である。前記方法で作出した再生植物体において、完全展開葉身の中央部から表皮のみをはぎ取り、はぎ取った表皮をスライドグラス上に敷いて、１％酢酸カーミンに２分間浸して核染色を行った。染色完了後カバーグラスを乗せ、光学顕微鏡下で孔辺細胞を観察し、ＦＦ＋１Ａと再生植物体の孔辺細胞直径を比較して、倍数性の推定を行った。孔辺細胞は各個体で１５０細胞ずつ観察し、平均値を求めた。その結果、ＦＦ＋１Ａにおける孔辺細胞直径は平均で約４０μｍあったのに対して（図１Ａ）、再生植物体における平均は約５０μｍであった（図１Ｂ）。本実施例では、表皮をカーミンで染色するという簡便な方法によって、再生植物体の倍数性が簡便に推測可能となった。
【実施例３】
【００３４】
（再生植物体の倍数性調査２） 再生植物体から表層をはぎ取った第２層（皮層、葉肉細胞＋生殖細胞）における倍数性の調査を、フローサイトメトリー分析を用いて行った。材料としては、ＦＦ＋１Ａ、再生植物体及び Ａ．ｖａｖｉｌｏｖｉｉ（内部標準用）を用いた。プラスチックシャーレに５−７ｍｍ四方大に切り取ったサンプルを採取し、Ｅｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを約２滴滴下した。鋭利なカミソリでこれを細かく刻み、再びＥｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを数滴垂らし、約２分間浸透した。その後、Ｃｅｌｌ Ｔｒｉｃｋｓ ｆｉｌｔｅｒでろ過し、Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒをろ液の４倍量加えた。パラフィルムでサンプル管の口を覆い、上下に穏やかに混合して約２分間浸透した。染色が完了した後、フローサイトメーター（Ｐａｒｔｅｃ社，ＰＡ型）によりＧ１期の蛍光強度別核数を測定した。資料注入速度は１．２０μｌ／ｓ、測定細胞数は約３０００個、検出速度は毎秒１０核前後の条件とした。
【００３５】
図２で示すとおり、２倍体であるＦＦ＋１Ａのピークは、内部標準であるＡ．ｖａｖｉｌｏｖｉｉのピークの左側に現れた。反対に、Ｎｏ．２１で示すとおり、Ａ．ｖａｖｉｌｏｖｉｉより右側にピークを有し、蛍光強度がＦＦ＋１Ａの２倍になっているものを、第２層における倍加細胞と判断した。Ｎｏ．１２の様なピークがＦＦ＋１Ａと４倍体の両方にまたがっているものについては、２倍体細胞と４倍体細胞が混在するキメラ細胞と判断した。
【実施例４】
【００３６】
（再生植物体の倍数性調査３） 植物体中心部の第３層（維管束など含む中心柱）における倍数性調査は、再生植物体の鱗茎より発根した根端細胞の核型分析によって行った。５−１０ｍｍに伸長した二次根を採取し、０．０５％コルヒチン水溶液に入れ約２０℃で約２時間半処理を行った。その後処理した二次根を酢酸エタノール混合液（１：３）に入れ、冷蔵庫で一晩放置して固定した。固定が完了した二次根を１Ｎ ＨＣｌで６０℃、６０分間処理し、塩基性フクシンによるフォイルゲン染色を行った。スライドグラス上に４５％酢酸を１滴落とし、その中に染色した二次根の根端を入れ、カバーグラスを乗せて染色体を一平面上に配列させた後、光学顕微鏡下で染色体数を計測した。
【００３７】
図３に染色の結果を示した。倍加個体における根端細胞の染色体数は、ＦＦ＋１Ａの染色体数（１７本）の２倍の３４本であり、他のネギ染色体より大型の中部動原体を持つシャロット第１染色体が２本観察された（Ｎｏ．２１）。一方、再生植物体Ｎｏ．１２については、第２層の検査で示唆された通り、染色体数が３４本と１７本の２種類の細胞を含んでおり、キメラ細胞である事が示された。上述した第１、第２、第３層それぞれにおける染色体数の推定方法を、図４にまとめた。
【実施例５】
【００３８】
（４倍性再生植物体におけるシャロット第１染色体の伝達率） 第１−３層全てにおいて倍加が推定された再生個体を、ここでは「シャロットの第１染色体を１対持った４倍体ネギ（ＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａ，２ｎ＝３４）」とした。この植物体とネギの２倍体栽培種である『九条細ネギ（２ｎ＝１６）』との間の正逆交雑を行って、シャロット第１染色体が交雑体に伝達されるかどうかを確認した。九条細ネギ♀×４倍性再生植物体♂との交配から、雄性配偶子における添加染色体の伝達率（２ｎ＝２５を示す個体数／得られた全ての個体数×１００，％）を、４倍性再生植物体♀×九条細ネギ♂との交配から、雌性配偶子における添加染色体の伝達率（％）をそれぞれ求めた。本発明者らが以前に明らかにした通り、異種染色体を添加した２倍体ネギ（ＦＦ＋１Ａ）における異種染色体の次世代への伝達率は、雄性配偶子においては０％、雌性配偶子については２４％であった（非特許文献９）。一方、４倍性再生植物体におけるシャロット第１染色体の伝達率は、雄性配偶子・雌性配偶子ともに１００％の値を示し、本発明の課題であった「添加染色体の次世代への伝達」について格段の向上が見られた（図５）。
【実施例６】
【００３９】
（４倍性再生植物体における添加染色体の生化学的分析） シャロット第１染色体を添加したネギ（ＦＦ＋１Ａ）の持つ特性として、高アスコルビン酸含量が挙げられる。本発明により作出された４倍性ネギの再生植物体がこの特性を維持しているかどうか確認するため、葉身部分よりヒドラジン法によってアスコルビン酸量を定量した（図６Ａ、Ｂ）。ＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａの再生植物体においても、２倍体ネギ（ＦＦ）に比べ遙かに高いアスコルビン酸量を示し、特性が維持されている事が確認された。すなわち、本発明の提供する４倍体の植物及びその作出方法は、異種染色体添加による形質を維持しつつ、当該形質の次世代への伝達を容易にするという極めて優れた方法である事が示された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、農産分野において、これまで困難だった異種染色体の添加によって付加された形質の次世代への伝達を容易に可能にするものであり、これは有用植物の品種改良や新品種の作出に大いに利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】異種染色体添加２倍体細胞（Ａ）及び染色体倍化処理後の再生植物体（Ｂ）の表皮組織における、孔辺細胞の直径を比較した。２倍体細胞ではおよそ４０μｍであったのに対して、４倍体細胞では５０μｍの値であった。この事はまた、孔辺細胞の観察という簡易な方法によって、染色体が倍加された４倍体細胞をスクリーニング可能である事も示している。
【図２】対照の２倍体植物及び再生植物体それぞれの起源層第２層由来の細胞を用いたフローサイトメトリーの結果を示す。対照個体（２ｎ＝１６＋１，左側）と比較して、再生個体Ｎｏ．２１（右側）では２ｎ＝３４を示すピークが見られた。一方Ｎｏ．１２では、２ｎ＝１６＋１と３４の両方を示すピークが観察され、この個体がキメラ個体である事を示した。フローサイトメトリー分析によっても、４倍体個体がスクリーニング可能である事が示された。
【図３】再生植物体の根端組織における分裂期の細胞を染色し、染色体を調査した。Ｎｏ．２１（右側）の細胞では、合計３４本の染色体が観察され、大きな動原体を持つシャロット由来第１染色体（矢印１Ａ）も２本確認された。この事は、染色体の倍化により異種染色体もまた倍加されたことを示す。一方キメラ細胞である事が示されたＮｏ．１２（左側）においては、染色体数が１７本、シャロット第１染色体が１本の細胞が見られ、この個体が４倍体でない細胞を含んでいる事を示した。
【図４】第１層、第２層及び第３層それぞれにおける染色体数の推定方法をまとめて示す。
【図５】シャロット第１染色体を１対持つ４倍体ネギにおける、添加染色体の次世代への伝達率を調べた。異種染色体添加２倍体ネギ（ＦＦ＋１Ａ，左側）では、雄性配偶子では０％、雌性配偶子では２４％と低い値であったのに対し、本発明により得られた４倍体ネギ（ＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａ）では雄性雌性とも伝達率が１００％を示した。
【図６】シャロット第１染色体を１対持つ４倍体ネギにおける、アスコルビン酸含有量を調べた。ネギ（ＦＦ）と比較して、４倍体（ＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａ）では２〜３倍のアスコルビン酸含量を示し、これは異種染色体添加２倍体（ＦＦ＋１Ａ）と同等の値であった。２つのグラフ（Ａ，Ｂ）は、２回の試験で得られた個別のデータを表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用植物の品種改良方法に関し、より詳しくは、異種生物の細胞に由来する染色体（以下「異種染色体」という）を有する２倍体の植物細胞において、染色体の倍加により前記異種染色体の次世代伝達能を付与することを特徴とする、４倍体植物細胞の作出方法及び異種染色体添加４倍体植物細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
有用植物の品種改良方法には、かけ合わせによる有用形質の選抜や遺伝子組み換えによる改良など、様々な手法が用いられている。それらの手法の一つとして、有用植物に異種細胞由来の染色体を添加して有用な形質を付与するといった染色体レベルでの品種改良手法も開発され、その利用も少しずつ広がって来ている。異種ゲノムから特定の染色体を一本だけ導入した系統を単一異種染色体添加系統といい、Ｌｅｉｇｈｔｙ＆Ｔａｙｌｏｒ（１９２４）がコムギの単一異種染色体添加系統をはじめて育成して以来、多くの植物種でその作出が行われてきた。１９７０年代迄は、食用作物、工業原料作物、飼料作物等に限れていた研究も、１９８０年代以降、園芸作物においてそれらを育成する試みがなされ始めている（非特許文献１−７）。
【０００３】
しかしながら染色体添加による品種改良法においては、作出方法の都合上２倍体（２ｎ）の細胞に対して半数（ｘ）本の染色体のみが添加され、減数分裂時にこれが生殖細胞に均等分配されない事から、形質が安定しないという大きな問題があった。すなわち、有用な形質を細胞に付与し、かつ、この形質を世代を超えて安定化させるための技術開発が切望されていた。
【特許文献１】特開平７−００５９４６ アリウム属に属する新規植物及びその育種・増殖方法
【特許文献２】特表２０００−５１４６６４ ハイブリッドコムギの生産方法
【特許文献３】特開平６−１５３７３１ 薬用ニンジンの４倍体誘導法
【特許文献４】特開２００１−３２０９９４ ユーカリ属４倍体の作成方法及び生長性かつ発根能力に優れたユーカリ属４倍体
【非特許文献１】Ｌｅｉｇｈｔｙ Ｃ．Ｅ．＆ Ｔａｙｌｏｒ Ｊ．Ｗ．（１９２４）Ｊ．Ａｇｒ．Ｒｅｓ．２８，５６７−５７６．
【非特許文献２】Ｐｅｆｆｌｅｙ Ｅ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７１，１７６−１８４．
【非特許文献３】Ｔａｓｈｉｒｏ Ｙ．Ｔｓｕｔｓｕｍｉ Ｍ．ａｎｄ Ｓｈｉｇｙｏ Ｍ．（２０００）Ａｃｔａ Ｈｒｔｃｕｌｔｕｒａｅ ５２１，２１１−２１７．
【非特許文献４】Ｊａｈｉｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｏｍｅ ３２，４０８−４１３．
【非特許文献５】ＭｃＧｒａｔｈ Ｊ．Ｍ．（１９８９）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ， Ｕｎｉｖ．Ｃａｌｉｆ．
【非特許文献６】Ｗｅｅｄｅｎ Ｎ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｈｏｒｔｓｃｉｅｎｃｅ ２１，１４３１−３３．
【非特許文献７】Ｓｈｉｇｙｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｓ＆Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ ７１，３６３−３７１．
【非特許文献８】北海道ホームページ内「ハイブリッドライグラス テトリライト」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｇｒｉ．ｐｒｅｆ．ｈｏｋｋａｉｄｏ．ｊｐ／ｃｅｎｔｅｒ／ｋｅｎｋｙｕｓｅｉｋａ／ｇａｉｙｏｓｈｏ／Ｓ５９ｇａｉｙｏ／１９８３２４４．ｈｔｍ）
【非特許文献９】Ｓｈｉｇｙｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｊａｐａｎ． Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ． ６８（１），１８−２２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は上記の現状に鑑み、異種染色体が添加された植物細胞において、前記異種染色体を安定に分配し、付与した形質を世代を超えて安定化させるための技術及びこれを用いて作出された植物細胞を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題の解決のため、本発明者らは研究を進め、異種染色体が添加された植物細胞における異種染色体の安定化手法として、ゲノムの倍数性に着目した。形質安定化の阻害要因である「添加染色体の半数性」を解決できれば、品種改良法としてきわめて有効である。植物においては、倍数体個体も正常に成長・繁殖できる例が多く知られている事から、本発明者らは異種染色体添加植物細胞におけるゲノムの倍加を試みた。
【０００６】
有用植物の倍数性については、古くはコムギの品種改良などをはじめ多くの植物で利用されてきた。中でも通常２倍体（２ｎ）を示す細胞の染色体を倍加して４倍体を得る技術は、有用形質の増幅、種間雑種植物への稔性の付与、４倍体植物と２倍体植物とを掛け合わせた３倍体植物作出など、多くの有用植物で活用されてきている。一般的な方法としては、細胞分裂時にコルヒチンなどの有糸分裂阻害物質を添加することで、複製された染色体の娘細胞への分配を阻害し、細胞内の染色体数を倍加させる方法が挙げられる。実際この手法を用い、有用植物の品種改良方法及び改良された有用植物が多くの文献で開示されている（特許文献１−４、非特許文献８）。
【０００７】
本発明者らは上記観点に基づく解析を進め、異種染色体倍加系統の植物体をアルカロイド含有培地において後述の特定条件下で組織培養することにより、ゲノムの核相が４ｎを示しかつ異種染色体が倍加された細胞を作出する事に成功した。また本発明者らは、これらの細胞に由来する植物個体を作出し、この個体が正常に減数分裂を行い異種染色体の次世代伝達能を有している事を確認して、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明の第１の態様は、異種染色体を１対または複数対有し、染色体が４倍性を示す植物細胞を提供する。
【０００９】
本発明の第２の態様は、異種染色体が１本添加された２倍体植物種細胞において、染色体を倍加して得られることを特徴とする、異種染色体添加４倍体植物細胞を提供する。
【００１０】
本発明の第３の態様は、２倍体植物種細胞がユリ科植物由来の細胞である、請求項２に記載の異種染色体添加４倍体植物細胞を提供する。
【００１１】
本発明の第４の態様は、２倍体植物種細胞がユリ科ネギ属植物由来の細胞である、請求項３に記載の異種染色体添加４倍体植物細胞を提供する。
【００１２】
本発明の第５の態様は、２倍体植物種細胞がネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）由来の細胞であって、シャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）由来の染色体を添加されたものであることを特徴とする、請求項４に記載の異種染色体添加４倍体植物細胞を提供する。
【００１３】
本発明の第６の態様は、添加された染色体が、シャロット第１染色体である事を特徴とする、請求項５に記載の異種染色体添加４倍体植物細胞を提供する。
【００１４】
本発明の第７の態様は、異種染色体が１本添加された２倍体植物から組織培養によって得られる事を特徴とする、請求項１から請求項６のうちいずれか１項に記載の異種染色体添加４倍体植物細胞を提供する。
【００１５】
本発明の第８の態様は、請求項１から請求項７のうちいずれか１項に記載の植物細胞に由来する、１対または複数対の異種染色体を有し、前記異種染色体の次世代伝達能を有する事を特徴とする、４倍体植物を提供する。
【００１６】
本発明の第９の態様は、下記工程を含むことを特徴とする、請求項８に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法−（ａ）１本の異種染色体を添加した２倍体植物の組織を単離し、染色体の倍加処理を行う工程。（ｂ）当該組織の組織培養により異種染色体を２本有する４倍体植物組織を発生させる工程。（ｃ）前記４倍体組織から植物個体を発生させる工程（個体再生工程）−を提供する。
【００１７】
本発明の第１０の態様は、１ないし２枚の葉原基を含む成長点を組織培養に用いる、請求項９に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法を提供する。
【００１８】
本発明の第１１の態様は、染色体倍加処理としてアルカロイドを用いる事を特徴とする、請求項９または請求項１０に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法を提供する。
【００１９】
本発明の第１２の態様は、アルカロイドがコルヒチンである、請求項１１に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法を提供する。
【００２０】
本発明の第１３の態様は、染色体倍加処理の反応補助剤として、ジメチルスルホキシドを用いることを特徴とする、請求項１１または請求項１２に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法を提供する。
【００２１】
本発明の第１４の態様は、染色体倍加処理の反応補助用植物ホルモンとして、ショ糖を用いることを特徴とする、請求項１１から請求項１３のうちいずれか１項に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法を提供する。
【００２２】
本発明の第１５の態様は、染色体倍加処理に用いる培地が、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ培地（ＭＳ培地）である、請求項９から請求項１４に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法を提供する。
【００２３】
本発明の第１６の態様は、ＭＳ培地が、寒天及び／またはジェランガムを添加した固体培地である、請求項１５に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法を提供する。
【００２４】
本発明の第１７の態様は、染色体の倍加処理工程における培養条件が、（ｄ）暗黒条件、（ｅ）温度条件２０℃±５℃、（ｆ）培養期間が３日間から５日間、のうち少なくとも１つを満たす、請求項１０から請求項１６のうちいずれか１項に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法を提供する。
【００２５】
本発明の第１８の態様は、染色体倍加後における組織からの個体再生工程に、ジェランガムで凝固したＭＳ培地を用いることを特徴とする、請求項１７に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法を提供する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の提供する異種染色体添加４倍体細胞及びその作出方法を利用する事により、異種間交配などに由来する有用植物の形質を遺伝的に安定化させ、これらの有用植物を特殊な設備や高度な技術を用いること無く、通常の２倍体植物と同様に扱うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下に本発明を詳細に説明する。本発明の第１の態様は、異種染色体を１対または複数対有し、染色体が４倍性を示す植物細胞を提供する。前述のように、異種染色体添加系統では付与した形質の次世代への伝達が、大きな問題であった。本発明はこれを、ゲノムの倍加によって解決するものである。
【００２８】
本発明の第２から第７の態様においては、異種染色体が１本添加された２倍体植物種細胞において、染色体を倍加して得られることを特徴とする、異種染色体添加４倍体植物細胞を提供する。ここにおいて２倍体植物細胞とは、好ましくはユリ科植物、更に好ましくはネギ属植物の細胞であって、好適にはネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）細胞にシャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）由来の第１染色体を添加した細胞である。またこれらの細胞は、好ましくは２倍体植物体から組織培養によって得られる細胞である。本発明は、異種染色体が添加された植物細胞であればどの様な細胞でも応用可能であるが、後述の実施例ではその中でもネギ細胞にシャロット（どちらも食用）の染色体を添加したものを示した。単一染色体添加系統については、その発現する形質についても本発明者らによる解析が進んでおり、シャロットの第１染色体を添加したネギ植物体の一部を組織培養し、染色体倍加処理を行うことによって、ビタミンを高生産でき、かつこの形質が有性生殖を経ても失われないネギ細個体を作出できる事が実証された。
【００２９】
本発明の第８の態様においては、第１から第７の態様に記載した異種染色体添加４倍体植物細胞に由来する４倍体植物を提供する。本発明によって得られた４倍体細胞は、実施例に示す様に、適当な培地と培養条件下において植物体へと成長させる事が可能である。こうして得られた植物体は稔性を持ち、２倍体植物と同様の手法によって子孫を得ることが出来、また添加した染色体の示す形質も問題なく次世代へと伝達される。すなわち、本態様の提供する植物を利用する事によって、高度な技能や複雑な装置を用いることなく、有用な形質を付与した作物を扱うことが可能となる。現時点では、植物体の簡便な再生のために、組織培養による染色体倍加処理が行われているが、再生植物体の遺伝的背景の安定化の観点から、将来的には単一細胞に由来する植物体を用いるのが望ましい。
【００３０】
本発明の第９から第１８の態様においては、第８の態様に記載の植物体を得るための作出方法を提供する。本作出方法は主要な工程３つ、すなわち（ａ）１本の異種染色体を添加した２倍体植物の組織を単離し、染色体の倍加処理を行う工程、（ｂ）当該組織の組織培養により異種染色体を２本有する４倍体植物組織を発生させる工程、（ｃ）前記４倍体組織から植物個体を発生させる工程（個体再生工程）を内包する。（ａ）工程の組織培養は、好ましくは１ないし２枚の葉原基を含む成長点を用いるものであり、また染色体倍化処理としてはアルカロイド、好適にはコルヒチンによる処理を行うものである。前記処理の補助成分としてはジメチルスルホキシド及び／またはショ糖が好ましい。コルヒチンによる染色体倍化処理は、倍数体の植物作成にこれまでも用いられてきたものであるが、ここに補助剤としてジメチルスルホキシドやショ糖を加えることによって、染色体倍加の効率を上げている。（ｂ）工程における組織培養には、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｃｏｏｇ培地（ＭＳ培地）が好ましく、更に好ましくは寒天やジェランガムで固化した培地を用いるのが良い。（ｃ）工程における個体再生工程は、好ましくは（ｄ）暗黒条件、（ｅ）温度条件２０℃±５℃、（ｆ）培養期間が３日間から５日間、のうち少なくとも１つの条件を満たす工程であり、より好ましくは土などに植えられるようになるまでジェランガムで凝固したＭＳ培地上で培養する工程である。植物の組織培養には無菌的な操作が必要であり、かつ培養組織から効率的に植物体を成長させる必要がある。本発明者らは、滅菌処理したＭＳ培地に植えた染色体倍加処理後の組織を、前記（ｄ）から（ｆ）までの条件下で培養することによって効率よく植物体を成長させられる事実を見出し、これを提供するものである。
【実施例１】
【００３１】
（単一異種染色体添加ネギ系統の作出） 本発明の実施例を以下に示すが、本発明は下記実施例に限定されるものでは無い。本発明に係る単一異種染色体添加ネギ系統は、非特許文献７に記載の方法で作出した（Ｓｈｉｇｙｏ ｅｔ ａｌ． １９９６）。作出方法の概要を表１に示す。２倍体のネギ（ＦＦ，２ｎ＝１６）とシャロット（ＡＡ，２ｎ＝１６）を掛け合わせ、雑種第一代（ＡＦ，ｎ＋ｎ＝１６）を得た。染色体の倍加によりＡｍｐｈｉｄｉｐｌｏｉｄ（ＡＡＦＦ，２ｎ＝３２）を得、これにネギ（ＦＦ）を掛け合わせて次代（ＡＦＦ，２ｎ＋ｎ＝２４）を得た。更にこれにネギ（ＦＦ）を掛け合わせると、シャロットゲノムＡに由来する染色体の不均等分配がおこり、この中から染色体１本を含む子孫の系統（Ａｌｉｅｎ ｍｏｎｏｓｏｍｉｃ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｌｉｎｅ）をそれぞれの染色体（第１〜第８）について作出した。
【表１】
【００３２】
（４倍体細胞の作出） 本発明の実施例として、前述の方法で作出したシャロット第１染色体を１本持つネギ系統（ＦＦ＋１Ａ，２ｎ＝１６＋１）を材料に用いた。前記植物体の１ないし２枚の葉原基を含む茎頂部成長点（１ｍｍ以下）を切り出し、０．０５％（ｗ／ｖ）コルヒチン、２％（ｗ／ｖ）ジメチルスルホキシド、３％ショ糖（ｗ／ｖ）を含むＭＳ固形培地（ジェランガムまたは寒天で固化）に置床して、２５℃、暗条件で４日間培養した（倍加処理）。その後、培養した前記組織をホルモンフリーショ糖３％（ｗ／ｖ）ＭＳ寒天培地上に無菌的に移し、２５℃、１６時間日長で３ヶ月間培養して、シャロット第１染色体を１対有する４倍体のネギ単一染色体添加植物細胞（ＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａ，２ｎ＝３４）に由来する植物体（再生植物体）を得た（表２）。
【表２】
【実施例２】
【００３３】
（再生植物体の倍数性調査１） 組織培養に由来する再生植物体では、染色体倍加の確認が重要である。前記方法で作出した再生植物体において、完全展開葉身の中央部から表皮のみをはぎ取り、はぎ取った表皮をスライドグラス上に敷いて、１％酢酸カーミンに２分間浸して核染色を行った。染色完了後カバーグラスを乗せ、光学顕微鏡下で孔辺細胞を観察し、ＦＦ＋１Ａと再生植物体の孔辺細胞直径を比較して、倍数性の推定を行った。孔辺細胞は各個体で１５０細胞ずつ観察し、平均値を求めた。その結果、ＦＦ＋１Ａにおける孔辺細胞直径は平均で約４０μｍあったのに対して（図１Ａ）、再生植物体における平均は約５０μｍであった（図１Ｂ）。本実施例では、表皮をカーミンで染色するという簡便な方法によって、再生植物体の倍数性が簡便に推測可能となった。
【実施例３】
【００３４】
（再生植物体の倍数性調査２） 再生植物体から表層をはぎ取った第２層（皮層、葉肉細胞＋生殖細胞）における倍数性の調査を、フローサイトメトリー分析を用いて行った。材料としては、ＦＦ＋１Ａ、再生植物体及び Ａ．ｖａｖｉｌｏｖｉｉ（内部標準用）を用いた。プラスチックシャーレに５−７ｍｍ四方大に切り取ったサンプルを採取し、Ｅｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを約２滴滴下した。鋭利なカミソリでこれを細かく刻み、再びＥｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを数滴垂らし、約２分間浸透した。その後、Ｃｅｌｌ Ｔｒｉｃｋｓ ｆｉｌｔｅｒでろ過し、Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒをろ液の４倍量加えた。パラフィルムでサンプル管の口を覆い、上下に穏やかに混合して約２分間浸透した。染色が完了した後、フローサイトメーター（Ｐａｒｔｅｃ社，ＰＡ型）によりＧ１期の蛍光強度別核数を測定した。資料注入速度は１．２０μｌ／ｓ、測定細胞数は約３０００個、検出速度は毎秒１０核前後の条件とした。
【００３５】
図２で示すとおり、２倍体であるＦＦ＋１Ａのピークは、内部標準であるＡ．ｖａｖｉｌｏｖｉｉのピークの左側に現れた。反対に、Ｎｏ．２１で示すとおり、Ａ．ｖａｖｉｌｏｖｉｉより右側にピークを有し、蛍光強度がＦＦ＋１Ａの２倍になっているものを、第２層における倍加細胞と判断した。Ｎｏ．１２の様なピークがＦＦ＋１Ａと４倍体の両方にまたがっているものについては、２倍体細胞と４倍体細胞が混在するキメラ細胞と判断した。
【実施例４】
【００３６】
（再生植物体の倍数性調査３） 植物体中心部の第３層（維管束など含む中心柱）における倍数性調査は、再生植物体の鱗茎より発根した根端細胞の核型分析によって行った。５−１０ｍｍに伸長した二次根を採取し、０．０５％コルヒチン水溶液に入れ約２０℃で約２時間半処理を行った。その後処理した二次根を酢酸エタノール混合液（１：３）に入れ、冷蔵庫で一晩放置して固定した。固定が完了した二次根を１Ｎ ＨＣｌで６０℃、６０分間処理し、塩基性フクシンによるフォイルゲン染色を行った。スライドグラス上に４５％酢酸を１滴落とし、その中に染色した二次根の根端を入れ、カバーグラスを乗せて染色体を一平面上に配列させた後、光学顕微鏡下で染色体数を計測した。
【００３７】
図３に染色の結果を示した。倍加個体における根端細胞の染色体数は、ＦＦ＋１Ａの染色体数（１７本）の２倍の３４本であり、他のネギ染色体より大型の中部動原体を持つシャロット第１染色体が２本観察された（Ｎｏ．２１）。一方、再生植物体Ｎｏ．１２については、第２層の検査で示唆された通り、染色体数が３４本と１７本の２種類の細胞を含んでおり、キメラ細胞である事が示された。上述した第１、第２、第３層それぞれにおける染色体数の推定方法を、図４にまとめた。
【実施例５】
【００３８】
（４倍性再生植物体におけるシャロット第１染色体の伝達率） 第１−３層全てにおいて倍加が推定された再生個体を、ここでは「シャロットの第１染色体を１対持った４倍体ネギ（ＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａ，２ｎ＝３４）」とした。この植物体とネギの２倍体栽培種である『九条細ネギ（２ｎ＝１６）』との間の正逆交雑を行って、シャロット第１染色体が交雑体に伝達されるかどうかを確認した。九条細ネギ♀×４倍性再生植物体♂との交配から、雄性配偶子における添加染色体の伝達率（２ｎ＝２５を示す個体数／得られた全ての個体数×１００，％）を、４倍性再生植物体♀×九条細ネギ♂との交配から、雌性配偶子における添加染色体の伝達率（％）をそれぞれ求めた。本発明者らが以前に明らかにした通り、異種染色体を添加した２倍体ネギ（ＦＦ＋１Ａ）における異種染色体の次世代への伝達率は、雄性配偶子においては０％、雌性配偶子については２４％であった（非特許文献９）。一方、４倍性再生植物体におけるシャロット第１染色体の伝達率は、雄性配偶子・雌性配偶子ともに１００％の値を示し、本発明の課題であった「添加染色体の次世代への伝達」について格段の向上が見られた（図５）。
【実施例６】
【００３９】
（４倍性再生植物体における添加染色体の生化学的分析） シャロット第１染色体を添加したネギ（ＦＦ＋１Ａ）の持つ特性として、高アスコルビン酸含量が挙げられる。本発明により作出された４倍性ネギの再生植物体がこの特性を維持しているかどうか確認するため、葉身部分よりヒドラジン法によってアスコルビン酸量を定量した（図６Ａ、Ｂ）。ＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａの再生植物体においても、２倍体ネギ（ＦＦ）に比べ遙かに高いアスコルビン酸量を示し、特性が維持されている事が確認された。すなわち、本発明の提供する４倍体の植物及びその作出方法は、異種染色体添加による形質を維持しつつ、当該形質の次世代への伝達を容易にするという極めて優れた方法である事が示された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、農産分野において、これまで困難だった異種染色体の添加によって付加された形質の次世代への伝達を容易に可能にするものであり、これは有用植物の品種改良や新品種の作出に大いに利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】異種染色体添加２倍体細胞（Ａ）及び染色体倍化処理後の再生植物体（Ｂ）の表皮組織における、孔辺細胞の直径を比較した。２倍体細胞ではおよそ４０μｍであったのに対して、４倍体細胞では５０μｍの値であった。この事はまた、孔辺細胞の観察という簡易な方法によって、染色体が倍加された４倍体細胞をスクリーニング可能である事も示している。
【図２】対照の２倍体植物及び再生植物体それぞれの起源層第２層由来の細胞を用いたフローサイトメトリーの結果を示す。対照個体（２ｎ＝１６＋１，左側）と比較して、再生個体Ｎｏ．２１（右側）では２ｎ＝３４を示すピークが見られた。一方Ｎｏ．１２では、２ｎ＝１６＋１と３４の両方を示すピークが観察され、この個体がキメラ個体である事を示した。フローサイトメトリー分析によっても、４倍体個体がスクリーニング可能である事が示された。
【図３】再生植物体の根端組織における分裂期の細胞を染色し、染色体を調査した。Ｎｏ．２１（右側）の細胞では、合計３４本の染色体が観察され、大きな動原体を持つシャロット由来第１染色体（矢印１Ａ）も２本確認された。この事は、染色体の倍化により異種染色体もまた倍加されたことを示す。一方キメラ細胞である事が示されたＮｏ．１２（左側）においては、染色体数が１７本、シャロット第１染色体が１本の細胞が見られ、この個体が４倍体でない細胞を含んでいる事を示した。
【図４】第１層、第２層及び第３層それぞれにおける染色体数の推定方法をまとめて示す。
【図５】シャロット第１染色体を１対持つ４倍体ネギにおける、添加染色体の次世代への伝達率を調べた。異種染色体添加２倍体ネギ（ＦＦ＋１Ａ，左側）では、雄性配偶子では０％、雌性配偶子では２４％と低い値であったのに対し、本発明により得られた４倍体ネギ（ＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａ）では雄性雌性とも伝達率が１００％を示した。
【図６】シャロット第１染色体を１対持つ４倍体ネギにおける、アスコルビン酸含有量を調べた。ネギ（ＦＦ）と比較して、４倍体（ＦＦＦＦ＋１Ａ１Ａ）では２〜３倍のアスコルビン酸含量を示し、これは異種染色体添加２倍体（ＦＦ＋１Ａ）と同等の値であった。２つのグラフ（Ａ，Ｂ）は、２回の試験で得られた個別のデータを表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種染色体（異種生物の細胞に由来する染色体）を１対または複数対有し、染色体が４倍性を示す植物細胞。
【請求項２】
異種染色体が１本添加された２倍体植物種細胞において、染色体を倍加して得られることを特徴とする、異種染色体添加４倍体植物細胞。
【請求項３】
２倍体植物種細胞がユリ科植物由来の細胞である、請求項２に記載の異種染色体添加４倍体植物細胞。
【請求項４】
２倍体植物種細胞がユリ科ネギ属植物由来の細胞である、請求項３に記載の異種染色体添加４倍体植物細胞。
【請求項５】
２倍体植物種細胞がネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）由来の細胞であって、シャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）由来の染色体を添加されたものであることを特徴とする、請求項４に記載の異種染色体添加４倍体植物細胞。
【請求項６】
添加された染色体が、シャロット第１染色体である事を特徴とする、請求項５に記載の異種染色体添加４倍体植物細胞。
【請求項７】
異種染色体が１本添加された２倍体植物から組織培養によって得られる事を特徴とする、請求項１から請求項６のうちいずれか１項に記載の異種染色体添加４倍体植物細胞。
【請求項８】
請求項１から請求項７のうちいずれか１項に記載の植物細胞に由来する、１対または複数対の異種染色体を有し、前記異種染色体の次世代伝達能を有する事を特徴とする、４倍体植物。
【請求項９】
下記工程を含むことを特徴とする、請求項８に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法。（ａ）１本の異種染色体を添加した２倍体植物の組織を単離し、染色体の倍加処理を行う工程。（ｂ）当該組織の組織培養により異種染色体を２本有する４倍体植物組織を発生させる工程。（ｃ）前記４倍体組織から植物個体を発生させる工程（個体再生工程）。
【請求項１０】
１ないし２枚の葉原基を含む成長点を組織培養に用いる、請求項９に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法。
【請求項１１】
染色体倍加処理としてアルカロイドを用いる事を特徴とする、請求項９または請求項１０に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法。
【請求項１２】
アルカロイドがコルヒチンである、請求項１１に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法。
【請求項１３】
染色体倍加処理の反応補助剤として、ジメチルスルホキシドを用いることを特徴とする、請求項１１または請求項１２に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法。
【請求項１４】
染色体倍加処理の反応補助用植物ホルモンとして、ショ糖を用いることを特徴とする、請求項１１から請求項１３のうちいずれか１項に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法。
【請求項１５】
染色体倍加処理に用いる培地が、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ培地（ＭＳ培地）である、請求項９から請求項１４に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法。
【請求項１６】
ＭＳ培地が、寒天及び／またはジェランガムを添加した固体培地である、請求項１５に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法。
【請求項１７】
染色体の倍加処理工程における培養条件が、（ｄ）暗黒条件、（ｅ）温度条件２０℃±５℃、（ｆ）培養期間が３日間から５日間、のうち少なくとも１つを満たす、請求項１０から請求項１６のうちいずれか１項に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法。
【請求項１８】
染色体倍加後における組織からの個体再生工程に、ジェランガムで凝固したＭＳ培地を用いることを特徴とする、請求項１７に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法。
【請求項１】
異種染色体（異種生物の細胞に由来する染色体）を１対または複数対有し、染色体が４倍性を示す植物細胞。
【請求項２】
異種染色体が１本添加された２倍体植物種細胞において、染色体を倍加して得られることを特徴とする、異種染色体添加４倍体植物細胞。
【請求項３】
２倍体植物種細胞がユリ科植物由来の細胞である、請求項２に記載の異種染色体添加４倍体植物細胞。
【請求項４】
２倍体植物種細胞がユリ科ネギ属植物由来の細胞である、請求項３に記載の異種染色体添加４倍体植物細胞。
【請求項５】
２倍体植物種細胞がネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）由来の細胞であって、シャロット（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）由来の染色体を添加されたものであることを特徴とする、請求項４に記載の異種染色体添加４倍体植物細胞。
【請求項６】
添加された染色体が、シャロット第１染色体である事を特徴とする、請求項５に記載の異種染色体添加４倍体植物細胞。
【請求項７】
異種染色体が１本添加された２倍体植物から組織培養によって得られる事を特徴とする、請求項１から請求項６のうちいずれか１項に記載の異種染色体添加４倍体植物細胞。
【請求項８】
請求項１から請求項７のうちいずれか１項に記載の植物細胞に由来する、１対または複数対の異種染色体を有し、前記異種染色体の次世代伝達能を有する事を特徴とする、４倍体植物。
【請求項９】
下記工程を含むことを特徴とする、請求項８に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法。（ａ）１本の異種染色体を添加した２倍体植物の組織を単離し、染色体の倍加処理を行う工程。（ｂ）当該組織の組織培養により異種染色体を２本有する４倍体植物組織を発生させる工程。（ｃ）前記４倍体組織から植物個体を発生させる工程（個体再生工程）。
【請求項１０】
１ないし２枚の葉原基を含む成長点を組織培養に用いる、請求項９に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法。
【請求項１１】
染色体倍加処理としてアルカロイドを用いる事を特徴とする、請求項９または請求項１０に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法。
【請求項１２】
アルカロイドがコルヒチンである、請求項１１に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法。
【請求項１３】
染色体倍加処理の反応補助剤として、ジメチルスルホキシドを用いることを特徴とする、請求項１１または請求項１２に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法。
【請求項１４】
染色体倍加処理の反応補助用植物ホルモンとして、ショ糖を用いることを特徴とする、請求項１１から請求項１３のうちいずれか１項に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法。
【請求項１５】
染色体倍加処理に用いる培地が、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ培地（ＭＳ培地）である、請求項９から請求項１４に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法。
【請求項１６】
ＭＳ培地が、寒天及び／またはジェランガムを添加した固体培地である、請求項１５に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法。
【請求項１７】
染色体の倍加処理工程における培養条件が、（ｄ）暗黒条件、（ｅ）温度条件２０℃±５℃、（ｆ）培養期間が３日間から５日間、のうち少なくとも１つを満たす、請求項１０から請求項１６のうちいずれか１項に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法。
【請求項１８】
染色体倍加後における組織からの個体再生工程に、ジェランガムで凝固したＭＳ培地を用いることを特徴とする、請求項１７に記載の異種染色体添加４倍体植物の作出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００７−１７４９４６（Ｐ２００７−１７４９４６Ａ）
【公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３７５５８０（Ｐ２００５−３７５５８０）
【出願日】平成１７年１２月２７日（２００５．１２．２７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１７年１０月１日 園芸学会発行の「園芸学会雑誌第７４巻別冊２ー２００５−」に発表
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【出願人】（３９１０１６０８２）山口県 (54)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２７日（２００５．１２．２７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１７年１０月１日 園芸学会発行の「園芸学会雑誌第７４巻別冊２ー２００５−」に発表
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【出願人】（３９１０１６０８２）山口県 (54)
【Ｆターム（参考）】
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