癌に関連する変異体細胞表面分子
【解決手段】 ｍｅｓｏｖｔ２のタンパク質及び核酸配列、それらに対する特異的抗体、ｍｅｓｏｖｔ２産生細胞の成長を標的化及び／若しくは阻害する方法、及び、悪性度を診断するためにｍｅｓｏｖｔ２を使用する方法が提供される。特定の癌、特にｍｅｓｏｖｔ２抗原の細胞表面発現が増加した癌（例えば、膵臓腺癌、肺癌、及び卵巣癌など）の治療において、ｍｅｓｏｖｔ２抗体を使用する方法も提供される。本発明は、モノクローナル抗体、誘導体、及び断片を発現する細胞にも関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、２００３年８月５日に出願された米国特許仮出願番号第６０／４９３，０４０号明細書、及び２００３年９月１２日に出願された米国特許仮出願番号第６０／５０２，７１５号明細書に対して優先権を主張するものであり、それぞれの全体はこの参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）変異体であるｍｅｓｏｖｔ２の発見に関するものであり、このｍｅｓｏｖｔ２のＲＮＡ及びタンパク質発現は、癌に関連している。本発明は、前記タンパク質及び核酸配列を利用する及び産生する方法、及びｍｅｓｏｖｔ２を産生している細胞の成長を標的化する及び／若しくは阻害する方法、及びｍｅｓｏｖｔ２によって悪性度を診断するために使用する方法を含む。治療に使用する方法は、ｍｅｓｏｖｔ２−特異的ポリペプチド及びその誘導体を使用することによる、液性及び細胞性仲介免疫を含む。特定の癌、特に、例えば膵臓腺癌、肺癌及び卵巣癌などのｍｅｓｏｖｔ２抗原の細胞表面発現が増加している癌の治療において、抗体は有用である。本発明は、モノクローナル抗体、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体などの抗体誘導体、抗体断片、前記モノクローナル抗体、誘導体及び断片を発現している哺乳類細胞を発現しているハイブリドーマ細胞と、ｍｅｓｏｖｔ２に特異的な抗体、誘導体及び断片を用いて癌を検出し治療する方法とに関するものである。
【０００３】
悪性組織に特異的な細胞表面抗原の同定は、癌を治療するための治療アプローチを提供する。多くの細胞表面抗原は、正常組織と比較すると、悪性組織においては過剰発現していると報告されているが、悪性状態において一部のみが特異的に発現している（１）。選択的スプライシング、異常転写後修飾、或いは変異に起因した構造性変異を示す、細胞表面タンパク質の同定は、疾患特異的組織に関連した標的抗原に別のレベルの特異性を与える（１）。メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）は、６９ｋＤａ前駆体として合成され、３０ｋＤａのＮＨ２−末端分泌型及び４０ｋＤａの膜結合型へとタンパク質分解的に処理された、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−連結糖タンパク質である（２）。メソテリンは、正常中皮細胞上、及びいくつかの腫瘍（例えば、中皮種及び卵巣癌を含む）の表面上に存在することが報告されてきた（２、３、４、５）。メソテリン（ここではメソテリンＡと言及される）は、２つの分類：１番目の分類は、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ３で免疫化したマウスから単離された抗血清を使用し（５）、２番目の分類は、巨核球増強因子としてコード化ｃＤＮＡをクローン化した（６）、によって同定された。その後、３番目の分類は、可溶性アイソフォームを生じる選択的スプライシング変異体を同定した（７）。いくつかのグループは、癌に対するメソテリンＡ−特異的免疫療法を使用するための治療アプローチを開発したが、正常中皮上でのこの抗原の強い発現に起因した、激しい副作用が報告された（８）。Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら（９、１０）は、シュードモナスエンテロトキシンＡ［ＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８］に由来した免疫毒素と抱合し、メソテリンＡを発現した細胞を特異的に殺傷することができ、完全長メソテリンＡ ｃＤＮＡで安定に形質移入された異所性ｓ．ｃ．頸類表皮癌細胞に対して抗腫瘍効果を発揮する（１０）、単鎖抗体とのメソテリンＡ高結合親和性の利用を教示している。
【０００４】
本発明者らは、癌細胞タイプに関連し、ｍｅｓｏｖｔ２と呼ばれる共通メソテリンアイソフォームの発見を本明細書において報告する。この抗原は、開示されたメソテリンＡを標的化できる抗体の使用及び免疫ベース療法を記載した他の人によって報告され（５、６、７）、米国特許番号第５，３２０，９５６号、第５，５２５，３３７号、５，８１７，３１３号、第６，０８３，５０２号、及び第６，１５３，４３０号に参照されたものとは異なるアイソフォームを提示している。Ｍｅｓｏｖｔ２は、特異的抗血清、及び悪性細胞タイプを標的化でき、中皮組織などの正常組織を損傷することによってあり得る毒性を避けることができる、本分野では既知である他の免疫療法戦略の開発のために有用である（８）。
【０００５】
メソテリンＡタンパク質に対する抗体及び免疫毒性の投与は、卵巣癌の治療ようの戦略として提案されてきた（９、１０）。中皮細胞におけるこのメソテリンアイソフォームの強い発現に起因して、この種を標的化することによる副作用が生じる可能性がある。ｍｅｓｏｖｔ２がより共通して癌細胞株及び悪性組織と関連しているように見えるという発見によって、癌特異的標的化にとって有用であり、それによって、原発性中皮細胞で発現したメソテリンＡアイソフォームを認識しないことによる毒性を避けることができることが示唆された。
【０００６】
癌での抗体療法の困難な問題は、しばしば前記抗体の標的が、腫瘍組織と同様に正常組織でも発現していることである。従って、癌細胞を殺傷するために使用される抗体は、正常細胞に対する有害な効果も有する。ユニークな標的或いは癌組織において優先的に発現された標的を発見することは、多くの癌において困難であったと示された。卵巣癌、膵臓癌、肺癌、及び他のメソテリンを有する癌に対しており、正常組織との反応性の問題を回避した、より効果的な抗体療法が必要とされている。ｍｅｓｏｖｔ２の特異的標的化は、この問題を回避し、癌特異的療法を提供する。
【発明の開示】
【発明の効果】
【０００７】
メソテリンを過剰発現している腫瘍は、ｍｅｓｏｖｔ２と呼ばれるスプライス変異体を発現する傾向があると発見された。あらゆる特定の理論によって縛られることを望まず、ｍｅｓｏｖｔ２の発現は、悪性細胞タイプに対する選択的利点を提供すると考えられる。以前に、他の研究者によって、多くの癌におけるメソテリンの過剰発現が発見されたが、同定されたアイソフォームは、メソテリンＡ形態であった。癌細胞株或いは原発悪性細胞におけるｍｅｓｏｖｔ２の発現は、以前には記載されていなかった。Ｋｏｊｉｍａら（６）は、膵臓癌細胞株から単離した、巨核球増強因子（ＭＰＦ）と呼ばれる６９ｋＤａのタンパク質を同定し、それによってｍｅｓｏｖｔ２可変配列が前タンパク質前駆体の一部として存在することを示した。しかしながら、ＭＰＦの発現解析によって、前記遺伝子産物の強い発現は、正常肺において観察された。この発見は、本発明の利用性を示唆し、ｍｅｓｏｖｔ２特異的ヌクレオチド、或いはタンパク質ベースプローブを用いて、前記ｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームの特異的発現が決定され得る。
【０００８】
本発明は、ｍｅｓｏｖｔ２と呼ばれる変異体メソテリン分子をコード化したヌクレオチド及びタンパク質配列、及び抗体を提供する。Ｍｅｓｏｖｔ２は、癌細胞において特異的に発現される。Ｍｅｓｏｖｔ２発現は、様々な形態の癌の診断及び治療に有用である。そのような治療方法の１つは、特異的抗体であって、ｍｅｓｏｖｔ２に対する抗体は、ｍＡＢ Ｋ１（Ｃｈａｎｇらによって開発された（３））或いはＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙらによって開発された（９、１０））によって容易に検出されるメソテリンＡアイソフォームとは区別され得るものである、すなわち、（ａ）前記抗体は、Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８抗体によって認識されるものとは別のアイソフォームを認識し、ｍＡＢ Ｋ１或いは単鎖ｆｖＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８によって認識されるエピトープとは別のエピトープに結合する、（ｂ）前記抗体は、ｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームを特異的に認識できる、或いは（ｃ）前記抗体は、メソテリンＡとは異なるｍｅｓｏｖｔ２のドメインを認識するものである。
【０００９】
本発明の抗体は、少なくとも約１ｘ１０−７Ｍ、１ｘ１０−８Ｍ、１ｘ１０−９Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍ、１ｘ１０−１１Ｍ、１ｘ１０−１２Ｍの親和性を有しており、標的細胞の細胞表面上のエピトープを認識する。
【００１０】
本発明の抗体は、キメラ抗体であり、これに限定されるものではないが、これはヒト−マウスキメラ抗体を含む。本発明の抗体は、ヒト化抗体でもある。本発明は、本発明の抗体を発現するハイブリドーマ細胞、本発明の交代をコード化するポリヌクレオチド、本発明の抗体をコード化するポリヌクレオチドを有するベクター、及び本発明のベクターを有する発現細胞も提供する。
【００１１】
本発明は、ｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合し、メソテリンＡ形態には結合しない抗体を産生する方法も提供し、ここにおいて前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８とは、（ａ）前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８によって検出されるエピトープとは異なるエピトープに結合する、或いは（ｂ）前記抗体はｍｅｓｏｖｔ２を提示する特異的エピトープに結合するという点で異なっているものである。前記方法は、本発明の抗体を発現するハイブリドーマ細胞、或いは本発明の抗体をコード化するポリヌクレオチドを含むベクターを有する発現細胞を培養する工程を有する。本発明の発現細胞は、細菌、酵母、昆虫、或いは動物細胞であり、好ましくは哺乳類細胞である。
【００１２】
本発明はさらに、ｍｅｓｏｖｔ２の発現の増加に関与する形成異常細胞の成長を阻害する方法を提供し、この方法は、そのような形成異常細胞を有する患者へ、ｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合する抗体を有する組成物を投与する工程を有し、ここにおいて前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１或いはＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８とは、（ａ）前記抗体はｍＡｂ Ｋ１或いはＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８のエピトープとは異なるエピトープに結合する、（ｂ）前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１或いはＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８と比較して、前記ｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに対して有意な親和性を有して結合する、或いは（ｃ）前記抗体は、メソテリンの前記ｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームへの結合に対して、ｍＡｂ Ｋ１或いはＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８とは競合しないという点で異なっている。前記方法は、例えば、これに限定されるものではないが、肺、卵巣、及び膵臓癌などの様々な形態異常状態に対して使用される。特定の実施形態において、前記患者は、ヒト患者である。いくつかの実施形態において、前記抗体は、これに限定されるものではないが、例えば放射性ヌクレオシド、トキシン、及び化学療法因子などの免疫毒性因子と抱合されるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本明細書において参照されたＧｅｎＢａｎｋデータベース配列に対するアクセッション番号を含む、参照研究、特許、特許出願、及び科学論文は、当業者の知識を構築し、それぞれが特定に、個々に参照によって組み込まれるように示されたのと同等に、それらの全体はこの参照によってここに組み込まれるものである。ここに引用されたあらゆる参考文献と、本明細書の開示との間の不一致は、後者を支持して解決されるべきものである。同様に、単語や語句の本分野で理解された定義と、本明細書に特に開示されているような単語や語句の定義との間の不一致は、後者を支持して解決されるべきものである。
【００１４】
標準参考文献は、本分野では既知である組換えＤＮＡ技術の一般的な原理を説明するために参照し、これには、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＡＮＤ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＥＤＩＣＩＮＥ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ（１９９５）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｅｄ．，ＤＩＲＥＣＴＥＤ ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）を含む。
【００１５】
本発明は、メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合するモノクローナル抗体を使用して、癌細胞の成長、及び腫瘍性疾患の進行を減少させる方法を提供する。本発明の方法は、哺乳類（ヒトを含む）における腫瘍細胞の成長及び癌の進行を調節するために使用される。阻害される前記癌細胞は、正常ヒト組織、特に配、卵巣、及び膵臓癌細胞に関して、ｍｅｓｏｖｔ２の発現が増加する全ての癌細胞を含む。
【００１６】
実行の特定な理論によって束縛されることなく、癌細胞におけるｍｅｓｏｖｔ２の発現の増加は、前記細胞の表面上のメソテリンのこのアイソフォームの関連性の増加をもたらすと考えられている。従って、癌細胞は、正常組織に関して、ｍｅｓｏｖｔ２の発現が増加している。また、メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームは、癌における抗体、或いは免疫ベース療法に対する理想的な標的である。
【００１７】
ここで用いられたように、「エピトープ」という用語は、モノクローナル抗体が特異的に結合する、抗原の一部分を意味している。
【００１８】
ここで用いられたように、「高次構造的エピトープ」という用語は、一連の連続アミノ酸以外の抗原のアミノ酸の間の空間的な関係によって形成される不連続エピトープを意味している。
【００１９】
ここで用いられたように、「アイソフォーム」という用語は、所定のポリペプチドの特異的形態を意味している。
【００２０】
ここで用いられたように、「免疫ベース」という用語は、特異的に或いは選択的に標的産生細胞を殺傷することができる免疫反応を産生するためのタンパク質に基づいた治療法を意味している。
【００２１】
ここで用いられたように、「ｉｎ ｖｉｔｒｏでの形態異常細胞の成長の阻害」という用語は、培養における腫瘍細胞数の減少、すなわち、約５％、好ましくは１０％、より好ましくは２０％、より好ましくは３０％、より好ましくは４０％、より好ましくは５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは１００％の減少を意味する。腫瘍細胞成長のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害は、ＧＥＯ細胞軟寒天アッセイなどの本分野では既知のアッセイで測定される。
【００２２】
ここで用いられたように、「ｉｎ ｖｉｖｏでの形態異常細胞の成長の阻害」という用語は、動物における腫瘍細胞数の減少、すなわち、約５％、好ましくは１０％、より好ましくは２０％、より好ましくは３０％、より好ましくは４０％、より好ましくは５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは１００％の減少を意味する。腫瘍細胞成長のｉｎ ｖｉｖｏ調節は、本分野では既知のアッセイで測定される。
【００２３】
ここで用いられたように、「形態異常細胞」は、異常成長を示す細胞を意味している。形態異常細胞は、これに限定されるものではないが、腫瘍細胞、過形成性細胞、及びそれらと同等物を含む。
【００２４】
「予防する」という用語は、生物が異常状態になる或いは発展する可能性を減少することを意味する。
【００２５】
「治療する」という用語は、治療効果を有し、生物における異常状態を少なくとも部分的に軽減する或いは抑制することをを意味している。治療は、腫瘍成長の阻害及び寛解期の誘導を維持することを含む。
【００２６】
「治療効果」という用語は、異常状態の阻害を意味する。治療効果は、前記異常状態の症状の１若しくはそれ以上をある程度軽減する。異常状態の治療に関して、治療効果は、以下の：（ａ）細胞の増殖、成長及び／若しくは分化における増加或いは減少、（ｂ）ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の成長の阻害（すなわち、緩徐化或いは停止）、（ｃ）細胞死の促進、（ｄ）変性の阻害、（ｅ）前記異常状態に関連する症状の１若しくはそれ以上のある程度の軽減、及び（ｆ）細胞集団の機能の増強、の１若しくはそれ以上を言及することができる。本明細書に記載された前記モノクローナル抗体及びそれらの誘導体は、単独で、或いは本発明の組成物の抱合体或いは添加化合物との組み合わせで、前記治療効果を達成する。
【００２７】
ここで用いられたように、「癌の進行を阻害する」という用語は、未治療癌細胞の末期病状に対する調節と関連した、末期癌に対する腫瘍性疾患の調節を緩徐化する治療の活動を意味する。
【００２８】
ここで用いられたように、「約」という用語は、許容可能な範囲内の規定値の近似値を意味する。好ましくは、この範囲は、規定値の＋／−５％である。
【００２９】
ここで用いられたように、「腫瘍性疾患」という用語は、組織の細胞の異常増殖によって特徴付けられる状態を意味する。
【００３０】
抗体
本発明の抗体は、メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記抗体は、メソテリンの他の形態に結合する。他の実施形態において、前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１或いはＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８によって結合されるもの以外のエピトープに結合する。
【００３１】
好ましい実施形態、及び本発明の方法に使用するのに適している抗体は、例えば、完全ヒト抗体、ヒト抗体相同体、ヒト化抗体相同体、キメラ抗体相同体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦ（ｖ）抗体断片、単鎖抗体、及び抗体重鎖或いは軽鎖の単量体或いは二量体、或いはそれらの混合物を含む。
【００３２】
本発明の抗体は、タイプＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（それらのサブタイプも同様に）を含むあらゆるアイソタイプの無傷免疫グロブリンを含む。免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ或いはラムダである。
【００３３】
本発明の抗体は、抗原結合特異性を保持する無傷抗体の一部、例えばＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ｖ）断片、重鎖単量体或いは二量体、軽鎖単量体或いは二量体、１つの重鎖と１つの軽鎖から成る二量体、及びそれらの同等物を含む。従って、抗原結合断片、さらに上述した抗体から由来した完全長二量体或いは三量体ポリペプチドは、それ自体で有用である。
【００３４】
本発明の発現細胞は、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞などの、既知のあらゆる昆虫発現細胞株を含む。前記発現細胞株は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（出芽酵母）、及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（分裂酵母）細胞などの酵母細胞株でもある。前記発現細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣、仔ハムスター腎臓細胞、ヒト胚性腎臓細胞株２９３、正常イヌ腎臓細胞株、正常ネコ腎臓細胞株、サル腎臓細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ＣＯＳ細胞、非腫瘍原性マウス筋芽細胞Ｇ８細胞、線維芽細胞株、骨髄腫細胞株、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＬＭＴＫ３１細胞、マウスセルトリ細胞、ヒト頚腫瘍細胞、バッファローラット肝臓細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝臓細胞、マウス乳癌細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞などの哺乳類細胞でもある。
【００３５】
「キメラ抗体」は、免疫グロブリン軽鎖、重鎖、或いは両者のヒンジ及び定常領域の全て或いは一部が、別の動物の免疫グロブリン軽鎖或いは重鎖からの対応領域に置換されている、組換えＤＮＡ技術によって産生された抗体である。このようにして、親モノクローナル抗体の前記抗原結合部分は、別の種の抗体のバックボーンへ移される。欧州特許番号第ＥＰ ０２３９４００号（Ｗｉｎｔｅｒら）に記載された１つのアプローチは、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン可変領域ドメインからのＣＤＲｓを、マウス可変領域ドメインからのＣＤＲｓに置換するという、ある種の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を別の種のそれに置換することを示している。これらの改変抗体は、次にヒト免疫グロブリン定常領域に連結し、前記抗原に特異的である、置換されたマウスＣＤＲｓ以外はヒトである抗体を形成する。抗体のＣＤＲ領域を移す方法は、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２７及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４〜１５３６に記載されている。
【００３６】
キメラ抗体は、より少ないマウスアミノ酸配列を含むキメラ抗体よりもヒトにおける免疫反応を誘発する問題を回避すると考えられた。ヒト治療因子としてのげっ歯類ＭＡｂｓの直接的な使用は、げっ歯類由来抗体で処置された著しくたくさんの患者において生じた、ヒト抗げっ歯類抗体（「ＨＡＲＡ」）反応を導いた（Ｋｈａｚａｅｌｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１５：４２〜５２）。
【００３７】
制限のない実施例として、ＣＤＲを移す方法は、前記標的抗原（例えばｍｅｓｏｖｔ２）に結合する目的の抗体のマウス重鎖及び軽鎖を配列化し、ＣＤＲ ＤＮＡ配列を遺伝的に改変し、部位特異的変異誘発によって対応するヒトＶ領域にこれらのアミノ酸配列を課すことによって実行される。望みのアイソタイプのヒト定常領域遺伝子セグメントを付加し、「ヒト化」重鎖及び軽鎖遺伝子を哺乳類細胞において共発現させ、可溶性ヒト化抗体を産生した。一般的な発現細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。前記キメラ抗体を作成するのに適切な方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２７；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９；及びＯｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３８３３に記載されている。
【００３８】
ＨＡＲＡ反応の問題を回避するための抗体の更なる改良点は、「ヒト化抗体」の開発を導く。ヒト化抗体は、組換えＤＮＡ技術によって産生され、ここにおいて、抗原結合に必要でないヒト免疫グロブリン軽鎖或いは重鎖のアミノ酸の少なくとも１つは、非ヒト哺乳対免疫グロブリン軽鎖或いは重鎖からの対応するアミノ酸に置換される。例えば、免疫グロブリンがマウスモノクローナル抗体である場合、抗原結合に必要でない少なくとも１つのアミノ酸は、その位置の対応するヒト抗体上に存在するアミノ酸を用いて置換される。操作のあらゆる特定の理論に束縛されることなく、前記モノクローナル抗体の「ヒト化」は、外来免疫グロブリン分子に対するヒト免疫反応を阻害すると考えられる。
【００３９】
Ｑｕｅｅｎら（（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９〜１００３３及び国際特許番号第ＷＯ ９０／０７８６１号）は、ヒト化抗体の調合を記載した。ヒト及びマウス可変フレームワーク領域は、最適タンパク質配列相同性に対して選択された。前記マウス可変領域の三次構造は、コンピュータ−モデル化し、相同性ヒトフレームワークに重ねたものであり、マウスＣＤＲｓとのアミノ酸残基の最適な相互作用を示した。これは、抗原に対する改善された結合親和性（この親和性は、ＣＤＲ−移植キメラ抗体を作成する際に一般的に減少する）を有する抗体の開発を導いた。ヒト化抗体を作成するための代わりのアプローチは、本分野では既知であり、例えば、Ｔｅｍｐｅｓｔ（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６〜２７１に記載されている。
【００４０】
「単鎖抗体」とは、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖断片をアミノ酸の改変スパンを介してＦｖ領域へ連結させるという組換えＤＮＡ技術によって形成された抗体を意味している。単鎖抗体を産生する様々な方法は、既知であり、米国特許番号第４，６９４，７７８号；Ｂｉｒｄ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３〜４４２；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９〜５８８３；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４５４；Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８〜１０４１に記載されているものを含む。
【００４１】
本発明の抗体は、単独で、或いは細胞毒性因子との免疫複合体として使用される。いくつかの実施形態において、前記細胞毒性因子は、これに限定されるものではないが、リード（Ｌｅａｄ）−２１２、ビスマス（Ｂｉｓｍｕｔｈ）−２１２、アスタチン（Ａｓｔａｔｉｎｅ）−２１１、イオジン（Ｉｏｄｉｎｅ）−１３１、スカンジウム（Ｓｃａｎｄｉｕｍ）−４７、レニウム（Ｒｈｅｎｉｕｍ）−１８６、レニウム（Ｒｈｅｎｉｕｍ）−１８８、イットリウム（Ｙｔｔｒｉｕｍ）−９０、イオジン（Ｉｏｄｉｎｅ）−１２３、イオジン（Ｉｏｄｉｎｅ）−１２５、ブロマイン（Ｂｒｏｍｉｎｅ）−７７、インジウム（Ｉｎｄｉｕｍ）−１１１、及びホウ素（Ｂｏｒｏｎ）−１０或いはアクチニド（Ａｃｔｉｎｉｄｅ）などの核分裂性核種を含む放射性同位元素である。他の実施形態において、前記細胞毒性因子は、これに限定されるものではないが、リシン、修飾シュードモナスエンテロトキシン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）Ａ、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、５−フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、及びそれらの同等物を含む、よく知られたトキシン（毒素）及び／若しくは細胞毒性剤である。そのような細胞毒性因子への抗体及び抗体断片の抱合は、文献においてよく知られている。
【００４２】
本発明の抗体は、例えば、前記抗体へのあらゆるタイプの分子の共有結合性接着（この共有結合性接着は、前記抗体がそのエピトープに結合することを阻害しない）によって修飾された誘導体を含む。適切な誘導体の例としては、これに限定されるものではないが、グリコシル化抗体及び断片、アセチル化抗体及び断片、ペグ化抗体及び断片、リン酸化抗体及び断片、及びアミド化抗体及び断片を含む。本発明の抗体及びそれらの誘導体は、既知の保護／封鎖基、タンパク質分解性切断、細胞性リガンド或いは他のタンパク質への連結、及びそれらと同等なものによって誘導体化されることによってなり得る。さらに、本発明の抗体及びそれらの誘導体は、１若しくはそれ以上の非古典的なアミノ酸を含有する。
【００４３】
本発明は、卵巣癌患者の末梢血単核細胞から由来した抗体などの完全ヒト抗体も含む。そのような細胞は、骨髄腫細胞と融合され、例えば、ｍｅｓｏｖｔ２に対する完全ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を形成する。
【００４４】
操作のあらゆる特定の理論に束縛されることなく、本発明の抗体は、癌細胞に関連した選択的スプライシング現象に起因する８アミノ酸の欠如によるタンパク質内の構造改変のため、メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに結合するために特に有用であることが考えられる。これは、癌細胞において特異的に認識され得るタンパク質抗原を導く。これは、本発明の抗体が正常組織に比べて腫瘍組織へより密接に結合するので、腫瘍を標的化するためには非常によい特徴である。
【００４５】
ｍｅｓｏｖｔ２に対する抗体を産生する方法
免疫化動物
本発明は、メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する方法も提供する。ｍｅｓｏｖｔ２は、タンパク質を単離及び精製するための様々なよく知られた技術を用いて、細胞から或いは組換えシステムから精製される。例えば、これに限定されるものではないが、ｍｅｓｏｖｔ２は、前記タンパク質をＳＤＳ−ＰＣＧＥゲルに供し、前記タンパク質をメンブレンにブロットすることによる、前記タンパク質の明らかな分子量に基づいて単離される。その後、メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２に対応する適切なサイズのバンドを、前記メンブレンから切り取り、動物の免疫原として直接使用した、若しくは前記メンブレンから前記タンパク質をまず抽出する或いは溶出することによって使用した。代わりの実施例として、前記タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィー単独、或いは単離及び精製の他の手段との組み合わせによって単離した。精製の他の手段は、Ｚｏｌａ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＵＳＥ ＯＦ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＤＥＲＩＶＡＴＩＶＥＳ（ＢＡＳＩＣＳ：ＦＲＯＭ ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ ＴＯ ＢＥＮＣＨ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００；ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩＯＮ，Ｃｈａｐｔｅｒ １１，"Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，"Ｈｏｗａｒｄ ａｎｄ Ｂｅｔｈｅｌｌ，Ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２０００；ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（ＳＰＲＩＮＧＥＲ ＬＡＢ ＭＡＮＵＡＬ．）Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，２００１などの標準参照テキストにおいて利用可能である。
【００４６】
ｍｅｓｏｖｔ２に対する抗体を産生するための１つの戦略は、ｍｅｓｏｖｔ２の組換え形態、或いはｍｅｓｏｖｔ２に特異的な領域から成るポリペプチドを有する免疫化動物を含む。そのように免疫化された動物は、前記タンパク質或いはポリペプチドに対する抗体を産生するであろう。従って、本発明は、ｍｅｓｏｖｔ２に特異的に結合する抗体を含むポリクローナル血清を含む。標準的な方法は、これに限定されるものではないが、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ & Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７を参照）、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２）、及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ，ｅｔ ａｌ．ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５，ｐｐ．７７〜９６を参照）を含む、モノクローナル抗体を作成するとして知られている。
【００４７】
抗体特異性のスクリーニング
メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合する抗体をスクリーニングすることは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて達成され、マイクロタイタープレートはメソテリンのｍｅｓｏｖｔ２形態でコーティングされている。ポジティブに反応するクローンからの抗体はさらに、メソテリンＡでコーティングされたマイクロタイタープレートを用いて、メソテリンのメソテリンＡ形態に対するＥＬＩＳＡ−ベースアッセイにおいて反応性をスクリーニングされた。メソテリンのメソテリンＡ形態に反応性を有する抗体を産生するクローンは除去し、ｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに反応性を有する抗体を産生するクローンのみを、更なる増殖及び発生のために選択した。
【００４８】
メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに対する前記抗体の反応性の確認は、例えば、ウエスタンブロットアッセイ（ここにおいて、肺、卵巣、或いは膵臓癌細胞からのタンパク質、及びｍｅｓｏｖｔ２やメソテリンＡｈａ，還元或いは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に供され、メンブレンにブロットされているものである）を用いて達成された。前記メンブレンは次に、仮想抗ｍｅｓｏｖｔ２抗体で探索（プローブ化）した。非還元条件下のメソテリンのｍｅｓｏｖｔ２形態に対する反応性、及びメソテリンのメソテリンＡ形態への非反応性（還元或いは非還元条件下）によって、ｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに対する反応性の特異性が確認された。
【００４９】
本発明の抗体及びそれらの誘導体は、１ｘ１０−２以下の解離定数（Ｋｄ）を含む結合親和性を有している。いくつかの実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−３以下である。他の実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−４以下である。いくつかの実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−５以下である。更なる他の実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−６以下である。他の実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−７以下である。他の実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−８以下である。他の実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−９以下である。他の実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−１０以下である。更なる他の実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−１１以下である。いくつかの実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−１２以下である。他の実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−１３以下である。他の実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−１４以下である。更なる他の実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−１５以下である。
【００５０】
抗体の産生
本発明の抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏ或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで産生される。ｉｎ ｖｉｖｏ抗体産生に対して、動物は、ｍｅｓｏｖｔ２の免疫原部分（好ましくはｍｅｓｏｖｔ２に特異的な領域）で一般的に免疫化されるものである。
【００５１】
１実施形態において、動物を免疫化するための、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏの免疫化細胞のために使用された前記免疫原は、ＶＮＫＧＨＥＭＳＰＱＶＡＴＬＩＤＲＦＶＫＧＲＧＱＬＤＫ（配列ＩＤ番号：７）のアミノ酸配列を有するポリペプチド、或いはその免疫原性部分である。前記免疫原性部分は、配列ＩＤ番号：７の少なくとも１０〜２７連続アミノ酸を有する。いくつかの実施形態において、前記免疫原性部分は、配列ＩＤ番号：７の少なくとも１５連続アミノ酸を有しており、他の実施形態においては、前記免疫原性部分は、配列ＩＤ番号：７の少なくとも２０連続アミノ酸を有しており、他の実施形態においては、前記免疫原性部分は、配列ＩＤ番号：７の少なくとも２４連続アミノ酸を有しており、他の実施形態においては、前記免疫原性部分は、配列ＩＤ番号：７の少なくとも２７連続アミノ酸を有している。
【００５２】
特定の実施形態において、ＮＫＧＨＥＭＳＰＱＶＡＴＬＩＤ（配列ＩＤ番号：１２）のアミノ酸配列を有し、ｐＭＥＳＯ２と命名されたペプチドが合成される。このペプチドは、メソテリンＡとｍｅｓｏｖｔ２を比較した際、アミノ酸の欠損が生じる接合点に及ぶ（図４を参照）。前記接合部は、配列ＩＤ番号：１２のセリンとプロリンとの間に生じる、つまり、ＮＫＧＨＥＭＳ／ＰＱＶＡＴＬＩＤである。さらに、他のペプチドは、ｍｅｓｏｖｔ２分子の他の部分に対して合成され、例えばｐＭＥＳＯ１：ＥＶＥＫＴＡＣＰＳＧＫＫＡＲＥ（配列ＩＤ番号：１３）、ｐＭＥＳＯ３：ＲＦＶＫＧＲＧＱＬＤＫＤＴＬＤ（配列ＩＤ番号：１４）、ｐＭＥＳＯ４：ＨＶＥＧＬＫＡＥＥＲＨＲＰＶＲ（配列ＩＤ番号：１５）などである。破傷風トキソイド（ＴＴ）をｍｅｓｏｖｔ２ペプチド或いはタンパク質と融合させる実験に対して、ＴＴアミノ酸配列（例えば、ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列ＩＤ番号：１６））から由来したペプチドで動物を免疫化することによって、ＴＴに対する抗体も開発する。前記ペプチドであるｐＭＥＳＯ１〜４及びｐＴＴは、表１に示される特徴を有している。
【００５３】
【表１】
【００５４】
いくつかの実施形態において、前記動物或いはｉｎ ｖｉｔｒｏシステム細胞は、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、或いは配列ＩＤ番号：１６の免疫原性部分で免疫化される。前記免疫原性部分は、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、或いは配列ＩＤ番号：１６の少なくとも１０連続アミノ酸を有する。いくつかの実施形態において、前記免疫原性部分は、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、或いは配列ＩＤ番号：１６の少なくとも１１連続アミノ酸を有し、他の実施形態においては、前記免疫原性部分は、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、或いは配列ＩＤ番号：１６の少なくとも１２連続アミノ酸を有し、他の実施形態において、前記免疫原性部分は、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、或いは配列ＩＤ番号：１６の少なくとも１３連続アミノ酸を有し、他の実施形態において、前記免疫原性部分は、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、或いは配列ＩＤ番号：１６の少なくとも１４連続アミノ酸を有する。
【００５５】
ｐＭＥＳＯ２（配列ＩＤ番号：１２）に対して生じた抗体は、メソテリンＡではなく、ｍｅｓｏｖｔ２を認識し、特異的に結合すると予想された。操作のあらゆる特定の理論に束縛されることなく、そのような抗体は、ｍｅｓｏｖｔ２に特異的であり、膵臓線癌、肺癌、及び卵巣癌などの腫瘍に特異的に結合するであろうと考えられる。そのこと自体で、これら抗体は、腫瘍の治療に特に有用である。前記抗体は、完全ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ｖ）抗体断片、或いはポリクローナル抗体である。
【００５６】
前記抗体は、一般的に、免疫原性を促進するためにアジュバント（免疫賦活剤）と組み合わされる。アジュバントは、免疫化に用いられる種によって変えられる。アジュバントの例としては、これに限定されるものではないが、Ｆｒｅｕｎｄ完全アジュバント（「ＦＣＡ」）、Ｆｒｅｕｎｄ不完全アジュバント（「ＦＩＡ」）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性化物質（例えば、リゾレシチン、プルロニンポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌｓ）、ポリアニオン）、ペプチドオイル乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン（「ＫＬＨ」）、ジニトロフェノール（「ＤＮＰ」）、及びウシ型弱毒結核菌ワクチン（「ＢＣＧ」）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍなどの潜在的に有用であるヒトアジュバントを含む。そのようなアジュバントは、本分野でもよく知られている。
【００５７】
免疫化は、よく知られた手順を用いて達成される。用量及び免疫化処方は、免疫化される哺乳類の種、その免疫状態、体重、及び／若しくは計算された表面積などに依存する。一般的に、血清は、免疫化動物から採取され、例えば、以下に記載したような適切なスクリーニングアッセイを用いて抗ｍｅｓｏｖｔ２抗体をアッセイする。
【００５８】
免疫化動物からの脾細胞は、例えば骨髄腫細胞株などの不死細胞株と前記脾細胞（抗体産生Ｂ細胞を含む）を融合することによって不死化される。一般的に、前記骨髄腫細胞株は、脾細胞ドナーと同じ種からのものである。１実施形態において、前記不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有する培養液（「ＨＡＴ培地」）に対して感受性を有している。いくつかの実施形態において、前記骨髄腫細胞は、ＨＡＴ−感受性、ＥＢＶ陰性、及びＩｇ発現陰性である。あらゆる適切な骨髄腫が使用される。マウスハイブリドーマは、マウス骨髄腫細胞株（例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３、或いはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫細胞株）を用いて産生される。これらのマウス骨髄腫細胞株は、ＡＴＣＣから利用可能である。これらの骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、好ましくは１５００分子量ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ１５００」）においてドナー脾細胞と融合される。この融合の結果生じるハイブリドーマ細胞は、非融合或いは非増殖性融合骨髄腫細胞を殺傷するＨＡＴ培地において選択される。非融合脾細胞は、短期間の培養で死滅する。いくつかの実施形態において、前記骨髄腫細胞は、免疫グロブリン遺伝子を発現しないものである。
【００５９】
上述したようなスクリーニングアッセイによって検出された、目的の抗体を産生するハイブリドーマは、培養で或いは動物において抗体を産生するために使用される。例えば、前記ハイブリドーマ細胞は、前記ハイブリドーマ細胞が培養液へモノクローナル抗体を分泌できるのに十分な条件下及び時間で、栄養性培養液において培養される。これらの技術及び培養液は、当業者によってよく知られている。或いは、前記ハイブリドーマ細胞は、非免疫化動物の腹膜へ注入される。前記細胞は、腹腔で増殖し、腹水として蓄積される抗体を分泌する。前記腹水は、モノクローナル抗体を豊富に含む源として、シリンジを用いて腹腔から取り除かれた。
【００６０】
ヒト抗体を産生するための別の限定されない方法は、不活性化されたそれら自身の内在性免疫グロブリン遺伝子を有し、別の種（例えばヒト）の抗体を産生するトランスジェニック哺乳類を記載した米国特許番号第５，７８９，６５０号、に記載されている。異種性抗体に対する遺伝子は、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコード化されている。非再編成免疫グロブリン−コード化領域を含む導入遺伝子は、非ヒト動物へ導入される。結果生じるトランスジェニック動物は、前記トランスジェニック免疫グロブリン配列を機能的に再編成し、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコード化された様々なアイソタイプの抗体のレパートリーを産生することができる。トランスジェニック動物からのＢ細胞は次に、不死化細胞株（例えば骨髄腫細胞）との融合を含む、様々な方法によって不死化される。
【００６１】
ｍｅｓｏｖｔ２に対する抗体は、本分野では既知である様々な技術を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでも調合される。例えば、これに限定されるものではないが、ｍｅｓｏｖｔ２に対する完全ヒトモノクローナル抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで予め刺激されたヒト脾細胞を用いることによって調合される（Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６〜９５）。
【００６２】
代わりに、例えば、本発明の抗体は、「レパートリークローニング」によって調合される（Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４３２〜２４３６；及びＨｕａｎｇ ａｎｄ Ｓｔｏｌｌａｒ（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４１：２２７〜２３６）。さらに、米国特許番号第５，７９８，２３０号では、エプスタイン・バーウイルス核抗原２（ＥＢＮＡ２）を発現するエプスタイン・バーウイルスの感染によって不死化されたヒトＢ抗体産生Ｂ細胞からのヒトモノクローナル抗体の調合が記載されている。不死化を必要とするＥＢＮＡ２は次に、抗体力価の増加をもたらすように不活性化される。
【００６３】
別の実施形態において、ｍｅｓｏｖｔ２に対する抗体は、末梢血単核細胞（「ＰＭＢＣｓ」）のｉｎ ｖｉｔｒｏ不死化によって形成される。これは、例えば、文献に記載された方法（Ｚａｆｉｒｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００：１８１〜１９０）を用いてなど、本分野で既知のあらゆる手段によって達成される。
【００６４】
本発明の１実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ不死化に対する手順は、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＭＳ２−１３４、ＰＭＳＲ２、ＰＭＳＲ３、ＭＬＨ１、ＭＨＬ２、ＭＬＨ３、ＭＬＨ４、ＭＬＨ５、ＭＬＨ６、ＰＭＳＬ９、ＭＳＨ１、及びＭＳＨ２などの、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子が前記脾細胞の融合後に前記ハイブリドーマに導入される、若しくは融合前に前記骨髄腫細胞へ導入される、前記ハイブリドーマ細胞の直接的変化が追加される。前記ドミナントネガティブ変異を含む細胞は、非形質移入コントロール細胞と比較して、高い割合で、高頻度変異性で蓄積する変異になる。前記変異細胞のプールは、より高い親和性抗体を産生する、或いは抗体のより高い力価を産生する、若しくは、単純に特定の条件下でより早くよりよく増殖するクローンをスクリーニングされる。ミスマッチ修復遺伝子ドミナントネガティブ対立遺伝子を用いた高頻度変異性細胞を産生するための技術は、２０００年１１月１４日に出願された米国特許番号第６，１４６，８９４号に記載されている。代わりに、ミスマッチ修復は、Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら（２００２年７月１８日に公開された、国際公開番号第ＷＯ ０２ ０５４８５６号「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｒｅｐａｉｒ」）によって記載されたミスマッチ修復の化学阻害剤を用いて阻害される。ミスマッチ修復遺伝子ドミナントネガティブ対立遺伝子、或いはミスマッチ修復の化学阻害剤を用いた抗体を増強する技術は、クローニングされた免疫グロブリン遺伝子を発現する哺乳類発現細胞に同様に適用される。前記ドミナントネガティブ対立遺伝子を発現している細胞は、「回復」され得、つまり、前記ドミナントネガティブ対立遺伝子は、細胞やその同等物から誘導可能に除去された場合、前記細胞がもう一度遺伝子的に安定になり、これ以上異常に高い割合で変異が蓄積しないように、オフにされ得る。
【００６５】
腫瘍細胞の成長を減少させる方法
本発明の方法は、ｍｅｓｏｖｔ２の発現の増加と関連した腫瘍性状態を有するとして同定されたヒト及び非ヒト動物において使用するのに適している。本発明の利益を享受する非ヒト動物は、ペット、外来種（例えば、動物園の動物）、及び家畜を含む。好ましくは、前記非ヒト動物は、哺乳類である。
【００６６】
本発明は、正常組織と比較した場合の、腫瘍におけるｍｅｓｏｖｔ２の発現の増加によって特徴付けられる形成異常障害を有するとして同定された、ヒト或いは動物患者において使用するのに適している。そのような患者がそのような状態を治療する必要があると同定された時点で、本発明の方法は、前記状態の効果的な治療が適用される。治療される腫瘍は、これに限定されるものではないが、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、輸卵管腫瘍、子宮ガン、及び特定の白血病細胞を含む。
【００６７】
本発明ににおいて使用される抗体及びそれらの誘導体は、例えば、カプセル、錠剤、水性懸濁液、水溶液、或いはそれらと同等物などの許容可能な剤形において経口的に投与される。前記抗体及びそれらの誘導体は、非経口的にも投与される。これは、以下：皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、鼻腔内、局所的、くも膜下内、肝臓内、病巣内、及び頭蓋骨内注射或いは注入技術の投与経路を介してである。一般的に、前記抗体及び誘導体は、筋肉内或いは静脈内注射として提供される。
【００６８】
本発明の抗体及び誘導体は、許容可能なアジュバント、溶媒、及び賦形剤を含む薬学的に許容可能な担体と共に投与される。
【００６９】
効果的な用量は、様々な因子に依存し、体重、治療の目的、最高許容用量、使用した特異的処方、投与経路、及びそれらと同等なものなどの様々なパラメーターに従って、所定の患者に対する用量を調整することは、熟練した医師の権限の範囲内である。一般的に、１日当たり約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の間の前記抗体或いはそれらの誘導体の用量レベルが適切である。いくつかの実施形態において、前記用量は、１日当たり約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の間の前記抗体或いはそれらの誘導体である。他の実施形態において、前記用量は、１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１日当たり約２０ｍｇ／ｋｇ体重である。さらなる他の実施形態において、前記用量は、１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１日当たり約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。投薬は、大量瞬時投与あるいは注入としてなされる。投与量は、１日１回、或いは１日複数回で与えられる。さらに、投与量は、複数回の期間で与えられる。いくつかの実施形態において、前記用量は、１〜１４日毎に投与される。いくつかの実施形態において、前記抗体或いはそれらの誘導体は、約３〜１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．として投与される。さらに、他の実施形態において、前記抗体或いはそれらの誘導体は、約５〜１２．５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．で投与される。他の実施形態において、前記抗体或いはそれらの誘導体は、少なくとも約１μｇ／ｍｌの血漿レベルが維持されるように提供されるものである。
【００７０】
効果的な治療は、様々な方法において評価される。１実施形態において、効果的な治療は、腫瘍成長の緩徐化した進行によって決定される。他の実施形態において、効果的な治療は、腫瘍の縮小（例えば、腫瘍サイズの減少など）によって特徴付けられる。他の実施形態において、効果的な治療は、腫瘍の転移の阻害によって特徴付けられる。更なる他の実施形態において、効果的な治療は、体重増加、力の回復、痛みの減少、繁栄、及び患者からの健康の自覚症状などのサイン（徴候）などを含む、患者の健康の増加によって測定される。
【００７１】
以下の実施例は、本発明を説明するために提供され、それらの限定と解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００７２】
ｍｅｓｏｖｔ２を発現している、メソテリン発現膵臓癌細胞株におけるモノクローナル抗体Ｋ１の結合の欠如は、ウエスタンブロットによって示した（図５Ｂ）。簡潔には、膵臓癌細胞を単離し、ＲＮＡ及びタンパク質抽出のために溶解した。ＯＶＣＡＲ−３及びＫＢ細胞からのｃＤＮＡは、Ｐｉｅｒｃｅ ＤＩＲＥＣＴＥＸＰＲＥＳＳ ＲＴ−ＰＣＲキットを用いて得た。
【００７３】
４０ｋＤａメソテリンタンパク質をコード化するｃＤＮＡは、特異的プライマー（番号は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ４０４３４に基づいている）を用いて増幅した。
【００７４】
メソテリン−２０７９−Ｒ（配列ＩＤ番号：８） ５’ＡＧＴＴＣＴＣＴＴＧＧＧＧＴＧＧＡＡＣＧＧＧＧＡＴ３’
メソテリン−９７５−Ｆ（配列ＩＤ番号：９） ５’ＧＣＧＧＧＡＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＣＴＧＴ３’
【００７５】
サブクローニングのために、プライマーは、５’末端にＢｓｒＧＩ配列と、単位複製配列の３’末端に６ヒスチジン残基コード化配列及びＸｂａＩ配列とを取り込むように設計されていた。
【００７６】
メソテリン−４０ｋＤａ−融合−ＢｓｒＧＩ−Ｆ（配列ＩＤ番号：１０）
５’−ＧＡＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＧＣＧＡＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＣＴＧＴ−３’
メソテリン−４０ｋＤａ−６Ｈｉｓ−ＸｂａＩ−Ｒ（配列ＩＤ番号：１１）
５’−ＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＡＴＧＣＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴ−３’
【００７７】
単位複製配列は、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙへクローニングすることによって捕獲し、Ｍ１３Ｆ及びＭ１３Ｒプライマーを用いて配列決定化した。
【００７８】
Ｐｉｅｒｃｅ ＤＩＲＥＣＴＥＸＰＲＥＳＳキットを用いて、６７μｌのｄＨ２Ｏ／ＴＡＱ混合物は、メソテリンｃＤＮＡ或いはβ−アクチン内に含まれた配列を標的化している遺伝子特異的プライマーとともに各サンプルへ分注した。以下の：９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１．５分の増幅条件を用いて、増幅を実行した。ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲル上で解析し、エチジウムブロマイド染色及びｕｖ評価によって可視化した。その結果は、図５Ａに示した。
【００７９】
ウエスタンブロットは、メソテリンの複数アイソフォームを認識する抗体の能力を決定するために実行した。簡潔には、細胞を回収し、製造業者（Ｎｏｖｅｘ）によって説明されたようにＲＩＰＡバッファーに溶解した。不溶性物質は、遠心分離によって除去し、上清の総タンパク質を、ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイを用いて決定した。これとは異なる実験において、５μｇ或いは２０μｇのタンパク質は、非還元条件下で４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（ＭＥＳ）に供した。電気泳動したタンパク質は、ＰＶＤＦメンブレンへ転写した。このメンブレンはＢｌｏｔｔｏ（５％ミルク、０．０５％ ＴＢＳ−Ｔ）においてブロッキングした。１：１０００希釈のＫ１ Ｍａｂ（Ｎｏｂｕｓ）は、１次抗体として前記Ｂｌｏｔｔｏブロッキング溶液へ直接添加し、前記メンブレンは一晩インキュベートした。このメンブレンは、３回（各５分ずつ）、０．０５％ ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、前記Ｂｌｏｔｔｏブロッキング溶液において２次抗体（西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギα−マウスＩｇＧ（重鎖及び軽鎖））を添加した。前記メンブレンは、３回（２０分、１５分、１５分）、０．０５％ ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。前記メンブレンは、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＥＣＬ試薬を用いて展開した。この結果は、図５Ｂに示した。結果より、メソテリンを過剰発現している特定の腫瘍は、メソテリンＡを超えるｍｅｓｏｖｔ２の産生を支持することが示された。この発見は、正常組織（一般的にメソテリンのメソテリンＡ形態を発現している）を無傷で残し、腫瘍組織を破壊するための、メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームを特異的に認識するモノクローナル抗体に利用され得る。
【００８０】
以下の参考文献のそれぞれの全体は、この参照によって本明細書に組み込まれる。
【００８１】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、ｍｅｓｏｖｔ２のｃＤＮＡ配列を示したものである（配列ＩＤ番号：１）。
【図２Ａ】図２Ａ及び２Ｂは、メソテリンＡ（「ｍｅｓｏＡ」）（配列ＩＤ番号：３）、ｍｅｓｏｖｔ２（配列ＩＤ番号：１）のｃＤＮＡ配列、及びコンセンサス配列（配列ＩＤ番号：４）の比較を示したものである。
【図２Ｂ】図２Ａ及び２Ｂは、メソテリンＡ（「ｍｅｓｏＡ」）（配列ＩＤ番号：３）、ｍｅｓｏｖｔ２（配列ＩＤ番号：１）のｃＤＮＡ配列、及びコンセンサス配列（配列ＩＤ番号：４）の比較を示したものである。
【図３】図３は、ｍｅｓｏｖｔ２のポリペプチド配列を示したものである（配列ＩＤ番号：２）。
【図４】図４は、メソテリンＡ（「ｍｅｓｏＡ」）（配列ＩＤ番号：５）、ｍｅｓｏｖｔ２（配列ＩＤ番号：２）のポリペプチド配列、及びコンセンサスポリペプチド配列（配列ＩＤ番号：６）の比較を示したものである。
【図５Ａ】図５Ａは、２つの膵臓癌細胞株（ＰＡＮ１及びＰＡＮ２）におけるメソテリンのＲＮＡ発現を示したものである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＰＡＮ１及びＰＡＮ２のＲＮＡレベルでは強い発現であるにも関わらず、Ｋ１抗体（メソテリンを認識すると報告されている）が全ての癌細胞においてメソテリンを検出しなかったことを示している。これは、メソテリン分子における構造変化に起因していると考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、２００３年８月５日に出願された米国特許仮出願番号第６０／４９３，０４０号明細書、及び２００３年９月１２日に出願された米国特許仮出願番号第６０／５０２，７１５号明細書に対して優先権を主張するものであり、それぞれの全体はこの参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）変異体であるｍｅｓｏｖｔ２の発見に関するものであり、このｍｅｓｏｖｔ２のＲＮＡ及びタンパク質発現は、癌に関連している。本発明は、前記タンパク質及び核酸配列を利用する及び産生する方法、及びｍｅｓｏｖｔ２を産生している細胞の成長を標的化する及び／若しくは阻害する方法、及びｍｅｓｏｖｔ２によって悪性度を診断するために使用する方法を含む。治療に使用する方法は、ｍｅｓｏｖｔ２−特異的ポリペプチド及びその誘導体を使用することによる、液性及び細胞性仲介免疫を含む。特定の癌、特に、例えば膵臓腺癌、肺癌及び卵巣癌などのｍｅｓｏｖｔ２抗原の細胞表面発現が増加している癌の治療において、抗体は有用である。本発明は、モノクローナル抗体、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体などの抗体誘導体、抗体断片、前記モノクローナル抗体、誘導体及び断片を発現している哺乳類細胞を発現しているハイブリドーマ細胞と、ｍｅｓｏｖｔ２に特異的な抗体、誘導体及び断片を用いて癌を検出し治療する方法とに関するものである。
【０００３】
悪性組織に特異的な細胞表面抗原の同定は、癌を治療するための治療アプローチを提供する。多くの細胞表面抗原は、正常組織と比較すると、悪性組織においては過剰発現していると報告されているが、悪性状態において一部のみが特異的に発現している（１）。選択的スプライシング、異常転写後修飾、或いは変異に起因した構造性変異を示す、細胞表面タンパク質の同定は、疾患特異的組織に関連した標的抗原に別のレベルの特異性を与える（１）。メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）は、６９ｋＤａ前駆体として合成され、３０ｋＤａのＮＨ２−末端分泌型及び４０ｋＤａの膜結合型へとタンパク質分解的に処理された、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−連結糖タンパク質である（２）。メソテリンは、正常中皮細胞上、及びいくつかの腫瘍（例えば、中皮種及び卵巣癌を含む）の表面上に存在することが報告されてきた（２、３、４、５）。メソテリン（ここではメソテリンＡと言及される）は、２つの分類：１番目の分類は、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ３で免疫化したマウスから単離された抗血清を使用し（５）、２番目の分類は、巨核球増強因子としてコード化ｃＤＮＡをクローン化した（６）、によって同定された。その後、３番目の分類は、可溶性アイソフォームを生じる選択的スプライシング変異体を同定した（７）。いくつかのグループは、癌に対するメソテリンＡ−特異的免疫療法を使用するための治療アプローチを開発したが、正常中皮上でのこの抗原の強い発現に起因した、激しい副作用が報告された（８）。Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら（９、１０）は、シュードモナスエンテロトキシンＡ［ＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８］に由来した免疫毒素と抱合し、メソテリンＡを発現した細胞を特異的に殺傷することができ、完全長メソテリンＡ ｃＤＮＡで安定に形質移入された異所性ｓ．ｃ．頸類表皮癌細胞に対して抗腫瘍効果を発揮する（１０）、単鎖抗体とのメソテリンＡ高結合親和性の利用を教示している。
【０００４】
本発明者らは、癌細胞タイプに関連し、ｍｅｓｏｖｔ２と呼ばれる共通メソテリンアイソフォームの発見を本明細書において報告する。この抗原は、開示されたメソテリンＡを標的化できる抗体の使用及び免疫ベース療法を記載した他の人によって報告され（５、６、７）、米国特許番号第５，３２０，９５６号、第５，５２５，３３７号、５，８１７，３１３号、第６，０８３，５０２号、及び第６，１５３，４３０号に参照されたものとは異なるアイソフォームを提示している。Ｍｅｓｏｖｔ２は、特異的抗血清、及び悪性細胞タイプを標的化でき、中皮組織などの正常組織を損傷することによってあり得る毒性を避けることができる、本分野では既知である他の免疫療法戦略の開発のために有用である（８）。
【０００５】
メソテリンＡタンパク質に対する抗体及び免疫毒性の投与は、卵巣癌の治療ようの戦略として提案されてきた（９、１０）。中皮細胞におけるこのメソテリンアイソフォームの強い発現に起因して、この種を標的化することによる副作用が生じる可能性がある。ｍｅｓｏｖｔ２がより共通して癌細胞株及び悪性組織と関連しているように見えるという発見によって、癌特異的標的化にとって有用であり、それによって、原発性中皮細胞で発現したメソテリンＡアイソフォームを認識しないことによる毒性を避けることができることが示唆された。
【０００６】
癌での抗体療法の困難な問題は、しばしば前記抗体の標的が、腫瘍組織と同様に正常組織でも発現していることである。従って、癌細胞を殺傷するために使用される抗体は、正常細胞に対する有害な効果も有する。ユニークな標的或いは癌組織において優先的に発現された標的を発見することは、多くの癌において困難であったと示された。卵巣癌、膵臓癌、肺癌、及び他のメソテリンを有する癌に対しており、正常組織との反応性の問題を回避した、より効果的な抗体療法が必要とされている。ｍｅｓｏｖｔ２の特異的標的化は、この問題を回避し、癌特異的療法を提供する。
【発明の開示】
【発明の効果】
【０００７】
メソテリンを過剰発現している腫瘍は、ｍｅｓｏｖｔ２と呼ばれるスプライス変異体を発現する傾向があると発見された。あらゆる特定の理論によって縛られることを望まず、ｍｅｓｏｖｔ２の発現は、悪性細胞タイプに対する選択的利点を提供すると考えられる。以前に、他の研究者によって、多くの癌におけるメソテリンの過剰発現が発見されたが、同定されたアイソフォームは、メソテリンＡ形態であった。癌細胞株或いは原発悪性細胞におけるｍｅｓｏｖｔ２の発現は、以前には記載されていなかった。Ｋｏｊｉｍａら（６）は、膵臓癌細胞株から単離した、巨核球増強因子（ＭＰＦ）と呼ばれる６９ｋＤａのタンパク質を同定し、それによってｍｅｓｏｖｔ２可変配列が前タンパク質前駆体の一部として存在することを示した。しかしながら、ＭＰＦの発現解析によって、前記遺伝子産物の強い発現は、正常肺において観察された。この発見は、本発明の利用性を示唆し、ｍｅｓｏｖｔ２特異的ヌクレオチド、或いはタンパク質ベースプローブを用いて、前記ｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームの特異的発現が決定され得る。
【０００８】
本発明は、ｍｅｓｏｖｔ２と呼ばれる変異体メソテリン分子をコード化したヌクレオチド及びタンパク質配列、及び抗体を提供する。Ｍｅｓｏｖｔ２は、癌細胞において特異的に発現される。Ｍｅｓｏｖｔ２発現は、様々な形態の癌の診断及び治療に有用である。そのような治療方法の１つは、特異的抗体であって、ｍｅｓｏｖｔ２に対する抗体は、ｍＡＢ Ｋ１（Ｃｈａｎｇらによって開発された（３））或いはＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙらによって開発された（９、１０））によって容易に検出されるメソテリンＡアイソフォームとは区別され得るものである、すなわち、（ａ）前記抗体は、Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８抗体によって認識されるものとは別のアイソフォームを認識し、ｍＡＢ Ｋ１或いは単鎖ｆｖＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８によって認識されるエピトープとは別のエピトープに結合する、（ｂ）前記抗体は、ｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームを特異的に認識できる、或いは（ｃ）前記抗体は、メソテリンＡとは異なるｍｅｓｏｖｔ２のドメインを認識するものである。
【０００９】
本発明の抗体は、少なくとも約１ｘ１０−７Ｍ、１ｘ１０−８Ｍ、１ｘ１０−９Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍ、１ｘ１０−１１Ｍ、１ｘ１０−１２Ｍの親和性を有しており、標的細胞の細胞表面上のエピトープを認識する。
【００１０】
本発明の抗体は、キメラ抗体であり、これに限定されるものではないが、これはヒト−マウスキメラ抗体を含む。本発明の抗体は、ヒト化抗体でもある。本発明は、本発明の抗体を発現するハイブリドーマ細胞、本発明の交代をコード化するポリヌクレオチド、本発明の抗体をコード化するポリヌクレオチドを有するベクター、及び本発明のベクターを有する発現細胞も提供する。
【００１１】
本発明は、ｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合し、メソテリンＡ形態には結合しない抗体を産生する方法も提供し、ここにおいて前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８とは、（ａ）前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８によって検出されるエピトープとは異なるエピトープに結合する、或いは（ｂ）前記抗体はｍｅｓｏｖｔ２を提示する特異的エピトープに結合するという点で異なっているものである。前記方法は、本発明の抗体を発現するハイブリドーマ細胞、或いは本発明の抗体をコード化するポリヌクレオチドを含むベクターを有する発現細胞を培養する工程を有する。本発明の発現細胞は、細菌、酵母、昆虫、或いは動物細胞であり、好ましくは哺乳類細胞である。
【００１２】
本発明はさらに、ｍｅｓｏｖｔ２の発現の増加に関与する形成異常細胞の成長を阻害する方法を提供し、この方法は、そのような形成異常細胞を有する患者へ、ｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合する抗体を有する組成物を投与する工程を有し、ここにおいて前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１或いはＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８とは、（ａ）前記抗体はｍＡｂ Ｋ１或いはＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８のエピトープとは異なるエピトープに結合する、（ｂ）前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１或いはＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８と比較して、前記ｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに対して有意な親和性を有して結合する、或いは（ｃ）前記抗体は、メソテリンの前記ｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームへの結合に対して、ｍＡｂ Ｋ１或いはＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８とは競合しないという点で異なっている。前記方法は、例えば、これに限定されるものではないが、肺、卵巣、及び膵臓癌などの様々な形態異常状態に対して使用される。特定の実施形態において、前記患者は、ヒト患者である。いくつかの実施形態において、前記抗体は、これに限定されるものではないが、例えば放射性ヌクレオシド、トキシン、及び化学療法因子などの免疫毒性因子と抱合されるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本明細書において参照されたＧｅｎＢａｎｋデータベース配列に対するアクセッション番号を含む、参照研究、特許、特許出願、及び科学論文は、当業者の知識を構築し、それぞれが特定に、個々に参照によって組み込まれるように示されたのと同等に、それらの全体はこの参照によってここに組み込まれるものである。ここに引用されたあらゆる参考文献と、本明細書の開示との間の不一致は、後者を支持して解決されるべきものである。同様に、単語や語句の本分野で理解された定義と、本明細書に特に開示されているような単語や語句の定義との間の不一致は、後者を支持して解決されるべきものである。
【００１４】
標準参考文献は、本分野では既知である組換えＤＮＡ技術の一般的な原理を説明するために参照し、これには、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＡＮＤ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＥＤＩＣＩＮＥ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ（１９９５）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｅｄ．，ＤＩＲＥＣＴＥＤ ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）を含む。
【００１５】
本発明は、メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合するモノクローナル抗体を使用して、癌細胞の成長、及び腫瘍性疾患の進行を減少させる方法を提供する。本発明の方法は、哺乳類（ヒトを含む）における腫瘍細胞の成長及び癌の進行を調節するために使用される。阻害される前記癌細胞は、正常ヒト組織、特に配、卵巣、及び膵臓癌細胞に関して、ｍｅｓｏｖｔ２の発現が増加する全ての癌細胞を含む。
【００１６】
実行の特定な理論によって束縛されることなく、癌細胞におけるｍｅｓｏｖｔ２の発現の増加は、前記細胞の表面上のメソテリンのこのアイソフォームの関連性の増加をもたらすと考えられている。従って、癌細胞は、正常組織に関して、ｍｅｓｏｖｔ２の発現が増加している。また、メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームは、癌における抗体、或いは免疫ベース療法に対する理想的な標的である。
【００１７】
ここで用いられたように、「エピトープ」という用語は、モノクローナル抗体が特異的に結合する、抗原の一部分を意味している。
【００１８】
ここで用いられたように、「高次構造的エピトープ」という用語は、一連の連続アミノ酸以外の抗原のアミノ酸の間の空間的な関係によって形成される不連続エピトープを意味している。
【００１９】
ここで用いられたように、「アイソフォーム」という用語は、所定のポリペプチドの特異的形態を意味している。
【００２０】
ここで用いられたように、「免疫ベース」という用語は、特異的に或いは選択的に標的産生細胞を殺傷することができる免疫反応を産生するためのタンパク質に基づいた治療法を意味している。
【００２１】
ここで用いられたように、「ｉｎ ｖｉｔｒｏでの形態異常細胞の成長の阻害」という用語は、培養における腫瘍細胞数の減少、すなわち、約５％、好ましくは１０％、より好ましくは２０％、より好ましくは３０％、より好ましくは４０％、より好ましくは５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは１００％の減少を意味する。腫瘍細胞成長のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害は、ＧＥＯ細胞軟寒天アッセイなどの本分野では既知のアッセイで測定される。
【００２２】
ここで用いられたように、「ｉｎ ｖｉｖｏでの形態異常細胞の成長の阻害」という用語は、動物における腫瘍細胞数の減少、すなわち、約５％、好ましくは１０％、より好ましくは２０％、より好ましくは３０％、より好ましくは４０％、より好ましくは５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは１００％の減少を意味する。腫瘍細胞成長のｉｎ ｖｉｖｏ調節は、本分野では既知のアッセイで測定される。
【００２３】
ここで用いられたように、「形態異常細胞」は、異常成長を示す細胞を意味している。形態異常細胞は、これに限定されるものではないが、腫瘍細胞、過形成性細胞、及びそれらと同等物を含む。
【００２４】
「予防する」という用語は、生物が異常状態になる或いは発展する可能性を減少することを意味する。
【００２５】
「治療する」という用語は、治療効果を有し、生物における異常状態を少なくとも部分的に軽減する或いは抑制することをを意味している。治療は、腫瘍成長の阻害及び寛解期の誘導を維持することを含む。
【００２６】
「治療効果」という用語は、異常状態の阻害を意味する。治療効果は、前記異常状態の症状の１若しくはそれ以上をある程度軽減する。異常状態の治療に関して、治療効果は、以下の：（ａ）細胞の増殖、成長及び／若しくは分化における増加或いは減少、（ｂ）ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の成長の阻害（すなわち、緩徐化或いは停止）、（ｃ）細胞死の促進、（ｄ）変性の阻害、（ｅ）前記異常状態に関連する症状の１若しくはそれ以上のある程度の軽減、及び（ｆ）細胞集団の機能の増強、の１若しくはそれ以上を言及することができる。本明細書に記載された前記モノクローナル抗体及びそれらの誘導体は、単独で、或いは本発明の組成物の抱合体或いは添加化合物との組み合わせで、前記治療効果を達成する。
【００２７】
ここで用いられたように、「癌の進行を阻害する」という用語は、未治療癌細胞の末期病状に対する調節と関連した、末期癌に対する腫瘍性疾患の調節を緩徐化する治療の活動を意味する。
【００２８】
ここで用いられたように、「約」という用語は、許容可能な範囲内の規定値の近似値を意味する。好ましくは、この範囲は、規定値の＋／−５％である。
【００２９】
ここで用いられたように、「腫瘍性疾患」という用語は、組織の細胞の異常増殖によって特徴付けられる状態を意味する。
【００３０】
抗体
本発明の抗体は、メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記抗体は、メソテリンの他の形態に結合する。他の実施形態において、前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１或いはＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８によって結合されるもの以外のエピトープに結合する。
【００３１】
好ましい実施形態、及び本発明の方法に使用するのに適している抗体は、例えば、完全ヒト抗体、ヒト抗体相同体、ヒト化抗体相同体、キメラ抗体相同体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦ（ｖ）抗体断片、単鎖抗体、及び抗体重鎖或いは軽鎖の単量体或いは二量体、或いはそれらの混合物を含む。
【００３２】
本発明の抗体は、タイプＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（それらのサブタイプも同様に）を含むあらゆるアイソタイプの無傷免疫グロブリンを含む。免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ或いはラムダである。
【００３３】
本発明の抗体は、抗原結合特異性を保持する無傷抗体の一部、例えばＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ｖ）断片、重鎖単量体或いは二量体、軽鎖単量体或いは二量体、１つの重鎖と１つの軽鎖から成る二量体、及びそれらの同等物を含む。従って、抗原結合断片、さらに上述した抗体から由来した完全長二量体或いは三量体ポリペプチドは、それ自体で有用である。
【００３４】
本発明の発現細胞は、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞などの、既知のあらゆる昆虫発現細胞株を含む。前記発現細胞株は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（出芽酵母）、及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（分裂酵母）細胞などの酵母細胞株でもある。前記発現細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣、仔ハムスター腎臓細胞、ヒト胚性腎臓細胞株２９３、正常イヌ腎臓細胞株、正常ネコ腎臓細胞株、サル腎臓細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ＣＯＳ細胞、非腫瘍原性マウス筋芽細胞Ｇ８細胞、線維芽細胞株、骨髄腫細胞株、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＬＭＴＫ３１細胞、マウスセルトリ細胞、ヒト頚腫瘍細胞、バッファローラット肝臓細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝臓細胞、マウス乳癌細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞などの哺乳類細胞でもある。
【００３５】
「キメラ抗体」は、免疫グロブリン軽鎖、重鎖、或いは両者のヒンジ及び定常領域の全て或いは一部が、別の動物の免疫グロブリン軽鎖或いは重鎖からの対応領域に置換されている、組換えＤＮＡ技術によって産生された抗体である。このようにして、親モノクローナル抗体の前記抗原結合部分は、別の種の抗体のバックボーンへ移される。欧州特許番号第ＥＰ ０２３９４００号（Ｗｉｎｔｅｒら）に記載された１つのアプローチは、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン可変領域ドメインからのＣＤＲｓを、マウス可変領域ドメインからのＣＤＲｓに置換するという、ある種の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を別の種のそれに置換することを示している。これらの改変抗体は、次にヒト免疫グロブリン定常領域に連結し、前記抗原に特異的である、置換されたマウスＣＤＲｓ以外はヒトである抗体を形成する。抗体のＣＤＲ領域を移す方法は、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２７及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４〜１５３６に記載されている。
【００３６】
キメラ抗体は、より少ないマウスアミノ酸配列を含むキメラ抗体よりもヒトにおける免疫反応を誘発する問題を回避すると考えられた。ヒト治療因子としてのげっ歯類ＭＡｂｓの直接的な使用は、げっ歯類由来抗体で処置された著しくたくさんの患者において生じた、ヒト抗げっ歯類抗体（「ＨＡＲＡ」）反応を導いた（Ｋｈａｚａｅｌｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１５：４２〜５２）。
【００３７】
制限のない実施例として、ＣＤＲを移す方法は、前記標的抗原（例えばｍｅｓｏｖｔ２）に結合する目的の抗体のマウス重鎖及び軽鎖を配列化し、ＣＤＲ ＤＮＡ配列を遺伝的に改変し、部位特異的変異誘発によって対応するヒトＶ領域にこれらのアミノ酸配列を課すことによって実行される。望みのアイソタイプのヒト定常領域遺伝子セグメントを付加し、「ヒト化」重鎖及び軽鎖遺伝子を哺乳類細胞において共発現させ、可溶性ヒト化抗体を産生した。一般的な発現細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。前記キメラ抗体を作成するのに適切な方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２７；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９；及びＯｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３８３３に記載されている。
【００３８】
ＨＡＲＡ反応の問題を回避するための抗体の更なる改良点は、「ヒト化抗体」の開発を導く。ヒト化抗体は、組換えＤＮＡ技術によって産生され、ここにおいて、抗原結合に必要でないヒト免疫グロブリン軽鎖或いは重鎖のアミノ酸の少なくとも１つは、非ヒト哺乳対免疫グロブリン軽鎖或いは重鎖からの対応するアミノ酸に置換される。例えば、免疫グロブリンがマウスモノクローナル抗体である場合、抗原結合に必要でない少なくとも１つのアミノ酸は、その位置の対応するヒト抗体上に存在するアミノ酸を用いて置換される。操作のあらゆる特定の理論に束縛されることなく、前記モノクローナル抗体の「ヒト化」は、外来免疫グロブリン分子に対するヒト免疫反応を阻害すると考えられる。
【００３９】
Ｑｕｅｅｎら（（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９〜１００３３及び国際特許番号第ＷＯ ９０／０７８６１号）は、ヒト化抗体の調合を記載した。ヒト及びマウス可変フレームワーク領域は、最適タンパク質配列相同性に対して選択された。前記マウス可変領域の三次構造は、コンピュータ−モデル化し、相同性ヒトフレームワークに重ねたものであり、マウスＣＤＲｓとのアミノ酸残基の最適な相互作用を示した。これは、抗原に対する改善された結合親和性（この親和性は、ＣＤＲ−移植キメラ抗体を作成する際に一般的に減少する）を有する抗体の開発を導いた。ヒト化抗体を作成するための代わりのアプローチは、本分野では既知であり、例えば、Ｔｅｍｐｅｓｔ（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６〜２７１に記載されている。
【００４０】
「単鎖抗体」とは、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖断片をアミノ酸の改変スパンを介してＦｖ領域へ連結させるという組換えＤＮＡ技術によって形成された抗体を意味している。単鎖抗体を産生する様々な方法は、既知であり、米国特許番号第４，６９４，７７８号；Ｂｉｒｄ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３〜４４２；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９〜５８８３；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４５４；Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８〜１０４１に記載されているものを含む。
【００４１】
本発明の抗体は、単独で、或いは細胞毒性因子との免疫複合体として使用される。いくつかの実施形態において、前記細胞毒性因子は、これに限定されるものではないが、リード（Ｌｅａｄ）−２１２、ビスマス（Ｂｉｓｍｕｔｈ）−２１２、アスタチン（Ａｓｔａｔｉｎｅ）−２１１、イオジン（Ｉｏｄｉｎｅ）−１３１、スカンジウム（Ｓｃａｎｄｉｕｍ）−４７、レニウム（Ｒｈｅｎｉｕｍ）−１８６、レニウム（Ｒｈｅｎｉｕｍ）−１８８、イットリウム（Ｙｔｔｒｉｕｍ）−９０、イオジン（Ｉｏｄｉｎｅ）−１２３、イオジン（Ｉｏｄｉｎｅ）−１２５、ブロマイン（Ｂｒｏｍｉｎｅ）−７７、インジウム（Ｉｎｄｉｕｍ）−１１１、及びホウ素（Ｂｏｒｏｎ）−１０或いはアクチニド（Ａｃｔｉｎｉｄｅ）などの核分裂性核種を含む放射性同位元素である。他の実施形態において、前記細胞毒性因子は、これに限定されるものではないが、リシン、修飾シュードモナスエンテロトキシン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）Ａ、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、５−フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、及びそれらの同等物を含む、よく知られたトキシン（毒素）及び／若しくは細胞毒性剤である。そのような細胞毒性因子への抗体及び抗体断片の抱合は、文献においてよく知られている。
【００４２】
本発明の抗体は、例えば、前記抗体へのあらゆるタイプの分子の共有結合性接着（この共有結合性接着は、前記抗体がそのエピトープに結合することを阻害しない）によって修飾された誘導体を含む。適切な誘導体の例としては、これに限定されるものではないが、グリコシル化抗体及び断片、アセチル化抗体及び断片、ペグ化抗体及び断片、リン酸化抗体及び断片、及びアミド化抗体及び断片を含む。本発明の抗体及びそれらの誘導体は、既知の保護／封鎖基、タンパク質分解性切断、細胞性リガンド或いは他のタンパク質への連結、及びそれらと同等なものによって誘導体化されることによってなり得る。さらに、本発明の抗体及びそれらの誘導体は、１若しくはそれ以上の非古典的なアミノ酸を含有する。
【００４３】
本発明は、卵巣癌患者の末梢血単核細胞から由来した抗体などの完全ヒト抗体も含む。そのような細胞は、骨髄腫細胞と融合され、例えば、ｍｅｓｏｖｔ２に対する完全ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を形成する。
【００４４】
操作のあらゆる特定の理論に束縛されることなく、本発明の抗体は、癌細胞に関連した選択的スプライシング現象に起因する８アミノ酸の欠如によるタンパク質内の構造改変のため、メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに結合するために特に有用であることが考えられる。これは、癌細胞において特異的に認識され得るタンパク質抗原を導く。これは、本発明の抗体が正常組織に比べて腫瘍組織へより密接に結合するので、腫瘍を標的化するためには非常によい特徴である。
【００４５】
ｍｅｓｏｖｔ２に対する抗体を産生する方法
免疫化動物
本発明は、メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する方法も提供する。ｍｅｓｏｖｔ２は、タンパク質を単離及び精製するための様々なよく知られた技術を用いて、細胞から或いは組換えシステムから精製される。例えば、これに限定されるものではないが、ｍｅｓｏｖｔ２は、前記タンパク質をＳＤＳ−ＰＣＧＥゲルに供し、前記タンパク質をメンブレンにブロットすることによる、前記タンパク質の明らかな分子量に基づいて単離される。その後、メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２に対応する適切なサイズのバンドを、前記メンブレンから切り取り、動物の免疫原として直接使用した、若しくは前記メンブレンから前記タンパク質をまず抽出する或いは溶出することによって使用した。代わりの実施例として、前記タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィー単独、或いは単離及び精製の他の手段との組み合わせによって単離した。精製の他の手段は、Ｚｏｌａ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＵＳＥ ＯＦ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＤＥＲＩＶＡＴＩＶＥＳ（ＢＡＳＩＣＳ：ＦＲＯＭ ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ ＴＯ ＢＥＮＣＨ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００；ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩＯＮ，Ｃｈａｐｔｅｒ １１，"Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，"Ｈｏｗａｒｄ ａｎｄ Ｂｅｔｈｅｌｌ，Ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２０００；ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（ＳＰＲＩＮＧＥＲ ＬＡＢ ＭＡＮＵＡＬ．）Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，２００１などの標準参照テキストにおいて利用可能である。
【００４６】
ｍｅｓｏｖｔ２に対する抗体を産生するための１つの戦略は、ｍｅｓｏｖｔ２の組換え形態、或いはｍｅｓｏｖｔ２に特異的な領域から成るポリペプチドを有する免疫化動物を含む。そのように免疫化された動物は、前記タンパク質或いはポリペプチドに対する抗体を産生するであろう。従って、本発明は、ｍｅｓｏｖｔ２に特異的に結合する抗体を含むポリクローナル血清を含む。標準的な方法は、これに限定されるものではないが、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ & Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７を参照）、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２）、及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ，ｅｔ ａｌ．ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５，ｐｐ．７７〜９６を参照）を含む、モノクローナル抗体を作成するとして知られている。
【００４７】
抗体特異性のスクリーニング
メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合する抗体をスクリーニングすることは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて達成され、マイクロタイタープレートはメソテリンのｍｅｓｏｖｔ２形態でコーティングされている。ポジティブに反応するクローンからの抗体はさらに、メソテリンＡでコーティングされたマイクロタイタープレートを用いて、メソテリンのメソテリンＡ形態に対するＥＬＩＳＡ−ベースアッセイにおいて反応性をスクリーニングされた。メソテリンのメソテリンＡ形態に反応性を有する抗体を産生するクローンは除去し、ｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに反応性を有する抗体を産生するクローンのみを、更なる増殖及び発生のために選択した。
【００４８】
メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに対する前記抗体の反応性の確認は、例えば、ウエスタンブロットアッセイ（ここにおいて、肺、卵巣、或いは膵臓癌細胞からのタンパク質、及びｍｅｓｏｖｔ２やメソテリンＡｈａ，還元或いは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に供され、メンブレンにブロットされているものである）を用いて達成された。前記メンブレンは次に、仮想抗ｍｅｓｏｖｔ２抗体で探索（プローブ化）した。非還元条件下のメソテリンのｍｅｓｏｖｔ２形態に対する反応性、及びメソテリンのメソテリンＡ形態への非反応性（還元或いは非還元条件下）によって、ｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに対する反応性の特異性が確認された。
【００４９】
本発明の抗体及びそれらの誘導体は、１ｘ１０−２以下の解離定数（Ｋｄ）を含む結合親和性を有している。いくつかの実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−３以下である。他の実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−４以下である。いくつかの実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−５以下である。更なる他の実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−６以下である。他の実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−７以下である。他の実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−８以下である。他の実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−９以下である。他の実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−１０以下である。更なる他の実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−１１以下である。いくつかの実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−１２以下である。他の実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−１３以下である。他の実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−１４以下である。更なる他の実施形態において、前記Ｋｄは、１ｘ１０−１５以下である。
【００５０】
抗体の産生
本発明の抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏ或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで産生される。ｉｎ ｖｉｖｏ抗体産生に対して、動物は、ｍｅｓｏｖｔ２の免疫原部分（好ましくはｍｅｓｏｖｔ２に特異的な領域）で一般的に免疫化されるものである。
【００５１】
１実施形態において、動物を免疫化するための、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏの免疫化細胞のために使用された前記免疫原は、ＶＮＫＧＨＥＭＳＰＱＶＡＴＬＩＤＲＦＶＫＧＲＧＱＬＤＫ（配列ＩＤ番号：７）のアミノ酸配列を有するポリペプチド、或いはその免疫原性部分である。前記免疫原性部分は、配列ＩＤ番号：７の少なくとも１０〜２７連続アミノ酸を有する。いくつかの実施形態において、前記免疫原性部分は、配列ＩＤ番号：７の少なくとも１５連続アミノ酸を有しており、他の実施形態においては、前記免疫原性部分は、配列ＩＤ番号：７の少なくとも２０連続アミノ酸を有しており、他の実施形態においては、前記免疫原性部分は、配列ＩＤ番号：７の少なくとも２４連続アミノ酸を有しており、他の実施形態においては、前記免疫原性部分は、配列ＩＤ番号：７の少なくとも２７連続アミノ酸を有している。
【００５２】
特定の実施形態において、ＮＫＧＨＥＭＳＰＱＶＡＴＬＩＤ（配列ＩＤ番号：１２）のアミノ酸配列を有し、ｐＭＥＳＯ２と命名されたペプチドが合成される。このペプチドは、メソテリンＡとｍｅｓｏｖｔ２を比較した際、アミノ酸の欠損が生じる接合点に及ぶ（図４を参照）。前記接合部は、配列ＩＤ番号：１２のセリンとプロリンとの間に生じる、つまり、ＮＫＧＨＥＭＳ／ＰＱＶＡＴＬＩＤである。さらに、他のペプチドは、ｍｅｓｏｖｔ２分子の他の部分に対して合成され、例えばｐＭＥＳＯ１：ＥＶＥＫＴＡＣＰＳＧＫＫＡＲＥ（配列ＩＤ番号：１３）、ｐＭＥＳＯ３：ＲＦＶＫＧＲＧＱＬＤＫＤＴＬＤ（配列ＩＤ番号：１４）、ｐＭＥＳＯ４：ＨＶＥＧＬＫＡＥＥＲＨＲＰＶＲ（配列ＩＤ番号：１５）などである。破傷風トキソイド（ＴＴ）をｍｅｓｏｖｔ２ペプチド或いはタンパク質と融合させる実験に対して、ＴＴアミノ酸配列（例えば、ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列ＩＤ番号：１６））から由来したペプチドで動物を免疫化することによって、ＴＴに対する抗体も開発する。前記ペプチドであるｐＭＥＳＯ１〜４及びｐＴＴは、表１に示される特徴を有している。
【００５３】
【表１】
【００５４】
いくつかの実施形態において、前記動物或いはｉｎ ｖｉｔｒｏシステム細胞は、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、或いは配列ＩＤ番号：１６の免疫原性部分で免疫化される。前記免疫原性部分は、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、或いは配列ＩＤ番号：１６の少なくとも１０連続アミノ酸を有する。いくつかの実施形態において、前記免疫原性部分は、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、或いは配列ＩＤ番号：１６の少なくとも１１連続アミノ酸を有し、他の実施形態においては、前記免疫原性部分は、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、或いは配列ＩＤ番号：１６の少なくとも１２連続アミノ酸を有し、他の実施形態において、前記免疫原性部分は、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、或いは配列ＩＤ番号：１６の少なくとも１３連続アミノ酸を有し、他の実施形態において、前記免疫原性部分は、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、或いは配列ＩＤ番号：１６の少なくとも１４連続アミノ酸を有する。
【００５５】
ｐＭＥＳＯ２（配列ＩＤ番号：１２）に対して生じた抗体は、メソテリンＡではなく、ｍｅｓｏｖｔ２を認識し、特異的に結合すると予想された。操作のあらゆる特定の理論に束縛されることなく、そのような抗体は、ｍｅｓｏｖｔ２に特異的であり、膵臓線癌、肺癌、及び卵巣癌などの腫瘍に特異的に結合するであろうと考えられる。そのこと自体で、これら抗体は、腫瘍の治療に特に有用である。前記抗体は、完全ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ｖ）抗体断片、或いはポリクローナル抗体である。
【００５６】
前記抗体は、一般的に、免疫原性を促進するためにアジュバント（免疫賦活剤）と組み合わされる。アジュバントは、免疫化に用いられる種によって変えられる。アジュバントの例としては、これに限定されるものではないが、Ｆｒｅｕｎｄ完全アジュバント（「ＦＣＡ」）、Ｆｒｅｕｎｄ不完全アジュバント（「ＦＩＡ」）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性化物質（例えば、リゾレシチン、プルロニンポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌｓ）、ポリアニオン）、ペプチドオイル乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン（「ＫＬＨ」）、ジニトロフェノール（「ＤＮＰ」）、及びウシ型弱毒結核菌ワクチン（「ＢＣＧ」）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍなどの潜在的に有用であるヒトアジュバントを含む。そのようなアジュバントは、本分野でもよく知られている。
【００５７】
免疫化は、よく知られた手順を用いて達成される。用量及び免疫化処方は、免疫化される哺乳類の種、その免疫状態、体重、及び／若しくは計算された表面積などに依存する。一般的に、血清は、免疫化動物から採取され、例えば、以下に記載したような適切なスクリーニングアッセイを用いて抗ｍｅｓｏｖｔ２抗体をアッセイする。
【００５８】
免疫化動物からの脾細胞は、例えば骨髄腫細胞株などの不死細胞株と前記脾細胞（抗体産生Ｂ細胞を含む）を融合することによって不死化される。一般的に、前記骨髄腫細胞株は、脾細胞ドナーと同じ種からのものである。１実施形態において、前記不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有する培養液（「ＨＡＴ培地」）に対して感受性を有している。いくつかの実施形態において、前記骨髄腫細胞は、ＨＡＴ−感受性、ＥＢＶ陰性、及びＩｇ発現陰性である。あらゆる適切な骨髄腫が使用される。マウスハイブリドーマは、マウス骨髄腫細胞株（例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３、或いはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫細胞株）を用いて産生される。これらのマウス骨髄腫細胞株は、ＡＴＣＣから利用可能である。これらの骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、好ましくは１５００分子量ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ１５００」）においてドナー脾細胞と融合される。この融合の結果生じるハイブリドーマ細胞は、非融合或いは非増殖性融合骨髄腫細胞を殺傷するＨＡＴ培地において選択される。非融合脾細胞は、短期間の培養で死滅する。いくつかの実施形態において、前記骨髄腫細胞は、免疫グロブリン遺伝子を発現しないものである。
【００５９】
上述したようなスクリーニングアッセイによって検出された、目的の抗体を産生するハイブリドーマは、培養で或いは動物において抗体を産生するために使用される。例えば、前記ハイブリドーマ細胞は、前記ハイブリドーマ細胞が培養液へモノクローナル抗体を分泌できるのに十分な条件下及び時間で、栄養性培養液において培養される。これらの技術及び培養液は、当業者によってよく知られている。或いは、前記ハイブリドーマ細胞は、非免疫化動物の腹膜へ注入される。前記細胞は、腹腔で増殖し、腹水として蓄積される抗体を分泌する。前記腹水は、モノクローナル抗体を豊富に含む源として、シリンジを用いて腹腔から取り除かれた。
【００６０】
ヒト抗体を産生するための別の限定されない方法は、不活性化されたそれら自身の内在性免疫グロブリン遺伝子を有し、別の種（例えばヒト）の抗体を産生するトランスジェニック哺乳類を記載した米国特許番号第５，７８９，６５０号、に記載されている。異種性抗体に対する遺伝子は、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコード化されている。非再編成免疫グロブリン−コード化領域を含む導入遺伝子は、非ヒト動物へ導入される。結果生じるトランスジェニック動物は、前記トランスジェニック免疫グロブリン配列を機能的に再編成し、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコード化された様々なアイソタイプの抗体のレパートリーを産生することができる。トランスジェニック動物からのＢ細胞は次に、不死化細胞株（例えば骨髄腫細胞）との融合を含む、様々な方法によって不死化される。
【００６１】
ｍｅｓｏｖｔ２に対する抗体は、本分野では既知である様々な技術を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでも調合される。例えば、これに限定されるものではないが、ｍｅｓｏｖｔ２に対する完全ヒトモノクローナル抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで予め刺激されたヒト脾細胞を用いることによって調合される（Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６〜９５）。
【００６２】
代わりに、例えば、本発明の抗体は、「レパートリークローニング」によって調合される（Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４３２〜２４３６；及びＨｕａｎｇ ａｎｄ Ｓｔｏｌｌａｒ（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４１：２２７〜２３６）。さらに、米国特許番号第５，７９８，２３０号では、エプスタイン・バーウイルス核抗原２（ＥＢＮＡ２）を発現するエプスタイン・バーウイルスの感染によって不死化されたヒトＢ抗体産生Ｂ細胞からのヒトモノクローナル抗体の調合が記載されている。不死化を必要とするＥＢＮＡ２は次に、抗体力価の増加をもたらすように不活性化される。
【００６３】
別の実施形態において、ｍｅｓｏｖｔ２に対する抗体は、末梢血単核細胞（「ＰＭＢＣｓ」）のｉｎ ｖｉｔｒｏ不死化によって形成される。これは、例えば、文献に記載された方法（Ｚａｆｉｒｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００：１８１〜１９０）を用いてなど、本分野で既知のあらゆる手段によって達成される。
【００６４】
本発明の１実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ不死化に対する手順は、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＭＳ２−１３４、ＰＭＳＲ２、ＰＭＳＲ３、ＭＬＨ１、ＭＨＬ２、ＭＬＨ３、ＭＬＨ４、ＭＬＨ５、ＭＬＨ６、ＰＭＳＬ９、ＭＳＨ１、及びＭＳＨ２などの、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子が前記脾細胞の融合後に前記ハイブリドーマに導入される、若しくは融合前に前記骨髄腫細胞へ導入される、前記ハイブリドーマ細胞の直接的変化が追加される。前記ドミナントネガティブ変異を含む細胞は、非形質移入コントロール細胞と比較して、高い割合で、高頻度変異性で蓄積する変異になる。前記変異細胞のプールは、より高い親和性抗体を産生する、或いは抗体のより高い力価を産生する、若しくは、単純に特定の条件下でより早くよりよく増殖するクローンをスクリーニングされる。ミスマッチ修復遺伝子ドミナントネガティブ対立遺伝子を用いた高頻度変異性細胞を産生するための技術は、２０００年１１月１４日に出願された米国特許番号第６，１４６，８９４号に記載されている。代わりに、ミスマッチ修復は、Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら（２００２年７月１８日に公開された、国際公開番号第ＷＯ ０２ ０５４８５６号「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｒｅｐａｉｒ」）によって記載されたミスマッチ修復の化学阻害剤を用いて阻害される。ミスマッチ修復遺伝子ドミナントネガティブ対立遺伝子、或いはミスマッチ修復の化学阻害剤を用いた抗体を増強する技術は、クローニングされた免疫グロブリン遺伝子を発現する哺乳類発現細胞に同様に適用される。前記ドミナントネガティブ対立遺伝子を発現している細胞は、「回復」され得、つまり、前記ドミナントネガティブ対立遺伝子は、細胞やその同等物から誘導可能に除去された場合、前記細胞がもう一度遺伝子的に安定になり、これ以上異常に高い割合で変異が蓄積しないように、オフにされ得る。
【００６５】
腫瘍細胞の成長を減少させる方法
本発明の方法は、ｍｅｓｏｖｔ２の発現の増加と関連した腫瘍性状態を有するとして同定されたヒト及び非ヒト動物において使用するのに適している。本発明の利益を享受する非ヒト動物は、ペット、外来種（例えば、動物園の動物）、及び家畜を含む。好ましくは、前記非ヒト動物は、哺乳類である。
【００６６】
本発明は、正常組織と比較した場合の、腫瘍におけるｍｅｓｏｖｔ２の発現の増加によって特徴付けられる形成異常障害を有するとして同定された、ヒト或いは動物患者において使用するのに適している。そのような患者がそのような状態を治療する必要があると同定された時点で、本発明の方法は、前記状態の効果的な治療が適用される。治療される腫瘍は、これに限定されるものではないが、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、輸卵管腫瘍、子宮ガン、及び特定の白血病細胞を含む。
【００６７】
本発明ににおいて使用される抗体及びそれらの誘導体は、例えば、カプセル、錠剤、水性懸濁液、水溶液、或いはそれらと同等物などの許容可能な剤形において経口的に投与される。前記抗体及びそれらの誘導体は、非経口的にも投与される。これは、以下：皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、鼻腔内、局所的、くも膜下内、肝臓内、病巣内、及び頭蓋骨内注射或いは注入技術の投与経路を介してである。一般的に、前記抗体及び誘導体は、筋肉内或いは静脈内注射として提供される。
【００６８】
本発明の抗体及び誘導体は、許容可能なアジュバント、溶媒、及び賦形剤を含む薬学的に許容可能な担体と共に投与される。
【００６９】
効果的な用量は、様々な因子に依存し、体重、治療の目的、最高許容用量、使用した特異的処方、投与経路、及びそれらと同等なものなどの様々なパラメーターに従って、所定の患者に対する用量を調整することは、熟練した医師の権限の範囲内である。一般的に、１日当たり約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の間の前記抗体或いはそれらの誘導体の用量レベルが適切である。いくつかの実施形態において、前記用量は、１日当たり約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の間の前記抗体或いはそれらの誘導体である。他の実施形態において、前記用量は、１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１日当たり約２０ｍｇ／ｋｇ体重である。さらなる他の実施形態において、前記用量は、１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１日当たり約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。投薬は、大量瞬時投与あるいは注入としてなされる。投与量は、１日１回、或いは１日複数回で与えられる。さらに、投与量は、複数回の期間で与えられる。いくつかの実施形態において、前記用量は、１〜１４日毎に投与される。いくつかの実施形態において、前記抗体或いはそれらの誘導体は、約３〜１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．として投与される。さらに、他の実施形態において、前記抗体或いはそれらの誘導体は、約５〜１２．５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．で投与される。他の実施形態において、前記抗体或いはそれらの誘導体は、少なくとも約１μｇ／ｍｌの血漿レベルが維持されるように提供されるものである。
【００７０】
効果的な治療は、様々な方法において評価される。１実施形態において、効果的な治療は、腫瘍成長の緩徐化した進行によって決定される。他の実施形態において、効果的な治療は、腫瘍の縮小（例えば、腫瘍サイズの減少など）によって特徴付けられる。他の実施形態において、効果的な治療は、腫瘍の転移の阻害によって特徴付けられる。更なる他の実施形態において、効果的な治療は、体重増加、力の回復、痛みの減少、繁栄、及び患者からの健康の自覚症状などのサイン（徴候）などを含む、患者の健康の増加によって測定される。
【００７１】
以下の実施例は、本発明を説明するために提供され、それらの限定と解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００７２】
ｍｅｓｏｖｔ２を発現している、メソテリン発現膵臓癌細胞株におけるモノクローナル抗体Ｋ１の結合の欠如は、ウエスタンブロットによって示した（図５Ｂ）。簡潔には、膵臓癌細胞を単離し、ＲＮＡ及びタンパク質抽出のために溶解した。ＯＶＣＡＲ−３及びＫＢ細胞からのｃＤＮＡは、Ｐｉｅｒｃｅ ＤＩＲＥＣＴＥＸＰＲＥＳＳ ＲＴ−ＰＣＲキットを用いて得た。
【００７３】
４０ｋＤａメソテリンタンパク質をコード化するｃＤＮＡは、特異的プライマー（番号は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ４０４３４に基づいている）を用いて増幅した。
【００７４】
メソテリン−２０７９−Ｒ（配列ＩＤ番号：８） ５’ＡＧＴＴＣＴＣＴＴＧＧＧＧＴＧＧＡＡＣＧＧＧＧＡＴ３’
メソテリン−９７５−Ｆ（配列ＩＤ番号：９） ５’ＧＣＧＧＧＡＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＣＴＧＴ３’
【００７５】
サブクローニングのために、プライマーは、５’末端にＢｓｒＧＩ配列と、単位複製配列の３’末端に６ヒスチジン残基コード化配列及びＸｂａＩ配列とを取り込むように設計されていた。
【００７６】
メソテリン−４０ｋＤａ−融合−ＢｓｒＧＩ−Ｆ（配列ＩＤ番号：１０）
５’−ＧＡＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＧＣＧＡＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＣＴＧＴ−３’
メソテリン−４０ｋＤａ−６Ｈｉｓ−ＸｂａＩ−Ｒ（配列ＩＤ番号：１１）
５’−ＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＡＴＧＣＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴ−３’
【００７７】
単位複製配列は、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙへクローニングすることによって捕獲し、Ｍ１３Ｆ及びＭ１３Ｒプライマーを用いて配列決定化した。
【００７８】
Ｐｉｅｒｃｅ ＤＩＲＥＣＴＥＸＰＲＥＳＳキットを用いて、６７μｌのｄＨ２Ｏ／ＴＡＱ混合物は、メソテリンｃＤＮＡ或いはβ−アクチン内に含まれた配列を標的化している遺伝子特異的プライマーとともに各サンプルへ分注した。以下の：９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１．５分の増幅条件を用いて、増幅を実行した。ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲル上で解析し、エチジウムブロマイド染色及びｕｖ評価によって可視化した。その結果は、図５Ａに示した。
【００７９】
ウエスタンブロットは、メソテリンの複数アイソフォームを認識する抗体の能力を決定するために実行した。簡潔には、細胞を回収し、製造業者（Ｎｏｖｅｘ）によって説明されたようにＲＩＰＡバッファーに溶解した。不溶性物質は、遠心分離によって除去し、上清の総タンパク質を、ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイを用いて決定した。これとは異なる実験において、５μｇ或いは２０μｇのタンパク質は、非還元条件下で４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（ＭＥＳ）に供した。電気泳動したタンパク質は、ＰＶＤＦメンブレンへ転写した。このメンブレンはＢｌｏｔｔｏ（５％ミルク、０．０５％ ＴＢＳ−Ｔ）においてブロッキングした。１：１０００希釈のＫ１ Ｍａｂ（Ｎｏｂｕｓ）は、１次抗体として前記Ｂｌｏｔｔｏブロッキング溶液へ直接添加し、前記メンブレンは一晩インキュベートした。このメンブレンは、３回（各５分ずつ）、０．０５％ ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、前記Ｂｌｏｔｔｏブロッキング溶液において２次抗体（西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギα−マウスＩｇＧ（重鎖及び軽鎖））を添加した。前記メンブレンは、３回（２０分、１５分、１５分）、０．０５％ ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。前記メンブレンは、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＥＣＬ試薬を用いて展開した。この結果は、図５Ｂに示した。結果より、メソテリンを過剰発現している特定の腫瘍は、メソテリンＡを超えるｍｅｓｏｖｔ２の産生を支持することが示された。この発見は、正常組織（一般的にメソテリンのメソテリンＡ形態を発現している）を無傷で残し、腫瘍組織を破壊するための、メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームを特異的に認識するモノクローナル抗体に利用され得る。
【００８０】
以下の参考文献のそれぞれの全体は、この参照によって本明細書に組み込まれる。
【００８１】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、ｍｅｓｏｖｔ２のｃＤＮＡ配列を示したものである（配列ＩＤ番号：１）。
【図２Ａ】図２Ａ及び２Ｂは、メソテリンＡ（「ｍｅｓｏＡ」）（配列ＩＤ番号：３）、ｍｅｓｏｖｔ２（配列ＩＤ番号：１）のｃＤＮＡ配列、及びコンセンサス配列（配列ＩＤ番号：４）の比較を示したものである。
【図２Ｂ】図２Ａ及び２Ｂは、メソテリンＡ（「ｍｅｓｏＡ」）（配列ＩＤ番号：３）、ｍｅｓｏｖｔ２（配列ＩＤ番号：１）のｃＤＮＡ配列、及びコンセンサス配列（配列ＩＤ番号：４）の比較を示したものである。
【図３】図３は、ｍｅｓｏｖｔ２のポリペプチド配列を示したものである（配列ＩＤ番号：２）。
【図４】図４は、メソテリンＡ（「ｍｅｓｏＡ」）（配列ＩＤ番号：５）、ｍｅｓｏｖｔ２（配列ＩＤ番号：２）のポリペプチド配列、及びコンセンサスポリペプチド配列（配列ＩＤ番号：６）の比較を示したものである。
【図５Ａ】図５Ａは、２つの膵臓癌細胞株（ＰＡＮ１及びＰＡＮ２）におけるメソテリンのＲＮＡ発現を示したものである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＰＡＮ１及びＰＡＮ２のＲＮＡレベルでは強い発現であるにも関わらず、Ｋ１抗体（メソテリンを認識すると報告されている）が全ての癌細胞においてメソテリンを検出しなかったことを示している。これは、メソテリン分子における構造変化に起因していると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォーム（配列ＩＤ番号：２）に特異的に結合する抗体であって、
前記抗体は、（ａ）前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８のエピトープとは異なるエピトープに結合する、（ｂ）前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８よりも大きな親和性を有して結合する、或いは（ｃ）前記抗体は、メソテリンの前記ｍｅｓｏｖｔ２形態への結合に対して、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８よりも有意である、という点でｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８とは区別されるものである、抗体。
【請求項２】
請求項１の抗体において、
前記抗体の親和性は、少なくとも約１ｘ１０−７Ｍである。
【請求項３】
請求項１の抗体において、
前記抗体の親和性は、少なくとも約１ｘ１０−８Ｍである。
【請求項４】
請求項１の抗体において、
前記抗体の親和性は、少なくとも約１ｘ１０−９Ｍである。
【請求項５】
請求項１の抗体において、
前記抗体の親和性は、少なくとも約１ｘ１０−１０Ｍである。
【請求項６】
請求項１の抗体において、
前記エピトープは、ジスルフィド−依存性エピトープである。
【請求項７】
請求項１の抗体において、
前記抗体は、キメラ抗体である。
【請求項８】
請求項７の抗体において、
前記キメラ抗体は、ヒト−マウスキメラ抗体である。
【請求項９】
請求項１の抗体において、
前記抗体は、ヒト化抗体である。
【請求項１０】
請求項１の抗体において、
前記抗体は、完全ヒト抗体である。
【請求項１１】
請求項１の抗体を発現するハイブリドーマ細胞。
【請求項１２】
請求項１の抗体をコード化するポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２のポリヌクレオチドを有するベクター。
【請求項１４】
請求項１３のベクターを有する発現細胞。
【請求項１５】
メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合する抗体を産生する方法であって、
前記抗体は、（ａ）前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８のエピトープとは異なるエピトープに結合する、（ｂ）前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８よりも大きな親和性を有して結合する、或いは（ｃ）前記抗体は、メソテリンの前記ｍｅｓｏｖｔ２形態への結合に対して、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８よりも有意である、という点でｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８とは区別されるものであり、
請求項１１のハイブリドーマを培養する工程を有する、方法。
【請求項１６】
メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームと特異的に結合する抗体を産生する方法であって、
前記抗体は、（ａ）前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８のエピトープとは異なるエピトープに結合する、（ｂ）前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８よりも大きな親和性を有して結合する、或いは（ｃ）前記抗体は、メソテリンの前記ｍｅｓｏｖｔ２形態への結合に対して、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８よりも有意である、という点でｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８とは区別されるものであり、
請求項１４の発現細胞を培養する工程を有する、方法。
【請求項１７】
請求項１４の発現細胞において、
前記細胞は、哺乳類細胞である。
【請求項１８】
請求項１６の方法において、
前記発現細胞は、哺乳類細胞である。
【請求項１９】
メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合する抗体を産生する方法であって、
前記抗体は、（ａ）前記抗体は、配列ＩＤ番号：７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、或いはそれらの抗原断片を抗原として用いて産生される、という点でｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８とは区別されるものである。
【請求項２０】
請求項１９の方法において、
前記抗体は、配列ＩＤ番号：７のアミノ酸配列から成るポリペプチドを用いて産生されるものである。
【請求項２１】
ｍｅｓｏｖｔ２の発現の増加に関連した形成異常細胞の成長を阻害する方法であって、
そのような形成異常細胞を有する患者へ、メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合する抗体を有する組成物を投与する工程を有するものであり、
ここにおいて前記抗体は、（ａ）前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８のエピトープとは異なるエピトープに結合する、（ｂ）前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８よりも大きな親和性を有して結合する、或いは（ｃ）前記抗体は、メソテリンの前記ｍｅｓｏｖｔ２形態への結合に対して、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８よりも有意である、という点でｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８とは区別されるものである、方法。
【請求項２２】
請求項２１の方法において、
前記抗体は、モノクローナル抗体である。
【請求項２３】
請求項２１の方法において、
前記形成異常細胞は、肺、卵巣、或いは膵臓癌細胞である。
【請求項２４】
請求項２１の方法において、
前記患者は、ヒト患者である。
【請求項２５】
請求項２１の方法において、
前記抗体は、化学療法因子と抱合されているものである。
【請求項２６】
請求項２５の方法において、
前記化学療法因子は、放射性核種である。
【請求項２７】
請求項２６の方法において、
前記放射性核種は、リード（Ｌｅａｄ）−２１２、ビスマス（Ｂｉｓｍｕｔｈ）−２１２、アスタチン（Ａｓｔａｔｉｎｅ）−２１１、イオジン（Ｉｏｄｉｎｅ）−１３１、スカンジウム（Ｓｃａｎｄｉｕｍ）−４７、レニウム（Ｒｈｅｎｉｕｍ）−１８６、レニウム（Ｒｈｅｎｉｕｍ）−１８８、イットリウム（Ｙｔｔｒｉｕｍ）−９０、イオジン（Ｉｏｄｉｎｅ）−１２３、イオジン（Ｉｏｄｉｎｅ）−１２５、ブロマイン（Ｂｒｏｍｉｎｅ）−７７、インジウム（Ｉｎｄｉｕｍ）−１１１、ホウ素（Ｂｏｒｏｎ）−１０、及びアクチニド（Ａｃｔｉｎｉｄｅ）から成る群から選択されるものである。
【請求項２８】
請求項２５の方法において、
前記化学療法因子は、リシン、修飾シュードモナスエンテロトキシン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）Ａ、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、及び５−フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）から成る群から選択されるものである。
【請求項２９】
請求項２８の抗体において、
前記抗体は、化学療法因子と抱合されているものである。
【請求項３０】
請求項２９の抗体において、
前記化学療法因子は、放射性核種である。
【請求項３１】
請求項３０の抗体において、
前記放射性核種は、リード（Ｌｅａｄ）−２１２、ビスマス（Ｂｉｓｍｕｔｈ）−２１２、アスタチン（Ａｓｔａｔｉｎｅ）−２１１、イオジン（Ｉｏｄｉｎｅ）−１３１、スカンジウム（Ｓｃａｎｄｉｕｍ）−４７、レニウム（Ｒｈｅｎｉｕｍ）−１８６、レニウム（Ｒｈｅｎｉｕｍ）−１８８、イットリウム（Ｙｔｔｒｉｕｍ）−９０、イオジン（Ｉｏｄｉｎｅ）−１２３、イオジン（Ｉｏｄｉｎｅ）−１２５、ブロマイン（Ｂｒｏｍｉｎｅ）−７７、インジウム（Ｉｎｄｉｕｍ）−１１１、ホウ素（Ｂｏｒｏｎ）−１０、及びアクチニド（Ａｃｔｉｎｉｄｅ）から成る群から選択されるものである。
【請求項３２】
請求項２５の抗体において、
前記化学療法因子は、リシン、修飾シュードモナスエンテロトキシン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）Ａ、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、及び５−フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）から成る群から選択されるものである。
【請求項３３】
メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合するワクチン抗体を産生する方法であって、
前記抗原は、（ａ）前記Ｔ細胞は、ｍｅｓｏｖｔ２に特異的なエピトープに結合する、という点でメソテリンＡとは区別されるものである、方法。
【請求項３４】
請求項１の抗体において、
前記抗体は、配列ＩＤ番号：１２の少なくとも１０連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、ｍｅｓｏｖｔ２上のエピトープへ特異的に結合するものである。
【請求項３５】
請求項３４の抗体において、
前記エピトープは、配列ＩＤ番号：１２の少なくとも１１連続アミノ酸を有するものである。
【請求項３６】
請求項３４の抗体において、
前記エピトープは、配列ＩＤ番号：１２の少なくとも１２連続アミノ酸を有するものである。
【請求項３７】
請求項３４の抗体において、
前記エピトープは、配列ＩＤ番号：１２の少なくとも１３連続アミノ酸を有するものである。
【請求項３８】
請求項３４の抗体において、
前記エピトープは、配列ＩＤ番号：１２の少なくとも１４連続アミノ酸を有するものである。
【請求項３９】
請求項３４の抗体において、
前記エピトープは、配列ＩＤ番号：１２のアミノ鎖配列を有するものである。
【請求項４０】
請求項３４の抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項４１】
配列ＩＤ番号：１２のアミノ酸配列を含む、ｍｅｓｏｖｔ２のエピトープに特異的に結合する抗体を有する、ポリクローナル抗体調合。
【請求項４２】
メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合する抗体を産生する方法であって、
前記抗体は、（ａ）前記抗体は、配列ＩＤ番号：１２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、或いはそれらの抗原断片を抗原として用いて産生される、という点でｍＡＢ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８とは区別されるものである、方法。
【請求項４３】
請求項１９の方法において、
前記抗体は、配列ＩＤ番号：１２のアミノ酸配列から成るポリペプチドを用いて産生されるものである。
【請求項４４】
ｍｅｓｏｖｔ２の発現の増加に関連した形成異常細胞の成長を阻害する方法であって、
そのような形成異常細胞を有する患者へ、メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合する抗体を有する組成物を投与する工程を有するものであり、
ここにおいて前記抗体は、配列ＩＤ番号：１２の少なくとも１０連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、ｍｅｓｏｖｔ２のエピトープに結合する、という点で、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８とは区別されるものである、方法。
【請求項４５】
請求項４４の方法において、
前記抗体は、配列ＩＤ番号：１２のアミノ酸配列を有するｍｅｓｏｖｔ２のエピトープに結合するものである。
【請求項１】
メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォーム（配列ＩＤ番号：２）に特異的に結合する抗体であって、
前記抗体は、（ａ）前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８のエピトープとは異なるエピトープに結合する、（ｂ）前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８よりも大きな親和性を有して結合する、或いは（ｃ）前記抗体は、メソテリンの前記ｍｅｓｏｖｔ２形態への結合に対して、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８よりも有意である、という点でｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８とは区別されるものである、抗体。
【請求項２】
請求項１の抗体において、
前記抗体の親和性は、少なくとも約１ｘ１０−７Ｍである。
【請求項３】
請求項１の抗体において、
前記抗体の親和性は、少なくとも約１ｘ１０−８Ｍである。
【請求項４】
請求項１の抗体において、
前記抗体の親和性は、少なくとも約１ｘ１０−９Ｍである。
【請求項５】
請求項１の抗体において、
前記抗体の親和性は、少なくとも約１ｘ１０−１０Ｍである。
【請求項６】
請求項１の抗体において、
前記エピトープは、ジスルフィド−依存性エピトープである。
【請求項７】
請求項１の抗体において、
前記抗体は、キメラ抗体である。
【請求項８】
請求項７の抗体において、
前記キメラ抗体は、ヒト−マウスキメラ抗体である。
【請求項９】
請求項１の抗体において、
前記抗体は、ヒト化抗体である。
【請求項１０】
請求項１の抗体において、
前記抗体は、完全ヒト抗体である。
【請求項１１】
請求項１の抗体を発現するハイブリドーマ細胞。
【請求項１２】
請求項１の抗体をコード化するポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２のポリヌクレオチドを有するベクター。
【請求項１４】
請求項１３のベクターを有する発現細胞。
【請求項１５】
メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合する抗体を産生する方法であって、
前記抗体は、（ａ）前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８のエピトープとは異なるエピトープに結合する、（ｂ）前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８よりも大きな親和性を有して結合する、或いは（ｃ）前記抗体は、メソテリンの前記ｍｅｓｏｖｔ２形態への結合に対して、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８よりも有意である、という点でｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８とは区別されるものであり、
請求項１１のハイブリドーマを培養する工程を有する、方法。
【請求項１６】
メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームと特異的に結合する抗体を産生する方法であって、
前記抗体は、（ａ）前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８のエピトープとは異なるエピトープに結合する、（ｂ）前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８よりも大きな親和性を有して結合する、或いは（ｃ）前記抗体は、メソテリンの前記ｍｅｓｏｖｔ２形態への結合に対して、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８よりも有意である、という点でｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８とは区別されるものであり、
請求項１４の発現細胞を培養する工程を有する、方法。
【請求項１７】
請求項１４の発現細胞において、
前記細胞は、哺乳類細胞である。
【請求項１８】
請求項１６の方法において、
前記発現細胞は、哺乳類細胞である。
【請求項１９】
メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合する抗体を産生する方法であって、
前記抗体は、（ａ）前記抗体は、配列ＩＤ番号：７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、或いはそれらの抗原断片を抗原として用いて産生される、という点でｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８とは区別されるものである。
【請求項２０】
請求項１９の方法において、
前記抗体は、配列ＩＤ番号：７のアミノ酸配列から成るポリペプチドを用いて産生されるものである。
【請求項２１】
ｍｅｓｏｖｔ２の発現の増加に関連した形成異常細胞の成長を阻害する方法であって、
そのような形成異常細胞を有する患者へ、メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合する抗体を有する組成物を投与する工程を有するものであり、
ここにおいて前記抗体は、（ａ）前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８のエピトープとは異なるエピトープに結合する、（ｂ）前記抗体は、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８よりも大きな親和性を有して結合する、或いは（ｃ）前記抗体は、メソテリンの前記ｍｅｓｏｖｔ２形態への結合に対して、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８よりも有意である、という点でｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８とは区別されるものである、方法。
【請求項２２】
請求項２１の方法において、
前記抗体は、モノクローナル抗体である。
【請求項２３】
請求項２１の方法において、
前記形成異常細胞は、肺、卵巣、或いは膵臓癌細胞である。
【請求項２４】
請求項２１の方法において、
前記患者は、ヒト患者である。
【請求項２５】
請求項２１の方法において、
前記抗体は、化学療法因子と抱合されているものである。
【請求項２６】
請求項２５の方法において、
前記化学療法因子は、放射性核種である。
【請求項２７】
請求項２６の方法において、
前記放射性核種は、リード（Ｌｅａｄ）−２１２、ビスマス（Ｂｉｓｍｕｔｈ）−２１２、アスタチン（Ａｓｔａｔｉｎｅ）−２１１、イオジン（Ｉｏｄｉｎｅ）−１３１、スカンジウム（Ｓｃａｎｄｉｕｍ）−４７、レニウム（Ｒｈｅｎｉｕｍ）−１８６、レニウム（Ｒｈｅｎｉｕｍ）−１８８、イットリウム（Ｙｔｔｒｉｕｍ）−９０、イオジン（Ｉｏｄｉｎｅ）−１２３、イオジン（Ｉｏｄｉｎｅ）−１２５、ブロマイン（Ｂｒｏｍｉｎｅ）−７７、インジウム（Ｉｎｄｉｕｍ）−１１１、ホウ素（Ｂｏｒｏｎ）−１０、及びアクチニド（Ａｃｔｉｎｉｄｅ）から成る群から選択されるものである。
【請求項２８】
請求項２５の方法において、
前記化学療法因子は、リシン、修飾シュードモナスエンテロトキシン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）Ａ、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、及び５−フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）から成る群から選択されるものである。
【請求項２９】
請求項２８の抗体において、
前記抗体は、化学療法因子と抱合されているものである。
【請求項３０】
請求項２９の抗体において、
前記化学療法因子は、放射性核種である。
【請求項３１】
請求項３０の抗体において、
前記放射性核種は、リード（Ｌｅａｄ）−２１２、ビスマス（Ｂｉｓｍｕｔｈ）−２１２、アスタチン（Ａｓｔａｔｉｎｅ）−２１１、イオジン（Ｉｏｄｉｎｅ）−１３１、スカンジウム（Ｓｃａｎｄｉｕｍ）−４７、レニウム（Ｒｈｅｎｉｕｍ）−１８６、レニウム（Ｒｈｅｎｉｕｍ）−１８８、イットリウム（Ｙｔｔｒｉｕｍ）−９０、イオジン（Ｉｏｄｉｎｅ）−１２３、イオジン（Ｉｏｄｉｎｅ）−１２５、ブロマイン（Ｂｒｏｍｉｎｅ）−７７、インジウム（Ｉｎｄｉｕｍ）−１１１、ホウ素（Ｂｏｒｏｎ）−１０、及びアクチニド（Ａｃｔｉｎｉｄｅ）から成る群から選択されるものである。
【請求項３２】
請求項２５の抗体において、
前記化学療法因子は、リシン、修飾シュードモナスエンテロトキシン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）Ａ、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、及び５−フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）から成る群から選択されるものである。
【請求項３３】
メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合するワクチン抗体を産生する方法であって、
前記抗原は、（ａ）前記Ｔ細胞は、ｍｅｓｏｖｔ２に特異的なエピトープに結合する、という点でメソテリンＡとは区別されるものである、方法。
【請求項３４】
請求項１の抗体において、
前記抗体は、配列ＩＤ番号：１２の少なくとも１０連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、ｍｅｓｏｖｔ２上のエピトープへ特異的に結合するものである。
【請求項３５】
請求項３４の抗体において、
前記エピトープは、配列ＩＤ番号：１２の少なくとも１１連続アミノ酸を有するものである。
【請求項３６】
請求項３４の抗体において、
前記エピトープは、配列ＩＤ番号：１２の少なくとも１２連続アミノ酸を有するものである。
【請求項３７】
請求項３４の抗体において、
前記エピトープは、配列ＩＤ番号：１２の少なくとも１３連続アミノ酸を有するものである。
【請求項３８】
請求項３４の抗体において、
前記エピトープは、配列ＩＤ番号：１２の少なくとも１４連続アミノ酸を有するものである。
【請求項３９】
請求項３４の抗体において、
前記エピトープは、配列ＩＤ番号：１２のアミノ鎖配列を有するものである。
【請求項４０】
請求項３４の抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項４１】
配列ＩＤ番号：１２のアミノ酸配列を含む、ｍｅｓｏｖｔ２のエピトープに特異的に結合する抗体を有する、ポリクローナル抗体調合。
【請求項４２】
メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合する抗体を産生する方法であって、
前記抗体は、（ａ）前記抗体は、配列ＩＤ番号：１２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、或いはそれらの抗原断片を抗原として用いて産生される、という点でｍＡＢ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８とは区別されるものである、方法。
【請求項４３】
請求項１９の方法において、
前記抗体は、配列ＩＤ番号：１２のアミノ酸配列から成るポリペプチドを用いて産生されるものである。
【請求項４４】
ｍｅｓｏｖｔ２の発現の増加に関連した形成異常細胞の成長を阻害する方法であって、
そのような形成異常細胞を有する患者へ、メソテリンのｍｅｓｏｖｔ２アイソフォームに特異的に結合する抗体を有する組成物を投与する工程を有するものであり、
ここにおいて前記抗体は、配列ＩＤ番号：１２の少なくとも１０連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、ｍｅｓｏｖｔ２のエピトープに結合する、という点で、ｍＡｂ Ｋ１及びＳＳ１（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８とは区別されるものである、方法。
【請求項４５】
請求項４４の方法において、
前記抗体は、配列ＩＤ番号：１２のアミノ酸配列を有するｍｅｓｏｖｔ２のエピトープに結合するものである。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【公表番号】特表２００７−５２５９７１（Ｐ２００７−５２５９７１Ａ）
【公表日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２２７７２（Ｐ２００６−５２２７７２）
【出願日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２５５５８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１４６５２
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（５０６０３１９４８）モルフォテック、インク． (16)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２５５５８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１４６５２
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（５０６０３１９４８）モルフォテック、インク． (16)
【Ｆターム（参考）】
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