糖鎖量測定方法
【課題】本発明は、固定化された糖鎖の量を精度よく測定可能な方法を提供する。
【解決手段】基材上に固定化された糖鎖の糖鎖量を測定する方法であって、前記糖鎖を酸化してアルデヒド基を形成すること、前記アルデヒド基に第１級アミノ基含有標識化合物を接触させて結合させること、及び、前記標識を検出することを含み、前記第１級アミノ基が、ヒドラジド基、オキシルアミノ基、又はアミノ基であり、前記第１級アミノ基含有標識化合物が、標識基と、第１級アミノ基と、前記標識基と前記第１級アミノ基とを接続する炭素原子を含むリンカー部とを有する化合物である糖鎖量測定方法。
【解決手段】基材上に固定化された糖鎖の糖鎖量を測定する方法であって、前記糖鎖を酸化してアルデヒド基を形成すること、前記アルデヒド基に第１級アミノ基含有標識化合物を接触させて結合させること、及び、前記標識を検出することを含み、前記第１級アミノ基が、ヒドラジド基、オキシルアミノ基、又はアミノ基であり、前記第１級アミノ基含有標識化合物が、標識基と、第１級アミノ基と、前記標識基と前記第１級アミノ基とを接続する炭素原子を含むリンカー部とを有する化合物である糖鎖量測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖量測定方法、並びに基材及び試薬キットの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学分野において、近年、核酸、タンパク質に続く第三の鎖として糖鎖分子が注目されている。特に細胞の分化や癌化、免疫反応や受精などのかかわりが研究され、新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。また、糖鎖は多くの毒素、ウィルス及びバクテリアなどの病原性外来因子受容体であり、また、癌のマーカーとしても注目されており、こちらの分野においても、同様に新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。
【０００３】
糖鎖は、それ単独で機能を発揮するというより、細胞レセプターに対するリガンドとして機能する場合も多く確認されている。それゆえ、糖鎖に対するレセプターの解析に供するために、種々の糖鎖を固定化するための基材が開発されている（例えば、特許文献１〜３）。しかしながら、固定化された糖鎖を定量する方法について言及している文献はほとんどない。糖鎖固定化基材の性能評価や品質管理を行う上では固定化された糖鎖をいかに定量するかが鍵となる。固定化された糖鎖を直接標識する場合、固相反応となるため反応効率が低く、糖の種類や固定化量によっては検出できない場合もありうる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−５２７５３９号公報
【特許文献２】特開２００８−２３１０１３号公報
【特許文献３】特開２００８−５３０５３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、固定化された糖鎖の量を精度よく測定可能な方法、並びに基材及び試薬キットの製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、一態様として、基材上に固定化された糖鎖の糖鎖量を測定する方法であって、前記糖鎖を酸化してアルデヒド基を形成すること、前記アルデヒド基に第１級アミノ基含有標識化合物を接触させて結合させること、及び、前記標識を検出することを含み、前記第１級アミノ基が、ヒドラジド基、オキシルアミノ基、又はアミノ基であり、前記第１級アミノ基含有標識化合物が、標識基と、第１級アミノ基と、前記標識基と前記第１級アミノ基とを接続する炭素原子を含むリンカー部とを有する化合物である糖鎖量測定方法（以下、「本発明の糖鎖量測定方法」ともいう）に関する。
【０００７】
本発明は、その他の態様として、糖鎖が固定化された基材の製造方法であって、本発明の糖鎖量測定方法によって固定化された前記糖鎖量を測定する工程を含む基材の製造方法（以下、「本発明の基材の製造方法」ともいう）に関する。
【０００８】
本発明は、さらにその他の態様として、糖鎖固定化基材を含む試薬キットの製造方法であって、本発明の糖鎖量測定方法によって固定化された前記糖鎖量を測定することを含む製造方法により前記糖鎖固定化基材を製造する工程を含む試薬キットの製造方法（以下、「本発明の試薬キットの製造方法」ともいう）に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、固定化された糖鎖の量を精度よく測定することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
基材上に固定化された糖鎖を酸化してアルデヒド基を形成し、形成させた糖鎖のアルデヒド基を所定のリンカー部を有する標識化合物と反応させることによって、標識化合物による標識を効率よく行うことができ、また基材上に固定化された糖鎖を精度よく測定できる、という知見に基づく。
【００１１】
基材上に固定化された糖鎖を酸化してアルデヒド基を形成し、形成させた糖鎖のアルデヒド基に所定のリンカー部を有する標識化合物と反応させることによって、標識化合物による標識を効率よく行うことができ、また基材上に固定化された糖鎖を精度よく測定できるメカニズムの詳細は不明であるが、以下のように推定できる。すなわち、リンカー部を有する標識化合物を用いることで、標識化合物の標識基と糖鎖の間に距離ができ、立体障害による標識効率の低下を防ぐことが可能であるため、と考えられる。但し、本発明はこれらのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
【００１２】
本発明は、以下の態様、すなわち、
〔１〕基材上に固定化された糖鎖の糖鎖量を測定する方法であって、前記糖鎖を酸化してアルデヒド基を形成すること、前記アルデヒド基に第１級アミノ基含有標識化合物を接触させて結合させること、及び、前記標識を検出することを含み、前記第１級アミノ基が、ヒドラジド基、オキシルアミノ基、又はアミノ基であり、前記第１級アミノ基含有標識化合物が、標識基と、第１級アミノ基と、前記標識基と前記第１級アミノ基とを接続する炭素原子を含むリンカー部とを有する化合物である糖鎖量測定方法；
〔２〕前記第１級アミノ基含有標識化合物の標識基が、ビオチン、酵素、蛍光物質及び紫外線吸収物質からなる群から選択される物質である〔１〕記載の糖鎖量測定方法；
〔３〕前記第１級アミノ基含有標識化合物のリンカー部が、ヘキサノイルアミノ基０〜２残基からなる群から選択される基である〔１〕又は〔２〕記載の糖鎖量測定方法；
〔４〕前記アルデヒド基と前記第１級アミノ基含有標識化合物との結合反応が、２５〜６０℃、１５分〜２４時間である〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の糖鎖量測定方法；
〔５〕前記糖鎖が、単糖、２糖以上の糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、及びそれらの誘導体からなる群から選択される糖鎖である〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の糖鎖量測定方法；
〔６〕前記基材が、プレート、チップ、チューブ、膜、又はビーズである〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の糖鎖量測定方法；
〔７〕前記基材の糖鎖が固定化される表面の材料が、樹脂、ガラス、又はシリコンである〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の糖鎖量測定方法；
〔８〕前記樹脂が、環状ポリオレフィン、スチレン、ＡＢＳ、ＰＴＦＥ、又はＰＥＴである〔７〕記載の糖鎖量測定方法；
〔９〕糖鎖が固定化された基材の製造方法であって、〔１〕から〔８〕のいずれかに記載の糖鎖量測定方法によって固定化された前記糖鎖量を測定する工程を含む、基材の製造方法；
〔１０〕糖鎖固定化基材を含む試薬キットの製造方法であって、〔１〕から〔８〕のいずれかに記載の糖鎖量測定方法によって固定化された前記糖鎖量を測定することを含む製造方法により前記糖鎖固定化基材を製造する工程を含む、試薬キットの製造方法；
に関する。
【００１３】
［糖鎖］
本明細書において「糖鎖」とは、１以上の単糖及び又は単糖の誘導体が鎖状にグリコシド結合により結合した分子のことをいう。糖鎖としては、例えば、単糖、２糖以上の糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、それらの誘導体、それらを含む生体由来物質等が挙げられる。誘導体としては、例えば、前記糖鎖物質を模倣した化合物や、必要に応じて蛍光物質などの標識分子を導入した化合物等が挙げられる。生体由来物質としては、例えば、血液、体液又は組織からの抽出物等が挙げられる。糖鎖は、化学合成により生成された糖鎖化合物であってもよい。
【００１４】
［基材］
本明細書において「基材」とは、糖鎖を固定化するためのものであって、その形状は特に制限されず、例えば、プレート、チップ、チューブ、膜、又はビーズ等が挙げられ、中でもプレートが好ましい。プレートとしては、一般にマルチウェルプレートと呼ばれ、細胞培養、組織培養、細菌培養、蛋白質やＤＮＡ、ＲＮＡ等の固定による免疫分析等の分野で汎用されているものが使用できる。マルチウェルプレートは１枚のプレートで多数の検体を同時に扱えるため多量の検体を扱う必要のある創薬スクリーニング、ＨＴＳ等で多量に使用される。マルチウェルプレートとしては、プレート当たりのウェルの数が６、１２、２４、４８、９６、３８４であるものが一般的である。基材の材質は特に制限されるものではないが、糖鎖が固定化される基材表面が糖鎖を固定化可能な官能基を有することが好ましい。また、基材の糖鎖が固定化される表面の材料は、樹脂、ガラス、又はシリコンであることが好ましい。樹脂としては、例えば、状ポリオレフィン、スチレン、ＡＢＳ（アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体）、ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）、又はＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）等が挙げられる。
【００１５】
本明細書において「基材上に固定化された糖鎖」とは、基材表面に糖鎖が固定化されていることであって、例えば、糖鎖は、基材表面に捕捉されていてもよいし、基材表面の官能基と結合していてもよい。基材表面の官能基との結合としては、例えば、ヒドラゾン結合、オキシム結合又はアミノ結合等が挙げられる。官能基としては、例えば、第１級アミノ基、第２級アミノ基等が挙げられる。反応のしやすさを考えると第１級アミノ基の使用が好ましい。第１級アミノ基としては、例えば、ヒドラジド基、オキシルアミノ基、又はアミノ基等が挙げられる。
【００１６】
［第１級アミノ基含有標識化合物］
本明細書において「第１級アミノ基含有標識化合物」とは、標識基と、第１級アミノ基と、前記標識基と前記第１級アミノ基とを接続する炭素原子を含むリンカー部とを有する化合物であって、第１級アミノ基が、ヒドラジド基、オキシルアミノ基、又はアミノ基である。
【００１７】
標識基としては、例えば、ビオチン、酵素、蛍光物質及び紫外線吸収物質等が挙げられる。
【００１８】
リンカー部は、炭素原子を含むものであればよく、特に限定されるものではないが、例えば、アルカノイルアミノ基、アルカノイル基、アルキルアミノ基、及びアルキル基等が挙げられる。リンカー部の炭素数は、特に限定されるものではないが、例えば、１〜２０である。アルカノイルアミノ基としては、例えば、炭素数が３〜１０のアルカノイルアミノ基が挙げられ、具体例としては、ブタノイルアミノ基、ペンタノイルアミノ基、ヘキサノイルアミノ基、及びオクタノイルアミノ基等が挙げられる。アルカノイル基としては、例えば、炭素数が３〜１０のアルカノイル基が挙げられ、具体例としては、ブタノイル基、ペンタノイル基、ヘキサノイル基、及びオクタノイル基等が挙げられる。中でも、リンカー部は、ヘキサノイルアミノ基０〜２残基が好ましく、より好ましくはヘキサノイルアミノ基１又は２残基である。
【００１９】
第１級アミノ基含有標識化合物としては、特に限定されるものではないが、例えば、下記式で表されるアミノオキシビオチン、６−（ビオチニルアミノ）ヘキサノイルヒドラジン、６−[６−（ビオチニルアミノ）ヘキサノイルアミノ]ヘキサノイルヒドラジンが挙げられ、入手のし易さの点から、６−（ビオチニルアミノ）ヘキサノイルヒドラジンが好ましい。
【化１】
【００２０】
［糖鎖量測定方法］
本発明は、一態様として、基材上に固定化された糖鎖の糖鎖量を測定する方法であって、前記糖鎖を酸化してアルデヒド基を形成すること、前記アルデヒド基に第１級アミノ基含有標識化合物を接触させて結合させること、及び、前記標識を検出することを含み、前記第１級アミノ基が、ヒドラジド基、オキシルアミノ基、又はアミノ基であり、前記第１級アミノ基含有標識化合物が、標識基と、第１級アミノ基と、前記標識基と前記第１級アミノ基とを接続する炭素原子を含むリンカー部とを有する化合物である糖鎖量測定方法に関する。本発明の糖鎖量測定方法によれば、基材上に固定化された糖鎖を基材上に固定化させた状態で直接測定するため、測定結果のばらつきが低減され、かつ高感度で精度よく固定化された糖鎖の量を測定することができる。
【００２１】
本発明の糖鎖量測定方法において、まず、基材上に固定化された糖鎖を酸化してアルデヒド基を形成することを含む。糖鎖の酸化は、公知の方法により行うことができ、例えば、過ヨウ素酸や四酢酸鉛を用いた酸化等が挙げられ、好ましくは過ヨウ素酸を用いた酸化である。過ヨウ素酸による酸化は、糖鎖の酸化によく用いられ、実験指導書にも記載が存在する。
【００２２】
酸化を行う条件は、特に制限されず公知の方法に応じて行うことができる。反応温度は、例えば、２５〜６０℃であり、好ましくは２５〜３７℃である。反応時間は、例えば、１５分以上であり、好ましくは１５〜３０分である。
【００２３】
糖鎖の酸化を過ヨウ素酸を用いて行う場合、反応溶液中の過ヨウ素酸の終濃度は特に制限されるものではないが、例えば、１ｍｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍＬである。
【００２４】
次に、前記糖鎖に第１級アミノ基含有標識化合物を接触させて前記糖鎖のアルデヒド基に前記標識化合物を結合させる。糖鎖のアルデヒド基に第１級アミノ基含有標識化合物との接触は、アルデヒド基が形成された糖鎖が固定された基材に第１級アミノ基含有標識化合物を接触させ、インキュベートすることにより行うことができる。
【００２５】
インキュベート条件は、糖鎖及び／又は第１級アミン基含有標識化合物の種類等に応じて適宜決定できる。インキュベート温度としては、例えば、２５〜６０℃であり、好ましくは２５〜３７℃である。インキュベート時間としては、例えば、１５分以上、好ましくは１５分〜２４時間、より好ましくは２〜２４時間、より好ましくは１２〜２４時間である。
【００２６】
反応溶液中の第１級アミノ基含有標識化合物の終濃度は、第１級アミノ基含有標識化合物等に応じて適宜決定でき特に限定されるものではないが、例えば、５μＭ以上であり、好ましくは５〜５０μＭである。
【００２７】
そして、前記標識を検出し、基材に固定化した糖鎖の定量等を行う。標識の検出は、例えば、マイクロプレートリーダー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
【００２８】
本発明の糖鎖測定方法は、さらに、糖鎖を基材上に固定化することを含んでいてもよい。基材上への糖鎖の固定化方法は、特に制限されるものではないが、例えば、糖鎖を含む溶液を基材に滴下し、加熱して乾固することにより行うことができる。基材表面が第１級アミノ基を有する場合、例えば、糖鎖のアルデヒド末端と第１級アミン基とを共有結合させることによって、糖鎖を基材上に結合させ固定化することができる。
【００２９】
基材表面は、糖鎖を固定化可能な官能基を有することが好ましい。上記官能基は、例えば、第１級アミノ基等の官能基を有する高分子化合物を基材表面にコーティングすることによって基材表面に付与することができる。第１級アミノ基を有する高分子化合物としては、例えば、ポリアリルアミンやポリエチレンイミン等の第１級アミンを主鎖中に有する高分子化合物や、側鎖にアミノ基を有するポリリジン又はポリオルニチン等のポリアミン等が挙げられ、中でも、糖を基材に固定化するための第１級アミノ基と夾雑物の非特異的吸着防止のための親水性基を有しており、より確実に糖のみを固定化させる点から、側鎖に第１級アミノ基を有するモノマー、側鎖に親水性基を有するモノマー、基材と固相化するための疎水基を有するモノマーを共重合させた高分子化合物が好ましい。第１級アミノ基を有する高分子化合物としては、具体的には、下記一般式（１）で表される高分子化合物を好適に用いることができる。
【００３０】
【化２】
【００３１】
式（１）中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一又は異なり水素原子またはメチル基を示す。Ｒ4は疎水性基を示し、好ましくはアルキル基であり、より好ましくは炭素数が２〜１０のアルキル基である。Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサを示す。Ｚは酸素原子又はＮＨを示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基を示し、好ましくはエチレンオキシ基である。ｐは、アルキレンオキシ基の繰り返し数を示し、例えば、１〜２０の整数である。繰り返し数であるｐが２以上２０以下の場合は、繰り返されるアルキレンオキシ基Ｘの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。ｌ、ｍ及びｎはモノマーユニット数を示す自然数であり、各構成成分の組成割合として表記される場合がある。
【００３２】
一般式（１）で表される高分子化合物は、（メタ）アクリル残基とホスホリルコリン基が炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基Ｘの連鎖を介して結合した構造であることが好ましい。ホスホリルコリン基を有するモノマーの組成割合は（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｌの比率）は、非特異的吸着を低減し、かつ高分子化合物の溶出を抑制する点から、高分子の全モノマーに対して、５〜９８ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％、さらに好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％である。一般式（１）で表される高分子化合物は、中でも、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−Ｎ−［２−［２−［２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシ−アセチルアミノ）エトキシ］エトキシ］エチル］−メタクリルアミド共重合体が好ましい。
【００３３】
［基材の製造方法］
本発明は、その他の態様として、糖鎖が固定化された基材の製造方法であって、本発明の糖鎖量測定方法によって固定化された前記糖鎖量を測定する工程を含む基材の製造方法に関する。本発明の基材の製造方法によれば、固定化された糖鎖の量が精度良く管理された糖鎖固定化基材を提供することができる。
【００３４】
定量は、例えば、マイクロプレートリーダー、及び高速液体クロマトグラフィー等によって行うことができる。
【００３５】
［試薬キットの製造方法］
本発明は、さらにその他の態様として、糖鎖固定化基材を含む試薬キットの製造方法であって、本発明の糖鎖量測定方法によって固定化された前記糖鎖量を測定することを含む製造方法により前記糖鎖固定化基材を製造する工程を含む試薬キットの製造方法に関する。本発明の試薬キットの製造方法によれば、固定化された糖鎖の量が精度良く管理された糖鎖固定化基材を含む試薬キットを提供することができる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例及び比較例に基づいて説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３７】
［実施例１］ プレート上に固定された糖鎖の定量
（糖鎖固定化基材の作製）
糖鎖を固定化させる基材としては、下記のようにして各ウェルの表面を下記高分子化合物でコーティングした９６ウェルプレートを使用した。なお、該９６ウェルプレートは住友ベークライトにおいて環状ポリオレフィン樹脂で成形したものを使用した。
【００３８】
高分子化合物としては２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−Ｎ-［２−［２−［２−（ｔ−ブトキシカルボニル（以下、「Ｂｏｃ」と称す）アミノオキシ−アセチルアミノ）エトキシ］エトキシ］エチル］−メタクリルアミド共重合体を用いた。該高分子化合物の１．０重量％エタノール溶液１５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに分注し、３０分静置した後に溶液を抜き取り乾燥させて基材表面に塗布した。乾燥後、２Ｍ塩酸１００μＬを分注し、３７℃で２時間反応させてＢｏｃ基を脱保護し、高分子化合物でウェル表面がコーティングされた９６ウェルプレートを作製した。
【００３９】
（糖鎖の固定化）
ウェル内を純水で洗浄した後に、ラクトース（Ｓｉｇｍａ、６１３３９−２５Ｇ）、コンドロイチン硫酸Ａ（生化学バイオビジネス、４００６５０）、コンドロイチン硫酸Ｂ（生化学バイオビジネス、４００６６０）、コンドロイチン硫酸Ｃ（生化学バイオビジネス、４００６７０）、コンドロイチン硫酸Ｄ（生化学バイオビジネス、４００６７６）、ヘパラン硫酸（生化学バイオビジネス、４００７００）およびヒアルロン酸（生化学バイオビジネス、４００７２０）を、２％酢酸含有アセトニトリル：水＝３：１の溶液でラクトースは１００μＭ、それ以外は５μｇ／ｍＬにそれぞれ調製し、各ウェルに１００μＬ分注して８０℃で１時間反応させてウェル内に糖鎖を固定化した。反応後ウェル内を純水で洗浄し、１０ｍｇ／ｍＬの無水コハク酸水溶液を１００μＬ分注し、１時間反応させてウェル表面をコーティングした高分子化合物の未反応の官能基を不活性化した。反応後、ウェル内を純水で洗浄した。
【００４０】
（固定化糖鎖の検出）
過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬、１９７−０２４０２）水溶液を１０ｍｇ／ｍＬに調製し、各ウェルに１００μＬ分注して２５℃で３０分反応させて固定化糖鎖を酸化した。ウェル内を純水で洗浄後、６−（ビオチニルアミノ）ヘキサノイルヒドラジン（同仁化学製、製品コード：Ｂ３０２）を３００ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で５０μＭに調製し、各ウェルに１００μＬ分注して３７℃で１２時間反応させて糖鎖をビオチン化した。ウェル内を純水で洗浄後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、１９１３７０）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳバッファーで０．５μｇ／ｍＬに調製し、各ウェルに１００μＬ分注して２５℃で１時間反応させて糖鎖をＨＲＰ標識した。ウェル内を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳバッファーで洗浄後、固相化されたＨＲＰ量を測定するために、ＴＭＢ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１７２−１０６７）で１５分発色し、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製Ｉｎｆｉｎｉｔ２００）で測定波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を下記表１に示す。
【００４１】
［比較例１］ プレート上に固定された糖鎖の定量
糖鎖のビオチン化で６−（ビオチニルアミノ）ヘキサノイルヒドラジン（同仁化学製、製品コード：Ｂ３０２）の代わりにビオチンヒドラジド（ＳＩＧＭＡ、製品コード：Ｂ７６３９）を用いた点を除き、実施例１と同様の実験を行った。その結果を下記表１に示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】
リンカー部としてヘキサノイルアミノ基を１残基有する標識化合物を用いた実施例１によれば、該リンカー部を有さない標識化合物を用いた比較例１と比較して固定化された糖鎖の量を高感度で精度よく測定することができることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は、医療分野、生化学、生物学等の学術分野で有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖量測定方法、並びに基材及び試薬キットの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学分野において、近年、核酸、タンパク質に続く第三の鎖として糖鎖分子が注目されている。特に細胞の分化や癌化、免疫反応や受精などのかかわりが研究され、新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。また、糖鎖は多くの毒素、ウィルス及びバクテリアなどの病原性外来因子受容体であり、また、癌のマーカーとしても注目されており、こちらの分野においても、同様に新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。
【０００３】
糖鎖は、それ単独で機能を発揮するというより、細胞レセプターに対するリガンドとして機能する場合も多く確認されている。それゆえ、糖鎖に対するレセプターの解析に供するために、種々の糖鎖を固定化するための基材が開発されている（例えば、特許文献１〜３）。しかしながら、固定化された糖鎖を定量する方法について言及している文献はほとんどない。糖鎖固定化基材の性能評価や品質管理を行う上では固定化された糖鎖をいかに定量するかが鍵となる。固定化された糖鎖を直接標識する場合、固相反応となるため反応効率が低く、糖の種類や固定化量によっては検出できない場合もありうる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−５２７５３９号公報
【特許文献２】特開２００８−２３１０１３号公報
【特許文献３】特開２００８−５３０５３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、固定化された糖鎖の量を精度よく測定可能な方法、並びに基材及び試薬キットの製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、一態様として、基材上に固定化された糖鎖の糖鎖量を測定する方法であって、前記糖鎖を酸化してアルデヒド基を形成すること、前記アルデヒド基に第１級アミノ基含有標識化合物を接触させて結合させること、及び、前記標識を検出することを含み、前記第１級アミノ基が、ヒドラジド基、オキシルアミノ基、又はアミノ基であり、前記第１級アミノ基含有標識化合物が、標識基と、第１級アミノ基と、前記標識基と前記第１級アミノ基とを接続する炭素原子を含むリンカー部とを有する化合物である糖鎖量測定方法（以下、「本発明の糖鎖量測定方法」ともいう）に関する。
【０００７】
本発明は、その他の態様として、糖鎖が固定化された基材の製造方法であって、本発明の糖鎖量測定方法によって固定化された前記糖鎖量を測定する工程を含む基材の製造方法（以下、「本発明の基材の製造方法」ともいう）に関する。
【０００８】
本発明は、さらにその他の態様として、糖鎖固定化基材を含む試薬キットの製造方法であって、本発明の糖鎖量測定方法によって固定化された前記糖鎖量を測定することを含む製造方法により前記糖鎖固定化基材を製造する工程を含む試薬キットの製造方法（以下、「本発明の試薬キットの製造方法」ともいう）に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、固定化された糖鎖の量を精度よく測定することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
基材上に固定化された糖鎖を酸化してアルデヒド基を形成し、形成させた糖鎖のアルデヒド基を所定のリンカー部を有する標識化合物と反応させることによって、標識化合物による標識を効率よく行うことができ、また基材上に固定化された糖鎖を精度よく測定できる、という知見に基づく。
【００１１】
基材上に固定化された糖鎖を酸化してアルデヒド基を形成し、形成させた糖鎖のアルデヒド基に所定のリンカー部を有する標識化合物と反応させることによって、標識化合物による標識を効率よく行うことができ、また基材上に固定化された糖鎖を精度よく測定できるメカニズムの詳細は不明であるが、以下のように推定できる。すなわち、リンカー部を有する標識化合物を用いることで、標識化合物の標識基と糖鎖の間に距離ができ、立体障害による標識効率の低下を防ぐことが可能であるため、と考えられる。但し、本発明はこれらのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
【００１２】
本発明は、以下の態様、すなわち、
〔１〕基材上に固定化された糖鎖の糖鎖量を測定する方法であって、前記糖鎖を酸化してアルデヒド基を形成すること、前記アルデヒド基に第１級アミノ基含有標識化合物を接触させて結合させること、及び、前記標識を検出することを含み、前記第１級アミノ基が、ヒドラジド基、オキシルアミノ基、又はアミノ基であり、前記第１級アミノ基含有標識化合物が、標識基と、第１級アミノ基と、前記標識基と前記第１級アミノ基とを接続する炭素原子を含むリンカー部とを有する化合物である糖鎖量測定方法；
〔２〕前記第１級アミノ基含有標識化合物の標識基が、ビオチン、酵素、蛍光物質及び紫外線吸収物質からなる群から選択される物質である〔１〕記載の糖鎖量測定方法；
〔３〕前記第１級アミノ基含有標識化合物のリンカー部が、ヘキサノイルアミノ基０〜２残基からなる群から選択される基である〔１〕又は〔２〕記載の糖鎖量測定方法；
〔４〕前記アルデヒド基と前記第１級アミノ基含有標識化合物との結合反応が、２５〜６０℃、１５分〜２４時間である〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の糖鎖量測定方法；
〔５〕前記糖鎖が、単糖、２糖以上の糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、及びそれらの誘導体からなる群から選択される糖鎖である〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の糖鎖量測定方法；
〔６〕前記基材が、プレート、チップ、チューブ、膜、又はビーズである〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の糖鎖量測定方法；
〔７〕前記基材の糖鎖が固定化される表面の材料が、樹脂、ガラス、又はシリコンである〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の糖鎖量測定方法；
〔８〕前記樹脂が、環状ポリオレフィン、スチレン、ＡＢＳ、ＰＴＦＥ、又はＰＥＴである〔７〕記載の糖鎖量測定方法；
〔９〕糖鎖が固定化された基材の製造方法であって、〔１〕から〔８〕のいずれかに記載の糖鎖量測定方法によって固定化された前記糖鎖量を測定する工程を含む、基材の製造方法；
〔１０〕糖鎖固定化基材を含む試薬キットの製造方法であって、〔１〕から〔８〕のいずれかに記載の糖鎖量測定方法によって固定化された前記糖鎖量を測定することを含む製造方法により前記糖鎖固定化基材を製造する工程を含む、試薬キットの製造方法；
に関する。
【００１３】
［糖鎖］
本明細書において「糖鎖」とは、１以上の単糖及び又は単糖の誘導体が鎖状にグリコシド結合により結合した分子のことをいう。糖鎖としては、例えば、単糖、２糖以上の糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、それらの誘導体、それらを含む生体由来物質等が挙げられる。誘導体としては、例えば、前記糖鎖物質を模倣した化合物や、必要に応じて蛍光物質などの標識分子を導入した化合物等が挙げられる。生体由来物質としては、例えば、血液、体液又は組織からの抽出物等が挙げられる。糖鎖は、化学合成により生成された糖鎖化合物であってもよい。
【００１４】
［基材］
本明細書において「基材」とは、糖鎖を固定化するためのものであって、その形状は特に制限されず、例えば、プレート、チップ、チューブ、膜、又はビーズ等が挙げられ、中でもプレートが好ましい。プレートとしては、一般にマルチウェルプレートと呼ばれ、細胞培養、組織培養、細菌培養、蛋白質やＤＮＡ、ＲＮＡ等の固定による免疫分析等の分野で汎用されているものが使用できる。マルチウェルプレートは１枚のプレートで多数の検体を同時に扱えるため多量の検体を扱う必要のある創薬スクリーニング、ＨＴＳ等で多量に使用される。マルチウェルプレートとしては、プレート当たりのウェルの数が６、１２、２４、４８、９６、３８４であるものが一般的である。基材の材質は特に制限されるものではないが、糖鎖が固定化される基材表面が糖鎖を固定化可能な官能基を有することが好ましい。また、基材の糖鎖が固定化される表面の材料は、樹脂、ガラス、又はシリコンであることが好ましい。樹脂としては、例えば、状ポリオレフィン、スチレン、ＡＢＳ（アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体）、ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）、又はＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）等が挙げられる。
【００１５】
本明細書において「基材上に固定化された糖鎖」とは、基材表面に糖鎖が固定化されていることであって、例えば、糖鎖は、基材表面に捕捉されていてもよいし、基材表面の官能基と結合していてもよい。基材表面の官能基との結合としては、例えば、ヒドラゾン結合、オキシム結合又はアミノ結合等が挙げられる。官能基としては、例えば、第１級アミノ基、第２級アミノ基等が挙げられる。反応のしやすさを考えると第１級アミノ基の使用が好ましい。第１級アミノ基としては、例えば、ヒドラジド基、オキシルアミノ基、又はアミノ基等が挙げられる。
【００１６】
［第１級アミノ基含有標識化合物］
本明細書において「第１級アミノ基含有標識化合物」とは、標識基と、第１級アミノ基と、前記標識基と前記第１級アミノ基とを接続する炭素原子を含むリンカー部とを有する化合物であって、第１級アミノ基が、ヒドラジド基、オキシルアミノ基、又はアミノ基である。
【００１７】
標識基としては、例えば、ビオチン、酵素、蛍光物質及び紫外線吸収物質等が挙げられる。
【００１８】
リンカー部は、炭素原子を含むものであればよく、特に限定されるものではないが、例えば、アルカノイルアミノ基、アルカノイル基、アルキルアミノ基、及びアルキル基等が挙げられる。リンカー部の炭素数は、特に限定されるものではないが、例えば、１〜２０である。アルカノイルアミノ基としては、例えば、炭素数が３〜１０のアルカノイルアミノ基が挙げられ、具体例としては、ブタノイルアミノ基、ペンタノイルアミノ基、ヘキサノイルアミノ基、及びオクタノイルアミノ基等が挙げられる。アルカノイル基としては、例えば、炭素数が３〜１０のアルカノイル基が挙げられ、具体例としては、ブタノイル基、ペンタノイル基、ヘキサノイル基、及びオクタノイル基等が挙げられる。中でも、リンカー部は、ヘキサノイルアミノ基０〜２残基が好ましく、より好ましくはヘキサノイルアミノ基１又は２残基である。
【００１９】
第１級アミノ基含有標識化合物としては、特に限定されるものではないが、例えば、下記式で表されるアミノオキシビオチン、６−（ビオチニルアミノ）ヘキサノイルヒドラジン、６−[６−（ビオチニルアミノ）ヘキサノイルアミノ]ヘキサノイルヒドラジンが挙げられ、入手のし易さの点から、６−（ビオチニルアミノ）ヘキサノイルヒドラジンが好ましい。
【化１】
【００２０】
［糖鎖量測定方法］
本発明は、一態様として、基材上に固定化された糖鎖の糖鎖量を測定する方法であって、前記糖鎖を酸化してアルデヒド基を形成すること、前記アルデヒド基に第１級アミノ基含有標識化合物を接触させて結合させること、及び、前記標識を検出することを含み、前記第１級アミノ基が、ヒドラジド基、オキシルアミノ基、又はアミノ基であり、前記第１級アミノ基含有標識化合物が、標識基と、第１級アミノ基と、前記標識基と前記第１級アミノ基とを接続する炭素原子を含むリンカー部とを有する化合物である糖鎖量測定方法に関する。本発明の糖鎖量測定方法によれば、基材上に固定化された糖鎖を基材上に固定化させた状態で直接測定するため、測定結果のばらつきが低減され、かつ高感度で精度よく固定化された糖鎖の量を測定することができる。
【００２１】
本発明の糖鎖量測定方法において、まず、基材上に固定化された糖鎖を酸化してアルデヒド基を形成することを含む。糖鎖の酸化は、公知の方法により行うことができ、例えば、過ヨウ素酸や四酢酸鉛を用いた酸化等が挙げられ、好ましくは過ヨウ素酸を用いた酸化である。過ヨウ素酸による酸化は、糖鎖の酸化によく用いられ、実験指導書にも記載が存在する。
【００２２】
酸化を行う条件は、特に制限されず公知の方法に応じて行うことができる。反応温度は、例えば、２５〜６０℃であり、好ましくは２５〜３７℃である。反応時間は、例えば、１５分以上であり、好ましくは１５〜３０分である。
【００２３】
糖鎖の酸化を過ヨウ素酸を用いて行う場合、反応溶液中の過ヨウ素酸の終濃度は特に制限されるものではないが、例えば、１ｍｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍＬである。
【００２４】
次に、前記糖鎖に第１級アミノ基含有標識化合物を接触させて前記糖鎖のアルデヒド基に前記標識化合物を結合させる。糖鎖のアルデヒド基に第１級アミノ基含有標識化合物との接触は、アルデヒド基が形成された糖鎖が固定された基材に第１級アミノ基含有標識化合物を接触させ、インキュベートすることにより行うことができる。
【００２５】
インキュベート条件は、糖鎖及び／又は第１級アミン基含有標識化合物の種類等に応じて適宜決定できる。インキュベート温度としては、例えば、２５〜６０℃であり、好ましくは２５〜３７℃である。インキュベート時間としては、例えば、１５分以上、好ましくは１５分〜２４時間、より好ましくは２〜２４時間、より好ましくは１２〜２４時間である。
【００２６】
反応溶液中の第１級アミノ基含有標識化合物の終濃度は、第１級アミノ基含有標識化合物等に応じて適宜決定でき特に限定されるものではないが、例えば、５μＭ以上であり、好ましくは５〜５０μＭである。
【００２７】
そして、前記標識を検出し、基材に固定化した糖鎖の定量等を行う。標識の検出は、例えば、マイクロプレートリーダー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
【００２８】
本発明の糖鎖測定方法は、さらに、糖鎖を基材上に固定化することを含んでいてもよい。基材上への糖鎖の固定化方法は、特に制限されるものではないが、例えば、糖鎖を含む溶液を基材に滴下し、加熱して乾固することにより行うことができる。基材表面が第１級アミノ基を有する場合、例えば、糖鎖のアルデヒド末端と第１級アミン基とを共有結合させることによって、糖鎖を基材上に結合させ固定化することができる。
【００２９】
基材表面は、糖鎖を固定化可能な官能基を有することが好ましい。上記官能基は、例えば、第１級アミノ基等の官能基を有する高分子化合物を基材表面にコーティングすることによって基材表面に付与することができる。第１級アミノ基を有する高分子化合物としては、例えば、ポリアリルアミンやポリエチレンイミン等の第１級アミンを主鎖中に有する高分子化合物や、側鎖にアミノ基を有するポリリジン又はポリオルニチン等のポリアミン等が挙げられ、中でも、糖を基材に固定化するための第１級アミノ基と夾雑物の非特異的吸着防止のための親水性基を有しており、より確実に糖のみを固定化させる点から、側鎖に第１級アミノ基を有するモノマー、側鎖に親水性基を有するモノマー、基材と固相化するための疎水基を有するモノマーを共重合させた高分子化合物が好ましい。第１級アミノ基を有する高分子化合物としては、具体的には、下記一般式（１）で表される高分子化合物を好適に用いることができる。
【００３０】
【化２】
【００３１】
式（１）中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一又は異なり水素原子またはメチル基を示す。Ｒ4は疎水性基を示し、好ましくはアルキル基であり、より好ましくは炭素数が２〜１０のアルキル基である。Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサを示す。Ｚは酸素原子又はＮＨを示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基を示し、好ましくはエチレンオキシ基である。ｐは、アルキレンオキシ基の繰り返し数を示し、例えば、１〜２０の整数である。繰り返し数であるｐが２以上２０以下の場合は、繰り返されるアルキレンオキシ基Ｘの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。ｌ、ｍ及びｎはモノマーユニット数を示す自然数であり、各構成成分の組成割合として表記される場合がある。
【００３２】
一般式（１）で表される高分子化合物は、（メタ）アクリル残基とホスホリルコリン基が炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基Ｘの連鎖を介して結合した構造であることが好ましい。ホスホリルコリン基を有するモノマーの組成割合は（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｌの比率）は、非特異的吸着を低減し、かつ高分子化合物の溶出を抑制する点から、高分子の全モノマーに対して、５〜９８ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％、さらに好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％である。一般式（１）で表される高分子化合物は、中でも、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−Ｎ−［２−［２−［２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシ−アセチルアミノ）エトキシ］エトキシ］エチル］−メタクリルアミド共重合体が好ましい。
【００３３】
［基材の製造方法］
本発明は、その他の態様として、糖鎖が固定化された基材の製造方法であって、本発明の糖鎖量測定方法によって固定化された前記糖鎖量を測定する工程を含む基材の製造方法に関する。本発明の基材の製造方法によれば、固定化された糖鎖の量が精度良く管理された糖鎖固定化基材を提供することができる。
【００３４】
定量は、例えば、マイクロプレートリーダー、及び高速液体クロマトグラフィー等によって行うことができる。
【００３５】
［試薬キットの製造方法］
本発明は、さらにその他の態様として、糖鎖固定化基材を含む試薬キットの製造方法であって、本発明の糖鎖量測定方法によって固定化された前記糖鎖量を測定することを含む製造方法により前記糖鎖固定化基材を製造する工程を含む試薬キットの製造方法に関する。本発明の試薬キットの製造方法によれば、固定化された糖鎖の量が精度良く管理された糖鎖固定化基材を含む試薬キットを提供することができる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例及び比較例に基づいて説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３７】
［実施例１］ プレート上に固定された糖鎖の定量
（糖鎖固定化基材の作製）
糖鎖を固定化させる基材としては、下記のようにして各ウェルの表面を下記高分子化合物でコーティングした９６ウェルプレートを使用した。なお、該９６ウェルプレートは住友ベークライトにおいて環状ポリオレフィン樹脂で成形したものを使用した。
【００３８】
高分子化合物としては２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−Ｎ-［２−［２−［２−（ｔ−ブトキシカルボニル（以下、「Ｂｏｃ」と称す）アミノオキシ−アセチルアミノ）エトキシ］エトキシ］エチル］−メタクリルアミド共重合体を用いた。該高分子化合物の１．０重量％エタノール溶液１５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに分注し、３０分静置した後に溶液を抜き取り乾燥させて基材表面に塗布した。乾燥後、２Ｍ塩酸１００μＬを分注し、３７℃で２時間反応させてＢｏｃ基を脱保護し、高分子化合物でウェル表面がコーティングされた９６ウェルプレートを作製した。
【００３９】
（糖鎖の固定化）
ウェル内を純水で洗浄した後に、ラクトース（Ｓｉｇｍａ、６１３３９−２５Ｇ）、コンドロイチン硫酸Ａ（生化学バイオビジネス、４００６５０）、コンドロイチン硫酸Ｂ（生化学バイオビジネス、４００６６０）、コンドロイチン硫酸Ｃ（生化学バイオビジネス、４００６７０）、コンドロイチン硫酸Ｄ（生化学バイオビジネス、４００６７６）、ヘパラン硫酸（生化学バイオビジネス、４００７００）およびヒアルロン酸（生化学バイオビジネス、４００７２０）を、２％酢酸含有アセトニトリル：水＝３：１の溶液でラクトースは１００μＭ、それ以外は５μｇ／ｍＬにそれぞれ調製し、各ウェルに１００μＬ分注して８０℃で１時間反応させてウェル内に糖鎖を固定化した。反応後ウェル内を純水で洗浄し、１０ｍｇ／ｍＬの無水コハク酸水溶液を１００μＬ分注し、１時間反応させてウェル表面をコーティングした高分子化合物の未反応の官能基を不活性化した。反応後、ウェル内を純水で洗浄した。
【００４０】
（固定化糖鎖の検出）
過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬、１９７−０２４０２）水溶液を１０ｍｇ／ｍＬに調製し、各ウェルに１００μＬ分注して２５℃で３０分反応させて固定化糖鎖を酸化した。ウェル内を純水で洗浄後、６−（ビオチニルアミノ）ヘキサノイルヒドラジン（同仁化学製、製品コード：Ｂ３０２）を３００ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で５０μＭに調製し、各ウェルに１００μＬ分注して３７℃で１２時間反応させて糖鎖をビオチン化した。ウェル内を純水で洗浄後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、１９１３７０）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳバッファーで０．５μｇ／ｍＬに調製し、各ウェルに１００μＬ分注して２５℃で１時間反応させて糖鎖をＨＲＰ標識した。ウェル内を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳバッファーで洗浄後、固相化されたＨＲＰ量を測定するために、ＴＭＢ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１７２−１０６７）で１５分発色し、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製Ｉｎｆｉｎｉｔ２００）で測定波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を下記表１に示す。
【００４１】
［比較例１］ プレート上に固定された糖鎖の定量
糖鎖のビオチン化で６−（ビオチニルアミノ）ヘキサノイルヒドラジン（同仁化学製、製品コード：Ｂ３０２）の代わりにビオチンヒドラジド（ＳＩＧＭＡ、製品コード：Ｂ７６３９）を用いた点を除き、実施例１と同様の実験を行った。その結果を下記表１に示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】
リンカー部としてヘキサノイルアミノ基を１残基有する標識化合物を用いた実施例１によれば、該リンカー部を有さない標識化合物を用いた比較例１と比較して固定化された糖鎖の量を高感度で精度よく測定することができることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は、医療分野、生化学、生物学等の学術分野で有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材上に固定化された糖鎖の糖鎖量を測定する方法であって、
前記糖鎖を酸化してアルデヒド基を形成すること、
前記アルデヒド基に第１級アミノ基含有標識化合物を接触させて結合させること、及び、
前記標識を検出することを含み、
前記第１級アミノ基が、ヒドラジド基、オキシルアミノ基、又はアミノ基であり、
前記第１級アミノ基含有標識化合物が、標識基と、第１級アミノ基と、前記標識基と前記第１級アミノ基とを接続する炭素原子を含むリンカー部とを有する化合物である、糖鎖量測定方法。
【請求項２】
前記第１級アミノ基含有標識化合物の標識基が、ビオチン、酵素、蛍光物質及び紫外線吸収物質からなる群から選択される物質である、請求項１記載の糖鎖量測定方法。
【請求項３】
前記第１級アミノ基含有標識化合物のリンカー部が、ヘキサノイルアミノ基０〜２残基からなる群から選択される基である、請求項１又は２記載の糖鎖量測定方法。
【請求項４】
前記アルデヒド基と前記第１級アミノ基含有標識化合物との結合反応が、２５〜６０℃、１５分〜２４時間である、請求項１から３のいずれかに記載の糖鎖量測定方法。
【請求項５】
前記糖鎖が、単糖、２糖以上の糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、及びそれらの誘導体からなる群から選択される糖鎖である、請求項１から４のいずれかに記載の糖鎖量測定方法。
【請求項６】
前記基材が、プレート、チップ、チューブ、膜、又はビーズである、請求項１から５のいずれかに記載の糖鎖量測定方法。
【請求項７】
前記基材の糖鎖が固定化される表面の材料が、樹脂、ガラス、又はシリコンである、請求項１から６のいずれかに記載の糖鎖量測定方法。
【請求項８】
前記樹脂が、環状ポリオレフィン、スチレン、ＡＢＳ、ＰＴＦＥ、又はＰＥＴである請求項７記載の糖鎖量測定方法。
【請求項９】
糖鎖が固定化された基材の製造方法であって、請求項１から８のいずれかに記載の糖鎖量測定方法によって固定化された前記糖鎖量を測定する工程を含む、基材の製造方法。
【請求項１０】
糖鎖固定化基材を含む試薬キットの製造方法であって、請求項１から８のいずれかに記載の糖鎖量測定方法によって固定化された前記糖鎖量を測定することを含む製造方法により前記糖鎖固定化基材を製造する工程を含む、試薬キットの製造方法。
【請求項１】
基材上に固定化された糖鎖の糖鎖量を測定する方法であって、
前記糖鎖を酸化してアルデヒド基を形成すること、
前記アルデヒド基に第１級アミノ基含有標識化合物を接触させて結合させること、及び、
前記標識を検出することを含み、
前記第１級アミノ基が、ヒドラジド基、オキシルアミノ基、又はアミノ基であり、
前記第１級アミノ基含有標識化合物が、標識基と、第１級アミノ基と、前記標識基と前記第１級アミノ基とを接続する炭素原子を含むリンカー部とを有する化合物である、糖鎖量測定方法。
【請求項２】
前記第１級アミノ基含有標識化合物の標識基が、ビオチン、酵素、蛍光物質及び紫外線吸収物質からなる群から選択される物質である、請求項１記載の糖鎖量測定方法。
【請求項３】
前記第１級アミノ基含有標識化合物のリンカー部が、ヘキサノイルアミノ基０〜２残基からなる群から選択される基である、請求項１又は２記載の糖鎖量測定方法。
【請求項４】
前記アルデヒド基と前記第１級アミノ基含有標識化合物との結合反応が、２５〜６０℃、１５分〜２４時間である、請求項１から３のいずれかに記載の糖鎖量測定方法。
【請求項５】
前記糖鎖が、単糖、２糖以上の糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、及びそれらの誘導体からなる群から選択される糖鎖である、請求項１から４のいずれかに記載の糖鎖量測定方法。
【請求項６】
前記基材が、プレート、チップ、チューブ、膜、又はビーズである、請求項１から５のいずれかに記載の糖鎖量測定方法。
【請求項７】
前記基材の糖鎖が固定化される表面の材料が、樹脂、ガラス、又はシリコンである、請求項１から６のいずれかに記載の糖鎖量測定方法。
【請求項８】
前記樹脂が、環状ポリオレフィン、スチレン、ＡＢＳ、ＰＴＦＥ、又はＰＥＴである請求項７記載の糖鎖量測定方法。
【請求項９】
糖鎖が固定化された基材の製造方法であって、請求項１から８のいずれかに記載の糖鎖量測定方法によって固定化された前記糖鎖量を測定する工程を含む、基材の製造方法。
【請求項１０】
糖鎖固定化基材を含む試薬キットの製造方法であって、請求項１から８のいずれかに記載の糖鎖量測定方法によって固定化された前記糖鎖量を測定することを含む製造方法により前記糖鎖固定化基材を製造する工程を含む、試薬キットの製造方法。
【公開番号】特開２０１３−７６６４８（Ｐ２０１３−７６６４８Ａ）
【公開日】平成２５年４月２５日（２０１３．４．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２１７１２５（Ｐ２０１１−２１７１２５）
【出願日】平成２３年９月３０日（２０１１．９．３０）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年４月２５日（２０１３．４．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月３０日（２０１１．９．３０）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]