細胞培養方法、及び細胞培養システム
【課題】 ガス透過性の培養バッグを用いて、閉鎖系で自動的に細胞を大量培養するにあたり、培養バッグを載置したインキュベータ内を乾燥状態として培養した場合、培養バッグ内に気泡が発生することを防止する。
【解決手段】 細胞及び培養液を封入した、ガス透過性の細胞培養容器をインキュベータ内に載置して細胞培養を行う細胞培養方法であって、細胞培養容器内の空気成分分圧を、インキュベータ内の乾燥空気の気圧と同じか、又はインキュベータ内の乾燥空気の気圧よりも大きくすることで、バッグ内における気泡の発生を防止する。このとき、細胞培養容器を積載台に載置し、前記細胞培養容器を加圧手段により加圧する。
【解決手段】 細胞及び培養液を封入した、ガス透過性の細胞培養容器をインキュベータ内に載置して細胞培養を行う細胞培養方法であって、細胞培養容器内の空気成分分圧を、インキュベータ内の乾燥空気の気圧と同じか、又はインキュベータ内の乾燥空気の気圧よりも大きくすることで、バッグ内における気泡の発生を防止する。このとき、細胞培養容器を積載台に載置し、前記細胞培養容器を加圧手段により加圧する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ガス透過性の細胞培養容器を用いて、閉鎖系で細胞を培養する方法に関し、特に培養細胞の観察を行い易い細胞培養方法、及び細胞培養システムに関する。
【背景技術】
【0002】
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような状況において、ガス透過性の培養バッグを用いて、閉鎖系で自動的に細胞を大量培養することが行われている。
細胞を長期間にわたり培養するにあたっては、一定時間毎に培養バッグ中の細胞を自動的に撮影して、培養細胞の数やその状態を定期的に観察することが求められ、その際に常に安定した画像を得ることが必要不可欠である。
【0003】
このようなガス透過性の培養バッグを用いた培養では、培養バッグはインキュベータ内に載置される。一般にインキュベータは温度や湿度、二酸化炭素ガス濃度などの制御が行われる。このとき、Dish(培養皿)を用いた培養では、培養液水分が蒸発するため、加湿を行うことが必要であるが、培養バッグを用いた培養では、培養液水分は蒸発しないため、必ずしもインキュベータ内を加湿する必要はない。
また、インキュベータ内を加湿すると、カビが発生しやすく不衛生である。このため、培養バッグを用いた培養では、インキュベータ内を乾燥状態として培養を行うことが望ましい。
【0004】
【特許文献1】特許第4451582号
【特許文献2】特開2006−325437号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、このようにインキュベータ内を乾燥状態にすると、バッグ内に気泡が発生するため、細胞を観測できなくなってしまうという問題があった。
すなわち、バッグ内に気泡が発生すると、細胞の観察のために撮影された画像に気泡が写り、細胞の数や状態を正確に観測することができない場合が生じていた。
このような場合、培養バッグが大きければ、気泡を手作業により観測位置から移動させて、撮影することも考えられる。ところが、特に培養の開始時においては、培養効率の観点からサイズの小さい培養バッグが使用されることが多い。このため、このようなサイズの小さい培養バッグを使用するときには、バッグ全体に生じた気泡を観測位置から移動させることはできず、細胞の撮影が適切に行えなくなるという問題があった。また、手作業により気泡をよける方法では、撮影の自動化ができないという問題があった。
【0006】
そこで、本発明者らは鋭意研究した結果、培養バッグ内の空気成分分圧又はインキュベータ内の気圧を調整することで、乾燥状態において、培養バッグ内に気泡を発生させることなく細胞培養が行えることを見いだした。
すなわち、培養バッグを加圧して培養バッグ内における空気成分分圧をインキュベータ内の乾燥空気気圧以上にすることで、又は、インキュベータ内を減圧してインキュベータ内の気圧を培養バッグ内の空気成分分圧以下にすることで、培養バッグ内における気泡の発生を防止することに成功し、本発明を完成させた。
【0007】
ここで、細胞培養において加圧を行うことが記載されている文献として、特許文献1を挙げることができる。この特許文献1に記載の細胞・組織培養装置は、細胞や組織の分化及び成長を促進させるために、細胞増殖や成長に必要な物理的刺激を付与するため、チャンバに収容された被培養物を加圧板により圧縮することが記載されている。
しかしながら、当該装置はチャンバ内において細胞が植えられた被培養物としてのマトリクスを加圧するものであり、培養バッグを加圧するものではなく、培養バッグにおける気泡の発生を防止できるものではなかった。
【0008】
また、特許文献2には、細胞と培養液が充填された袋状容器を、トレイ本体と押さえ板との間に挟んで圧迫し、本来柔軟な容器壁にテンションを生じさせることによって、容易には変形しないようにした培養用トレイが開示されている。この培養用トレイによれば、通常の取り扱いでは容器内の培養液に不用な流れが生じないため、形成された細胞のクラスターが壊れず、細胞の成長や増殖等が阻害されることを防止できるとされている。しかしながら、この培養用トレイは、袋状容器内における空気分圧を制御可能なものではなく、気泡の発生を防止できるものではなかった。
【0009】
これに対し、本発明によれば、上記の通り培養バッグ内における気泡の発生を防止することができるため、培養バッグ中の細胞の数やその状態を正確に観測することができ、長期間の連続観測を安定的に行うことが可能となる。
すなわち、本発明は、培養バッグ内の空気成分分圧又はインキュベータ内の気圧を調整することで、乾燥状態において、培養バッグ内に気泡を発生させることなく細胞培養を行うことを可能とする細胞培養方法、及び細胞培養システムの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
上記目的を達成するため、本発明の細胞培養方法は、細胞及び培養液を封入した、ガス透過性の細胞培養容器をインキュベータ内に載置して細胞培養を行う細胞培養方法であって、細胞培養容器の空気成分分圧を、インキュベータ内の乾燥空気気圧と同じか、又はインキュベータ内の乾燥空気気圧よりも大きくすることで、バッグ内における気泡の発生を防止する方法としてある。
【0011】
また、本発明の細胞培養システムは、細胞及び培養液を封入した、ガス透過性の細胞培養容器と、細胞培養容器を積載する積載台と、細胞培養容器を積載した積載台を内部に載置して培養環境を制御するインキュベータと、細胞培養容器の空気成分分圧を、インキュベータ内の乾燥空気気圧と同じか、又はインキュベータ内の乾燥空気気圧よりも大きくする圧力調整手段とを備える構成としてある。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、ガス透過性バッグを用いた閉鎖系培養を乾燥状態で行う場合に、バッグ内部に気泡が発生する現象を防ぐことができるため、培養細胞に対する長期間の連続観測を安定的に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】本発明の細胞培養システムの概要を示す図である。
【図2】本発明の細胞培養方法及び細胞培養システムにおけるインキュベータ内を乾燥状態にした場合の細胞培養容器の内外の圧力の関係を示す図である。
【図3】本発明の細胞培養方法及び細胞培養システムにおけるインキュベータ内を加湿状態にした場合の細胞培養容器の内外の圧力の関係を示す図である。
【図4】本発明の細胞培養方法及び細胞培養システムにおけるインキュベータ内を乾燥状態にし、かつ細胞培養容器を加圧した場合の細胞培養容器の内外の圧力の関係を示す図である。
【図5】本発明の細胞培養方法及び細胞培養システムにおけるインキュベータ内を乾燥状態にし、かつインキュベータ内を減圧した場合の細胞培養容器の内外の圧力の関係を示す図である。
【図6】本発明の第一実施形態の細胞培養システムの構成を示す図である。
【図7】本発明の第二実施形態の細胞培養システムの構成を示す図である。
【図8】本発明の実施例1及び比較例1の結果を示す図である。
【図9】本発明の実施例2,3の細胞培養システムを示す図である。
【図10】本発明の実施例2及び比較例2の結果(観察写真画像)を示す図である。
【図11】本発明の実施例2及び比較例2の結果(外観写真画像)を示す図である。
【図12】本発明の実施例3及び比較例3の結果(観察写真画像)を示す図である。
【図13】本発明の実施例3及び比較例3の結果(外観写真画像)を示す図である。
【図14】従来の細胞培養システムによる培養の様子を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明の実施形態について具体的に説明する。
まず、本発明の細胞培養方法及び細胞培養システムにおける気泡発生防止技術の原理について、図1−5,14を参照して説明する。図1は、本発明の細胞培養システムの概要を示す図である。図2〜図5は、それぞれ本発明の細胞培養方法及び細胞培養システムにおけるインキュベータ内を乾燥状態にした場合、加湿状態にした場合、乾燥状態にしかつ細胞培養容器を加圧した場合、及び乾燥状態にしかつインキュベータ内を減圧した場合の細胞培養容器の内外の圧力の関係を示す図である。なお、説明を簡単にするため、水蒸気(または培地水分)の割合を大きく表現している。また、図14は、従来の細胞培養システムによる培養の様子を示す図である。
【0015】
本発明の細胞培養システムは、図1に示すように、細胞及び培養液11が充填された細胞培養容器10と、これを積載した積載台20を含む細胞培養装置と、この細胞培養装置が載置されているインキュベータ40を有している。細胞培養装置には圧力調整装置12が備えられている。なお、細胞培養装置には、その他に細胞観測用の照明や攪拌部材など各種装置が備えられる場合があるが、同図では省略している。
さらに、本発明の細胞培養システムは、積載台20に設けられた観測孔21を介して細胞培養容器10内の細胞を撮影するための顕微鏡30を有している。
【0016】
このような細胞培養システムによれば、細胞培養容器10を圧力調整装置12により加圧して、細胞培養容器10内の空気成分分圧を、インキュベータ40内の乾燥空気気圧と同じか、インキュベータ内の乾燥空気気圧よりも大きくすることができる。このため、細胞培養容器10内に気泡が発生することを防止することが可能となっている。
なお、本発明では、細胞培養容器10の空気成分分圧の調整、及び/又は、インキュベータ40内の気圧の調整を行うが、その調整を行う圧力調整手段12としては種々のものを用いることができ、細胞培養容器10に圧力を加えるための加圧板などの各種加圧手段や、インキュベータ40内を減圧するための各種減圧装置などを使用することが可能である。また、細胞培養容器10に培養液を供給するための培養液供給装置を加圧手段として用いることもできる。すなわち、培養液供給装置から供給ポンプを介して培養液を細胞培養容器10にその許容量いっぱいまで送り込むことで、細胞培養容器10を加圧することも可能である。
【0017】
一方、従来の細胞培養方法では、図14に示すように、インキュベータ400内に細胞培養容器100を積載した積載台200を含む細胞培養装置が載置され、細胞培養容器100には細胞及び培養液110が充填されている。そして、顕微鏡300により、積載台200に設けられた観測孔210を介して、細胞培養容器100内の細胞の撮影が行われる構成となっている。
このような従来の細胞培養方法では、インキュベータ400内が乾燥状態である場合には、細胞培養容器100内の空気成分分圧が、インキュベータ400内の乾燥空気気圧よりも小さい状態となる。このため、細胞培養容器100内の空気成分分圧とインキュベータ400内の気圧が同じになるように、バッグ外からバッグ内にガス(空気成分)が移動し、細胞培養容器10内に気泡130が発生する。このため、顕微鏡300により観測孔210を介して細胞培養容器100の細胞を撮影すると、画像に気泡130が写り込むため、細胞の数のカウントや細胞の状態の観察を適切に行うことができなかった。
【0018】
次に、インキュベータ40内が乾燥状態の場合と、加湿状態の場合におけるそれぞれの細胞培養容器10の内外の圧力の関係について説明する。
まず、図2は、乾燥状態のインキュベータ40内における細胞培養容器10の空気成分分圧と、インキュベータ40内の乾燥空気の気圧の関係を示している。
同図に示すように、インキュベータ40内が乾燥状態の場合、細胞培養容器10の内圧は、空気成分の分圧と水蒸気(培養液の水分を含む)の分圧により構成され、これがインキュベータ40内の乾燥空気の気圧と同じになっている。すなわち、これらの分圧を合計した細胞培養容器10の内圧が、インキュベータ40内の乾燥空気気圧と同じになっている。なお、ここでいう「空気成分」は、酸素、窒素、二酸化炭素など乾燥空気成分からなり、「水蒸気」は、水蒸気及び/又は培養液からなっている。また、細胞培養容器10内における培養液の分圧を、飽和水蒸気圧とみなすことができる。
その結果、細胞培養容器10内の空気成分分圧が、インキュベータ40内の乾燥空気の分圧よりも小さくなるため、バッグの外側からバッグの内側への空気の移動が生じ、バッグ内に気泡が発生する。
【0019】
一方、図3は、加湿状態のインキュベータ40内における細胞培養容器10の空気成分分圧と、インキュベータ40内の乾燥空気の気圧の関係を示している。
このように、インキュベータ40内を湿度100%RH(相対湿度)の加湿状態にすると、すなわち、インキュベータ40内の湿度を飽和状態にすると、細胞培養容器10内の空気成分分圧は、インキュベータ40内の乾燥空気の分圧と同じになる。このため、バッグの外側からバッグの内側への空気の移動は生じず、バッグ内に気泡は発生しない。なお、このようにインキュベータ40内を加湿状態にすれば、バッグ内に気泡は発生しないが、上述したように、カビが発生しやすく不衛生という問題がある。
【0020】
次に、図4は、乾燥状態のインキュベータ40内において、細胞培養容器10を加圧した場合の細胞培養容器10の空気成分分圧と、インキュベータ40内の乾燥空気の気圧の関係を示している。
このように、細胞培養容器10を加圧して、細胞培養容器10の空気成分分圧を、インキュベータ40内の乾燥空気の気圧以上にすれば、バッグの外側からバッグの内側への空気の移動が生じることはなく、バッグ内に気泡は発生しない。
【0021】
次に、図5は、乾燥状態のインキュベータ40内を減圧した場合の細胞培養容器10の空気成分分圧と、インキュベータ40内の乾燥空気の気圧の関係を示している。
このように、インキュベータ40内の乾燥空気の気圧を、細胞培養容器10の空気成分分圧以下にすれば、バッグの外側からバッグの内側への空気の移動が生じることはなく、バッグ内に気泡は発生しない。
【0022】
なお、図4及び図5を参照して説明した圧力調整では、細胞培養容器10の空気成分分圧を相対的にインキュベータ40内の乾燥空気の気圧以上にすることで、バッグ内に気泡が発生することを防止しているが、細胞培養容器10の空気成分分圧がインキュベータ40内の気圧未満の場合であっても、細胞培養容器10の空気成分分圧がインキュベータ40内の気圧に近くなるように圧力調整を行うことで、バッグ内に発生する気泡を低減させることが可能となる。
【0023】
[第一実施形態]
次に、本発明の第一実施形態の細胞培養方法及び細胞培養システムについて、図6を参照して説明する。同図は、本実施形態の細胞培養システムの構成を示す図である。
本実施形態の細胞培養システムは、同図に示すように、細胞及び培養液11を封入した、ガス透過性の細胞培養容器10と、細胞培養容器10を積載する積載台20と、細胞培養容器10を積載した積載台20を内部に載置して温度や湿度などの培養環境を制御するインキュベータ40を有している。また、細胞培養容器10を加圧するための加圧板13を備えた圧力調整装置12(圧力調整手段)と、細胞培養容器10内の細胞の数やその状態を撮影するための顕微鏡30を有している。
【0024】
細胞培養容器10は、軟包材を材料として、袋状(バック型)に形成した容器である。このように、細胞培養容器10の材料として軟包材を用いることで、細胞培養容器10に可撓性・柔軟性を付与することができる。軟包材としては、例えば、特開2009−247225号公報(培養容器)や、特開2006−262876号公報(培養バッグ、培地保存方法および細胞培養方法)に記載されているものなどを用いることができる。
【0025】
また、細胞培養容器10は、細胞培養に必要なガス透過性を有しており、内容物を確認できるように、一部又は全部が透明性を有している。このような条件を満たす培養容器の材料としては、例えばポリオレフィン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、スチレン系エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、シリコーンゴム等を挙げることができる。
【0026】
細胞培養容器10には、培養する細胞及び培養液11が充填されている。
培養液としては、培養細胞の増殖に適したものを適宜使用することができ、特に限定されるものではないが、本実施形態の細胞培養方法及び細胞培養システムは気泡の発生を防止するものであるため、液体培地やジェル培地等を対象としている。
また、培養細胞としては、ヒト、その他の動物、植物、微生物などにおける各種細胞を用いることができ、例えばヒトの白血病Tリンパ腫における細胞や正常末梢血単核球、ヒト胎児腎臓由来細胞株、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、胚性幹細胞(ES細胞)、造血幹細胞、神経幹細胞等を用いることができる。
【0027】
加圧板13は、細胞培養容器10に圧力を加えて内部の空気成分分圧を増加できる加圧手段であれば特に限定されないが、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、PET(ポリエチレンテレフタレート)、環状ポリオレフィン(COP)、ABS、アクリル、ステンレス、アルミ、ガラス、及びMCナイロンやポリカーボネートなどのエンジニアリングプラスチック等を材料とするものを用いることができる。
加圧板13のサイズは、細胞培養容器10内の空気成分分圧を十分に調整できるものであれば良く、特に限定されない。
【0028】
また、加圧板13の形状は、単なる板状のものではなく、パンチングメタル状ものや、剛性のある網状の板(規則的に穴が設けられたもの)などを用いることもできる。さらに、棒状の加圧手段を用いて、細胞培養容器10を加圧することもできる。また、このような棒状の加圧手段を多数用いて細胞培養容器10の上面全体を同時に加圧することも可能である。
細胞培養容器10に圧力を加えるための手段としては、これらに限定されるものではなく、例えば細胞培養容器10の端部を巻き込んだり、端部からローラを移動させて細胞培養容器10の実質容量を減少させることで加圧するものなど、細胞培養容器10内の空気成分分圧を十分に調整できるものであれば良い。
【0029】
なお、本実施形態では、細胞培養容器10を加圧するため、細胞培養容器10内の細胞にも圧力が加わることになる。培養細胞は一般に圧力に強いものが多く、細胞培養容器10内の空気成分分圧がインキュベータ40内の気圧と同程度かやや大きくなるように加圧しても、通常問題なく増殖する。また、例えば軟骨細胞などでは、所定の圧力を加えることで増殖効率が向上することが知られている。
【0030】
圧力調整装置12は、積載台20に対する加圧板13の位置を調整して、細胞培養容器10内の空気成分分圧を調整する装置である。すなわち、加圧板13を積載台20に向けて移動させることで、積載台20上の細胞培養容器10を押圧することができ、その押圧した位置で加圧板13を固定させることができる。
圧力調整装置12は、このような動作を行えるものであれば、特に限定されないが、図6に示す圧力調整装置12は、加圧版13を両端又は四隅に固定するとともに、積載台20に上方に向かって立設された支持柱20aに上下動可能に取り付けられており、ネジ13aにより加圧板13の上下方向の位置を固定できる構成となっている。
【0031】
積載台20は、その上面に細胞培養容器10が載置される平面の台である。積載台20には、例えば細胞培養容器10の両端を積載台20に固定するための固定具など、細胞培養容器10を定置させるための各種構成を設けることができる。
また、積載台20は、観測孔21を備えている。この観測孔21を介して、顕微鏡30により積載台20に積載された細胞培養容器10内の細胞を観測することができるようになっている。
【0032】
顕微鏡30は、カメラ機能を備えた顕微鏡であり、一定時間毎に観測孔21を介して細胞培養容器10内の細胞を自動的に撮影する。また、図示しないが、撮影された画像データは、情報処理装置に入力され、この画像データにおける細胞数がカウントされる。このような顕微鏡30と、自動撮影方法及び細胞数のカウント方法は、現在一般的に使用されているものを用いることができる。なお、カメラ機能は顕微鏡30と別個に設けても良い。
インキュベータ40は、細胞培養環境を制御するための装置である。恒温槽、恒温恒湿槽などをインキュベータ40として使用することができる。また、酸素濃度及び二酸化炭素濃度等のガスを、所定の条件に調整できるものを用いることもできる。
【0033】
本実施形態の細胞培養方法及び細胞培養システムを用いるタイミングは、特に限定されないが、細胞培養の開始時の期間や、誘導因子により細胞を刺激して細胞増殖を行う場合、細胞分化を行う場合などに、好適に使用することが可能である。
細胞培養の開始時の期間においては、一般に小さい培養バッグや大きな培養バッグの一部など、所定の容積以下の小さい細胞培養容器10が使用される。これは、細胞が効率的に増殖するためには、一定以上の細胞密度が必要であり、最初から大きい容積の培養バッグを使用すると増殖効率が低くなるためである。
【0034】
このような細胞培養の開始時の期間とは、培養細胞数が、およそ1倍〜10倍になるまでを意味し、一般には培養の開始後、1日から5日までの期間を意味する。
細胞培養の開始時において用いられる培養バッグのサイズとしては、水平面積が3,000〜25,000mm2のものを好適に使用することができる。また、このような培養バッグにおいて、培養液の量としては、6〜50mlが好適に使用される。このような培養バッグを細胞培養の開始時の期間に使用することで、培養初期段階に高い増殖効率を得ることが可能である。
【0035】
誘導因子により細胞を刺激して細胞増殖を行う場合とは、例えばT細胞を抗CD3抗体で刺激して増殖を誘導する場合などを挙げることができる。
また、細胞分化を行う場合とは、例えばES細胞などの幹細胞を心筋細胞や神経細胞などに分化させる場合や、単球を樹状細胞に分化させる場合などを挙げることができる。
【0036】
このような細胞増殖のための誘導刺激を行う場合や、細胞を分化させる場合においては、約10,000mm2程度の小容量の細胞培養容器10を用いて培養を行うことが多い。また、このとき、同一細胞の変化を経時的に観察するために撹拌等を行わないことが多い。
このような培養を行う場合にあたっては、特にその培養過程を観察して、誘導や分化が適切に行われているかを確認する必要があり、観測の障害になる気泡の発生を防止することは重要である。
【0037】
本実施形態の細胞培養方法は、このような細胞培養システムを用いて、以下のような工程を有するものとすることができる。
まず、培養バッグに細胞及び培養液11を充填して、積載台20に積載する。そして、培養バッグ上に加圧板13を載せ、圧力調整装置12を使用して、培養バッグ内の空気成分分圧がインキュベータ40内の乾燥空気の気圧と同じか、又はインキュベータ40内の乾燥空気の気圧よりも大きくなる位置まで、加圧板13を下方に移動させて固定する。
そして、これらをインキュベータに載置し、乾燥状態で細胞培養を開始する。乾燥状態とは、非加湿状態であれば良く、特に限定されないが、具体的には例えば湿度が80%RH未満の状態を意味する。以下の実施形態においても同様である。
【0038】
なお、本実施形態の細胞培養方法及び細胞培養システムにおける気泡発生防止技術の原理上、インキュベータ40内の湿度が飽和状態でなければ(100%RH未満であれば)、細胞培養容器10の加圧などの圧力調整を行うことは、気泡発生防止の観点から有効である。さらに、カビ発生を防ぐという目的のためには、80%RH未満であることが望ましい。一般的には、梅雨の時(例えば25℃,100%RH)であっても、インキュベータ内(37℃)の湿度は50%RH程度にしかならないため、本実施形態の細胞培養方法及び細胞培養システムは、加湿を行わない状態で、細胞培養容器10における気泡を好適に防止できる点で有効である。
【0039】
次に、積載台20の観測孔21の下に顕微鏡30を配置し、一定時間毎に培養バッグ内の細胞を自動撮影する。なお、図示していないが、顕微鏡30を情報処理装置に接続して、撮影した画像データを情報処理装置へ送信させ、情報処理装置において画像データにおける細胞数を自動的にカウントすることが可能となっている。
【0040】
なお、数時間後に、もし気泡が発生している場合には、加圧板13を下方に移動させて加圧をさらに強くすることで、発生した気泡を消すことも可能である。
そして、このような条件下で細胞を培養し、一定時間毎に、細胞を撮影した画像データと、培養された細胞数を得ることができる。
【0041】
本実施形態の細胞培養方法をこのようにすることで、インキュベータ40内を乾燥させた状態でも、細胞培養容器10に気泡を発生させることなく、細胞培養を行うことができる。
このため、顕微鏡30により自動的に撮影された画像に気泡が映り込むことがなく、画像における細胞数を適切にカウントすることができ、また細胞の状態も適切に確認することが可能となる。
【0042】
[第二実施形態]
次に、本発明の第二実施形態の細胞培養方法及び細胞培養システムについて、図7を参照して説明する。同図は、本実施形態の細胞培養システムの構成を示す図である。
本実施形態の細胞培養システムは、圧力調整装置12として、減圧装置50を備え、これによりインキュベータ40内を減圧して、細胞培養容器10内の空気成分分圧を、インキュベータ40内の乾燥空気の気圧以上にすることができる点で第一実施形態と相違する。その他の点は、第一実施形態と同様である。
【0043】
減圧装置50は、インキュベータ40内の空気の減圧を行えるものであれば特に限定されるものではなく、一般的なものを使用することができる。
本実施形態の細胞培養方法では、培養バッグを積載した積載台20をインキュベータ40に載置して、インキュベータ40を減圧装置50により減圧し、インキュベータ40内の乾燥空気の気圧を細胞培養容器10内の空気成分分圧と同じか、細胞培養容器10内の空気成分分圧よりも小さくする。また、積載台20の観測孔21の下に顕微鏡30を配置する。一定時間毎に培養バッグ内の細胞を自動撮影し、細胞数の自動カウントを行うことができる点も第一実施形態と同様である。そして、乾燥状態で細胞培養を開始する。
【0044】
数時間後、培養バッグ内に気泡が発生していないかを確認し、発生している場合には減圧装置50によりインキュベータ40内の気圧をさらに減圧して、培養バッグ内に気泡が発生しなくなるように調整する。
そして、このような条件下で細胞を培養し、一定時間毎に、細胞を撮影した画像データと、培養された細胞数を得ることができる。
【0045】
このような本実施形態の細胞培養方法及び細胞培養システムによれば、細胞培養容器10を加圧することなく、減圧装置50によりインキュベータ40内の気圧を調整することで、細胞培養容器10に気泡が発生することを防止することができる。
このため、例えば細胞に圧力を加えることなく増殖を行いたい場合や、培養バッグが柔軟な素材からなるものではない場合など、加圧に適さないものである場合においても好適に用いることが可能である。
【実施例】
【0046】
以下、本発明の細胞培養方法及び細胞培養システムにより、細胞培養容器を加圧して細胞培養を行った実施例及び加圧することなく細胞培養を行った比較例について説明する。
【0047】
(実施例1)
細胞培養容器10として、LLDPE(直鎖状低密度ポリエチレン)製、サイズが80mm×40mm、フィルム厚0.15mmのバッグを使用した。
この細胞培養容器10に、培養液として細胞科学研究所のAlyS505N−0培地のみを充填した。培養液の量は7ml、細胞培養容器10の厚みは2.5mmであった。
そして、細胞培養容器10をインキュベータ40内に載置して、加圧板13を用いて加圧した。このとき、加圧板13により、細胞培養容器10の厚みが2.3mmになるように加圧し、この加圧板13を固定して、インキュベータ40内を37℃、CO2濃度5%、湿度30〜40%RHの乾燥状態とした。本実施例の細胞培養容器10では、このような加圧板13を用いた加圧によって、細胞培養容器10内の空気成分分圧が、インキュベータ40内の乾燥空気の気圧よりも大きくなっている。
【0048】
なお、本実施例では、加圧板13は、細胞培養容器10の上面全体を覆うものを使用した。
このようにして、細胞培養容器10をインキュベータ40内に3日間静置させた結果、図8の(加圧あり)に示すように、細胞培養容器10において気泡が発生することなく保持することができた。
【0049】
(比較例1)
実施例1と同様の細胞培養容器10、及び培養液を使用して、加圧板13による加圧を行うことなく細胞培養容器10をインキュベータ40に載置し、実施例1と同様に、37℃、CO2濃度5%、湿度30〜40%RHの乾燥状態で、3日間静置させた。
この結果、図8の(加圧なし)に示すように、細胞培養容器10の全面に気泡が発生して、培養容器内を観察できない状態になっていた。
【0050】
(実施例2)
細胞培養容器10として、LLDPE(直鎖状低密度ポリエチレン)製、サイズが40mm×80mm、フィルム厚0.15mmのバッグを使用した。
この細胞培養容器10に、培養液として細胞科学研究所のAlyS505N−0培地と、培養細胞としてヒト白血病Tリンパ種のJurkatE6.1株を充填した。細胞と培養液の量は7ml、細胞培養容器10の厚みは2.5mmであった。
そして、これをインキュベータ40に載置し、加圧板13を用いて細胞培養容器10の厚みが2.3mmになるよう加圧し、加圧板13を固定して、37℃、CO2濃度5%、湿度30〜40%RHの乾燥状態で、48時間細胞培養を行った。本実施例では、加圧板13は、細胞培養容器10の水平面積と同じ面積を備えたものを使用した。このときの細胞培養容器10の空気成分分圧は、インキュベータ40内の乾燥空気の気圧以上となっている。
【0051】
図9に本実施例で用いた細胞培養システムを示す。この細胞培養システムは、細胞培養容器10を、観察孔21を備えた積載台20上に積載するとともに、細胞培養容器10を加圧板13で押圧する構成となっている。加圧板13は、その四隅において、ネジ13aとスペーサー13bにより加圧した位置で固定されている。また、加圧板13の長尺方向の両端の下にもスペーサー13bが配置され、細胞培養容器10に対する加圧板13の位置を適切に調整できるようになっている。
図10の(加圧あり)は、本実施例の培養開始から48時間後の培養細胞を顕微鏡30により撮影した画像(観察写真画像)を示している。また、図11の(加圧あり)は、本実施例の培養開始から48時間後の細胞培養容器10の外観写真画像を示している。
これらの図から、本実施例では、細胞培養容器10において気泡は発生せず、培養された細胞を明瞭に観察できることがわかる。
【0052】
(比較例2)
実施例2と同様の細胞培養容器10、細胞及び培養液11を用いて、加圧板13による加圧を行うことなく、インキュベータ40に載置し、その他の点は実施例2と同一条件で細胞培養を行った。
図10の(加圧なし)は、本比較例の培養開始から48時間後の培養細胞を顕微鏡30により撮影した画像(観察写真画像)を示している。また、図11の(加圧なし)は、本比較例の培養開始から48時間後の細胞培養容器10の外観写真画像を示している。
これらの図から明らかなように、本比較例では、細胞培養容器10内に気泡が生じている。このため、培養細胞数を適切にカウントすることができず、また細胞の状態も観察しにくい状態となっている。
【0053】
(実施例3)
細胞培養容器10として、LLDPE(直鎖状低密度ポリエチレン)製、サイズが40mm×80mm、フィルム厚0.15mmのバッグを使用した。
この細胞培養容器10に、培養液として細胞科学研究所のAlyS505N−7培地と、培養細胞としてhPBMC(ヒト末梢血単核球)を充填した。細胞と培養液の量は7ml、細胞培養容器10の厚みは2.5mmであった。本実施例は、培養容器内に固相化した抗CD3抗体を用いてT細胞を刺激し、その増殖誘導過程を観察したものであり、培養時間は、72時間である。本実施例は、図9の細胞培養システムを用いて行った。
図12の(加圧あり)は、本実施例の培養開始から72時間後の培養細胞を顕微鏡30により撮影した画像(観察写真画像)を示している。また、図13の(加圧あり)は、本実施例の培養開始から72時間後の細胞培養容器10の外観写真画像を示している。
【0054】
これらの図から、本実施例では、細胞培養容器10において気泡は発生しておらず、培養された細胞を明瞭に観察することができることがわかる。また、図12の(加圧あり)の画像には、増殖を開始した凝集塊がはっきりと写し出されている。
このように本発明の細胞培養方法及び細胞培養システムによれば、細胞増殖のために誘導刺激を行う場合や、細胞を分化させる場合において、その培養過程を適切に観察し得ることが明らかとなった。
【0055】
(比較例3)
実施例3と同様の細胞培養容器10、細胞及び培養液11を用いて、加圧板13による加圧を行うことなく、インキュベータ40に載置し、その他の点は実施例3と同一条件で細胞培養を行った。
図12の(加圧なし)は、本比較例の培養開始から72時間後の培養細胞を顕微鏡30により撮影した画像(観察写真画像)を示している。また、図13の(加圧なし)は、本比較例の培養開始から72時間後の細胞培養容器10の外観写真画像を示している。
これらの図から明らかなように、本比較例では、細胞培養容器10内に気泡が生じており、培養細胞数を適切にカウントすることができず、また細胞の状態はほとんど観察できない状態となっている。
【0056】
」
以上の実施例及び比較例から明らかなように、ガス透過性の培養バッグを用いて、閉鎖系で自動的に細胞を大量培養するにあたり、インキュベータ内を乾燥状態とする場合でも、培養バッグ内の空気成分分圧を、インキュベータ内の乾燥空気の気圧以上にすることで、培養バッグ内に気泡を発生させることなく、培養バッグ中の細胞の数やその状態を正確に観測することができ、長期間の連続観察を安定的に行えることがわかる。
【0057】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、第一実施形態と第二実施形態を組み合わせて、圧力調整装置として加圧板及び減圧装置の両方を備え、インキュベータ内において細胞培養容器を加圧し、かつ、インキュベータ内を減圧することで、細胞培養容器内における気泡の発生を防止することも可能である。
また、上記実施形態及び実施例では、細胞を培養する場合について説明しているが、例えば微生物などその他の有機体、又は無機物などの観測が必要となる場合において、培養バッグ内に気泡が発生することを防止するなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【0058】
本発明は、細胞培養容器を用いて、細胞を大量培養する場合に好適に利用することが可能である。
【符号の説明】
【0059】
10 細胞培養容器
11 細胞及び培養液
12 圧力調整装置
13 加圧板
13a ねじ
13b スペーサー
20 積載台
20a 支持柱
21 観測孔
30 顕微鏡
40 インキュベータ
50 減圧装置
【技術分野】
【0001】
本発明は、ガス透過性の細胞培養容器を用いて、閉鎖系で細胞を培養する方法に関し、特に培養細胞の観察を行い易い細胞培養方法、及び細胞培養システムに関する。
【背景技術】
【0002】
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような状況において、ガス透過性の培養バッグを用いて、閉鎖系で自動的に細胞を大量培養することが行われている。
細胞を長期間にわたり培養するにあたっては、一定時間毎に培養バッグ中の細胞を自動的に撮影して、培養細胞の数やその状態を定期的に観察することが求められ、その際に常に安定した画像を得ることが必要不可欠である。
【0003】
このようなガス透過性の培養バッグを用いた培養では、培養バッグはインキュベータ内に載置される。一般にインキュベータは温度や湿度、二酸化炭素ガス濃度などの制御が行われる。このとき、Dish(培養皿)を用いた培養では、培養液水分が蒸発するため、加湿を行うことが必要であるが、培養バッグを用いた培養では、培養液水分は蒸発しないため、必ずしもインキュベータ内を加湿する必要はない。
また、インキュベータ内を加湿すると、カビが発生しやすく不衛生である。このため、培養バッグを用いた培養では、インキュベータ内を乾燥状態として培養を行うことが望ましい。
【0004】
【特許文献1】特許第4451582号
【特許文献2】特開2006−325437号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、このようにインキュベータ内を乾燥状態にすると、バッグ内に気泡が発生するため、細胞を観測できなくなってしまうという問題があった。
すなわち、バッグ内に気泡が発生すると、細胞の観察のために撮影された画像に気泡が写り、細胞の数や状態を正確に観測することができない場合が生じていた。
このような場合、培養バッグが大きければ、気泡を手作業により観測位置から移動させて、撮影することも考えられる。ところが、特に培養の開始時においては、培養効率の観点からサイズの小さい培養バッグが使用されることが多い。このため、このようなサイズの小さい培養バッグを使用するときには、バッグ全体に生じた気泡を観測位置から移動させることはできず、細胞の撮影が適切に行えなくなるという問題があった。また、手作業により気泡をよける方法では、撮影の自動化ができないという問題があった。
【0006】
そこで、本発明者らは鋭意研究した結果、培養バッグ内の空気成分分圧又はインキュベータ内の気圧を調整することで、乾燥状態において、培養バッグ内に気泡を発生させることなく細胞培養が行えることを見いだした。
すなわち、培養バッグを加圧して培養バッグ内における空気成分分圧をインキュベータ内の乾燥空気気圧以上にすることで、又は、インキュベータ内を減圧してインキュベータ内の気圧を培養バッグ内の空気成分分圧以下にすることで、培養バッグ内における気泡の発生を防止することに成功し、本発明を完成させた。
【0007】
ここで、細胞培養において加圧を行うことが記載されている文献として、特許文献1を挙げることができる。この特許文献1に記載の細胞・組織培養装置は、細胞や組織の分化及び成長を促進させるために、細胞増殖や成長に必要な物理的刺激を付与するため、チャンバに収容された被培養物を加圧板により圧縮することが記載されている。
しかしながら、当該装置はチャンバ内において細胞が植えられた被培養物としてのマトリクスを加圧するものであり、培養バッグを加圧するものではなく、培養バッグにおける気泡の発生を防止できるものではなかった。
【0008】
また、特許文献2には、細胞と培養液が充填された袋状容器を、トレイ本体と押さえ板との間に挟んで圧迫し、本来柔軟な容器壁にテンションを生じさせることによって、容易には変形しないようにした培養用トレイが開示されている。この培養用トレイによれば、通常の取り扱いでは容器内の培養液に不用な流れが生じないため、形成された細胞のクラスターが壊れず、細胞の成長や増殖等が阻害されることを防止できるとされている。しかしながら、この培養用トレイは、袋状容器内における空気分圧を制御可能なものではなく、気泡の発生を防止できるものではなかった。
【0009】
これに対し、本発明によれば、上記の通り培養バッグ内における気泡の発生を防止することができるため、培養バッグ中の細胞の数やその状態を正確に観測することができ、長期間の連続観測を安定的に行うことが可能となる。
すなわち、本発明は、培養バッグ内の空気成分分圧又はインキュベータ内の気圧を調整することで、乾燥状態において、培養バッグ内に気泡を発生させることなく細胞培養を行うことを可能とする細胞培養方法、及び細胞培養システムの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
上記目的を達成するため、本発明の細胞培養方法は、細胞及び培養液を封入した、ガス透過性の細胞培養容器をインキュベータ内に載置して細胞培養を行う細胞培養方法であって、細胞培養容器の空気成分分圧を、インキュベータ内の乾燥空気気圧と同じか、又はインキュベータ内の乾燥空気気圧よりも大きくすることで、バッグ内における気泡の発生を防止する方法としてある。
【0011】
また、本発明の細胞培養システムは、細胞及び培養液を封入した、ガス透過性の細胞培養容器と、細胞培養容器を積載する積載台と、細胞培養容器を積載した積載台を内部に載置して培養環境を制御するインキュベータと、細胞培養容器の空気成分分圧を、インキュベータ内の乾燥空気気圧と同じか、又はインキュベータ内の乾燥空気気圧よりも大きくする圧力調整手段とを備える構成としてある。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、ガス透過性バッグを用いた閉鎖系培養を乾燥状態で行う場合に、バッグ内部に気泡が発生する現象を防ぐことができるため、培養細胞に対する長期間の連続観測を安定的に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】本発明の細胞培養システムの概要を示す図である。
【図2】本発明の細胞培養方法及び細胞培養システムにおけるインキュベータ内を乾燥状態にした場合の細胞培養容器の内外の圧力の関係を示す図である。
【図3】本発明の細胞培養方法及び細胞培養システムにおけるインキュベータ内を加湿状態にした場合の細胞培養容器の内外の圧力の関係を示す図である。
【図4】本発明の細胞培養方法及び細胞培養システムにおけるインキュベータ内を乾燥状態にし、かつ細胞培養容器を加圧した場合の細胞培養容器の内外の圧力の関係を示す図である。
【図5】本発明の細胞培養方法及び細胞培養システムにおけるインキュベータ内を乾燥状態にし、かつインキュベータ内を減圧した場合の細胞培養容器の内外の圧力の関係を示す図である。
【図6】本発明の第一実施形態の細胞培養システムの構成を示す図である。
【図7】本発明の第二実施形態の細胞培養システムの構成を示す図である。
【図8】本発明の実施例1及び比較例1の結果を示す図である。
【図9】本発明の実施例2,3の細胞培養システムを示す図である。
【図10】本発明の実施例2及び比較例2の結果(観察写真画像)を示す図である。
【図11】本発明の実施例2及び比較例2の結果(外観写真画像)を示す図である。
【図12】本発明の実施例3及び比較例3の結果(観察写真画像)を示す図である。
【図13】本発明の実施例3及び比較例3の結果(外観写真画像)を示す図である。
【図14】従来の細胞培養システムによる培養の様子を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明の実施形態について具体的に説明する。
まず、本発明の細胞培養方法及び細胞培養システムにおける気泡発生防止技術の原理について、図1−5,14を参照して説明する。図1は、本発明の細胞培養システムの概要を示す図である。図2〜図5は、それぞれ本発明の細胞培養方法及び細胞培養システムにおけるインキュベータ内を乾燥状態にした場合、加湿状態にした場合、乾燥状態にしかつ細胞培養容器を加圧した場合、及び乾燥状態にしかつインキュベータ内を減圧した場合の細胞培養容器の内外の圧力の関係を示す図である。なお、説明を簡単にするため、水蒸気(または培地水分)の割合を大きく表現している。また、図14は、従来の細胞培養システムによる培養の様子を示す図である。
【0015】
本発明の細胞培養システムは、図1に示すように、細胞及び培養液11が充填された細胞培養容器10と、これを積載した積載台20を含む細胞培養装置と、この細胞培養装置が載置されているインキュベータ40を有している。細胞培養装置には圧力調整装置12が備えられている。なお、細胞培養装置には、その他に細胞観測用の照明や攪拌部材など各種装置が備えられる場合があるが、同図では省略している。
さらに、本発明の細胞培養システムは、積載台20に設けられた観測孔21を介して細胞培養容器10内の細胞を撮影するための顕微鏡30を有している。
【0016】
このような細胞培養システムによれば、細胞培養容器10を圧力調整装置12により加圧して、細胞培養容器10内の空気成分分圧を、インキュベータ40内の乾燥空気気圧と同じか、インキュベータ内の乾燥空気気圧よりも大きくすることができる。このため、細胞培養容器10内に気泡が発生することを防止することが可能となっている。
なお、本発明では、細胞培養容器10の空気成分分圧の調整、及び/又は、インキュベータ40内の気圧の調整を行うが、その調整を行う圧力調整手段12としては種々のものを用いることができ、細胞培養容器10に圧力を加えるための加圧板などの各種加圧手段や、インキュベータ40内を減圧するための各種減圧装置などを使用することが可能である。また、細胞培養容器10に培養液を供給するための培養液供給装置を加圧手段として用いることもできる。すなわち、培養液供給装置から供給ポンプを介して培養液を細胞培養容器10にその許容量いっぱいまで送り込むことで、細胞培養容器10を加圧することも可能である。
【0017】
一方、従来の細胞培養方法では、図14に示すように、インキュベータ400内に細胞培養容器100を積載した積載台200を含む細胞培養装置が載置され、細胞培養容器100には細胞及び培養液110が充填されている。そして、顕微鏡300により、積載台200に設けられた観測孔210を介して、細胞培養容器100内の細胞の撮影が行われる構成となっている。
このような従来の細胞培養方法では、インキュベータ400内が乾燥状態である場合には、細胞培養容器100内の空気成分分圧が、インキュベータ400内の乾燥空気気圧よりも小さい状態となる。このため、細胞培養容器100内の空気成分分圧とインキュベータ400内の気圧が同じになるように、バッグ外からバッグ内にガス(空気成分)が移動し、細胞培養容器10内に気泡130が発生する。このため、顕微鏡300により観測孔210を介して細胞培養容器100の細胞を撮影すると、画像に気泡130が写り込むため、細胞の数のカウントや細胞の状態の観察を適切に行うことができなかった。
【0018】
次に、インキュベータ40内が乾燥状態の場合と、加湿状態の場合におけるそれぞれの細胞培養容器10の内外の圧力の関係について説明する。
まず、図2は、乾燥状態のインキュベータ40内における細胞培養容器10の空気成分分圧と、インキュベータ40内の乾燥空気の気圧の関係を示している。
同図に示すように、インキュベータ40内が乾燥状態の場合、細胞培養容器10の内圧は、空気成分の分圧と水蒸気(培養液の水分を含む)の分圧により構成され、これがインキュベータ40内の乾燥空気の気圧と同じになっている。すなわち、これらの分圧を合計した細胞培養容器10の内圧が、インキュベータ40内の乾燥空気気圧と同じになっている。なお、ここでいう「空気成分」は、酸素、窒素、二酸化炭素など乾燥空気成分からなり、「水蒸気」は、水蒸気及び/又は培養液からなっている。また、細胞培養容器10内における培養液の分圧を、飽和水蒸気圧とみなすことができる。
その結果、細胞培養容器10内の空気成分分圧が、インキュベータ40内の乾燥空気の分圧よりも小さくなるため、バッグの外側からバッグの内側への空気の移動が生じ、バッグ内に気泡が発生する。
【0019】
一方、図3は、加湿状態のインキュベータ40内における細胞培養容器10の空気成分分圧と、インキュベータ40内の乾燥空気の気圧の関係を示している。
このように、インキュベータ40内を湿度100%RH(相対湿度)の加湿状態にすると、すなわち、インキュベータ40内の湿度を飽和状態にすると、細胞培養容器10内の空気成分分圧は、インキュベータ40内の乾燥空気の分圧と同じになる。このため、バッグの外側からバッグの内側への空気の移動は生じず、バッグ内に気泡は発生しない。なお、このようにインキュベータ40内を加湿状態にすれば、バッグ内に気泡は発生しないが、上述したように、カビが発生しやすく不衛生という問題がある。
【0020】
次に、図4は、乾燥状態のインキュベータ40内において、細胞培養容器10を加圧した場合の細胞培養容器10の空気成分分圧と、インキュベータ40内の乾燥空気の気圧の関係を示している。
このように、細胞培養容器10を加圧して、細胞培養容器10の空気成分分圧を、インキュベータ40内の乾燥空気の気圧以上にすれば、バッグの外側からバッグの内側への空気の移動が生じることはなく、バッグ内に気泡は発生しない。
【0021】
次に、図5は、乾燥状態のインキュベータ40内を減圧した場合の細胞培養容器10の空気成分分圧と、インキュベータ40内の乾燥空気の気圧の関係を示している。
このように、インキュベータ40内の乾燥空気の気圧を、細胞培養容器10の空気成分分圧以下にすれば、バッグの外側からバッグの内側への空気の移動が生じることはなく、バッグ内に気泡は発生しない。
【0022】
なお、図4及び図5を参照して説明した圧力調整では、細胞培養容器10の空気成分分圧を相対的にインキュベータ40内の乾燥空気の気圧以上にすることで、バッグ内に気泡が発生することを防止しているが、細胞培養容器10の空気成分分圧がインキュベータ40内の気圧未満の場合であっても、細胞培養容器10の空気成分分圧がインキュベータ40内の気圧に近くなるように圧力調整を行うことで、バッグ内に発生する気泡を低減させることが可能となる。
【0023】
[第一実施形態]
次に、本発明の第一実施形態の細胞培養方法及び細胞培養システムについて、図6を参照して説明する。同図は、本実施形態の細胞培養システムの構成を示す図である。
本実施形態の細胞培養システムは、同図に示すように、細胞及び培養液11を封入した、ガス透過性の細胞培養容器10と、細胞培養容器10を積載する積載台20と、細胞培養容器10を積載した積載台20を内部に載置して温度や湿度などの培養環境を制御するインキュベータ40を有している。また、細胞培養容器10を加圧するための加圧板13を備えた圧力調整装置12(圧力調整手段)と、細胞培養容器10内の細胞の数やその状態を撮影するための顕微鏡30を有している。
【0024】
細胞培養容器10は、軟包材を材料として、袋状(バック型)に形成した容器である。このように、細胞培養容器10の材料として軟包材を用いることで、細胞培養容器10に可撓性・柔軟性を付与することができる。軟包材としては、例えば、特開2009−247225号公報(培養容器)や、特開2006−262876号公報(培養バッグ、培地保存方法および細胞培養方法)に記載されているものなどを用いることができる。
【0025】
また、細胞培養容器10は、細胞培養に必要なガス透過性を有しており、内容物を確認できるように、一部又は全部が透明性を有している。このような条件を満たす培養容器の材料としては、例えばポリオレフィン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、スチレン系エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、シリコーンゴム等を挙げることができる。
【0026】
細胞培養容器10には、培養する細胞及び培養液11が充填されている。
培養液としては、培養細胞の増殖に適したものを適宜使用することができ、特に限定されるものではないが、本実施形態の細胞培養方法及び細胞培養システムは気泡の発生を防止するものであるため、液体培地やジェル培地等を対象としている。
また、培養細胞としては、ヒト、その他の動物、植物、微生物などにおける各種細胞を用いることができ、例えばヒトの白血病Tリンパ腫における細胞や正常末梢血単核球、ヒト胎児腎臓由来細胞株、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、胚性幹細胞(ES細胞)、造血幹細胞、神経幹細胞等を用いることができる。
【0027】
加圧板13は、細胞培養容器10に圧力を加えて内部の空気成分分圧を増加できる加圧手段であれば特に限定されないが、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、PET(ポリエチレンテレフタレート)、環状ポリオレフィン(COP)、ABS、アクリル、ステンレス、アルミ、ガラス、及びMCナイロンやポリカーボネートなどのエンジニアリングプラスチック等を材料とするものを用いることができる。
加圧板13のサイズは、細胞培養容器10内の空気成分分圧を十分に調整できるものであれば良く、特に限定されない。
【0028】
また、加圧板13の形状は、単なる板状のものではなく、パンチングメタル状ものや、剛性のある網状の板(規則的に穴が設けられたもの)などを用いることもできる。さらに、棒状の加圧手段を用いて、細胞培養容器10を加圧することもできる。また、このような棒状の加圧手段を多数用いて細胞培養容器10の上面全体を同時に加圧することも可能である。
細胞培養容器10に圧力を加えるための手段としては、これらに限定されるものではなく、例えば細胞培養容器10の端部を巻き込んだり、端部からローラを移動させて細胞培養容器10の実質容量を減少させることで加圧するものなど、細胞培養容器10内の空気成分分圧を十分に調整できるものであれば良い。
【0029】
なお、本実施形態では、細胞培養容器10を加圧するため、細胞培養容器10内の細胞にも圧力が加わることになる。培養細胞は一般に圧力に強いものが多く、細胞培養容器10内の空気成分分圧がインキュベータ40内の気圧と同程度かやや大きくなるように加圧しても、通常問題なく増殖する。また、例えば軟骨細胞などでは、所定の圧力を加えることで増殖効率が向上することが知られている。
【0030】
圧力調整装置12は、積載台20に対する加圧板13の位置を調整して、細胞培養容器10内の空気成分分圧を調整する装置である。すなわち、加圧板13を積載台20に向けて移動させることで、積載台20上の細胞培養容器10を押圧することができ、その押圧した位置で加圧板13を固定させることができる。
圧力調整装置12は、このような動作を行えるものであれば、特に限定されないが、図6に示す圧力調整装置12は、加圧版13を両端又は四隅に固定するとともに、積載台20に上方に向かって立設された支持柱20aに上下動可能に取り付けられており、ネジ13aにより加圧板13の上下方向の位置を固定できる構成となっている。
【0031】
積載台20は、その上面に細胞培養容器10が載置される平面の台である。積載台20には、例えば細胞培養容器10の両端を積載台20に固定するための固定具など、細胞培養容器10を定置させるための各種構成を設けることができる。
また、積載台20は、観測孔21を備えている。この観測孔21を介して、顕微鏡30により積載台20に積載された細胞培養容器10内の細胞を観測することができるようになっている。
【0032】
顕微鏡30は、カメラ機能を備えた顕微鏡であり、一定時間毎に観測孔21を介して細胞培養容器10内の細胞を自動的に撮影する。また、図示しないが、撮影された画像データは、情報処理装置に入力され、この画像データにおける細胞数がカウントされる。このような顕微鏡30と、自動撮影方法及び細胞数のカウント方法は、現在一般的に使用されているものを用いることができる。なお、カメラ機能は顕微鏡30と別個に設けても良い。
インキュベータ40は、細胞培養環境を制御するための装置である。恒温槽、恒温恒湿槽などをインキュベータ40として使用することができる。また、酸素濃度及び二酸化炭素濃度等のガスを、所定の条件に調整できるものを用いることもできる。
【0033】
本実施形態の細胞培養方法及び細胞培養システムを用いるタイミングは、特に限定されないが、細胞培養の開始時の期間や、誘導因子により細胞を刺激して細胞増殖を行う場合、細胞分化を行う場合などに、好適に使用することが可能である。
細胞培養の開始時の期間においては、一般に小さい培養バッグや大きな培養バッグの一部など、所定の容積以下の小さい細胞培養容器10が使用される。これは、細胞が効率的に増殖するためには、一定以上の細胞密度が必要であり、最初から大きい容積の培養バッグを使用すると増殖効率が低くなるためである。
【0034】
このような細胞培養の開始時の期間とは、培養細胞数が、およそ1倍〜10倍になるまでを意味し、一般には培養の開始後、1日から5日までの期間を意味する。
細胞培養の開始時において用いられる培養バッグのサイズとしては、水平面積が3,000〜25,000mm2のものを好適に使用することができる。また、このような培養バッグにおいて、培養液の量としては、6〜50mlが好適に使用される。このような培養バッグを細胞培養の開始時の期間に使用することで、培養初期段階に高い増殖効率を得ることが可能である。
【0035】
誘導因子により細胞を刺激して細胞増殖を行う場合とは、例えばT細胞を抗CD3抗体で刺激して増殖を誘導する場合などを挙げることができる。
また、細胞分化を行う場合とは、例えばES細胞などの幹細胞を心筋細胞や神経細胞などに分化させる場合や、単球を樹状細胞に分化させる場合などを挙げることができる。
【0036】
このような細胞増殖のための誘導刺激を行う場合や、細胞を分化させる場合においては、約10,000mm2程度の小容量の細胞培養容器10を用いて培養を行うことが多い。また、このとき、同一細胞の変化を経時的に観察するために撹拌等を行わないことが多い。
このような培養を行う場合にあたっては、特にその培養過程を観察して、誘導や分化が適切に行われているかを確認する必要があり、観測の障害になる気泡の発生を防止することは重要である。
【0037】
本実施形態の細胞培養方法は、このような細胞培養システムを用いて、以下のような工程を有するものとすることができる。
まず、培養バッグに細胞及び培養液11を充填して、積載台20に積載する。そして、培養バッグ上に加圧板13を載せ、圧力調整装置12を使用して、培養バッグ内の空気成分分圧がインキュベータ40内の乾燥空気の気圧と同じか、又はインキュベータ40内の乾燥空気の気圧よりも大きくなる位置まで、加圧板13を下方に移動させて固定する。
そして、これらをインキュベータに載置し、乾燥状態で細胞培養を開始する。乾燥状態とは、非加湿状態であれば良く、特に限定されないが、具体的には例えば湿度が80%RH未満の状態を意味する。以下の実施形態においても同様である。
【0038】
なお、本実施形態の細胞培養方法及び細胞培養システムにおける気泡発生防止技術の原理上、インキュベータ40内の湿度が飽和状態でなければ(100%RH未満であれば)、細胞培養容器10の加圧などの圧力調整を行うことは、気泡発生防止の観点から有効である。さらに、カビ発生を防ぐという目的のためには、80%RH未満であることが望ましい。一般的には、梅雨の時(例えば25℃,100%RH)であっても、インキュベータ内(37℃)の湿度は50%RH程度にしかならないため、本実施形態の細胞培養方法及び細胞培養システムは、加湿を行わない状態で、細胞培養容器10における気泡を好適に防止できる点で有効である。
【0039】
次に、積載台20の観測孔21の下に顕微鏡30を配置し、一定時間毎に培養バッグ内の細胞を自動撮影する。なお、図示していないが、顕微鏡30を情報処理装置に接続して、撮影した画像データを情報処理装置へ送信させ、情報処理装置において画像データにおける細胞数を自動的にカウントすることが可能となっている。
【0040】
なお、数時間後に、もし気泡が発生している場合には、加圧板13を下方に移動させて加圧をさらに強くすることで、発生した気泡を消すことも可能である。
そして、このような条件下で細胞を培養し、一定時間毎に、細胞を撮影した画像データと、培養された細胞数を得ることができる。
【0041】
本実施形態の細胞培養方法をこのようにすることで、インキュベータ40内を乾燥させた状態でも、細胞培養容器10に気泡を発生させることなく、細胞培養を行うことができる。
このため、顕微鏡30により自動的に撮影された画像に気泡が映り込むことがなく、画像における細胞数を適切にカウントすることができ、また細胞の状態も適切に確認することが可能となる。
【0042】
[第二実施形態]
次に、本発明の第二実施形態の細胞培養方法及び細胞培養システムについて、図7を参照して説明する。同図は、本実施形態の細胞培養システムの構成を示す図である。
本実施形態の細胞培養システムは、圧力調整装置12として、減圧装置50を備え、これによりインキュベータ40内を減圧して、細胞培養容器10内の空気成分分圧を、インキュベータ40内の乾燥空気の気圧以上にすることができる点で第一実施形態と相違する。その他の点は、第一実施形態と同様である。
【0043】
減圧装置50は、インキュベータ40内の空気の減圧を行えるものであれば特に限定されるものではなく、一般的なものを使用することができる。
本実施形態の細胞培養方法では、培養バッグを積載した積載台20をインキュベータ40に載置して、インキュベータ40を減圧装置50により減圧し、インキュベータ40内の乾燥空気の気圧を細胞培養容器10内の空気成分分圧と同じか、細胞培養容器10内の空気成分分圧よりも小さくする。また、積載台20の観測孔21の下に顕微鏡30を配置する。一定時間毎に培養バッグ内の細胞を自動撮影し、細胞数の自動カウントを行うことができる点も第一実施形態と同様である。そして、乾燥状態で細胞培養を開始する。
【0044】
数時間後、培養バッグ内に気泡が発生していないかを確認し、発生している場合には減圧装置50によりインキュベータ40内の気圧をさらに減圧して、培養バッグ内に気泡が発生しなくなるように調整する。
そして、このような条件下で細胞を培養し、一定時間毎に、細胞を撮影した画像データと、培養された細胞数を得ることができる。
【0045】
このような本実施形態の細胞培養方法及び細胞培養システムによれば、細胞培養容器10を加圧することなく、減圧装置50によりインキュベータ40内の気圧を調整することで、細胞培養容器10に気泡が発生することを防止することができる。
このため、例えば細胞に圧力を加えることなく増殖を行いたい場合や、培養バッグが柔軟な素材からなるものではない場合など、加圧に適さないものである場合においても好適に用いることが可能である。
【実施例】
【0046】
以下、本発明の細胞培養方法及び細胞培養システムにより、細胞培養容器を加圧して細胞培養を行った実施例及び加圧することなく細胞培養を行った比較例について説明する。
【0047】
(実施例1)
細胞培養容器10として、LLDPE(直鎖状低密度ポリエチレン)製、サイズが80mm×40mm、フィルム厚0.15mmのバッグを使用した。
この細胞培養容器10に、培養液として細胞科学研究所のAlyS505N−0培地のみを充填した。培養液の量は7ml、細胞培養容器10の厚みは2.5mmであった。
そして、細胞培養容器10をインキュベータ40内に載置して、加圧板13を用いて加圧した。このとき、加圧板13により、細胞培養容器10の厚みが2.3mmになるように加圧し、この加圧板13を固定して、インキュベータ40内を37℃、CO2濃度5%、湿度30〜40%RHの乾燥状態とした。本実施例の細胞培養容器10では、このような加圧板13を用いた加圧によって、細胞培養容器10内の空気成分分圧が、インキュベータ40内の乾燥空気の気圧よりも大きくなっている。
【0048】
なお、本実施例では、加圧板13は、細胞培養容器10の上面全体を覆うものを使用した。
このようにして、細胞培養容器10をインキュベータ40内に3日間静置させた結果、図8の(加圧あり)に示すように、細胞培養容器10において気泡が発生することなく保持することができた。
【0049】
(比較例1)
実施例1と同様の細胞培養容器10、及び培養液を使用して、加圧板13による加圧を行うことなく細胞培養容器10をインキュベータ40に載置し、実施例1と同様に、37℃、CO2濃度5%、湿度30〜40%RHの乾燥状態で、3日間静置させた。
この結果、図8の(加圧なし)に示すように、細胞培養容器10の全面に気泡が発生して、培養容器内を観察できない状態になっていた。
【0050】
(実施例2)
細胞培養容器10として、LLDPE(直鎖状低密度ポリエチレン)製、サイズが40mm×80mm、フィルム厚0.15mmのバッグを使用した。
この細胞培養容器10に、培養液として細胞科学研究所のAlyS505N−0培地と、培養細胞としてヒト白血病Tリンパ種のJurkatE6.1株を充填した。細胞と培養液の量は7ml、細胞培養容器10の厚みは2.5mmであった。
そして、これをインキュベータ40に載置し、加圧板13を用いて細胞培養容器10の厚みが2.3mmになるよう加圧し、加圧板13を固定して、37℃、CO2濃度5%、湿度30〜40%RHの乾燥状態で、48時間細胞培養を行った。本実施例では、加圧板13は、細胞培養容器10の水平面積と同じ面積を備えたものを使用した。このときの細胞培養容器10の空気成分分圧は、インキュベータ40内の乾燥空気の気圧以上となっている。
【0051】
図9に本実施例で用いた細胞培養システムを示す。この細胞培養システムは、細胞培養容器10を、観察孔21を備えた積載台20上に積載するとともに、細胞培養容器10を加圧板13で押圧する構成となっている。加圧板13は、その四隅において、ネジ13aとスペーサー13bにより加圧した位置で固定されている。また、加圧板13の長尺方向の両端の下にもスペーサー13bが配置され、細胞培養容器10に対する加圧板13の位置を適切に調整できるようになっている。
図10の(加圧あり)は、本実施例の培養開始から48時間後の培養細胞を顕微鏡30により撮影した画像(観察写真画像)を示している。また、図11の(加圧あり)は、本実施例の培養開始から48時間後の細胞培養容器10の外観写真画像を示している。
これらの図から、本実施例では、細胞培養容器10において気泡は発生せず、培養された細胞を明瞭に観察できることがわかる。
【0052】
(比較例2)
実施例2と同様の細胞培養容器10、細胞及び培養液11を用いて、加圧板13による加圧を行うことなく、インキュベータ40に載置し、その他の点は実施例2と同一条件で細胞培養を行った。
図10の(加圧なし)は、本比較例の培養開始から48時間後の培養細胞を顕微鏡30により撮影した画像(観察写真画像)を示している。また、図11の(加圧なし)は、本比較例の培養開始から48時間後の細胞培養容器10の外観写真画像を示している。
これらの図から明らかなように、本比較例では、細胞培養容器10内に気泡が生じている。このため、培養細胞数を適切にカウントすることができず、また細胞の状態も観察しにくい状態となっている。
【0053】
(実施例3)
細胞培養容器10として、LLDPE(直鎖状低密度ポリエチレン)製、サイズが40mm×80mm、フィルム厚0.15mmのバッグを使用した。
この細胞培養容器10に、培養液として細胞科学研究所のAlyS505N−7培地と、培養細胞としてhPBMC(ヒト末梢血単核球)を充填した。細胞と培養液の量は7ml、細胞培養容器10の厚みは2.5mmであった。本実施例は、培養容器内に固相化した抗CD3抗体を用いてT細胞を刺激し、その増殖誘導過程を観察したものであり、培養時間は、72時間である。本実施例は、図9の細胞培養システムを用いて行った。
図12の(加圧あり)は、本実施例の培養開始から72時間後の培養細胞を顕微鏡30により撮影した画像(観察写真画像)を示している。また、図13の(加圧あり)は、本実施例の培養開始から72時間後の細胞培養容器10の外観写真画像を示している。
【0054】
これらの図から、本実施例では、細胞培養容器10において気泡は発生しておらず、培養された細胞を明瞭に観察することができることがわかる。また、図12の(加圧あり)の画像には、増殖を開始した凝集塊がはっきりと写し出されている。
このように本発明の細胞培養方法及び細胞培養システムによれば、細胞増殖のために誘導刺激を行う場合や、細胞を分化させる場合において、その培養過程を適切に観察し得ることが明らかとなった。
【0055】
(比較例3)
実施例3と同様の細胞培養容器10、細胞及び培養液11を用いて、加圧板13による加圧を行うことなく、インキュベータ40に載置し、その他の点は実施例3と同一条件で細胞培養を行った。
図12の(加圧なし)は、本比較例の培養開始から72時間後の培養細胞を顕微鏡30により撮影した画像(観察写真画像)を示している。また、図13の(加圧なし)は、本比較例の培養開始から72時間後の細胞培養容器10の外観写真画像を示している。
これらの図から明らかなように、本比較例では、細胞培養容器10内に気泡が生じており、培養細胞数を適切にカウントすることができず、また細胞の状態はほとんど観察できない状態となっている。
【0056】
」
以上の実施例及び比較例から明らかなように、ガス透過性の培養バッグを用いて、閉鎖系で自動的に細胞を大量培養するにあたり、インキュベータ内を乾燥状態とする場合でも、培養バッグ内の空気成分分圧を、インキュベータ内の乾燥空気の気圧以上にすることで、培養バッグ内に気泡を発生させることなく、培養バッグ中の細胞の数やその状態を正確に観測することができ、長期間の連続観察を安定的に行えることがわかる。
【0057】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、第一実施形態と第二実施形態を組み合わせて、圧力調整装置として加圧板及び減圧装置の両方を備え、インキュベータ内において細胞培養容器を加圧し、かつ、インキュベータ内を減圧することで、細胞培養容器内における気泡の発生を防止することも可能である。
また、上記実施形態及び実施例では、細胞を培養する場合について説明しているが、例えば微生物などその他の有機体、又は無機物などの観測が必要となる場合において、培養バッグ内に気泡が発生することを防止するなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【0058】
本発明は、細胞培養容器を用いて、細胞を大量培養する場合に好適に利用することが可能である。
【符号の説明】
【0059】
10 細胞培養容器
11 細胞及び培養液
12 圧力調整装置
13 加圧板
13a ねじ
13b スペーサー
20 積載台
20a 支持柱
21 観測孔
30 顕微鏡
40 インキュベータ
50 減圧装置
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞及び培養液を封入した、ガス透過性の細胞培養容器をインキュベータ内に載置して細胞培養を行う細胞培養方法であって、
前記細胞培養容器内の空気成分分圧を、前記インキュベータ内の乾燥空気の気圧と同じか、又は前記インキュベータ内の乾燥空気の気圧よりも大きくすることで、前記細胞培養容器内における気泡の発生を防止する
ことを特徴とする細胞培養方法。
【請求項2】
前記インキュベータ内を湿度80%RH未満の乾燥状態にして、前記細胞培養を行うことを特徴とする請求項1記載の細胞培養方法。
【請求項3】
前記細胞培養容器を積載台に載置し、前記細胞培養容器を加圧手段により加圧して、前記細胞培養容器の空気成分分圧を、前記インキュベータ内の乾燥空気の気圧と同じか、又はより大きくする
ことを特徴とする請求項1又は2記載の細胞培養方法。
【請求項4】
前記インキュベータ内を減圧して、前記細胞培養容器の空気成分分圧を、前記インキュベータ内の乾燥空気の気圧と同じか、又は前記インキュベータ内の乾燥空気の気圧よりも大きくする
ことを特徴とする請求項1又は2記載の細胞培養方法。
【請求項5】
前記細胞培養容器として所定の容積以下のものを使用する細胞培養の開始時の所定の期間、誘導因子により細胞を刺激して細胞増殖を行う場合、又は細胞分化を行う場合において、前記細胞培養容器の空気成分分圧を、前記インキュベータ内の乾燥空気の気圧と同じか、又は前記インキュベータ内の乾燥空気の気圧よりも大きくして、前記細胞培養を行う
ことを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項6】
細胞及び培養液を封入した、ガス透過性の細胞培養容器と、
前記細胞培養容器を積載する積載台と、
前記細胞培養容器を積載した積載台を内部に載置して培養環境を制御するインキュベータと、
前記細胞培養容器の空気成分分圧を、前記インキュベータ内の乾燥空気の気圧と同じか、又は前記インキュベータ内の乾燥空気の気圧よりも大きくする圧力調整手段と、を備える
ことを特徴とする細胞培養システム。
【請求項7】
前記圧力調整手段が、前記細胞培養容器を加圧する加圧手段を備えたことを特徴とする請求項6記載の細胞培養システム。
【請求項8】
前記圧力調整手段が、前前記インキュベータ内の気圧を調整する減圧装置を備えたことを特徴とする請求項6記載の細胞培養システム。
【請求項1】
細胞及び培養液を封入した、ガス透過性の細胞培養容器をインキュベータ内に載置して細胞培養を行う細胞培養方法であって、
前記細胞培養容器内の空気成分分圧を、前記インキュベータ内の乾燥空気の気圧と同じか、又は前記インキュベータ内の乾燥空気の気圧よりも大きくすることで、前記細胞培養容器内における気泡の発生を防止する
ことを特徴とする細胞培養方法。
【請求項2】
前記インキュベータ内を湿度80%RH未満の乾燥状態にして、前記細胞培養を行うことを特徴とする請求項1記載の細胞培養方法。
【請求項3】
前記細胞培養容器を積載台に載置し、前記細胞培養容器を加圧手段により加圧して、前記細胞培養容器の空気成分分圧を、前記インキュベータ内の乾燥空気の気圧と同じか、又はより大きくする
ことを特徴とする請求項1又は2記載の細胞培養方法。
【請求項4】
前記インキュベータ内を減圧して、前記細胞培養容器の空気成分分圧を、前記インキュベータ内の乾燥空気の気圧と同じか、又は前記インキュベータ内の乾燥空気の気圧よりも大きくする
ことを特徴とする請求項1又は2記載の細胞培養方法。
【請求項5】
前記細胞培養容器として所定の容積以下のものを使用する細胞培養の開始時の所定の期間、誘導因子により細胞を刺激して細胞増殖を行う場合、又は細胞分化を行う場合において、前記細胞培養容器の空気成分分圧を、前記インキュベータ内の乾燥空気の気圧と同じか、又は前記インキュベータ内の乾燥空気の気圧よりも大きくして、前記細胞培養を行う
ことを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項6】
細胞及び培養液を封入した、ガス透過性の細胞培養容器と、
前記細胞培養容器を積載する積載台と、
前記細胞培養容器を積載した積載台を内部に載置して培養環境を制御するインキュベータと、
前記細胞培養容器の空気成分分圧を、前記インキュベータ内の乾燥空気の気圧と同じか、又は前記インキュベータ内の乾燥空気の気圧よりも大きくする圧力調整手段と、を備える
ことを特徴とする細胞培養システム。
【請求項7】
前記圧力調整手段が、前記細胞培養容器を加圧する加圧手段を備えたことを特徴とする請求項6記載の細胞培養システム。
【請求項8】
前記圧力調整手段が、前前記インキュベータ内の気圧を調整する減圧装置を備えたことを特徴とする請求項6記載の細胞培養システム。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図14】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図14】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【公開番号】特開2012−239401(P2012−239401A)
【公開日】平成24年12月10日(2012.12.10)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2011−110260(P2011−110260)
【出願日】平成23年5月17日(2011.5.17)
【出願人】(000003768)東洋製罐株式会社 (1,150)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成24年12月10日(2012.12.10)
【国際特許分類】
【出願日】平成23年5月17日(2011.5.17)
【出願人】(000003768)東洋製罐株式会社 (1,150)
【Fターム(参考)】
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