経口用組成物
【課題】重篤な副作用がなく、長期服用が可能であって、慢性関節炎だけではなく急性関節炎にも抗炎症作用を有する経口用組成物、並びに該経口用組成物を含有する飲食品及び医薬品の提供。
【解決手段】酵母由来のマンナンタンパク質、酵母由来のα―マンナン、及び酵母の乾燥菌末からなる群より選択される１以上を有効成分とし、関節炎に対する抗炎症作用を有することを特徴とする経口用組成物、酵母由来のマンナンタンパク質を有効成分とすることを特徴とする前記記載の経口用組成物、並びに前記いずれか記載の経口用組成物を含有する飲食品及び医薬品。
【解決手段】酵母由来のマンナンタンパク質、酵母由来のα―マンナン、及び酵母の乾燥菌末からなる群より選択される１以上を有効成分とし、関節炎に対する抗炎症作用を有することを特徴とする経口用組成物、酵母由来のマンナンタンパク質を有効成分とすることを特徴とする前記記載の経口用組成物、並びに前記いずれか記載の経口用組成物を含有する飲食品及び医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節炎に対する抗炎症作用を有する経口用組成物、並びに該経口用組成物を含有する飲食品及び医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節炎は、関節に生じる炎症性疾患であり、浮腫、発赤、強直、疼痛、発熱等の症状があり、重症の場合には運動障害を生ずる場合がある。関節炎には様々な病態があり、また、その発症機序も病態ごとに異なる。例えば、関節炎は、関節リウマチ、痛風、細菌による化膿、外傷、急性炎症のスポーツ障害による捻挫・関節痛等の様々な原因で発症し、発症原因の特定が困難な場合もある。関節炎の患者数は多く、また、高齢化に従い、今後ますます増加すると予想されている。
【０００３】
現在、関節炎に対する急性炎症や慢性炎症の治療には、抗炎症薬の服用が一般的である。抗炎症薬は、デキサメタゾン等のステロイド性抗炎症薬と、アスピリン、インドメタシン、ジクロフェナク、イブプロフェン等の非ステロイド性抗炎症薬の２種に大別される。ステロイド性抗炎症薬は、他のステロイド剤と同様に長期服用には適しておらず、一方、非ステロイド性抗炎症薬にも、胃粘膜や腎臓等の組織に炎症を引き起こす等の副作用があり、長期服用は困難となる場合が多い。このため、重篤な副作用がなく、長期服用可能な治療剤や予防剤等の開発が強く望まれている。
【０００４】
このように、長期服用が可能であって、関節炎に有効である物質の一つにグルコサミンがある。グルコサミンは天然のアミノ糖であり、Ｎ−アセチル体として特にキチンやプロテオグリカン中に存在する。高濃度のグルコサミンを経口投与したアジュバント誘発関節炎ラットでは、関節の浮腫が抑制され、関節炎スコアが低くなることが報告されている（例えば非特許文献１参照。）。なお、アジュバント誘発関節炎ラットは、リウマチ等の慢性関節炎のモデル動物の１種である。
【０００５】
その他、やはり長期服用が可能であって、関節炎に有効であると考えられているものに、乾燥ビール酵母がある。乾燥ビール酵母を経口投与したコラーゲン誘導関節炎マウスでは、関節炎病変が抑制され、関節炎スコアが低くなることが報告されている（例えば非特許文献２参照。）。なお、コラーゲン誘導関節炎マウスは、アジュバント誘発関節炎と同様、リウマチ等の慢性関節炎のモデル動物の１種である。
【０００６】
また、（１）マンノース−６−ホスフェート等の糖燐酸若しくはそのエステル誘導体又はホスホマンノース残基を含有する、前記の燐酸含有オリゴ糖若しくは多糖又はそれらのエステル誘導体を含み、マンノースホスフェートレセプターの天然配位子の拮抗質又は拮抗阻害剤である、動物又は人間の患者の抗炎症治療用及び（又は）細胞媒介過敏症治療用の医療用又は獣医学的組成物も開示されている（例えば、特許文献１参照。）。特に特許文献１には、該組成物が、ヒトの多発性硬化症に似た動物の中枢神経の炎症の一つであるラットの実験的アレルギー性脳髄膜炎や、ラットのアジュバント誘発関節炎に対して抑制効果を有することが記載されている。
【非特許文献１】Ｊ．Ｈｕａ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５年、第５４巻、第１２７〜１３２ページ。
【非特許文献２】細田ら、日本家政学会誌、２０００年、第５１巻、第６号、第４７３〜４７９ページ。
【特許文献１】特許第３００９１６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
グルコサミンは、機能性食品としてサプリメント等の形態で広く使用されているが、関節炎の抗炎症効果としては十分であるとは言い難い。さらに、急性関節炎に対する抗炎症効果はない。
【０００８】
同様に、乾燥ビール酵母や上記（１）の組成物も、やはり慢性関節炎に対する効果の報告はあるものの、急性関節炎に対する抗炎症効果は不明である。
特に乾燥ビール酵母では、腸管免疫系に対し何らかの影響を及ぼすために関節炎が抑制されているとの示唆はあるが、酵母の乾燥菌末を投与しているため、酵母中のどの成分が有効成分として機能しているのかは不明である。
【０００９】
本発明は、重篤な副作用がなく、長期服用が可能であって、慢性関節炎だけではなく急性関節炎にも抗炎症作用を有する経口用組成物、並びに該経口用組成物を含有する飲食品及び医薬品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、酵母由来のマンナンタンパク質、酵母由来のα―マンナン、及びこれらを含有している酵母の乾燥菌末を経口摂取することにより、浮腫等の関節炎の症状が緩和されること、及び、これらのマンナンタンパク質等は、慢性関節炎と急性関節炎の両方に対して有効であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、酵母由来のマンナンタンパク質、酵母由来のα―マンナン、及び酵母の乾燥菌末からなる群より選択される１以上を有効成分とし、関節炎に対する抗炎症作用を有することを特徴とする経口用組成物を提供するものである。
また、本発明は、酵母由来のマンナンタンパク質を有効成分とすることを特徴とする前記記載の経口用組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記関節炎が急性関節炎であることを特徴とする前記いずれか記載の経口用組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記酵母が糖鎖合成系遺伝子に変異を有し、マンナンタンパク質を培地中に放出する酵母であることを特徴とする前記いずれか記載の経口用組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記変異型糖鎖合成系遺伝子が、α１，２−マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする前記記載の経口用組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記酵母が、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、サッカロマイセス・パラドキサス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、サッカロマイセス・ミカタエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍｉｋａｔａｅ）、サッカロマイセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）からなる群より選択されることを特徴とする前記いずれか記載の経口用組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記酵母が、サッカロマイセス・セレビシエＭＴＹ９（ｇｐｉ１０）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３９１）又はサッカロマイセス・セレビシエＡＢ９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３９０）であることを特徴とする前記いずれか記載の経口用組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載の経口用組成物を含有することを特徴とする飲食品又は医薬品を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の経口用組成物は、従来の抗炎症剤とは異なり、重篤な副作用を有さないため、安全に長期間服用することができる、抗炎症性物質である。また、発症機序の異なる急性関節炎と慢性関節炎の両方に対して抗炎症作用を奏し得る組成物である。毎日服用することも可能であるため、飲食品としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の経口用組成物は、酵母由来のマンナンタンパク質、酵母由来のα―マンナン、及び酵母の乾燥菌末からなる群より選択される１以上を有効成分とし、関節炎に対する抗炎症作用を有することを特徴とする。本発明において、α―マンナンとは、α１，６―結合、α１，２―結合、又はα１，３―結合からなるＤ−マンノースの重合体であり、水溶性多糖類である。一方、マンナンタンパク質とは、酵母の細胞壁に局在するタンパク質に、Ｎ−グリコシド結合又はＯ−グリコシド結合により、１又は２以上のα―マンナン鎖が結合した水溶性の糖タンパク質を意味する。ここで、α―マンナン鎖とは、Ｄ−マンノースがα１，６―結合、α１，２―結合、又はα１，３―結合により重合した多糖鎖である。マンナンタンパク質及びマンナンタンパク質中に含まれるα―マンナンは、いずれも酵母の細胞壁を構成する主要な成分である。
【００１４】
なお、本発明において、酵母由来のマンナンタンパク質、酵母由来のα―マンナンとは、酵母が産生するマンナンタンパク質等であることを意味する。つまり、酵母が産生したものであれば、特に限定されるものではなく、酵母の細胞壁を酵素や化学的処理等により損傷させて分離回収（抽出）したものであってもよく、酵母から培地中に放出されたものを回収したものであってもよい。
【００１５】
本発明において用いられるα―マンナンやマンナンタンパク質を産生する酵母は、α―マンナンやマンナンタンパク質を細胞壁の構成成分とする酵母であれば特に限定されるものではない。例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌、シゾサッカロマイセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属菌、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属菌、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属菌、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属菌、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属菌、ガラクトマイセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属菌、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属菌、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属菌、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属菌、ジゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌等の酵母であってもよい。本発明においては、可食性の酵母であることが好ましく、パン酵母やビール酵母として使用されているものであることがより好ましい。具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、サッカロマイセス・パラドキサス、サッカロマイセス・ミカタエ、サッカロマイセス・バヤヌス、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ、クルイベロマイセス・ラクチス、キャンディダ・ユーティリス、キャンディダ・アルビカンス、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｙｐｏｌｉｔｉｃａ）、キャンディダ・サケ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｋｅ）等であることが好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、サッカロマイセス・パラドキサス、サッカロマイセス・ミカタエ、サッカロマイセス・バヤヌス、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ、クルイベロマイセス・ラクチス、キャンディダ・ユーティリス、キャンディダ・アルビカンスであることがより好ましく、サッカロマイセス・セレビシエであることがさらに好ましい。
【００１６】
酵母からのα―マンナンの抽出は、公知の何れの手法を用いて行ってもよい。酵母からのα―マンナンの抽出方法として、例えば、熱水（希アルカリを含む）抽出法（例えば、特公昭６４−３４７９号公報、特開昭５８−１０９４２３号公報参照。）、自己消化法（例えば、特公昭５８−５７１５３号公報参照。）、細胞壁溶解酵素による酵素消化方法（例えば、特公昭５９−４０１２６号公報参照。）等がある。本発明において用いられるα―マンナンは、これらの方法により酵母から得られたα―マンナン粗抽出物であってもよく、該粗抽出物を適宜精製処理したものであってもよい。該精製処理として、例えば、塩酸等による除タンパク、アルコール沈殿、プロテアーゼ処理、クロマトグラフィー法等がある。
【００１７】
酵母からのマンナンタンパク質の抽出は、公知の何れの手法を用いて行ってもよい。具体的には、例えば、自発的に、又はヒートショック等により培養上清中に放出されたマンナンタンパク質を回収する方法や、酵母を、例えばＳＤＳ等の界面活性剤や、グルカナーゼ等の酵素を用いて処理する方法等により、酵母からマンナンタンパク質を抽出することができる。本発明において用いられるマンナンタンパク質は、α―マンナンと同様に、酵母からの粗抽出物であってもよく、該粗抽出物を、適宜精製処理したものであってもよい。精製処理の方法としては、分子の大きさを指標として精製する方法を用いることが好ましく、ゲルろ過（サイズ排除）クロマトグラフィー法や、限外濾過膜等のフィルターを用いた分画法等を用いることがより好ましい。
【００１８】
但し、マンナンタンパク質は、細胞壁に埋め込まれている等により、非常に細胞壁から抽出し難く、熱処理、酸・アルカリ処理、酵素処理等のいずれの処理を行った場合であっても、十分量の収量を得ることは困難であるが、マンナンタンパク質を培地中に放出し得る酵母変異株を用いることにより、十分量のマンナンタンパク質を酵母から回収することができる。具体的には、このような酵母変異株を常法により培養した後、培地からマンナンタンパク質を精製することにより、酵母が本来持っている状態に近いマンナンタンパク質を、簡便に大量に得ることができる。なお、培地中からのマンナンタンパク質の精製は、前述の酵母からの粗精製物からの精製処理と同様に行うことができる。
【００１９】
マンナンタンパク質を培地中に放出し得る酵母変異株は、例えば、自然界の酵母から、四分子解析（Ｔｅｔｒａｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を行い、培養時の培地中のマンナンタンパク質量が高い酵母株を選抜することにより得ることができる。また、公知の酵母に対して、変異誘発処理を行った後、培養時の培地中のマンナンタンパク質量が高い酵母株を選抜することによっても得ることができる。変異誘発処理は、酵母等の生物が有する遺伝子の一部を変異させ得る処理であれば、特に限定されるものではなく、酵母等の微生物の変異株を作製する場合に通常用いられるいずれの手法を用いて行ってもよい。例えば、変異原として、紫外線、電離放射線、亜硝酸、ニトロソグアニジン、ＥＭＳ（Ｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｕｆｏｎａｔｅ）等を用いて酵母を処理することにより、酵母に変異誘発処理を行うことができる。
【００２０】
本発明においては、マンナンタンパク質を産生する酵母として、糖鎖合成系遺伝子に変異を有し、マンナンタンパク質を培地中に放出する酵母であることが好ましく、α１，２−マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に変異を有し、マンナンタンパク質を培地中に放出する酵母であることがより好ましい。このような酵母変異株は、例えば、国際公開２００６／０２５２９５号パンフレット等に開示の方法により得ることができる。
【００２１】
本発明においては、特に、サッカロマイセス・セレビシエＭＴＹ９（ｇｐｉ１０）株［ＭＡＴα ｇｐｉ１０ ｕｒａ３ ｔｒｐ１］（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３９１）、サッカロマイセス・セレビシエＡＢ９株［ＭＡＴａ／α ｇｐｉ１０／ｇｐｉ１０ ｕｒａ３／ＵＲＡ３ ｌｅｕ２／ＬＥＵ２］（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３９０）の培地中から回収されたマンナンタンパク質であることが好ましい。なお、サッカロマイセス・セレビシエＭＴＹ９（ｇｐｉ１０）株とサッカロマイセス・セレビシエＡＢ９株は、いずれも独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１）に寄託されている（原寄託の寄託日：２００４年７月１３日、国際寄託への移管日：２００５年８月３日）。
【００２２】
本発明の経口用組成物が適用され得る関節炎は、各種スポーツによりもたらされる障害（打撲、捻挫や肘痛、膝痛等）の急性関節炎であってもよく、慢性関節リウマチ、変形性関節症等の慢性関節炎であってもよい。例えば、急性炎症に対しては、事前に服用していることにより、炎症による浮腫の予防・抑制効果が得られる。一方、慢性炎症に対しては、炎症発生時から服用することにより、炎症による浮腫の抑制効果、関節炎スコアの低値化効果（関節炎病変の抑制効果）等が得られる。特に、マンナンタンパク質を有効成分とする本発明の経口用組成物は、慢性関節炎の初期の浮腫を効果的に抑制することができる。
【００２３】
本発明の経口用組成物が関節炎に対し抗炎症作用を奏する作用機序は不明であるが、一つには、免疫賦活作用が関与していると推察される。但し、免疫反応とは関係が薄いと考えられているカラゲニン浮腫モデルにおいても、本発明の経口用組成物は抗炎症作用を奏することから、免疫賦活作用とは異なる未知の作用効果も有しており、これらの機能の相乗効果により、急性関節炎と慢性関節炎の双方に有効な抗炎症作用が得られていると推察される。
【００２４】
本発明の経口用組成物は、炎症による浮腫や発赤、強直等の症状を抑制・緩解し得るという抗炎症作用を有しているが、重篤な副作用がない。これは、マンナンタンパク質やα―マンナンは、多くの細胞に構成的に存在しているＣＯＸ（シクロオキシゲナーゼ）を阻害せず、マンナンタンパク質等を経口摂取しても、胃酸分泌や胃粘膜保護に関与するＰＧＥ２等のプロスタグランジン類の産生は抑制されないためである。つまり、本発明の経口用組成物は、イブプロフェン等の非ステロイド性抗炎症薬とは異なり、安全に長期間服用することが可能である。例えば、本発明の経口用組成物は、慢性関節炎の緩解を目的として、副作用等の危険を考慮する必要なく、長期間服用することができる。また、毎日摂取することにより、関節炎を予防し得ること、急性関節炎を発症した場合にも症状を軽くすること等が期待できる。
【００２５】
なお、本発明の経口用組成物の有効成分としては、酵母自体の乾燥菌末を用いてもよい。酵母の乾燥菌末中にも、マンナンタンパク質やα―マンナンが含まれているためである。酵母の乾燥菌末は、凍結乾燥法、スプレードライ法、ドラムドライ法等の公知の手法により作製することができる。
【００２６】
本発明の経口用組成物としては、特にマンナンタンパク質を有効成分とすることが好ましい。マンナンタンパク質を有効成分とした場合には、α―マンナンや酵母菌末よりも優れた抗炎症効果を有するためである。マンナンタンパク質のほうがα―マンナンよりも抗炎症作用が高い理由は明らかではないが、マンナンタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、抗炎症効果が低下することから、抗炎症作用を奏するためには、タンパク質にα―マンナン鎖が結合している構造を保持している構造が重要であると推察される。その他、分子量の大きなマンナンタンパク質として経口摂取することにより、より有効な分子として体内に吸収されるのではないかとも推察される。
【００２７】
本発明の経口用組成物は、マンナンタンパク質等の抗炎症作用を阻害しない限り、マンナンタンパク質等に加えて、経口摂取可能な他の成分を含有していてもよい。例えば、ビタミンＥ、Ｃ、パントテン酸等の抗酸化剤、コラーゲン、コンドロイチン（コンドロイチン硫酸）、グルコサミン、ヒアルロン酸等の、関節炎に有効とされている公知の成分を含むこともできる。
【００２８】
本発明の経口用組成物は、その他、乳糖、グルコース、マンニトール、ソルビトール等の糖類、バレイショ、トウモロコシ等のデンプン類、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤等を含んでいてもよい。
【００２９】
本発明の経口用組成物の形態は、経口に適した形態であれば、特に限定されるものではない。有効成分であるマンナンタンパク質やα―マンナンは、水溶性であるため、加工性、製造時の取り扱い性等に優れている。このため、固形剤と液剤とのいずれにも、簡便に適用することができる。例えば、固形剤としては錠剤、ハードカプセル剤、ソフトカプセル剤、丸剤、顆粒剤、液剤としては溶液剤、懸濁剤、シロップ剤等の形態が挙げられる。
【００３０】
また、本発明の経口用組成物中の、マンナンタンパク質、α―マンナン、又は乾燥酵母菌末等の有効成分の量は、マンナンタンパク質等による抗炎症作用が作用効果を奏し得る量であれば、特に限定されるものではなく、原料とするマンナンタンパク質等の種類や精製度合い、形態等を考慮して、適宜決定することができる。
【００３１】
本発明の経口用組成物は、サプリメント等として、単独で経口摂取されるものであってもよく、飲食品に含有させてもよい。本発明の経口用組成物を含有する飲食品は、特に限定されるものではなく、本発明の経口用組成物を有効成分とする機能性食品や食品添加物等であってもよく、一般的な飲食品であってもよい。
【００３２】
本発明の経口用組成物を含有する飲食品の形態は、特に限定されるものではなく、種々の形態をとることができる。飲食品の形態として、例えば、飲料、固形食品、半流動食品、ゲル状食品、錠剤、キャプレット、カプセル剤等が挙げられる。本発明の経口用組成物を含有する飲食品は、本発明の経口用組成物を含有させ、必要に応じて保存料、抗酸化剤、安定化剤、調味料、香料等を適宜配合し、常法により製造することができる。
【００３３】
また、本発明の経口用組成物は、医薬品に含有させてもよい。本発明の経口用組成物を含有する医薬品は、本発明の経口用組成物が有する抗炎症効果を有する経口医薬であれば、特に限定されるものではなく、本発明の経口用組成物のみを有効成分とするものであってもよく、他の薬効成分を有するものであってもよい。
【００３４】
本発明の経口用組成物を含有する医薬品は、経口剤として通常用いられる剤型をとることができる。具体的には経口用組成物の形態で例示した剤型をとることができる。本発明の経口用組成物を含有する医薬品は、本発明の経口用組成物を含有させ、必要に応じて賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色料、ｐＨ調整剤等を適宜配合し、常法により製造することができる。
【００３５】
本発明の経口用組成物、並びに本発明の経口用組成物を含有する飲食品及び医薬品の、一日当たりの好ましい摂取量は、摂取する対象、摂取の形態等の種類、摂取の間隔等の要因に依存して変動するものであるが、一般的に、ヒト成人一人の一日当たりの摂取量は、本発明の経口用組成物中の有効成分であるマンナンタンパク質、α―マンナン、又は乾燥酵母菌末として、約０．０１〜１０ｇであることが好ましく、約０．５〜５ｇであることがより好ましい。また、この一日量を、一度に摂取してもよく、２〜４回に分割して摂取することもできる。
【００３６】
本発明の経口用組成物は、ヒト以外の動物に対しても投与することができ、例えば、家畜用飼料や動物用医薬品等のヒト以外の動物等に摂取される飲食品や医薬等に含有させてもよい。動物に使用する場合の投与量は、特に限定されるものではなく、投与対象の動物の種類、体重、年齢等を考慮して、適宜決定することができる。例えば、本発明の経口用組成物中の有効成分であるマンナンタンパク質、α―マンナン、又は乾燥酵母菌末として、一日当たり約０．０１〜１０ｇ／ｋｇを、一度に又は複数回に分割して摂取させることができる。
【実施例】
【００３７】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、実施例の測定値結果の表中、「ＮＳ」は、有意差がなかったことを示す。また、平均分子量は、多角度光散乱検出器（ＤＡＷＮ−ＥＯＳ；昭光通商（株）製）を用いて測定した。
【００３８】
[製造例１] マンナンタンパク質の製造
サッカロマイセス・セレビシエＡＢ９株を用い、以下の通りマンナンタンパク質を製造した。
−８０℃でグリセロール中に保存していたＡＢ９株を、ＹＰＤ寒天培地上に塗沫して３０℃にて２日間培養した。その後、ＹＰＤ寒天培地一枚分全量に生育した酵母を、１００ｍＬのＹＰＤ添加培地を含む５００ｍＬ容三角フラスコに接種し、３０℃にて、攪拌速度１６０ｒｐｍで２４時間、振盪培養した。なお、ＹＰＤ添加培地とは、ＹＰＤ培地に、グルコース（和光純薬工業（株）製、最終濃度：２０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ（株）製、１０ｇ／Ｌ）、ペプトン（Ｄｉｆｃｏ（株）製、最終濃度：２０ｇ／Ｌ）となるように添加した培地である。
振盪培養にて得られた培養液１００ｍＬを全量、１．４Ｌの基礎培地を含む５Ｌ醗酵槽に接種し、培養温度３０℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍ、培養液ｐＨはアンモニア水を用いて４．５以下にならないよう制御を行いながら、１．５Ｌの流加培地を呼吸商が一定になるよう添加し、流加培地がなくなるまで培養を行った。なお、基礎培地及び流加培地の組成は下記の通りである。
基礎培地：５ｇ／Ｌ グルコース（和光純薬工業（株）製）、０．６ｇ／Ｌ 酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ（株）製）、８ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４（和光純薬工業（株）製）、３ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（和光純薬工業（株）製）、０．５ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（和光純薬工業（株）製）、及び６．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ（株）製）。
流加培地：４００ｇ／Ｌ グルコース（和光純薬工業（株）製）、９ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４（和光純薬工業（株）製）、２．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（和光純薬工業（株）製）、３．５ｇ／Ｌ Ｋ２ＳＯ４（和光純薬工業（株）製）、及び６．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ（株）製）。
得られた培養液を、遠心分離により培養液中の菌体を分離、除去し、得られた培養上清を室温にて、ＭＦ膜（ミリポア（株）製、平膜０．４５μｍ、ＰＶＤＦ（Ｄｕｒａｐｏｒｅ）、 Ｖスクリーン）を用いた精密濾過にて清澄化した後、分画分子量１０，０００ＤａのＵＦ膜（ミリポアペリコン２カセットバイオマックス０１０Ｋ（Ｖスクリーン））を用いた限外濾過にて濃縮、脱塩を行った。さらに、減圧下にて濃縮後、スプレードライヤーＳＤ−１０００（東京理化（株）製）を用いて、入口温度が１６０℃、熱風空気量が０．７５ｍ３／ｍｉｎ、噴霧用空気圧が１００ｋＰａの条件で噴霧乾燥を行うことにより、精製マンナンタンパク質粉末を得た。
得られた精製マンナンタンパク質粉末は、α結合（主鎖α１，６−結合、側鎖α１，３−、α１，２−結合）のマンノースが約８５％、タンパク質約１５％であり、平均分子量が５２０，０００であった。
【００３９】
[製造例２] ビール酵母マンナン（α−マンナン）の製造
ビール酵母マンナンは、特開２００６−１６９５１４号公報（酵母水溶性多糖類、その製造方法、食品添加物および飲食品）に記載の方法に則って作製したものを使用した。
得られたビール酵母マンナンは、α結合（主鎖α１，６−結合、側鎖α１，３−、α１，２−結合）のマンノースが約７０％、ペプチド類約１５％であり、平均分子量が９５，０００であった。
【００４０】
[製造例３] プロテアーゼ処理済マンナンタンパク質の製造
製造例１で製造したマンナンタンパク質を、リン酸バッファー（ｐＨ１０）に溶解した後、最終濃度１％になるようにプロテアーゼ（天野エンザイム（株）製）を添加し、６０℃で１６時間処理した。該処理により得られた溶液を、製造例１と同様に、分画分子量１０，０００ＤａのＵＦ膜を用いて分子量分画後、スプレードライヤーを用いて噴霧乾燥を行うことにより、プロテアーゼ処理済マンナンタンパク質粉末を得た。
得られたプロテアーゼ処理済マンナンタンパク質粉末の平均分子量は１２５，０００であった。
【００４１】
[実施例１]
製造例１で製造したマンナンタンパク質の急性関節炎に対する抗炎症作用を、カラゲニン浮腫モデルを用いて調べた。具体的には、事前に７日間マンナンタンパク質を摂取させたラットにカラゲニンを投与し、浮腫率を調べた。
まず、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ、純正化学（株）製）溶液にマンナンタンパク質を加えて懸濁後、５０、１００及び２００ｍｇ／ｍＬのマンナンタンパク質懸濁液を作製した。また、陽性対照物質としてイブプロフェン（和光純薬工業（株）製）を用いて、０．５％ＣＭＣ溶液にイブプロフェンを加えて懸濁後、３ｍｇ／ｍＬのイブプロフェン懸濁液を作製した。さらに、ラットに投与する１％カラゲニン溶液は、カラゲニン浮腫誘発日（ｄａｙ７）に、λ―カラゲニン（Ｃ３８８９、Ｓｉｇｍａ（株）製）を適当量秤り、生理食塩液を加えて加温させながら溶解させて調製した。
日本エスエルシー（株）より３週齢で購入した雄性ＳＤ系ラット（ＳＰＦ）を約１週間予備飼育して実験に供した。ラットは予備飼育期間及び実験期間を通して室温２４±３℃、相対湿度５５±１５％のＳＰＦバリア飼育室（照明時間７時〜１９時、換気回数１８回／時）で飼育した。ラットは４匹／ケージとし、固形飼料（ＭＦ、オリエンタル酵母工業（株）製）と滅菌蒸留水をそれぞれ自由に与えた。ラットの個体識別にはピクリン酸を被毛に塗布した。なお、ラットの群構成日をｄａｙ０とした。
マンナンタンパク質は、ｄａｙ０〜６及びｄａｙ７のカラゲニン注射の１時間前、合計８回、イブプロフェンはｄａｙ７のカラゲニン注射の３０分前のみ１回、ラット用経口ゾンデを用いて強制経口投与した。動物数は、８匹／群で、群構成は以下のとおり行った。
【００４２】
【表１】
【００４３】
浮腫誘発当日にラットを固定し右後肢足蹠をアルコール綿で消毒し、０．１ｍＬの１％カラゲニン溶液を皮下注射した。その後、一般状態と誘発された浮腫の状態を観察した。
一般状態は、毎日１回症状を観察し、体重は体重計にて測定した。体重測定日はｄａｙ０、４及び７とした。
足容積は、足容積測定装置（ＴＫ−１０５、室町機械（株）製）を使用して、右後肢の容積を浮腫誘発日（ｄａｙ７）に測定した。測定時間は浮腫誘発前、誘発後１、２、３、４及び５時間とした。測定した足容積より、以下の計算式に従って浮腫率（％）を算出した。
浮腫率（％）＝［（誘発後容積−誘発前容積）÷誘発前容積］×１００
【００４４】
得られた体重及び浮腫率（％）は群毎の平均値±標準誤差で示した。陰性対照群（１群）に対する各群の統計的有意を検定するため、解析ソフト（Ｓｔａｔ Ｖｉｅｗ、 Ａｂａｃｕｓ Ｉｎｃ. ＵＳＡ）を用いて分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った後、Ｆｉｓｈｅｒ‘ｓ ＰＬＳＤ法である多重比較検定を行い、群間の比較を行った。統計的有意差はｐ＜０．０５の場合を有意であるとした。
【００４５】
対照群（１群）の体重増加に比べて、マンナンタンパク質投与群（２〜４群）は有意な差を示さず、順調な体重増加を示した。
一般症状の変化においても、マンナンタンパク質投与群（２〜４群）は何等特記すべき一般症状の異常を示さなかった。
【００４６】
足容積から計算した浮腫率を図１に示した。図中、「○」は対照群（１群）、「△」はマンナンタンパク質低用量投与群（２群）、「▲」はマンナンタンパク質中用量投与群（３群）、「●」はマンナンタンパク質高用量投与群（４群）、「□」はイブプロフェン投与群（５群）の測定結果をそれぞれ示している。
対照群（１群）はカラゲニン注射１時間後から浮腫を示し、４時間後にピークの８７．２±２．０％を示した。これに対しマンナンタンパク質投与群（２〜４群）は、４時間後にそれぞれ６６．７±１．８％、４５．２±３．２％及び５０．５±４．０％を示した（いずれもｐ＜０．００１）。マンナンタンパク質投与群（２〜４群）はいずれの測定時間においても浮腫抑制効果を示したが、３群と４群の間の浮腫率に大きな差は認められなかった。また、イブプロフェン投与群（５群）は４時間後に３８．６±２．５％の浮腫率（ｐ＜０．００１）を示した。マンナンタンパク質投与群の浮腫抑制効果に比べて、イブプロフェン投与群の抑制効果がやや強かった。
これらの結果から、マンナンタンパク質が、イブプロフェンと同様に急性関節炎に対する抗炎症作用を有すること、また、イブプロフェンと異なり、毎日継続的に摂取しても健康を損なわず、安全に長期投与が可能であることが明らかである。
【００４７】
[実施例２]
製造例１で製造したマンナンタンパク質と、製造例２で製造したビール酵母マンナンの急性関節炎に対する抗炎症作用を、カラゲニン浮腫モデルを用いて調べた。具体的には、事前に７日間マンナンタンパク質又はビール酵母マンナンを摂取させたラットにカラゲニンを投与し、浮腫率を調べた。
０．５％ＣＭＣ溶液に、マンナンタンパク質、ビール酵母マンナン、又はイブプロフェンをそれぞれ加えて懸濁後、２００ｍｇ／ｍＬのマンナンタンパク質懸濁液、２００ｍｇ／ｍＬのビール酵母マンナン懸濁液、及び３ｍｇ／ｍＬのイブプロフェン懸濁液をそれぞれ調製した。マンナンタンパク質及びビール酵母マンナンはカラゲニン注射の前７日間と注射日の１時間前、合計８回経口投与し、イブプロフェンはカラゲニン注射の３０分前のみ、１回経口投与した。群構成は表２記載のとおり行った。その他の方法は実施例１と同様に行った。
【００４８】
【表２】
【００４９】
対照群（１群）の体重増加に比べて、マンナンタンパク質投与群（２群）とビール酵母マンナン投与群（３群）は有意な差を示さず、順調な体重増加を示した。
一般症状の変化においても、マンナンタンパク質投与群（２群）とビール酵母マンナン投与群（３群）は何等特記すべき一般症状の異常を示さなかった。
【００５０】
足容積から計算した浮腫率を図２に示した。図中、「○」は対照群（１群）、「●」はマンナンタンパク質投与群（２群）、「△」はビール酵母マンナン投与群（３群）、「□」はイブプロフェン投与群（４群）の測定結果をそれぞれ示している。
対照群（１群）はカラゲニン注射１時間後から浮腫を示し、５時間後にピークの７１．６±３．３％を示した。これに対しマンナンタンパク質投与群（２群）は、４時間後に４６．８±３．０％を示した（ｐ＜０．００１）。また、ビール酵母マンナン投与群（３群）は、４時間後に５０．２±４．３％を示した（ｐ＜０．０１）。マンナンタンパク質投与群（２群）とビール酵母マンナン投与群（３群）は、いずれの測定時間においても浮腫抑制効果を示した。
また、イブプロフェン投与群は５時間後に４２．０±３．６％の浮腫率（ｐ＜０．００１）を示した。浮腫抑制効果は、イブプロフェン投与群、マンナンタンパク質投与群（２群）、ビール酵母マンナン投与群（３群）の順に強かった。
これらの結果から、ビール酵母マンナンが、マンナンタンパク質やイブプロフェンと同様に急性関節炎に対する抗炎症作用を有すること、また、イブプロフェンと異なり、毎日継続的に摂取しても健康を損なわず、安全に長期投与が可能であることが明らかである。
【００５１】
[実施例３]
製造例１で製造したマンナンタンパク質の急性関節炎に対する抗炎症作用を、カラゲニン浮腫モデルを用いて調べた。具体的には、事前に７日間マンナンタンパク質を摂取させたラットの右後肢足蹠にカラゲニンを投与し、浮腫率と、足蹠中の炎症マーカーの量を調べた。
実施例１と同様にして調製した１００ｍｇ／ｍＬのマンナンタンパク質懸濁液をカラゲニン注射の前７日間と注射日の１時間前、合計８回経口投与し、実施例１と同様にして調製した３ｍｇ／ｍＬのイブプロフェン懸濁液をカラゲニン注射の３０分前のみ、１回経口投与した。ラットは３匹／ケージとした。動物数は６匹／群とし、群構成は表３記載のとおり行った。その他の方法は実施例１と同様に行った。なお、表３中「採材」とは、炎症マーカー量測定のために右後肢足蹠を切断することを意味する。
【００５２】
【表３】
【００５３】
組織中炎症マーカー分析は、足容積を測定直後のラットの右後肢に１０μＭのインドメタシン（和光純薬工業（株）製）溶液０．１ｍＬを皮下投与した。その後、ラットをエーテル麻酔下で放血致死させ、踝から下の部位を切断した。あらかじめ１５ｍＬの遠心管に２０ｍＭアスピリン含有生理食塩液１００μＬ、２０ｕｎｉｔ／ｍＬヘパリン含有生理食塩液２５０μＬを加え、その中に２ｍＬのピペットチップの先端を切ったチップを入れた容器を用意し、ラットの足蹠部位の皮膚に大きく縦１箇所、横３〜５箇所の切開を加え、容器の中にこの足組織をつま先が下になるように入れ、３，０００ｒｐｍで１５分間冷却遠心し浸出液を採取した。回収した浸出液に生理食塩液を加えて全量を１．５ｍＬとし、再度３，０００ｒｐｍで１５分間冷却遠心した上清をサンプルとした。
ＰＧＥ２はＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ ＥＩＡ Ｋｉｔ−Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（株）製）を用い、またＩＬ−６及びＴＮＦαは、ラットＩＬ−６及びラットＴＮＦα測定キット（いずれもＥｎｄｏｇｅｎ（株）製）を用いて 測定した。
【００５４】
対照群（１〜２、５群）の体重増加と同様に、マンナンタンパク質投与群（３、６群）は順調な体重増加を示した。
一般症状の変化においても、マンナンタンパク質投与群は何等特記すべき一般症状の異常を示さなかった。
【００５５】
容積の測定結果及び容積から計算した浮腫率を図３に示した。図中、左カラムが対照群（２又は５群）であり、中カラムがマンナンタンパク質投与群（３又は６群）であり、右カラムがイブプロフェン投与群（３又は７群）の結果である。
対照群の浮腫率は２時間後に５０．０±２．７５％（２群）、４時間後（５群）に７１．０±１．６４％を示した。これに対しマンナンタンパク質投与群は、２時間後に３１．４±０．９０％（３群）、４時間後に４５．０±２．６０％（６群）を示した（いずれもｐ＜０．００１）。マンナンタンパク質はいずれの測定時間においても浮腫抑制効果を示した。また、イブプロフェン投与群は２時間後に１８．６±１．８５％（４群）、４時間後に２１．２±２．２３％（６群）の浮腫率（いずれもｐ＜０．００１）を示し、マンナンタンパク質の浮腫抑制効果に比べて、イブプロフェン投与群の抑制効果が強かった。
【００５６】
足蹠組織中ＰＧＥ２の測定結果を図４に示した。図中、左カラムが対照群（１、２又は５群）であり、中カラムがマンナンタンパク質投与群（３又は６群）であり、右カラムがイブプロフェン投与群（３又は７群）の結果である。
対照群のＰＧＥ２は、浮腫非誘発群（１群）で２７２５±２４７ｐｇ／ｐａｗを示し、浮腫誘発２時間後及び４時間後に、３９５０±４９９ｐｇ／ｐａｗ（２群）(浮腫非誘発群に対するＰ＜０．０５)及び３１０１±３１７ｐｇ／ｐａｗ（５群）に上昇した。マンナンタンパク質投与群のＰＧＥ２は、浮腫誘発２時間後及び４時間後に、４１０７±３２７ｐｇ／ｐａｗ（３群）及び４０１９±４６２ｐｇ／ｐａｗ（６群）を示した。一方、イブプロフェン投与群は、浮腫誘発２時間後及び４時間後に、４５９±１７２ｐｇ／ｐａｗ（４群）及び６８７±１３２ｐｇ／ｐａｗ（７群）を示し、浮腫誘発対照群に比べて有意な抑制を示した（ｐ＜０．００１）。
【００５７】
足蹠組織中ＩＬ−６の測定結果を図５に示した。図中、左カラムが対照群（１、２又は５群）であり、中カラムがマンナンタンパク質投与群（３又は６群）であり、右カラムがイブプロフェン投与群（３又は７群）の結果である。
対照群のＩＬ−６は、浮腫非誘発群（１群）で１１０８±９７ｐｇ／ｐａｗを示し、浮腫誘発２時間後及び４時間後に、９４２±８８ｐｇ／ｐａｗ（２群）及び８２５７±１７７９ｐｇ／ｐａｗ（５群）(浮腫非誘発群に対するｐ＜０．００１)に上昇した。マンナンタンパク質投与群のＩＬ−６は、浮腫誘発２時間後及び４時間後に、９７９±６１ｐｇ／ｐａｗ（３群）及び４６１５±７２０ｐｇ／ｐａｗ（６群）(浮腫誘発対照群に比べてｐ＜０．０１)を示した。一方、イブプロフェン投与群は、腫誘発２時間後及び４時間後に、６８７±１６２ｐｇ／ｐａｗ（４群）及び６２２３±１３８８ｐｇ／ｐａｗ（７群）を示した。
【００５８】
足蹠組織中ＴＮＦαの測定結果を図６に示した。図中、左カラムが対照群（１、２又は５群）であり、中カラムがマンナンタンパク質投与群（３又は６群）であり、右カラムがイブプロフェン投与群（３又は７群）の結果である。
対照群のＴＮＦαは、浮腫非誘発群（１群）で１２００±２９９ｐｇ／ｐａｗを示し、浮腫誘発２時間後及び４時間後に、１４８１±２５７ｐｇ／ｐａｗ（２群）及び２８１７±８４６ｐｇ／ｐａｗ（５群）(浮腫非誘発群に対するｐ＜０．０５)に上昇した。マンナンタンパク質投与群のＴＮＦαは、浮腫誘発２時間後及び４時間後に、１２７８±１９６ｐｇ／ｐａｗ（３群）及び１９１６±５９８ｐｇ／ｐａｗ（６群）を示した。一方、イブプロフェン投与群は、浮腫誘発２時間後及び４時間後に、１０５３±１４４ｐｇ／ｐａｗ（４群）及び３０１６±９５３ｐｇ／ｐａｗ（７群）を示した。
【００５９】
つまり、マンナンタンパク質投与群では、イブプロフェン投与群と異なり、ＰＧＥ２量は減少していなかったが、炎症マーカーであるＩＬ−６やＴＮＦαは対照群と比べて有意に低下していた。これらの結果から、マンナンタンパク質投与により、ＰＧＥ２量に対し影響を与えることなく、安全に抗炎症効果が得られることが明らかである。
【００６０】
[実施例４]
製造例２で製造したビール酵母マンナンとビール酵母の急性関節炎に対する抗炎症作用を、カラゲニン浮腫モデルを用いて調べた。具体的には、事前に７日間ビール酵母マンナン又はビール酵母を摂取させたラットの右後肢足蹠にカラゲニンを投与し、浮腫率と、足蹠中のＰＧＥ２量を調べた。
ラットに投与するイブプロフェンは、実施例２と同様にして調製したものを用いた。また、ビール酵母は、アサヒフードアンドヘルスケア（株）製の製造専用日本薬局法乾燥酵母を使用した。
ビール酵母マンナン及びビール酵母は１００ｍｇ／ｍＬの懸濁液を実施例２と同様に調製後、カラゲニン注射の前７日間と注射日の１時間前、合計８回経口投与し、イブプロフェンはカラゲニン注射の３０分前のみ、１回経口投与した。ラットは４匹／ケージとした。動物数は８匹／群とし、群構成は表４記載のとおり行った。その他の方法は、体重測定日をｄａｙ０、２、５及び７とした以外は、実施例３と同様に行った。ＰＧＥ２量は、浮腫誘発５時間後に採材して測定した。
【００６１】
【表４】
【００６２】
体重推移において群間による差は認められず、ほぼ同様の推移を示した。
また、浮腫率の結果を図７に示した。図中、「×」は非誘発群（１群）、「○」は対照群（２群）、「●」はビール酵母マンナン投与群（３群）、「▲」はビール酵母投与群（４群）、「□」はイブプロフェン投与群（５群）の測定結果をそれぞれ示している。
非誘発群（１群）では、浮腫が認められず、試験期間を通じてほぼ一定に推移した。対照群（２群）では、カラゲニン誘発３、４及び５時間後の浮腫率は、それぞれ６９．５±２．８％、６６．６±２．１％及び６４．４±１．９％を示し、非誘発群（１群）と比較して統計学的に有意な差が認められた（ｔ検定、ｐ＜０．０１）。ビール酵母マンナン投与群では、カラゲニン誘発３、４及び５時間後の浮腫率は、それぞれ６０．０±２．２％、５２．８±１．８％及び４７．０±２．０％を示し、対照群と比較して４及び５時間後で有意な抑制作用が認められた（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ＜０．０１）。ビール酵母では、カラゲニン誘発３、４及び５時間後の浮腫率は、それぞれ５４．８±３．０％、５０．７±３．５％及び４９．４±２．５％を示し、対照群と比較して３、４及び５時間後で有意な抑制作用が認められた（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ＜０．０１）。イブプロフェンでは、カラゲニン誘発３、４及び５時間後の浮腫率はそれぞれ３９．８±３．２％、３９．１±２．５％及び３８．１±２．３％を示し、対照と比較して２、３、４、５時間後で有意な抑制作用が認められた（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ＜０．０１）。
【００６３】
組織中炎症性マーカーＰＧＥ２の分析結果を図８に示した。非誘発群（１群）では、１．７４±０．２１ｎｇ／ｍＬ、対照群（２群）では６．８５±０．８０ｎｇ／ｍＬを示し、非誘発群と比較して高値を示した。ビール酵母マンナン投与群では、６．７０±０．６７ｎｇ／ｍＬ、ビール酵母投与群では、６．５４±０．５０ｎｇ／ｍＬ、イブプロフェン投与群では、１．４９±０．２１ｎｇ／ｍＬを示し、イブプロフェン群は、対照と比較して統計学的に有意な差が認められた（Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定、ｐ＜０．０１）。
これらの結果から、ビール酵母マンナン及びビール酵母は、マンナンタンパク質と同様に、抗炎症作用を有するが、ＰＧＥ２量を低下させないことが明らかである。
【００６４】
[実施例５]
製造例１で製造したマンナンタンパク質の慢性関節炎に対する抗炎症作用を、アジュバント誘発関節炎モデルを用いて調べた。具体的には、アジュバント投与後のラットに一日一回マンナンタンパク質を投与し、浮腫率等の炎症状態を調べた。
まず、０．５％ＣＭＣ溶液にマンナンタンパク質を加えて懸濁後、１０、５０及び１００ｍｇ／ｍＬのマンナンタンパク質懸濁液を作製した。また、陽性対照物質としてインドメタシン（和光純薬工業（株）製）を用いて、０．５％ＣＭＣ溶液にインドメタシンを加えて懸濁後、０．１ｍｇ／ｍＬのインドメタシン懸濁液を作製した。なお、ラットに対する投与量は体重１００ｇ当り１ｍＬとした。
さらに、ラットに投与するアジュバント溶液は、加熱し死菌としたＭ. ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒａ（和光純薬工業（株）製）を適当量秤り、メノウ乳鉢で微粉末にした後、流動パラフィン（和光純薬工業（株）製）を少しずつ加えて懸濁し、３ｍｇ／ｍＬの懸濁液を作製した。調製はアジュバント感作日に行った。
日本チャールスリバー（株）より８週齢で購入した雌性Ｌｅｗｉｓ系ラット(ＳＰＦ)を７日間予備飼育して実験に供した。ラットは２〜３匹／ケージとし、固形飼料（ＭＦ、オリエンタル酵母工業（株）製）と滅菌脱イオン水をそれぞれ自由に与えた。ラットの個体識別にはピクリン酸を被毛に塗布した。その他の飼育条件は実施例１と同様にして行った。
浮腫誘発当日に、エーテル麻酔下でラットを固定し、右後肢足蹠をアルコール綿で消毒し、０．１ｍＬのアジュバント溶液を右後肢足蹠皮下注射し関節炎を誘発した。なお、誘発日をｄａｙ０とした。
ｄａｙ０〜２２に、一日一回、マンナンタンパク質、インドメタシン又は０．５％ＣＭＣを、ラット用経口ゾンデを用いて強制経口投与した。動物数は、８匹／群で、群構成は表５記載のとおり行った。
【００６５】
【表５】
【００６６】
炎症誘発後、一般状態と誘発された浮腫の状態を観察した。
一般状態は、毎日１回症状を観察し、体重は体重計にて測定した。体重測定日はｄａｙ０、５、９、１４、１９及び２１とした。
体重測定日に、感作部位の右後肢と非感作部位の左後肢の浮腫率を、実施例１と同様にして測定した。また、感作部位の右後肢を除く右前肢、左前肢及び左後肢の発赤、腫脹及び強直の程度を肉眼的に観察し、０〜４点（０：ｎｉｌ、１：ｍｉｌｄ、２：ｍｏｄｅｒａｔｅ、３：ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ−ｓｅｖｅｒｅ、４：ｓｅｖｅｒｅ）のスコアを付けた。さらに、尾の数珠球様硬化、耳介毛細血管の増生、鼻部の汚染についても０（異常なし）又は１点（異常）のスコアを付けた。右前肢、左前肢、左後肢、尾、耳及び鼻のスコアを合計し最高１５点で評価した。
試験終了翌日（ｄａｙ２２）にエーテル吸入麻酔下で、注射器（ヘパリンＮａ添加）を用いて腹部大動脈より採血し、遠心処理後の上層（血漿）部分を−８０℃に保存した。
血漿中のＮＯは、ＮＯ２／ＮＯ３ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＣＩＩ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ（同仁化学（株）製）を用いてＧｒｉｅｓｓ法で測定した。血漿中のＰＧＥ２は、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ ＥＩＡ Ｋｉｔ−Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（株）製）を用いてＥＩＡ法で測定した。
得られた体重、関節炎スコア、足容積測定値は群毎の平均値±標準誤差で示した。対照群（１群）に対する各群の統計的有意を検定するため、実施例１と同様に多重比較検定を行い群間の比較を行った。統計的有意差はｐ＜０．０５の場合を有意であるとした。
【００６７】
関節炎を誘発させたラットの体重は減少傾向を示したが、対照群（２群）に比べ、マンナンタンパク質投与群（３〜５群）とインドメタシン投与群（６群）のいずれも有意な体重変化を示さなかった。
一般状態の観察結果では、インドメタシン投与群（６群）では、長期投与による副作用として胃炎を発症していた。これに対し、マンナンタンパク質投与群（３〜５群）では、対照群（２群）と同様に、関節炎症状以外の異常症状は示さなかった。
【００６８】
一方、関節炎スコアの測定結果を図９に示した。図中、「○」は対照群（２群）、「△」はマンナンタンパク質低用量投与群（３群）、「●」はマンナンタンパク質中用量投与群（４群）、「▲」はマンナンタンパク質高用量投与群（５群）、「□」はイブプロフェン投与群（６群）の測定結果をそれぞれ示している。
Ｄａｙ１４、ｄａｙ１９及びｄａｙ２１のスコア測定で、マンナンタンパク質高用量投与群（５群）及びインドメタシン投与群（６群）は、スコア増加を有意に抑制した（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１又はｐ＜０．００１）。
【００６９】
感作後肢である右後肢の容積（ｍＬ）の測定結果を図１０に示した。図中、「○」は対照群（２群）、「△」はマンナンタンパク質低用量投与群（３群）、「●」はマンナンタンパク質中用量投与群（４群）、「▲」はマンナンタンパク質高用量投与群（５群）、「□」はイブプロフェン投与群（６群）の測定結果をそれぞれ示している。
マンナンタンパク質中用量投与群（４群）は、ｄａｙ５、ｄａｙ９、ｄａｙ１９、及びｄａｙ２１の右後肢の容積増加を有意に抑制した（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１又はｐ＜０．００１)。また、マンナンタンパク質高用量投与群（５群）は、インドメタシン投与群（６群）と同様に、全ての測定時期において、右後肢の容積増加を有意に抑制した（５群：ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１又はｐ＜０．００１、６群：ｐ＜０．００１)。
【００７０】
非感作後肢である左後肢の容積（ｍＬ）の測定結果を図１１に示した。図中、「○」は対照群（２群）、「△」はマンナンタンパク質低用量投与群（３群）、「●」はマンナンタンパク質中用量投与群（４群）、「▲」はマンナンタンパク質高用量投与群（５群）、「□」はイブプロフェン投与群（６群）の測定結果をそれぞれ示している。
マンナンタンパク質低用量投与群（３群）は、ｄａｙ１９及びｄａｙ２１の左後肢の容積増加を有意に抑制した（ｐ＜０．０５)。マンナンタンパク質中用量投与群（４群）は、ｄａｙ２１の左後肢の容積増加を有意に抑制した（ｐ＜０．００１)。また、マンナンタンパク質高用量投与群（５群）は、ｄａｙ１４、ｄａｙ１９、及びｄａｙ２１の左後肢の容積増加を有意に抑制した（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１又はｐ＜０．００１)。一方、インドメタシン投与群（６群）は、ｄａｙ９、ｄａｙ１４、ｄａｙ１９、及びｄａｙ２１の左後肢の容積増加を有意に抑制した（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１又はｐ＜０．００１)。
【００７１】
血漿ＮＯ２−＋ＮＯ３の分析結果を図１２に、血漿ＰＧＥ２の分析結果を図１３に、それぞれ示した。
関節炎を誘発させた対照群（２群）のＮＯ２−＋ＮＯ３は、非誘発群（１群）の１３．０±０．９(μｍｏｌ／Ｌ)に比べ、６５．７±７．１(μｍｏｌ／Ｌ)を示し、顕著な増加を示した（ｐ＜０．００１）。マンナンタンパク質投与群（３〜５群）では、ＮＯ２−＋ＮＯ３の増加に影響は観察されなかった。インドメタシン投与群（６群）では、有意にＮＯ２−＋ＮＯ３の増加が抑制された（ｐ＜０．００１）。
一方、関節炎を誘発させた対照群（２群）のＰＧＥ２量は、非誘発群（１群）の１８０．８±１５．４（ｐｇ／ｍＬ）に比べ、１３４１．２±６３．０（ｐｇ／ｍＬ）を示し、顕著な増加を示した（ｐ＜０．００１）。マンナンタンパク質低用量投与群（３群）とマンナンタンパク質中用量投与群（４群）では、ＰＧＥ２の増加に影響は観察されなかった。マンナンタンパク質高用量投与群（５群）ではＰＧＥ２の増加を１０％程度抑制したが、有意な抑制ではなかった。これに対し、インドメタシン投与群（６群）では顕著な抑制を示した（ｐ＜０．００１）。
これらの結果から、マンナンタンパク質が、インドメタシンと同様に慢性関節炎に対する抗炎症作用を有すること、また、インドメタシンと異なり、血漿ＮＯ２−＋ＮＯ３と血漿ＰＧＥ２に対する影響が小さく、毎日継続的に摂取しても健康を損なわず、安全に長期投与が可能であることが明らかである。
【００７２】
[実施例６]
マンナンタンパク質、マンナンタンパク質のプロテアーゼ処理物、ビール酵母マンナン、及びビール酵母の慢性関節炎に対する抗炎症作用を、アジュバント誘発関節炎モデルを用いて調べた。具体的には、アジュバント投与後のラットに一日一回マンナンタンパク質等を投与し、浮腫率を調べた。
実施例５と同様にして、１００ｍｇ／ｍＬのマンナンタンパク質懸濁液、１００ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼ処理済マンナンタンパク質懸濁液、３ｍｇ／ｍＬのイブプロフェン（和光純薬工業（株）製）懸濁液、１００ｍｇ／ｍＬのビール酵母マンナン懸濁液、１００ｍｇ／ｍＬのビール酵母懸濁液を、それぞれ調製した。なお、ビール酵母マンナンとビール酵母は実施例４で使用したものと同様のものを、プロテアーゼ処理済マンナンタンパク質は製造例３で製造したものを、それぞれ用いた。
また、ラットに投与するアジュバント溶液は、加熱し死菌としたＭ. ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒａ（ＤＩＦＣＯ（株）製）を適当量秤り、メノウ乳鉢で微粉末にした後、流動パラフィン（関東化学（株）製）を少しずつ加えて懸濁し、５ｍｇ／ｍＬの懸濁液を作製した。調製はアジュバント感作日に行った。
日本チャールスリバー（株）より８週齢で購入した雌性Ｌｅｗｉｓ系ラット(ＳＰＦ)を７日間予備飼育して実験に供した。予備飼育及び実験期間を通じ、温度２２±３℃、湿度５０±２０％、換気回数１３〜１７回／時間、照明１２時間（８時〜２０時）の環境下で飼育した。その他の飼育条件は実施例５と同様にして行った。
浮腫誘発当日に、エーテル麻酔下でラットを固定し、左後肢足蹠をアルコール綿で消毒し、０．１ｍＬのアジュバント溶液を左後肢足蹠皮下注射し関節炎を誘発した。なお、誘発日をｄａｙ０とした。
ｄａｙ０〜２２に、一日一回、マンナンタンパク質、プロテアーゼ処理済マンナンタンパク質、ビール酵母マンナン、ビール酵母、イブプロフェン、又は０．５％ＣＭＣを、ラット用経口ゾンデを用いて強制経口投与した。動物数は、８匹／群で、群構成は表６記載のとおり行った。
【００７３】
【表６】
【００７４】
炎症誘発後、一般状態と誘発された浮腫の状態を観察した。
一般状態は、毎日１回症状を観察し、体重は体重計にて測定した。体重測定日はｄａｙ０、５、９、１４、１９及び２１とした。また、体重測定日に、非感作部位の右後肢の浮腫率を、実施例１と同様にして測定した。
【００７５】
関節炎を誘発させた群（２〜７群）の体重は、非誘発群（１群）と比べて、ｄａｙ１４以降有意な低値を示した（ｔ検定、ｐ＜０．０１）。また、その他の誘発群（３〜７群）のいずれも投与物質群間による差は認められず、対照群（２群）とほぼ同様な体重推移を示した。
【００７６】
浮腫率の測定結果を図１４及び図１５に示した。図１５は、ｄａｙ９の浮腫率をグラフ化したものである。図１４中、「×」は非誘発群（１群）、「○」は対照群（２群）、「△」はマンナンタンパク質投与群（３群）、「▽」はプロテアーゼ処理済マンナンタンパク質投与群（４群）、「●」はビール酵母マンナン投与群（５群）、「▲」はビール酵母投与群（６群）、「□」はイブプロフェン投与群（７群）の測定結果をそれぞれ示している。
非誘発群（１群）では、浮腫が認められず、試験期間を通じてほぼ一定に推移したが、対照群（２群）では、ｄａｙ９以降にかけて浮腫率の増加が認められ、ｄａｙ１４、ｄａｙ１９、及びｄａｙ２１において、１５３．４±１２．１％、１６６．２±８．３％、１７０．１±８．２％を示し、非誘発群（１群）と比較して統計学的に有意な差が認められた（ｄａｙ９：ｐ＜０．０５、ｄａｙ１４以降：ｐ＜０．０１）。また、浮腫率の曲線下面積において、１６６２．０±１１９．３（％×日）を示し、非誘発群（１群）と比較して統計学的に有意な差が認められた（ｔ検定、ｐ＜０．０１）。
マンナンタンパク質投与群（３群）では、ｄａｙ９以降にかけて浮腫率の増加が認められ、ｄａｙ１４、ｄａｙ１９、及びｄａｙ２１において、１３６．６±１４．２％、１４４．３±１１．９％、１５２．７±１０．２％を示した。特にｄａｙ９では、プロテアーゼ処理済マンナンタンパク質投与群（４群）やビール酵母マンナン群投与群（５群）よりも低く、イブプロフェン投与群（７群）と同程度の浮腫率を示した。また、浮腫率の曲線下面積において、１３９１．４±９９．４（％×日）を示した。
プロテアーゼ処理済マンナンタンパク質投与群（４群）では、ｄａｙ９以降にかけて浮腫率の増加が認められ、ｄａｙ１４、ｄａｙ１９、及びｄａｙ２１において、１３０．７±４．０％、１６３．７±５．８％、１５４．７±４．２％を示した。また、浮腫率の曲線下面積において、１４８８．３±５８．８（％×日）を示した。
ビール酵母マンナン群投与群（５群）では、ｄａｙ９以降にかけて浮腫率の増加が認められ、ｄａｙ１４、ｄａｙ１９、及びｄａｙ２１において、１２７．８±１６．２％、１３２．３±１２．６％、１４０．９±１１．７％を示した。また、浮腫率の曲線下面積において、１３５３．３±１４６．２（％×日）を示した。
ビール酵母投与群（６群）では、ｄａｙ９以降にかけて浮腫率の増加が認められ、ｄａｙ１４、ｄａｙ１９、及びｄａｙ２１において、１２８．７±８．７％、１４５．１±１０．６％、１５１．９±９．５％を示した。また、浮腫率の曲線下面積において、１４０６．１±１０８．１（％×日）を示した。
一方、イブプロフェン投与群（７群）では、ｄａｙ９以降にかけて浮腫率の増加が認められ、ｄａｙ１４、ｄａｙ１９、及びｄａｙ２１において、８２．７±８．０％、９３．３±５．０％、９５．３±５．１％を示した。また、ｄａｙ１４、ｄａｙ１９、及びｄａｙ２１において、対照群（２群）と比較して有意な低値が認められた（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ＜０．０１）。また、浮腫率の曲線下面積において、８９２．３±６５．５（％×日）を示し、対照群（２群）と比較して統計学的に有意な差が認められた（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ＜０．０１）。
これらの結果から、ビール酵母マンナン及びビール酵母も、マンナンタンパク質と同様に慢性関節炎に対し抗炎症作用を有することが明らかである。特に、ｄａｙ９においては、ビール酵母マンナンやビール酵母よりも、マンナンタンパク質のほうが優れた抗炎症作用を有していたことから、初期の浮腫に対して、マンナンタンパク質が特に有効であることが示唆された。
一方、マンナンタンパク質をプロテアーゼ処理した場合には、処理前よりも抗炎症作用が低下することから、マンナンタンパク質として経口摂取することが、良好な抗炎症効果を得るためには重要であることも明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の経口用組成物は、重篤な副作用がなく、長期服用が可能であって、慢性関節炎だけではなく急性関節炎にも抗炎症作用を有するものであり、特に関節炎の予防又は治療の分野で利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】実施例１において、足容積から計算した浮腫率を示した図である。
【図２】実施例２において、足容積から計算した浮腫率を示した図である。
【図３】実施例３において、足容積から計算した浮腫率を示した図である。
【図４】実施例３において、足蹠組織中のＰＧＥ２量の測定結果を示した図である。
【図５】実施例３において、足蹠組織中のＩＬ−６量の測定結果を示した図である。
【図６】実施例３において、足蹠組織中のＴＮＦα量の測定結果を示した図である。
【図７】実施例４において、足容積から計算した浮腫率を示した図である。
【図８】実施例４において、足蹠組織中のＰＧＥ２量の測定結果を示した図である。
【図９】実施例５において、関節炎スコアの測定結果を示した図である。
【図１０】実施例５において、感作後肢である右後肢の容積の測定結果を示した図である。
【図１１】実施例５において、非感作後肢である左後肢の容積の測定結果を示した図である。
【図１２】実施例５において、血漿ＮＯ２−＋ＮＯ３の分析結果を示した図である。
【図１３】実施例５において、血漿ＰＧＥ２の分析結果を示した図である。
【図１４】実施例６において、足容積から計算した浮腫率を示した図である。
【図１５】実施例６において、ｄａｙ９の浮腫率をグラフ化した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節炎に対する抗炎症作用を有する経口用組成物、並びに該経口用組成物を含有する飲食品及び医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節炎は、関節に生じる炎症性疾患であり、浮腫、発赤、強直、疼痛、発熱等の症状があり、重症の場合には運動障害を生ずる場合がある。関節炎には様々な病態があり、また、その発症機序も病態ごとに異なる。例えば、関節炎は、関節リウマチ、痛風、細菌による化膿、外傷、急性炎症のスポーツ障害による捻挫・関節痛等の様々な原因で発症し、発症原因の特定が困難な場合もある。関節炎の患者数は多く、また、高齢化に従い、今後ますます増加すると予想されている。
【０００３】
現在、関節炎に対する急性炎症や慢性炎症の治療には、抗炎症薬の服用が一般的である。抗炎症薬は、デキサメタゾン等のステロイド性抗炎症薬と、アスピリン、インドメタシン、ジクロフェナク、イブプロフェン等の非ステロイド性抗炎症薬の２種に大別される。ステロイド性抗炎症薬は、他のステロイド剤と同様に長期服用には適しておらず、一方、非ステロイド性抗炎症薬にも、胃粘膜や腎臓等の組織に炎症を引き起こす等の副作用があり、長期服用は困難となる場合が多い。このため、重篤な副作用がなく、長期服用可能な治療剤や予防剤等の開発が強く望まれている。
【０００４】
このように、長期服用が可能であって、関節炎に有効である物質の一つにグルコサミンがある。グルコサミンは天然のアミノ糖であり、Ｎ−アセチル体として特にキチンやプロテオグリカン中に存在する。高濃度のグルコサミンを経口投与したアジュバント誘発関節炎ラットでは、関節の浮腫が抑制され、関節炎スコアが低くなることが報告されている（例えば非特許文献１参照。）。なお、アジュバント誘発関節炎ラットは、リウマチ等の慢性関節炎のモデル動物の１種である。
【０００５】
その他、やはり長期服用が可能であって、関節炎に有効であると考えられているものに、乾燥ビール酵母がある。乾燥ビール酵母を経口投与したコラーゲン誘導関節炎マウスでは、関節炎病変が抑制され、関節炎スコアが低くなることが報告されている（例えば非特許文献２参照。）。なお、コラーゲン誘導関節炎マウスは、アジュバント誘発関節炎と同様、リウマチ等の慢性関節炎のモデル動物の１種である。
【０００６】
また、（１）マンノース−６−ホスフェート等の糖燐酸若しくはそのエステル誘導体又はホスホマンノース残基を含有する、前記の燐酸含有オリゴ糖若しくは多糖又はそれらのエステル誘導体を含み、マンノースホスフェートレセプターの天然配位子の拮抗質又は拮抗阻害剤である、動物又は人間の患者の抗炎症治療用及び（又は）細胞媒介過敏症治療用の医療用又は獣医学的組成物も開示されている（例えば、特許文献１参照。）。特に特許文献１には、該組成物が、ヒトの多発性硬化症に似た動物の中枢神経の炎症の一つであるラットの実験的アレルギー性脳髄膜炎や、ラットのアジュバント誘発関節炎に対して抑制効果を有することが記載されている。
【非特許文献１】Ｊ．Ｈｕａ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５年、第５４巻、第１２７〜１３２ページ。
【非特許文献２】細田ら、日本家政学会誌、２０００年、第５１巻、第６号、第４７３〜４７９ページ。
【特許文献１】特許第３００９１６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
グルコサミンは、機能性食品としてサプリメント等の形態で広く使用されているが、関節炎の抗炎症効果としては十分であるとは言い難い。さらに、急性関節炎に対する抗炎症効果はない。
【０００８】
同様に、乾燥ビール酵母や上記（１）の組成物も、やはり慢性関節炎に対する効果の報告はあるものの、急性関節炎に対する抗炎症効果は不明である。
特に乾燥ビール酵母では、腸管免疫系に対し何らかの影響を及ぼすために関節炎が抑制されているとの示唆はあるが、酵母の乾燥菌末を投与しているため、酵母中のどの成分が有効成分として機能しているのかは不明である。
【０００９】
本発明は、重篤な副作用がなく、長期服用が可能であって、慢性関節炎だけではなく急性関節炎にも抗炎症作用を有する経口用組成物、並びに該経口用組成物を含有する飲食品及び医薬品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、酵母由来のマンナンタンパク質、酵母由来のα―マンナン、及びこれらを含有している酵母の乾燥菌末を経口摂取することにより、浮腫等の関節炎の症状が緩和されること、及び、これらのマンナンタンパク質等は、慢性関節炎と急性関節炎の両方に対して有効であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、酵母由来のマンナンタンパク質、酵母由来のα―マンナン、及び酵母の乾燥菌末からなる群より選択される１以上を有効成分とし、関節炎に対する抗炎症作用を有することを特徴とする経口用組成物を提供するものである。
また、本発明は、酵母由来のマンナンタンパク質を有効成分とすることを特徴とする前記記載の経口用組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記関節炎が急性関節炎であることを特徴とする前記いずれか記載の経口用組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記酵母が糖鎖合成系遺伝子に変異を有し、マンナンタンパク質を培地中に放出する酵母であることを特徴とする前記いずれか記載の経口用組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記変異型糖鎖合成系遺伝子が、α１，２−マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする前記記載の経口用組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記酵母が、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、サッカロマイセス・パラドキサス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、サッカロマイセス・ミカタエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍｉｋａｔａｅ）、サッカロマイセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）からなる群より選択されることを特徴とする前記いずれか記載の経口用組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記酵母が、サッカロマイセス・セレビシエＭＴＹ９（ｇｐｉ１０）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３９１）又はサッカロマイセス・セレビシエＡＢ９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３９０）であることを特徴とする前記いずれか記載の経口用組成物を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載の経口用組成物を含有することを特徴とする飲食品又は医薬品を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の経口用組成物は、従来の抗炎症剤とは異なり、重篤な副作用を有さないため、安全に長期間服用することができる、抗炎症性物質である。また、発症機序の異なる急性関節炎と慢性関節炎の両方に対して抗炎症作用を奏し得る組成物である。毎日服用することも可能であるため、飲食品としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の経口用組成物は、酵母由来のマンナンタンパク質、酵母由来のα―マンナン、及び酵母の乾燥菌末からなる群より選択される１以上を有効成分とし、関節炎に対する抗炎症作用を有することを特徴とする。本発明において、α―マンナンとは、α１，６―結合、α１，２―結合、又はα１，３―結合からなるＤ−マンノースの重合体であり、水溶性多糖類である。一方、マンナンタンパク質とは、酵母の細胞壁に局在するタンパク質に、Ｎ−グリコシド結合又はＯ−グリコシド結合により、１又は２以上のα―マンナン鎖が結合した水溶性の糖タンパク質を意味する。ここで、α―マンナン鎖とは、Ｄ−マンノースがα１，６―結合、α１，２―結合、又はα１，３―結合により重合した多糖鎖である。マンナンタンパク質及びマンナンタンパク質中に含まれるα―マンナンは、いずれも酵母の細胞壁を構成する主要な成分である。
【００１４】
なお、本発明において、酵母由来のマンナンタンパク質、酵母由来のα―マンナンとは、酵母が産生するマンナンタンパク質等であることを意味する。つまり、酵母が産生したものであれば、特に限定されるものではなく、酵母の細胞壁を酵素や化学的処理等により損傷させて分離回収（抽出）したものであってもよく、酵母から培地中に放出されたものを回収したものであってもよい。
【００１５】
本発明において用いられるα―マンナンやマンナンタンパク質を産生する酵母は、α―マンナンやマンナンタンパク質を細胞壁の構成成分とする酵母であれば特に限定されるものではない。例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌、シゾサッカロマイセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属菌、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属菌、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属菌、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属菌、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属菌、ガラクトマイセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属菌、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属菌、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属菌、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属菌、ジゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌等の酵母であってもよい。本発明においては、可食性の酵母であることが好ましく、パン酵母やビール酵母として使用されているものであることがより好ましい。具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、サッカロマイセス・パラドキサス、サッカロマイセス・ミカタエ、サッカロマイセス・バヤヌス、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ、クルイベロマイセス・ラクチス、キャンディダ・ユーティリス、キャンディダ・アルビカンス、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｙｐｏｌｉｔｉｃａ）、キャンディダ・サケ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｋｅ）等であることが好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、サッカロマイセス・パラドキサス、サッカロマイセス・ミカタエ、サッカロマイセス・バヤヌス、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ、クルイベロマイセス・ラクチス、キャンディダ・ユーティリス、キャンディダ・アルビカンスであることがより好ましく、サッカロマイセス・セレビシエであることがさらに好ましい。
【００１６】
酵母からのα―マンナンの抽出は、公知の何れの手法を用いて行ってもよい。酵母からのα―マンナンの抽出方法として、例えば、熱水（希アルカリを含む）抽出法（例えば、特公昭６４−３４７９号公報、特開昭５８−１０９４２３号公報参照。）、自己消化法（例えば、特公昭５８−５７１５３号公報参照。）、細胞壁溶解酵素による酵素消化方法（例えば、特公昭５９−４０１２６号公報参照。）等がある。本発明において用いられるα―マンナンは、これらの方法により酵母から得られたα―マンナン粗抽出物であってもよく、該粗抽出物を適宜精製処理したものであってもよい。該精製処理として、例えば、塩酸等による除タンパク、アルコール沈殿、プロテアーゼ処理、クロマトグラフィー法等がある。
【００１７】
酵母からのマンナンタンパク質の抽出は、公知の何れの手法を用いて行ってもよい。具体的には、例えば、自発的に、又はヒートショック等により培養上清中に放出されたマンナンタンパク質を回収する方法や、酵母を、例えばＳＤＳ等の界面活性剤や、グルカナーゼ等の酵素を用いて処理する方法等により、酵母からマンナンタンパク質を抽出することができる。本発明において用いられるマンナンタンパク質は、α―マンナンと同様に、酵母からの粗抽出物であってもよく、該粗抽出物を、適宜精製処理したものであってもよい。精製処理の方法としては、分子の大きさを指標として精製する方法を用いることが好ましく、ゲルろ過（サイズ排除）クロマトグラフィー法や、限外濾過膜等のフィルターを用いた分画法等を用いることがより好ましい。
【００１８】
但し、マンナンタンパク質は、細胞壁に埋め込まれている等により、非常に細胞壁から抽出し難く、熱処理、酸・アルカリ処理、酵素処理等のいずれの処理を行った場合であっても、十分量の収量を得ることは困難であるが、マンナンタンパク質を培地中に放出し得る酵母変異株を用いることにより、十分量のマンナンタンパク質を酵母から回収することができる。具体的には、このような酵母変異株を常法により培養した後、培地からマンナンタンパク質を精製することにより、酵母が本来持っている状態に近いマンナンタンパク質を、簡便に大量に得ることができる。なお、培地中からのマンナンタンパク質の精製は、前述の酵母からの粗精製物からの精製処理と同様に行うことができる。
【００１９】
マンナンタンパク質を培地中に放出し得る酵母変異株は、例えば、自然界の酵母から、四分子解析（Ｔｅｔｒａｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を行い、培養時の培地中のマンナンタンパク質量が高い酵母株を選抜することにより得ることができる。また、公知の酵母に対して、変異誘発処理を行った後、培養時の培地中のマンナンタンパク質量が高い酵母株を選抜することによっても得ることができる。変異誘発処理は、酵母等の生物が有する遺伝子の一部を変異させ得る処理であれば、特に限定されるものではなく、酵母等の微生物の変異株を作製する場合に通常用いられるいずれの手法を用いて行ってもよい。例えば、変異原として、紫外線、電離放射線、亜硝酸、ニトロソグアニジン、ＥＭＳ（Ｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｕｆｏｎａｔｅ）等を用いて酵母を処理することにより、酵母に変異誘発処理を行うことができる。
【００２０】
本発明においては、マンナンタンパク質を産生する酵母として、糖鎖合成系遺伝子に変異を有し、マンナンタンパク質を培地中に放出する酵母であることが好ましく、α１，２−マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に変異を有し、マンナンタンパク質を培地中に放出する酵母であることがより好ましい。このような酵母変異株は、例えば、国際公開２００６／０２５２９５号パンフレット等に開示の方法により得ることができる。
【００２１】
本発明においては、特に、サッカロマイセス・セレビシエＭＴＹ９（ｇｐｉ１０）株［ＭＡＴα ｇｐｉ１０ ｕｒａ３ ｔｒｐ１］（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３９１）、サッカロマイセス・セレビシエＡＢ９株［ＭＡＴａ／α ｇｐｉ１０／ｇｐｉ１０ ｕｒａ３／ＵＲＡ３ ｌｅｕ２／ＬＥＵ２］（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３９０）の培地中から回収されたマンナンタンパク質であることが好ましい。なお、サッカロマイセス・セレビシエＭＴＹ９（ｇｐｉ１０）株とサッカロマイセス・セレビシエＡＢ９株は、いずれも独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１）に寄託されている（原寄託の寄託日：２００４年７月１３日、国際寄託への移管日：２００５年８月３日）。
【００２２】
本発明の経口用組成物が適用され得る関節炎は、各種スポーツによりもたらされる障害（打撲、捻挫や肘痛、膝痛等）の急性関節炎であってもよく、慢性関節リウマチ、変形性関節症等の慢性関節炎であってもよい。例えば、急性炎症に対しては、事前に服用していることにより、炎症による浮腫の予防・抑制効果が得られる。一方、慢性炎症に対しては、炎症発生時から服用することにより、炎症による浮腫の抑制効果、関節炎スコアの低値化効果（関節炎病変の抑制効果）等が得られる。特に、マンナンタンパク質を有効成分とする本発明の経口用組成物は、慢性関節炎の初期の浮腫を効果的に抑制することができる。
【００２３】
本発明の経口用組成物が関節炎に対し抗炎症作用を奏する作用機序は不明であるが、一つには、免疫賦活作用が関与していると推察される。但し、免疫反応とは関係が薄いと考えられているカラゲニン浮腫モデルにおいても、本発明の経口用組成物は抗炎症作用を奏することから、免疫賦活作用とは異なる未知の作用効果も有しており、これらの機能の相乗効果により、急性関節炎と慢性関節炎の双方に有効な抗炎症作用が得られていると推察される。
【００２４】
本発明の経口用組成物は、炎症による浮腫や発赤、強直等の症状を抑制・緩解し得るという抗炎症作用を有しているが、重篤な副作用がない。これは、マンナンタンパク質やα―マンナンは、多くの細胞に構成的に存在しているＣＯＸ（シクロオキシゲナーゼ）を阻害せず、マンナンタンパク質等を経口摂取しても、胃酸分泌や胃粘膜保護に関与するＰＧＥ２等のプロスタグランジン類の産生は抑制されないためである。つまり、本発明の経口用組成物は、イブプロフェン等の非ステロイド性抗炎症薬とは異なり、安全に長期間服用することが可能である。例えば、本発明の経口用組成物は、慢性関節炎の緩解を目的として、副作用等の危険を考慮する必要なく、長期間服用することができる。また、毎日摂取することにより、関節炎を予防し得ること、急性関節炎を発症した場合にも症状を軽くすること等が期待できる。
【００２５】
なお、本発明の経口用組成物の有効成分としては、酵母自体の乾燥菌末を用いてもよい。酵母の乾燥菌末中にも、マンナンタンパク質やα―マンナンが含まれているためである。酵母の乾燥菌末は、凍結乾燥法、スプレードライ法、ドラムドライ法等の公知の手法により作製することができる。
【００２６】
本発明の経口用組成物としては、特にマンナンタンパク質を有効成分とすることが好ましい。マンナンタンパク質を有効成分とした場合には、α―マンナンや酵母菌末よりも優れた抗炎症効果を有するためである。マンナンタンパク質のほうがα―マンナンよりも抗炎症作用が高い理由は明らかではないが、マンナンタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、抗炎症効果が低下することから、抗炎症作用を奏するためには、タンパク質にα―マンナン鎖が結合している構造を保持している構造が重要であると推察される。その他、分子量の大きなマンナンタンパク質として経口摂取することにより、より有効な分子として体内に吸収されるのではないかとも推察される。
【００２７】
本発明の経口用組成物は、マンナンタンパク質等の抗炎症作用を阻害しない限り、マンナンタンパク質等に加えて、経口摂取可能な他の成分を含有していてもよい。例えば、ビタミンＥ、Ｃ、パントテン酸等の抗酸化剤、コラーゲン、コンドロイチン（コンドロイチン硫酸）、グルコサミン、ヒアルロン酸等の、関節炎に有効とされている公知の成分を含むこともできる。
【００２８】
本発明の経口用組成物は、その他、乳糖、グルコース、マンニトール、ソルビトール等の糖類、バレイショ、トウモロコシ等のデンプン類、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤等を含んでいてもよい。
【００２９】
本発明の経口用組成物の形態は、経口に適した形態であれば、特に限定されるものではない。有効成分であるマンナンタンパク質やα―マンナンは、水溶性であるため、加工性、製造時の取り扱い性等に優れている。このため、固形剤と液剤とのいずれにも、簡便に適用することができる。例えば、固形剤としては錠剤、ハードカプセル剤、ソフトカプセル剤、丸剤、顆粒剤、液剤としては溶液剤、懸濁剤、シロップ剤等の形態が挙げられる。
【００３０】
また、本発明の経口用組成物中の、マンナンタンパク質、α―マンナン、又は乾燥酵母菌末等の有効成分の量は、マンナンタンパク質等による抗炎症作用が作用効果を奏し得る量であれば、特に限定されるものではなく、原料とするマンナンタンパク質等の種類や精製度合い、形態等を考慮して、適宜決定することができる。
【００３１】
本発明の経口用組成物は、サプリメント等として、単独で経口摂取されるものであってもよく、飲食品に含有させてもよい。本発明の経口用組成物を含有する飲食品は、特に限定されるものではなく、本発明の経口用組成物を有効成分とする機能性食品や食品添加物等であってもよく、一般的な飲食品であってもよい。
【００３２】
本発明の経口用組成物を含有する飲食品の形態は、特に限定されるものではなく、種々の形態をとることができる。飲食品の形態として、例えば、飲料、固形食品、半流動食品、ゲル状食品、錠剤、キャプレット、カプセル剤等が挙げられる。本発明の経口用組成物を含有する飲食品は、本発明の経口用組成物を含有させ、必要に応じて保存料、抗酸化剤、安定化剤、調味料、香料等を適宜配合し、常法により製造することができる。
【００３３】
また、本発明の経口用組成物は、医薬品に含有させてもよい。本発明の経口用組成物を含有する医薬品は、本発明の経口用組成物が有する抗炎症効果を有する経口医薬であれば、特に限定されるものではなく、本発明の経口用組成物のみを有効成分とするものであってもよく、他の薬効成分を有するものであってもよい。
【００３４】
本発明の経口用組成物を含有する医薬品は、経口剤として通常用いられる剤型をとることができる。具体的には経口用組成物の形態で例示した剤型をとることができる。本発明の経口用組成物を含有する医薬品は、本発明の経口用組成物を含有させ、必要に応じて賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色料、ｐＨ調整剤等を適宜配合し、常法により製造することができる。
【００３５】
本発明の経口用組成物、並びに本発明の経口用組成物を含有する飲食品及び医薬品の、一日当たりの好ましい摂取量は、摂取する対象、摂取の形態等の種類、摂取の間隔等の要因に依存して変動するものであるが、一般的に、ヒト成人一人の一日当たりの摂取量は、本発明の経口用組成物中の有効成分であるマンナンタンパク質、α―マンナン、又は乾燥酵母菌末として、約０．０１〜１０ｇであることが好ましく、約０．５〜５ｇであることがより好ましい。また、この一日量を、一度に摂取してもよく、２〜４回に分割して摂取することもできる。
【００３６】
本発明の経口用組成物は、ヒト以外の動物に対しても投与することができ、例えば、家畜用飼料や動物用医薬品等のヒト以外の動物等に摂取される飲食品や医薬等に含有させてもよい。動物に使用する場合の投与量は、特に限定されるものではなく、投与対象の動物の種類、体重、年齢等を考慮して、適宜決定することができる。例えば、本発明の経口用組成物中の有効成分であるマンナンタンパク質、α―マンナン、又は乾燥酵母菌末として、一日当たり約０．０１〜１０ｇ／ｋｇを、一度に又は複数回に分割して摂取させることができる。
【実施例】
【００３７】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、実施例の測定値結果の表中、「ＮＳ」は、有意差がなかったことを示す。また、平均分子量は、多角度光散乱検出器（ＤＡＷＮ−ＥＯＳ；昭光通商（株）製）を用いて測定した。
【００３８】
[製造例１] マンナンタンパク質の製造
サッカロマイセス・セレビシエＡＢ９株を用い、以下の通りマンナンタンパク質を製造した。
−８０℃でグリセロール中に保存していたＡＢ９株を、ＹＰＤ寒天培地上に塗沫して３０℃にて２日間培養した。その後、ＹＰＤ寒天培地一枚分全量に生育した酵母を、１００ｍＬのＹＰＤ添加培地を含む５００ｍＬ容三角フラスコに接種し、３０℃にて、攪拌速度１６０ｒｐｍで２４時間、振盪培養した。なお、ＹＰＤ添加培地とは、ＹＰＤ培地に、グルコース（和光純薬工業（株）製、最終濃度：２０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ（株）製、１０ｇ／Ｌ）、ペプトン（Ｄｉｆｃｏ（株）製、最終濃度：２０ｇ／Ｌ）となるように添加した培地である。
振盪培養にて得られた培養液１００ｍＬを全量、１．４Ｌの基礎培地を含む５Ｌ醗酵槽に接種し、培養温度３０℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍ、培養液ｐＨはアンモニア水を用いて４．５以下にならないよう制御を行いながら、１．５Ｌの流加培地を呼吸商が一定になるよう添加し、流加培地がなくなるまで培養を行った。なお、基礎培地及び流加培地の組成は下記の通りである。
基礎培地：５ｇ／Ｌ グルコース（和光純薬工業（株）製）、０．６ｇ／Ｌ 酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ（株）製）、８ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４（和光純薬工業（株）製）、３ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（和光純薬工業（株）製）、０．５ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（和光純薬工業（株）製）、及び６．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ（株）製）。
流加培地：４００ｇ／Ｌ グルコース（和光純薬工業（株）製）、９ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４（和光純薬工業（株）製）、２．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（和光純薬工業（株）製）、３．５ｇ／Ｌ Ｋ２ＳＯ４（和光純薬工業（株）製）、及び６．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ（株）製）。
得られた培養液を、遠心分離により培養液中の菌体を分離、除去し、得られた培養上清を室温にて、ＭＦ膜（ミリポア（株）製、平膜０．４５μｍ、ＰＶＤＦ（Ｄｕｒａｐｏｒｅ）、 Ｖスクリーン）を用いた精密濾過にて清澄化した後、分画分子量１０，０００ＤａのＵＦ膜（ミリポアペリコン２カセットバイオマックス０１０Ｋ（Ｖスクリーン））を用いた限外濾過にて濃縮、脱塩を行った。さらに、減圧下にて濃縮後、スプレードライヤーＳＤ−１０００（東京理化（株）製）を用いて、入口温度が１６０℃、熱風空気量が０．７５ｍ３／ｍｉｎ、噴霧用空気圧が１００ｋＰａの条件で噴霧乾燥を行うことにより、精製マンナンタンパク質粉末を得た。
得られた精製マンナンタンパク質粉末は、α結合（主鎖α１，６−結合、側鎖α１，３−、α１，２−結合）のマンノースが約８５％、タンパク質約１５％であり、平均分子量が５２０，０００であった。
【００３９】
[製造例２] ビール酵母マンナン（α−マンナン）の製造
ビール酵母マンナンは、特開２００６−１６９５１４号公報（酵母水溶性多糖類、その製造方法、食品添加物および飲食品）に記載の方法に則って作製したものを使用した。
得られたビール酵母マンナンは、α結合（主鎖α１，６−結合、側鎖α１，３−、α１，２−結合）のマンノースが約７０％、ペプチド類約１５％であり、平均分子量が９５，０００であった。
【００４０】
[製造例３] プロテアーゼ処理済マンナンタンパク質の製造
製造例１で製造したマンナンタンパク質を、リン酸バッファー（ｐＨ１０）に溶解した後、最終濃度１％になるようにプロテアーゼ（天野エンザイム（株）製）を添加し、６０℃で１６時間処理した。該処理により得られた溶液を、製造例１と同様に、分画分子量１０，０００ＤａのＵＦ膜を用いて分子量分画後、スプレードライヤーを用いて噴霧乾燥を行うことにより、プロテアーゼ処理済マンナンタンパク質粉末を得た。
得られたプロテアーゼ処理済マンナンタンパク質粉末の平均分子量は１２５，０００であった。
【００４１】
[実施例１]
製造例１で製造したマンナンタンパク質の急性関節炎に対する抗炎症作用を、カラゲニン浮腫モデルを用いて調べた。具体的には、事前に７日間マンナンタンパク質を摂取させたラットにカラゲニンを投与し、浮腫率を調べた。
まず、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ、純正化学（株）製）溶液にマンナンタンパク質を加えて懸濁後、５０、１００及び２００ｍｇ／ｍＬのマンナンタンパク質懸濁液を作製した。また、陽性対照物質としてイブプロフェン（和光純薬工業（株）製）を用いて、０．５％ＣＭＣ溶液にイブプロフェンを加えて懸濁後、３ｍｇ／ｍＬのイブプロフェン懸濁液を作製した。さらに、ラットに投与する１％カラゲニン溶液は、カラゲニン浮腫誘発日（ｄａｙ７）に、λ―カラゲニン（Ｃ３８８９、Ｓｉｇｍａ（株）製）を適当量秤り、生理食塩液を加えて加温させながら溶解させて調製した。
日本エスエルシー（株）より３週齢で購入した雄性ＳＤ系ラット（ＳＰＦ）を約１週間予備飼育して実験に供した。ラットは予備飼育期間及び実験期間を通して室温２４±３℃、相対湿度５５±１５％のＳＰＦバリア飼育室（照明時間７時〜１９時、換気回数１８回／時）で飼育した。ラットは４匹／ケージとし、固形飼料（ＭＦ、オリエンタル酵母工業（株）製）と滅菌蒸留水をそれぞれ自由に与えた。ラットの個体識別にはピクリン酸を被毛に塗布した。なお、ラットの群構成日をｄａｙ０とした。
マンナンタンパク質は、ｄａｙ０〜６及びｄａｙ７のカラゲニン注射の１時間前、合計８回、イブプロフェンはｄａｙ７のカラゲニン注射の３０分前のみ１回、ラット用経口ゾンデを用いて強制経口投与した。動物数は、８匹／群で、群構成は以下のとおり行った。
【００４２】
【表１】
【００４３】
浮腫誘発当日にラットを固定し右後肢足蹠をアルコール綿で消毒し、０．１ｍＬの１％カラゲニン溶液を皮下注射した。その後、一般状態と誘発された浮腫の状態を観察した。
一般状態は、毎日１回症状を観察し、体重は体重計にて測定した。体重測定日はｄａｙ０、４及び７とした。
足容積は、足容積測定装置（ＴＫ−１０５、室町機械（株）製）を使用して、右後肢の容積を浮腫誘発日（ｄａｙ７）に測定した。測定時間は浮腫誘発前、誘発後１、２、３、４及び５時間とした。測定した足容積より、以下の計算式に従って浮腫率（％）を算出した。
浮腫率（％）＝［（誘発後容積−誘発前容積）÷誘発前容積］×１００
【００４４】
得られた体重及び浮腫率（％）は群毎の平均値±標準誤差で示した。陰性対照群（１群）に対する各群の統計的有意を検定するため、解析ソフト（Ｓｔａｔ Ｖｉｅｗ、 Ａｂａｃｕｓ Ｉｎｃ. ＵＳＡ）を用いて分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った後、Ｆｉｓｈｅｒ‘ｓ ＰＬＳＤ法である多重比較検定を行い、群間の比較を行った。統計的有意差はｐ＜０．０５の場合を有意であるとした。
【００４５】
対照群（１群）の体重増加に比べて、マンナンタンパク質投与群（２〜４群）は有意な差を示さず、順調な体重増加を示した。
一般症状の変化においても、マンナンタンパク質投与群（２〜４群）は何等特記すべき一般症状の異常を示さなかった。
【００４６】
足容積から計算した浮腫率を図１に示した。図中、「○」は対照群（１群）、「△」はマンナンタンパク質低用量投与群（２群）、「▲」はマンナンタンパク質中用量投与群（３群）、「●」はマンナンタンパク質高用量投与群（４群）、「□」はイブプロフェン投与群（５群）の測定結果をそれぞれ示している。
対照群（１群）はカラゲニン注射１時間後から浮腫を示し、４時間後にピークの８７．２±２．０％を示した。これに対しマンナンタンパク質投与群（２〜４群）は、４時間後にそれぞれ６６．７±１．８％、４５．２±３．２％及び５０．５±４．０％を示した（いずれもｐ＜０．００１）。マンナンタンパク質投与群（２〜４群）はいずれの測定時間においても浮腫抑制効果を示したが、３群と４群の間の浮腫率に大きな差は認められなかった。また、イブプロフェン投与群（５群）は４時間後に３８．６±２．５％の浮腫率（ｐ＜０．００１）を示した。マンナンタンパク質投与群の浮腫抑制効果に比べて、イブプロフェン投与群の抑制効果がやや強かった。
これらの結果から、マンナンタンパク質が、イブプロフェンと同様に急性関節炎に対する抗炎症作用を有すること、また、イブプロフェンと異なり、毎日継続的に摂取しても健康を損なわず、安全に長期投与が可能であることが明らかである。
【００４７】
[実施例２]
製造例１で製造したマンナンタンパク質と、製造例２で製造したビール酵母マンナンの急性関節炎に対する抗炎症作用を、カラゲニン浮腫モデルを用いて調べた。具体的には、事前に７日間マンナンタンパク質又はビール酵母マンナンを摂取させたラットにカラゲニンを投与し、浮腫率を調べた。
０．５％ＣＭＣ溶液に、マンナンタンパク質、ビール酵母マンナン、又はイブプロフェンをそれぞれ加えて懸濁後、２００ｍｇ／ｍＬのマンナンタンパク質懸濁液、２００ｍｇ／ｍＬのビール酵母マンナン懸濁液、及び３ｍｇ／ｍＬのイブプロフェン懸濁液をそれぞれ調製した。マンナンタンパク質及びビール酵母マンナンはカラゲニン注射の前７日間と注射日の１時間前、合計８回経口投与し、イブプロフェンはカラゲニン注射の３０分前のみ、１回経口投与した。群構成は表２記載のとおり行った。その他の方法は実施例１と同様に行った。
【００４８】
【表２】
【００４９】
対照群（１群）の体重増加に比べて、マンナンタンパク質投与群（２群）とビール酵母マンナン投与群（３群）は有意な差を示さず、順調な体重増加を示した。
一般症状の変化においても、マンナンタンパク質投与群（２群）とビール酵母マンナン投与群（３群）は何等特記すべき一般症状の異常を示さなかった。
【００５０】
足容積から計算した浮腫率を図２に示した。図中、「○」は対照群（１群）、「●」はマンナンタンパク質投与群（２群）、「△」はビール酵母マンナン投与群（３群）、「□」はイブプロフェン投与群（４群）の測定結果をそれぞれ示している。
対照群（１群）はカラゲニン注射１時間後から浮腫を示し、５時間後にピークの７１．６±３．３％を示した。これに対しマンナンタンパク質投与群（２群）は、４時間後に４６．８±３．０％を示した（ｐ＜０．００１）。また、ビール酵母マンナン投与群（３群）は、４時間後に５０．２±４．３％を示した（ｐ＜０．０１）。マンナンタンパク質投与群（２群）とビール酵母マンナン投与群（３群）は、いずれの測定時間においても浮腫抑制効果を示した。
また、イブプロフェン投与群は５時間後に４２．０±３．６％の浮腫率（ｐ＜０．００１）を示した。浮腫抑制効果は、イブプロフェン投与群、マンナンタンパク質投与群（２群）、ビール酵母マンナン投与群（３群）の順に強かった。
これらの結果から、ビール酵母マンナンが、マンナンタンパク質やイブプロフェンと同様に急性関節炎に対する抗炎症作用を有すること、また、イブプロフェンと異なり、毎日継続的に摂取しても健康を損なわず、安全に長期投与が可能であることが明らかである。
【００５１】
[実施例３]
製造例１で製造したマンナンタンパク質の急性関節炎に対する抗炎症作用を、カラゲニン浮腫モデルを用いて調べた。具体的には、事前に７日間マンナンタンパク質を摂取させたラットの右後肢足蹠にカラゲニンを投与し、浮腫率と、足蹠中の炎症マーカーの量を調べた。
実施例１と同様にして調製した１００ｍｇ／ｍＬのマンナンタンパク質懸濁液をカラゲニン注射の前７日間と注射日の１時間前、合計８回経口投与し、実施例１と同様にして調製した３ｍｇ／ｍＬのイブプロフェン懸濁液をカラゲニン注射の３０分前のみ、１回経口投与した。ラットは３匹／ケージとした。動物数は６匹／群とし、群構成は表３記載のとおり行った。その他の方法は実施例１と同様に行った。なお、表３中「採材」とは、炎症マーカー量測定のために右後肢足蹠を切断することを意味する。
【００５２】
【表３】
【００５３】
組織中炎症マーカー分析は、足容積を測定直後のラットの右後肢に１０μＭのインドメタシン（和光純薬工業（株）製）溶液０．１ｍＬを皮下投与した。その後、ラットをエーテル麻酔下で放血致死させ、踝から下の部位を切断した。あらかじめ１５ｍＬの遠心管に２０ｍＭアスピリン含有生理食塩液１００μＬ、２０ｕｎｉｔ／ｍＬヘパリン含有生理食塩液２５０μＬを加え、その中に２ｍＬのピペットチップの先端を切ったチップを入れた容器を用意し、ラットの足蹠部位の皮膚に大きく縦１箇所、横３〜５箇所の切開を加え、容器の中にこの足組織をつま先が下になるように入れ、３，０００ｒｐｍで１５分間冷却遠心し浸出液を採取した。回収した浸出液に生理食塩液を加えて全量を１．５ｍＬとし、再度３，０００ｒｐｍで１５分間冷却遠心した上清をサンプルとした。
ＰＧＥ２はＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ ＥＩＡ Ｋｉｔ−Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（株）製）を用い、またＩＬ−６及びＴＮＦαは、ラットＩＬ−６及びラットＴＮＦα測定キット（いずれもＥｎｄｏｇｅｎ（株）製）を用いて 測定した。
【００５４】
対照群（１〜２、５群）の体重増加と同様に、マンナンタンパク質投与群（３、６群）は順調な体重増加を示した。
一般症状の変化においても、マンナンタンパク質投与群は何等特記すべき一般症状の異常を示さなかった。
【００５５】
容積の測定結果及び容積から計算した浮腫率を図３に示した。図中、左カラムが対照群（２又は５群）であり、中カラムがマンナンタンパク質投与群（３又は６群）であり、右カラムがイブプロフェン投与群（３又は７群）の結果である。
対照群の浮腫率は２時間後に５０．０±２．７５％（２群）、４時間後（５群）に７１．０±１．６４％を示した。これに対しマンナンタンパク質投与群は、２時間後に３１．４±０．９０％（３群）、４時間後に４５．０±２．６０％（６群）を示した（いずれもｐ＜０．００１）。マンナンタンパク質はいずれの測定時間においても浮腫抑制効果を示した。また、イブプロフェン投与群は２時間後に１８．６±１．８５％（４群）、４時間後に２１．２±２．２３％（６群）の浮腫率（いずれもｐ＜０．００１）を示し、マンナンタンパク質の浮腫抑制効果に比べて、イブプロフェン投与群の抑制効果が強かった。
【００５６】
足蹠組織中ＰＧＥ２の測定結果を図４に示した。図中、左カラムが対照群（１、２又は５群）であり、中カラムがマンナンタンパク質投与群（３又は６群）であり、右カラムがイブプロフェン投与群（３又は７群）の結果である。
対照群のＰＧＥ２は、浮腫非誘発群（１群）で２７２５±２４７ｐｇ／ｐａｗを示し、浮腫誘発２時間後及び４時間後に、３９５０±４９９ｐｇ／ｐａｗ（２群）(浮腫非誘発群に対するＰ＜０．０５)及び３１０１±３１７ｐｇ／ｐａｗ（５群）に上昇した。マンナンタンパク質投与群のＰＧＥ２は、浮腫誘発２時間後及び４時間後に、４１０７±３２７ｐｇ／ｐａｗ（３群）及び４０１９±４６２ｐｇ／ｐａｗ（６群）を示した。一方、イブプロフェン投与群は、浮腫誘発２時間後及び４時間後に、４５９±１７２ｐｇ／ｐａｗ（４群）及び６８７±１３２ｐｇ／ｐａｗ（７群）を示し、浮腫誘発対照群に比べて有意な抑制を示した（ｐ＜０．００１）。
【００５７】
足蹠組織中ＩＬ−６の測定結果を図５に示した。図中、左カラムが対照群（１、２又は５群）であり、中カラムがマンナンタンパク質投与群（３又は６群）であり、右カラムがイブプロフェン投与群（３又は７群）の結果である。
対照群のＩＬ−６は、浮腫非誘発群（１群）で１１０８±９７ｐｇ／ｐａｗを示し、浮腫誘発２時間後及び４時間後に、９４２±８８ｐｇ／ｐａｗ（２群）及び８２５７±１７７９ｐｇ／ｐａｗ（５群）(浮腫非誘発群に対するｐ＜０．００１)に上昇した。マンナンタンパク質投与群のＩＬ−６は、浮腫誘発２時間後及び４時間後に、９７９±６１ｐｇ／ｐａｗ（３群）及び４６１５±７２０ｐｇ／ｐａｗ（６群）(浮腫誘発対照群に比べてｐ＜０．０１)を示した。一方、イブプロフェン投与群は、腫誘発２時間後及び４時間後に、６８７±１６２ｐｇ／ｐａｗ（４群）及び６２２３±１３８８ｐｇ／ｐａｗ（７群）を示した。
【００５８】
足蹠組織中ＴＮＦαの測定結果を図６に示した。図中、左カラムが対照群（１、２又は５群）であり、中カラムがマンナンタンパク質投与群（３又は６群）であり、右カラムがイブプロフェン投与群（３又は７群）の結果である。
対照群のＴＮＦαは、浮腫非誘発群（１群）で１２００±２９９ｐｇ／ｐａｗを示し、浮腫誘発２時間後及び４時間後に、１４８１±２５７ｐｇ／ｐａｗ（２群）及び２８１７±８４６ｐｇ／ｐａｗ（５群）(浮腫非誘発群に対するｐ＜０．０５)に上昇した。マンナンタンパク質投与群のＴＮＦαは、浮腫誘発２時間後及び４時間後に、１２７８±１９６ｐｇ／ｐａｗ（３群）及び１９１６±５９８ｐｇ／ｐａｗ（６群）を示した。一方、イブプロフェン投与群は、浮腫誘発２時間後及び４時間後に、１０５３±１４４ｐｇ／ｐａｗ（４群）及び３０１６±９５３ｐｇ／ｐａｗ（７群）を示した。
【００５９】
つまり、マンナンタンパク質投与群では、イブプロフェン投与群と異なり、ＰＧＥ２量は減少していなかったが、炎症マーカーであるＩＬ−６やＴＮＦαは対照群と比べて有意に低下していた。これらの結果から、マンナンタンパク質投与により、ＰＧＥ２量に対し影響を与えることなく、安全に抗炎症効果が得られることが明らかである。
【００６０】
[実施例４]
製造例２で製造したビール酵母マンナンとビール酵母の急性関節炎に対する抗炎症作用を、カラゲニン浮腫モデルを用いて調べた。具体的には、事前に７日間ビール酵母マンナン又はビール酵母を摂取させたラットの右後肢足蹠にカラゲニンを投与し、浮腫率と、足蹠中のＰＧＥ２量を調べた。
ラットに投与するイブプロフェンは、実施例２と同様にして調製したものを用いた。また、ビール酵母は、アサヒフードアンドヘルスケア（株）製の製造専用日本薬局法乾燥酵母を使用した。
ビール酵母マンナン及びビール酵母は１００ｍｇ／ｍＬの懸濁液を実施例２と同様に調製後、カラゲニン注射の前７日間と注射日の１時間前、合計８回経口投与し、イブプロフェンはカラゲニン注射の３０分前のみ、１回経口投与した。ラットは４匹／ケージとした。動物数は８匹／群とし、群構成は表４記載のとおり行った。その他の方法は、体重測定日をｄａｙ０、２、５及び７とした以外は、実施例３と同様に行った。ＰＧＥ２量は、浮腫誘発５時間後に採材して測定した。
【００６１】
【表４】
【００６２】
体重推移において群間による差は認められず、ほぼ同様の推移を示した。
また、浮腫率の結果を図７に示した。図中、「×」は非誘発群（１群）、「○」は対照群（２群）、「●」はビール酵母マンナン投与群（３群）、「▲」はビール酵母投与群（４群）、「□」はイブプロフェン投与群（５群）の測定結果をそれぞれ示している。
非誘発群（１群）では、浮腫が認められず、試験期間を通じてほぼ一定に推移した。対照群（２群）では、カラゲニン誘発３、４及び５時間後の浮腫率は、それぞれ６９．５±２．８％、６６．６±２．１％及び６４．４±１．９％を示し、非誘発群（１群）と比較して統計学的に有意な差が認められた（ｔ検定、ｐ＜０．０１）。ビール酵母マンナン投与群では、カラゲニン誘発３、４及び５時間後の浮腫率は、それぞれ６０．０±２．２％、５２．８±１．８％及び４７．０±２．０％を示し、対照群と比較して４及び５時間後で有意な抑制作用が認められた（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ＜０．０１）。ビール酵母では、カラゲニン誘発３、４及び５時間後の浮腫率は、それぞれ５４．８±３．０％、５０．７±３．５％及び４９．４±２．５％を示し、対照群と比較して３、４及び５時間後で有意な抑制作用が認められた（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ＜０．０１）。イブプロフェンでは、カラゲニン誘発３、４及び５時間後の浮腫率はそれぞれ３９．８±３．２％、３９．１±２．５％及び３８．１±２．３％を示し、対照と比較して２、３、４、５時間後で有意な抑制作用が認められた（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ＜０．０１）。
【００６３】
組織中炎症性マーカーＰＧＥ２の分析結果を図８に示した。非誘発群（１群）では、１．７４±０．２１ｎｇ／ｍＬ、対照群（２群）では６．８５±０．８０ｎｇ／ｍＬを示し、非誘発群と比較して高値を示した。ビール酵母マンナン投与群では、６．７０±０．６７ｎｇ／ｍＬ、ビール酵母投与群では、６．５４±０．５０ｎｇ／ｍＬ、イブプロフェン投与群では、１．４９±０．２１ｎｇ／ｍＬを示し、イブプロフェン群は、対照と比較して統計学的に有意な差が認められた（Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定、ｐ＜０．０１）。
これらの結果から、ビール酵母マンナン及びビール酵母は、マンナンタンパク質と同様に、抗炎症作用を有するが、ＰＧＥ２量を低下させないことが明らかである。
【００６４】
[実施例５]
製造例１で製造したマンナンタンパク質の慢性関節炎に対する抗炎症作用を、アジュバント誘発関節炎モデルを用いて調べた。具体的には、アジュバント投与後のラットに一日一回マンナンタンパク質を投与し、浮腫率等の炎症状態を調べた。
まず、０．５％ＣＭＣ溶液にマンナンタンパク質を加えて懸濁後、１０、５０及び１００ｍｇ／ｍＬのマンナンタンパク質懸濁液を作製した。また、陽性対照物質としてインドメタシン（和光純薬工業（株）製）を用いて、０．５％ＣＭＣ溶液にインドメタシンを加えて懸濁後、０．１ｍｇ／ｍＬのインドメタシン懸濁液を作製した。なお、ラットに対する投与量は体重１００ｇ当り１ｍＬとした。
さらに、ラットに投与するアジュバント溶液は、加熱し死菌としたＭ. ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒａ（和光純薬工業（株）製）を適当量秤り、メノウ乳鉢で微粉末にした後、流動パラフィン（和光純薬工業（株）製）を少しずつ加えて懸濁し、３ｍｇ／ｍＬの懸濁液を作製した。調製はアジュバント感作日に行った。
日本チャールスリバー（株）より８週齢で購入した雌性Ｌｅｗｉｓ系ラット(ＳＰＦ)を７日間予備飼育して実験に供した。ラットは２〜３匹／ケージとし、固形飼料（ＭＦ、オリエンタル酵母工業（株）製）と滅菌脱イオン水をそれぞれ自由に与えた。ラットの個体識別にはピクリン酸を被毛に塗布した。その他の飼育条件は実施例１と同様にして行った。
浮腫誘発当日に、エーテル麻酔下でラットを固定し、右後肢足蹠をアルコール綿で消毒し、０．１ｍＬのアジュバント溶液を右後肢足蹠皮下注射し関節炎を誘発した。なお、誘発日をｄａｙ０とした。
ｄａｙ０〜２２に、一日一回、マンナンタンパク質、インドメタシン又は０．５％ＣＭＣを、ラット用経口ゾンデを用いて強制経口投与した。動物数は、８匹／群で、群構成は表５記載のとおり行った。
【００６５】
【表５】
【００６６】
炎症誘発後、一般状態と誘発された浮腫の状態を観察した。
一般状態は、毎日１回症状を観察し、体重は体重計にて測定した。体重測定日はｄａｙ０、５、９、１４、１９及び２１とした。
体重測定日に、感作部位の右後肢と非感作部位の左後肢の浮腫率を、実施例１と同様にして測定した。また、感作部位の右後肢を除く右前肢、左前肢及び左後肢の発赤、腫脹及び強直の程度を肉眼的に観察し、０〜４点（０：ｎｉｌ、１：ｍｉｌｄ、２：ｍｏｄｅｒａｔｅ、３：ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ−ｓｅｖｅｒｅ、４：ｓｅｖｅｒｅ）のスコアを付けた。さらに、尾の数珠球様硬化、耳介毛細血管の増生、鼻部の汚染についても０（異常なし）又は１点（異常）のスコアを付けた。右前肢、左前肢、左後肢、尾、耳及び鼻のスコアを合計し最高１５点で評価した。
試験終了翌日（ｄａｙ２２）にエーテル吸入麻酔下で、注射器（ヘパリンＮａ添加）を用いて腹部大動脈より採血し、遠心処理後の上層（血漿）部分を−８０℃に保存した。
血漿中のＮＯは、ＮＯ２／ＮＯ３ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＣＩＩ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ（同仁化学（株）製）を用いてＧｒｉｅｓｓ法で測定した。血漿中のＰＧＥ２は、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ ＥＩＡ Ｋｉｔ−Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（株）製）を用いてＥＩＡ法で測定した。
得られた体重、関節炎スコア、足容積測定値は群毎の平均値±標準誤差で示した。対照群（１群）に対する各群の統計的有意を検定するため、実施例１と同様に多重比較検定を行い群間の比較を行った。統計的有意差はｐ＜０．０５の場合を有意であるとした。
【００６７】
関節炎を誘発させたラットの体重は減少傾向を示したが、対照群（２群）に比べ、マンナンタンパク質投与群（３〜５群）とインドメタシン投与群（６群）のいずれも有意な体重変化を示さなかった。
一般状態の観察結果では、インドメタシン投与群（６群）では、長期投与による副作用として胃炎を発症していた。これに対し、マンナンタンパク質投与群（３〜５群）では、対照群（２群）と同様に、関節炎症状以外の異常症状は示さなかった。
【００６８】
一方、関節炎スコアの測定結果を図９に示した。図中、「○」は対照群（２群）、「△」はマンナンタンパク質低用量投与群（３群）、「●」はマンナンタンパク質中用量投与群（４群）、「▲」はマンナンタンパク質高用量投与群（５群）、「□」はイブプロフェン投与群（６群）の測定結果をそれぞれ示している。
Ｄａｙ１４、ｄａｙ１９及びｄａｙ２１のスコア測定で、マンナンタンパク質高用量投与群（５群）及びインドメタシン投与群（６群）は、スコア増加を有意に抑制した（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１又はｐ＜０．００１）。
【００６９】
感作後肢である右後肢の容積（ｍＬ）の測定結果を図１０に示した。図中、「○」は対照群（２群）、「△」はマンナンタンパク質低用量投与群（３群）、「●」はマンナンタンパク質中用量投与群（４群）、「▲」はマンナンタンパク質高用量投与群（５群）、「□」はイブプロフェン投与群（６群）の測定結果をそれぞれ示している。
マンナンタンパク質中用量投与群（４群）は、ｄａｙ５、ｄａｙ９、ｄａｙ１９、及びｄａｙ２１の右後肢の容積増加を有意に抑制した（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１又はｐ＜０．００１)。また、マンナンタンパク質高用量投与群（５群）は、インドメタシン投与群（６群）と同様に、全ての測定時期において、右後肢の容積増加を有意に抑制した（５群：ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１又はｐ＜０．００１、６群：ｐ＜０．００１)。
【００７０】
非感作後肢である左後肢の容積（ｍＬ）の測定結果を図１１に示した。図中、「○」は対照群（２群）、「△」はマンナンタンパク質低用量投与群（３群）、「●」はマンナンタンパク質中用量投与群（４群）、「▲」はマンナンタンパク質高用量投与群（５群）、「□」はイブプロフェン投与群（６群）の測定結果をそれぞれ示している。
マンナンタンパク質低用量投与群（３群）は、ｄａｙ１９及びｄａｙ２１の左後肢の容積増加を有意に抑制した（ｐ＜０．０５)。マンナンタンパク質中用量投与群（４群）は、ｄａｙ２１の左後肢の容積増加を有意に抑制した（ｐ＜０．００１)。また、マンナンタンパク質高用量投与群（５群）は、ｄａｙ１４、ｄａｙ１９、及びｄａｙ２１の左後肢の容積増加を有意に抑制した（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１又はｐ＜０．００１)。一方、インドメタシン投与群（６群）は、ｄａｙ９、ｄａｙ１４、ｄａｙ１９、及びｄａｙ２１の左後肢の容積増加を有意に抑制した（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１又はｐ＜０．００１)。
【００７１】
血漿ＮＯ２−＋ＮＯ３の分析結果を図１２に、血漿ＰＧＥ２の分析結果を図１３に、それぞれ示した。
関節炎を誘発させた対照群（２群）のＮＯ２−＋ＮＯ３は、非誘発群（１群）の１３．０±０．９(μｍｏｌ／Ｌ)に比べ、６５．７±７．１(μｍｏｌ／Ｌ)を示し、顕著な増加を示した（ｐ＜０．００１）。マンナンタンパク質投与群（３〜５群）では、ＮＯ２−＋ＮＯ３の増加に影響は観察されなかった。インドメタシン投与群（６群）では、有意にＮＯ２−＋ＮＯ３の増加が抑制された（ｐ＜０．００１）。
一方、関節炎を誘発させた対照群（２群）のＰＧＥ２量は、非誘発群（１群）の１８０．８±１５．４（ｐｇ／ｍＬ）に比べ、１３４１．２±６３．０（ｐｇ／ｍＬ）を示し、顕著な増加を示した（ｐ＜０．００１）。マンナンタンパク質低用量投与群（３群）とマンナンタンパク質中用量投与群（４群）では、ＰＧＥ２の増加に影響は観察されなかった。マンナンタンパク質高用量投与群（５群）ではＰＧＥ２の増加を１０％程度抑制したが、有意な抑制ではなかった。これに対し、インドメタシン投与群（６群）では顕著な抑制を示した（ｐ＜０．００１）。
これらの結果から、マンナンタンパク質が、インドメタシンと同様に慢性関節炎に対する抗炎症作用を有すること、また、インドメタシンと異なり、血漿ＮＯ２−＋ＮＯ３と血漿ＰＧＥ２に対する影響が小さく、毎日継続的に摂取しても健康を損なわず、安全に長期投与が可能であることが明らかである。
【００７２】
[実施例６]
マンナンタンパク質、マンナンタンパク質のプロテアーゼ処理物、ビール酵母マンナン、及びビール酵母の慢性関節炎に対する抗炎症作用を、アジュバント誘発関節炎モデルを用いて調べた。具体的には、アジュバント投与後のラットに一日一回マンナンタンパク質等を投与し、浮腫率を調べた。
実施例５と同様にして、１００ｍｇ／ｍＬのマンナンタンパク質懸濁液、１００ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼ処理済マンナンタンパク質懸濁液、３ｍｇ／ｍＬのイブプロフェン（和光純薬工業（株）製）懸濁液、１００ｍｇ／ｍＬのビール酵母マンナン懸濁液、１００ｍｇ／ｍＬのビール酵母懸濁液を、それぞれ調製した。なお、ビール酵母マンナンとビール酵母は実施例４で使用したものと同様のものを、プロテアーゼ処理済マンナンタンパク質は製造例３で製造したものを、それぞれ用いた。
また、ラットに投与するアジュバント溶液は、加熱し死菌としたＭ. ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒａ（ＤＩＦＣＯ（株）製）を適当量秤り、メノウ乳鉢で微粉末にした後、流動パラフィン（関東化学（株）製）を少しずつ加えて懸濁し、５ｍｇ／ｍＬの懸濁液を作製した。調製はアジュバント感作日に行った。
日本チャールスリバー（株）より８週齢で購入した雌性Ｌｅｗｉｓ系ラット(ＳＰＦ)を７日間予備飼育して実験に供した。予備飼育及び実験期間を通じ、温度２２±３℃、湿度５０±２０％、換気回数１３〜１７回／時間、照明１２時間（８時〜２０時）の環境下で飼育した。その他の飼育条件は実施例５と同様にして行った。
浮腫誘発当日に、エーテル麻酔下でラットを固定し、左後肢足蹠をアルコール綿で消毒し、０．１ｍＬのアジュバント溶液を左後肢足蹠皮下注射し関節炎を誘発した。なお、誘発日をｄａｙ０とした。
ｄａｙ０〜２２に、一日一回、マンナンタンパク質、プロテアーゼ処理済マンナンタンパク質、ビール酵母マンナン、ビール酵母、イブプロフェン、又は０．５％ＣＭＣを、ラット用経口ゾンデを用いて強制経口投与した。動物数は、８匹／群で、群構成は表６記載のとおり行った。
【００７３】
【表６】
【００７４】
炎症誘発後、一般状態と誘発された浮腫の状態を観察した。
一般状態は、毎日１回症状を観察し、体重は体重計にて測定した。体重測定日はｄａｙ０、５、９、１４、１９及び２１とした。また、体重測定日に、非感作部位の右後肢の浮腫率を、実施例１と同様にして測定した。
【００７５】
関節炎を誘発させた群（２〜７群）の体重は、非誘発群（１群）と比べて、ｄａｙ１４以降有意な低値を示した（ｔ検定、ｐ＜０．０１）。また、その他の誘発群（３〜７群）のいずれも投与物質群間による差は認められず、対照群（２群）とほぼ同様な体重推移を示した。
【００７６】
浮腫率の測定結果を図１４及び図１５に示した。図１５は、ｄａｙ９の浮腫率をグラフ化したものである。図１４中、「×」は非誘発群（１群）、「○」は対照群（２群）、「△」はマンナンタンパク質投与群（３群）、「▽」はプロテアーゼ処理済マンナンタンパク質投与群（４群）、「●」はビール酵母マンナン投与群（５群）、「▲」はビール酵母投与群（６群）、「□」はイブプロフェン投与群（７群）の測定結果をそれぞれ示している。
非誘発群（１群）では、浮腫が認められず、試験期間を通じてほぼ一定に推移したが、対照群（２群）では、ｄａｙ９以降にかけて浮腫率の増加が認められ、ｄａｙ１４、ｄａｙ１９、及びｄａｙ２１において、１５３．４±１２．１％、１６６．２±８．３％、１７０．１±８．２％を示し、非誘発群（１群）と比較して統計学的に有意な差が認められた（ｄａｙ９：ｐ＜０．０５、ｄａｙ１４以降：ｐ＜０．０１）。また、浮腫率の曲線下面積において、１６６２．０±１１９．３（％×日）を示し、非誘発群（１群）と比較して統計学的に有意な差が認められた（ｔ検定、ｐ＜０．０１）。
マンナンタンパク質投与群（３群）では、ｄａｙ９以降にかけて浮腫率の増加が認められ、ｄａｙ１４、ｄａｙ１９、及びｄａｙ２１において、１３６．６±１４．２％、１４４．３±１１．９％、１５２．７±１０．２％を示した。特にｄａｙ９では、プロテアーゼ処理済マンナンタンパク質投与群（４群）やビール酵母マンナン群投与群（５群）よりも低く、イブプロフェン投与群（７群）と同程度の浮腫率を示した。また、浮腫率の曲線下面積において、１３９１．４±９９．４（％×日）を示した。
プロテアーゼ処理済マンナンタンパク質投与群（４群）では、ｄａｙ９以降にかけて浮腫率の増加が認められ、ｄａｙ１４、ｄａｙ１９、及びｄａｙ２１において、１３０．７±４．０％、１６３．７±５．８％、１５４．７±４．２％を示した。また、浮腫率の曲線下面積において、１４８８．３±５８．８（％×日）を示した。
ビール酵母マンナン群投与群（５群）では、ｄａｙ９以降にかけて浮腫率の増加が認められ、ｄａｙ１４、ｄａｙ１９、及びｄａｙ２１において、１２７．８±１６．２％、１３２．３±１２．６％、１４０．９±１１．７％を示した。また、浮腫率の曲線下面積において、１３５３．３±１４６．２（％×日）を示した。
ビール酵母投与群（６群）では、ｄａｙ９以降にかけて浮腫率の増加が認められ、ｄａｙ１４、ｄａｙ１９、及びｄａｙ２１において、１２８．７±８．７％、１４５．１±１０．６％、１５１．９±９．５％を示した。また、浮腫率の曲線下面積において、１４０６．１±１０８．１（％×日）を示した。
一方、イブプロフェン投与群（７群）では、ｄａｙ９以降にかけて浮腫率の増加が認められ、ｄａｙ１４、ｄａｙ１９、及びｄａｙ２１において、８２．７±８．０％、９３．３±５．０％、９５．３±５．１％を示した。また、ｄａｙ１４、ｄａｙ１９、及びｄａｙ２１において、対照群（２群）と比較して有意な低値が認められた（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ＜０．０１）。また、浮腫率の曲線下面積において、８９２．３±６５．５（％×日）を示し、対照群（２群）と比較して統計学的に有意な差が認められた（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定、ｐ＜０．０１）。
これらの結果から、ビール酵母マンナン及びビール酵母も、マンナンタンパク質と同様に慢性関節炎に対し抗炎症作用を有することが明らかである。特に、ｄａｙ９においては、ビール酵母マンナンやビール酵母よりも、マンナンタンパク質のほうが優れた抗炎症作用を有していたことから、初期の浮腫に対して、マンナンタンパク質が特に有効であることが示唆された。
一方、マンナンタンパク質をプロテアーゼ処理した場合には、処理前よりも抗炎症作用が低下することから、マンナンタンパク質として経口摂取することが、良好な抗炎症効果を得るためには重要であることも明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の経口用組成物は、重篤な副作用がなく、長期服用が可能であって、慢性関節炎だけではなく急性関節炎にも抗炎症作用を有するものであり、特に関節炎の予防又は治療の分野で利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】実施例１において、足容積から計算した浮腫率を示した図である。
【図２】実施例２において、足容積から計算した浮腫率を示した図である。
【図３】実施例３において、足容積から計算した浮腫率を示した図である。
【図４】実施例３において、足蹠組織中のＰＧＥ２量の測定結果を示した図である。
【図５】実施例３において、足蹠組織中のＩＬ−６量の測定結果を示した図である。
【図６】実施例３において、足蹠組織中のＴＮＦα量の測定結果を示した図である。
【図７】実施例４において、足容積から計算した浮腫率を示した図である。
【図８】実施例４において、足蹠組織中のＰＧＥ２量の測定結果を示した図である。
【図９】実施例５において、関節炎スコアの測定結果を示した図である。
【図１０】実施例５において、感作後肢である右後肢の容積の測定結果を示した図である。
【図１１】実施例５において、非感作後肢である左後肢の容積の測定結果を示した図である。
【図１２】実施例５において、血漿ＮＯ２−＋ＮＯ３の分析結果を示した図である。
【図１３】実施例５において、血漿ＰＧＥ２の分析結果を示した図である。
【図１４】実施例６において、足容積から計算した浮腫率を示した図である。
【図１５】実施例６において、ｄａｙ９の浮腫率をグラフ化した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母由来のマンナンタンパク質、酵母由来のα―マンナン、及び酵母の乾燥菌末からなる群より選択される１以上を有効成分とし、関節炎に対する抗炎症作用を有することを特徴とする経口用組成物。
【請求項２】
酵母由来のマンナンタンパク質を有効成分とすることを特徴とする請求項１記載の経口用組成物。
【請求項３】
前記関節炎が急性関節炎であることを特徴とする請求項１又は２記載の経口用組成物。
【請求項４】
前記酵母が糖鎖合成系遺伝子に変異を有し、マンナンタンパク質を培地中に放出する酵母であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の経口用組成物。
【請求項５】
前記変異型糖鎖合成系遺伝子が、α１，２−マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項４記載の経口用組成物。
【請求項６】
前記酵母が、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、サッカロマイセス・パラドキサス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、サッカロマイセス・ミカタエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍｉｋａｔａｅ）、サッカロマイセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の経口用組成物。
【請求項７】
前記酵母が、サッカロマイセス・セレビシエＭＴＹ９（ｇｐｉ１０）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３９１）又はサッカロマイセス・セレビシエＡＢ９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３９０）であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の経口用組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載の経口用組成物を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか記載の経口用組成物を含有することを特徴とする医薬品。
【請求項１】
酵母由来のマンナンタンパク質、酵母由来のα―マンナン、及び酵母の乾燥菌末からなる群より選択される１以上を有効成分とし、関節炎に対する抗炎症作用を有することを特徴とする経口用組成物。
【請求項２】
酵母由来のマンナンタンパク質を有効成分とすることを特徴とする請求項１記載の経口用組成物。
【請求項３】
前記関節炎が急性関節炎であることを特徴とする請求項１又は２記載の経口用組成物。
【請求項４】
前記酵母が糖鎖合成系遺伝子に変異を有し、マンナンタンパク質を培地中に放出する酵母であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の経口用組成物。
【請求項５】
前記変異型糖鎖合成系遺伝子が、α１，２−マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項４記載の経口用組成物。
【請求項６】
前記酵母が、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、サッカロマイセス・パラドキサス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、サッカロマイセス・ミカタエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍｉｋａｔａｅ）、サッカロマイセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の経口用組成物。
【請求項７】
前記酵母が、サッカロマイセス・セレビシエＭＴＹ９（ｇｐｉ１０）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３９１）又はサッカロマイセス・セレビシエＡＢ９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３９０）であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の経口用組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載の経口用組成物を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか記載の経口用組成物を含有することを特徴とする医薬品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２００９−２９８７０２（Ｐ２００９−２９８７０２Ａ）
【公開日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１５１７７０（Ｐ２００８−１５１７７０）
【出願日】平成２０年６月１０日（２００８．６．１０）
【出願人】（０００００００５５）アサヒビール株式会社 (535)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１０日（２００８．６．１０）
【出願人】（０００００００５５）アサヒビール株式会社 (535)
【Ｆターム（参考）】
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