蛍光分析装置
【課題】高精度の測定が可能で、オンサイト分析に適した小型、堅牢な蛍光分析装置を実現する。
【解決手段】蛍光分析装置１は、測定対象に励起光を照射するための励起光源１２、測定対象が発する蛍光を検出する検出器１３、測定対象の励起波長を選択的に透過させる励起光フィルタ１４、励起光成分を除去し、検出器１３への励起光の侵入を避けるために励起光をカットする励起光カットフィルタ１５、測定対象が発する蛍光波長を選択的に透過させる蛍光フィルタ１６を備えており、励起光源１２は励起光の光軸がカートリッジ３０の表面３０ｃに対して傾斜するように配置され、検出器１３は受光面１３ａがカートリッジ３０の励起光照射領域に対向して配置され、受光面１３ａが励起光照射領域よりも大きくなるように構成されている。
【解決手段】蛍光分析装置１は、測定対象に励起光を照射するための励起光源１２、測定対象が発する蛍光を検出する検出器１３、測定対象の励起波長を選択的に透過させる励起光フィルタ１４、励起光成分を除去し、検出器１３への励起光の侵入を避けるために励起光をカットする励起光カットフィルタ１５、測定対象が発する蛍光波長を選択的に透過させる蛍光フィルタ１６を備えており、励起光源１２は励起光の光軸がカートリッジ３０の表面３０ｃに対して傾斜するように配置され、検出器１３は受光面１３ａがカートリッジ３０の励起光照射領域に対向して配置され、受光面１３ａが励起光照射領域よりも大きくなるように構成されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定対象を吸着する吸着剤が充填部に充填されたカートリッジに励起光を照射し、測定対象が発する蛍光の蛍光強度に基づいて定量分析を行う蛍光分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、残留農薬や食品添加物の分析にはガスクロマトグラフ法や液体クロマトグラフ法が用いられてきた。しかし、これらの方法は測定装置が高額であるとともに、測定に時間がかかるため、フィールドなどで使用するオンサイト分析、スクリーニングには適していない。
そこで、これら方法よりも短時間で測定可能な蛍光発光測定法の適用が考えられる。
オンサイト分析を行うために測定時間を短縮するには、蛍光発光分析法を適用することが有効と考えられる。従来の蛍光分析装置（例えば、特許文献１）では、対象物質の励起光及び蛍光波長が解らないケースや測定精度を向上させるため、励起光及び蛍光を分光する分光器を用いている。また、測定対象の蛍光発光領域を小さくし、レンズなどの光学系により集光効率を高めることにより感度向上を図っているため、分析装置の小型化やフィールド等へ持ち運び使用することが困難である。
一方、分析装置を小型化する試みとして、光学系にプリズムを用いた蛍光検出装置（例えば、特許文献２）などが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許４４５０７５０号
【特許文献２】特開２００３−２６３６６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、特許文献２に記載のような技術では、プリズムを用いており角度を持った面へ光学フィルタなどを成膜する構成により、励起光と蛍光を合成分波するため、光学フィルタの角度依存性が測定精度に影響する。また、励起光、蛍光がＰ波、Ｓ波に分離されてしまい、偏光成分を考慮しなければならない。以上のように、十分な測定精度や測定再現性を得ることができないとともに、光学系に高い精度が要求されるため、オンサイトにおける使用に適した堅牢さを保つことが困難である。
【０００５】
そこで、本発明は、高精度の測定が可能で、オンサイト分析に適した小型、堅牢な蛍光分析装置を実現することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明では、上記目的を実現するために、請求項１に記載の発明では、測定対象を吸着する吸着剤が充填部に充填されたカートリッジに励起光を照射し、測定対象が発する蛍光の蛍光強度に基づいて定量分析を行う蛍光分析装置であって、測定対象に励起光を照射する励起光源と、測定対象が発する蛍光を検出する検出器と、励起光源の前方に配置され、測定対象の励起波長を選択的に透過させる励起光フィルタと、検出器の手前に配置され、励起光成分を除去する励起光カットフィルタと、検出器の手前に配置され、測定対象が発する蛍光波長を選択的に透過させる蛍光フィルタと、前記検出器により検出された蛍光の発光強度に基づき対象物質の定量分析を行う定量分析部と、前記励起光源による励起光の照射を制御する励起光制御部と、を備え、前記励起光源による励起光の光軸が、前記カートリッジの表面において励起光が全反射しない角度で前記カートリッジの表面に対して傾斜するように励起光源を配置し、前記検出器に蛍光が入射する受光面は、カートリッジの励起光照射領域に対向して配置され、当該受光面がカートリッジの励起光照射領域よりも大きくなるように構成されている、という技術的手段を用いる。
【０００７】
請求項１に記載の発明によれば、励起光フィルタにより測定対象の励起に有効な励起波長を選択的に照射することができるので、測定精度を向上させることができる。励起光カットフィルタ及び蛍光フィルタを用いることにより、励起光をカットし、測定対象が発した蛍光だけを選択的に検出器に入射させることができる。これにより、分光器を使用しない構成により高精度の測定が可能となり、オンサイト分析に適した小型、堅牢な蛍光分析装置を実現することができる。
また、カートリッジの表面に対して傾斜して励起光を照射するため、吸着剤に対して励起光の照射する面積を拡大することができる。これにより、測定対象の吸着剤による吸着状態に吸着量の多少の分布がある場合でも、局所の測定でなく広い範囲を測定することができるので、測定精度を向上させることができる。
そして、検出器は、受光面がカートリッジの励起光照射領域に対向して配置され、当該受光面がカートリッジの励起光照射領域よりも大きくなるように構成されているため、蛍光を効率よく検出器に入射させることができ、測定精度を向上させることができる。
以上のように、高精度の測定が可能で、オンサイト分析に適した小型、堅牢な蛍光分析装置を実現することができる。
【０００８】
請求項２に記載の発明では、請求項１に記載の蛍光分析装置において、前記励起光源による励起光の光軸が、前記カートリッジの励起光照射領域が前記カートリッジの充填部より広くなる角度で傾斜するように励起光源を配置する、という技術的手段を用いる。
【０００９】
請求項２に記載の発明のように、カートリッジの励起光照射領域がカートリッジの充填部より広くなる角度で傾斜するように励起光源を配置することにより、励起光が照射される吸着剤の量を増大させることができるので、測定精度を更に向上させることができる。
【００１０】
請求項３に記載の発明では、請求項１または請求項２に記載の蛍光分析装置において、前記励起光源として、発光ダイオードまたは半導体レーザを用いる、という技術的手段を用いる。
【００１１】
請求項３に記載の発明のように、励起光として良好な波長特性を有し、小型化が可能な発光ダイオード、半導体レーザを用いることができる。特に、発光ダイオードは広い面積に励起光を照射可能であり、好適に用いることができる。
【００１２】
請求項４に記載の発明では、請求項３に記載の蛍光分析装置において、前記励起光制御部は、前記励起光源による励起光をパルス発光させる、という技術的手段を用いる。
【００１３】
請求項４に記載の発明のように、励起光源に発光ダイオード、半導体レーザを用いる場合には、励起光はパルス発光させることが好ましい。これにより、励起光源の出力を上げ、輝度を向上させることができる。また、連続発光を行うと、励起光源の温度が上昇し、温度特性により励起光のピーク波長が変化し、発光強度が変化することで蛍光の強度に影響を及ぼすことがある。パルス発光では励起光源の温度が上昇しにくいため、このような問題を避けることができる。
【００１４】
請求項５に記載の発明では、請求項４に記載の蛍光分析装置において、前記パルス発光される励起光は矩形波で制御され、前記定量分析部は、励起光発光後に蛍光強度が一定となったときの蛍光強度に基づいて定量分析を行う、という技術的手段を用いる。
【００１５】
パルス光を矩形波で制御すると、蛍光強度は一定値を示すため演算処理が容易であるが、蛍光は励起光照射開始後に数１０ｍｓｅｃ程度遅れて発光するため、請求項５に記載の発明のように、励起光発光後に蛍光強度が一定となったときの蛍光強度に基づいて定量分析を行うことにより測定精度を向上させることができる。
【００１６】
請求項６に記載の発明では、請求項１ないし請求項５のいずれか１つに記載の蛍光分析装置において、励起光及び蛍光に対する透光性を有し、励起光に対して発蛍光性を持たない材料により作製された平坦面を有する基体の内部に、吸着剤を充填保持する充填部と、当該充填部に測定対象を含む溶液の通液及び排出が可能な流路と、が形成されているカートリッジを用い、前記平坦面側から前記充填部に励起光を照射し、蛍光を検出する、という技術的手段を用いる。
【００１７】
請求項６に記載の発明のように構成されたカートリッジでは、平坦面側から充填部に励起光を照射し、蛍光を検出する、つまり、励起光を照射する励起光照射領域及び蛍光を検出するための蛍光検出領域が平坦面となるため、励起光の受光効率を高くすることができるとともに、蛍光が広がりにくく検出器による検出効率を高くすることができるので、測定精度を向上させるために好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】蛍光分析装置の概略構成を示す説明図である。
【図２】蛍光分析装置の装置本体の構造を示す説明図である。図２（Ａ）は透視説明図、図２（Ｂ）は図２（Ａ）のＡ−Ａ矢視断面図である。
【図３】蛍光分析装置に取り付けて使用するカートリッジの構造を示す説明図である。図３（Ａ）は励起光を照射する面を見た平面図、図３（Ｂ）は図３（Ａ）のＢ−Ｂ矢視断面図である。
【図４】充填部、照射窓及び受光面の位置関係、面積の関係の一例を示す説明図である。
【図５】蛍光強度の測定方法を示す説明図である。
【図６】カートリッジの変更例を示す説明図である。図６（Ａ）は長手方向の断面図、図６（Ｂ）は図６（Ａ）を図中左方向から見た平面図である。
【図７】実施例の測定で検出された蛍光プロファイルを示す説明図である。
【図８】実施例の測定結果と高速液体クロマトグラフィー−質量分析法による定量結果とを比較する説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明に係る蛍光分析装置について、図を参照して説明する。
【００２０】
本発明の蛍光分析装置１は、図１に示すように、装置本体１０と制御装置２０とからなる。制御装置２０は、パーソナルコンピュータなどにより構成され、検出器１３により検出された蛍光の発光強度に基づき対象物質の定量分析、例えば濃度の算出を行う定量分析部２１と、励起光源１２による励起光の照射を制御する励起光制御部２２と、を備えている。
【００２１】
装置本体１０は、図２に示すように、筐体１１の内部に、測定対象に励起光を照射するための励起光源１２、測定対象が発する蛍光を検出する検出器１３、励起光フィルタ１４、励起光カットフィルタ１５、蛍光フィルタ１６を備えている。なお、図２では、説明のため、透視図を用い内部構造を示しているが、測定時には筐体１１の内部は視認することができない。
【００２２】
筐体１１には、励起光及び蛍光を透光可能な材料からなり、測定対象を吸着固定する吸着剤が充填されたカートリッジ３０が取り付けられる。カートリッジ３０を構成する材料としては、ガラス、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、透明塩化ビニル（ＰＶＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、フッ素樹脂などを使用することができ、検出する光の波長や使用溶媒への耐性などを考慮して適宜選択することができる。ここで、検出器１３において検出される蛍光のうち、バックグランドを増大させる蛍光を低減させるためには、励起光に対して発蛍光性を持たないことが好ましい。上記材料のうち、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）は、低蛍光性、光透過性が高く好ましい。
【００２３】
本実施形態では、カートリッジ３０は平板状のＰＭＭＡにより形成され、図３に示すように、本体内部に、吸着剤３１を充填保持する充填部３０ａと、充填部３０ａに試料溶液の導入及び洗浄液の排出が可能とするための流路３０ｂと、が形成されている。ここで、充填部３０ａが励起光を照射する励起光照射領域及び蛍光を検出するための蛍光検出領域となる。
充填部３０ａは吸着剤３１全体に励起光が照射され受光効率が高くなるように、例えば、厚さが１０ｍｍ以下に、薄く形成されている。一方、吸着剤３１の量は、測定対象の吸着量に関係し、少ないと十分な量の測定対象を吸着できず分析感度の低下を招く。そこで、測定対象を十分に吸着するために、必要量の吸着剤を充填できるように、面積が十分に広く形成されている。励起光照射領域及び蛍光検出領域は、十分な面積を有する平坦面となるため、励起光の受光効率を高くすることができるとともに、蛍光が広がりにくく検出器１３による検出効率を高くすることができる。
本実施形態では、充填部３０ａは１辺５ｍｍの６角形状で、面積７５ｍｍ２、深さ１．６ｍｍ、容積１２０ｍｍ３となるように形成した。
【００２４】
図２に示すように、筐体１１には、カートリッジ３０を固定するホルダ１１ａ、励起光源１２を固定する励起光源固定部１１ｂ、検出器１３を固定する検出器固定部１１ｃ、励起光源１２から照射される励起光及び測定対象が発光する蛍光の光路である照射室１１ｄ及びカートリッジ３０に励起光を照射するための照射窓１１ｅが設けられている。
本実施形態では、筐体１１は、アルミニウム合金を加工したブロックにより作製され、照射室１１ｄなどの内面には励起光により蛍光発光しない材料により黒塗装が施されている。これにより、励起光の迷光及び外光の散乱によるバックグラウンド光増に起因する測定精度の低下を防ぐことができる。
【００２５】
励起光源１２は、励起光の光軸がカートリッジ３０の表面３０ｃに対して傾斜し、筐体１１に固定されたカートリッジ３０の充填部３０ａに、充填部３０ａへの垂線から傾斜した方向から励起光を照射できるように励起光源固定部１１ｂに配置されている。本実施形態では、励起光源１２は、励起光源１２の光軸が充填部３０ａの中心部を向くように配置されている。
【００２６】
励起光源１２としては、小型で、励起光の波長幅を狭くすることができ、広い面積に励起光を照射可能な発光ダイオード（ＬＥＤ）を好適に用いることができる。ここで、励起光源１２としてＬＥＤを用いる場合、励起光制御部２２により励起光をパルス光として照射することができる。本実施形態では、励起光源１２として紫外線ＬＥＤを用いる。
【００２７】
励起光源１２の光軸のカートリッジ３０に対する傾斜角度θは、励起光を照射する面積を十分に大きくすることができ、かつ、カートリッジ３０の表面３０ｃで励起光が全反射しない範囲とする。特に、励起光が充填部３０ａ全域に照射される角度とすることが好ましい。
傾斜角度θが小さすぎると励起光を十分拡大し十分な面積に照射することができないため、蛍光発光の再現性や測定精度を向上させることができない。また、カートリッジ３０の表面３０ｃにおいて励起光が正反射して検出器１３に励起光が入射してしまいバックグラウンドが増大し、測定精度が低下してしまう。
【００２８】
一方、θが大きすぎるとカートリッジ３０の表面３０ｃにおいて励起光が全反射してしまい、充填部３０ａに充填された吸着剤３１に励起光が照射されなくなるため、測定自体ができなくなる。このため、傾斜角度θは、例えば、カートリッジ３０の材質としてＰＭＭＡを採用する場合に、１５°≦θ≦７５°とすることができ、本実施形態では、θ＝４５°とした。
【００２９】
検出器１３は、蛍光を電流に変換して検出可能な受光素子を備え、受光した特定の波長の蛍光を電気信号に変換するように構成されている。受光素子としては、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管、ＣＣＤ、ＣＭＯＳなど各種検出素子を用いることができる。本実施形態では、温度特性に優れたフォトダイオードを採用した。
【００３０】
検出器１３は、蛍光を受光する受光面１３ａがカートリッジ３０の充填部３０ａに対向するように垂直上方に配置され、受光面１３ａがカートリッジ３０の充填部３０ａを表面３０ｃから見た面積よりも大きくなるように構成されている。充填部３０ａ、照射窓１１ｅ及び受光面１３ａの位置関係、面積の関係の一例を図４に示す。検出器１３は、カートリッジ３０に対して励起光を遮蔽しない程度の距離まで近接させて、蛍光を効率よく受光面１３ａへ入射させることが好ましい。
【００３１】
励起光源１２の前方には、測定対象の励起波長を選択的に透過させ、特に可視光成分を除去する励起光フィルタ１４が配置される。これにより、測定対象の励起に有効な励起波長を選択的に照射することができるので、測定精度を向上させることができる。
【００３２】
検出器１３の手前には、検出器１３への励起光の侵入を避けるために励起光をカットする励起光カットフィルタ１５と、測定対象が発する蛍光波長を選択的に透過させる蛍光フィルタ１６と、が配置されている。
励起光カットフィルタ１５、蛍光フィルタ１６は、光吸収性の色ガラスや金属酸化物、金属窒化物、金属フッ化物などの誘電体薄膜または金属薄膜からなる多層膜を基板上に形成したフィルタである。誘電体薄膜としては、親水性あるいは非親水性の無機化合物であって、例えばＴｉＯ２（二酸化チタン）、Ｔａ２Ｏ５（五酸化タンタル）、ＺｒＯ２（酸化ジルコン）、Ａ１２Ｏ３（酸化アルミニウム）、Ｎｂ２Ｏ５（五酸化ニオブ）、ＳｉＯ２（酸化ケイ素）、Ｓｉ３Ｎ４（窒化ケイ素）、ＭｇＦ２（フッ化マグネシウム）などが挙げられる。誘電体多層薄膜層の各膜厚は、数十ｎｍ〜数百ｎｍに設定される。ここで、「金属薄膜層」は、例えば金、銀、プラチナのような酸化されにくく、金属光沢を有する金属のごく薄い膜構造体をいう。これらの誘誘電体薄膜および金属薄膜の成膜方法は特に限定されるものではないが、蒸着法やスパッタリング法で成膜されることが好ましい。このような干渉フィルタは、透明なガラスやプラスチックなどから成る基板の表面に成膜されるが、本件では励起光により基板自身からの蛍光発光が無いものを選択する必要があるため、ガラスで特に石英ガラスまたは白板ガラスへの成膜が望ましい。ここで、励起光カットフィルタ１５と蛍光フィルタ１６とは同一基板を用いて一体的に構成することもできる。
【００３３】
励起光カットフィルタ１５により、励起光が検出器１３へ入射してバックグラウンドが増大することを避けることができる。また、蛍光フィルタ１６により、カートリッジ３０が蛍光発光した場合なども、測定対象が発した蛍光だけを検出器１３に入射させることができる。このように、分光器を用いることなく、励起光をカットし、測定対象が発した蛍光だけを選択的に検出器１３に入射させることができる。
【００３４】
例えば、カビ毒であるオクラトキシン及びアフラトキシンを分析する場合を例にとると、アフラトキシンＢ１については励起波長：３６５ｎｍ、蛍光波長：４５０ｎｍ、オクラトキシンＡについては励起波長：３３０ｎｍまたは３７０ｎｍ、蛍光波長：４６０ｎｍまたは４２０ｎｍである。従って、３７０ｎｍに極大発光を持つ紫外発光ＬＥＤを励起光源として使用することができる。この紫外発光ＬＥＤに３００〜４００ｎｍの光を透過する励起光フィルタ１４を組み合わせて用いることによりアフラトキシン及びオクラトキシンの励起に有効な励起波長を得ることができる。一方、受光側には４００ｎｍ以下の光を除去する励起光カットフィルタ１５と、長波長光をカットする蛍光フィルタ１６とを用いると、励起光の影響を受けずにアフラトキシン及びオクラトキシンに基づく蛍光を確実に受光することが可能となる。
【００３５】
次に、本発明の蛍光分析装置１を用いた測定方法について説明する。まず、食品などの測定検体に、粉砕、溶解、ろ過または遠心分離などの所定の調整を行って試験溶液を作製し、試験溶液をカートリッジ３０に流路３０ｂから通液して測定対象を吸着剤３１に吸着させる。このカートリッジ３０を筐体１１のホルダ１１ａに照射窓１１ｅに充填部３０ａが面するように取り付ける。
【００３６】
続いて、制御装置２０の励起光制御部２２により励起光源１２を制御し、励起光をカートリッジ３０に照射する。このとき、励起光フィルタ１４により、励起光のうち測定対象の励起波長を選択的に透過させる。
【００３７】
カートリッジ３０の充填部３０ａに充填された吸着剤３１に励起光が照射されると、吸着剤３１に吸着された測定対象が蛍光を発光する。検出器１３には、この蛍光とともに励起光の迷光やカートリッジ３０が発する蛍光が入射しようとするが、励起光カットフィルタ１５及び蛍光フィルタ１６により測定対象が発光した蛍光のみが選択的に透過され、検出器１３に入射される。
【００３８】
検出器１３により検出した蛍光強度に基づいて制御装置２０の定量分析部２１において演算処理することにより、対象物質の定量分析、例えば濃度測定、を行う。
【００３９】
ここで、定量分析部２１には、あらかじめ取得しておいた測定対象を吸着前のカートリッジ３０での蛍光強度がバックグラウンドとして記憶されており、上記の蛍光強度に差分処理を行うことにより、測定精度を向上させている。
【００４０】
励起光源１２として、ＬＥＤを用いた場合には、励起光はパルス発光させて照射することが好ましい。パルス発光を行うことにより、ＬＥＤへの印加電圧を上げることができ、輝度を向上させることができる。また、出力調整を行いやすくすることができる。また、ＬＥＤを連続的に発光させると、温度が上昇し、温度特性により励起光のピーク波長が変化（例えば数ｎｍ移動）したり、発光強度が変化したりして、蛍光の強度に影響を及ぼすことがある。パルス発光ではＬＥＤの温度が上昇しにくいため、このような問題を避けることができる。また、パルス光を矩形波とすることにより、検出器１３で受光した蛍光の演算処理が容易となる。
【００４１】
蛍光は、励起光照射開始後に数１０ｍｓｅｃ程度遅れて発光し、励起光照射停止後も発光を数１０ｍｓｅｃ程度継続する。精度の高い測定を行うためには、蛍光強度が一定値を維持する定常状態における蛍光強度を測定することが重要である。例えば、図５（Ａ）に示すように、励起光の発光時間が短い場合には、発光強度が一定となる前に、蛍光強度が低下してしまう。そこで、図５（Ｂ）に示すように、蛍光強度が一定値を維持する定常状態を示す照射条件とし、一定値に達してから蛍光強度を用いることが好ましい。例えば、励起光の点灯時間は１２０ｍｓｅｃとし、励起光照射後に、蛍光強度が一定となったときから２０ｍｓｅｃ後、または、一定時間の積算値を求め、濃度換算に用いる。
【００４２】
（変更例）
本実施形態では、励起光源１２として紫外線発光ダイオードを用いたが、これに限定されるものではない。例えば、可視光発光ダイオードや励起光として良好な波長特性を有する半導体レーザ、励起光を連続して発光するハロゲンランプや超高圧水銀灯などを用いることができる。ここで、励起光源１２として可視光ＬＥＤ、半導体レーザを用いる場合には、励起光制御部２２により励起光をパルス光として照射するように構成することができる。また、励起光源１２は複数個用意することができ、パルス光を用いる場合には、発光タイミングを任意に設定することができる。
【００４３】
本実施形態では、励起光源１２の光軸が充填部３０ａの中心部を向いた構成を示したが、これに限定されるものではない。例えば、測定対象が吸着剤３１の特定箇所に偏在するような場合、励起光をその特定箇所を中心に照射されるように、カートリッジ３０の位置を調整することもできる。
【００４４】
カートリッジ３０と検出器１３との間にレンズを挿入し、蛍光を集光させる構成を用いることができる。これによれば、より効率よく蛍光を検出器１３に入射させることができる。
【００４５】
制御装置２０は装置本体１０の温度を測定する測温手段を備え、定量分析部２１において励起光源１２の温度特性を補正する演算処理を行うことができる。これにより、蛍光分析装置１をフィールド分析で使用する場合に、測定環境が及ぼす影響を低減することができる。
【００４６】
本実施形態では、カートリッジとして外形が平板形状のものを用いたが、これに限定されるものではなく、各種形状のものを用いることができる。従来の蛍光分析装置で広く使用されている円筒形状のカートリッジを用いることもできるが、励起光照射領域及び蛍光検出領域が曲面である場合、励起光の均一照射が困難となり励起光の照射効率が下がり、蛍光発光量の低下とともに感度低下を招くおそれがあるため、励起光照射領域及び蛍光検出領域が平坦面であることが好ましい。
例えば、図６に示すような円筒を半割した半円筒状のカートリッジや角柱型、三角柱型など多角柱状に形成されたカートリッジを用いることができる。
カートリッジ４０は、一端部が細く絞られて試料溶液の導入及び洗浄液の排出が可能とするための流路４１ｂが形成された半円筒状の本体部４１の内部空間を多孔質材料からなるフリット４１ｄ、４１ｅにより吸着剤３１を充填する充填部４１ａを区画してなる。カートリッジ４０は、平坦面４１ｃが励起光照射領域及び蛍光検出領域となるように筐体１１に取り付けて用いる。
ここで、フリット４１ｅの右側の空間は流路４１ｂに相当し、本実施形態では、試料溶液は図中右側から充填部４１ａに導入される。
【００４７】
［実施形態の効果］
本発明の蛍光分析装置１によれば、励起光フィルタ１４により測定対象の励起に有効な励起波長を選択的に照射することができるので、測定精度を向上させることができる。励起光カットフィルタ１５及び蛍光フィルタ１６を用いることにより、励起光をカットし、測定対象が発した蛍光だけを選択的に検出器１３に入射させることができる。これにより、分光器を使用しない構成により高精度の測定が可能となり、オンサイト分析に適した小型、堅牢な蛍光分析装置１を実現することができる。
また、カートリッジ３０の表面３０ｃに対して傾斜して励起光を照射するため、吸着剤３１に対して励起光の照射する面積を拡大することができる。これにより、測定対象の吸着剤３１による吸着状態に吸着量の多少の分布がある場合でも、局所の測定でなく広い範囲を測定することができるので、測定精度を向上させることができる。
そして、検出器１３は、受光面１３ａがカートリッジ３０の励起光照射領域（充填部３０ａ）に対向して配置され、受光面１３ａがカートリッジ３０の充填部３０ａよりも大きくなるように構成されているため、蛍光を効率よく検出器１３に入射させることができ、測定精度を向上させることができる。
励起光源１２に発光ダイオードを用い、パルス発光させる構成では、励起光源１２の出力を上げ、輝度を向上させることができる。パルス発光では励起光源１２の温度が上昇しにくいため、励起光のピーク波長のドリフト、発光強度の変化などが生じにくい。そして、パルス光を矩形波で制御し、励起光発光後に蛍光強度が一定となったときの蛍光強度に基づいて定量分析を行うことにより測定精度を向上させることができる。
以上のように、高精度の測定が可能で、オンサイト分析に適した小型、堅牢な蛍光分析装置１を実現することができる。
【実施例】
【００４８】
本発明の蛍光分析装置を用いて、オクラトキシンＡの定量分析を行った。まず、吸着剤として両性イオン性官能基導入吸着剤を用いてオクラトキシンＡを吸着剤に吸着させたカートリッジを用意した。カートリッジとしては、充填部が面積７５ｍｍ２、深さ１．６ｍｍに形成されているものを用いた。オクラトキシンＡの吸着量は、０（ブランク）、１、３μｇの３水準で測定を実施した。
【００４９】
装置本体は、励起光源としての紫外発光ＬＥＤ（日亜化学工業株式会社：ＮＳＨＵ５９１Ｂ）、励起光フィルタとして紫外線透過フィルタ（ＨＯＹＡ株式会社：Ｕ３６０）、検出器の受光素子として受光面サイズ１０ｍｍ×１０ｍｍで有効受光面積が１００ｍｍ２のシリコンフォトダイオード（浜松ホトニクス株式会社：Ｓ１３３７−１０１０ＢＲ）、励起光カットフィルタして石英ガラスまたは白板ガラスに、真空蒸着法によりＴｉＯ２（二酸化チタン）とＳｉＯ２（酸化ケイ素）を交互に積層し計４２層で形成した赤外・紫外線カットフィルタと、蛍光フィルタとして計２８層で形成したロングパスフィルタを用いて構成した。
励起光源はカートリッジに対して４５°傾斜させて配置し、カートリッジの表面と検出器の受光面との距離は１８．２ｍｍと近接して配置した。
【００５０】
上述のように構成された蛍光分析装置を用いて、励起光を照射して蛍光検出を行った。検出された蛍光プロファイルを図７に示す。
【００５１】
制御装置の励起光制御部は、ＬＥＤ点灯後１００ｍｓｅｃから検出器により取得された蛍光強度のサンプリングを行う。サンプリングは０．０１ｍｓｅｃ間隔で１６６回行い、サンプリング終了後にＬＥＤを消灯するという制御により励起光の照射を行い、蛍光検出を行った。
【００５２】
蛍光強度は、試料濃度に伴い滑らかに増加した。この結果を基に、ブランクのノイズから計算したオクラトキシンＡの検出下限（Ｓ／Ｎ＝３）は絶対負荷量で０．１μｇであった。
【００５３】
次に、測定後のカートリッジに０．１％トリフルオロ酢酸／ＭｅＯＨ（２０／８０）溶離液を通液し、オクラトキシンＡを回収し、溶出液をＯＤＳカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）−蛍光分析法により定量した。移動相にはＭｅＣＮ／水／酢酸（４９．５／４９．５／１）を用い、励起波長３３３ｎｍ、蛍光波長光４６０ｎｍで測定した。
図８に示すように、本発明の蛍光分析装置による測定結果（縦軸：蛍光強度の出力値）は、高精度測定が可能な高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）−蛍光分析法による定量値（横軸）と指数関数的な相関を示した。これは固相表面上でのオクラトキシンＡの密度が高いために濃度消光を起こしているものと考えられたが、絶対負荷量１μｇまでは、精度が高い測定が可能であることが確認された。
【符号の説明】
【００５４】
１…蛍光分析装置
１０…装置本体
１１…筐体
１１ａ…ホルダ
１１ｂ…励起光源固定部
１１ｃ…検出器固定部
１１ｄ…照射室
１１ｅ…照射窓
１２…励起光源
１３…検出器
１３ａ…受光面
１４…励起光フィルタ
１５…励起光カットフィルタ
１６…蛍光フィルタ
２０…制御装置
２１…定量分析部
２２…励起光制御部
３０…カートリッジ
３０ａ…充填部
３０ｂ…流路
３０ｃ…表面
３１…吸着剤
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定対象を吸着する吸着剤が充填部に充填されたカートリッジに励起光を照射し、測定対象が発する蛍光の蛍光強度に基づいて定量分析を行う蛍光分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、残留農薬や食品添加物の分析にはガスクロマトグラフ法や液体クロマトグラフ法が用いられてきた。しかし、これらの方法は測定装置が高額であるとともに、測定に時間がかかるため、フィールドなどで使用するオンサイト分析、スクリーニングには適していない。
そこで、これら方法よりも短時間で測定可能な蛍光発光測定法の適用が考えられる。
オンサイト分析を行うために測定時間を短縮するには、蛍光発光分析法を適用することが有効と考えられる。従来の蛍光分析装置（例えば、特許文献１）では、対象物質の励起光及び蛍光波長が解らないケースや測定精度を向上させるため、励起光及び蛍光を分光する分光器を用いている。また、測定対象の蛍光発光領域を小さくし、レンズなどの光学系により集光効率を高めることにより感度向上を図っているため、分析装置の小型化やフィールド等へ持ち運び使用することが困難である。
一方、分析装置を小型化する試みとして、光学系にプリズムを用いた蛍光検出装置（例えば、特許文献２）などが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許４４５０７５０号
【特許文献２】特開２００３−２６３６６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、特許文献２に記載のような技術では、プリズムを用いており角度を持った面へ光学フィルタなどを成膜する構成により、励起光と蛍光を合成分波するため、光学フィルタの角度依存性が測定精度に影響する。また、励起光、蛍光がＰ波、Ｓ波に分離されてしまい、偏光成分を考慮しなければならない。以上のように、十分な測定精度や測定再現性を得ることができないとともに、光学系に高い精度が要求されるため、オンサイトにおける使用に適した堅牢さを保つことが困難である。
【０００５】
そこで、本発明は、高精度の測定が可能で、オンサイト分析に適した小型、堅牢な蛍光分析装置を実現することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明では、上記目的を実現するために、請求項１に記載の発明では、測定対象を吸着する吸着剤が充填部に充填されたカートリッジに励起光を照射し、測定対象が発する蛍光の蛍光強度に基づいて定量分析を行う蛍光分析装置であって、測定対象に励起光を照射する励起光源と、測定対象が発する蛍光を検出する検出器と、励起光源の前方に配置され、測定対象の励起波長を選択的に透過させる励起光フィルタと、検出器の手前に配置され、励起光成分を除去する励起光カットフィルタと、検出器の手前に配置され、測定対象が発する蛍光波長を選択的に透過させる蛍光フィルタと、前記検出器により検出された蛍光の発光強度に基づき対象物質の定量分析を行う定量分析部と、前記励起光源による励起光の照射を制御する励起光制御部と、を備え、前記励起光源による励起光の光軸が、前記カートリッジの表面において励起光が全反射しない角度で前記カートリッジの表面に対して傾斜するように励起光源を配置し、前記検出器に蛍光が入射する受光面は、カートリッジの励起光照射領域に対向して配置され、当該受光面がカートリッジの励起光照射領域よりも大きくなるように構成されている、という技術的手段を用いる。
【０００７】
請求項１に記載の発明によれば、励起光フィルタにより測定対象の励起に有効な励起波長を選択的に照射することができるので、測定精度を向上させることができる。励起光カットフィルタ及び蛍光フィルタを用いることにより、励起光をカットし、測定対象が発した蛍光だけを選択的に検出器に入射させることができる。これにより、分光器を使用しない構成により高精度の測定が可能となり、オンサイト分析に適した小型、堅牢な蛍光分析装置を実現することができる。
また、カートリッジの表面に対して傾斜して励起光を照射するため、吸着剤に対して励起光の照射する面積を拡大することができる。これにより、測定対象の吸着剤による吸着状態に吸着量の多少の分布がある場合でも、局所の測定でなく広い範囲を測定することができるので、測定精度を向上させることができる。
そして、検出器は、受光面がカートリッジの励起光照射領域に対向して配置され、当該受光面がカートリッジの励起光照射領域よりも大きくなるように構成されているため、蛍光を効率よく検出器に入射させることができ、測定精度を向上させることができる。
以上のように、高精度の測定が可能で、オンサイト分析に適した小型、堅牢な蛍光分析装置を実現することができる。
【０００８】
請求項２に記載の発明では、請求項１に記載の蛍光分析装置において、前記励起光源による励起光の光軸が、前記カートリッジの励起光照射領域が前記カートリッジの充填部より広くなる角度で傾斜するように励起光源を配置する、という技術的手段を用いる。
【０００９】
請求項２に記載の発明のように、カートリッジの励起光照射領域がカートリッジの充填部より広くなる角度で傾斜するように励起光源を配置することにより、励起光が照射される吸着剤の量を増大させることができるので、測定精度を更に向上させることができる。
【００１０】
請求項３に記載の発明では、請求項１または請求項２に記載の蛍光分析装置において、前記励起光源として、発光ダイオードまたは半導体レーザを用いる、という技術的手段を用いる。
【００１１】
請求項３に記載の発明のように、励起光として良好な波長特性を有し、小型化が可能な発光ダイオード、半導体レーザを用いることができる。特に、発光ダイオードは広い面積に励起光を照射可能であり、好適に用いることができる。
【００１２】
請求項４に記載の発明では、請求項３に記載の蛍光分析装置において、前記励起光制御部は、前記励起光源による励起光をパルス発光させる、という技術的手段を用いる。
【００１３】
請求項４に記載の発明のように、励起光源に発光ダイオード、半導体レーザを用いる場合には、励起光はパルス発光させることが好ましい。これにより、励起光源の出力を上げ、輝度を向上させることができる。また、連続発光を行うと、励起光源の温度が上昇し、温度特性により励起光のピーク波長が変化し、発光強度が変化することで蛍光の強度に影響を及ぼすことがある。パルス発光では励起光源の温度が上昇しにくいため、このような問題を避けることができる。
【００１４】
請求項５に記載の発明では、請求項４に記載の蛍光分析装置において、前記パルス発光される励起光は矩形波で制御され、前記定量分析部は、励起光発光後に蛍光強度が一定となったときの蛍光強度に基づいて定量分析を行う、という技術的手段を用いる。
【００１５】
パルス光を矩形波で制御すると、蛍光強度は一定値を示すため演算処理が容易であるが、蛍光は励起光照射開始後に数１０ｍｓｅｃ程度遅れて発光するため、請求項５に記載の発明のように、励起光発光後に蛍光強度が一定となったときの蛍光強度に基づいて定量分析を行うことにより測定精度を向上させることができる。
【００１６】
請求項６に記載の発明では、請求項１ないし請求項５のいずれか１つに記載の蛍光分析装置において、励起光及び蛍光に対する透光性を有し、励起光に対して発蛍光性を持たない材料により作製された平坦面を有する基体の内部に、吸着剤を充填保持する充填部と、当該充填部に測定対象を含む溶液の通液及び排出が可能な流路と、が形成されているカートリッジを用い、前記平坦面側から前記充填部に励起光を照射し、蛍光を検出する、という技術的手段を用いる。
【００１７】
請求項６に記載の発明のように構成されたカートリッジでは、平坦面側から充填部に励起光を照射し、蛍光を検出する、つまり、励起光を照射する励起光照射領域及び蛍光を検出するための蛍光検出領域が平坦面となるため、励起光の受光効率を高くすることができるとともに、蛍光が広がりにくく検出器による検出効率を高くすることができるので、測定精度を向上させるために好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】蛍光分析装置の概略構成を示す説明図である。
【図２】蛍光分析装置の装置本体の構造を示す説明図である。図２（Ａ）は透視説明図、図２（Ｂ）は図２（Ａ）のＡ−Ａ矢視断面図である。
【図３】蛍光分析装置に取り付けて使用するカートリッジの構造を示す説明図である。図３（Ａ）は励起光を照射する面を見た平面図、図３（Ｂ）は図３（Ａ）のＢ−Ｂ矢視断面図である。
【図４】充填部、照射窓及び受光面の位置関係、面積の関係の一例を示す説明図である。
【図５】蛍光強度の測定方法を示す説明図である。
【図６】カートリッジの変更例を示す説明図である。図６（Ａ）は長手方向の断面図、図６（Ｂ）は図６（Ａ）を図中左方向から見た平面図である。
【図７】実施例の測定で検出された蛍光プロファイルを示す説明図である。
【図８】実施例の測定結果と高速液体クロマトグラフィー−質量分析法による定量結果とを比較する説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明に係る蛍光分析装置について、図を参照して説明する。
【００２０】
本発明の蛍光分析装置１は、図１に示すように、装置本体１０と制御装置２０とからなる。制御装置２０は、パーソナルコンピュータなどにより構成され、検出器１３により検出された蛍光の発光強度に基づき対象物質の定量分析、例えば濃度の算出を行う定量分析部２１と、励起光源１２による励起光の照射を制御する励起光制御部２２と、を備えている。
【００２１】
装置本体１０は、図２に示すように、筐体１１の内部に、測定対象に励起光を照射するための励起光源１２、測定対象が発する蛍光を検出する検出器１３、励起光フィルタ１４、励起光カットフィルタ１５、蛍光フィルタ１６を備えている。なお、図２では、説明のため、透視図を用い内部構造を示しているが、測定時には筐体１１の内部は視認することができない。
【００２２】
筐体１１には、励起光及び蛍光を透光可能な材料からなり、測定対象を吸着固定する吸着剤が充填されたカートリッジ３０が取り付けられる。カートリッジ３０を構成する材料としては、ガラス、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、透明塩化ビニル（ＰＶＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、フッ素樹脂などを使用することができ、検出する光の波長や使用溶媒への耐性などを考慮して適宜選択することができる。ここで、検出器１３において検出される蛍光のうち、バックグランドを増大させる蛍光を低減させるためには、励起光に対して発蛍光性を持たないことが好ましい。上記材料のうち、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）は、低蛍光性、光透過性が高く好ましい。
【００２３】
本実施形態では、カートリッジ３０は平板状のＰＭＭＡにより形成され、図３に示すように、本体内部に、吸着剤３１を充填保持する充填部３０ａと、充填部３０ａに試料溶液の導入及び洗浄液の排出が可能とするための流路３０ｂと、が形成されている。ここで、充填部３０ａが励起光を照射する励起光照射領域及び蛍光を検出するための蛍光検出領域となる。
充填部３０ａは吸着剤３１全体に励起光が照射され受光効率が高くなるように、例えば、厚さが１０ｍｍ以下に、薄く形成されている。一方、吸着剤３１の量は、測定対象の吸着量に関係し、少ないと十分な量の測定対象を吸着できず分析感度の低下を招く。そこで、測定対象を十分に吸着するために、必要量の吸着剤を充填できるように、面積が十分に広く形成されている。励起光照射領域及び蛍光検出領域は、十分な面積を有する平坦面となるため、励起光の受光効率を高くすることができるとともに、蛍光が広がりにくく検出器１３による検出効率を高くすることができる。
本実施形態では、充填部３０ａは１辺５ｍｍの６角形状で、面積７５ｍｍ２、深さ１．６ｍｍ、容積１２０ｍｍ３となるように形成した。
【００２４】
図２に示すように、筐体１１には、カートリッジ３０を固定するホルダ１１ａ、励起光源１２を固定する励起光源固定部１１ｂ、検出器１３を固定する検出器固定部１１ｃ、励起光源１２から照射される励起光及び測定対象が発光する蛍光の光路である照射室１１ｄ及びカートリッジ３０に励起光を照射するための照射窓１１ｅが設けられている。
本実施形態では、筐体１１は、アルミニウム合金を加工したブロックにより作製され、照射室１１ｄなどの内面には励起光により蛍光発光しない材料により黒塗装が施されている。これにより、励起光の迷光及び外光の散乱によるバックグラウンド光増に起因する測定精度の低下を防ぐことができる。
【００２５】
励起光源１２は、励起光の光軸がカートリッジ３０の表面３０ｃに対して傾斜し、筐体１１に固定されたカートリッジ３０の充填部３０ａに、充填部３０ａへの垂線から傾斜した方向から励起光を照射できるように励起光源固定部１１ｂに配置されている。本実施形態では、励起光源１２は、励起光源１２の光軸が充填部３０ａの中心部を向くように配置されている。
【００２６】
励起光源１２としては、小型で、励起光の波長幅を狭くすることができ、広い面積に励起光を照射可能な発光ダイオード（ＬＥＤ）を好適に用いることができる。ここで、励起光源１２としてＬＥＤを用いる場合、励起光制御部２２により励起光をパルス光として照射することができる。本実施形態では、励起光源１２として紫外線ＬＥＤを用いる。
【００２７】
励起光源１２の光軸のカートリッジ３０に対する傾斜角度θは、励起光を照射する面積を十分に大きくすることができ、かつ、カートリッジ３０の表面３０ｃで励起光が全反射しない範囲とする。特に、励起光が充填部３０ａ全域に照射される角度とすることが好ましい。
傾斜角度θが小さすぎると励起光を十分拡大し十分な面積に照射することができないため、蛍光発光の再現性や測定精度を向上させることができない。また、カートリッジ３０の表面３０ｃにおいて励起光が正反射して検出器１３に励起光が入射してしまいバックグラウンドが増大し、測定精度が低下してしまう。
【００２８】
一方、θが大きすぎるとカートリッジ３０の表面３０ｃにおいて励起光が全反射してしまい、充填部３０ａに充填された吸着剤３１に励起光が照射されなくなるため、測定自体ができなくなる。このため、傾斜角度θは、例えば、カートリッジ３０の材質としてＰＭＭＡを採用する場合に、１５°≦θ≦７５°とすることができ、本実施形態では、θ＝４５°とした。
【００２９】
検出器１３は、蛍光を電流に変換して検出可能な受光素子を備え、受光した特定の波長の蛍光を電気信号に変換するように構成されている。受光素子としては、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管、ＣＣＤ、ＣＭＯＳなど各種検出素子を用いることができる。本実施形態では、温度特性に優れたフォトダイオードを採用した。
【００３０】
検出器１３は、蛍光を受光する受光面１３ａがカートリッジ３０の充填部３０ａに対向するように垂直上方に配置され、受光面１３ａがカートリッジ３０の充填部３０ａを表面３０ｃから見た面積よりも大きくなるように構成されている。充填部３０ａ、照射窓１１ｅ及び受光面１３ａの位置関係、面積の関係の一例を図４に示す。検出器１３は、カートリッジ３０に対して励起光を遮蔽しない程度の距離まで近接させて、蛍光を効率よく受光面１３ａへ入射させることが好ましい。
【００３１】
励起光源１２の前方には、測定対象の励起波長を選択的に透過させ、特に可視光成分を除去する励起光フィルタ１４が配置される。これにより、測定対象の励起に有効な励起波長を選択的に照射することができるので、測定精度を向上させることができる。
【００３２】
検出器１３の手前には、検出器１３への励起光の侵入を避けるために励起光をカットする励起光カットフィルタ１５と、測定対象が発する蛍光波長を選択的に透過させる蛍光フィルタ１６と、が配置されている。
励起光カットフィルタ１５、蛍光フィルタ１６は、光吸収性の色ガラスや金属酸化物、金属窒化物、金属フッ化物などの誘電体薄膜または金属薄膜からなる多層膜を基板上に形成したフィルタである。誘電体薄膜としては、親水性あるいは非親水性の無機化合物であって、例えばＴｉＯ２（二酸化チタン）、Ｔａ２Ｏ５（五酸化タンタル）、ＺｒＯ２（酸化ジルコン）、Ａ１２Ｏ３（酸化アルミニウム）、Ｎｂ２Ｏ５（五酸化ニオブ）、ＳｉＯ２（酸化ケイ素）、Ｓｉ３Ｎ４（窒化ケイ素）、ＭｇＦ２（フッ化マグネシウム）などが挙げられる。誘電体多層薄膜層の各膜厚は、数十ｎｍ〜数百ｎｍに設定される。ここで、「金属薄膜層」は、例えば金、銀、プラチナのような酸化されにくく、金属光沢を有する金属のごく薄い膜構造体をいう。これらの誘誘電体薄膜および金属薄膜の成膜方法は特に限定されるものではないが、蒸着法やスパッタリング法で成膜されることが好ましい。このような干渉フィルタは、透明なガラスやプラスチックなどから成る基板の表面に成膜されるが、本件では励起光により基板自身からの蛍光発光が無いものを選択する必要があるため、ガラスで特に石英ガラスまたは白板ガラスへの成膜が望ましい。ここで、励起光カットフィルタ１５と蛍光フィルタ１６とは同一基板を用いて一体的に構成することもできる。
【００３３】
励起光カットフィルタ１５により、励起光が検出器１３へ入射してバックグラウンドが増大することを避けることができる。また、蛍光フィルタ１６により、カートリッジ３０が蛍光発光した場合なども、測定対象が発した蛍光だけを検出器１３に入射させることができる。このように、分光器を用いることなく、励起光をカットし、測定対象が発した蛍光だけを選択的に検出器１３に入射させることができる。
【００３４】
例えば、カビ毒であるオクラトキシン及びアフラトキシンを分析する場合を例にとると、アフラトキシンＢ１については励起波長：３６５ｎｍ、蛍光波長：４５０ｎｍ、オクラトキシンＡについては励起波長：３３０ｎｍまたは３７０ｎｍ、蛍光波長：４６０ｎｍまたは４２０ｎｍである。従って、３７０ｎｍに極大発光を持つ紫外発光ＬＥＤを励起光源として使用することができる。この紫外発光ＬＥＤに３００〜４００ｎｍの光を透過する励起光フィルタ１４を組み合わせて用いることによりアフラトキシン及びオクラトキシンの励起に有効な励起波長を得ることができる。一方、受光側には４００ｎｍ以下の光を除去する励起光カットフィルタ１５と、長波長光をカットする蛍光フィルタ１６とを用いると、励起光の影響を受けずにアフラトキシン及びオクラトキシンに基づく蛍光を確実に受光することが可能となる。
【００３５】
次に、本発明の蛍光分析装置１を用いた測定方法について説明する。まず、食品などの測定検体に、粉砕、溶解、ろ過または遠心分離などの所定の調整を行って試験溶液を作製し、試験溶液をカートリッジ３０に流路３０ｂから通液して測定対象を吸着剤３１に吸着させる。このカートリッジ３０を筐体１１のホルダ１１ａに照射窓１１ｅに充填部３０ａが面するように取り付ける。
【００３６】
続いて、制御装置２０の励起光制御部２２により励起光源１２を制御し、励起光をカートリッジ３０に照射する。このとき、励起光フィルタ１４により、励起光のうち測定対象の励起波長を選択的に透過させる。
【００３７】
カートリッジ３０の充填部３０ａに充填された吸着剤３１に励起光が照射されると、吸着剤３１に吸着された測定対象が蛍光を発光する。検出器１３には、この蛍光とともに励起光の迷光やカートリッジ３０が発する蛍光が入射しようとするが、励起光カットフィルタ１５及び蛍光フィルタ１６により測定対象が発光した蛍光のみが選択的に透過され、検出器１３に入射される。
【００３８】
検出器１３により検出した蛍光強度に基づいて制御装置２０の定量分析部２１において演算処理することにより、対象物質の定量分析、例えば濃度測定、を行う。
【００３９】
ここで、定量分析部２１には、あらかじめ取得しておいた測定対象を吸着前のカートリッジ３０での蛍光強度がバックグラウンドとして記憶されており、上記の蛍光強度に差分処理を行うことにより、測定精度を向上させている。
【００４０】
励起光源１２として、ＬＥＤを用いた場合には、励起光はパルス発光させて照射することが好ましい。パルス発光を行うことにより、ＬＥＤへの印加電圧を上げることができ、輝度を向上させることができる。また、出力調整を行いやすくすることができる。また、ＬＥＤを連続的に発光させると、温度が上昇し、温度特性により励起光のピーク波長が変化（例えば数ｎｍ移動）したり、発光強度が変化したりして、蛍光の強度に影響を及ぼすことがある。パルス発光ではＬＥＤの温度が上昇しにくいため、このような問題を避けることができる。また、パルス光を矩形波とすることにより、検出器１３で受光した蛍光の演算処理が容易となる。
【００４１】
蛍光は、励起光照射開始後に数１０ｍｓｅｃ程度遅れて発光し、励起光照射停止後も発光を数１０ｍｓｅｃ程度継続する。精度の高い測定を行うためには、蛍光強度が一定値を維持する定常状態における蛍光強度を測定することが重要である。例えば、図５（Ａ）に示すように、励起光の発光時間が短い場合には、発光強度が一定となる前に、蛍光強度が低下してしまう。そこで、図５（Ｂ）に示すように、蛍光強度が一定値を維持する定常状態を示す照射条件とし、一定値に達してから蛍光強度を用いることが好ましい。例えば、励起光の点灯時間は１２０ｍｓｅｃとし、励起光照射後に、蛍光強度が一定となったときから２０ｍｓｅｃ後、または、一定時間の積算値を求め、濃度換算に用いる。
【００４２】
（変更例）
本実施形態では、励起光源１２として紫外線発光ダイオードを用いたが、これに限定されるものではない。例えば、可視光発光ダイオードや励起光として良好な波長特性を有する半導体レーザ、励起光を連続して発光するハロゲンランプや超高圧水銀灯などを用いることができる。ここで、励起光源１２として可視光ＬＥＤ、半導体レーザを用いる場合には、励起光制御部２２により励起光をパルス光として照射するように構成することができる。また、励起光源１２は複数個用意することができ、パルス光を用いる場合には、発光タイミングを任意に設定することができる。
【００４３】
本実施形態では、励起光源１２の光軸が充填部３０ａの中心部を向いた構成を示したが、これに限定されるものではない。例えば、測定対象が吸着剤３１の特定箇所に偏在するような場合、励起光をその特定箇所を中心に照射されるように、カートリッジ３０の位置を調整することもできる。
【００４４】
カートリッジ３０と検出器１３との間にレンズを挿入し、蛍光を集光させる構成を用いることができる。これによれば、より効率よく蛍光を検出器１３に入射させることができる。
【００４５】
制御装置２０は装置本体１０の温度を測定する測温手段を備え、定量分析部２１において励起光源１２の温度特性を補正する演算処理を行うことができる。これにより、蛍光分析装置１をフィールド分析で使用する場合に、測定環境が及ぼす影響を低減することができる。
【００４６】
本実施形態では、カートリッジとして外形が平板形状のものを用いたが、これに限定されるものではなく、各種形状のものを用いることができる。従来の蛍光分析装置で広く使用されている円筒形状のカートリッジを用いることもできるが、励起光照射領域及び蛍光検出領域が曲面である場合、励起光の均一照射が困難となり励起光の照射効率が下がり、蛍光発光量の低下とともに感度低下を招くおそれがあるため、励起光照射領域及び蛍光検出領域が平坦面であることが好ましい。
例えば、図６に示すような円筒を半割した半円筒状のカートリッジや角柱型、三角柱型など多角柱状に形成されたカートリッジを用いることができる。
カートリッジ４０は、一端部が細く絞られて試料溶液の導入及び洗浄液の排出が可能とするための流路４１ｂが形成された半円筒状の本体部４１の内部空間を多孔質材料からなるフリット４１ｄ、４１ｅにより吸着剤３１を充填する充填部４１ａを区画してなる。カートリッジ４０は、平坦面４１ｃが励起光照射領域及び蛍光検出領域となるように筐体１１に取り付けて用いる。
ここで、フリット４１ｅの右側の空間は流路４１ｂに相当し、本実施形態では、試料溶液は図中右側から充填部４１ａに導入される。
【００４７】
［実施形態の効果］
本発明の蛍光分析装置１によれば、励起光フィルタ１４により測定対象の励起に有効な励起波長を選択的に照射することができるので、測定精度を向上させることができる。励起光カットフィルタ１５及び蛍光フィルタ１６を用いることにより、励起光をカットし、測定対象が発した蛍光だけを選択的に検出器１３に入射させることができる。これにより、分光器を使用しない構成により高精度の測定が可能となり、オンサイト分析に適した小型、堅牢な蛍光分析装置１を実現することができる。
また、カートリッジ３０の表面３０ｃに対して傾斜して励起光を照射するため、吸着剤３１に対して励起光の照射する面積を拡大することができる。これにより、測定対象の吸着剤３１による吸着状態に吸着量の多少の分布がある場合でも、局所の測定でなく広い範囲を測定することができるので、測定精度を向上させることができる。
そして、検出器１３は、受光面１３ａがカートリッジ３０の励起光照射領域（充填部３０ａ）に対向して配置され、受光面１３ａがカートリッジ３０の充填部３０ａよりも大きくなるように構成されているため、蛍光を効率よく検出器１３に入射させることができ、測定精度を向上させることができる。
励起光源１２に発光ダイオードを用い、パルス発光させる構成では、励起光源１２の出力を上げ、輝度を向上させることができる。パルス発光では励起光源１２の温度が上昇しにくいため、励起光のピーク波長のドリフト、発光強度の変化などが生じにくい。そして、パルス光を矩形波で制御し、励起光発光後に蛍光強度が一定となったときの蛍光強度に基づいて定量分析を行うことにより測定精度を向上させることができる。
以上のように、高精度の測定が可能で、オンサイト分析に適した小型、堅牢な蛍光分析装置１を実現することができる。
【実施例】
【００４８】
本発明の蛍光分析装置を用いて、オクラトキシンＡの定量分析を行った。まず、吸着剤として両性イオン性官能基導入吸着剤を用いてオクラトキシンＡを吸着剤に吸着させたカートリッジを用意した。カートリッジとしては、充填部が面積７５ｍｍ２、深さ１．６ｍｍに形成されているものを用いた。オクラトキシンＡの吸着量は、０（ブランク）、１、３μｇの３水準で測定を実施した。
【００４９】
装置本体は、励起光源としての紫外発光ＬＥＤ（日亜化学工業株式会社：ＮＳＨＵ５９１Ｂ）、励起光フィルタとして紫外線透過フィルタ（ＨＯＹＡ株式会社：Ｕ３６０）、検出器の受光素子として受光面サイズ１０ｍｍ×１０ｍｍで有効受光面積が１００ｍｍ２のシリコンフォトダイオード（浜松ホトニクス株式会社：Ｓ１３３７−１０１０ＢＲ）、励起光カットフィルタして石英ガラスまたは白板ガラスに、真空蒸着法によりＴｉＯ２（二酸化チタン）とＳｉＯ２（酸化ケイ素）を交互に積層し計４２層で形成した赤外・紫外線カットフィルタと、蛍光フィルタとして計２８層で形成したロングパスフィルタを用いて構成した。
励起光源はカートリッジに対して４５°傾斜させて配置し、カートリッジの表面と検出器の受光面との距離は１８．２ｍｍと近接して配置した。
【００５０】
上述のように構成された蛍光分析装置を用いて、励起光を照射して蛍光検出を行った。検出された蛍光プロファイルを図７に示す。
【００５１】
制御装置の励起光制御部は、ＬＥＤ点灯後１００ｍｓｅｃから検出器により取得された蛍光強度のサンプリングを行う。サンプリングは０．０１ｍｓｅｃ間隔で１６６回行い、サンプリング終了後にＬＥＤを消灯するという制御により励起光の照射を行い、蛍光検出を行った。
【００５２】
蛍光強度は、試料濃度に伴い滑らかに増加した。この結果を基に、ブランクのノイズから計算したオクラトキシンＡの検出下限（Ｓ／Ｎ＝３）は絶対負荷量で０．１μｇであった。
【００５３】
次に、測定後のカートリッジに０．１％トリフルオロ酢酸／ＭｅＯＨ（２０／８０）溶離液を通液し、オクラトキシンＡを回収し、溶出液をＯＤＳカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）−蛍光分析法により定量した。移動相にはＭｅＣＮ／水／酢酸（４９．５／４９．５／１）を用い、励起波長３３３ｎｍ、蛍光波長光４６０ｎｍで測定した。
図８に示すように、本発明の蛍光分析装置による測定結果（縦軸：蛍光強度の出力値）は、高精度測定が可能な高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）−蛍光分析法による定量値（横軸）と指数関数的な相関を示した。これは固相表面上でのオクラトキシンＡの密度が高いために濃度消光を起こしているものと考えられたが、絶対負荷量１μｇまでは、精度が高い測定が可能であることが確認された。
【符号の説明】
【００５４】
１…蛍光分析装置
１０…装置本体
１１…筐体
１１ａ…ホルダ
１１ｂ…励起光源固定部
１１ｃ…検出器固定部
１１ｄ…照射室
１１ｅ…照射窓
１２…励起光源
１３…検出器
１３ａ…受光面
１４…励起光フィルタ
１５…励起光カットフィルタ
１６…蛍光フィルタ
２０…制御装置
２１…定量分析部
２２…励起光制御部
３０…カートリッジ
３０ａ…充填部
３０ｂ…流路
３０ｃ…表面
３１…吸着剤
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象を吸着する吸着剤が充填部に充填されたカートリッジに励起光を照射し、測定対象が発する蛍光の蛍光強度に基づいて定量分析を行う蛍光分析装置であって、
測定対象に励起光を照射する励起光源と、
測定対象が発する蛍光を検出する検出器と、
励起光源の前方に配置され、測定対象の励起波長を選択的に透過させる励起光フィルタと、
検出器の手前に配置され、励起光成分を除去する励起光カットフィルタと、
検出器の手前に配置され、測定対象が発する蛍光波長を選択的に透過させる蛍光フィルタと、
前記検出器により検出された蛍光の発光強度に基づき対象物質の定量分析を行う定量分析部と、
前記励起光源による励起光の照射を制御する励起光制御部と、を備え、
前記励起光源による励起光の光軸が、前記カートリッジの表面において励起光が全反射しない角度で前記カートリッジの表面に対して傾斜するように励起光源を配置し、
前記検出器に蛍光が入射する受光面は、カートリッジの励起光照射領域に対向して配置され、当該受光面がカートリッジの励起光照射領域よりも大きくなるように構成されていることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項２】
前記励起光源による励起光の光軸が、前記カートリッジの励起光照射領域が前記カートリッジの充填部より広くなる角度で傾斜するように励起光源を配置することを特徴とする請求項１に記載の蛍光分析装置。
【請求項３】
前記励起光源として、発光ダイオードまたは半導体レーザを用いることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の蛍光分析装置。
【請求項４】
前記励起光制御部は、前記励起光源による励起光をパルス発光させることを特徴とする請求項３に記載の蛍光分析装置。
【請求項５】
前記パルス発光される励起光は矩形波で制御され、前記定量分析部は、励起光発光後に蛍光強度が一定となったときの蛍光強度に基づいて定量分析を行うことを特徴とする請求項４に記載の蛍光分析装置。
【請求項６】
励起光及び蛍光に対する透光性を有し、励起光に対して発蛍光性を持たない材料により作製された平坦面を有する基体の内部に、吸着剤を充填保持する充填部と、当該充填部に測定対象を含む溶液の通液及び排出が可能な流路と、が形成されているカートリッジを用い、前記平坦面側から前記充填部に励起光を照射し、蛍光を検出することを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれか１つに記載の蛍光分析装置。
【請求項１】
測定対象を吸着する吸着剤が充填部に充填されたカートリッジに励起光を照射し、測定対象が発する蛍光の蛍光強度に基づいて定量分析を行う蛍光分析装置であって、
測定対象に励起光を照射する励起光源と、
測定対象が発する蛍光を検出する検出器と、
励起光源の前方に配置され、測定対象の励起波長を選択的に透過させる励起光フィルタと、
検出器の手前に配置され、励起光成分を除去する励起光カットフィルタと、
検出器の手前に配置され、測定対象が発する蛍光波長を選択的に透過させる蛍光フィルタと、
前記検出器により検出された蛍光の発光強度に基づき対象物質の定量分析を行う定量分析部と、
前記励起光源による励起光の照射を制御する励起光制御部と、を備え、
前記励起光源による励起光の光軸が、前記カートリッジの表面において励起光が全反射しない角度で前記カートリッジの表面に対して傾斜するように励起光源を配置し、
前記検出器に蛍光が入射する受光面は、カートリッジの励起光照射領域に対向して配置され、当該受光面がカートリッジの励起光照射領域よりも大きくなるように構成されていることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項２】
前記励起光源による励起光の光軸が、前記カートリッジの励起光照射領域が前記カートリッジの充填部より広くなる角度で傾斜するように励起光源を配置することを特徴とする請求項１に記載の蛍光分析装置。
【請求項３】
前記励起光源として、発光ダイオードまたは半導体レーザを用いることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の蛍光分析装置。
【請求項４】
前記励起光制御部は、前記励起光源による励起光をパルス発光させることを特徴とする請求項３に記載の蛍光分析装置。
【請求項５】
前記パルス発光される励起光は矩形波で制御され、前記定量分析部は、励起光発光後に蛍光強度が一定となったときの蛍光強度に基づいて定量分析を行うことを特徴とする請求項４に記載の蛍光分析装置。
【請求項６】
励起光及び蛍光に対する透光性を有し、励起光に対して発蛍光性を持たない材料により作製された平坦面を有する基体の内部に、吸着剤を充填保持する充填部と、当該充填部に測定対象を含む溶液の通液及び排出が可能な流路と、が形成されているカートリッジを用い、前記平坦面側から前記充填部に励起光を照射し、蛍光を検出することを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれか１つに記載の蛍光分析装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１３−１９８１９（Ｐ２０１３−１９８１９Ａ）
【公開日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１５４３９８（Ｐ２０１１−１５４３９８）
【出願日】平成２３年７月１３日（２０１１．７．１３）
【出願人】（０００２１９７３８）東海光学株式会社 (112)
【出願人】（０００２２９８１８）日本フイルコン株式会社 (58)
【出願人】（５００４３３２２５）学校法人中部大学 (105)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月１３日（２０１１．７．１３）
【出願人】（０００２１９７３８）東海光学株式会社 (112)
【出願人】（０００２２９８１８）日本フイルコン株式会社 (58)
【出願人】（５００４３３２２５）学校法人中部大学 (105)
【Ｆターム（参考）】
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