蠕虫性寄生生物由来の免疫賦活剤
【課題】ｉｎ ｖｉｖｏで強いＴｈ２免疫賦活化を引き起こすＴｈ２免疫賦活剤や該免疫賦活剤の製造方法を提供すること。
【解決手段】消化管蠕虫性寄生虫の一種であるニッポストロンジラス・ブラジリエンシス(Nippostrongylus brasiliensis)を超音波破砕処理した処理物と、界面活性剤の１つであるTritonX-114含有水溶液とを混合した後、水層と界面活性剤層との層分離処理を行う。かかる界面活性剤層を界面活性剤画分として抽出した界面活性剤画分からエタノール沈殿法によりTritonX-114を除去した脱界面活性剤抽出画分は、単回の経口投与によりＴｈ２免疫賦活化の指標であるＩｇＥ量の増加、好酸球数の増加、又はＩＬ−４発現量の増加作用を有する。
【解決手段】消化管蠕虫性寄生虫の一種であるニッポストロンジラス・ブラジリエンシス(Nippostrongylus brasiliensis)を超音波破砕処理した処理物と、界面活性剤の１つであるTritonX-114含有水溶液とを混合した後、水層と界面活性剤層との層分離処理を行う。かかる界面活性剤層を界面活性剤画分として抽出した界面活性剤画分からエタノール沈殿法によりTritonX-114を除去した脱界面活性剤抽出画分は、単回の経口投与によりＴｈ２免疫賦活化の指標であるＩｇＥ量の増加、好酸球数の増加、又はＩＬ−４発現量の増加作用を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、寄生虫から界面活性剤を用いて抽出した界面活性剤画分から界面活性剤を除去した脱界面活性剤抽出画分を有効成分とするＴｈ２免疫賦活剤や該免疫賦活剤の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫反応において、機能するヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）は、主にタイプＩ（Ｔｈ１）細胞とタイプII（Ｔｈ２）細胞とに分類され（例えば、非特許文献１、非特許文献１６、非特許文献１７参照）、そのうちＴｈ１細胞は細胞性炎症反応に関与することが知られており、かかる細胞性炎症反応としては、例えばＴｈ１細胞が分泌するサイトカイン（Ｔｈ１サイトカイン）であるＩＬ−２やＩＦＮ−γにより誘導される細胞障害性反応、遅延型過敏反応等が知られている。他方、Ｔｈ２細胞は体液性免疫反応に関与することが知られており、かかる体液性免疫反応としては、例えばＴｈ２細胞が分泌するサイトカイン（Ｔｈ２サイトカイン）であるＩＬ−４やＩＬ−５により誘導されるＩｇＥ量増加に伴ったアレルギー反応や、寄生虫からの防御反応等が知られている（例えば非特許文献１７参照）。また、Ｔｈ１サイトカイン及びＴｈ２サイトカインがそれぞれ他方のサイトカインの働きを抑制することにより、免疫反応のタイプがＴｈ１型又はＴｈ２型のどちらか一方に迅速に変化することが知られている（例えば非特許文献１、非特許文献１６参照）。こうした免疫反応のシステムにより、生体内では外来抗原の種類に応じて適切な免疫反応が誘導される（例えば非特許文献１、非特許文献１６参照）が、免疫反応のバランス制御が乱れ、Ｔｈ１型に過度に傾くとクローン病などの組織障害性疾患や、慢性関節リウマチ、自己免疫性肝炎などの臓器特異的自己免疫疾患を引き起こすことが知られている（例えば非特許文献１、非特許文献７、非特許文献１６参照）。また、逆にＴｈ２型に過度に傾くとアレルギー、アトピー、全身性自己免疫疾患などの免疫疾患を引き起こすことが知られている（例えば非特許文献１、非特許文献１６参照）。これらの疾患を治療するために、乱れた免疫反応のバランスを正常な状態に戻すことを目的とした研究が行われている。
【０００３】
ＬＰＳ（Lipo poly saccharide）やＣｐＧ（cytosine-phosphate-guanine）は、単回投与でもＴｈ１免疫反応の活性化を誘導できることから（例えば非特許文献１４参照）、過度にＴｈ２型に傾いたバランスをＴｈ１型側へ戻すツールとして注目されている。免疫反応の活性化（免疫賦活化）におけるプロセスの一つとして、抗原が抗原提示細胞に取り込まれた後、抗原処理されたペプチド断片がプロセシングによりＭＨＣ（主要組織適合性抗原複合体）分子と結合し、その後抗原提示細胞の細胞表面に発現した抗原をＴｈ細胞が認識して感作が起こることが知られているが（例えば非特許文献１、非特許文献６）、ＬＰＳやＣｐＧによるＴｈ１免疫反応の活性化（Ｔｈ１免疫賦活化）は、上記プロセスとは異なり、ＬＰＳやＣｐＧがＴＬＲ（Tall-like receptor）のリガンドとして直接抗原提示細胞を刺激して宿主に免疫反応を起こすことから、ＬＰＳやＣｐＧはＴｈ１免疫賦活活性を有する物質（Ｔｈ１ activator）としての有用性が高いことが知られている。また、上記Ｔｈ１免疫賦活活性を有する物質は、それ単独でＴｈ１免疫賦活化ができるので、Ｔｈ１免疫反応のメカニズムを解明する基礎研究、例えば抗原提示細胞における細胞内刺激伝達経路を解明する研究などにも応用されていることが知られている（例えば非特許文献１４参照）。
【０００４】
他方、Ｔｈ２免疫賦活活性を有する物質の探索も行われており、それらの中でも、例えばマイコプラズマの菌体表面に存在する不溶性物質（リポペプチド）であるＰａｍ−３−ｃｙｓ（例えば非特許文献３参照）やＦＳＬ−１（例えば非特許文献４参照）などが、ＴＬＲ２（Tall-like receptor ２）を介して直接抗原提示細胞に作用することにより、Ｔｈ２免疫賦活化することが報告されているが、一方で、これらの物質は、Ｔｈ２サイトカインに加えてＴｈ１サイトカイン（ＩＬ−６など）の産生も増加する効果があること（例えば非特許文献１４参照）、Ｔｈ２免疫賦活化にはｉｎ ｖｉｔｒｏの実験系においても高用量必要（例えば非特許文献４参照）であること、Ｔｈ２免疫賦活化による効果が十分でない（例えば非特許文献１４参照）ことも知られている。さらに、強いＴｈ２免疫賦活化を引き起こす消化管寄生虫からＴｈ２免疫賦活活性を有する物質を探索する研究も行われており、その結果、いくつかＴｈ２免疫賦活化する物質が同定されているが、それらの物質は単なる抗原としてアジュバントが必要であったり、頻回投与による感作・チャレンジが必要であったり（例えば非特許文献６参照）、又はｉｎ ｖｉｔｒｏでしかその効果が認められない（例えば非特許文献８参照）ことが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Mosmann TR, Sad S. 1996. The expanding universe of T-cell subsets: Th1, Th2 and more. Immunol Today. 17(3): 138-46.
【非特許文献２】Bordier C. 1981. Phase separation of integral membrane proteins in TritonX-114 solution. J Biol Chem. 256(4): 1604-7.
【非特許文献３】Hasebe A, Mu HH, Washburn LR, Chan FV, Pennock ND, Taylor ML, Cole BC. 2007. Inflammatory lipoproteins purified from a toxigenic and arthritogenic strain of Mycoplasma arthritidis are dependent on Toll-like receptor 2 and CD14. Infect Immun. 75(4): 1820-6.
【非特許文献４】Kiura K, Kataoka H, Yasuda M, Inoue N, Shibata K. 2006. The diacylated lipopeptide FSL-1 induces TLR2-mediated Th2 responses. FEMS Immunol Med Microbiol. 48(1): 44-55.
【非特許文献５】N. Ishikawa, Y. Horii, Y. Nawa. 1994. Inhibitory effects of concurrently present ’normal’ Nippostrongylus brasiliensis worms on expulsion of ’damaged’ worms and associated goblet cell changes in rats. Parasite Immunology. 16: 329-332.
【非特許文献６】Wilson MS, Elnekave E, Mentink-Kane MM, Hodges MG, Pesce JT, Ramalingam TR, Thompson RW, Kamanaka M, Flavell RA, Keane-Myers A, Cheever AW, Wynn TA. 2007. IL-13Ralpha2 and IL-10 coordinately suppress airway inflammation, airway-hyperreactivity, and fibrosis in mice. J Clin Invest. 117(10): 2941-51.
【非特許文献７】R W Summers, D E Elliott, J F Urban Jr, R Thompson, J V Weinstock. 2005. Trichuris suis therapy in Crohn’s disease. Gut. 54: 87-90.
【非特許文献８】Li Q, Kumar A, Gui JF, Yu FS. 2008. Staphylococcus aureuslipoproteins trigger human corneal epithelial innate response through toll-like receptor-2. Microb Pathog. 44(5): 426-34.
【非特許文献９】Metcalfe DD.1984. Mast cell mediators with emphasis on intestinal mast cells. Ann Allergy. 53: 563-75.
【非特許文献１０】McKenzie GJ, Bancroft A, Grencis RK, McKenzie AN. 1998. A distinct role for interleukin-13 in Th2-cell-mediated immune responses. Curr Biol. 8(6): 339-42.
【非特許文献１１】Perdue MH, Ramage JK, Burget D, Marshall J, Masson S. 1989. Intestinal mucosal injury is associated with mast cell activation and leukotriene generation during Nippostrongylus-induced inflammation in the rat. Dig Dis Sci. 34(5): 724-31.
【非特許文献１２】Holland MJ, Harcus YM, Riches PL, Maizels RM. 2000. Proteins secreted by the parasitic nematode Nippostrongylus brasiliensis act as adjuvants for Th2 responses. Eur J Immunol. 30(7): 1977-87.
【非特許文献１３】Dullemen HMV. 1994. Treatment of Crohn’s disease with anti-tumor necrosis factor chimeric antibody (cA2). Gastroentrerol. 109: 129-135.
【非特許文献１４】Dillon S, Agrawal A, Van Dyke T, Landreth G, McCauley L, Koh A, Maliszewski C, Akira S, Pulendran B. 2004. A Toll-like receptor 2 ligand stimulates Th2 responses in vivo, via induction of extracellular signal-regulated kinase mitogen-activated protein kinase and c-Fos in dendritic cells. J Immunol. 172(8): 4733-43.
【非特許文献１５】Kamiya M, Oku Y, Itayama H, Ohbayashi M. 1985. Prolonged expulsion of adult Trichinella spiralis and eosinophil infiltration in mast cell-deficient W/Wv mice. J Helminthol. 59(3): 233-9.
【非特許文献１６】Carter LL, Dutton RW. 1996. Type 1 and type 2: a fundamental dichotomy for all T-cell subsets. Curr Opin Immunol. 8(3): 336-42.
【非特許文献１７】Urban JF Jr, Madden KB, Svetic A, Cheever A, Trotta PP, Gause WC, Katona IM, Finkelman FD. 1992. The importance of Th2 cytokines in protective immunity to nematodes. Immunol Rev. 127: 205-20.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ｉｎ ｖｉｖｏで使用する上でＴｈ２免疫賦活活性の十分な効果を有する物質は、未だ見つかっていないのが現状である。そのため、Ｔｈ２免疫賦活活性を有する物質の探索は、Ｔｈ１側に傾いた免疫反応のバランスをＴｈ２側に戻す治療薬としてだけでなく、Ｔｈ２免疫賦活化の初期におけるメカニズムを解明し、アレルギーの予防、又は治療薬開発のための知見を得るためにも重要であると考えられている。本発明の課題は、ｉｎ ｖｉｖｏで強いＴｈ２免疫賦活化を引き起こすＴｈ２免疫賦活剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この分野の研究者は、消化管蠕虫性寄生虫のＴｈ２免疫賦活作用に着目し、専ら消化管蠕虫性寄生虫の水溶性抽出画分についてのＴｈ２免疫賦活作用について検討をしてきた（例えば非特許文献８）。しかし、本発明者は、消化管蠕虫性寄生虫の水溶性抽出画分のＴｈ２免疫賦活作用では実用化の限界があると考えていた。最近、消化管蠕虫性寄生虫の一種であるニッポストロンジラス・ブラジリエンシス（Nippostrongylus brasiliensis）（以下「Ｎｂ」ということがある）を感染させたラットからＮｂを採取し、別のラットにＮｂを感染させる実験において、排除時期に物理的な傷害を受けたＮｂの方が感染初期に採取したＮｂと比べて早期にＴｈ２賦活化反応を起こし、Ｎｂが排除されることが報告された（例えば非特許文献５）。これらの結果から、本発明者は、Ｎｂから漏出した成分には高いＴｈ２免疫賦活作用があるのではないかと考え、その成分を探索するために、精製やその後の製剤化が不利と考えられるＮｂの水難溶性画分について検討することとした。そして、界面活性剤の１つであるTritonX-114を用いて抽出したＮｂ由来の界面活性剤画分（水難溶性画分）には、従来技術では得られていない高いＴｈ２免疫賦活作用があることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、（１）寄生虫から界面活性剤を用いて抽出した界面活性剤画分から界面活性剤を除去した脱界面活性剤抽出画分を有効成分とすることを特徴とするＴｈ２免疫賦活剤や、（２）脱界面活性剤抽出画分の有効成分が、ペプチドを含むことを特徴とする上記（１）記載のＴｈ２免疫賦活剤や、（３）寄生虫が蠕虫性寄生虫であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載のＴｈ２免疫賦活剤や、（４）蠕虫性寄生虫がニッポストロンジラス・ブラジリエンシス（Nippostrongylus brasiliensis）であることを特徴とする上記（３）記載のＴｈ２免疫賦活剤や、（５）界面活性剤がTritonX-114（登録商標）であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載のＴｈ２免疫賦活剤や、（６）Ｔｈ２免疫賦活活性の有無をＩｇＥ量の増加、好酸球数の増加、又はＩＬ−４発現量の増加に基づいて判定することを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載のＴｈ２免疫賦活剤や、（７）経口投与の形態で用いられることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか記載のＴｈ２免疫賦活剤に関する。
【０００９】
また本発明は、（８）上記（１）〜（７）のいずれか記載のＴｈ２免疫賦活剤を含有することを特徴とする免疫賦活活性を有する組成物に関する。
【００１０】
さらに本発明は、（９）（ａ）寄生虫又はその処理物と界面活性剤含有水溶液とを混合する工程；（ｂ）水層と界面活性剤層との層分離処理を行う工程;（ｃ）界面活性剤画分を採取する工程；（ｄ）界面活性剤画分から界面活性剤の除去処理を行い、脱界面活性剤抽出画分を得る工程；を備えたことを特徴とするＴｈ２免疫賦活剤の製造方法や、（１０）寄生虫の処理物が、寄生虫の物理的破壊処理物であることを特徴とする上記（９）記載の製造方法や、（１１）寄生虫が蠕虫性寄生虫であることを特徴とする上記（９）又は（１０）記載の製造方法や、（１２）蠕虫性寄生虫がニッポストロンジラス・ブラジリエンシス（Nippostrongylus brasiliensis）であることを特徴とする上記（１１）記載の製造方法や、（１３）界面活性剤がTritonX-114（登録商標）であることを特徴とする上記（９）〜（１２）のいずれか記載の製造方法や、（１４）工程（ｄ）における界面活性剤の除去処理が、タンパク質の沈殿処理を含むことを特徴とする上記（９）〜（１３）のいずれか記載の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
従来技術（例えば非特許文献６、非特許文献８参照）によると、Ｔｈ２免疫賦活化を引き起こす物質は、単なる抗原としてアジュバントが必要なものや、頻回投与による感作・チャレンジが必要なものや、ｉｎ ｖｉｔｒｏでしかその活性効果が認められないのに対し、本発明のＴｈ２免疫賦活剤によると、単回の経口投与によるＴｈ２免疫賦活剤、特にアジュバントを併用しなくてもよい副作用の少ない免疫賦活剤の開発や、ワクチン開発に繋がることが期待でき、さらに、Ｔｈ２免疫賦活化の初期におけるメカニズムを解明する基礎研究にとっても有用なツールとなることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明のＴｈ２免疫賦活剤（ＴＸ）、寄生虫全成分（ＡＷ）又はＰＢＳの投与後７日及び１４日における各群の体重を示す図である。
【図２】ＴＸ、ＡＷ又はＰＢＳの投与後７日及び１４日における各群の小腸重量（ｇ／ＢＷｇ×１００）を示す図である。
【図３】ＴＸ、ＡＷ又はＰＢＳの投与後７日及び１４日における各群の脾臓重量（ｇ／ＢＷｇ×１００）を示す図である。
【図４】ＴＸ、ＡＷ又はＰＢＳの投与後７日及び１４日における各群の腸間膜リンパ節重量（ｇ／ＢＷｇ×１００）をグラフで示す図である。
【図５】ＴＸ、ＡＷ又はＰＢＳの投与後７日及び１４日における各群の末梢血中の好酸球数を示す図である。
【図６】ＴＸ又はＰＢＳの投与後７日及び１４日における各群の血清中のＩｇＥ濃度を示す図である。
【図７】ＴＸ又はＰＢＳの投与後７日における各群の脾臓及び腸間膜リンパ節でのＩＬ−４ｍＲＮＡ発現量（ＰＢＳ投与群を１．００とする。）を示す図である。縦軸は、２の指数値を表す。
【図８】ＰＢＳ投与群における投与後７日の小腸（Ｈ−Ｅ染色切片）の光学顕微鏡（１６０倍）観察の結果を示す図である。
【図９】ＰＢＳ投与群における投与後７日の小腸（アルシアンブルー染色切片）の光学顕微鏡（１６０倍）観察の結果を示す図である。
【図１０】ＡＷ群における投与後７日の小腸（Ｈ−Ｅ染色切片）の光学顕微鏡（１６０倍）観察の結果を示す図である。
【図１１】ＡＷ群における投与後７日の小腸（アルシアンブルー染色切片）の光学顕微鏡（１６０倍）観察の結果を示す図である。
【図１２】ＴＸ群における投与後７日の小腸（Ｈ−Ｅ染色切片）の光学顕微鏡（１６０倍）観察の結果を示す図である。
【図１３】ＴＸ群における投与後７日の小腸（アルシアンブルー染色切片）の光学顕微鏡（１６０倍）観察の結果を示す図である。
【図１４】ＴＸ群、ＳＤＳ処理ＴＸ群又はＰｒｏＫ処理ＴＸ群における投与後３日及び５日目の各群の末梢血中の好酸球数を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のＴｈ２免疫賦活剤としては、寄生虫から界面活性剤を用いて抽出した界面活性剤画分から界面活性剤を除去した脱界面活性剤抽出画分を有効成分として含有するものであれば特に制限されず、また、本発明のＴｈ２免疫賦活剤の製造方法としては、寄生虫又はその処理物と界面活性剤含有水溶液とを混合する工程（ａ）；水層と界面活性剤層との層分離処理を行う工程（ｂ）；界面活性剤画分を採取する工程（ｃ）；界面活性剤画分から界面活性剤の除去処理を行い、脱界面活性剤抽出画分を得る工程（ｄ）；を備えた方法であれば特に制限されず、ここで「Ｔｈ２免疫賦活剤」とは、Ｔｈ２免疫反応を活性化する作用を有するものをいう。
【００１４】
上記寄生虫としては、胞子虫類、根足虫類、鞭毛虫類等の単細胞からなる原虫性寄生虫や、線虫、吸虫類、条虫類等の多細胞からなる蠕虫性寄生虫を挙げることができるが、蠕虫性寄生虫に感染するとＴｈ２免疫賦活化が起こることから、蠕虫性寄生虫が好ましい。蠕虫性寄生虫のうち、マウスに感染する蠕虫性寄生虫としては、例えばTrichuris muris、Trichinella spiralis、ニッポストロンジラス・ブラジリエンシス（Nippostrongylus brasiliensis）、Heligmonsomoides polygyrus、Hymenolepsis nana等を挙げることができ、ラットに感染する蠕虫性寄生虫としては、例えばAngiostrongylus等を挙げることができ、豚に感染する蠕虫性寄生虫としては、例えばTrichuris suis、Ascaris suum等を挙げることができ、イヌ又はネコに感染する蠕虫性寄生虫としては、例えばTrichuris vulpis、Toxocara、Gnathostoma、Ancylostoma等を挙げることができ、海洋哺乳動物に感染する蠕虫性寄生虫としては、例えばAnisakis、Pseudoterranova等を挙げることができ、鳥類に感染する蠕虫性寄生虫としては、例えばS. douthitti、Trichobilharzia ocellata、T. stagnicolae、T. physellae、Gigantobilharzia huronensis等を挙げることができ、これらの中でもニッポストロンジラス・ブラジリエンシスを好適に例示することができる。
【００１５】
上記界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤及びイオン性界面活性剤を挙げることができ、これらのうち、非イオン性界面活性剤として、例えばTritonX-100、TritonX-114、NP-40、Tween-20、Tween-80等を挙げることができ、両イオン性界面活性剤として、例えば７ＢｚＯ、ＳＢ３−１０、ＳＢ３−１４、ＣＨＡＰＳ、アミドスルホベタイン−１４（ＡＳＢ１４）等を挙げることができ、イオン性界面活性剤として、例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等を挙げることができ、これらの中でも曇点が約２０℃であり、生理的な条件下で水溶液画分と界面活性剤画分に分離することができるため、TritonX-114が好ましい。
【００１６】
上記脱界面活性剤抽出画分には、例えば寄生虫の構成成分であるポリヌクレオチド、ペプチド、脂質、糖質等が含まれている可能性があり、これらの中でもプロテアーゼ処理によりＴｈ２免疫賦活活性が失われるため、ペプチドが含まれている可能性が大きい。かかる脱界面活性剤抽出画分は以下のようにして調製することができる。
【００１７】
まず、寄生虫又はその処理物と界面活性剤含有水溶液とを混合する。上記寄生虫の処理物を得るための方法としては、寄生虫と界面活性剤含有水溶液とを混合する前に、界面活性剤含有水溶液が浸透しやすいように寄生虫を破壊した処理方法が好ましく、例えば生化学的破壊処理、物理的破壊処理等を挙げることができるが、寄生虫を効果的且つ効率的に破壊処理することができる物理的破壊処理が好ましい。物理的破壊処理における処理方法としては、例えば凍結融解法、超音波破砕処理法、ホモジナイザーによる破砕法、ガラスビーズによる破砕法等を挙げることができ、これらの中でも超音波破砕処理法を好適に例示することができる。
【００１８】
上記界面活性剤含有水溶液としては、上記界面活性剤を含有している水溶液であればよく、界面活性剤の濃度は、使用する界面活性剤の種類に応じて公知の使用マニュアル（例えばMolecular Cloningなど）により適宜選択することができ、例えばTritonX-114を用いる場合、０．２％〜１０％が好ましく、１％〜３％がより好ましい。また、必要に応じて、緩衝剤、タンパク質分解酵素阻害剤、防腐剤等を添加してもよい。
【００１９】
次に、水層と界面活性剤層との層分離処理を行う。かかる層分離処理としては、界面活性剤含有水溶液をその曇点より低い温度から高い温度へ上昇させるとミセル形成ができなくなり、水層と界面活性剤層とに分離する現象を利用した処理が好ましく、界面活性剤としてTritonX-114を用いる場合、その曇点が約２０℃であるため、曇点より低い温度としては、０℃〜２０℃、好ましくは２℃〜１０℃を、曇点より高い温度としては、２０℃〜４２℃、好ましくは３０℃〜４０℃をそれぞれ例示することができる。
【００２０】
続いて、界面活性剤画分を採取する。かかる採取方法としては、水層と界面活性剤層とに層分離した界面活性剤含有水溶液から、界面活性剤層を界面活性剤画分として採取できる方法であればよく、界面活性剤は水と比べ比重が重いため、水層よりも界面活性剤層の方が下に分離することから、水層部分をデカンテーションやピペットなどにより回収することで除く方法等を挙げることができる。
【００２１】
次いで、界面活性剤画分から界面活性剤の除去処理を行い、脱界面活性剤抽出画分を得る。界面活性剤画分から界面活性剤の除去方法としては、例えばカラム、限外ろ過膜などを用いた非変性条件下で行う方法や、メタノール沈殿、エタノール沈殿、アセトン沈殿、ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）沈殿などを用いた変性条件下で行う方法等を挙げることができるが、変性条件下でもＴｈ２免疫賦活活性は消失しないため、操作の簡易性及び費用対効果の面から考慮すると、変性条件下で行う方法が好ましい。このように、界面活性剤画分から界面活性剤を除去すると、本発明のＴｈ２免疫賦活剤の有効成分である脱界面活性剤抽出画分を得ることができる。
【００２２】
上記脱界面活性剤抽出画分がＴｈ２免疫賦活活性を有することを確認する方法としては、例えばＴｈ２免疫賦活により誘導される（増加する）物質、Ｔｈ２免疫賦活により抑制される（減少する）物質等を指標とする方法を挙げることができ、これらの中でもＴｈ２免疫賦活により増加する物質を指標にして行うことが好ましい。かかるＴｈ２免疫賦活により増加する物質として、例えばＩｇＥ、好酸球、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３など）等を挙げることができ、これらの中でもＩｇＥ、好酸球、IL−４を好適に例示することができる。
【００２３】
本発明のＴｈ２免疫賦活活性を有する組成物としては、本発明のＴｈ２免疫賦活剤を含有するものであれば特に制限されず、本発明のＴｈ２免疫賦活剤を医薬用の治療剤として用いる場合などの、Ｔｈ２免疫賦活剤に薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤等の各種調剤用配合成分が添加された組成物や、本発明のＴｈ２免疫賦活剤をサプリメントとして用いる場合などの、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の配合成分が添加された組成物を例示することができる。
【００２４】
本発明のＴｈ２免疫賦活剤やＴｈ２免疫賦活活性を有する組成物の投与形態としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で投与する経口投与や、溶液、乳剤、懸濁液等の剤型を注射、又はスプレー剤の型で鼻孔内投与する非経口投与を挙げることができるが、単回の経口投与でも十分Ｔｈ２免疫賦活効果があるため、経口投与が好ましい。また、本発明のＴｈ２免疫賦活剤やＴｈ２免疫賦活活性を有する組成物は、クローン病などの組織障害性疾患や、慢性関節リウマチ、自己免疫性肝炎などの臓器特異的自己免疫疾患に有用な医薬品、サプリメント、機能性食品として用いることができる。かかる機能性食品としては、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、チーズ、バター等の乳製品や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜を挙げることができる。
【００２５】
以下実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はかかる実施例により制限されるものではない。実施例において、全てのデータは、平均±標準誤差（ＳＥ）で示し、統計学的解析を用いた有意差の検定はMann-Whitney U-testにより行った。平均値間の相違は、Ｐ−ｖａｌｕｅが０．０５未満であるときに有意とした。なお、本実施例におけるラットとしては、ＳＤラット（Ｓｌｃ社）又はＷｉｓｔａｒラット（Ｓｌｃ社）を用い、マウスとしては、ＩＣＲマウス（Ｓｌｃ社）（雌・８週齢・ＳＰＦ）を用いた。また、本実施例におけるラットの飼育方法としては、解剖時までウッドチップ（滅菌済み）を敷いたプラスチックケージで、１２０℃、２０分間加熱滅菌した試料（日本クレア、ＣＥ−２、大阪、日本）と水道水を自由摂取させる方法を用い、マウスの飼育方法としては、ウッドチップを敷いたメタルケージ（共に加熱滅菌済み）で、１２０℃、２０分間加熱滅菌した飼料（日本クレア、ＣＥ−２、大阪、日本）と水道水を自由摂取させる方法を用いた。なお、上記ラット及びマウスの飼育方法は、山口大学農学部動物実験指針に従って行った。
【実施例１】
【００２６】
[Ｎｂの継代方法及び回収方法]
ニッポストロンジラス・ブラジリエンシス（Ｎｂ）（東京慈恵会医科大学より分与）は、ラットを用いて継代及び増殖させた後、回収した。Baermann法により第３期幼虫（Ｌ３）におけるＮｂ３５００〜４０００隻／匹を回収した（工程１）後、Ｎｂをラットの鼠径部皮下に接種し、８日後に成虫となったＮｂから排出された卵を含むラットの結腸便及び盲腸便を採取した（工程２）。その後、Ｎｂから排出された卵をチャコール培養法を行いてＬ３まで成長させた（工程３）。再び工程１〜工程３を繰り返すことにより、Ｎｂの継代及び増殖を行った。また、Ｎｂの回収はBaermann法により以下に述べる手順で行った。すなわち、Ｎｂの接種から８日後のラットの小腸を採取し、縦に切り開いた後、２００ｍｌのメートルグラスの口を覆うようにクリップで留めたガーゼの上に載せ０．９％生理食塩水（ＰＢＳ）に浸し、Ｎｂが濾過されるように３７℃の条件下で１時間放置した。その後、底に沈んだＮｂを少量の生理食塩水とともに採取し、濾紙を乗せた漏斗に移して約８０ｍｌの生理食塩水を数回通し、濾過洗浄した後、Ｎｂを回収した。
【実施例２】
【００２７】
[TritonX-114による脱界面活性剤画分の取得方法]
上記実施例１により回収した成虫Ｎｂ約２０００匹にＴＥ（Tris-EDTA Buffer）１ｍｌを加えた後、超音波破砕処理をBRANSON SONIFIER 450を用いて行った。上記処理により得られた超音波破砕処理物に対して、１０％TritonX-114（Sigma-Aldrich社製）溶液を０．２５ｍｌ加え、４℃で２．５時間静置した後、遠心処理（１３０００ｒｐｍ、３分間、４℃）により上清を回収し、その後静置処理（３７℃、１０分間）及び遠心処理（１３０００ｒｐｍ、５分間、２４℃）により層分離を行った後（例えば非特許文献２、非特許文献８参照）、上層（水層）を除去した下層（界面活性剤層）へ１ｍｌＴＥ及び、２．５倍量のエタノールに加え、その後−４℃で一晩静置した後、遠心処理（３０００ｒｐｍ、２０分、４℃）により得られた沈殿（脱界面活性剤画分）を、０．２ｍｌＰＢＳに懸濁した。
【実施例３】
【００２８】
[脱界面活性剤画分のマウスへの経口投与]
上記実施例２により得られた脱界面活性剤画分のタンパク質量をBradford法を用いて測定した後、タンパク質濃度が１５０μｇ／５００μｌとなるようにオリーブ油で希釈した脱界面活性剤画分を、マウスに経口投与する群を脱界面活性剤画分投与（ＴＸ）群とした。また、コントロールとして、上記脱界面活性剤画分の代わりにＰＢＳを、マウスに経口投与する群をＰＢＳ投与（ＰＢＳ）群とした。さらに、成虫Ｎｂ約２０００匹に対してＴＥ１ｍｌを加えて超音波破壊処理を行って得られた超音波破砕処理物を、１５０μｇ／５００μｌとなるようにオリーブ油で希釈した後、その超音波破砕処理物をマウスに経口投与する群をＮｂ投与（ＡＷ）群とした。すなわち、ＴＸ群、ＰＢＳ群、及びＡＷ群の計３群に分けて、ゾンデを用いた経口（胃内）投与を行った。
【００２９】
マウスに経口投与した後、７日及び１４日に各群の体重（ｇ）を測定した結果、ＰＢＳ群、ＡＷ群やＴＸ群の各群において、体重に有意な差は認められなかった（図１）。
【００３０】
消化管寄生蠕虫感染時に認められる生体反応として、腸管でのマスト細胞及び杯細胞の増加、杯細胞からの粘液分泌の亢進、腸間膜リンパ節やパイエル板の腫大等が知られている（例えば非特許文献１７参照）。またＮｂ感染個体の小腸では、活性化した粘膜型マスト細胞が産生するロイコトリエンやヘパリン（例えば非特許文献９参照）、ヒスタミン放出による腸管上皮の透過性亢進等によって浮腫が生じる（例えば非特許文献１１参照）ことが報告されており、マスト細胞数の増加もＴｈ２サイトカインの産生増加によって生ずると考えられている（例えば非特許文献１１参照）。そこで、もし寄生虫由来の脱界面活性剤画分の経口投与によりＴｈ２免疫反応が活性化がされるとすれば、ＴＸ群のマウス小腸に浮腫が生じ、小腸の重量が増加していることが予想される。そこで、小腸の重量を測定した（図２）。また、比較対照として脾臓及び腸間膜リンパ節の重量についても測定した（図３及び図４）。経口投与した後、7日及び１４日のいずれの場合においても、ＰＢＳ群やＡＷ群と比べ、ＴＸ群の方が小腸の重量（ｇ／ＢＷｇ×１００）は有意に少なかった（図２）。また、脾臓重量（ｇ／ＢＷｇ×１００）及び腸間膜リンパ節重量（ｇ／ＢＷｇ×１００）については、ＰＢＳ群、ＡＷ群やＴＸ群の各群において有意差は認められなかった（図３及び図４）。
【００３１】
さらに、小腸において、Ｔｈ２免疫賦活化が原因で生じる炎症等による組織変化が見られるかどうかを調べるために、病理組織学的観察を行った。病理組織標本は、以下の手順により作製した。すなわち、ＰＢＳ群、ＡＷ群、及びＴＸ群の各群において、経口投与後７日や１４日のマウスを、それぞれエーテル麻酔した後、ヘパリン化シリンジを用いて心臓からの全採血により安楽殺させ、その後脾臓、腸間膜リンパ節、肝臓、及び十二指腸基部から空腸を採材した後、カルノア液で固定し、その後４μｍのパラフィン切片（病理組織標本）を作製した。上記病理組織標本を、定法のヘマトキシリン・エオジン（Ｈ−Ｅ）染色、及びアルシアンブルー染色を施した後、光学顕微鏡により観察した結果、寄生虫感染による粘膜固有層の水腫は認められなかった（図８〜図１３）。また、Ｔｈ２免疫賦活化によりＴｈ２サイトカインが、肥満（マスト）細胞数や杯細胞数を増加することが報告されているため、上記病理組織標本におけるマスト細胞数及び杯細胞数を、マウス１頭につき絨毛−陰窩を１単位として１０単位以上計数して平均値を求め、小腸粘膜１絨毛あたりの細胞数（細胞数／絨毛陰窩単位）として算出した結果、マスト細胞数はＰＢＳ群の０．１２に対してＴＸ群では０．１６とほとんど差はなく、また同様に、杯細胞は対照群の４．２に対してＴＸ群では４．１とほとんど差が認められなかった。
【００３２】
病理組織学的観察からは、Ｔｈ２免疫賦活化が起こっているかどうかはわからなかったので、次にＴｈ２免疫賦活化の有無を検証する別の指標として、ＩｇＥ量の増加、好酸球数の増加、及びＩＬ−４ｍＲＮＡ量の増加を用いて解析を行った。ＩｇＥ量を測定するために、各群から採取した末梢血から遠心分離（１２０００ｒｐｍ、３０分）により調製した血清を、−８０℃で凍結保存した後、マウスＩｇＥ測定キット（森永生科学研究所）を用いてＥＩＡサンドイッチ法により解析を行った（図６）。その結果、経口投与後７日での末梢血中のＩｇＥ濃度（ｎｇ／ｍｌ）は、ＰＢＳ群とＴＸ群の各群において有意差は認められなかったのに対し、経口投与後１４日でのＩｇＥ濃度は、ＰＢＳ群と比べＴＸ群の方が４．３倍高く、有意に上昇していた（図６）。
【００３３】
また、好酸球数を計測するために、心採血により採取した血液の一部をHinkelmann液（０．５％ yellow eosin、０．５％ phenol、０．５％ formalin）で１０倍希釈し、穏やかに攪拌した後、好酸球計算盤（ＴＡＴＡＩ）を用いて好酸球数の計数を行った（図５）。その結果、経口投与後７日での末梢血中の好酸球数（好酸球数／０．１ｍｍ３）は、ＰＢＳ群と比べてＡＷ群の方が２．４倍、ＰＢＳ群に比べてＴＸ群の方が６．８倍増加しており、さらにＡＷ群に比べてＴＸ群の方が２．９倍増加しており、それぞれ有意差が認められた。他方、経口投与後１４日では、ＴＸ群における好酸球数（好酸球数／０．１ｍｍ３）は、７日と比べ減少しており、ＰＢＳ群と有意差は認められなかった（図５）。
【００３４】
さらに、ＩＬ−４ｍＲＮＡ量の検出するために、以下の手順に従ってＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、及び定量ＰＣＲによるｍＲＮＡの検出を行った。すなわち、経口投与後７日のＴＸ群及びＰＢＳ群におけるマウスの脾臓の一部、並びに腸間膜リンパ節から、ＲＮｅａｓｙＴＭＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてマニュアルに従い、ＲＮＡを抽出した。続いて、抽出したＲＮＡ１０μｌにランダムプライマー（Invitrogen社製）を１μｇ加え、７０℃で１０分間、直ちに氷上で静置した後、５×ＲＴ ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ、０．１Ｍ ＤＴＴ、ＲＮＡｓｉｎ（Promega社製）を加えて１９μｌとし、４２℃で２分間、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Invitrogen社製）１μｌを加えて計２０μｌとし４２℃で５０分間、７０℃で１５分間反応させることでｃＤＮＡを合成した。さらに、合成したｃＤＮＡ、ＩＬ−４遺伝子産物（ＩＬ−４ｍＲＮＡ）を増幅するプライマーセット（Applied Biosystems社製）、及びＴａｑＭａｎＴＭＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓキット（Applied Biosystems社製）を用いたＳｔｅｐ ＯｎｅＴＭＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Applied Biosystems社製）によりリアルタイムＰＣＲ法を行い、ＩＬ−４のｍＲＮＡ量を定量した。ＰＣＲの条件としては、５０℃で２分間、９５℃で１０分間を１サイクル、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を５０サイクルとして行った。なお、コントロールとしてハウスキーピング遺伝子である１８ｓ ｒＲＮＡｍＲＮＡを増幅するプライマーセット（Applied Biosystems社製）を用いたリアルタイムＰＣＲ法を行い、算出された１８ｓ ｒＲＮＡｍＲＮＡ量の値によりＩＬ−４ｍＲＮＡ量の値を標準化した。さらに、ＰＢＳ群におけるＩＬ−４ｍＲＮＡ量の値を１とした場合のＴＸ群におけるＩＬ−４ｍＲＮＡ量の値を算出した（図７）。その結果、脾臓では、ＰＢＳ群と比べＴＸ群におけるＩＬ−４ｍＲＮＡ量に有意差は認められなかった。他方、腸間膜リンパ節では、ＰＢＳ群と比べＴＸ群におけるＩＬ−４ｍＲＮＡ発現は１２８倍上昇しており、有意差が認められた（図７）。
【００３５】
脱界面活性剤画分の有効成分がペプチド（タンパク質を含む）であるかどうかを調べるために、タンパク質の変性剤であるＳＤＳ及びタンパク質分解酵素であるＰｒｏＫ（Sigma社製）を用いて検討した。すなわち、脱界面活性剤画分を、０．５％ ＳＤＳ／ＴＥ溶液中、又は０．００１％ ＰｒｏＫ／（０．５％ ＳＤＳ／ＴＥ）溶液中で、３７℃、１２時間処理を行った後、２．５倍量のエタノールに加え、その後−４℃で一晩静置した後、遠心処理（３０００ｒｐｍ、２０分、４℃）により得られた沈殿物を、０．２ｍｌ ＰＢＳに懸濁した。かかる沈殿物のうち、ＳＤＳ処理したものをマウスへ経口投与する群をＳＤＳ処理ＴＸ群、ＰｒｏＫ処理したものをマウスへ経口投与する群をＰｒｏＫ処理ＴＸ群とし、投与後３日及び５日における好酸球数を算出した（図１４）。その結果、投与後３日及び５日のいずれの場合においても好酸球数はＴＸ群と比べＰｒｏＫ処理ＴＸ群では著しく減少し、有意差が認められた。また、ＳＤＳ処理ＴＸ群においても、わずかであるが有意な減少が認められた。
【００３６】
〔考察〕
本発明における実施例３では、Ｎｂ由来の脱界面活性剤画分の経口投与によってＴｈ２免疫賦活化が起こるかどうかを検証するために、Ｔｈ２免疫賦活化の指標とされる種々の反応を用いた。その結果、投与後７日で末梢血中の好酸球数及び腸間膜リンパ節でのＩＬ−４ｍＲＮＡ量の著明な増加が認められた（図５及び図７）。さらに、Ｎｂの全成分を投与したＡＷ群における末梢血中の好酸球数は、ＰＢＳを投与したＰＢＳ群と比べ有意に増加していたが、その割合は脱界面活性剤画分を投与したＴＸ群と比べると有意に低かった。このことは、Ｔｈ２免疫賦活化する有効成分がＮｂに含まれていることを示すだけでなく、上記有効成分は本実施例により分離した脱界面活性剤画分に主に含まれていることを示している。
【００３７】
腸間膜リンパ節でのＩＬ−４ｍＲＮＡ量の増加や好酸球数の増加は、投与後７日で認められたが、末梢血中のＩｇＥ濃度の増加は投与後７日では認められず、１４日で認められた。他方、好酸球数は、投与後１４日ではＰＢＳ群と同程度まで減少していた。これらの結果は、Ｎｂ由来の脱界面活性剤画分の投与によって少なくとも７日目にはＴｈ２免疫賦活化が起こること、及び、１４日目にはＴｈ２免疫賦活化レベルは通常状態に戻るが、Ｔｈ２免疫反応の活性化によりＩＬ−４産生が増加され、その結果ＩｇＥ濃度が上昇することを示している。以前本発明者は、Ｎｂは投与後７日までにほとんどが排除され、その排除にはＴｈ２免疫賦活化が必須であること、及びＩｇＥ濃度の増加は投与後１４日に初めて認められることを示しており、本実施例はこれらの結果を支持している。
【００３８】
Ｎｂ感染時に認められる生体反応として、腸管でのマスト細胞及び杯細胞の増加、杯細胞からの粘液分泌の亢進、腸間膜リンパ節やパイエル板の腫大などが知られている（例えば非特許文献１７参照）。またＮｂが感染した小腸では、活性化した粘膜型マスト細胞が産生するロイコトリエンやヘパリン（例えば非特許文献９参照）、ヒスタミン放出による腸管上皮の透過性亢進等によって浮腫が生じる（例えば非特許文献９、非特許文献１１参照）ことが報告されており、マスト細胞数の増加もＴｈ２サイトカインの産生増加によって生ずると考えられている（例えば非特許文献１１、非特許文献１７参照）。本実施例におけるＮｂ由来の脱界面活性剤画分による投与においても、Ｔｈ２免疫賦活化による浮腫が生じ、その結果ＴＸ群の小腸重量は増加することが予想されたが、逆にＰＢＳ群よりも少ない結果となった（図２）。さらに、病理組織学的観察から、ＴＸ群の小腸において炎症などの反応性変化は認められず、またマスト細胞や杯細胞の数もＰＢＳ群と比べて著明な増加は認められなかった（図８〜図１３）。マスト細胞数の増加には、Ｔｈ２サイトカインに加え、ＳＣＦ（Stem Cell Factor）等の増殖因子も関与していることが報告されている（例えば非特許文献１７参照）。また、ＳＣＦレセプター機能不全の突然変異（Ｗ／Ｗｖ）マウスでは、消化管寄生虫感染時にＴｈ２サイトカインの産生増加が生じても、マスト細胞数が増加しないことが示されている（例えば非特許文献１５参照）。これらの従来技術の知見から、本実施例３において、リンパ節でのＩＬ−４産生増加や、好酸球数の増加が認められたにもかかわらず、マスト細胞数や杯細胞数が増加しなかった原因として、Ｎｂ由来の脱界面活性剤画分の投与は寄生虫感染とは異なり、ＳＣＦの産生等には作用を及ぼさなかった可能性が考えられる。また、杯細胞の増殖には、Ｔｈ２サイトカインの一つであるＩＬ−１３が必須であるとの報告があることから（例えば非特許文献１０参照）、杯細胞数が増えていない原因をより詳細に検証するために、ＩＬ−１３の産生量を検出する必要がある。さらに、消化管寄生虫の排虫によるＴｈ２免疫賦活化は、寄生虫の種類によって賦活化のレベルが違うこと（例えば非特許文献１７参照）、及び好酸球の分化増殖や、ＩｇＥの産生、杯細胞数、マスト細胞数等の増加には、関与するＴｈ２サイトカインに違いがあること（例えば非特許文献１７参照）も報告されており、本実施例におけるＴｈ２免疫反応の活性化のメカニズムをより詳細に解析するためには、それぞれのサイトカインの産生量の変化を基に検証することが必要だと考えられる。
【００３９】
Ｔｈ２免疫反応の活性化のメカニズムとしては、抗原が抗原提示細胞に取り込まれた後、抗原処理されたペプチド断片がプロセシングによりＭＨＣ分子と結合し、その後抗原提示細胞の細胞表面に発現した抗原をＴ細胞が認識して感作が起こり、その後抗原がＴ細胞に侵入することによってＴｈ２免疫賦活化が起こるメカニズムと、抗原提示細胞の細胞表面上に存在するＴＬＲ２（例えば非特許文献３、非特許文献１４参照）等のレセプターに直接作用し、Ｔｈ２免疫賦活化が起こるメカニズムとを、挙げることができるが、アジュバントと混合した頻回投与によりＴｈ２免疫賦活化が起こることが知られている従来技術は（例えば非特許文献６、非特許文献１２参照）、前者のメカニズムによるものと考えられ、他方、本実施例では、経口投与で、且つ単回の投与でも有意にＴｈ２免疫反応を活性化させることができたことから、より直接的な後者のメカニズムによるものと考えることができる。細菌由来のＬＰＳやＣｐＧなど、直接抗原提示細胞に働きかけてＴｈ１免疫賦活化を誘導する物質の発見により、Ｔｈ１免疫賦活化機構の初期反応の研究が進んだこと（例えば非特許文献４、非特許文献１４参照）からも、本発明で用いたＮｂ由来の脱界面活性剤画分が直接抗原提示細胞に作用することがわかれば、未だに不明な点が多いＴｈ２免疫賦活化機構の初期反応のメカニズムの解明にも繋がると考えられる。
【００４０】
Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫反応のバランスが崩れると、様々な免疫疾患が生じると考えられている。Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫反応バランスが過剰にＴｈ１へ傾く病気、すなわちＴｈ１病としては、クローン病、慢性関節リウマチ、自己免疫性肝炎等を挙げることができる。これらの中でもクローン病は、潰瘍性大腸炎とともに炎症性腸疾患と称され、消化管全般で発病しうる慢性疾患であることが知られている。その原因は未だ不明であるが、遺伝的な素因を持ち、主にＩＦＮ−γの粘膜障害性による炎症等の症状を引き起こし、Ｔｈ１免疫反応を過剰に活性化して発症すると考えられている（例えば非特許文献７、非特許文献１３参照）。根本的な治療法はなく、アミノサリチル酸製剤やステロイド剤などの消炎鎮痛剤で寛解を図るとともに、重症例のクローン病治療には免疫抑制剤が用いられてきた。しかし、ステロイドや免疫抑制剤では重度の副作用が懸念されており、近年では、抗ＴＮＦ−α抗体製剤であるインフリキシマブが一般的に使用されているが、単回投与では長期寛解維持が困難な場合が多く、継続的に投与する必要がある（例えば非特許文献１３参照）。従って、本発明の脱界面活性剤画分のうち、強いＴｈ２免疫賦活活性の有効成分はペプチド（タンパク質を含む）である可能性は高いが（図１４）、かかる有効成分の同定や分子構造の解明などさらなる研究が進めば、Ｔｈ１型に過度に傾いたクローン病等の新しい治療法の開発に繋がることが期待される。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明におけるＴｈ２免疫賦活活性を有する組成物は、単回の経口投与により非常に強いＴｈ２免疫賦活化を誘導することができることから、その有効成分の同定や分子構造の解明など研究を進めることにより、Ｔｈ２免疫賦活剤としての薬品や、ワクチン開発に繋がることが期待できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、寄生虫から界面活性剤を用いて抽出した界面活性剤画分から界面活性剤を除去した脱界面活性剤抽出画分を有効成分とするＴｈ２免疫賦活剤や該免疫賦活剤の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫反応において、機能するヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）は、主にタイプＩ（Ｔｈ１）細胞とタイプII（Ｔｈ２）細胞とに分類され（例えば、非特許文献１、非特許文献１６、非特許文献１７参照）、そのうちＴｈ１細胞は細胞性炎症反応に関与することが知られており、かかる細胞性炎症反応としては、例えばＴｈ１細胞が分泌するサイトカイン（Ｔｈ１サイトカイン）であるＩＬ−２やＩＦＮ−γにより誘導される細胞障害性反応、遅延型過敏反応等が知られている。他方、Ｔｈ２細胞は体液性免疫反応に関与することが知られており、かかる体液性免疫反応としては、例えばＴｈ２細胞が分泌するサイトカイン（Ｔｈ２サイトカイン）であるＩＬ−４やＩＬ−５により誘導されるＩｇＥ量増加に伴ったアレルギー反応や、寄生虫からの防御反応等が知られている（例えば非特許文献１７参照）。また、Ｔｈ１サイトカイン及びＴｈ２サイトカインがそれぞれ他方のサイトカインの働きを抑制することにより、免疫反応のタイプがＴｈ１型又はＴｈ２型のどちらか一方に迅速に変化することが知られている（例えば非特許文献１、非特許文献１６参照）。こうした免疫反応のシステムにより、生体内では外来抗原の種類に応じて適切な免疫反応が誘導される（例えば非特許文献１、非特許文献１６参照）が、免疫反応のバランス制御が乱れ、Ｔｈ１型に過度に傾くとクローン病などの組織障害性疾患や、慢性関節リウマチ、自己免疫性肝炎などの臓器特異的自己免疫疾患を引き起こすことが知られている（例えば非特許文献１、非特許文献７、非特許文献１６参照）。また、逆にＴｈ２型に過度に傾くとアレルギー、アトピー、全身性自己免疫疾患などの免疫疾患を引き起こすことが知られている（例えば非特許文献１、非特許文献１６参照）。これらの疾患を治療するために、乱れた免疫反応のバランスを正常な状態に戻すことを目的とした研究が行われている。
【０００３】
ＬＰＳ（Lipo poly saccharide）やＣｐＧ（cytosine-phosphate-guanine）は、単回投与でもＴｈ１免疫反応の活性化を誘導できることから（例えば非特許文献１４参照）、過度にＴｈ２型に傾いたバランスをＴｈ１型側へ戻すツールとして注目されている。免疫反応の活性化（免疫賦活化）におけるプロセスの一つとして、抗原が抗原提示細胞に取り込まれた後、抗原処理されたペプチド断片がプロセシングによりＭＨＣ（主要組織適合性抗原複合体）分子と結合し、その後抗原提示細胞の細胞表面に発現した抗原をＴｈ細胞が認識して感作が起こることが知られているが（例えば非特許文献１、非特許文献６）、ＬＰＳやＣｐＧによるＴｈ１免疫反応の活性化（Ｔｈ１免疫賦活化）は、上記プロセスとは異なり、ＬＰＳやＣｐＧがＴＬＲ（Tall-like receptor）のリガンドとして直接抗原提示細胞を刺激して宿主に免疫反応を起こすことから、ＬＰＳやＣｐＧはＴｈ１免疫賦活活性を有する物質（Ｔｈ１ activator）としての有用性が高いことが知られている。また、上記Ｔｈ１免疫賦活活性を有する物質は、それ単独でＴｈ１免疫賦活化ができるので、Ｔｈ１免疫反応のメカニズムを解明する基礎研究、例えば抗原提示細胞における細胞内刺激伝達経路を解明する研究などにも応用されていることが知られている（例えば非特許文献１４参照）。
【０００４】
他方、Ｔｈ２免疫賦活活性を有する物質の探索も行われており、それらの中でも、例えばマイコプラズマの菌体表面に存在する不溶性物質（リポペプチド）であるＰａｍ−３−ｃｙｓ（例えば非特許文献３参照）やＦＳＬ−１（例えば非特許文献４参照）などが、ＴＬＲ２（Tall-like receptor ２）を介して直接抗原提示細胞に作用することにより、Ｔｈ２免疫賦活化することが報告されているが、一方で、これらの物質は、Ｔｈ２サイトカインに加えてＴｈ１サイトカイン（ＩＬ−６など）の産生も増加する効果があること（例えば非特許文献１４参照）、Ｔｈ２免疫賦活化にはｉｎ ｖｉｔｒｏの実験系においても高用量必要（例えば非特許文献４参照）であること、Ｔｈ２免疫賦活化による効果が十分でない（例えば非特許文献１４参照）ことも知られている。さらに、強いＴｈ２免疫賦活化を引き起こす消化管寄生虫からＴｈ２免疫賦活活性を有する物質を探索する研究も行われており、その結果、いくつかＴｈ２免疫賦活化する物質が同定されているが、それらの物質は単なる抗原としてアジュバントが必要であったり、頻回投与による感作・チャレンジが必要であったり（例えば非特許文献６参照）、又はｉｎ ｖｉｔｒｏでしかその効果が認められない（例えば非特許文献８参照）ことが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Mosmann TR, Sad S. 1996. The expanding universe of T-cell subsets: Th1, Th2 and more. Immunol Today. 17(3): 138-46.
【非特許文献２】Bordier C. 1981. Phase separation of integral membrane proteins in TritonX-114 solution. J Biol Chem. 256(4): 1604-7.
【非特許文献３】Hasebe A, Mu HH, Washburn LR, Chan FV, Pennock ND, Taylor ML, Cole BC. 2007. Inflammatory lipoproteins purified from a toxigenic and arthritogenic strain of Mycoplasma arthritidis are dependent on Toll-like receptor 2 and CD14. Infect Immun. 75(4): 1820-6.
【非特許文献４】Kiura K, Kataoka H, Yasuda M, Inoue N, Shibata K. 2006. The diacylated lipopeptide FSL-1 induces TLR2-mediated Th2 responses. FEMS Immunol Med Microbiol. 48(1): 44-55.
【非特許文献５】N. Ishikawa, Y. Horii, Y. Nawa. 1994. Inhibitory effects of concurrently present ’normal’ Nippostrongylus brasiliensis worms on expulsion of ’damaged’ worms and associated goblet cell changes in rats. Parasite Immunology. 16: 329-332.
【非特許文献６】Wilson MS, Elnekave E, Mentink-Kane MM, Hodges MG, Pesce JT, Ramalingam TR, Thompson RW, Kamanaka M, Flavell RA, Keane-Myers A, Cheever AW, Wynn TA. 2007. IL-13Ralpha2 and IL-10 coordinately suppress airway inflammation, airway-hyperreactivity, and fibrosis in mice. J Clin Invest. 117(10): 2941-51.
【非特許文献７】R W Summers, D E Elliott, J F Urban Jr, R Thompson, J V Weinstock. 2005. Trichuris suis therapy in Crohn’s disease. Gut. 54: 87-90.
【非特許文献８】Li Q, Kumar A, Gui JF, Yu FS. 2008. Staphylococcus aureuslipoproteins trigger human corneal epithelial innate response through toll-like receptor-2. Microb Pathog. 44(5): 426-34.
【非特許文献９】Metcalfe DD.1984. Mast cell mediators with emphasis on intestinal mast cells. Ann Allergy. 53: 563-75.
【非特許文献１０】McKenzie GJ, Bancroft A, Grencis RK, McKenzie AN. 1998. A distinct role for interleukin-13 in Th2-cell-mediated immune responses. Curr Biol. 8(6): 339-42.
【非特許文献１１】Perdue MH, Ramage JK, Burget D, Marshall J, Masson S. 1989. Intestinal mucosal injury is associated with mast cell activation and leukotriene generation during Nippostrongylus-induced inflammation in the rat. Dig Dis Sci. 34(5): 724-31.
【非特許文献１２】Holland MJ, Harcus YM, Riches PL, Maizels RM. 2000. Proteins secreted by the parasitic nematode Nippostrongylus brasiliensis act as adjuvants for Th2 responses. Eur J Immunol. 30(7): 1977-87.
【非特許文献１３】Dullemen HMV. 1994. Treatment of Crohn’s disease with anti-tumor necrosis factor chimeric antibody (cA2). Gastroentrerol. 109: 129-135.
【非特許文献１４】Dillon S, Agrawal A, Van Dyke T, Landreth G, McCauley L, Koh A, Maliszewski C, Akira S, Pulendran B. 2004. A Toll-like receptor 2 ligand stimulates Th2 responses in vivo, via induction of extracellular signal-regulated kinase mitogen-activated protein kinase and c-Fos in dendritic cells. J Immunol. 172(8): 4733-43.
【非特許文献１５】Kamiya M, Oku Y, Itayama H, Ohbayashi M. 1985. Prolonged expulsion of adult Trichinella spiralis and eosinophil infiltration in mast cell-deficient W/Wv mice. J Helminthol. 59(3): 233-9.
【非特許文献１６】Carter LL, Dutton RW. 1996. Type 1 and type 2: a fundamental dichotomy for all T-cell subsets. Curr Opin Immunol. 8(3): 336-42.
【非特許文献１７】Urban JF Jr, Madden KB, Svetic A, Cheever A, Trotta PP, Gause WC, Katona IM, Finkelman FD. 1992. The importance of Th2 cytokines in protective immunity to nematodes. Immunol Rev. 127: 205-20.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ｉｎ ｖｉｖｏで使用する上でＴｈ２免疫賦活活性の十分な効果を有する物質は、未だ見つかっていないのが現状である。そのため、Ｔｈ２免疫賦活活性を有する物質の探索は、Ｔｈ１側に傾いた免疫反応のバランスをＴｈ２側に戻す治療薬としてだけでなく、Ｔｈ２免疫賦活化の初期におけるメカニズムを解明し、アレルギーの予防、又は治療薬開発のための知見を得るためにも重要であると考えられている。本発明の課題は、ｉｎ ｖｉｖｏで強いＴｈ２免疫賦活化を引き起こすＴｈ２免疫賦活剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この分野の研究者は、消化管蠕虫性寄生虫のＴｈ２免疫賦活作用に着目し、専ら消化管蠕虫性寄生虫の水溶性抽出画分についてのＴｈ２免疫賦活作用について検討をしてきた（例えば非特許文献８）。しかし、本発明者は、消化管蠕虫性寄生虫の水溶性抽出画分のＴｈ２免疫賦活作用では実用化の限界があると考えていた。最近、消化管蠕虫性寄生虫の一種であるニッポストロンジラス・ブラジリエンシス（Nippostrongylus brasiliensis）（以下「Ｎｂ」ということがある）を感染させたラットからＮｂを採取し、別のラットにＮｂを感染させる実験において、排除時期に物理的な傷害を受けたＮｂの方が感染初期に採取したＮｂと比べて早期にＴｈ２賦活化反応を起こし、Ｎｂが排除されることが報告された（例えば非特許文献５）。これらの結果から、本発明者は、Ｎｂから漏出した成分には高いＴｈ２免疫賦活作用があるのではないかと考え、その成分を探索するために、精製やその後の製剤化が不利と考えられるＮｂの水難溶性画分について検討することとした。そして、界面活性剤の１つであるTritonX-114を用いて抽出したＮｂ由来の界面活性剤画分（水難溶性画分）には、従来技術では得られていない高いＴｈ２免疫賦活作用があることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、（１）寄生虫から界面活性剤を用いて抽出した界面活性剤画分から界面活性剤を除去した脱界面活性剤抽出画分を有効成分とすることを特徴とするＴｈ２免疫賦活剤や、（２）脱界面活性剤抽出画分の有効成分が、ペプチドを含むことを特徴とする上記（１）記載のＴｈ２免疫賦活剤や、（３）寄生虫が蠕虫性寄生虫であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載のＴｈ２免疫賦活剤や、（４）蠕虫性寄生虫がニッポストロンジラス・ブラジリエンシス（Nippostrongylus brasiliensis）であることを特徴とする上記（３）記載のＴｈ２免疫賦活剤や、（５）界面活性剤がTritonX-114（登録商標）であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載のＴｈ２免疫賦活剤や、（６）Ｔｈ２免疫賦活活性の有無をＩｇＥ量の増加、好酸球数の増加、又はＩＬ−４発現量の増加に基づいて判定することを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載のＴｈ２免疫賦活剤や、（７）経口投与の形態で用いられることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか記載のＴｈ２免疫賦活剤に関する。
【０００９】
また本発明は、（８）上記（１）〜（７）のいずれか記載のＴｈ２免疫賦活剤を含有することを特徴とする免疫賦活活性を有する組成物に関する。
【００１０】
さらに本発明は、（９）（ａ）寄生虫又はその処理物と界面活性剤含有水溶液とを混合する工程；（ｂ）水層と界面活性剤層との層分離処理を行う工程;（ｃ）界面活性剤画分を採取する工程；（ｄ）界面活性剤画分から界面活性剤の除去処理を行い、脱界面活性剤抽出画分を得る工程；を備えたことを特徴とするＴｈ２免疫賦活剤の製造方法や、（１０）寄生虫の処理物が、寄生虫の物理的破壊処理物であることを特徴とする上記（９）記載の製造方法や、（１１）寄生虫が蠕虫性寄生虫であることを特徴とする上記（９）又は（１０）記載の製造方法や、（１２）蠕虫性寄生虫がニッポストロンジラス・ブラジリエンシス（Nippostrongylus brasiliensis）であることを特徴とする上記（１１）記載の製造方法や、（１３）界面活性剤がTritonX-114（登録商標）であることを特徴とする上記（９）〜（１２）のいずれか記載の製造方法や、（１４）工程（ｄ）における界面活性剤の除去処理が、タンパク質の沈殿処理を含むことを特徴とする上記（９）〜（１３）のいずれか記載の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
従来技術（例えば非特許文献６、非特許文献８参照）によると、Ｔｈ２免疫賦活化を引き起こす物質は、単なる抗原としてアジュバントが必要なものや、頻回投与による感作・チャレンジが必要なものや、ｉｎ ｖｉｔｒｏでしかその活性効果が認められないのに対し、本発明のＴｈ２免疫賦活剤によると、単回の経口投与によるＴｈ２免疫賦活剤、特にアジュバントを併用しなくてもよい副作用の少ない免疫賦活剤の開発や、ワクチン開発に繋がることが期待でき、さらに、Ｔｈ２免疫賦活化の初期におけるメカニズムを解明する基礎研究にとっても有用なツールとなることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明のＴｈ２免疫賦活剤（ＴＸ）、寄生虫全成分（ＡＷ）又はＰＢＳの投与後７日及び１４日における各群の体重を示す図である。
【図２】ＴＸ、ＡＷ又はＰＢＳの投与後７日及び１４日における各群の小腸重量（ｇ／ＢＷｇ×１００）を示す図である。
【図３】ＴＸ、ＡＷ又はＰＢＳの投与後７日及び１４日における各群の脾臓重量（ｇ／ＢＷｇ×１００）を示す図である。
【図４】ＴＸ、ＡＷ又はＰＢＳの投与後７日及び１４日における各群の腸間膜リンパ節重量（ｇ／ＢＷｇ×１００）をグラフで示す図である。
【図５】ＴＸ、ＡＷ又はＰＢＳの投与後７日及び１４日における各群の末梢血中の好酸球数を示す図である。
【図６】ＴＸ又はＰＢＳの投与後７日及び１４日における各群の血清中のＩｇＥ濃度を示す図である。
【図７】ＴＸ又はＰＢＳの投与後７日における各群の脾臓及び腸間膜リンパ節でのＩＬ−４ｍＲＮＡ発現量（ＰＢＳ投与群を１．００とする。）を示す図である。縦軸は、２の指数値を表す。
【図８】ＰＢＳ投与群における投与後７日の小腸（Ｈ−Ｅ染色切片）の光学顕微鏡（１６０倍）観察の結果を示す図である。
【図９】ＰＢＳ投与群における投与後７日の小腸（アルシアンブルー染色切片）の光学顕微鏡（１６０倍）観察の結果を示す図である。
【図１０】ＡＷ群における投与後７日の小腸（Ｈ−Ｅ染色切片）の光学顕微鏡（１６０倍）観察の結果を示す図である。
【図１１】ＡＷ群における投与後７日の小腸（アルシアンブルー染色切片）の光学顕微鏡（１６０倍）観察の結果を示す図である。
【図１２】ＴＸ群における投与後７日の小腸（Ｈ−Ｅ染色切片）の光学顕微鏡（１６０倍）観察の結果を示す図である。
【図１３】ＴＸ群における投与後７日の小腸（アルシアンブルー染色切片）の光学顕微鏡（１６０倍）観察の結果を示す図である。
【図１４】ＴＸ群、ＳＤＳ処理ＴＸ群又はＰｒｏＫ処理ＴＸ群における投与後３日及び５日目の各群の末梢血中の好酸球数を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のＴｈ２免疫賦活剤としては、寄生虫から界面活性剤を用いて抽出した界面活性剤画分から界面活性剤を除去した脱界面活性剤抽出画分を有効成分として含有するものであれば特に制限されず、また、本発明のＴｈ２免疫賦活剤の製造方法としては、寄生虫又はその処理物と界面活性剤含有水溶液とを混合する工程（ａ）；水層と界面活性剤層との層分離処理を行う工程（ｂ）；界面活性剤画分を採取する工程（ｃ）；界面活性剤画分から界面活性剤の除去処理を行い、脱界面活性剤抽出画分を得る工程（ｄ）；を備えた方法であれば特に制限されず、ここで「Ｔｈ２免疫賦活剤」とは、Ｔｈ２免疫反応を活性化する作用を有するものをいう。
【００１４】
上記寄生虫としては、胞子虫類、根足虫類、鞭毛虫類等の単細胞からなる原虫性寄生虫や、線虫、吸虫類、条虫類等の多細胞からなる蠕虫性寄生虫を挙げることができるが、蠕虫性寄生虫に感染するとＴｈ２免疫賦活化が起こることから、蠕虫性寄生虫が好ましい。蠕虫性寄生虫のうち、マウスに感染する蠕虫性寄生虫としては、例えばTrichuris muris、Trichinella spiralis、ニッポストロンジラス・ブラジリエンシス（Nippostrongylus brasiliensis）、Heligmonsomoides polygyrus、Hymenolepsis nana等を挙げることができ、ラットに感染する蠕虫性寄生虫としては、例えばAngiostrongylus等を挙げることができ、豚に感染する蠕虫性寄生虫としては、例えばTrichuris suis、Ascaris suum等を挙げることができ、イヌ又はネコに感染する蠕虫性寄生虫としては、例えばTrichuris vulpis、Toxocara、Gnathostoma、Ancylostoma等を挙げることができ、海洋哺乳動物に感染する蠕虫性寄生虫としては、例えばAnisakis、Pseudoterranova等を挙げることができ、鳥類に感染する蠕虫性寄生虫としては、例えばS. douthitti、Trichobilharzia ocellata、T. stagnicolae、T. physellae、Gigantobilharzia huronensis等を挙げることができ、これらの中でもニッポストロンジラス・ブラジリエンシスを好適に例示することができる。
【００１５】
上記界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤及びイオン性界面活性剤を挙げることができ、これらのうち、非イオン性界面活性剤として、例えばTritonX-100、TritonX-114、NP-40、Tween-20、Tween-80等を挙げることができ、両イオン性界面活性剤として、例えば７ＢｚＯ、ＳＢ３−１０、ＳＢ３−１４、ＣＨＡＰＳ、アミドスルホベタイン−１４（ＡＳＢ１４）等を挙げることができ、イオン性界面活性剤として、例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等を挙げることができ、これらの中でも曇点が約２０℃であり、生理的な条件下で水溶液画分と界面活性剤画分に分離することができるため、TritonX-114が好ましい。
【００１６】
上記脱界面活性剤抽出画分には、例えば寄生虫の構成成分であるポリヌクレオチド、ペプチド、脂質、糖質等が含まれている可能性があり、これらの中でもプロテアーゼ処理によりＴｈ２免疫賦活活性が失われるため、ペプチドが含まれている可能性が大きい。かかる脱界面活性剤抽出画分は以下のようにして調製することができる。
【００１７】
まず、寄生虫又はその処理物と界面活性剤含有水溶液とを混合する。上記寄生虫の処理物を得るための方法としては、寄生虫と界面活性剤含有水溶液とを混合する前に、界面活性剤含有水溶液が浸透しやすいように寄生虫を破壊した処理方法が好ましく、例えば生化学的破壊処理、物理的破壊処理等を挙げることができるが、寄生虫を効果的且つ効率的に破壊処理することができる物理的破壊処理が好ましい。物理的破壊処理における処理方法としては、例えば凍結融解法、超音波破砕処理法、ホモジナイザーによる破砕法、ガラスビーズによる破砕法等を挙げることができ、これらの中でも超音波破砕処理法を好適に例示することができる。
【００１８】
上記界面活性剤含有水溶液としては、上記界面活性剤を含有している水溶液であればよく、界面活性剤の濃度は、使用する界面活性剤の種類に応じて公知の使用マニュアル（例えばMolecular Cloningなど）により適宜選択することができ、例えばTritonX-114を用いる場合、０．２％〜１０％が好ましく、１％〜３％がより好ましい。また、必要に応じて、緩衝剤、タンパク質分解酵素阻害剤、防腐剤等を添加してもよい。
【００１９】
次に、水層と界面活性剤層との層分離処理を行う。かかる層分離処理としては、界面活性剤含有水溶液をその曇点より低い温度から高い温度へ上昇させるとミセル形成ができなくなり、水層と界面活性剤層とに分離する現象を利用した処理が好ましく、界面活性剤としてTritonX-114を用いる場合、その曇点が約２０℃であるため、曇点より低い温度としては、０℃〜２０℃、好ましくは２℃〜１０℃を、曇点より高い温度としては、２０℃〜４２℃、好ましくは３０℃〜４０℃をそれぞれ例示することができる。
【００２０】
続いて、界面活性剤画分を採取する。かかる採取方法としては、水層と界面活性剤層とに層分離した界面活性剤含有水溶液から、界面活性剤層を界面活性剤画分として採取できる方法であればよく、界面活性剤は水と比べ比重が重いため、水層よりも界面活性剤層の方が下に分離することから、水層部分をデカンテーションやピペットなどにより回収することで除く方法等を挙げることができる。
【００２１】
次いで、界面活性剤画分から界面活性剤の除去処理を行い、脱界面活性剤抽出画分を得る。界面活性剤画分から界面活性剤の除去方法としては、例えばカラム、限外ろ過膜などを用いた非変性条件下で行う方法や、メタノール沈殿、エタノール沈殿、アセトン沈殿、ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）沈殿などを用いた変性条件下で行う方法等を挙げることができるが、変性条件下でもＴｈ２免疫賦活活性は消失しないため、操作の簡易性及び費用対効果の面から考慮すると、変性条件下で行う方法が好ましい。このように、界面活性剤画分から界面活性剤を除去すると、本発明のＴｈ２免疫賦活剤の有効成分である脱界面活性剤抽出画分を得ることができる。
【００２２】
上記脱界面活性剤抽出画分がＴｈ２免疫賦活活性を有することを確認する方法としては、例えばＴｈ２免疫賦活により誘導される（増加する）物質、Ｔｈ２免疫賦活により抑制される（減少する）物質等を指標とする方法を挙げることができ、これらの中でもＴｈ２免疫賦活により増加する物質を指標にして行うことが好ましい。かかるＴｈ２免疫賦活により増加する物質として、例えばＩｇＥ、好酸球、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３など）等を挙げることができ、これらの中でもＩｇＥ、好酸球、IL−４を好適に例示することができる。
【００２３】
本発明のＴｈ２免疫賦活活性を有する組成物としては、本発明のＴｈ２免疫賦活剤を含有するものであれば特に制限されず、本発明のＴｈ２免疫賦活剤を医薬用の治療剤として用いる場合などの、Ｔｈ２免疫賦活剤に薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤等の各種調剤用配合成分が添加された組成物や、本発明のＴｈ２免疫賦活剤をサプリメントとして用いる場合などの、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の配合成分が添加された組成物を例示することができる。
【００２４】
本発明のＴｈ２免疫賦活剤やＴｈ２免疫賦活活性を有する組成物の投与形態としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で投与する経口投与や、溶液、乳剤、懸濁液等の剤型を注射、又はスプレー剤の型で鼻孔内投与する非経口投与を挙げることができるが、単回の経口投与でも十分Ｔｈ２免疫賦活効果があるため、経口投与が好ましい。また、本発明のＴｈ２免疫賦活剤やＴｈ２免疫賦活活性を有する組成物は、クローン病などの組織障害性疾患や、慢性関節リウマチ、自己免疫性肝炎などの臓器特異的自己免疫疾患に有用な医薬品、サプリメント、機能性食品として用いることができる。かかる機能性食品としては、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、チーズ、バター等の乳製品や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜を挙げることができる。
【００２５】
以下実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はかかる実施例により制限されるものではない。実施例において、全てのデータは、平均±標準誤差（ＳＥ）で示し、統計学的解析を用いた有意差の検定はMann-Whitney U-testにより行った。平均値間の相違は、Ｐ−ｖａｌｕｅが０．０５未満であるときに有意とした。なお、本実施例におけるラットとしては、ＳＤラット（Ｓｌｃ社）又はＷｉｓｔａｒラット（Ｓｌｃ社）を用い、マウスとしては、ＩＣＲマウス（Ｓｌｃ社）（雌・８週齢・ＳＰＦ）を用いた。また、本実施例におけるラットの飼育方法としては、解剖時までウッドチップ（滅菌済み）を敷いたプラスチックケージで、１２０℃、２０分間加熱滅菌した試料（日本クレア、ＣＥ−２、大阪、日本）と水道水を自由摂取させる方法を用い、マウスの飼育方法としては、ウッドチップを敷いたメタルケージ（共に加熱滅菌済み）で、１２０℃、２０分間加熱滅菌した飼料（日本クレア、ＣＥ−２、大阪、日本）と水道水を自由摂取させる方法を用いた。なお、上記ラット及びマウスの飼育方法は、山口大学農学部動物実験指針に従って行った。
【実施例１】
【００２６】
[Ｎｂの継代方法及び回収方法]
ニッポストロンジラス・ブラジリエンシス（Ｎｂ）（東京慈恵会医科大学より分与）は、ラットを用いて継代及び増殖させた後、回収した。Baermann法により第３期幼虫（Ｌ３）におけるＮｂ３５００〜４０００隻／匹を回収した（工程１）後、Ｎｂをラットの鼠径部皮下に接種し、８日後に成虫となったＮｂから排出された卵を含むラットの結腸便及び盲腸便を採取した（工程２）。その後、Ｎｂから排出された卵をチャコール培養法を行いてＬ３まで成長させた（工程３）。再び工程１〜工程３を繰り返すことにより、Ｎｂの継代及び増殖を行った。また、Ｎｂの回収はBaermann法により以下に述べる手順で行った。すなわち、Ｎｂの接種から８日後のラットの小腸を採取し、縦に切り開いた後、２００ｍｌのメートルグラスの口を覆うようにクリップで留めたガーゼの上に載せ０．９％生理食塩水（ＰＢＳ）に浸し、Ｎｂが濾過されるように３７℃の条件下で１時間放置した。その後、底に沈んだＮｂを少量の生理食塩水とともに採取し、濾紙を乗せた漏斗に移して約８０ｍｌの生理食塩水を数回通し、濾過洗浄した後、Ｎｂを回収した。
【実施例２】
【００２７】
[TritonX-114による脱界面活性剤画分の取得方法]
上記実施例１により回収した成虫Ｎｂ約２０００匹にＴＥ（Tris-EDTA Buffer）１ｍｌを加えた後、超音波破砕処理をBRANSON SONIFIER 450を用いて行った。上記処理により得られた超音波破砕処理物に対して、１０％TritonX-114（Sigma-Aldrich社製）溶液を０．２５ｍｌ加え、４℃で２．５時間静置した後、遠心処理（１３０００ｒｐｍ、３分間、４℃）により上清を回収し、その後静置処理（３７℃、１０分間）及び遠心処理（１３０００ｒｐｍ、５分間、２４℃）により層分離を行った後（例えば非特許文献２、非特許文献８参照）、上層（水層）を除去した下層（界面活性剤層）へ１ｍｌＴＥ及び、２．５倍量のエタノールに加え、その後−４℃で一晩静置した後、遠心処理（３０００ｒｐｍ、２０分、４℃）により得られた沈殿（脱界面活性剤画分）を、０．２ｍｌＰＢＳに懸濁した。
【実施例３】
【００２８】
[脱界面活性剤画分のマウスへの経口投与]
上記実施例２により得られた脱界面活性剤画分のタンパク質量をBradford法を用いて測定した後、タンパク質濃度が１５０μｇ／５００μｌとなるようにオリーブ油で希釈した脱界面活性剤画分を、マウスに経口投与する群を脱界面活性剤画分投与（ＴＸ）群とした。また、コントロールとして、上記脱界面活性剤画分の代わりにＰＢＳを、マウスに経口投与する群をＰＢＳ投与（ＰＢＳ）群とした。さらに、成虫Ｎｂ約２０００匹に対してＴＥ１ｍｌを加えて超音波破壊処理を行って得られた超音波破砕処理物を、１５０μｇ／５００μｌとなるようにオリーブ油で希釈した後、その超音波破砕処理物をマウスに経口投与する群をＮｂ投与（ＡＷ）群とした。すなわち、ＴＸ群、ＰＢＳ群、及びＡＷ群の計３群に分けて、ゾンデを用いた経口（胃内）投与を行った。
【００２９】
マウスに経口投与した後、７日及び１４日に各群の体重（ｇ）を測定した結果、ＰＢＳ群、ＡＷ群やＴＸ群の各群において、体重に有意な差は認められなかった（図１）。
【００３０】
消化管寄生蠕虫感染時に認められる生体反応として、腸管でのマスト細胞及び杯細胞の増加、杯細胞からの粘液分泌の亢進、腸間膜リンパ節やパイエル板の腫大等が知られている（例えば非特許文献１７参照）。またＮｂ感染個体の小腸では、活性化した粘膜型マスト細胞が産生するロイコトリエンやヘパリン（例えば非特許文献９参照）、ヒスタミン放出による腸管上皮の透過性亢進等によって浮腫が生じる（例えば非特許文献１１参照）ことが報告されており、マスト細胞数の増加もＴｈ２サイトカインの産生増加によって生ずると考えられている（例えば非特許文献１１参照）。そこで、もし寄生虫由来の脱界面活性剤画分の経口投与によりＴｈ２免疫反応が活性化がされるとすれば、ＴＸ群のマウス小腸に浮腫が生じ、小腸の重量が増加していることが予想される。そこで、小腸の重量を測定した（図２）。また、比較対照として脾臓及び腸間膜リンパ節の重量についても測定した（図３及び図４）。経口投与した後、7日及び１４日のいずれの場合においても、ＰＢＳ群やＡＷ群と比べ、ＴＸ群の方が小腸の重量（ｇ／ＢＷｇ×１００）は有意に少なかった（図２）。また、脾臓重量（ｇ／ＢＷｇ×１００）及び腸間膜リンパ節重量（ｇ／ＢＷｇ×１００）については、ＰＢＳ群、ＡＷ群やＴＸ群の各群において有意差は認められなかった（図３及び図４）。
【００３１】
さらに、小腸において、Ｔｈ２免疫賦活化が原因で生じる炎症等による組織変化が見られるかどうかを調べるために、病理組織学的観察を行った。病理組織標本は、以下の手順により作製した。すなわち、ＰＢＳ群、ＡＷ群、及びＴＸ群の各群において、経口投与後７日や１４日のマウスを、それぞれエーテル麻酔した後、ヘパリン化シリンジを用いて心臓からの全採血により安楽殺させ、その後脾臓、腸間膜リンパ節、肝臓、及び十二指腸基部から空腸を採材した後、カルノア液で固定し、その後４μｍのパラフィン切片（病理組織標本）を作製した。上記病理組織標本を、定法のヘマトキシリン・エオジン（Ｈ−Ｅ）染色、及びアルシアンブルー染色を施した後、光学顕微鏡により観察した結果、寄生虫感染による粘膜固有層の水腫は認められなかった（図８〜図１３）。また、Ｔｈ２免疫賦活化によりＴｈ２サイトカインが、肥満（マスト）細胞数や杯細胞数を増加することが報告されているため、上記病理組織標本におけるマスト細胞数及び杯細胞数を、マウス１頭につき絨毛−陰窩を１単位として１０単位以上計数して平均値を求め、小腸粘膜１絨毛あたりの細胞数（細胞数／絨毛陰窩単位）として算出した結果、マスト細胞数はＰＢＳ群の０．１２に対してＴＸ群では０．１６とほとんど差はなく、また同様に、杯細胞は対照群の４．２に対してＴＸ群では４．１とほとんど差が認められなかった。
【００３２】
病理組織学的観察からは、Ｔｈ２免疫賦活化が起こっているかどうかはわからなかったので、次にＴｈ２免疫賦活化の有無を検証する別の指標として、ＩｇＥ量の増加、好酸球数の増加、及びＩＬ−４ｍＲＮＡ量の増加を用いて解析を行った。ＩｇＥ量を測定するために、各群から採取した末梢血から遠心分離（１２０００ｒｐｍ、３０分）により調製した血清を、−８０℃で凍結保存した後、マウスＩｇＥ測定キット（森永生科学研究所）を用いてＥＩＡサンドイッチ法により解析を行った（図６）。その結果、経口投与後７日での末梢血中のＩｇＥ濃度（ｎｇ／ｍｌ）は、ＰＢＳ群とＴＸ群の各群において有意差は認められなかったのに対し、経口投与後１４日でのＩｇＥ濃度は、ＰＢＳ群と比べＴＸ群の方が４．３倍高く、有意に上昇していた（図６）。
【００３３】
また、好酸球数を計測するために、心採血により採取した血液の一部をHinkelmann液（０．５％ yellow eosin、０．５％ phenol、０．５％ formalin）で１０倍希釈し、穏やかに攪拌した後、好酸球計算盤（ＴＡＴＡＩ）を用いて好酸球数の計数を行った（図５）。その結果、経口投与後７日での末梢血中の好酸球数（好酸球数／０．１ｍｍ３）は、ＰＢＳ群と比べてＡＷ群の方が２．４倍、ＰＢＳ群に比べてＴＸ群の方が６．８倍増加しており、さらにＡＷ群に比べてＴＸ群の方が２．９倍増加しており、それぞれ有意差が認められた。他方、経口投与後１４日では、ＴＸ群における好酸球数（好酸球数／０．１ｍｍ３）は、７日と比べ減少しており、ＰＢＳ群と有意差は認められなかった（図５）。
【００３４】
さらに、ＩＬ−４ｍＲＮＡ量の検出するために、以下の手順に従ってＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、及び定量ＰＣＲによるｍＲＮＡの検出を行った。すなわち、経口投与後７日のＴＸ群及びＰＢＳ群におけるマウスの脾臓の一部、並びに腸間膜リンパ節から、ＲＮｅａｓｙＴＭＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてマニュアルに従い、ＲＮＡを抽出した。続いて、抽出したＲＮＡ１０μｌにランダムプライマー（Invitrogen社製）を１μｇ加え、７０℃で１０分間、直ちに氷上で静置した後、５×ＲＴ ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ、０．１Ｍ ＤＴＴ、ＲＮＡｓｉｎ（Promega社製）を加えて１９μｌとし、４２℃で２分間、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Invitrogen社製）１μｌを加えて計２０μｌとし４２℃で５０分間、７０℃で１５分間反応させることでｃＤＮＡを合成した。さらに、合成したｃＤＮＡ、ＩＬ−４遺伝子産物（ＩＬ−４ｍＲＮＡ）を増幅するプライマーセット（Applied Biosystems社製）、及びＴａｑＭａｎＴＭＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓキット（Applied Biosystems社製）を用いたＳｔｅｐ ＯｎｅＴＭＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Applied Biosystems社製）によりリアルタイムＰＣＲ法を行い、ＩＬ−４のｍＲＮＡ量を定量した。ＰＣＲの条件としては、５０℃で２分間、９５℃で１０分間を１サイクル、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を５０サイクルとして行った。なお、コントロールとしてハウスキーピング遺伝子である１８ｓ ｒＲＮＡｍＲＮＡを増幅するプライマーセット（Applied Biosystems社製）を用いたリアルタイムＰＣＲ法を行い、算出された１８ｓ ｒＲＮＡｍＲＮＡ量の値によりＩＬ−４ｍＲＮＡ量の値を標準化した。さらに、ＰＢＳ群におけるＩＬ−４ｍＲＮＡ量の値を１とした場合のＴＸ群におけるＩＬ−４ｍＲＮＡ量の値を算出した（図７）。その結果、脾臓では、ＰＢＳ群と比べＴＸ群におけるＩＬ−４ｍＲＮＡ量に有意差は認められなかった。他方、腸間膜リンパ節では、ＰＢＳ群と比べＴＸ群におけるＩＬ−４ｍＲＮＡ発現は１２８倍上昇しており、有意差が認められた（図７）。
【００３５】
脱界面活性剤画分の有効成分がペプチド（タンパク質を含む）であるかどうかを調べるために、タンパク質の変性剤であるＳＤＳ及びタンパク質分解酵素であるＰｒｏＫ（Sigma社製）を用いて検討した。すなわち、脱界面活性剤画分を、０．５％ ＳＤＳ／ＴＥ溶液中、又は０．００１％ ＰｒｏＫ／（０．５％ ＳＤＳ／ＴＥ）溶液中で、３７℃、１２時間処理を行った後、２．５倍量のエタノールに加え、その後−４℃で一晩静置した後、遠心処理（３０００ｒｐｍ、２０分、４℃）により得られた沈殿物を、０．２ｍｌ ＰＢＳに懸濁した。かかる沈殿物のうち、ＳＤＳ処理したものをマウスへ経口投与する群をＳＤＳ処理ＴＸ群、ＰｒｏＫ処理したものをマウスへ経口投与する群をＰｒｏＫ処理ＴＸ群とし、投与後３日及び５日における好酸球数を算出した（図１４）。その結果、投与後３日及び５日のいずれの場合においても好酸球数はＴＸ群と比べＰｒｏＫ処理ＴＸ群では著しく減少し、有意差が認められた。また、ＳＤＳ処理ＴＸ群においても、わずかであるが有意な減少が認められた。
【００３６】
〔考察〕
本発明における実施例３では、Ｎｂ由来の脱界面活性剤画分の経口投与によってＴｈ２免疫賦活化が起こるかどうかを検証するために、Ｔｈ２免疫賦活化の指標とされる種々の反応を用いた。その結果、投与後７日で末梢血中の好酸球数及び腸間膜リンパ節でのＩＬ−４ｍＲＮＡ量の著明な増加が認められた（図５及び図７）。さらに、Ｎｂの全成分を投与したＡＷ群における末梢血中の好酸球数は、ＰＢＳを投与したＰＢＳ群と比べ有意に増加していたが、その割合は脱界面活性剤画分を投与したＴＸ群と比べると有意に低かった。このことは、Ｔｈ２免疫賦活化する有効成分がＮｂに含まれていることを示すだけでなく、上記有効成分は本実施例により分離した脱界面活性剤画分に主に含まれていることを示している。
【００３７】
腸間膜リンパ節でのＩＬ−４ｍＲＮＡ量の増加や好酸球数の増加は、投与後７日で認められたが、末梢血中のＩｇＥ濃度の増加は投与後７日では認められず、１４日で認められた。他方、好酸球数は、投与後１４日ではＰＢＳ群と同程度まで減少していた。これらの結果は、Ｎｂ由来の脱界面活性剤画分の投与によって少なくとも７日目にはＴｈ２免疫賦活化が起こること、及び、１４日目にはＴｈ２免疫賦活化レベルは通常状態に戻るが、Ｔｈ２免疫反応の活性化によりＩＬ−４産生が増加され、その結果ＩｇＥ濃度が上昇することを示している。以前本発明者は、Ｎｂは投与後７日までにほとんどが排除され、その排除にはＴｈ２免疫賦活化が必須であること、及びＩｇＥ濃度の増加は投与後１４日に初めて認められることを示しており、本実施例はこれらの結果を支持している。
【００３８】
Ｎｂ感染時に認められる生体反応として、腸管でのマスト細胞及び杯細胞の増加、杯細胞からの粘液分泌の亢進、腸間膜リンパ節やパイエル板の腫大などが知られている（例えば非特許文献１７参照）。またＮｂが感染した小腸では、活性化した粘膜型マスト細胞が産生するロイコトリエンやヘパリン（例えば非特許文献９参照）、ヒスタミン放出による腸管上皮の透過性亢進等によって浮腫が生じる（例えば非特許文献９、非特許文献１１参照）ことが報告されており、マスト細胞数の増加もＴｈ２サイトカインの産生増加によって生ずると考えられている（例えば非特許文献１１、非特許文献１７参照）。本実施例におけるＮｂ由来の脱界面活性剤画分による投与においても、Ｔｈ２免疫賦活化による浮腫が生じ、その結果ＴＸ群の小腸重量は増加することが予想されたが、逆にＰＢＳ群よりも少ない結果となった（図２）。さらに、病理組織学的観察から、ＴＸ群の小腸において炎症などの反応性変化は認められず、またマスト細胞や杯細胞の数もＰＢＳ群と比べて著明な増加は認められなかった（図８〜図１３）。マスト細胞数の増加には、Ｔｈ２サイトカインに加え、ＳＣＦ（Stem Cell Factor）等の増殖因子も関与していることが報告されている（例えば非特許文献１７参照）。また、ＳＣＦレセプター機能不全の突然変異（Ｗ／Ｗｖ）マウスでは、消化管寄生虫感染時にＴｈ２サイトカインの産生増加が生じても、マスト細胞数が増加しないことが示されている（例えば非特許文献１５参照）。これらの従来技術の知見から、本実施例３において、リンパ節でのＩＬ−４産生増加や、好酸球数の増加が認められたにもかかわらず、マスト細胞数や杯細胞数が増加しなかった原因として、Ｎｂ由来の脱界面活性剤画分の投与は寄生虫感染とは異なり、ＳＣＦの産生等には作用を及ぼさなかった可能性が考えられる。また、杯細胞の増殖には、Ｔｈ２サイトカインの一つであるＩＬ−１３が必須であるとの報告があることから（例えば非特許文献１０参照）、杯細胞数が増えていない原因をより詳細に検証するために、ＩＬ−１３の産生量を検出する必要がある。さらに、消化管寄生虫の排虫によるＴｈ２免疫賦活化は、寄生虫の種類によって賦活化のレベルが違うこと（例えば非特許文献１７参照）、及び好酸球の分化増殖や、ＩｇＥの産生、杯細胞数、マスト細胞数等の増加には、関与するＴｈ２サイトカインに違いがあること（例えば非特許文献１７参照）も報告されており、本実施例におけるＴｈ２免疫反応の活性化のメカニズムをより詳細に解析するためには、それぞれのサイトカインの産生量の変化を基に検証することが必要だと考えられる。
【００３９】
Ｔｈ２免疫反応の活性化のメカニズムとしては、抗原が抗原提示細胞に取り込まれた後、抗原処理されたペプチド断片がプロセシングによりＭＨＣ分子と結合し、その後抗原提示細胞の細胞表面に発現した抗原をＴ細胞が認識して感作が起こり、その後抗原がＴ細胞に侵入することによってＴｈ２免疫賦活化が起こるメカニズムと、抗原提示細胞の細胞表面上に存在するＴＬＲ２（例えば非特許文献３、非特許文献１４参照）等のレセプターに直接作用し、Ｔｈ２免疫賦活化が起こるメカニズムとを、挙げることができるが、アジュバントと混合した頻回投与によりＴｈ２免疫賦活化が起こることが知られている従来技術は（例えば非特許文献６、非特許文献１２参照）、前者のメカニズムによるものと考えられ、他方、本実施例では、経口投与で、且つ単回の投与でも有意にＴｈ２免疫反応を活性化させることができたことから、より直接的な後者のメカニズムによるものと考えることができる。細菌由来のＬＰＳやＣｐＧなど、直接抗原提示細胞に働きかけてＴｈ１免疫賦活化を誘導する物質の発見により、Ｔｈ１免疫賦活化機構の初期反応の研究が進んだこと（例えば非特許文献４、非特許文献１４参照）からも、本発明で用いたＮｂ由来の脱界面活性剤画分が直接抗原提示細胞に作用することがわかれば、未だに不明な点が多いＴｈ２免疫賦活化機構の初期反応のメカニズムの解明にも繋がると考えられる。
【００４０】
Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫反応のバランスが崩れると、様々な免疫疾患が生じると考えられている。Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫反応バランスが過剰にＴｈ１へ傾く病気、すなわちＴｈ１病としては、クローン病、慢性関節リウマチ、自己免疫性肝炎等を挙げることができる。これらの中でもクローン病は、潰瘍性大腸炎とともに炎症性腸疾患と称され、消化管全般で発病しうる慢性疾患であることが知られている。その原因は未だ不明であるが、遺伝的な素因を持ち、主にＩＦＮ−γの粘膜障害性による炎症等の症状を引き起こし、Ｔｈ１免疫反応を過剰に活性化して発症すると考えられている（例えば非特許文献７、非特許文献１３参照）。根本的な治療法はなく、アミノサリチル酸製剤やステロイド剤などの消炎鎮痛剤で寛解を図るとともに、重症例のクローン病治療には免疫抑制剤が用いられてきた。しかし、ステロイドや免疫抑制剤では重度の副作用が懸念されており、近年では、抗ＴＮＦ−α抗体製剤であるインフリキシマブが一般的に使用されているが、単回投与では長期寛解維持が困難な場合が多く、継続的に投与する必要がある（例えば非特許文献１３参照）。従って、本発明の脱界面活性剤画分のうち、強いＴｈ２免疫賦活活性の有効成分はペプチド（タンパク質を含む）である可能性は高いが（図１４）、かかる有効成分の同定や分子構造の解明などさらなる研究が進めば、Ｔｈ１型に過度に傾いたクローン病等の新しい治療法の開発に繋がることが期待される。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明におけるＴｈ２免疫賦活活性を有する組成物は、単回の経口投与により非常に強いＴｈ２免疫賦活化を誘導することができることから、その有効成分の同定や分子構造の解明など研究を進めることにより、Ｔｈ２免疫賦活剤としての薬品や、ワクチン開発に繋がることが期待できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄生虫から界面活性剤を用いて抽出した界面活性剤画分から界面活性剤を除去した脱界面活性剤抽出画分を有効成分とすることを特徴とするＴｈ２免疫賦活剤。
【請求項２】
脱界面活性剤抽出画分の有効成分が、ペプチドを含むことを特徴とする請求項１記載のＴｈ２免疫賦活剤。
【請求項３】
寄生虫が蠕虫性寄生虫であることを特徴とする請求項１又は２記載のＴｈ２免疫賦活剤。
【請求項４】
蠕虫性寄生虫がニッポストロンジラス・ブラジリエンシス(Nippostrongylus brasiliensis)であることを特徴とする請求項３記載のＴｈ２免疫賦活剤。
【請求項５】
界面活性剤がTritonX-114（登録商標）であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のＴｈ２免疫賦活剤。
【請求項６】
Ｔｈ２免疫賦活活性の有無をＩｇＥ量の増加、好酸球数の増加、又はＩＬ−４発現量の増加に基づいて判定することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のＴｈ２免疫賦活剤。
【請求項７】
経口投与の形態で用いられることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のＴｈ２免疫賦活剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載のＴｈ２免疫賦活剤を含有することを特徴とする免疫賦活活性を有する組成物。
【請求項９】
以下の工程（ａ）〜（ｄ）の工程を備えたことを特徴とするＴｈ２免疫賦活剤の製造方法。
（ａ）寄生虫又はその処理物と界面活性剤含有水溶液とを混合する工程；
（ｂ）水層と界面活性剤層との層分離処理を行う工程;
（ｃ）界面活性剤画分を採取する工程；
（ｄ）界面活性剤画分から界面活性剤の除去処理を行い、脱界面活性剤抽出画分を得る工程；
【請求項１０】
寄生虫の処理物が、寄生虫の物理的破壊処理物であることを特徴とする請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
寄生虫が蠕虫性寄生虫であることを特徴とする請求項９又は１０記載の製造方法。
【請求項１２】
蠕虫性寄生虫がニッポストロンジラス・ブラジリエンシス(Nippostrongylus brasiliensis)であることを特徴とする請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
界面活性剤がTritonX-114（登録商標）であることを特徴とする請求項９〜１２のいずれか記載の製造方法。
【請求項１４】
工程（ｄ）における界面活性剤の除去処理が、タンパク質の沈殿処理を含むことを特徴とする請求項９〜１３のいずれか記載の製造方法。
【請求項１】
寄生虫から界面活性剤を用いて抽出した界面活性剤画分から界面活性剤を除去した脱界面活性剤抽出画分を有効成分とすることを特徴とするＴｈ２免疫賦活剤。
【請求項２】
脱界面活性剤抽出画分の有効成分が、ペプチドを含むことを特徴とする請求項１記載のＴｈ２免疫賦活剤。
【請求項３】
寄生虫が蠕虫性寄生虫であることを特徴とする請求項１又は２記載のＴｈ２免疫賦活剤。
【請求項４】
蠕虫性寄生虫がニッポストロンジラス・ブラジリエンシス(Nippostrongylus brasiliensis)であることを特徴とする請求項３記載のＴｈ２免疫賦活剤。
【請求項５】
界面活性剤がTritonX-114（登録商標）であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のＴｈ２免疫賦活剤。
【請求項６】
Ｔｈ２免疫賦活活性の有無をＩｇＥ量の増加、好酸球数の増加、又はＩＬ−４発現量の増加に基づいて判定することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のＴｈ２免疫賦活剤。
【請求項７】
経口投与の形態で用いられることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のＴｈ２免疫賦活剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載のＴｈ２免疫賦活剤を含有することを特徴とする免疫賦活活性を有する組成物。
【請求項９】
以下の工程（ａ）〜（ｄ）の工程を備えたことを特徴とするＴｈ２免疫賦活剤の製造方法。
（ａ）寄生虫又はその処理物と界面活性剤含有水溶液とを混合する工程；
（ｂ）水層と界面活性剤層との層分離処理を行う工程;
（ｃ）界面活性剤画分を採取する工程；
（ｄ）界面活性剤画分から界面活性剤の除去処理を行い、脱界面活性剤抽出画分を得る工程；
【請求項１０】
寄生虫の処理物が、寄生虫の物理的破壊処理物であることを特徴とする請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
寄生虫が蠕虫性寄生虫であることを特徴とする請求項９又は１０記載の製造方法。
【請求項１２】
蠕虫性寄生虫がニッポストロンジラス・ブラジリエンシス(Nippostrongylus brasiliensis)であることを特徴とする請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
界面活性剤がTritonX-114（登録商標）であることを特徴とする請求項９〜１２のいずれか記載の製造方法。
【請求項１４】
工程（ｄ）における界面活性剤の除去処理が、タンパク質の沈殿処理を含むことを特徴とする請求項９〜１３のいずれか記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１２−９２０４５（Ｐ２０１２−９２０４５Ａ）
【公開日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２４０８８２（Ｐ２０１０−２４０８８２）
【出願日】平成２２年１０月２７日（２０１０．１０．２７）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月２７日（２０１０．１０．２７）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
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