血栓形成傾向の診断方法
本発明は、ＨＩＶまたは全身性自己免疫疾患に罹患している対象における血栓形成傾向の診断方法であって、前記対象から得られた血液試料において、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとを決定することを含む方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血栓形成傾向の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇｏｏｄｗｉｎら（Ｇｏｏｄｗｉｎら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：１２６巻、１１号、１３４９〜１３６６頁）は、プロテインＳ（ＰＳ）アッセイの技術的側面および診断的側面、ならびに臨床的疫学研究に対するそれらの適用を検討している。
【０００３】
プロテインＳ（ＰＳ）は、プロテインＣ抗凝固系の補因子として機能する、６３５個のアミノ酸から構成されるビタミンＫ依存性血漿糖タンパク質である。プロテインＳは、主に肝臓において産生される。
【０００４】
遺伝性ＰＳ欠乏症と静脈血栓症との関連性は、１９８４年に最初に確認された。遺伝性ＰＳ欠乏症に関連した動脈血栓症の症例は、まれに報告されている。プロテインＳは、第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子のタンパク質分解における活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）の活性を増強する補因子としての役割を果たす。
【０００５】
血漿中では、６０％〜７０％のＰＳが、ＰＳのカルボキシ末端ステロイド結合グロブリンドメイン中の結合部位を介してＣ４結合タンパク質（Ｃ４ｂＢＰ、補体調節タンパク質）に非共有結合で結合し、その結合相互作用の解離定数はナノモルの範囲内である。この結合親和性から、ＰＳの全ての利用可能なＣ４ｂＢＰ結合部位が埋まっていることが予測される。この結合相互作用は、血漿中ＰＳ濃度の測定および解釈を複雑にする。Ｃ４ｂＢＰは、２種のアイソフォーム（Ｍｒ５４００００および５９００００）を有する多量体タンパク質である。ＰＳの抗凝固活性は、遊離ＰＳにある。Ｃ４ｂＢＰβ＋に結合したＰＳは、ＡＰＣ補因子活性を有さない。
【０００６】
プロテインＳ欠乏症は、遺伝性または後天性であり得る。ホモ接合体のＰＳ欠乏症のまれな症例が、ホモ接合体のプロテインＣ欠乏症と同様に重症の新生児電撃性紫斑病と関連している。また、プロテインＣ欠乏症と同様に、ＰＳ欠乏症についての生化学的証拠は、５００人中約１人の有病率を示唆する。
【０００７】
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅは、総ＰＳ、遊離ＰＳの血漿中濃度およびＡＰＣ補因子活性に基づいて遺伝性ＰＳ欠乏症の３つの型を定義している。Ｉ型ＰＳ欠乏症は、ＡＰＣ補因子活性の減少を伴う低レベルの遊離ＰＳおよび総ＰＳ抗原によって確認される。ＩＩ型ＰＳ欠乏症は、低レベルのＡＰＣ補因子活性を伴う正常レベルの総ＰＳおよび遊離ＰＳ抗原によって特徴付けられる。ＩＩＩ型ＰＳ欠乏症は、正常から低レベルの総ＰＳと、低遊離ＰＳと、Ｃ４ｂＢＰに結合したＰＳ部分の増加とによって特徴付けられる。ＰＳ欠乏性患者の約２／３がＩ型欠乏症を有し、１／３がＩＩＩ型欠乏症を有し、ＩＩ型欠乏症はまれである。
【０００８】
血漿中ＰＳは、免疫学的および機能的アッセイによって定量されている。Ｆａｉｏｎｉ（Ｆａｉｏｎｉ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２００１；８６：１１３９〜１１４０）による総説では、この複合分析物の測定において不確実性を生じさせ続ける長期にわたる方法論的問題を強調している。初期のアッセイは、ポリクローナルエレクトロイムノアッセイ（主に、Ｌａｕｒｅｌｌ）によって総ＰＳを測定するものであった。遊離ＰＳは、２次元免疫電気泳動、または３．７５％のポリエチレングリコール６０００（ＰＥＧ）の添加による血漿中のＣ４ｂＢＰ−ＰＳ複合体の沈殿後の上清の測定のいずれかによって決定された。臨床検査室では、現在、ＰＥＧ沈殿と共に総ＰＳおよび遊離ＰＳを測定する多くの市販のポリクローナル酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が行われている。ＰＥＧ沈殿は、周知のように再生不可能でかつ時間がかかるにもかかわらず、依然として機能的ＰＳアッセイおよびモノクローナル遊離ＰＳ ＥＬＩＳＡの妥当性の判断基準である。近年、遊離ＰＳを正確に測定する市販のモノクローナルＥＬＩＳＡがいくつか利用可能になってきている。遊離ＰＳアッセイの唯一の欠点は、ＩＩ型ＰＳ欠乏症のまれな症例を見落とす可能性があることである。１９９６年に、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ ＨａｅｍｏｓｔａｓｉｓおよびＷｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）の合同会議は、ＰＳ欠乏症の診断のために総ＰＳよりも遊離ＰＳの測定が有用であり得ることを推奨した。更に、１９９６年におけるこのコンセンサス会議は、利用可能な機能的アッセイが（主にＡＰＣ抵抗性のために）特異性を欠くため、遊離ＰＳについてイムノアッセイを使用することを支持した。
【０００９】
ＰＳのＡＰＣ補因子活性は、修飾された活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）およびプロトロンビン時間（ＰＴ）フォーマットに基づいたアッセイにおいて測定され得る。ＡＰＴＴフォーマットにおいて、希釈された患者血漿は、精製ＡＰＣおよびＶａ型因子の存在下でＰＳ欠失血漿に添加される。ＰＴフォーマットにおいて、同様のアプローチをとることができるか、またはその欠失血漿中のネイティブ血漿ＰＣをＰｒｏｔａｃ（アメリカマムシ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃｏｐｐｅｒｈｅａｄ）のヘビ毒（アグキストロドン・コントルトリックス・コントルトリックス（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ））由来の酵素）によって活性化することができる。機能的アッセイの欠点は、ＡＰＣ抵抗性、第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ、高濃度のプロトロンビン、第ＶＩＩＩａ因子および第ＶＩＩａ因子の存在による高い割合の偽陽性の結果から生じる。ループス様阻害剤はまた、そのアッセイにおいて用いられる患者血漿の希釈によってこの効果が最小限にされるにもかかわらず、干渉することもできる。高添加濃度の添加Ｖａ型因子を用いるアッセイは、ＡＰＣ抵抗性または第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎの存在によってあまり影響を受けない。
【００１０】
血漿中総ＰＳ濃度の正常範囲の下限は、プールされた正常ヒト血漿中で観察される濃度の６５％として一般的に認められている。しかし、個々の検査室は、正常な個体から得られた血漿試料を用いるそれらのアッセイに特異的な正常範囲を確立すべきである。ＰＳ血漿中濃度は、男性よりも女性において低く、閉経女性、妊娠している女性および経口避妊を行う女性と比較して閉経前女性において低く、したがって、これらは、ホルモン状態の顕著な効果を示す。一般に、ＰＳレベルは、女性において年齢と共に増加するが、男性においてはほとんど変化しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、血栓形成傾向を評価するための簡単な信頼できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ＨＩＶまたは全身性自己免疫疾患に罹患している対象における血栓形成傾向の診断方法であって、前記対象から得られた血液試料において、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとを決定することを含む方法に関する。
【００１３】
血液試料中のＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとの両方を測定することによって、プロテインＳのＡＰＣ補因子活性を阻害する自己抗体によって誘発される血栓形成傾向を診断することが可能になる。
【００１４】
例えばＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳ／総プロテインＳの比を計算することによりＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとを比較することによって、例えばビタミンＫ欠乏症、肝疾患、妊娠、年齢に起因するプロテインＳの偏差と実質的に独立した正規化数を得ることができる。次いで、この正規化数は、自己免疫性プロテインＳ欠乏症の信頼できる指標となる。
【００１５】
典型的には、ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳ／総プロテインＳの比は、遊離プロテインＳの補因子活性を中和する抗プロテインＳ自己抗体の存在に対する間接的マーカーである。低い比は、遊離プロテインＳの補因子活性を中和する抗プロテインＳ自己抗体の存在を示す。本発明はまた、自己免疫性プロテインＳ欠乏症の指標としての、ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳおよび総プロテインＳの使用にも関する。
【００１６】
典型的には、この比は、基準値と比較され得る。基準値は、一群の健康対象から得られ得る。典型的には、かかる対象は、試験すべき生物学的試料が得られた対象と比較して同様の性別、年齢および／またはボディマスインデックスを有することができる。あるいは、基準値は、結節性再生性過形成を伴うＨＩＶまたは全身性自己免疫疾患に罹患している一群の対象から得られ得る。
【００１７】
本発明はまた、自己免疫性プロテインＳ欠乏症の指標としての、ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳおよび総プロテインＳの使用にも関する。
【００１８】
本発明はまた、対象における自己免疫性プロテインＳ欠乏症の診断方法であって、前記対象から得られた血液試料において、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとを決定することを含む方法にも関する。
【００１９】
本発明の別の目的は、
ａ）ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳを検出するための手段、および
ｂ）総プロテインＳを検出するための手段
を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】「プロテインＳ活性」対「総プロテインＳ」の比を示す図である。 結節性再生性過形成を有する（黒丸）および有さない（白丸）ＨＩＶ陽性患者の、結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陰性患者（黒四角）由来の、ならびに健康対照者（白四角）由来の血漿において、プロテインＳ活性および総プロテインＳのレベルを測定した。図は、「プロテインＳ活性」対「総プロテインＳ」の比を患者毎に示す。スチューデントのｔ検定を用いて統計学的有意性を評価した。
【図２】結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陽性患者のプロテインＳ特異的ＩｇＧのレベルを示す図である。 Ａ．結節性再生性過形成を有する（グレー丸）および有さない（白丸）ＨＩＶ陽性患者由来、結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陰性患者（グレーおよび黒四角）由来、ならびに健康対照者（白四角）由来の血漿を、プロテインＳ被覆ＥＬＩＳＡプレート中でインキュベートした。ペルオキシダーゼ結合ポリクローナル抗ヒトＩｇＧおよびその基質を用いて、結合ＩｇＧを検出した。示された結合強度を、４９２ｎｍでスコアした光学密度（ＯＤ）として１／５０の血漿希釈率で測定した。被覆プロテインＳの認識は、ＩｇＧの用量に依存した（図示せず）。Ｂ．結節性再生性過形成を有するＨＩＶ感染患者の血漿から精製されたＩｇＧの阻害活性。患者の血漿から精製したＩｇＧ（１ミリリットル当たり０から２ミリグラム）を、組換えプロテインＳ（１ミリリットル当たり２０マイクログラム）と共にインキュベートした。次いで、プロテインＳのプロテインＣ補助因子活性を、説明されるように機能的凝固アッセイにおいて測定した。ＩｇＧの特異的阻害活性は、１ミリグラム当たりの単位で表現され、５０パーセントのプロテインＳ阻害を生じさせるＩｇＧ濃度の逆数を表す。バーは中央値を表す。Ｐ値は、グラフ上に示される。データは、少なくとも２つの独立した実験からのものである。ＨＩＶ陰性患者の場合、全身性エリテマトーデスを有する２人の患者は、黒四角として示される。
【図３】「プロテインＳ活性」対「総プロテインＳ」の比とプロテインＳのＩｇＧ媒介阻害との間の相関を示す図である。 結節性再生性過形成を有する５人のＨＩＶ感染患者の血漿から精製したＩｇＧの阻害活性（図２Ｂ参照）を、遊離プロテインＳ対総プロテインＳの比（図１参照）の関数としてプロットした。相関の有意性を、ノンパラメトリックスピアマン相関検定を用いて評価した（Ｒｈｏ＝−０．９、Ｐ＝０．０３７）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
「血栓形成傾向」という用語は、血栓症に素因となる止血の異常を指す。
【００２２】
本明細書において用いられる「血液試料」という用語は、インビトロにおける評価の目的のために得られた血液試料を指す。血液試料の例としては、全血試料、血漿または血清試料がある。
【００２３】
本発明は、ＨＩＶまたは全身性自己免疫疾患に罹患している対象における血栓形成傾向の診断方法であって、前記対象から得られた血液試料において、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとを決定することを含む方法に関する。
【００２４】
一実施形態において、全身性自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、抗リン脂質抗体症候群、ベーチェット病、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、ウイルス誘発性プロトロンビン状態、血栓性血小板減少性紫斑病である。
【００２５】
後天性ＡＰＣ抵抗性が、ＳＬＥを有する患者の抗プロテインＳ自己抗体と関連していることがすでに示されている（Ｎｏｊｉｍａら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ．２００９年１月６日）。
【００２６】
本発明はまた、自己免疫性プロテインＳ欠乏症の指標としてのＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳと総プロテインＳとの使用にも関する。
【００２７】
本発明はまた、対象における自己免疫性プロテインＳ欠乏症の診断方法であって、前記対象から得られた血液試料において、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとを決定することを含む方法にも関する。
【００２８】
本発明の方法は、対象における血栓形成傾向または全身性自己免疫疾患を診断するために用いられる従来の方法と組み合わせて用いられ得る。典型的には、医師は、血栓形成傾向または全身性自己免疫疾患を診断するための既存の方法において用いられる他の臨床または病理学的パラメーターを考慮することもできる。したがって、本発明の方法を用いて得られた結果は、血栓形成傾向または全身性自己免疫疾患の診断のために実施された他の試験、アッセイまたは手法からの結果と比較することができ、かつ／または組み合わせることができる。かかる比較および／または組合せは、より洗練された診断を提供することを助けることができる。
【００２９】
血液試料中のＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとの決定は、当技術分野におけるいずれの公知の方法によっても実施され得る。これらのレベルは、イムノアッセイ、例えば、競合、直接反応、アレイチップまたはサンドイッチ型アッセイが含まれる標準的免疫診断技術を用いて測定され得る。かかるアッセイとしては、ウエスタンブロット、凝集試験、酵素標識および媒介イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、ビオチン／アビジン型アッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫電気泳動、免疫沈降、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー、固相アフィニティー等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
例えば、ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルは、免疫学的アッセイ（例えば、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ（Ｆｒａｎｃｅ）の市販のＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ（登録商標）遊離プロテインＳアッセイ）および機能的アッセイ（例えば、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ（Ｆｒａｎｃｅ）の市販のＳＴＡＣＬＯＴ（登録商標）プロテインＳアッセイ）によって決定され得る。ＰＳのＡＰＣ補因子活性は、修飾された活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）およびプロトロンビン時間（ＰＴ）フォーマットに基づいたアッセイにおいて測定され得る。
【００３１】
総プロテインＳのレベルは、免疫学的アッセイ（例えば、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ（Ｆｒａｎｃｅ）の市販のＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ（登録商標）総プロテインＳアッセイ）によって決定され得る。
【００３２】
特定の一実施態様において、ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルは、ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳと選択的に相互作用し得る結合パートナーにより決定され得る。結合パートナーは、活性化プロテインＣの認識を担うプロテインＳの特異的アミノ酸に結合することができる。典型的には、結合パートナーは、プロテインＳのγ−カルボキシルグルタミン酸ドメインに結合することができる。このドメインは、ＡＰＣとのプロテインＳ相互作用に関与する（Ｓａｌｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ．２００５年１月１日；１０５（１）：１２２〜３０）。
【００３３】
例えば、結合パートナーは、ポリクローナルもしくはモノクローナルであってよい抗プロテインＳ抗体またはその断片もしくは誘導体であってよい。別の例において、結合パートナーはアプタマーであってよい。
【００３４】
本発明のポリクローナル抗体またはその断片は、例えば、とりわけ、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジおよびマウスから選択される宿主動物に、適切な抗原またはエピトープを投与することによって、公知の方法に従ってもたらすことができる。抗体産生を増強するために、当技術分野において公知の各種アジュバントを用いることができる。本発明の実施に有用な抗体はポリクローナルであり得るが、モノクローナル抗体が好ましい。
【００３５】
本発明のモノクローナル抗体は、連続培養細胞系による抗体分子の産生をもたらす任意の技術を用いて調製かつ単離することができる。産生および単離のための技術としては、最初にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｃｏｔｅら、１９８３）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。別の場合、一本鎖抗体の産生について記載された技術（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号参照）を適合させて、一本鎖抗体を産生することができる。本発明の実施に有用な抗体としては、限定されないが、インタクト抗体分子のペプシン消化によって作製され得るＦ（ａｂ’）２断片や、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減少させることによって作製され得るＦａｂ断片が含まれる断片が挙げられる。別の場合、所望の特異性を有する断片の迅速同定を可能にするために、Ｆａｂおよび／またはｓｃＦｖ発現ライブラリーを構築することができる。例えば、抗体のファージディスプレイを用いることができる。かかる方法において、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ断片を、適切なバクテリオファージ、例えばＭ１３の表面上に発現させる。簡潔に言えば、タンパク質で免疫化した適切な宿主、例えばマウスの脾臓細胞を摘出する。そのタンパク質に対する所望の抗体を産生するそれらの細胞からＶＬおよびＶＨ鎖のコード領域が得られる。次いで、これらのコード領域をファージ配列の末端に融合させる。一旦ファージが適切な担体、例えば細菌に挿入されると、ファージは抗体断片を提示する。当業者に公知のコンビナトリアル方法によって抗体のファージディスプレイを提供することもできる。次いで、ファージによって提示される抗体断片をイムノアッセイの一部として用いることができる。
【００３６】
アプタマーは、分子認識の点において抗体に対する代替物を表す分子のクラスである。アプタマーは、高親和性および特異性で事実上標的分子のあらゆるクラスを認識する能力を有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチド配列である。かかるリガンドは、Ｔｕｅｒｋ Ｃ．およびＧｏｌｄ Ｌ．（１９９０）に記載されているように、ランダム配列ライブラリーの試験管内人工進化（ＳＥＬＥＸ）を通して単離され得る。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって入手可能である。このライブラリーにおいて、各メンバーは、ユニーク配列の、最終的には化学修飾をほどこした直鎖状オリゴマーである。分子のこのクラスの可能な修飾、使用および利点は、Ｊａｙａｓｅｎａ Ｓ．Ｄ．（１９９９）においてレビューされている。ペプチドアプタマーは、２つのハイブリッド法によってコンビナトリアルライブラリーから選択される、大腸菌チオレドキシンＡ等のプラットフォームタンパク質によって提示される、配座的に制限された抗体可変領域から成る（Ｃｏｌａｓら、１９９６）。
【００３７】
上述のアッセイは、固体支持体への結合パートナー（すなわち、抗体またはアプタマー）の結合を含むことができる。本発明の実施に使用され得る固体支持体としては、基質、例えば、ニトロセルロース（例えば、膜またはマイクロタイターウェル形態の）、ポリ塩化ビニル（例えば、シートまたはマイクロタイターウェル）、ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレート）、ポリフッ化ビニリジン、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性化ビーズ、磁気応答性ビーズ等が挙げられる。
【００３８】
本発明の結合パートナー、例えば、抗体またはアプタマーは、検出可能分子または物質、例えば、蛍光分子、放射性分子または当技術分野において公知のあらゆる他の標識で標識され得る。一般にシグナルを（直接的または間接的に）提供する標識は、当技術分野において公知である。
【００３９】
本明細書において用いられる場合、抗体またはアプタマーに関する「標識」という用語は、抗体またはアプタマーに検出可能物質、例えば、放射性剤またはフルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）またはインドシアニン（Ｃｙ５））を結合する（すなわち、物理的に連結する）ことによる抗体またはアプタマーの直接的標識化、および検出可能物質との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識化を包含することが意図される。本発明の抗体またはアプタマーは、当技術分野において公知の任意の方法によって放射性分子で標識され得る。例えば、放射性分子としては、限定されるものではないが、シンチグラフィー検査のための放射性原子、例えば、Ｉ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８が挙げられる。
【００４０】
特定の一実施形態において、ＥＬＩＳＡ法は、マイクロタイタープレートのウェルに、ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳに対する一組の抗体と総プロテインＳを検出することが可能な一組の抗体とを被覆した、血液試料中のＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとの決定に適切であり得る。次いで、血液試料を被覆ウェルに加える。抗体−抗原複合体の形成を可能にするために十分なインキュベーションの期間の後、プレート（複数可）を洗浄して、非結合部分と、加えた、検出可能に標識された２次結合分子とを除去することができる。２次結合分子を任意の捕捉した試料マーカータンパク質と反応させ、プレートを洗浄し、当技術分野において周知の方法を用いて２次結合分子の存在を検出する。
【００４１】
別の特定の一実施形態において、血液試料中のＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとの決定は、アレイチップで実施され得る。かかるアレイ技術によって、生物学的分析物のために用いる場合に一般にバイオチップとして知られている単一基質上で多く実験を同時に実施することが可能になる。アレイチップの例は、国際特許文献ＷＯ２００７０１２８８５、ならびにＤｕｐｕｙ ＡＭ．ら（２００５）、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ＳＲら（２０００）およびＪａｉｎ ＫＫら（２０００）に記載されている。
【００４２】
例えば、ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳおよび総プロテインＳに対する結合パートナーを前記アレイチップの表面において固定することができる。次いで、前記対象から得られた血液試料をアレイチップ中に沈積させる。複合体の形成を可能にするために十分なインキュベーションの期間の後、次いでアレイチップを洗浄して、非結合部分を除去することができる。第２ステップにおいて、ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとを、ＡＰＣ補因子活性を有する前記遊離プロテインＳおよび前記総プロテインＳに対して特異的な第２結合パートナーで決定する。好ましい一実施形態において、前記結合パートナーを標識し、しかるに、それによって、遊離プロテインＳまたは総プロテインＳに対して特異的な一組の「スポット」（着色沈積物）の形成が可能になる。例えば、検出および定量は、特異的な検出器を有する前記アレイチップ中のスポットを分析することによって実施され得る。
【００４３】
本発明のその上別の目的は、ａ）ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳを検出するための手段、および
ｂ）総プロテインＳを検出するための手段
を含むキットに関する。
【００４４】
典型的には、前記キットは、
ａ）ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳと選択的に相互作用する結合パートナー、および
ｂ）総プロテインＳを検出することが可能な結合パートナー
を含む。
【００４５】
典型的には、前記結合は、ポリクローナルもしくはモノクローナルであってよい抗体、またはその断片もしくは誘導体であってよい。
【００４６】
典型的には、抗体は、上記に記載されるように標識され得る。
【００４７】
キットはまた、適用可能な場合、固相マトリックスおよび標準物質を含む、特定の検出プロトコールのために必要とされる他の適切に包装された試薬および材料を含むこともできる。
【００４８】
好ましい一実施形態において、本発明による方法は、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルを決定することによって実施される。別法として、同方法は、遊離プロテインＳのレベルを決定することによって実施され得る。
【００４９】
本発明を、以下の図および実施例に鑑みて更に示す。
【００５０】
【表１】
【００５１】
【表２】
【００５２】
＜実施例１＞
要約
原因不明の結節性再生性過形成を有する１３人の継続ＨＩＶ陽性患者と、結節性再生性過形成を有さない１６人の継続ＨＩＶ陽性患者と、確認された原因からの結節性再生性過形成を有する８人のＨＩＶ陰性患者と、１０人の匿名の健康供血者とを比較した。
【００５３】
患者および対照者を、欠乏症プロテインＳ活性および抗プロテインＳ ＩｇＧ抗体についてスクリーニングした。患者および対照者からの精製ＩｇＧの抗プロテインＳ活性を、プロテインＳが補因子の役割を果たすプロテインＣの活性化の機能検査において評価した。完全肝臓ＣＴ−門脈造影を症例患者の肝臓外植体上で実現した。
【００５４】
そのＣＴ門脈造影は、びまん性閉塞性門脈静脈障害（ｄｉｆｆｕｓｅ ｏｂｌｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｐｏｒｔａｌ ｖｅｎｏｐａｔｈｙ）を開示した。プロテインＳ活性のレベルは、結節性再生性過形成を有さないＨＩＶ陽性患者および結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陰性患者と比較した場合、ＨＩＶ関連結節性再生性過形成を有する患者において低かった（全比較についてＰ＜０．００５）。結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陽性患者は、結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陰性患者および健康対照者よりも抗プロテインＳ ＩｇＧのレベルが有意に高かった。ＨＩＶ関連結節性再生性過形成を有する患者由来の精製ＩｇＧは、プロテインＳ依存性プロテインＣ活性化を特異的に阻害した。
【００５５】
結論：後天性自己免疫性プロテインＳ欠乏および続発性血栓形成傾向は、ＨＩＶ陽性患者における閉塞性門脈静脈障害および代償性結節性再生性過形成の原因であると思われる。
【００５６】
方法
試験デザイン
肝臓の生検で確認された結節性再生性過形成を有する１６人のＨＩＶ感染患者を、Ｃｏｃｈｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）の肝臓部門に紹介した。
【００５７】
これらの１６人の患者の内の３人は、Ｃ型肝炎ウイルスに同時感染しており、本分析から除外された。慢性肝疾患の全ての共通の原因は、他の１３人の患者において除外された。ウイルス性Ｂ型およびＣ型肝炎のゲノム増幅は陰性であり、顕在的または潜在的Ｂ型肝炎および／またはＣ型肝炎感染症を除外した。Ｂ型肝炎コア（ＨＢｃ）抗体（ＩｇＧ）は、１３人の患者の内で６人の患者において陽性だった。アルコールの過剰摂取（＞２０ｇ／日）の過去または最近の既往歴はなく、フェリチンおよびトランスフェリン飽和血中レベルは正常であり、抗肝臓自己抗体および抗核抗体は陰性と検査された。血清α−１−抗トリプシン、銅およびセルロプラスミンレベルは正常であり、ヘモクロマトーシス、自己免疫性肝炎、α−１−抗トリプシン欠乏症およびウィルソン病をそれぞれ除外した。いずれの患者も、とりわけ心臓、血液学的または腎臓病状に関する重大な併存疾患を有さなかった。毒物曝露（ビタミンＡ、硫酸銅、塩化ビニルモノマー、硫酸トリウム、スペインのトキシックオイルまたはヒ素塩）の既往歴はなく、過去のまたは継続しているホルモン療法や生薬治療はなかった。
【００５８】
肝機能検査が厳密に正常な１６人の継続ＨＩＶ陽性患者と、確認された原因に続発する結節性再生性過形成を有する８人の患者との、症例患者のプロテインＳ活性のレベルを比較した。結節性再生性過形成を有する８人のＨＩＶ陰性患者は、不均一の基礎疾患を示したが、それらの基礎疾患に含まれるのは、５人は腎臓移植、２人はループス、１人はバルトネラ症であった。ＥＬＩＳＡにおけるプロテインＳの認識とプロテインＳに対する精製ＩｇＧの阻害活性とをそれぞれ検査するために、試料の入手可能性に基づいて、結節性再生性過形成を有する７人または５人のＨＩＶ陽性患者の血清を使用した。これらの患者についての臨床プロファイルは、とりわけＣＤ４細胞数に関して、残りの患者のそれと同様であり、試験した群間にバイアスはなかった（比較についてＰ＝０．１２７）。ＩｇＧアッセイのための対照としての役割を果たした匿名の健康供血者からの血液の１０の試料。インフォームドコンセントを全ての患者から得て、我々の病院の施設内審査委員会はこの試験を承認した。
【００５９】
プロトロンビン止血障害評価
全ての患者を、ループス抗凝固因子、ＩｇＧおよびＩｇＭアイソタイプの抗リン酸脂質抗体、アンチトロンビンおよびプロテインＣ機能的欠乏症、プロテインＳ機能的欠乏症、ならびにＧ１６９１Ａ第Ｖ因子およびＧ２０２１１０Ａ第ＩＩ因子変異についてスクリーニングした。
【００６０】
市販のＥＬＩＳＡ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ（Ｆｒａｎｃｅ）のＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ（登録商標）総プロテインＳアッセイおよびＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ（登録商標）遊離プロテインＳアッセイ）を製造業者によって示されるように用いて、総プロテインＳおよび遊離プロテインＳのレベルを測定した。
【００６１】
血漿中のＣ４ｂ結合タンパク質の測定
指示されるように市販のＬｉａｔｅｓｔ（登録商標）Ｃ４ｂ結合タンパク質色素産生アッセイを用いて（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ（Ｆｒａｎｃｅ））、患者および対照者からの血漿中のＣ４ｂ結合タンパク質のレベルを評価した。
【００６２】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による抗プロテインＳ ＩｇＧの定量
１ミリリットル当たり２マイクログラムのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の組換えヒトプロテインＳをＥＬＩＳＡプレートに被覆し、摂氏４度で終夜静置した（Ｍｏｒｂｏｅｕｆら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ２０００、１００：８１〜８８）。それらのプレートを０．２パーセントのＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで洗浄し、１パーセントのウシ血清アルブミンを有するＰＢＳでブロックし、次いで室温で１時間静置した。患者および健康供血者を含む対照者からの血漿試料を、室温で２時間、系列希釈物中でインキュベートした。ウェルの広範囲にわたる洗浄の後、ペルオキシダーゼに結合させたポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｌｏｎｅ ＪＤＣ−１０、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびその基質を用いて結合ＩｇＧを認めた。Ｇｅｎｙｏｓ（ＴＥＣＡＮ）を用いて４９２ナノメートルで色素産生産物を読みとった。
【００６３】
血漿からのＩｇＧの精製
タンパク質Ｇ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）上でアフィニティークロマトグラフィーによって患者および健康供血者の血漿からＩｇＧを精製した。血漿を、０．０１パーセントのアジドを有するＰＢＳ（ＰＢＳ／アジド）中のタンパク質Ｇ−セファロースと共にインキュベートし、摂氏４度で終夜静置した。ＰＢＳ／アジドによる広範囲にわたる洗浄の後、ＩｇＧを、０．２ｍｏｌ／リットルのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．８）を用いて溶出し、３モルのトリスを用いて中和した。ＩｇＧを、摂氏４度で４時間ＰＢＳに対して透析し、２８０ナノメートルの分光測定によって定量した。
【００６４】
プロテインＳの阻害についての機能的アッセイ
組換えヒトプロテインＳ（１ミリリットル当たり２０マイクログラム）を、Ｏｗｒｅｎ−Ｋｏｌｌｅｒ緩衝液中で単独で、または精製ＩｇＧ（１ミリリットル当たり０．５、１および２ミリグラム）と共に、摂氏３７度で２時間インキュベートした（Ｍｏｒｂｏｅｕｆら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ２０００、１００：８１〜８８）。次いで、プロテインＳが欠失したヒト血漿、ヒト活性化プロテインＣおよびウシ活性化第Ｖ因子の混合物に試料を加えた。塩酸カルシウム（１リットル当たり０．０２５ｍｏｌ）で凝固を開始させ、凝固にかかった時間を、凝固計ＫＣ１０ ｍｉｃｒｏ（Ａｍｅｌｕｎｇ、Ｌｅｍｇｏ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定し、組換えプロテインＳの系列希釈物（１ミリリットル当たり３０から０．３３マイクログラム）で得た標準曲線と比較した。５０パーセントのプロテインＳ阻害を生じさせるＩｇＧ濃度の逆数を表すミリグラム当たりの単位で表現されるＩｇＧの特異的阻害活性を計算した。
【００６５】
統計分析
連続変数は、中央値および四分位範囲または平均値および平均値の標準誤差として示される。カテゴリー変数は、計数および百分率として示される。群間の差を、マン−ホイットニーＵ検定およびクラスカル−ウォリスＨ検定で評価した。全てのＰ値は両側であり、第１種の誤りを５パーセントに設定した。ＳＰＳＳソフトウェア（バージョン１６）（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて全ての統計分析を実施した。
【００６６】
結果
臨床的特徴
ＨＩＶ関連結節性再生性過形成を有する患者の年齢の中央値は、４１歳であった。９人の男性および４人の女性がいた。全員が、各種感染ルートによる持続性ＨＩＶ感染症（知られたＨＩＶ陽性の長さの中央値は１２年）を有した。全員が、１マイクロリットル当たり２６５個の細胞の診断時のＣＤ４Ｔ細胞数の中央値およびＣＤ４細胞の正常割合により、高活性抗レトロウイルス療法によって適切に免疫が回復したと判断された。全員を、（各種抗レトロウイルス治療の中で）ジダノシンに曝露させたか、または曝露させていた。
【００６７】
症状の初期状態は、患者の半分超における原因不明の肝機能検査異常（軽度の血小板減少症を伴うアルカリホスファターゼの上昇）であった。残りは、門脈圧亢進症の直接的または間接的な徴候を示した。最初に示された肝臓異常と結節性再生性過形成の診断との間の遅延期間の中央値は、１７ヵ月であった。
【００６８】
１１人の患者（８５パーセント）に、上部内視鏡検査において食道静脈瘤および高血圧性胃疾患があった。その内の６人は、診断時にまたは追跡調査の間に胃腸出血を経験した。１人の患者が、門脈圧亢進性滲出性胃腸症に関連する慢性下痢および重症の栄養失調を発症した。４人の患者が、肝不全および門脈圧亢進症のための肝臓移植を受けた。結節性再生性過形成の診断と肝臓移植との間の遅延期間の中央値は、３７ヵ月（範囲は２４〜４７）であった。２人の患者が、肝臓移植時に門脈血栓症を有した。
【００６９】
病理学および放射線医学
最後の移植患者の外植体を入手することは、放射線学的レベルおよび病理学的レベルの両方でＨＩＶ関連結節性再生性過形成の機序を垣間見ることを提供した。肝臓全体のＣＴ−門脈造影は、遠位肝内門脈枝のびまん性閉塞を伴う閉塞性門脈静脈障害の像を明らかにした。外植体の病理検査は、結節性再生性過形成、類洞拡張および肝実質中の肝門脈硬化症の像によって、閉塞性門脈静脈障害の典型的な態様を開示した。重大な線維症は認められなかった。
【００７０】
プロトロンビン止血障害評価
閉塞性門脈静脈障害は、プロトロンビン障害としばしば関連付けられる。したがって、ＨＩＶ関連結節性再生性過形成を有する全患者を、プロトロンビン止血障害についてスクリーニングした。ＨＩＶ関連結節性再生性過形成を有する全ての患者は、プロテインＳ活性のレベルが低下した（表１）。
【００７１】
対応対照と比較した場合、プロテインＳ活性のレベルは、結節性再生性過形成を有さないＨＩＶ陽性患者および結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陰性患者と比較して、結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陽性患者において低かった（表１）。対照的に、総プロテインＳのレベルは、結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陽性患者と有さないＨＩＶ陽性患者の場合で類似しており、健康供与者の場合とも類似していた（表１）。
【００７２】
次いで、本試験に含まれる患者毎に、「プロテインＳ活性」対「総プロテインＳ」の比を計算した（表１）。結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陽性患者における比は、結節性再生性過形成を有さないＨＩＶ陽性患者および健康対照者よりも有意に低かった（図１、Ｐ＜０．００１）。結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陰性患者でも同じことが当てはまった。
【００７３】
Ｃ４ｂ結合タンパク質のレベル
遊離プロテインＳの減少をＣ４ｂ結合タンパク質と複合体を形成した形態へのシフトに帰すことができるかどうかを決定するため、患者の血漿中のＣ４ｂ結合タンパク質のレベルを、対照者の血漿中のそのレベルと比較した。結節性再生性過形成を有するＨＩＶ感染患者とそれを有さないＨＩＶ感染患者は、血漿中のＣ４ｂ結合タンパク質レベルが同じであることを示した（Ｐ＝０．５３０）。予想外に、結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陰性患者からの血漿は、血漿中Ｃ４ｂ結合タンパク質レベルが３．６から５．４倍高いが（表１）、このことは、これらの患者における総プロテインＳの有意な増加を説明することが可能である。
【００７４】
抗プロテインＳ ＩｇＧ
ＨＩＶ感染患者におけるプロテインＳレベルの低下が、後天性抗プロテインＳ体液性免疫応答に起因するのかどうかを検討した。興味深いことに、プロテインＳ特異的ＩｇＧが、健康供与者の血漿中で検出された。結節性再生性過形成を有さないＨＩＶ感染患者は、健康な個体と同様の抗プロテインＳ ＩｇＧレベルを示した。対照的に、結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陰性およびＨＩＶ陽性患者は、健康供与者および結節性再生性過形成を有さないＨＩＶ感染症を有する患者よりも抗プロテインＳ ＩｇＧレベルが高かった（図２Ａ）。結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陽性患者の場合、血漿中ＩｇＧによる上昇したプロテインＳ認識は、結節性再生性過形成を有さないＨＩＶ陽性患者および健康供血者と比較して、より高い量の循環ＩｇＧと関連付けられた（表１）。注目すべきことは、最も高いレベルの抗プロテインＳ ＩｇＧを有する患者は、基礎疾患としてループスを有したことである。
【００７５】
プロテインＳに対する精製ＩｇＧの阻害活性
次いで、結節性再生性過形成を有する患者における抗プロテインＳ ＩｇＧがプロテインＳ機能を中和することができるかどうかを検討した。健康供与者および結節性再生性過形成を有さないＨＩＶ感染患者からのＩｇＧによるプロテインＳ活性の基礎阻害が、おそらく我々の阻害アッセイの限定により認められた。プロテインＳ活性の阻害は、ＩｇＧの濃度に依存した。結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陽性患者由来のＩｇＧは、健康供与者由来のＩｇＧおよび結節性再生性過形成を有さないＨＩＶ陽性患者由来のＩｇＧよりも、プロテインＳに対して一貫してかつ有意に高い阻害活性を示した。結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陰性患者由来のＩｇＧは、プロテインＳ阻害に関して不均一であり、健康供与者および結節性再生性過形成を有さないＨＩＶ感染患者由来のＩｇＧのそれによって認められる阻害と有意に異なるものではなかった（それぞれ、Ｐ＝０．３２９およびＰ＝０．１２６）（表１、図２Ｂ）。結節性再生性過形成を有する５人のＨＩＶ陽性患者の血漿から精製したＩｇＧによるプロテインＳ活性の阻害と遊離対総プロテインＳの比との間に有意な相関があった（図３）。
【００７６】
考察
ここで、唯一の確認された病因因子がＨＩＶ感染症である結節性再生性過形成を有する１３人の患者の症例シリーズを示す。症状の様式は、非常にステレオタイプであり、持続性ＨＩＶ感染症、抗レトロウイルス薬、とりわけジダノシンに対する曝露、適切な免疫の回復および原因不明の肝機能検査異常または門脈圧亢進症であった。門脈圧亢進症に関連した合併症が、その内の約半分において出現し、４人が肝臓移植を必要とした。ＨＩＶ関連結節性再生性過形成の機序は、現在まで不明であるが、大部分の患者が適切に免疫を回復したことから、ＨＩＶ感染症および後天性免疫抑制自体に関連があるとは思われない。
【００７７】
最後の移植患者の外植体のＣＴ−門脈造影は、ＨＩＶ関連結節性再生性過形成における原発病変が、びまん性閉塞性門脈静脈障害であることを示す。小門脈の閉塞は、肝細胞集団を維持するために供給腺房の虚血および残部の再生性過形成をもたらす。この所見は、結節性再生性過形成における原発病変が閉塞性門脈静脈障害であることを示唆する結節性再生性過形成における有力な剖検研究に一致する。ＨＩＶ感染患者における本症候群を表すために、ＨＩＶ関連閉塞性門脈障害（ＨＩＶ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｏｂｌｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｐｏｒｔｏｐａｔｈｙ）（ＨＩＶ−ＯＰ）の用語を提案する。
【００７８】
結節性再生性過形成および閉塞性門脈静脈障害は、リウマチ性障害、血管障害および骨髄増殖性障害が含まれる他の全身性疾患に関連して、更にある種の薬物および後天性プロテインＳ欠乏症が含まれる先天性または後天性プロトロンビン状態に関連して出現することが報告されている。
【００７９】
プロテインＳ活性は、結節性再生性過形成を有さないマッチしたＨＩＶ陽性対照者および別の起源の結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陰性患者と比較して、ＨＩＶ−ＯＰを有する患者において有意に低かった。
【００８０】
したがって、我々のデータは、プロテインＳ欠乏症とＨＩＶ−ＯＰの発症との関連を示す。
【００８１】
興味深いことに、プロテインＳ活性の著しい低下にもかかわらず、結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陽性患者の総プロテインＳのレベルは、結節性再生性過形成を有さないＨＩＶ陽性患者および健康供与者のそれと同じであり、このことは、循環プロテインＳの機能的不活性化を示す。我々は、実際、健康供与者を含む他の群からの患者と比較してＨＩＶ−ＯＰを有する患者由来の血漿中の抗プロテインＳ ＩｇＧの増加したレベルを実証する。特に興味深いことに、「プロテインＳ活性」対「総プロテインＳ」の比の計算は、結節性再生性過形成を有する患者を他の患者および健康供与者から明らかに区別することを可能にする。
【００８２】
抗プロテインＳ ＩｇＧは、機能的アッセイにおける活性化プロテインＣに対するプロテインＳの補助因子活性を阻害することが可能だった。結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陽性患者から精製したＩｇＧによるプロテインＳ活性の阻害と遊離対総プロテインＳの比との間の観察された有意な相関は、遊離対総プロテインＳの比の低下がかかる患者における阻害性抗プロテインＳ ＩｇＧの存在を間接的に反映することを示唆する。
【００８３】
重要なことに、Ｃ４ｂ結合タンパク質のレベルは、ＨＩＶ−ＯＰを有する患者において変化しなかった。遊離プロテインＳのレベルが、肝疾患および血栓症を含む多発性疾患プロセスによって影響を受ける可能性があるが、我々のデータは、後天性抗プロテインＳ ＩｇＧが、ＨＩＶ陽性患者の肝臓における結節性再生性過形成の病因に関与することを示唆する。ＨＩＶ感染患者における高いレベルの阻害性抗プロテインＳ ＩｇＧの存在は、慢性ポリクローナル活性化につながる、抗レトロウイルス療法にもかかわらず生じるＢ細胞活性化またはＢ細胞レパートリーの持続的異常によって説明することができる（Ｒｅｄｇｒａｖｅら、ＨＩＶ Ｍｅｄ ２００５、６：３０７〜３１２）。実際、抗プロテインＳ抗体の存在は、ＩｇＧレベルと十分に相関した。本明細書において試験されたＨＩＶ感染患者は、妥当なＣＤ４陽性リンパ球細胞数を有したが、その内の半分は、そのＣＤ４細胞数を非常に低い最低値から劇的に増加させていた。これは、炎症性および本物の自己抗体媒介自己免疫性状態を含む免疫再構築症候群の各種兆候の出現に好都合であることが知られている。
【００８４】
ＨＩＶ−ＯＰの発現率が不明であるにもかかわらず、それは、一般に考えられているよりもよく見られる可能性がある。ＨＩＶ−ＯＰだけを有する患者だけをここで報告するが、Ｃ型肝炎ウイルスに同時感染した患者における同じ症例を認めている（Ｍａｌｌｅｔら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｌ ２００７、３１：８７８〜８８０）。ＨＩＶ−ＯＰを有する患者が典型的には肝硬変に似た臨床的特徴を示すので、診断を確認するためにほとんどの症例において肝生検が適応となる。しかし、いずれの基礎肝疾患も存在しない場合、ＨＩＶ−ＯＰの診断を、ＨＩＶ感染患者において原因不明の肝機能検査異常がある場合、とりわけプロテインＳのレベルの低下が見出される場合に考慮すべきである。この場合、患者を、潜在性門脈圧亢進症についてスクリーニングすべきである。
【００８５】
結論として、ＨＩＶ−ＯＰは、後天性自己免疫性プロテインＳ欠乏症に続発する高活性抗レトロウイルス療法下で治療されたＨＩＶ感染症の合併症として現れる。
【００８６】
＜実施例２＞
遊離／総プロテインＳ比の変化を、自己免疫障害を有する患者においても認めることができるかどうかを検討するために、Ｈｏｐｉｔａｌ Ｃｏｃｈｉｎ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）からの全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を有する３９人の患者から血漿を回収した。対照として、８人の健康供血者からも血漿を回収した。上記のように（実施例１）、市販のＥＬＩＳＡ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、ＦｒａｎｃｅのＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ（登録商標）総プロテインＳアッセイおよびＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ（登録商標）遊離プロテインＳアッセイ）を用いて、総プロテインＳおよび遊離プロテインＳのレベルを血漿中で測定した。患者および対照者由来の血漿中のＣ４ｂ結合タンパク質のレベルを、市販のＬｉａｔｅｓｔ（登録商標）Ｃ４ｂ結合タンパク質色素産生アッセイ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて評価した。
【００８７】
遊離および総プロテインＳのレベルは、ＳＬＥを有する患者と健康供与者との間で有意に異ならなかった（表２）。Ｃ４ｂ結合タンパク質のレベルは、健康供与者の血漿中よりもＳＬＥ患者の血漿中で１．３倍高かった（Ｐ＝０．０３）。次いで、遊離プロテインＳ対総プロテインＳの比を計算した。その比は、健康対照者と比較して、ＳＬＥ患者について２倍低かった。（表２、Ｐ＝０．００１）。興味深いことに、試験中に含まれる３９人の患者の内で２４人（６２％）が、健康供与者の場合に測定された最小値より低い遊離プロテインＳ対総プロテインＳの比（すなわち０．６１）を有した。
【００８８】
結論として、これらの試験から、ＳＬＥを有する患者の６２％が、遊離対総プロテインＳの比の低下を示すことが示される。
【００８９】
参照文献
本出願の全体にわたって、各種の参照文献は、本発明が関係する現況技術を記載する。これらの参照文献の開示は、本発明の開示中に参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血栓形成傾向の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇｏｏｄｗｉｎら（Ｇｏｏｄｗｉｎら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：１２６巻、１１号、１３４９〜１３６６頁）は、プロテインＳ（ＰＳ）アッセイの技術的側面および診断的側面、ならびに臨床的疫学研究に対するそれらの適用を検討している。
【０００３】
プロテインＳ（ＰＳ）は、プロテインＣ抗凝固系の補因子として機能する、６３５個のアミノ酸から構成されるビタミンＫ依存性血漿糖タンパク質である。プロテインＳは、主に肝臓において産生される。
【０００４】
遺伝性ＰＳ欠乏症と静脈血栓症との関連性は、１９８４年に最初に確認された。遺伝性ＰＳ欠乏症に関連した動脈血栓症の症例は、まれに報告されている。プロテインＳは、第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子のタンパク質分解における活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）の活性を増強する補因子としての役割を果たす。
【０００５】
血漿中では、６０％〜７０％のＰＳが、ＰＳのカルボキシ末端ステロイド結合グロブリンドメイン中の結合部位を介してＣ４結合タンパク質（Ｃ４ｂＢＰ、補体調節タンパク質）に非共有結合で結合し、その結合相互作用の解離定数はナノモルの範囲内である。この結合親和性から、ＰＳの全ての利用可能なＣ４ｂＢＰ結合部位が埋まっていることが予測される。この結合相互作用は、血漿中ＰＳ濃度の測定および解釈を複雑にする。Ｃ４ｂＢＰは、２種のアイソフォーム（Ｍｒ５４００００および５９００００）を有する多量体タンパク質である。ＰＳの抗凝固活性は、遊離ＰＳにある。Ｃ４ｂＢＰβ＋に結合したＰＳは、ＡＰＣ補因子活性を有さない。
【０００６】
プロテインＳ欠乏症は、遺伝性または後天性であり得る。ホモ接合体のＰＳ欠乏症のまれな症例が、ホモ接合体のプロテインＣ欠乏症と同様に重症の新生児電撃性紫斑病と関連している。また、プロテインＣ欠乏症と同様に、ＰＳ欠乏症についての生化学的証拠は、５００人中約１人の有病率を示唆する。
【０００７】
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅは、総ＰＳ、遊離ＰＳの血漿中濃度およびＡＰＣ補因子活性に基づいて遺伝性ＰＳ欠乏症の３つの型を定義している。Ｉ型ＰＳ欠乏症は、ＡＰＣ補因子活性の減少を伴う低レベルの遊離ＰＳおよび総ＰＳ抗原によって確認される。ＩＩ型ＰＳ欠乏症は、低レベルのＡＰＣ補因子活性を伴う正常レベルの総ＰＳおよび遊離ＰＳ抗原によって特徴付けられる。ＩＩＩ型ＰＳ欠乏症は、正常から低レベルの総ＰＳと、低遊離ＰＳと、Ｃ４ｂＢＰに結合したＰＳ部分の増加とによって特徴付けられる。ＰＳ欠乏性患者の約２／３がＩ型欠乏症を有し、１／３がＩＩＩ型欠乏症を有し、ＩＩ型欠乏症はまれである。
【０００８】
血漿中ＰＳは、免疫学的および機能的アッセイによって定量されている。Ｆａｉｏｎｉ（Ｆａｉｏｎｉ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２００１；８６：１１３９〜１１４０）による総説では、この複合分析物の測定において不確実性を生じさせ続ける長期にわたる方法論的問題を強調している。初期のアッセイは、ポリクローナルエレクトロイムノアッセイ（主に、Ｌａｕｒｅｌｌ）によって総ＰＳを測定するものであった。遊離ＰＳは、２次元免疫電気泳動、または３．７５％のポリエチレングリコール６０００（ＰＥＧ）の添加による血漿中のＣ４ｂＢＰ−ＰＳ複合体の沈殿後の上清の測定のいずれかによって決定された。臨床検査室では、現在、ＰＥＧ沈殿と共に総ＰＳおよび遊離ＰＳを測定する多くの市販のポリクローナル酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が行われている。ＰＥＧ沈殿は、周知のように再生不可能でかつ時間がかかるにもかかわらず、依然として機能的ＰＳアッセイおよびモノクローナル遊離ＰＳ ＥＬＩＳＡの妥当性の判断基準である。近年、遊離ＰＳを正確に測定する市販のモノクローナルＥＬＩＳＡがいくつか利用可能になってきている。遊離ＰＳアッセイの唯一の欠点は、ＩＩ型ＰＳ欠乏症のまれな症例を見落とす可能性があることである。１９９６年に、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ ＨａｅｍｏｓｔａｓｉｓおよびＷｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）の合同会議は、ＰＳ欠乏症の診断のために総ＰＳよりも遊離ＰＳの測定が有用であり得ることを推奨した。更に、１９９６年におけるこのコンセンサス会議は、利用可能な機能的アッセイが（主にＡＰＣ抵抗性のために）特異性を欠くため、遊離ＰＳについてイムノアッセイを使用することを支持した。
【０００９】
ＰＳのＡＰＣ補因子活性は、修飾された活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）およびプロトロンビン時間（ＰＴ）フォーマットに基づいたアッセイにおいて測定され得る。ＡＰＴＴフォーマットにおいて、希釈された患者血漿は、精製ＡＰＣおよびＶａ型因子の存在下でＰＳ欠失血漿に添加される。ＰＴフォーマットにおいて、同様のアプローチをとることができるか、またはその欠失血漿中のネイティブ血漿ＰＣをＰｒｏｔａｃ（アメリカマムシ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃｏｐｐｅｒｈｅａｄ）のヘビ毒（アグキストロドン・コントルトリックス・コントルトリックス（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ））由来の酵素）によって活性化することができる。機能的アッセイの欠点は、ＡＰＣ抵抗性、第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ、高濃度のプロトロンビン、第ＶＩＩＩａ因子および第ＶＩＩａ因子の存在による高い割合の偽陽性の結果から生じる。ループス様阻害剤はまた、そのアッセイにおいて用いられる患者血漿の希釈によってこの効果が最小限にされるにもかかわらず、干渉することもできる。高添加濃度の添加Ｖａ型因子を用いるアッセイは、ＡＰＣ抵抗性または第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎの存在によってあまり影響を受けない。
【００１０】
血漿中総ＰＳ濃度の正常範囲の下限は、プールされた正常ヒト血漿中で観察される濃度の６５％として一般的に認められている。しかし、個々の検査室は、正常な個体から得られた血漿試料を用いるそれらのアッセイに特異的な正常範囲を確立すべきである。ＰＳ血漿中濃度は、男性よりも女性において低く、閉経女性、妊娠している女性および経口避妊を行う女性と比較して閉経前女性において低く、したがって、これらは、ホルモン状態の顕著な効果を示す。一般に、ＰＳレベルは、女性において年齢と共に増加するが、男性においてはほとんど変化しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、血栓形成傾向を評価するための簡単な信頼できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ＨＩＶまたは全身性自己免疫疾患に罹患している対象における血栓形成傾向の診断方法であって、前記対象から得られた血液試料において、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとを決定することを含む方法に関する。
【００１３】
血液試料中のＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとの両方を測定することによって、プロテインＳのＡＰＣ補因子活性を阻害する自己抗体によって誘発される血栓形成傾向を診断することが可能になる。
【００１４】
例えばＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳ／総プロテインＳの比を計算することによりＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとを比較することによって、例えばビタミンＫ欠乏症、肝疾患、妊娠、年齢に起因するプロテインＳの偏差と実質的に独立した正規化数を得ることができる。次いで、この正規化数は、自己免疫性プロテインＳ欠乏症の信頼できる指標となる。
【００１５】
典型的には、ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳ／総プロテインＳの比は、遊離プロテインＳの補因子活性を中和する抗プロテインＳ自己抗体の存在に対する間接的マーカーである。低い比は、遊離プロテインＳの補因子活性を中和する抗プロテインＳ自己抗体の存在を示す。本発明はまた、自己免疫性プロテインＳ欠乏症の指標としての、ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳおよび総プロテインＳの使用にも関する。
【００１６】
典型的には、この比は、基準値と比較され得る。基準値は、一群の健康対象から得られ得る。典型的には、かかる対象は、試験すべき生物学的試料が得られた対象と比較して同様の性別、年齢および／またはボディマスインデックスを有することができる。あるいは、基準値は、結節性再生性過形成を伴うＨＩＶまたは全身性自己免疫疾患に罹患している一群の対象から得られ得る。
【００１７】
本発明はまた、自己免疫性プロテインＳ欠乏症の指標としての、ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳおよび総プロテインＳの使用にも関する。
【００１８】
本発明はまた、対象における自己免疫性プロテインＳ欠乏症の診断方法であって、前記対象から得られた血液試料において、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとを決定することを含む方法にも関する。
【００１９】
本発明の別の目的は、
ａ）ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳを検出するための手段、および
ｂ）総プロテインＳを検出するための手段
を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】「プロテインＳ活性」対「総プロテインＳ」の比を示す図である。 結節性再生性過形成を有する（黒丸）および有さない（白丸）ＨＩＶ陽性患者の、結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陰性患者（黒四角）由来の、ならびに健康対照者（白四角）由来の血漿において、プロテインＳ活性および総プロテインＳのレベルを測定した。図は、「プロテインＳ活性」対「総プロテインＳ」の比を患者毎に示す。スチューデントのｔ検定を用いて統計学的有意性を評価した。
【図２】結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陽性患者のプロテインＳ特異的ＩｇＧのレベルを示す図である。 Ａ．結節性再生性過形成を有する（グレー丸）および有さない（白丸）ＨＩＶ陽性患者由来、結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陰性患者（グレーおよび黒四角）由来、ならびに健康対照者（白四角）由来の血漿を、プロテインＳ被覆ＥＬＩＳＡプレート中でインキュベートした。ペルオキシダーゼ結合ポリクローナル抗ヒトＩｇＧおよびその基質を用いて、結合ＩｇＧを検出した。示された結合強度を、４９２ｎｍでスコアした光学密度（ＯＤ）として１／５０の血漿希釈率で測定した。被覆プロテインＳの認識は、ＩｇＧの用量に依存した（図示せず）。Ｂ．結節性再生性過形成を有するＨＩＶ感染患者の血漿から精製されたＩｇＧの阻害活性。患者の血漿から精製したＩｇＧ（１ミリリットル当たり０から２ミリグラム）を、組換えプロテインＳ（１ミリリットル当たり２０マイクログラム）と共にインキュベートした。次いで、プロテインＳのプロテインＣ補助因子活性を、説明されるように機能的凝固アッセイにおいて測定した。ＩｇＧの特異的阻害活性は、１ミリグラム当たりの単位で表現され、５０パーセントのプロテインＳ阻害を生じさせるＩｇＧ濃度の逆数を表す。バーは中央値を表す。Ｐ値は、グラフ上に示される。データは、少なくとも２つの独立した実験からのものである。ＨＩＶ陰性患者の場合、全身性エリテマトーデスを有する２人の患者は、黒四角として示される。
【図３】「プロテインＳ活性」対「総プロテインＳ」の比とプロテインＳのＩｇＧ媒介阻害との間の相関を示す図である。 結節性再生性過形成を有する５人のＨＩＶ感染患者の血漿から精製したＩｇＧの阻害活性（図２Ｂ参照）を、遊離プロテインＳ対総プロテインＳの比（図１参照）の関数としてプロットした。相関の有意性を、ノンパラメトリックスピアマン相関検定を用いて評価した（Ｒｈｏ＝−０．９、Ｐ＝０．０３７）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
「血栓形成傾向」という用語は、血栓症に素因となる止血の異常を指す。
【００２２】
本明細書において用いられる「血液試料」という用語は、インビトロにおける評価の目的のために得られた血液試料を指す。血液試料の例としては、全血試料、血漿または血清試料がある。
【００２３】
本発明は、ＨＩＶまたは全身性自己免疫疾患に罹患している対象における血栓形成傾向の診断方法であって、前記対象から得られた血液試料において、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとを決定することを含む方法に関する。
【００２４】
一実施形態において、全身性自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、抗リン脂質抗体症候群、ベーチェット病、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、ウイルス誘発性プロトロンビン状態、血栓性血小板減少性紫斑病である。
【００２５】
後天性ＡＰＣ抵抗性が、ＳＬＥを有する患者の抗プロテインＳ自己抗体と関連していることがすでに示されている（Ｎｏｊｉｍａら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ．２００９年１月６日）。
【００２６】
本発明はまた、自己免疫性プロテインＳ欠乏症の指標としてのＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳと総プロテインＳとの使用にも関する。
【００２７】
本発明はまた、対象における自己免疫性プロテインＳ欠乏症の診断方法であって、前記対象から得られた血液試料において、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとを決定することを含む方法にも関する。
【００２８】
本発明の方法は、対象における血栓形成傾向または全身性自己免疫疾患を診断するために用いられる従来の方法と組み合わせて用いられ得る。典型的には、医師は、血栓形成傾向または全身性自己免疫疾患を診断するための既存の方法において用いられる他の臨床または病理学的パラメーターを考慮することもできる。したがって、本発明の方法を用いて得られた結果は、血栓形成傾向または全身性自己免疫疾患の診断のために実施された他の試験、アッセイまたは手法からの結果と比較することができ、かつ／または組み合わせることができる。かかる比較および／または組合せは、より洗練された診断を提供することを助けることができる。
【００２９】
血液試料中のＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとの決定は、当技術分野におけるいずれの公知の方法によっても実施され得る。これらのレベルは、イムノアッセイ、例えば、競合、直接反応、アレイチップまたはサンドイッチ型アッセイが含まれる標準的免疫診断技術を用いて測定され得る。かかるアッセイとしては、ウエスタンブロット、凝集試験、酵素標識および媒介イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、ビオチン／アビジン型アッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫電気泳動、免疫沈降、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー、固相アフィニティー等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
例えば、ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルは、免疫学的アッセイ（例えば、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ（Ｆｒａｎｃｅ）の市販のＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ（登録商標）遊離プロテインＳアッセイ）および機能的アッセイ（例えば、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ（Ｆｒａｎｃｅ）の市販のＳＴＡＣＬＯＴ（登録商標）プロテインＳアッセイ）によって決定され得る。ＰＳのＡＰＣ補因子活性は、修飾された活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）およびプロトロンビン時間（ＰＴ）フォーマットに基づいたアッセイにおいて測定され得る。
【００３１】
総プロテインＳのレベルは、免疫学的アッセイ（例えば、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ（Ｆｒａｎｃｅ）の市販のＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ（登録商標）総プロテインＳアッセイ）によって決定され得る。
【００３２】
特定の一実施態様において、ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルは、ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳと選択的に相互作用し得る結合パートナーにより決定され得る。結合パートナーは、活性化プロテインＣの認識を担うプロテインＳの特異的アミノ酸に結合することができる。典型的には、結合パートナーは、プロテインＳのγ−カルボキシルグルタミン酸ドメインに結合することができる。このドメインは、ＡＰＣとのプロテインＳ相互作用に関与する（Ｓａｌｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ．２００５年１月１日；１０５（１）：１２２〜３０）。
【００３３】
例えば、結合パートナーは、ポリクローナルもしくはモノクローナルであってよい抗プロテインＳ抗体またはその断片もしくは誘導体であってよい。別の例において、結合パートナーはアプタマーであってよい。
【００３４】
本発明のポリクローナル抗体またはその断片は、例えば、とりわけ、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジおよびマウスから選択される宿主動物に、適切な抗原またはエピトープを投与することによって、公知の方法に従ってもたらすことができる。抗体産生を増強するために、当技術分野において公知の各種アジュバントを用いることができる。本発明の実施に有用な抗体はポリクローナルであり得るが、モノクローナル抗体が好ましい。
【００３５】
本発明のモノクローナル抗体は、連続培養細胞系による抗体分子の産生をもたらす任意の技術を用いて調製かつ単離することができる。産生および単離のための技術としては、最初にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｃｏｔｅら、１９８３）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。別の場合、一本鎖抗体の産生について記載された技術（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号参照）を適合させて、一本鎖抗体を産生することができる。本発明の実施に有用な抗体としては、限定されないが、インタクト抗体分子のペプシン消化によって作製され得るＦ（ａｂ’）２断片や、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減少させることによって作製され得るＦａｂ断片が含まれる断片が挙げられる。別の場合、所望の特異性を有する断片の迅速同定を可能にするために、Ｆａｂおよび／またはｓｃＦｖ発現ライブラリーを構築することができる。例えば、抗体のファージディスプレイを用いることができる。かかる方法において、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ断片を、適切なバクテリオファージ、例えばＭ１３の表面上に発現させる。簡潔に言えば、タンパク質で免疫化した適切な宿主、例えばマウスの脾臓細胞を摘出する。そのタンパク質に対する所望の抗体を産生するそれらの細胞からＶＬおよびＶＨ鎖のコード領域が得られる。次いで、これらのコード領域をファージ配列の末端に融合させる。一旦ファージが適切な担体、例えば細菌に挿入されると、ファージは抗体断片を提示する。当業者に公知のコンビナトリアル方法によって抗体のファージディスプレイを提供することもできる。次いで、ファージによって提示される抗体断片をイムノアッセイの一部として用いることができる。
【００３６】
アプタマーは、分子認識の点において抗体に対する代替物を表す分子のクラスである。アプタマーは、高親和性および特異性で事実上標的分子のあらゆるクラスを認識する能力を有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチド配列である。かかるリガンドは、Ｔｕｅｒｋ Ｃ．およびＧｏｌｄ Ｌ．（１９９０）に記載されているように、ランダム配列ライブラリーの試験管内人工進化（ＳＥＬＥＸ）を通して単離され得る。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって入手可能である。このライブラリーにおいて、各メンバーは、ユニーク配列の、最終的には化学修飾をほどこした直鎖状オリゴマーである。分子のこのクラスの可能な修飾、使用および利点は、Ｊａｙａｓｅｎａ Ｓ．Ｄ．（１９９９）においてレビューされている。ペプチドアプタマーは、２つのハイブリッド法によってコンビナトリアルライブラリーから選択される、大腸菌チオレドキシンＡ等のプラットフォームタンパク質によって提示される、配座的に制限された抗体可変領域から成る（Ｃｏｌａｓら、１９９６）。
【００３７】
上述のアッセイは、固体支持体への結合パートナー（すなわち、抗体またはアプタマー）の結合を含むことができる。本発明の実施に使用され得る固体支持体としては、基質、例えば、ニトロセルロース（例えば、膜またはマイクロタイターウェル形態の）、ポリ塩化ビニル（例えば、シートまたはマイクロタイターウェル）、ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレート）、ポリフッ化ビニリジン、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性化ビーズ、磁気応答性ビーズ等が挙げられる。
【００３８】
本発明の結合パートナー、例えば、抗体またはアプタマーは、検出可能分子または物質、例えば、蛍光分子、放射性分子または当技術分野において公知のあらゆる他の標識で標識され得る。一般にシグナルを（直接的または間接的に）提供する標識は、当技術分野において公知である。
【００３９】
本明細書において用いられる場合、抗体またはアプタマーに関する「標識」という用語は、抗体またはアプタマーに検出可能物質、例えば、放射性剤またはフルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）またはインドシアニン（Ｃｙ５））を結合する（すなわち、物理的に連結する）ことによる抗体またはアプタマーの直接的標識化、および検出可能物質との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識化を包含することが意図される。本発明の抗体またはアプタマーは、当技術分野において公知の任意の方法によって放射性分子で標識され得る。例えば、放射性分子としては、限定されるものではないが、シンチグラフィー検査のための放射性原子、例えば、Ｉ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８が挙げられる。
【００４０】
特定の一実施形態において、ＥＬＩＳＡ法は、マイクロタイタープレートのウェルに、ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳに対する一組の抗体と総プロテインＳを検出することが可能な一組の抗体とを被覆した、血液試料中のＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとの決定に適切であり得る。次いで、血液試料を被覆ウェルに加える。抗体−抗原複合体の形成を可能にするために十分なインキュベーションの期間の後、プレート（複数可）を洗浄して、非結合部分と、加えた、検出可能に標識された２次結合分子とを除去することができる。２次結合分子を任意の捕捉した試料マーカータンパク質と反応させ、プレートを洗浄し、当技術分野において周知の方法を用いて２次結合分子の存在を検出する。
【００４１】
別の特定の一実施形態において、血液試料中のＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとの決定は、アレイチップで実施され得る。かかるアレイ技術によって、生物学的分析物のために用いる場合に一般にバイオチップとして知られている単一基質上で多く実験を同時に実施することが可能になる。アレイチップの例は、国際特許文献ＷＯ２００７０１２８８５、ならびにＤｕｐｕｙ ＡＭ．ら（２００５）、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ＳＲら（２０００）およびＪａｉｎ ＫＫら（２０００）に記載されている。
【００４２】
例えば、ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳおよび総プロテインＳに対する結合パートナーを前記アレイチップの表面において固定することができる。次いで、前記対象から得られた血液試料をアレイチップ中に沈積させる。複合体の形成を可能にするために十分なインキュベーションの期間の後、次いでアレイチップを洗浄して、非結合部分を除去することができる。第２ステップにおいて、ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとを、ＡＰＣ補因子活性を有する前記遊離プロテインＳおよび前記総プロテインＳに対して特異的な第２結合パートナーで決定する。好ましい一実施形態において、前記結合パートナーを標識し、しかるに、それによって、遊離プロテインＳまたは総プロテインＳに対して特異的な一組の「スポット」（着色沈積物）の形成が可能になる。例えば、検出および定量は、特異的な検出器を有する前記アレイチップ中のスポットを分析することによって実施され得る。
【００４３】
本発明のその上別の目的は、ａ）ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳを検出するための手段、および
ｂ）総プロテインＳを検出するための手段
を含むキットに関する。
【００４４】
典型的には、前記キットは、
ａ）ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳと選択的に相互作用する結合パートナー、および
ｂ）総プロテインＳを検出することが可能な結合パートナー
を含む。
【００４５】
典型的には、前記結合は、ポリクローナルもしくはモノクローナルであってよい抗体、またはその断片もしくは誘導体であってよい。
【００４６】
典型的には、抗体は、上記に記載されるように標識され得る。
【００４７】
キットはまた、適用可能な場合、固相マトリックスおよび標準物質を含む、特定の検出プロトコールのために必要とされる他の適切に包装された試薬および材料を含むこともできる。
【００４８】
好ましい一実施形態において、本発明による方法は、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルを決定することによって実施される。別法として、同方法は、遊離プロテインＳのレベルを決定することによって実施され得る。
【００４９】
本発明を、以下の図および実施例に鑑みて更に示す。
【００５０】
【表１】
【００５１】
【表２】
【００５２】
＜実施例１＞
要約
原因不明の結節性再生性過形成を有する１３人の継続ＨＩＶ陽性患者と、結節性再生性過形成を有さない１６人の継続ＨＩＶ陽性患者と、確認された原因からの結節性再生性過形成を有する８人のＨＩＶ陰性患者と、１０人の匿名の健康供血者とを比較した。
【００５３】
患者および対照者を、欠乏症プロテインＳ活性および抗プロテインＳ ＩｇＧ抗体についてスクリーニングした。患者および対照者からの精製ＩｇＧの抗プロテインＳ活性を、プロテインＳが補因子の役割を果たすプロテインＣの活性化の機能検査において評価した。完全肝臓ＣＴ−門脈造影を症例患者の肝臓外植体上で実現した。
【００５４】
そのＣＴ門脈造影は、びまん性閉塞性門脈静脈障害（ｄｉｆｆｕｓｅ ｏｂｌｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｐｏｒｔａｌ ｖｅｎｏｐａｔｈｙ）を開示した。プロテインＳ活性のレベルは、結節性再生性過形成を有さないＨＩＶ陽性患者および結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陰性患者と比較した場合、ＨＩＶ関連結節性再生性過形成を有する患者において低かった（全比較についてＰ＜０．００５）。結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陽性患者は、結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陰性患者および健康対照者よりも抗プロテインＳ ＩｇＧのレベルが有意に高かった。ＨＩＶ関連結節性再生性過形成を有する患者由来の精製ＩｇＧは、プロテインＳ依存性プロテインＣ活性化を特異的に阻害した。
【００５５】
結論：後天性自己免疫性プロテインＳ欠乏および続発性血栓形成傾向は、ＨＩＶ陽性患者における閉塞性門脈静脈障害および代償性結節性再生性過形成の原因であると思われる。
【００５６】
方法
試験デザイン
肝臓の生検で確認された結節性再生性過形成を有する１６人のＨＩＶ感染患者を、Ｃｏｃｈｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）の肝臓部門に紹介した。
【００５７】
これらの１６人の患者の内の３人は、Ｃ型肝炎ウイルスに同時感染しており、本分析から除外された。慢性肝疾患の全ての共通の原因は、他の１３人の患者において除外された。ウイルス性Ｂ型およびＣ型肝炎のゲノム増幅は陰性であり、顕在的または潜在的Ｂ型肝炎および／またはＣ型肝炎感染症を除外した。Ｂ型肝炎コア（ＨＢｃ）抗体（ＩｇＧ）は、１３人の患者の内で６人の患者において陽性だった。アルコールの過剰摂取（＞２０ｇ／日）の過去または最近の既往歴はなく、フェリチンおよびトランスフェリン飽和血中レベルは正常であり、抗肝臓自己抗体および抗核抗体は陰性と検査された。血清α−１−抗トリプシン、銅およびセルロプラスミンレベルは正常であり、ヘモクロマトーシス、自己免疫性肝炎、α−１−抗トリプシン欠乏症およびウィルソン病をそれぞれ除外した。いずれの患者も、とりわけ心臓、血液学的または腎臓病状に関する重大な併存疾患を有さなかった。毒物曝露（ビタミンＡ、硫酸銅、塩化ビニルモノマー、硫酸トリウム、スペインのトキシックオイルまたはヒ素塩）の既往歴はなく、過去のまたは継続しているホルモン療法や生薬治療はなかった。
【００５８】
肝機能検査が厳密に正常な１６人の継続ＨＩＶ陽性患者と、確認された原因に続発する結節性再生性過形成を有する８人の患者との、症例患者のプロテインＳ活性のレベルを比較した。結節性再生性過形成を有する８人のＨＩＶ陰性患者は、不均一の基礎疾患を示したが、それらの基礎疾患に含まれるのは、５人は腎臓移植、２人はループス、１人はバルトネラ症であった。ＥＬＩＳＡにおけるプロテインＳの認識とプロテインＳに対する精製ＩｇＧの阻害活性とをそれぞれ検査するために、試料の入手可能性に基づいて、結節性再生性過形成を有する７人または５人のＨＩＶ陽性患者の血清を使用した。これらの患者についての臨床プロファイルは、とりわけＣＤ４細胞数に関して、残りの患者のそれと同様であり、試験した群間にバイアスはなかった（比較についてＰ＝０．１２７）。ＩｇＧアッセイのための対照としての役割を果たした匿名の健康供血者からの血液の１０の試料。インフォームドコンセントを全ての患者から得て、我々の病院の施設内審査委員会はこの試験を承認した。
【００５９】
プロトロンビン止血障害評価
全ての患者を、ループス抗凝固因子、ＩｇＧおよびＩｇＭアイソタイプの抗リン酸脂質抗体、アンチトロンビンおよびプロテインＣ機能的欠乏症、プロテインＳ機能的欠乏症、ならびにＧ１６９１Ａ第Ｖ因子およびＧ２０２１１０Ａ第ＩＩ因子変異についてスクリーニングした。
【００６０】
市販のＥＬＩＳＡ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ（Ｆｒａｎｃｅ）のＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ（登録商標）総プロテインＳアッセイおよびＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ（登録商標）遊離プロテインＳアッセイ）を製造業者によって示されるように用いて、総プロテインＳおよび遊離プロテインＳのレベルを測定した。
【００６１】
血漿中のＣ４ｂ結合タンパク質の測定
指示されるように市販のＬｉａｔｅｓｔ（登録商標）Ｃ４ｂ結合タンパク質色素産生アッセイを用いて（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ（Ｆｒａｎｃｅ））、患者および対照者からの血漿中のＣ４ｂ結合タンパク質のレベルを評価した。
【００６２】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による抗プロテインＳ ＩｇＧの定量
１ミリリットル当たり２マイクログラムのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の組換えヒトプロテインＳをＥＬＩＳＡプレートに被覆し、摂氏４度で終夜静置した（Ｍｏｒｂｏｅｕｆら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ２０００、１００：８１〜８８）。それらのプレートを０．２パーセントのＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで洗浄し、１パーセントのウシ血清アルブミンを有するＰＢＳでブロックし、次いで室温で１時間静置した。患者および健康供血者を含む対照者からの血漿試料を、室温で２時間、系列希釈物中でインキュベートした。ウェルの広範囲にわたる洗浄の後、ペルオキシダーゼに結合させたポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｌｏｎｅ ＪＤＣ−１０、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびその基質を用いて結合ＩｇＧを認めた。Ｇｅｎｙｏｓ（ＴＥＣＡＮ）を用いて４９２ナノメートルで色素産生産物を読みとった。
【００６３】
血漿からのＩｇＧの精製
タンパク質Ｇ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）上でアフィニティークロマトグラフィーによって患者および健康供血者の血漿からＩｇＧを精製した。血漿を、０．０１パーセントのアジドを有するＰＢＳ（ＰＢＳ／アジド）中のタンパク質Ｇ−セファロースと共にインキュベートし、摂氏４度で終夜静置した。ＰＢＳ／アジドによる広範囲にわたる洗浄の後、ＩｇＧを、０．２ｍｏｌ／リットルのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．８）を用いて溶出し、３モルのトリスを用いて中和した。ＩｇＧを、摂氏４度で４時間ＰＢＳに対して透析し、２８０ナノメートルの分光測定によって定量した。
【００６４】
プロテインＳの阻害についての機能的アッセイ
組換えヒトプロテインＳ（１ミリリットル当たり２０マイクログラム）を、Ｏｗｒｅｎ−Ｋｏｌｌｅｒ緩衝液中で単独で、または精製ＩｇＧ（１ミリリットル当たり０．５、１および２ミリグラム）と共に、摂氏３７度で２時間インキュベートした（Ｍｏｒｂｏｅｕｆら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ２０００、１００：８１〜８８）。次いで、プロテインＳが欠失したヒト血漿、ヒト活性化プロテインＣおよびウシ活性化第Ｖ因子の混合物に試料を加えた。塩酸カルシウム（１リットル当たり０．０２５ｍｏｌ）で凝固を開始させ、凝固にかかった時間を、凝固計ＫＣ１０ ｍｉｃｒｏ（Ａｍｅｌｕｎｇ、Ｌｅｍｇｏ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定し、組換えプロテインＳの系列希釈物（１ミリリットル当たり３０から０．３３マイクログラム）で得た標準曲線と比較した。５０パーセントのプロテインＳ阻害を生じさせるＩｇＧ濃度の逆数を表すミリグラム当たりの単位で表現されるＩｇＧの特異的阻害活性を計算した。
【００６５】
統計分析
連続変数は、中央値および四分位範囲または平均値および平均値の標準誤差として示される。カテゴリー変数は、計数および百分率として示される。群間の差を、マン−ホイットニーＵ検定およびクラスカル−ウォリスＨ検定で評価した。全てのＰ値は両側であり、第１種の誤りを５パーセントに設定した。ＳＰＳＳソフトウェア（バージョン１６）（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて全ての統計分析を実施した。
【００６６】
結果
臨床的特徴
ＨＩＶ関連結節性再生性過形成を有する患者の年齢の中央値は、４１歳であった。９人の男性および４人の女性がいた。全員が、各種感染ルートによる持続性ＨＩＶ感染症（知られたＨＩＶ陽性の長さの中央値は１２年）を有した。全員が、１マイクロリットル当たり２６５個の細胞の診断時のＣＤ４Ｔ細胞数の中央値およびＣＤ４細胞の正常割合により、高活性抗レトロウイルス療法によって適切に免疫が回復したと判断された。全員を、（各種抗レトロウイルス治療の中で）ジダノシンに曝露させたか、または曝露させていた。
【００６７】
症状の初期状態は、患者の半分超における原因不明の肝機能検査異常（軽度の血小板減少症を伴うアルカリホスファターゼの上昇）であった。残りは、門脈圧亢進症の直接的または間接的な徴候を示した。最初に示された肝臓異常と結節性再生性過形成の診断との間の遅延期間の中央値は、１７ヵ月であった。
【００６８】
１１人の患者（８５パーセント）に、上部内視鏡検査において食道静脈瘤および高血圧性胃疾患があった。その内の６人は、診断時にまたは追跡調査の間に胃腸出血を経験した。１人の患者が、門脈圧亢進性滲出性胃腸症に関連する慢性下痢および重症の栄養失調を発症した。４人の患者が、肝不全および門脈圧亢進症のための肝臓移植を受けた。結節性再生性過形成の診断と肝臓移植との間の遅延期間の中央値は、３７ヵ月（範囲は２４〜４７）であった。２人の患者が、肝臓移植時に門脈血栓症を有した。
【００６９】
病理学および放射線医学
最後の移植患者の外植体を入手することは、放射線学的レベルおよび病理学的レベルの両方でＨＩＶ関連結節性再生性過形成の機序を垣間見ることを提供した。肝臓全体のＣＴ−門脈造影は、遠位肝内門脈枝のびまん性閉塞を伴う閉塞性門脈静脈障害の像を明らかにした。外植体の病理検査は、結節性再生性過形成、類洞拡張および肝実質中の肝門脈硬化症の像によって、閉塞性門脈静脈障害の典型的な態様を開示した。重大な線維症は認められなかった。
【００７０】
プロトロンビン止血障害評価
閉塞性門脈静脈障害は、プロトロンビン障害としばしば関連付けられる。したがって、ＨＩＶ関連結節性再生性過形成を有する全患者を、プロトロンビン止血障害についてスクリーニングした。ＨＩＶ関連結節性再生性過形成を有する全ての患者は、プロテインＳ活性のレベルが低下した（表１）。
【００７１】
対応対照と比較した場合、プロテインＳ活性のレベルは、結節性再生性過形成を有さないＨＩＶ陽性患者および結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陰性患者と比較して、結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陽性患者において低かった（表１）。対照的に、総プロテインＳのレベルは、結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陽性患者と有さないＨＩＶ陽性患者の場合で類似しており、健康供与者の場合とも類似していた（表１）。
【００７２】
次いで、本試験に含まれる患者毎に、「プロテインＳ活性」対「総プロテインＳ」の比を計算した（表１）。結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陽性患者における比は、結節性再生性過形成を有さないＨＩＶ陽性患者および健康対照者よりも有意に低かった（図１、Ｐ＜０．００１）。結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陰性患者でも同じことが当てはまった。
【００７３】
Ｃ４ｂ結合タンパク質のレベル
遊離プロテインＳの減少をＣ４ｂ結合タンパク質と複合体を形成した形態へのシフトに帰すことができるかどうかを決定するため、患者の血漿中のＣ４ｂ結合タンパク質のレベルを、対照者の血漿中のそのレベルと比較した。結節性再生性過形成を有するＨＩＶ感染患者とそれを有さないＨＩＶ感染患者は、血漿中のＣ４ｂ結合タンパク質レベルが同じであることを示した（Ｐ＝０．５３０）。予想外に、結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陰性患者からの血漿は、血漿中Ｃ４ｂ結合タンパク質レベルが３．６から５．４倍高いが（表１）、このことは、これらの患者における総プロテインＳの有意な増加を説明することが可能である。
【００７４】
抗プロテインＳ ＩｇＧ
ＨＩＶ感染患者におけるプロテインＳレベルの低下が、後天性抗プロテインＳ体液性免疫応答に起因するのかどうかを検討した。興味深いことに、プロテインＳ特異的ＩｇＧが、健康供与者の血漿中で検出された。結節性再生性過形成を有さないＨＩＶ感染患者は、健康な個体と同様の抗プロテインＳ ＩｇＧレベルを示した。対照的に、結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陰性およびＨＩＶ陽性患者は、健康供与者および結節性再生性過形成を有さないＨＩＶ感染症を有する患者よりも抗プロテインＳ ＩｇＧレベルが高かった（図２Ａ）。結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陽性患者の場合、血漿中ＩｇＧによる上昇したプロテインＳ認識は、結節性再生性過形成を有さないＨＩＶ陽性患者および健康供血者と比較して、より高い量の循環ＩｇＧと関連付けられた（表１）。注目すべきことは、最も高いレベルの抗プロテインＳ ＩｇＧを有する患者は、基礎疾患としてループスを有したことである。
【００７５】
プロテインＳに対する精製ＩｇＧの阻害活性
次いで、結節性再生性過形成を有する患者における抗プロテインＳ ＩｇＧがプロテインＳ機能を中和することができるかどうかを検討した。健康供与者および結節性再生性過形成を有さないＨＩＶ感染患者からのＩｇＧによるプロテインＳ活性の基礎阻害が、おそらく我々の阻害アッセイの限定により認められた。プロテインＳ活性の阻害は、ＩｇＧの濃度に依存した。結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陽性患者由来のＩｇＧは、健康供与者由来のＩｇＧおよび結節性再生性過形成を有さないＨＩＶ陽性患者由来のＩｇＧよりも、プロテインＳに対して一貫してかつ有意に高い阻害活性を示した。結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陰性患者由来のＩｇＧは、プロテインＳ阻害に関して不均一であり、健康供与者および結節性再生性過形成を有さないＨＩＶ感染患者由来のＩｇＧのそれによって認められる阻害と有意に異なるものではなかった（それぞれ、Ｐ＝０．３２９およびＰ＝０．１２６）（表１、図２Ｂ）。結節性再生性過形成を有する５人のＨＩＶ陽性患者の血漿から精製したＩｇＧによるプロテインＳ活性の阻害と遊離対総プロテインＳの比との間に有意な相関があった（図３）。
【００７６】
考察
ここで、唯一の確認された病因因子がＨＩＶ感染症である結節性再生性過形成を有する１３人の患者の症例シリーズを示す。症状の様式は、非常にステレオタイプであり、持続性ＨＩＶ感染症、抗レトロウイルス薬、とりわけジダノシンに対する曝露、適切な免疫の回復および原因不明の肝機能検査異常または門脈圧亢進症であった。門脈圧亢進症に関連した合併症が、その内の約半分において出現し、４人が肝臓移植を必要とした。ＨＩＶ関連結節性再生性過形成の機序は、現在まで不明であるが、大部分の患者が適切に免疫を回復したことから、ＨＩＶ感染症および後天性免疫抑制自体に関連があるとは思われない。
【００７７】
最後の移植患者の外植体のＣＴ−門脈造影は、ＨＩＶ関連結節性再生性過形成における原発病変が、びまん性閉塞性門脈静脈障害であることを示す。小門脈の閉塞は、肝細胞集団を維持するために供給腺房の虚血および残部の再生性過形成をもたらす。この所見は、結節性再生性過形成における原発病変が閉塞性門脈静脈障害であることを示唆する結節性再生性過形成における有力な剖検研究に一致する。ＨＩＶ感染患者における本症候群を表すために、ＨＩＶ関連閉塞性門脈障害（ＨＩＶ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｏｂｌｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｐｏｒｔｏｐａｔｈｙ）（ＨＩＶ−ＯＰ）の用語を提案する。
【００７８】
結節性再生性過形成および閉塞性門脈静脈障害は、リウマチ性障害、血管障害および骨髄増殖性障害が含まれる他の全身性疾患に関連して、更にある種の薬物および後天性プロテインＳ欠乏症が含まれる先天性または後天性プロトロンビン状態に関連して出現することが報告されている。
【００７９】
プロテインＳ活性は、結節性再生性過形成を有さないマッチしたＨＩＶ陽性対照者および別の起源の結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陰性患者と比較して、ＨＩＶ−ＯＰを有する患者において有意に低かった。
【００８０】
したがって、我々のデータは、プロテインＳ欠乏症とＨＩＶ−ＯＰの発症との関連を示す。
【００８１】
興味深いことに、プロテインＳ活性の著しい低下にもかかわらず、結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陽性患者の総プロテインＳのレベルは、結節性再生性過形成を有さないＨＩＶ陽性患者および健康供与者のそれと同じであり、このことは、循環プロテインＳの機能的不活性化を示す。我々は、実際、健康供与者を含む他の群からの患者と比較してＨＩＶ−ＯＰを有する患者由来の血漿中の抗プロテインＳ ＩｇＧの増加したレベルを実証する。特に興味深いことに、「プロテインＳ活性」対「総プロテインＳ」の比の計算は、結節性再生性過形成を有する患者を他の患者および健康供与者から明らかに区別することを可能にする。
【００８２】
抗プロテインＳ ＩｇＧは、機能的アッセイにおける活性化プロテインＣに対するプロテインＳの補助因子活性を阻害することが可能だった。結節性再生性過形成を有するＨＩＶ陽性患者から精製したＩｇＧによるプロテインＳ活性の阻害と遊離対総プロテインＳの比との間の観察された有意な相関は、遊離対総プロテインＳの比の低下がかかる患者における阻害性抗プロテインＳ ＩｇＧの存在を間接的に反映することを示唆する。
【００８３】
重要なことに、Ｃ４ｂ結合タンパク質のレベルは、ＨＩＶ−ＯＰを有する患者において変化しなかった。遊離プロテインＳのレベルが、肝疾患および血栓症を含む多発性疾患プロセスによって影響を受ける可能性があるが、我々のデータは、後天性抗プロテインＳ ＩｇＧが、ＨＩＶ陽性患者の肝臓における結節性再生性過形成の病因に関与することを示唆する。ＨＩＶ感染患者における高いレベルの阻害性抗プロテインＳ ＩｇＧの存在は、慢性ポリクローナル活性化につながる、抗レトロウイルス療法にもかかわらず生じるＢ細胞活性化またはＢ細胞レパートリーの持続的異常によって説明することができる（Ｒｅｄｇｒａｖｅら、ＨＩＶ Ｍｅｄ ２００５、６：３０７〜３１２）。実際、抗プロテインＳ抗体の存在は、ＩｇＧレベルと十分に相関した。本明細書において試験されたＨＩＶ感染患者は、妥当なＣＤ４陽性リンパ球細胞数を有したが、その内の半分は、そのＣＤ４細胞数を非常に低い最低値から劇的に増加させていた。これは、炎症性および本物の自己抗体媒介自己免疫性状態を含む免疫再構築症候群の各種兆候の出現に好都合であることが知られている。
【００８４】
ＨＩＶ−ＯＰの発現率が不明であるにもかかわらず、それは、一般に考えられているよりもよく見られる可能性がある。ＨＩＶ−ＯＰだけを有する患者だけをここで報告するが、Ｃ型肝炎ウイルスに同時感染した患者における同じ症例を認めている（Ｍａｌｌｅｔら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｌ ２００７、３１：８７８〜８８０）。ＨＩＶ−ＯＰを有する患者が典型的には肝硬変に似た臨床的特徴を示すので、診断を確認するためにほとんどの症例において肝生検が適応となる。しかし、いずれの基礎肝疾患も存在しない場合、ＨＩＶ−ＯＰの診断を、ＨＩＶ感染患者において原因不明の肝機能検査異常がある場合、とりわけプロテインＳのレベルの低下が見出される場合に考慮すべきである。この場合、患者を、潜在性門脈圧亢進症についてスクリーニングすべきである。
【００８５】
結論として、ＨＩＶ−ＯＰは、後天性自己免疫性プロテインＳ欠乏症に続発する高活性抗レトロウイルス療法下で治療されたＨＩＶ感染症の合併症として現れる。
【００８６】
＜実施例２＞
遊離／総プロテインＳ比の変化を、自己免疫障害を有する患者においても認めることができるかどうかを検討するために、Ｈｏｐｉｔａｌ Ｃｏｃｈｉｎ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）からの全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を有する３９人の患者から血漿を回収した。対照として、８人の健康供血者からも血漿を回収した。上記のように（実施例１）、市販のＥＬＩＳＡ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、ＦｒａｎｃｅのＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ（登録商標）総プロテインＳアッセイおよびＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ（登録商標）遊離プロテインＳアッセイ）を用いて、総プロテインＳおよび遊離プロテインＳのレベルを血漿中で測定した。患者および対照者由来の血漿中のＣ４ｂ結合タンパク質のレベルを、市販のＬｉａｔｅｓｔ（登録商標）Ｃ４ｂ結合タンパク質色素産生アッセイ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて評価した。
【００８７】
遊離および総プロテインＳのレベルは、ＳＬＥを有する患者と健康供与者との間で有意に異ならなかった（表２）。Ｃ４ｂ結合タンパク質のレベルは、健康供与者の血漿中よりもＳＬＥ患者の血漿中で１．３倍高かった（Ｐ＝０．０３）。次いで、遊離プロテインＳ対総プロテインＳの比を計算した。その比は、健康対照者と比較して、ＳＬＥ患者について２倍低かった。（表２、Ｐ＝０．００１）。興味深いことに、試験中に含まれる３９人の患者の内で２４人（６２％）が、健康供与者の場合に測定された最小値より低い遊離プロテインＳ対総プロテインＳの比（すなわち０．６１）を有した。
【００８８】
結論として、これらの試験から、ＳＬＥを有する患者の６２％が、遊離対総プロテインＳの比の低下を示すことが示される。
【００８９】
参照文献
本出願の全体にわたって、各種の参照文献は、本発明が関係する現況技術を記載する。これらの参照文献の開示は、本発明の開示中に参照により本明細書に組み込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶまたは全身性自己免疫疾患に罹患している対象における血栓形成傾向の診断方法であって、前記対象から得られた血液試料において、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとを決定することを含む方法。
【請求項２】
対象における自己免疫性プロテインＳ欠乏症の診断方法であって、前記対象から得られた血液試料において、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとを決定することを含む方法。
【請求項３】
ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳ／総プロテインＳの比を計算するステップを含み、低い比が、遊離プロテインＳの補因子活性を中和する抗プロテインＳ自己抗体の存在を示す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象がＨＩＶに罹患している、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記対象が全身性自己免疫疾患に罹患している、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記全身性自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、抗リン脂質抗体症候群、ベーチェット病、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、ウイルス誘発性プロトロンビン状態、血栓性血小板減少性紫斑病である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ａ）ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳを検出するための手段、および
ｂ）総プロテインＳを検出するための手段
を含むキット。
【請求項８】
ａ）ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳと選択的に相互作用する結合パートナー、および
ｂ）総プロテインＳを検出することが可能な結合パートナー
を含む、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
自己免疫性プロテインＳ欠乏症の指標としての、ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳおよび総プロテインＳの使用。
【請求項１】
ＨＩＶまたは全身性自己免疫疾患に罹患している対象における血栓形成傾向の診断方法であって、前記対象から得られた血液試料において、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとを決定することを含む方法。
【請求項２】
対象における自己免疫性プロテインＳ欠乏症の診断方法であって、前記対象から得られた血液試料において、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）補因子活性を有する遊離プロテインＳのレベルと総プロテインＳのレベルとを決定することを含む方法。
【請求項３】
ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳ／総プロテインＳの比を計算するステップを含み、低い比が、遊離プロテインＳの補因子活性を中和する抗プロテインＳ自己抗体の存在を示す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象がＨＩＶに罹患している、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記対象が全身性自己免疫疾患に罹患している、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記全身性自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、抗リン脂質抗体症候群、ベーチェット病、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、ウイルス誘発性プロトロンビン状態、血栓性血小板減少性紫斑病である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ａ）ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳを検出するための手段、および
ｂ）総プロテインＳを検出するための手段
を含むキット。
【請求項８】
ａ）ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳと選択的に相互作用する結合パートナー、および
ｂ）総プロテインＳを検出することが可能な結合パートナー
を含む、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
自己免疫性プロテインＳ欠乏症の指標としての、ＡＰＣ補因子活性を有する遊離プロテインＳおよび総プロテインＳの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１２−５２６２７２（Ｐ２０１２−５２６２７２Ａ）
【公表日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０９０５２（Ｐ２０１２−５０９０５２）
【出願日】平成２２年５月７日（２０１０．５．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６２６８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２８１４６
【国際公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【出願人】（５９９１７６５０６）アンセルム（アンスチチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル） (23)
【出願人】（５０８１９２２５６）
【出願人】（５０３４００４５５）ユニベルシテ・ルネ・デカルト・パリ ５ (6)
【出願人】（５１１１３３１０７）
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＳＩＳＴＡＮＣＥ ＰＵＢＬＩＱＵＥ ＨＯＰＩＴＡＵＸ ＤＥ ＰＡＲＩＳ
【住所又は居所原語表記】３ Ａｖｅｎｕｅ Ｖｉｃｔｏｒｉａ， Ｆ−７５００４ Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月７日（２０１０．５．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６２６８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２８１４６
【国際公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【出願人】（５９９１７６５０６）アンセルム（アンスチチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル） (23)
【出願人】（５０８１９２２５６）
【出願人】（５０３４００４５５）ユニベルシテ・ルネ・デカルト・パリ ５ (6)
【出願人】（５１１１３３１０７）
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＳＩＳＴＡＮＣＥ ＰＵＢＬＩＱＵＥ ＨＯＰＩＴＡＵＸ ＤＥ ＰＡＲＩＳ
【住所又は居所原語表記】３ Ａｖｅｎｕｅ Ｖｉｃｔｏｒｉａ， Ｆ−７５００４ Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
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