酵母及びその利用
【課題】 セレブロシドを含有する新規酵母、該酵母からセレブロシドを製造する方法、及びセレブロシドを含有する食品の提供。
【解決手段】 セレブロシドを含有するシュードザイマ(Pseudozyma)属に属する酵母、より詳しくはセレブロシドを乾燥菌体重量あたり1mg/g以上含有する該酵母。又、シュードザイマ・アフィディス（Pseudozyma aphidis）に属する該酵母、より詳しくはシュードザイマ・アフィディス（Pseudozyma aphidis）Y178株（FERM P-21005）である該酵母。又、該酵母を培養し、分離、精製することを特徴とする、セレブロシドの製造方法。さらに、本発明酵母又は該方法により得られたセレブロシドを含有する食品。本発明により、酵母による栄養補給に加えて、有益な各種生理活性を有するセレブロシドも同時に付与することが可能。
【解決手段】 セレブロシドを含有するシュードザイマ(Pseudozyma)属に属する酵母、より詳しくはセレブロシドを乾燥菌体重量あたり1mg/g以上含有する該酵母。又、シュードザイマ・アフィディス（Pseudozyma aphidis）に属する該酵母、より詳しくはシュードザイマ・アフィディス（Pseudozyma aphidis）Y178株（FERM P-21005）である該酵母。又、該酵母を培養し、分離、精製することを特徴とする、セレブロシドの製造方法。さらに、本発明酵母又は該方法により得られたセレブロシドを含有する食品。本発明により、酵母による栄養補給に加えて、有益な各種生理活性を有するセレブロシドも同時に付与することが可能。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セレブロシドを含有する新規酵母、該酵母からセレブロシドを製造する方法、及びセレブロシドを含有する食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な生理活性を有するスフィンゴ脂質であるセラミドが注目されている。スフィンゴ脂質とは、スフィンゴシンあるいはこれに類似の長鎖アミノアルコールを有する脂質の総称であり、スフィンゴリン脂質とスフィンゴ糖脂質が含まれる。スフィンゴリン脂質にはスフィンゴミエリンが、またスフィンゴ糖脂質にはセレブロシド、ガングリオシド等がある。セラミドは、スフィンゴシンに脂肪酸がアミド結合した部分の総称である。スフィンゴ脂質は、動物の脳及び神経組織を初めとして他の臓器や組織に広く分布し、表皮では角質細胞間の細胞間脂質の主要成分として角質保湿機能に深く関与している（非特許文献１）。セラミドは、皮膚の老化防止、あるいは発癌予防に効果があると言われており、医薬品や化粧品素材のみならず、一般食品や飲料などの食品素材として利用が増えてきている。セラミドの一つであるセレブロシドは、スフィンゴシンの１位の水酸基に単糖又はオリゴ糖をエーテル結合させたスフィンゴイド塩基と脂肪酸の結合したスフィンゴ脂質である。セレブロシドの効果としては、例えば抗嘔吐剤（特許文献１）、抗アレルギー剤（特許文献２）等が既に報告されている。
【０００３】
これまで天然のセレブロシドは主に牛脳から製造されてきたが、その安全性の問題から最近では穀類や魚介類等を原料とする製造方法が検討されている。例えば、植物体より抽出されたセレブロシドが製品化されているが、植物体にはセレブロシドは極微量にしか含まれていないため、セレブロシドは非常に高価なものになっている。このように、これらにはセレブロシドが微量しか含まれていないため、セレブロシドを抽出、分離、精製するためには多大な労力やコストが必要となる。又、セレブロシドを効率的に取得するための原料として、微生物も近年注目されている。特に安全性の面から酵母を用いることが考えられ、近年ではセレブロシドを高含量蓄積する酵母、例えば乾燥菌体1gあたり1.3mgのセレブロシドを蓄積するZygosaccharomyces fermentatiやKluyveromyces lactis（特許文献３）、あるいはスフィンゴイド塩基を生産するPichia ciferriiの変異株（特許文献４）等が報告されている。また、セレブロシドの製造方法として、クルイベロマイセス・ラクティスをホエーあるいはその派生物を含む培地で培養することを特徴とするセレブロシドの発酵生産方法（特許文献５）、クルイベロマイセス・マルキシアナスをホエーあるいはその派生物を含む培地で培養することを特徴とするセレブロシドの発酵生産方法（特許文献６）、セレブロシド生産性酵母又は糸状菌の培養中及び／又は培養後に窒素源及び／又は炭素源不含培地や食塩及び／又はアルコール存在下等のストレス環境下で培養する方法（特許文献７）、酵母、カビ、キノコ等真菌類を特定の乾燥方法により乾燥しセラミドを抽出する方法、（特許文献８）が知られている。
【０００４】
【特許文献１】特開平6-271598号公報
【特許文献２】特開2003-155231号公報
【特許文献３】特開2004−89047号公報
【特許文献４】特表2002-519070号公報
【特許文献５】特開2006-55070号公報
【特許文献６】特開2006-55071号公報
【特許文献７】特開2005-185126号公報
【特許文献８】特開2006-67842号公報
【非特許文献１】鈴木正人ら編，「コスメディック」，シーエムシー，1988年12月，第２巻，ｐ．４（１９３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、セレブロシドを含有する新規酵母、該酵母からセレブロシドを製造する方法、及び該酵母及び／又は該セレブロシドを含有する食品を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の状況に鑑みセレブロシドを含有する新規な微生物を求め鋭意探索の結果、魚介類より分離したPseudozyma属に属する酵母にセレブロシドを多く含有するものを初めて見出し、本発明を完成するに至った。従って本発明は、セレブロシドを含有するシュードザイマ(Pseudozyma)属に属する酵母、より詳しくはセレブロシドを乾燥菌体重量当たり1mg/g以上含有する該酵母に関する。また、シュードザイマ・アフィディス（Pseudozyma aphidis）に属する該酵母、より詳しくはシュードザイマ・アフィディス（Pseudozyma aphidis）Y178株（FERM P-21005）である該酵母に関する。また、該酵母を培養し、分離、精製することを特徴とする、セレブロシドの製造方法に関する。また、該酵母及び／又は該方法により得られたセレブロシドを含有する食品に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、セレブロシドを含有する新規な酵母が提供される。また、この酵母を用いたセレブロシドの製造方法、それにより得られたセレブロシド、得られたセレブロシドを含有する食品が提供される。これにより、酵母による栄養補給に加えて、有益な各種生理活性を有するセレブロシドも同時に付与することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、セレブロシドを含有するシュードザイマ(Pseudozyma)属に属する酵母であり、その中でも特にセレブロシドを乾燥菌体重量当たり1mg/g以上含有する酵母に関する。本発明酵母は、セレブロシドを含有するシュードザイマ(Pseudozyma)属に属する酵母であり、セレブロシドを乾燥菌体重量当たり1mg/g以上、好ましくは1.5mg/g以上含有する酵母であれば特に限定されないが、好ましくはシュードザイマ・アフィディス（Pseudozyma aphidis）に属する酵母、特に好ましくはシュードザイマ・アフィディス（Pseudozyma aphidis）Y178株（FERM P-21005）が挙げられる。本発明酵母は、魚腸管から一般的な酵母の分離方法に従い分離することができる。例えば、スズキ目タカサゴ科の魚であるクマササハナムロの腸管を滅菌海水中で懸濁し、懸濁液を培地に塗沫し培養する。この時、用いる培地としては固形培地であれば特に限定されないが、魚類や海水等から菌を分離する時に用いられる培地を用いれば良く、特に好ましくはポテトデキストロース寒天培地が用いられる。形成されたコロニーを取り、さらに液体培地に懸濁し培養する。この培養液をさらに別の液体培地に植菌して、振とう培養する。この時、用いる培地としては液体培地であれば特に限定されないが、魚類や海水等から菌を分離する時に用いられる培地を用いれば良く、特に好ましくはポテトデキストロース液体培地が用いられる。又、前述の培養する際の条件は、魚類や海水等から菌を分離する際の条件と同様に行えば良いが、例えば培養温度は30℃前後が好ましい。この培地から菌体を分離し、有機溶媒等で抽出し、スフィンゴシン生産量を指標として菌株を選抜する。この時、用いる有機溶媒としては特に限定されないが、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等のアルコール類、酢酸メチル、酢酸エチル、アセトン、クロロホルム、トルエン、等を単独あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。このようにして選抜された菌株について、菌学的性状及びrDNAの相同性を比較することにより、本発明酵母であるシュードザイマ属に属する菌株を得ることができる。この菌株は、以下の菌学的性状を示す。尚、本発明菌株については、Pseudozyma aphidis Y178として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、受託番号FERM P-21005として平成18年8月25日に受託されている。
【０００９】
炭素源資化性
D-グルコース ＋
D-ガラクトース ＋
L-ソルボース Ｓ
D-リボース ＋
D-キシロース ＋
L-アラビノース Ｓ
L-ラムノース ＋
シュクロース ＋
マルトース ＋
α,α−トレハロース ＋
α-メチル-D-グルコース ＋
D-セロビオース ＋
サリシン Ｓ
メリビオース ＋
D-ラフィノース ＋
メレジトース ＋
可溶性デンプン Ｓ
グリセロール Ｓ
メソエリスリトール ＋
リビトール Ｌ
D-ソルビトール ＋
D-マンニトール ＋
D-ガラクチトール −
ミオイノシトール ＋
D-グルコン酸 Ｓ
グルクロン酸 ＋
DL−乳酸 ＋
クエン酸 Ｓ
エタノール Ｗ／−
糖発酵性
D-グルコース −
ビタミン要求性
ビタミンなし −
窒素源資化性
硝酸カリウム ＋
エチルアミン ＋
L-リシン ＋
カダベリン ＋
耐性試験
37℃ ＋／Ｗ
40℃ −
10%NaCl −
（+;陽性、-;陰性、W;弱い陽性、S;徐徐に陽性、L;時間経過後急激に陽性）
【００１０】
又、本発明酵母を培養し、分離、精製することを特徴とする、セレブロシドの製造方法に関する。本発明酵母の選抜、培養方法は、前述した通りである。本発明はまた、このようにして培養、選抜した本発明酵母をさらに培養し、菌体からセレブロシドを分離、精製することを特徴とする、セレブロシドの製造方法に関する。菌体からのセレブロシドの抽出方法としては、常法に従い抽出すれば良いが、例えば菌体を適当な有機溶媒に加え数時間攪拌し、この液を濾過する。これを数回繰り返し、得られた濾液を濃縮した後、さらに適当な分配方法で分配すれば良い。この時、有機溶媒は前述したものが用いられる。又、濃縮方法は常法であれば特に限定されないが、例えば減圧濃縮等が挙げられる。又、分配方法としては、一般に用いられる方法であれば特に限定されないが、例えば高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過、シリカゲルクロマトグラフィー等が挙げられる。このようにして、目的とするセレブロシドを抽出することができる。
本発明はまた、本発明酵母又は該方法により得られたセレブロシドを含有する食品に関する。本発明酵母をそのまま、あるいは食品素材として食品に添加、混合、塗布等することにより、酵母による栄養補給に加えて、有益な各種生理活性を有するセレブロシドも同時に付与することが可能となる。また、抽出されたセレブロシドも同様に食品素材とすることができ、食品に有益な各種生理活性を付与することが可能となる。又、食品の他に医薬品、化粧品、飼料等に用いることも可能である。
【００１１】
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１２】
セレブロシド生産株の選抜
スズキ目タカサゴ科の魚であるクマササハナムロの腸管を採取し、滅菌海水中で懸濁した。懸濁液を希釈して塩化ナトリウムを加えたポテトデキストロース寒天培地（0.4％ポテトスターチ、2％デキストロース、1.5％アガー、2％NaCl）に塗沫後、30℃で培養した。形成されたコロニーを１白金耳かきとり、2mlのポテトデキストロース培地（0.4％ポテトスターチ、2％デキストロース、2％NaCl）に懸濁し、30℃で2日間前培養した。さらに100mlのポテトデキストロース液体培地が入った500mlのバッフル付きフラスコに植菌して、25℃〜30℃で5〜7日間振とう培養した（回転数140rpm）。この方法で155株の真菌を得た。又、陽性対照として、独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手した酵母Pichia farinosaNBRC1163、Candida tenuis NBRC10315、Kluyveromayces aestuarii NBRC10597についても同様の方法で培養を行った。培養物100mlにメタノールを加えて超音波で30分間抽出し、さらにクロロホルムを200ml添加してさらに30分間超音波で抽出した。500mlの分液ロートに上記の抽出液をいれ、二層に分配した。一晩静置したのち、下層を分離してロータリーエバポレーターにて濃縮することにより、数十mgの抽出物を得た。この抽出物5〜20mgを封管用試験管に秤量し、1mlの水性−塩酸メタノール試薬（9.4mlの水に8.6mlの濃塩酸を加え、メタノールで100mlに希釈）を加えて一晩70℃で加水分解を行った。冷却後、5mlメスフラスコに定容した。そのうち、500μlを試験管にとり、0.5N水酸化ナトリウムを500μl加えて、pH10に調整した。酢酸エチル2.5ml加えて激しく振とうし、3000rpmで5分間遠心分離した。下層を除去し、水を1ml加え、酢酸エチル層を洗浄し後、3000rpmで5分間遠心分離した。この洗浄操作を計2回繰り返した。洗浄後の酢酸エチル層に1mlの0.01M酢酸ナトリウム緩衝液（pH3.65、酢酸エチルで洗浄）、0.1mlのメチルオレンジ試薬（0.5％溶液、クロロホルムで洗浄）を加え1分間振とうした後、3000rpmで5分間遠心分離した。その後、酢酸エチル層の412nmにおける吸光度を測定した。試料ブランクとして同様の処理をしてメチルオレンジ試薬無添加のものを用いた。また、5〜25μgのスフィンゴシンを2.5mlの酢酸エチルに溶解した後、同様に酢酸ナトリウム緩衝液と酢酸バッファーを加え発色させ、吸光度の値から検量線を作製した。検量線から抽出物中に含まれるスフィンゴシン含量と1L培養物あたりのスフィンゴシン産生量を算出した。結果を表１に示す。
【００１３】
【表１】
【００１４】
この結果、これまでにセレブロシドを含有する微生物として報告されている酵母Pichia farinosa NBRC1163、Candida tenuis NBRC10315、Kluyveromayces aestuarii NBRC10597と同等、あるいはそれ以上にスフィンゴシン生産量が多い酵母が7菌株見出された。
【実施例２】
【００１５】
セレブロシド生産株の同定
実施例１で得られた7菌株について各々核酸を抽出し、28srDNAの塩基配列を調べデータベースと相同性検索した。得られた7菌株のうち、病原性の報告例が見られなかったNo.178株について同定を行った。本株の生化学的性状を表２に示す。
【００１６】
【表２】
【００１７】
この結果、上記性状と28SrDNA及びITS-5.8SrDNAの塩基配列の結果より、本株はPseudozyma aphidisと同定され、Pseudozyma属の菌株として初めてセレブロシドを生産することが確認された。本株をPseudozyma aphidis Y178と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、受託番号FERM P-21005として平成18年8月25日に受託されている。
【実施例３】
【００１８】
Pseudozyma属酵母のセレブロシド含量
本発明酵母と同属であるPseudozyma属の酵母6株（Pseudozyma tsukubaensis NBRC1940、Pseudozyma aphidis NBRC10182、Pseudozyma fusiformata NBRC10225、Pseudozyma antarctica NBRC10260、Pseudozyma flocculosa NBRC10875、及びPseudozyma rugulosa NBRC10877；独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手）について、実施例１と同様に培養後スフィンゴシンを抽出し、スフィンゴシン含量の測定を行った。結果を表３に示す。
【００１９】
【表３】
【００２０】
この結果、Pseudozyma属の酵母全てがスフィンゴシンを含有することが確認され、特に本発明酵母Y178株と同一の酵母であるPseudozyma aphidis NBRC10182のスフィンゴシン生産量が最も高いことが確認された。
【実施例４】
【００２１】
セレブロシドの特定
本発明酵母Pseudozyma aphidis Y178株に含まれるセレブロシドを特定するために以下のように本菌株を大量に培養し、抽出、分離精製後、構造解析を行った。即ち、魚腸管より採集した酵母の菌体をポテトデキストロース寒天培地より1コロニーかきとり、試験管中の液体培地（2％ペプトン、1％イーストエクストラクト、2％グルコース、2％NaCl）5mlに接種して30℃で2日間種培養を行った（前培養(1)）。菌体が増殖した上記前培養液(1)5mlを500ml三角フラスコ中の上記液体培地100mlに移植して、30℃で１日培養を行った（前培養(2)）。前培養液(2)を25mlずつ4本の1L中三角フラスコ中の上記液体培地240mlに分注し、30℃、2日間培養した（前培養(3)）。4基のジャーファーメンターに6Lの液体培地および泡消剤アデカノールを加え、増殖した前培養液(3)を240mlずつ添加して、30℃、4日間振盪培養した。培養終了後、連続遠心（15,000rpm）にて菌体を回収したところ、菌体950g（湿重量）が得られた。このうち386gの菌体に約1.5Lのクロロホルム−メタノール（2:1、v/v）を加えて3時間攪拌して、ろ紙（アドバンテック東洋社製；No.2）にてろ過した。残渣に約1.5Lのクロロホルム−メタノール（2:1、v/v）を加え、同様に抽出、ろ過を行い、計3回の抽出操作を行った。ろ液を濃縮したのち、残った水分の同容のメタノールと2倍容のクロロホルムを加え二層に分配した。分離後、下層を濃縮し抽出物6.92g得た。この抽出物6.2gを55mlのクロロホルム−メタノール（10:1、v/v）に溶解したのち、シリカゲルクロマトグラフィー（直径6×24.5cm）に付し、クロロホルム−メタノールの混合溶媒で順次溶出して10分画した。TLC上セレブロシドを含む画分をさらにシリカゲルカラム、ODSカラムで分画したところ、135.3mgのセレブロシドが得られた。菌体乾燥重量あたりのセレブロシドは1.6mg/gであった。このセレブロシドを一次元NMR及び二次元NMRにて解析した結果、セラミド類のうち、少なくとも以下の２種のセラミド類が得られた。そのうちのひとつはスフィンゴイド塩基9-メチル-4,8-スフィンガジエニンの1位の水酸基に糖または水素が結合し、アミノ基に脂肪酸または、２−ヒドロキシ脂肪酸が結合したもの（化１）であることが明らかになった。その他、スフィンゴイド塩基がスフィンゴシンであるもの（化２）も含まれていることが確認された。
【００２２】
【化１】
【００２３】
【化２】
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明により、セレブロシドを含有する新規な酵母が提供される。また、この酵母を用いたセレブロシドの製造方法、それにより得られたセレブロシド、得られたセレブロシドを含有する食品が提供される。これにより、酵母による栄養補給に加えて、有益な各種生理活性を有するセレブロシドも同時に付与することが可能となる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セレブロシドを含有する新規酵母、該酵母からセレブロシドを製造する方法、及びセレブロシドを含有する食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な生理活性を有するスフィンゴ脂質であるセラミドが注目されている。スフィンゴ脂質とは、スフィンゴシンあるいはこれに類似の長鎖アミノアルコールを有する脂質の総称であり、スフィンゴリン脂質とスフィンゴ糖脂質が含まれる。スフィンゴリン脂質にはスフィンゴミエリンが、またスフィンゴ糖脂質にはセレブロシド、ガングリオシド等がある。セラミドは、スフィンゴシンに脂肪酸がアミド結合した部分の総称である。スフィンゴ脂質は、動物の脳及び神経組織を初めとして他の臓器や組織に広く分布し、表皮では角質細胞間の細胞間脂質の主要成分として角質保湿機能に深く関与している（非特許文献１）。セラミドは、皮膚の老化防止、あるいは発癌予防に効果があると言われており、医薬品や化粧品素材のみならず、一般食品や飲料などの食品素材として利用が増えてきている。セラミドの一つであるセレブロシドは、スフィンゴシンの１位の水酸基に単糖又はオリゴ糖をエーテル結合させたスフィンゴイド塩基と脂肪酸の結合したスフィンゴ脂質である。セレブロシドの効果としては、例えば抗嘔吐剤（特許文献１）、抗アレルギー剤（特許文献２）等が既に報告されている。
【０００３】
これまで天然のセレブロシドは主に牛脳から製造されてきたが、その安全性の問題から最近では穀類や魚介類等を原料とする製造方法が検討されている。例えば、植物体より抽出されたセレブロシドが製品化されているが、植物体にはセレブロシドは極微量にしか含まれていないため、セレブロシドは非常に高価なものになっている。このように、これらにはセレブロシドが微量しか含まれていないため、セレブロシドを抽出、分離、精製するためには多大な労力やコストが必要となる。又、セレブロシドを効率的に取得するための原料として、微生物も近年注目されている。特に安全性の面から酵母を用いることが考えられ、近年ではセレブロシドを高含量蓄積する酵母、例えば乾燥菌体1gあたり1.3mgのセレブロシドを蓄積するZygosaccharomyces fermentatiやKluyveromyces lactis（特許文献３）、あるいはスフィンゴイド塩基を生産するPichia ciferriiの変異株（特許文献４）等が報告されている。また、セレブロシドの製造方法として、クルイベロマイセス・ラクティスをホエーあるいはその派生物を含む培地で培養することを特徴とするセレブロシドの発酵生産方法（特許文献５）、クルイベロマイセス・マルキシアナスをホエーあるいはその派生物を含む培地で培養することを特徴とするセレブロシドの発酵生産方法（特許文献６）、セレブロシド生産性酵母又は糸状菌の培養中及び／又は培養後に窒素源及び／又は炭素源不含培地や食塩及び／又はアルコール存在下等のストレス環境下で培養する方法（特許文献７）、酵母、カビ、キノコ等真菌類を特定の乾燥方法により乾燥しセラミドを抽出する方法、（特許文献８）が知られている。
【０００４】
【特許文献１】特開平6-271598号公報
【特許文献２】特開2003-155231号公報
【特許文献３】特開2004−89047号公報
【特許文献４】特表2002-519070号公報
【特許文献５】特開2006-55070号公報
【特許文献６】特開2006-55071号公報
【特許文献７】特開2005-185126号公報
【特許文献８】特開2006-67842号公報
【非特許文献１】鈴木正人ら編，「コスメディック」，シーエムシー，1988年12月，第２巻，ｐ．４（１９３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、セレブロシドを含有する新規酵母、該酵母からセレブロシドを製造する方法、及び該酵母及び／又は該セレブロシドを含有する食品を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の状況に鑑みセレブロシドを含有する新規な微生物を求め鋭意探索の結果、魚介類より分離したPseudozyma属に属する酵母にセレブロシドを多く含有するものを初めて見出し、本発明を完成するに至った。従って本発明は、セレブロシドを含有するシュードザイマ(Pseudozyma)属に属する酵母、より詳しくはセレブロシドを乾燥菌体重量当たり1mg/g以上含有する該酵母に関する。また、シュードザイマ・アフィディス（Pseudozyma aphidis）に属する該酵母、より詳しくはシュードザイマ・アフィディス（Pseudozyma aphidis）Y178株（FERM P-21005）である該酵母に関する。また、該酵母を培養し、分離、精製することを特徴とする、セレブロシドの製造方法に関する。また、該酵母及び／又は該方法により得られたセレブロシドを含有する食品に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、セレブロシドを含有する新規な酵母が提供される。また、この酵母を用いたセレブロシドの製造方法、それにより得られたセレブロシド、得られたセレブロシドを含有する食品が提供される。これにより、酵母による栄養補給に加えて、有益な各種生理活性を有するセレブロシドも同時に付与することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、セレブロシドを含有するシュードザイマ(Pseudozyma)属に属する酵母であり、その中でも特にセレブロシドを乾燥菌体重量当たり1mg/g以上含有する酵母に関する。本発明酵母は、セレブロシドを含有するシュードザイマ(Pseudozyma)属に属する酵母であり、セレブロシドを乾燥菌体重量当たり1mg/g以上、好ましくは1.5mg/g以上含有する酵母であれば特に限定されないが、好ましくはシュードザイマ・アフィディス（Pseudozyma aphidis）に属する酵母、特に好ましくはシュードザイマ・アフィディス（Pseudozyma aphidis）Y178株（FERM P-21005）が挙げられる。本発明酵母は、魚腸管から一般的な酵母の分離方法に従い分離することができる。例えば、スズキ目タカサゴ科の魚であるクマササハナムロの腸管を滅菌海水中で懸濁し、懸濁液を培地に塗沫し培養する。この時、用いる培地としては固形培地であれば特に限定されないが、魚類や海水等から菌を分離する時に用いられる培地を用いれば良く、特に好ましくはポテトデキストロース寒天培地が用いられる。形成されたコロニーを取り、さらに液体培地に懸濁し培養する。この培養液をさらに別の液体培地に植菌して、振とう培養する。この時、用いる培地としては液体培地であれば特に限定されないが、魚類や海水等から菌を分離する時に用いられる培地を用いれば良く、特に好ましくはポテトデキストロース液体培地が用いられる。又、前述の培養する際の条件は、魚類や海水等から菌を分離する際の条件と同様に行えば良いが、例えば培養温度は30℃前後が好ましい。この培地から菌体を分離し、有機溶媒等で抽出し、スフィンゴシン生産量を指標として菌株を選抜する。この時、用いる有機溶媒としては特に限定されないが、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等のアルコール類、酢酸メチル、酢酸エチル、アセトン、クロロホルム、トルエン、等を単独あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。このようにして選抜された菌株について、菌学的性状及びrDNAの相同性を比較することにより、本発明酵母であるシュードザイマ属に属する菌株を得ることができる。この菌株は、以下の菌学的性状を示す。尚、本発明菌株については、Pseudozyma aphidis Y178として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、受託番号FERM P-21005として平成18年8月25日に受託されている。
【０００９】
炭素源資化性
D-グルコース ＋
D-ガラクトース ＋
L-ソルボース Ｓ
D-リボース ＋
D-キシロース ＋
L-アラビノース Ｓ
L-ラムノース ＋
シュクロース ＋
マルトース ＋
α,α−トレハロース ＋
α-メチル-D-グルコース ＋
D-セロビオース ＋
サリシン Ｓ
メリビオース ＋
D-ラフィノース ＋
メレジトース ＋
可溶性デンプン Ｓ
グリセロール Ｓ
メソエリスリトール ＋
リビトール Ｌ
D-ソルビトール ＋
D-マンニトール ＋
D-ガラクチトール −
ミオイノシトール ＋
D-グルコン酸 Ｓ
グルクロン酸 ＋
DL−乳酸 ＋
クエン酸 Ｓ
エタノール Ｗ／−
糖発酵性
D-グルコース −
ビタミン要求性
ビタミンなし −
窒素源資化性
硝酸カリウム ＋
エチルアミン ＋
L-リシン ＋
カダベリン ＋
耐性試験
37℃ ＋／Ｗ
40℃ −
10%NaCl −
（+;陽性、-;陰性、W;弱い陽性、S;徐徐に陽性、L;時間経過後急激に陽性）
【００１０】
又、本発明酵母を培養し、分離、精製することを特徴とする、セレブロシドの製造方法に関する。本発明酵母の選抜、培養方法は、前述した通りである。本発明はまた、このようにして培養、選抜した本発明酵母をさらに培養し、菌体からセレブロシドを分離、精製することを特徴とする、セレブロシドの製造方法に関する。菌体からのセレブロシドの抽出方法としては、常法に従い抽出すれば良いが、例えば菌体を適当な有機溶媒に加え数時間攪拌し、この液を濾過する。これを数回繰り返し、得られた濾液を濃縮した後、さらに適当な分配方法で分配すれば良い。この時、有機溶媒は前述したものが用いられる。又、濃縮方法は常法であれば特に限定されないが、例えば減圧濃縮等が挙げられる。又、分配方法としては、一般に用いられる方法であれば特に限定されないが、例えば高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過、シリカゲルクロマトグラフィー等が挙げられる。このようにして、目的とするセレブロシドを抽出することができる。
本発明はまた、本発明酵母又は該方法により得られたセレブロシドを含有する食品に関する。本発明酵母をそのまま、あるいは食品素材として食品に添加、混合、塗布等することにより、酵母による栄養補給に加えて、有益な各種生理活性を有するセレブロシドも同時に付与することが可能となる。また、抽出されたセレブロシドも同様に食品素材とすることができ、食品に有益な各種生理活性を付与することが可能となる。又、食品の他に医薬品、化粧品、飼料等に用いることも可能である。
【００１１】
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１２】
セレブロシド生産株の選抜
スズキ目タカサゴ科の魚であるクマササハナムロの腸管を採取し、滅菌海水中で懸濁した。懸濁液を希釈して塩化ナトリウムを加えたポテトデキストロース寒天培地（0.4％ポテトスターチ、2％デキストロース、1.5％アガー、2％NaCl）に塗沫後、30℃で培養した。形成されたコロニーを１白金耳かきとり、2mlのポテトデキストロース培地（0.4％ポテトスターチ、2％デキストロース、2％NaCl）に懸濁し、30℃で2日間前培養した。さらに100mlのポテトデキストロース液体培地が入った500mlのバッフル付きフラスコに植菌して、25℃〜30℃で5〜7日間振とう培養した（回転数140rpm）。この方法で155株の真菌を得た。又、陽性対照として、独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手した酵母Pichia farinosaNBRC1163、Candida tenuis NBRC10315、Kluyveromayces aestuarii NBRC10597についても同様の方法で培養を行った。培養物100mlにメタノールを加えて超音波で30分間抽出し、さらにクロロホルムを200ml添加してさらに30分間超音波で抽出した。500mlの分液ロートに上記の抽出液をいれ、二層に分配した。一晩静置したのち、下層を分離してロータリーエバポレーターにて濃縮することにより、数十mgの抽出物を得た。この抽出物5〜20mgを封管用試験管に秤量し、1mlの水性−塩酸メタノール試薬（9.4mlの水に8.6mlの濃塩酸を加え、メタノールで100mlに希釈）を加えて一晩70℃で加水分解を行った。冷却後、5mlメスフラスコに定容した。そのうち、500μlを試験管にとり、0.5N水酸化ナトリウムを500μl加えて、pH10に調整した。酢酸エチル2.5ml加えて激しく振とうし、3000rpmで5分間遠心分離した。下層を除去し、水を1ml加え、酢酸エチル層を洗浄し後、3000rpmで5分間遠心分離した。この洗浄操作を計2回繰り返した。洗浄後の酢酸エチル層に1mlの0.01M酢酸ナトリウム緩衝液（pH3.65、酢酸エチルで洗浄）、0.1mlのメチルオレンジ試薬（0.5％溶液、クロロホルムで洗浄）を加え1分間振とうした後、3000rpmで5分間遠心分離した。その後、酢酸エチル層の412nmにおける吸光度を測定した。試料ブランクとして同様の処理をしてメチルオレンジ試薬無添加のものを用いた。また、5〜25μgのスフィンゴシンを2.5mlの酢酸エチルに溶解した後、同様に酢酸ナトリウム緩衝液と酢酸バッファーを加え発色させ、吸光度の値から検量線を作製した。検量線から抽出物中に含まれるスフィンゴシン含量と1L培養物あたりのスフィンゴシン産生量を算出した。結果を表１に示す。
【００１３】
【表１】
【００１４】
この結果、これまでにセレブロシドを含有する微生物として報告されている酵母Pichia farinosa NBRC1163、Candida tenuis NBRC10315、Kluyveromayces aestuarii NBRC10597と同等、あるいはそれ以上にスフィンゴシン生産量が多い酵母が7菌株見出された。
【実施例２】
【００１５】
セレブロシド生産株の同定
実施例１で得られた7菌株について各々核酸を抽出し、28srDNAの塩基配列を調べデータベースと相同性検索した。得られた7菌株のうち、病原性の報告例が見られなかったNo.178株について同定を行った。本株の生化学的性状を表２に示す。
【００１６】
【表２】
【００１７】
この結果、上記性状と28SrDNA及びITS-5.8SrDNAの塩基配列の結果より、本株はPseudozyma aphidisと同定され、Pseudozyma属の菌株として初めてセレブロシドを生産することが確認された。本株をPseudozyma aphidis Y178と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、受託番号FERM P-21005として平成18年8月25日に受託されている。
【実施例３】
【００１８】
Pseudozyma属酵母のセレブロシド含量
本発明酵母と同属であるPseudozyma属の酵母6株（Pseudozyma tsukubaensis NBRC1940、Pseudozyma aphidis NBRC10182、Pseudozyma fusiformata NBRC10225、Pseudozyma antarctica NBRC10260、Pseudozyma flocculosa NBRC10875、及びPseudozyma rugulosa NBRC10877；独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手）について、実施例１と同様に培養後スフィンゴシンを抽出し、スフィンゴシン含量の測定を行った。結果を表３に示す。
【００１９】
【表３】
【００２０】
この結果、Pseudozyma属の酵母全てがスフィンゴシンを含有することが確認され、特に本発明酵母Y178株と同一の酵母であるPseudozyma aphidis NBRC10182のスフィンゴシン生産量が最も高いことが確認された。
【実施例４】
【００２１】
セレブロシドの特定
本発明酵母Pseudozyma aphidis Y178株に含まれるセレブロシドを特定するために以下のように本菌株を大量に培養し、抽出、分離精製後、構造解析を行った。即ち、魚腸管より採集した酵母の菌体をポテトデキストロース寒天培地より1コロニーかきとり、試験管中の液体培地（2％ペプトン、1％イーストエクストラクト、2％グルコース、2％NaCl）5mlに接種して30℃で2日間種培養を行った（前培養(1)）。菌体が増殖した上記前培養液(1)5mlを500ml三角フラスコ中の上記液体培地100mlに移植して、30℃で１日培養を行った（前培養(2)）。前培養液(2)を25mlずつ4本の1L中三角フラスコ中の上記液体培地240mlに分注し、30℃、2日間培養した（前培養(3)）。4基のジャーファーメンターに6Lの液体培地および泡消剤アデカノールを加え、増殖した前培養液(3)を240mlずつ添加して、30℃、4日間振盪培養した。培養終了後、連続遠心（15,000rpm）にて菌体を回収したところ、菌体950g（湿重量）が得られた。このうち386gの菌体に約1.5Lのクロロホルム−メタノール（2:1、v/v）を加えて3時間攪拌して、ろ紙（アドバンテック東洋社製；No.2）にてろ過した。残渣に約1.5Lのクロロホルム−メタノール（2:1、v/v）を加え、同様に抽出、ろ過を行い、計3回の抽出操作を行った。ろ液を濃縮したのち、残った水分の同容のメタノールと2倍容のクロロホルムを加え二層に分配した。分離後、下層を濃縮し抽出物6.92g得た。この抽出物6.2gを55mlのクロロホルム−メタノール（10:1、v/v）に溶解したのち、シリカゲルクロマトグラフィー（直径6×24.5cm）に付し、クロロホルム−メタノールの混合溶媒で順次溶出して10分画した。TLC上セレブロシドを含む画分をさらにシリカゲルカラム、ODSカラムで分画したところ、135.3mgのセレブロシドが得られた。菌体乾燥重量あたりのセレブロシドは1.6mg/gであった。このセレブロシドを一次元NMR及び二次元NMRにて解析した結果、セラミド類のうち、少なくとも以下の２種のセラミド類が得られた。そのうちのひとつはスフィンゴイド塩基9-メチル-4,8-スフィンガジエニンの1位の水酸基に糖または水素が結合し、アミノ基に脂肪酸または、２−ヒドロキシ脂肪酸が結合したもの（化１）であることが明らかになった。その他、スフィンゴイド塩基がスフィンゴシンであるもの（化２）も含まれていることが確認された。
【００２２】
【化１】
【００２３】
【化２】
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明により、セレブロシドを含有する新規な酵母が提供される。また、この酵母を用いたセレブロシドの製造方法、それにより得られたセレブロシド、得られたセレブロシドを含有する食品が提供される。これにより、酵母による栄養補給に加えて、有益な各種生理活性を有するセレブロシドも同時に付与することが可能となる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セレブロシドを含有するシュードザイマ(Pseudozyma)属に属する酵母。
【請求項２】
セレブロシドを乾燥菌体重量当たり1mg/g以上含有する、請求項１記載の酵母。
【請求項３】
シュードザイマ・アフィディス（Pseudozyma aphidis）に属する、請求項１又は２記載の酵母。
【請求項４】
シュードザイマ・アフィディス（Pseudozyma aphidis）Y178株（FERM P-21005）である、請求項１乃至３記載の酵母。
【請求項５】
請求項１乃至４記載の酵母を培養し、分離、精製することを特徴とする、セレブロシドの製造方法。
【請求項６】
請求項５記載の方法により得られたセレブロシド。
【請求項７】
請求項４記載の酵母及び／又は請求項６記載のセレブロシドを含有する食品。
【請求項１】
セレブロシドを含有するシュードザイマ(Pseudozyma)属に属する酵母。
【請求項２】
セレブロシドを乾燥菌体重量当たり1mg/g以上含有する、請求項１記載の酵母。
【請求項３】
シュードザイマ・アフィディス（Pseudozyma aphidis）に属する、請求項１又は２記載の酵母。
【請求項４】
シュードザイマ・アフィディス（Pseudozyma aphidis）Y178株（FERM P-21005）である、請求項１乃至３記載の酵母。
【請求項５】
請求項１乃至４記載の酵母を培養し、分離、精製することを特徴とする、セレブロシドの製造方法。
【請求項６】
請求項５記載の方法により得られたセレブロシド。
【請求項７】
請求項４記載の酵母及び／又は請求項６記載のセレブロシドを含有する食品。
【公開番号】特開２００８−２４５６０７（Ｐ２００８−２４５６０７Ａ）
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−９３４９６（Ｐ２００７−９３４９６）
【出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【出願人】（０００００４１８９）日本水産株式会社 (119)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【出願人】（０００００４１８９）日本水産株式会社 (119)
【Ｆターム（参考）】
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