顎嚢胞治療剤
【課題】新たな顎嚢胞治療剤の提供。
【解決手段】ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦまたはＰＤＧＦ等の受容体チロシンキナーゼ阻害剤が顎嚢胞の嚢胞壁を主要に構成する線維芽細胞の細胞死を誘導することを見出し、該受容体チロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とする新たな顎嚢胞治療剤を提供した。
【解決手段】ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦまたはＰＤＧＦ等の受容体チロシンキナーゼ阻害剤が顎嚢胞の嚢胞壁を主要に構成する線維芽細胞の細胞死を誘導することを見出し、該受容体チロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とする新たな顎嚢胞治療剤を提供した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とする顎嚢胞治療剤に関する。さらに詳しくは、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）またはＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）等の受容体チロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とする顎嚢胞治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、角化嚢胞性歯原性腫瘍（歯原性角化嚢胞）等の顎嚢胞に対しては、外科的切除以外に治療方法がなく、顎嚢胞のひとつである歯根嚢胞においては、初発に感染根管治療を行うことも可能ではあるが、この治療が奏功しない場合には、やはり外科的切除するしかなかった。しかし、外科的切除をすると骨に大きな空洞ができるため、生体への侵襲が大きいという問題があった。
【０００３】
本発明者らは、この問題に着目し、外科的切除以外の顎嚢胞の治療方法を模索してきた。そして、歯根嚢胞壁で産生されるＰＧＥ2（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ2）が歯根嚢胞由来の線維芽細胞様細胞（Ｒａｄｉｃｕｌａｒ ｃｙｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ、以下、ＲＣ細胞（ＲＣＦ）とする）および角化嚢胞性歯原性腫瘍（歯原性角化嚢胞）由来の線維芽細胞様細胞（Ｏｄｏｎｔｏｇｅｎｉｃ ｋｅｒａｔｏｃｙｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ、以下、ＫＣ細胞（ＫＣＦ）とする）を刺激することにより、ＩＬ−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）、ＩＬ−１１（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１１）、ＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）等の炎症性メディエーターの産生が促進され、嚢胞の拡大に繋がることを確認した。そこで、このシグナル伝達機構に関与するｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤により、炎症性メディエーターの産生の促進を阻害したところ、嚢胞の拡大が抑制できることを見出した。
【０００４】
これにより、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分とする顎嚢胞治療剤を本発明者が得たところ（例えば、特許文献１参照）、この顎嚢胞治療剤は、顎嚢胞の予防や治療において強い期待が寄せられる薬剤であった。そこで、本発明者らはさらに有用な薬剤を検討したところ、本発明において、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦまたはＰＤＧＦ等の受容体チロシンキナーゼ阻害剤が、顎嚢胞の予防や治療において有用であることを見出した。
受容体チロシンキナーゼ阻害剤は、腫瘍、乾癬、肺線維症、多嚢胞性腎疾患等の増殖性疾患や嚢胞性線維症等の治療に用い得ることが示唆されているものの（例えば、特許文献２、３参照）、顎嚢胞に対する効果は知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−２６０７０３号公報
【特許文献２】特開平１０−２１８７６８号公報
【特許文献３】特開平２００９−５２９０４７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新たな顎嚢胞治療剤の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦまたはＰＤＧＦ等の受容体チロシンキナーゼ阻害剤が、顎嚢胞の嚢胞壁を主要に構成する線維芽細胞の細胞死を誘導することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明によって得られた、受容体チロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とする顎嚢胞治療剤は、嚢胞内に直接局所投与等することができ、嚢胞壁の線維芽細胞の細胞死を誘導することで、嚢胞の消滅や、嚢胞の拡大予防に利用できる。
また、本発明の顎嚢胞治療剤と、炎症性メディエーターの産生の促進を阻害することで嚢胞の拡大が抑制する、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分とする顎嚢胞治療剤とを組み合わせることにより、顎嚢胞の薬剤による予防または治療を包括的に行うことも可能となる。
【０００８】
すなわち、本発明は次の（１）〜（５）の顎嚢胞顎嚢胞治療剤等に関する。
（１）チロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とする顎嚢胞治療剤。
（２）チロシンキナーゼ阻害剤がＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）またはＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ）の受容体チロシンキナーゼ阻害剤である上記（１）に記載の顎嚢胞治療剤。
（３）チロシンキナーゼ阻害剤が１−（２−Ａｍｉｎｏ−６−（２，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｏ［２，３−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−７−ｙｌ）−３−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｕｒｅａまたは１−ｔ−Ｂｕｔｙｌ−３−（６−（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ）−ｐｙｒｉｄｏ［２，３−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−７−ｙｌ） ｕｒｅａである上記（１）または（２）に記載の顎嚢胞治療剤。
（４）嚢胞内に局所投与して用いる上記（１）〜（３）のいずれかに記載の顎嚢胞治療剤。
（５）顎嚢胞が歯根嚢胞または角化嚢胞性歯原性腫瘍である上記（１）〜（４）のいずれかに記載の顎嚢胞治療剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の顎嚢胞治療剤は、嚢胞内への直接局所投与が可能であるため人体に与える副作用が少なく有用である。また、嚢胞壁の線維芽細胞の細胞死を誘導する本発明の顎嚢胞治療剤と、炎症性メディエーターの産生の促進を阻害するｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分とする顎嚢胞治療剤とを組み合わせることにより、薬剤による顎嚢胞の包括的な予防または治療方法を提供することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】顎嚢胞治療剤の顎嚢胞由来細胞への効果を示した図である（試験例１）。
【図２】顎嚢胞治療剤の顎嚢胞由来細胞への効果を示した図である（試験例２）。
【図３】顎嚢胞治療剤の顎嚢胞由来細胞への効果を示した図である（試験例３）。
【図４】顎嚢胞治療剤の歯肉上皮細胞への効果を示した図である（試験例４）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の「顎嚢胞治療剤」は、チロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とし、顎嚢胞の予防または治療に有用な剤のことをいう。有効成分であるチロシンキナーゼ阻害剤のみからなる剤であってもよく、その他薬学的に許容される他の成分を含む剤であってもよい。
【００１２】
本発明の「顎嚢胞治療剤」の有効成分であるチロシンキナーゼ阻害剤は、顎嚢胞の予防または治療に利用できるものであればいずれのものでもあっても良いが、特に、顎嚢胞の嚢胞壁を主要に構成する線維芽細胞の細胞死を誘導することで顎嚢胞の予防または治療に利用できるものであることが好ましい。
このようなチロシンキナーゼ阻害剤として、例えば、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦまたはＰＤＧＦ等の受容体チロシンキナーゼ阻害剤等が挙げられる。本発明の「顎嚢胞治療剤」の有効成分として用いる受容体チロシンキナーゼ阻害剤としては、例えばＥＧＦ、ＦＧＦまたはＰＤＧＦの受容体チロシンキナーゼ阻害剤である１−（２−Ａｍｉｎｏ−６−（２，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｏ［２，３−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−７−ｙｌ）−３−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｕｒｅａ等が挙げられ、これはメルク社の製品番号ＰＤ０８９８２８等、市販のものであってもよい。
また、ＦＧＦまたはＶＥＧＦの受容体チロシンキナーゼ阻害剤である１−ｔ−Ｂｕｔｙｌ−３−（６−（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ）−ｐｙｒｉｄｏ［２，３−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−７−ｙｌ） ｕｒｅａ等が挙げられ、これもメルク社の製品番号ＰＤ１７３０７４（ＦＧＦ／ＶＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ等、市販のものであってもよい。また、これらの化合物の生理学的に許容される塩、例えば塩酸塩も受容体チロシンキナーゼ阻害剤として、本発明の顎嚢胞治療剤の有効成分に含むことができる。
【００１３】
本発明の「顎嚢胞治療剤」の対象となる顎嚢胞としては、歯根嚢胞、角化嚢胞性歯原性腫瘍（歯原性角化嚢胞）等が挙げられる。本発明の「顎嚢胞治療剤」は、顎嚢胞の発生の可能性が高い部位に本発明の組成物を塗布すること等で投与することができる。さらに顎嚢胞の発生の予防を目的とする場合には、根管貼薬として、綿栓やペーパーポイント等に滲み込ませて根管内に投与することができ、外科的切除後の再発防止を目的とする場合には、徐放性となるように、コラーゲンスポンジ等の吸収性の担体を併用して投与することができる。本発明の組成物を予防のために投与する、顎嚢胞の発生の高い部位としては、感染根管治療によって、器械刺激や組織障害を受けやすい、根管治療中の歯等の部位が挙げられる。また、顎嚢胞が発生した後であれば、嚢胞内に局所投与することで、人体に与える副作用の可能性を下げることができる。
【００１４】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１５】
顎嚢胞治療剤
受容体チロシンキナーゼ阻害剤である１−（２−Ａｍｉｎｏ−６−（２，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｏ［２，３−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−７−ｙｌ）−３−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｕｒｅａとして、メルク社の製品番号ＰＤ０８９８２８（ＥＧＦ／ＦＧＦ／ＰＤＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用いた。また１−ｔ−Ｂｕｔｙｌ−３−（６−（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ）−ｐｙｒｉｄｏ［２，３−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−７−ｙｌ） ｕｒｅａとして、メルク社の製品番号ＰＤ１７３０７４（ＦＧＦ／ＶＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を顎嚢胞治療剤として用いた。
【００１６】
［試験例］
顎嚢胞治療剤の効果の確認
材料の調製
１．顎嚢胞治療剤
次の１）および２）の方法により調製したものを用いた。
１）メルク社より購入した粉末のＰＤ０８９８２８を、濃度が１０ｍＭとなるようにジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、以下、ＤＭＳＯとする）で調製し、小分けして、フリーザーに凍結保存した。使用時に終末濃度（０．２〜５μＭ）となるように希釈して用いた。
２）メルク社より購入した粉末のＰＤ１７３０７４を、濃度が１０ｍＭとなるようにＤＭＳＯで調製し、小分けして、フリーザーに凍結保存した。使用時に終末濃度（０．２〜５μＭ）となるように希釈して用いた。
【００１７】
２．顎嚢胞由来細胞
顎嚢胞由来細胞の一つとして、日本大学歯学部付属歯科病院口腔外科、歯内療法科で治療の目的で外科的に摘出され、同病院検査室病理部で歯根嚢胞また角化嚢胞性歯原性腫瘍（歯原性角化嚢胞）と診断された嚢胞組織の一部から、歯根嚢胞由来のＲＣ細胞（ＲＣＦ）と角化嚢胞性歯原性腫瘍（歯原性角化嚢胞）由来のＫＣ細胞（ＫＣＦ）を得た。なお、試料の採取は日本大学歯学部倫理委員会の規定に基いて行った。また、患者には組織の一部が本研究に用いられることをあらかじめ説明し、文書による同意を得た。
【００１８】
１）ＲＣ細胞（ＲＣＦ）
野崎ら（参考文献１参照）の方法に準じて得た。
すなわち、歯根嚢胞由来の組織片を３％の抗生物質溶液（ペニシリン／ストレプトマイシン／ネオマイシン、ＰＳＮ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（Ｗａｋｏ、以下ＤＭＥＭと示す）培地で数回洗浄し、歯科用メス（Ｎｏ．１５、Ｆｅａｔｈｅｒ）で細片化した。２症例の歯根嚢胞から組織片を得て、それぞれ個体別に用いた。６穴プレート（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ）の底に当該組織片をカバースリップで固定後、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）および１％ＰＳＮを含むＤＭＥＭ培地で、３７℃および５％ＣＯ2／９５％ａｉｒの条件下で初代培養を行った。約２週間後、外生した細胞がコンフルエントになった時点で、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞を剥離し、同様の条件下で継代培養を行い、４から７代継代したものをＲＣ細胞（ＲＣＦ）として用いた。
参考文献１：野崎弘晃、大島光宏、山口洋子、小木曽文内、明石俊和、大塚吉兵衛：ＰＧＥ2が歯根嚢胞由来細胞のケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）産生に及ぼす影響；日本歯科保存学雑誌４４、９１７−９２３、２００１
【００１９】
２）ＫＣ細胞（ＫＣＦ）
大島ら（参考文献２参照）の方法に準じて得た。
すなわち、角化嚢胞性歯原性腫瘍（歯原性角化嚢胞）由来の組織片を３％の抗生物質溶液（ペニシリン／ストレプトマイシン／ネオマイシン、ＰＳＮ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ培地で数回洗浄し、歯科用メス（Ｎｏ．１５、Ｆｅａｔｈｅｒ）で細片化した。２症例の角化嚢胞性歯原性腫瘍（歯原性角化嚢胞）から組織片を得て、それぞれ個体別に用いた。６穴プレート（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ）の底に当該組織片をカバースリップで固定後、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）および１％ＰＳＮを含むＤＭＥＭ培地で、３７℃および５％ＣＯ2／９５％ａｉｒの条件下で初代培養を行った。約２週間後、外生した細胞がコンフルエントになった時点で、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞を剥離し、同様の条件下で継代培養を行い、４から７代継代したものをＲＣ細胞（ＲＣＦ）として用いた。
参考文献２：大島崇文ほか：ＰＧＥ2が歯根嚢胞および歯原性角化嚢胞由来細胞のＨＧＦ，ＩＬ−６およびＰＧＥ2産生に及ぼす影響；日本歯科保存学雑誌 ４９（６），７９７−８０９，２００６−１２−３１
【００２０】
［試験例１］
１．顎嚢胞治療剤の顎嚢胞由来細胞への作用
１）上記で継代培養したＲＣ細胞（ＲＣＦ）またはＫＣ細胞（ＫＣＦ）（各２症例）を２４穴プレートに播き、初代培養と同様の条件下でコンフルエントになるまで培養した。
２）コンフルエントに達した細胞に１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に、上記で調製した顎嚢胞治療剤（ＰＤ０８９８２８またはＰＤ１７３０７４）をそれぞれ終末濃度１μＭまたは５μＭとなるように加え、４８時間または９６時間作用させた。
【００２１】
２．顎嚢胞由来細胞の細胞死の評価
細胞死はＷＳＴ‐８：Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学）にて評価した。
【００２２】
３．結果
その結果、図１に示したように、ＰＤ０８９８２８またはＰＤ１７３０７４を加えて作用させたものはいずれも顎嚢胞由来細胞の細胞死を誘導することが確認された。特にＰＤ０８９８２８を終末濃度１μＭまたは５μＭとなるように加えて９６時間作用させたものと、ＰＤ１７３０７４を終末濃度５μＭとなるように加えて９６時間作用させたものは、顎嚢胞由来細胞の細胞死を強く誘導することが確認された。
【００２３】
［試験例２］
１．顎嚢胞治療剤の顎嚢胞由来細胞への作用（無血清状態）
１）上記で継代培養したＲＣ細胞（ＲＣＦ）またはＫＣ細胞（ＫＣＦ）（各２症例）を２４穴プレートに播き、コンフルエントになるまで培養した。
２）無血清のＤＭＥＭ培地で２４時間の血清飢餓を行った後、顎嚢胞治療剤（ＰＤ０８９８２８またはＰＤ１７３０７４）をそれぞれ終末濃度０．２μＭ、１μＭまたは５μＭを含む無血清のＤＭＥＭ培地と交換し、４８時間または９６時間作用させた。
【００２４】
２．顎嚢胞由来細胞の細胞死の評価
細胞死はＷＳＴ‐８：Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学）にて評価した。
【００２５】
３．結果
その結果、図２に示したように、無血清状態（血清に含まれる増殖因子等の影響がない状態）で作用させた場合でも、ＰＤ０８９８２８またはＰＤ１７３０７４を加えて作用させたものはいずれも濃度依存的に顎嚢胞由来細胞の細胞死を誘導することが確認された。
【００２６】
［試験例３］
１．顎嚢胞治療剤の顎嚢胞由来細胞への作用
１）上記で継代培養したＲＣ細胞（ＲＣＦ）またはＫＣ細胞（ＫＣＦ）（各２症例）を２４穴プレートに播き、初代培養と同様の条件下でコンフルエントになるまで培養した。
２）コンフルエントに達した細胞に１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に、上記で調製した顎嚢胞治療剤（ＰＤ０８９８２８またはＰＤ１７３０７４）をそれぞれ終末濃度１μＭまたは５μＭとなるように１％血清を含む培地に加え、６日間または８日間作用させた。
【００２７】
２．顎嚢胞由来細胞の細胞死の評価
細胞死はＷＳＴ‐８：Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学）にて評価した。
【００２８】
３．結果
その結果、図３に示したように、ＰＤ０８９８２８またはＰＤ１７３０７４を加えて作用させたものはいずれも濃度依存的に顎嚢胞由来細胞の細胞死を誘導することが確認された。
ＰＤ０８９８２８またはＰＤ１７３０７４を加えた後、６日間または８日間という長期間経過後でも顎嚢胞由来細胞の細胞死を誘導する効果が確認されたことから、１回の投与で長時間作用を持続できることが示唆され、阻害剤の種類によっては低濃度でも同様の効果が期待された。
【００２９】
［試験例４］
顎嚢胞治療剤の歯肉上皮細胞への作用
本発明の顎嚢胞治療剤が、顎嚢胞を構成する嚢胞の裏層上皮の細胞死を誘導する可能性があるか否かを、歯肉上皮細胞を用いて検討した。嚢胞の裏層上皮は、一般的にマラッセの上皮遺残由来であるとされており、このマラッセの上皮遺残由来細胞と歯肉上皮細胞（いずれも初代培養細胞）は非常によく似た細胞であることが最近報告されている（参考文献３参照）。従って、本発明の顎嚢胞治療剤が歯肉上皮細胞の細胞死を誘導すれば、嚢胞の裏層上皮の細胞死も誘導する可能性が高いと考えられる。
【００３０】
１．試料
１）顎嚢胞治療剤
上記試験例にて調製した顎嚢胞治療剤を用いた。
２）歯肉上皮細胞
歯周外科手術の際に切除され、不要となった歯肉片より、Ｏｈｓｈｉｍａらの方法（参考文献３）によって、ヒト歯肉上皮細胞を得た。
すなわち、歯肉片をディスパーゼ（Ｄｉｓｐａｓｅ、合同酒精）処理した後、上皮組織部分を結合組織部分から剥離した。上皮組織を細切後、組織片をプレート（Ｉ型コラーゲンコート：住友ベークライト）の底に静置し、組織片から外生した細胞を第１代とした。この歯肉上皮細胞を、Ｉ型コラーゲンがコートされたプレート（Ｉ型コラーゲンコート：住友ベークライト）を用い、細胞はＥｐｉ Ｌｉｆｅ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に増殖添加剤（Ｓ７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１％の抗生物質溶液（ＰＳＮ、Ｓｉｇｍａ）を加えた培地（ＥＬ＋）を用いて増殖させた。
コンフルエントに増殖した歯肉上皮細胞を、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）−ＥＤＴＡ溶液を用いてプレートから剥がし、本発明者らが確立した歯肉上皮細胞の培養方法（参考文献４）によって継代培養し、６から１２代継代したものを歯肉上皮細胞として用いた。
参考文献３：Ｍｉｔｓｕｈｉｒｏ Ｏｓｈｉｍａ．， ｅｔ． ａｌ．， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣｙｔｏｋａｉｎｅＰｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｔｓ ｏｆ Ｍａｌａｓｓｅｚ．， Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ ７９， ９１２−９１８， ２００８．
参考文献４：特願２００９−２３１３９９
【００３１】
２．顎嚢胞治療剤の顎嚢胞由来細胞への作用
１）上記で継代培養した歯肉上皮細胞（３例）を２４穴プレートに播き、初代培養と同様の条件下でコンフルエントになるまで培養した。
２）Ｅｐｉ Ｌｉｆｅ ｍｅｄｉｕｍに１％ＰＳＮを加えた培地（ＥＬ−）で２４時間の増殖添加剤フリーで培養した後、ＥＬ−培地に、上記で調製した顎嚢胞治療剤（ＰＤ０８９８２８またはＰＤ１７３０７４）をそれぞれ終末濃度０．２μＭ、１μＭまたは５μＭとなるようにＥＬ−培地に加え、４８時間作用させた。
【００３２】
３．顎嚢胞由来細胞の細胞死の評価
細胞死はＷＳＴ‐８：Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学）にて評価した。
【００３３】
４．結果
その結果、図４に示したように、ＰＤ０８９８２８またはＰＤ１７３０７４を加えて作用させたものはいずれも濃度依存的に歯肉上皮細胞の細胞死を誘導することが確認された。従って、本発明の顎嚢胞治療剤は、歯肉上皮細胞とよく似た細胞であるとされているマラッセの上皮遺残由来細胞およびこれを由来とする嚢胞の裏層上皮の細胞死も誘導する可能性が高いことが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
嚢胞壁の線維芽細胞の細胞死を誘導する本発明の顎嚢胞治療剤に加え、本発明者が見出した炎症性メディエーターの産生の促進を阻害するｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分とする顎嚢胞治療剤とを組み合わせることにより、外科的切除以外の薬剤による包括的な顎嚢胞の予防または治療が可能となる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とする顎嚢胞治療剤に関する。さらに詳しくは、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）またはＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）等の受容体チロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とする顎嚢胞治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、角化嚢胞性歯原性腫瘍（歯原性角化嚢胞）等の顎嚢胞に対しては、外科的切除以外に治療方法がなく、顎嚢胞のひとつである歯根嚢胞においては、初発に感染根管治療を行うことも可能ではあるが、この治療が奏功しない場合には、やはり外科的切除するしかなかった。しかし、外科的切除をすると骨に大きな空洞ができるため、生体への侵襲が大きいという問題があった。
【０００３】
本発明者らは、この問題に着目し、外科的切除以外の顎嚢胞の治療方法を模索してきた。そして、歯根嚢胞壁で産生されるＰＧＥ2（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ2）が歯根嚢胞由来の線維芽細胞様細胞（Ｒａｄｉｃｕｌａｒ ｃｙｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ、以下、ＲＣ細胞（ＲＣＦ）とする）および角化嚢胞性歯原性腫瘍（歯原性角化嚢胞）由来の線維芽細胞様細胞（Ｏｄｏｎｔｏｇｅｎｉｃ ｋｅｒａｔｏｃｙｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ、以下、ＫＣ細胞（ＫＣＦ）とする）を刺激することにより、ＩＬ−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）、ＩＬ−１１（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１１）、ＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）等の炎症性メディエーターの産生が促進され、嚢胞の拡大に繋がることを確認した。そこで、このシグナル伝達機構に関与するｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤により、炎症性メディエーターの産生の促進を阻害したところ、嚢胞の拡大が抑制できることを見出した。
【０００４】
これにより、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分とする顎嚢胞治療剤を本発明者が得たところ（例えば、特許文献１参照）、この顎嚢胞治療剤は、顎嚢胞の予防や治療において強い期待が寄せられる薬剤であった。そこで、本発明者らはさらに有用な薬剤を検討したところ、本発明において、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦまたはＰＤＧＦ等の受容体チロシンキナーゼ阻害剤が、顎嚢胞の予防や治療において有用であることを見出した。
受容体チロシンキナーゼ阻害剤は、腫瘍、乾癬、肺線維症、多嚢胞性腎疾患等の増殖性疾患や嚢胞性線維症等の治療に用い得ることが示唆されているものの（例えば、特許文献２、３参照）、顎嚢胞に対する効果は知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−２６０７０３号公報
【特許文献２】特開平１０−２１８７６８号公報
【特許文献３】特開平２００９−５２９０４７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新たな顎嚢胞治療剤の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦまたはＰＤＧＦ等の受容体チロシンキナーゼ阻害剤が、顎嚢胞の嚢胞壁を主要に構成する線維芽細胞の細胞死を誘導することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明によって得られた、受容体チロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とする顎嚢胞治療剤は、嚢胞内に直接局所投与等することができ、嚢胞壁の線維芽細胞の細胞死を誘導することで、嚢胞の消滅や、嚢胞の拡大予防に利用できる。
また、本発明の顎嚢胞治療剤と、炎症性メディエーターの産生の促進を阻害することで嚢胞の拡大が抑制する、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分とする顎嚢胞治療剤とを組み合わせることにより、顎嚢胞の薬剤による予防または治療を包括的に行うことも可能となる。
【０００８】
すなわち、本発明は次の（１）〜（５）の顎嚢胞顎嚢胞治療剤等に関する。
（１）チロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とする顎嚢胞治療剤。
（２）チロシンキナーゼ阻害剤がＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）またはＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ）の受容体チロシンキナーゼ阻害剤である上記（１）に記載の顎嚢胞治療剤。
（３）チロシンキナーゼ阻害剤が１−（２−Ａｍｉｎｏ−６−（２，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｏ［２，３−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−７−ｙｌ）−３−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｕｒｅａまたは１−ｔ−Ｂｕｔｙｌ−３−（６−（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ）−ｐｙｒｉｄｏ［２，３−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−７−ｙｌ） ｕｒｅａである上記（１）または（２）に記載の顎嚢胞治療剤。
（４）嚢胞内に局所投与して用いる上記（１）〜（３）のいずれかに記載の顎嚢胞治療剤。
（５）顎嚢胞が歯根嚢胞または角化嚢胞性歯原性腫瘍である上記（１）〜（４）のいずれかに記載の顎嚢胞治療剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の顎嚢胞治療剤は、嚢胞内への直接局所投与が可能であるため人体に与える副作用が少なく有用である。また、嚢胞壁の線維芽細胞の細胞死を誘導する本発明の顎嚢胞治療剤と、炎症性メディエーターの産生の促進を阻害するｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分とする顎嚢胞治療剤とを組み合わせることにより、薬剤による顎嚢胞の包括的な予防または治療方法を提供することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】顎嚢胞治療剤の顎嚢胞由来細胞への効果を示した図である（試験例１）。
【図２】顎嚢胞治療剤の顎嚢胞由来細胞への効果を示した図である（試験例２）。
【図３】顎嚢胞治療剤の顎嚢胞由来細胞への効果を示した図である（試験例３）。
【図４】顎嚢胞治療剤の歯肉上皮細胞への効果を示した図である（試験例４）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の「顎嚢胞治療剤」は、チロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とし、顎嚢胞の予防または治療に有用な剤のことをいう。有効成分であるチロシンキナーゼ阻害剤のみからなる剤であってもよく、その他薬学的に許容される他の成分を含む剤であってもよい。
【００１２】
本発明の「顎嚢胞治療剤」の有効成分であるチロシンキナーゼ阻害剤は、顎嚢胞の予防または治療に利用できるものであればいずれのものでもあっても良いが、特に、顎嚢胞の嚢胞壁を主要に構成する線維芽細胞の細胞死を誘導することで顎嚢胞の予防または治療に利用できるものであることが好ましい。
このようなチロシンキナーゼ阻害剤として、例えば、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦまたはＰＤＧＦ等の受容体チロシンキナーゼ阻害剤等が挙げられる。本発明の「顎嚢胞治療剤」の有効成分として用いる受容体チロシンキナーゼ阻害剤としては、例えばＥＧＦ、ＦＧＦまたはＰＤＧＦの受容体チロシンキナーゼ阻害剤である１−（２−Ａｍｉｎｏ−６−（２，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｏ［２，３−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−７−ｙｌ）−３−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｕｒｅａ等が挙げられ、これはメルク社の製品番号ＰＤ０８９８２８等、市販のものであってもよい。
また、ＦＧＦまたはＶＥＧＦの受容体チロシンキナーゼ阻害剤である１−ｔ−Ｂｕｔｙｌ−３−（６−（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ）−ｐｙｒｉｄｏ［２，３−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−７−ｙｌ） ｕｒｅａ等が挙げられ、これもメルク社の製品番号ＰＤ１７３０７４（ＦＧＦ／ＶＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ等、市販のものであってもよい。また、これらの化合物の生理学的に許容される塩、例えば塩酸塩も受容体チロシンキナーゼ阻害剤として、本発明の顎嚢胞治療剤の有効成分に含むことができる。
【００１３】
本発明の「顎嚢胞治療剤」の対象となる顎嚢胞としては、歯根嚢胞、角化嚢胞性歯原性腫瘍（歯原性角化嚢胞）等が挙げられる。本発明の「顎嚢胞治療剤」は、顎嚢胞の発生の可能性が高い部位に本発明の組成物を塗布すること等で投与することができる。さらに顎嚢胞の発生の予防を目的とする場合には、根管貼薬として、綿栓やペーパーポイント等に滲み込ませて根管内に投与することができ、外科的切除後の再発防止を目的とする場合には、徐放性となるように、コラーゲンスポンジ等の吸収性の担体を併用して投与することができる。本発明の組成物を予防のために投与する、顎嚢胞の発生の高い部位としては、感染根管治療によって、器械刺激や組織障害を受けやすい、根管治療中の歯等の部位が挙げられる。また、顎嚢胞が発生した後であれば、嚢胞内に局所投与することで、人体に与える副作用の可能性を下げることができる。
【００１４】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１５】
顎嚢胞治療剤
受容体チロシンキナーゼ阻害剤である１−（２−Ａｍｉｎｏ−６−（２，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｏ［２，３−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−７−ｙｌ）−３−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｕｒｅａとして、メルク社の製品番号ＰＤ０８９８２８（ＥＧＦ／ＦＧＦ／ＰＤＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用いた。また１−ｔ−Ｂｕｔｙｌ−３−（６−（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ）−ｐｙｒｉｄｏ［２，３−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−７−ｙｌ） ｕｒｅａとして、メルク社の製品番号ＰＤ１７３０７４（ＦＧＦ／ＶＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を顎嚢胞治療剤として用いた。
【００１６】
［試験例］
顎嚢胞治療剤の効果の確認
材料の調製
１．顎嚢胞治療剤
次の１）および２）の方法により調製したものを用いた。
１）メルク社より購入した粉末のＰＤ０８９８２８を、濃度が１０ｍＭとなるようにジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、以下、ＤＭＳＯとする）で調製し、小分けして、フリーザーに凍結保存した。使用時に終末濃度（０．２〜５μＭ）となるように希釈して用いた。
２）メルク社より購入した粉末のＰＤ１７３０７４を、濃度が１０ｍＭとなるようにＤＭＳＯで調製し、小分けして、フリーザーに凍結保存した。使用時に終末濃度（０．２〜５μＭ）となるように希釈して用いた。
【００１７】
２．顎嚢胞由来細胞
顎嚢胞由来細胞の一つとして、日本大学歯学部付属歯科病院口腔外科、歯内療法科で治療の目的で外科的に摘出され、同病院検査室病理部で歯根嚢胞また角化嚢胞性歯原性腫瘍（歯原性角化嚢胞）と診断された嚢胞組織の一部から、歯根嚢胞由来のＲＣ細胞（ＲＣＦ）と角化嚢胞性歯原性腫瘍（歯原性角化嚢胞）由来のＫＣ細胞（ＫＣＦ）を得た。なお、試料の採取は日本大学歯学部倫理委員会の規定に基いて行った。また、患者には組織の一部が本研究に用いられることをあらかじめ説明し、文書による同意を得た。
【００１８】
１）ＲＣ細胞（ＲＣＦ）
野崎ら（参考文献１参照）の方法に準じて得た。
すなわち、歯根嚢胞由来の組織片を３％の抗生物質溶液（ペニシリン／ストレプトマイシン／ネオマイシン、ＰＳＮ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（Ｗａｋｏ、以下ＤＭＥＭと示す）培地で数回洗浄し、歯科用メス（Ｎｏ．１５、Ｆｅａｔｈｅｒ）で細片化した。２症例の歯根嚢胞から組織片を得て、それぞれ個体別に用いた。６穴プレート（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ）の底に当該組織片をカバースリップで固定後、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）および１％ＰＳＮを含むＤＭＥＭ培地で、３７℃および５％ＣＯ2／９５％ａｉｒの条件下で初代培養を行った。約２週間後、外生した細胞がコンフルエントになった時点で、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞を剥離し、同様の条件下で継代培養を行い、４から７代継代したものをＲＣ細胞（ＲＣＦ）として用いた。
参考文献１：野崎弘晃、大島光宏、山口洋子、小木曽文内、明石俊和、大塚吉兵衛：ＰＧＥ2が歯根嚢胞由来細胞のケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）産生に及ぼす影響；日本歯科保存学雑誌４４、９１７−９２３、２００１
【００１９】
２）ＫＣ細胞（ＫＣＦ）
大島ら（参考文献２参照）の方法に準じて得た。
すなわち、角化嚢胞性歯原性腫瘍（歯原性角化嚢胞）由来の組織片を３％の抗生物質溶液（ペニシリン／ストレプトマイシン／ネオマイシン、ＰＳＮ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ培地で数回洗浄し、歯科用メス（Ｎｏ．１５、Ｆｅａｔｈｅｒ）で細片化した。２症例の角化嚢胞性歯原性腫瘍（歯原性角化嚢胞）から組織片を得て、それぞれ個体別に用いた。６穴プレート（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ）の底に当該組織片をカバースリップで固定後、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）および１％ＰＳＮを含むＤＭＥＭ培地で、３７℃および５％ＣＯ2／９５％ａｉｒの条件下で初代培養を行った。約２週間後、外生した細胞がコンフルエントになった時点で、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞を剥離し、同様の条件下で継代培養を行い、４から７代継代したものをＲＣ細胞（ＲＣＦ）として用いた。
参考文献２：大島崇文ほか：ＰＧＥ2が歯根嚢胞および歯原性角化嚢胞由来細胞のＨＧＦ，ＩＬ−６およびＰＧＥ2産生に及ぼす影響；日本歯科保存学雑誌 ４９（６），７９７−８０９，２００６−１２−３１
【００２０】
［試験例１］
１．顎嚢胞治療剤の顎嚢胞由来細胞への作用
１）上記で継代培養したＲＣ細胞（ＲＣＦ）またはＫＣ細胞（ＫＣＦ）（各２症例）を２４穴プレートに播き、初代培養と同様の条件下でコンフルエントになるまで培養した。
２）コンフルエントに達した細胞に１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に、上記で調製した顎嚢胞治療剤（ＰＤ０８９８２８またはＰＤ１７３０７４）をそれぞれ終末濃度１μＭまたは５μＭとなるように加え、４８時間または９６時間作用させた。
【００２１】
２．顎嚢胞由来細胞の細胞死の評価
細胞死はＷＳＴ‐８：Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学）にて評価した。
【００２２】
３．結果
その結果、図１に示したように、ＰＤ０８９８２８またはＰＤ１７３０７４を加えて作用させたものはいずれも顎嚢胞由来細胞の細胞死を誘導することが確認された。特にＰＤ０８９８２８を終末濃度１μＭまたは５μＭとなるように加えて９６時間作用させたものと、ＰＤ１７３０７４を終末濃度５μＭとなるように加えて９６時間作用させたものは、顎嚢胞由来細胞の細胞死を強く誘導することが確認された。
【００２３】
［試験例２］
１．顎嚢胞治療剤の顎嚢胞由来細胞への作用（無血清状態）
１）上記で継代培養したＲＣ細胞（ＲＣＦ）またはＫＣ細胞（ＫＣＦ）（各２症例）を２４穴プレートに播き、コンフルエントになるまで培養した。
２）無血清のＤＭＥＭ培地で２４時間の血清飢餓を行った後、顎嚢胞治療剤（ＰＤ０８９８２８またはＰＤ１７３０７４）をそれぞれ終末濃度０．２μＭ、１μＭまたは５μＭを含む無血清のＤＭＥＭ培地と交換し、４８時間または９６時間作用させた。
【００２４】
２．顎嚢胞由来細胞の細胞死の評価
細胞死はＷＳＴ‐８：Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学）にて評価した。
【００２５】
３．結果
その結果、図２に示したように、無血清状態（血清に含まれる増殖因子等の影響がない状態）で作用させた場合でも、ＰＤ０８９８２８またはＰＤ１７３０７４を加えて作用させたものはいずれも濃度依存的に顎嚢胞由来細胞の細胞死を誘導することが確認された。
【００２６】
［試験例３］
１．顎嚢胞治療剤の顎嚢胞由来細胞への作用
１）上記で継代培養したＲＣ細胞（ＲＣＦ）またはＫＣ細胞（ＫＣＦ）（各２症例）を２４穴プレートに播き、初代培養と同様の条件下でコンフルエントになるまで培養した。
２）コンフルエントに達した細胞に１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に、上記で調製した顎嚢胞治療剤（ＰＤ０８９８２８またはＰＤ１７３０７４）をそれぞれ終末濃度１μＭまたは５μＭとなるように１％血清を含む培地に加え、６日間または８日間作用させた。
【００２７】
２．顎嚢胞由来細胞の細胞死の評価
細胞死はＷＳＴ‐８：Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学）にて評価した。
【００２８】
３．結果
その結果、図３に示したように、ＰＤ０８９８２８またはＰＤ１７３０７４を加えて作用させたものはいずれも濃度依存的に顎嚢胞由来細胞の細胞死を誘導することが確認された。
ＰＤ０８９８２８またはＰＤ１７３０７４を加えた後、６日間または８日間という長期間経過後でも顎嚢胞由来細胞の細胞死を誘導する効果が確認されたことから、１回の投与で長時間作用を持続できることが示唆され、阻害剤の種類によっては低濃度でも同様の効果が期待された。
【００２９】
［試験例４］
顎嚢胞治療剤の歯肉上皮細胞への作用
本発明の顎嚢胞治療剤が、顎嚢胞を構成する嚢胞の裏層上皮の細胞死を誘導する可能性があるか否かを、歯肉上皮細胞を用いて検討した。嚢胞の裏層上皮は、一般的にマラッセの上皮遺残由来であるとされており、このマラッセの上皮遺残由来細胞と歯肉上皮細胞（いずれも初代培養細胞）は非常によく似た細胞であることが最近報告されている（参考文献３参照）。従って、本発明の顎嚢胞治療剤が歯肉上皮細胞の細胞死を誘導すれば、嚢胞の裏層上皮の細胞死も誘導する可能性が高いと考えられる。
【００３０】
１．試料
１）顎嚢胞治療剤
上記試験例にて調製した顎嚢胞治療剤を用いた。
２）歯肉上皮細胞
歯周外科手術の際に切除され、不要となった歯肉片より、Ｏｈｓｈｉｍａらの方法（参考文献３）によって、ヒト歯肉上皮細胞を得た。
すなわち、歯肉片をディスパーゼ（Ｄｉｓｐａｓｅ、合同酒精）処理した後、上皮組織部分を結合組織部分から剥離した。上皮組織を細切後、組織片をプレート（Ｉ型コラーゲンコート：住友ベークライト）の底に静置し、組織片から外生した細胞を第１代とした。この歯肉上皮細胞を、Ｉ型コラーゲンがコートされたプレート（Ｉ型コラーゲンコート：住友ベークライト）を用い、細胞はＥｐｉ Ｌｉｆｅ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に増殖添加剤（Ｓ７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１％の抗生物質溶液（ＰＳＮ、Ｓｉｇｍａ）を加えた培地（ＥＬ＋）を用いて増殖させた。
コンフルエントに増殖した歯肉上皮細胞を、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）−ＥＤＴＡ溶液を用いてプレートから剥がし、本発明者らが確立した歯肉上皮細胞の培養方法（参考文献４）によって継代培養し、６から１２代継代したものを歯肉上皮細胞として用いた。
参考文献３：Ｍｉｔｓｕｈｉｒｏ Ｏｓｈｉｍａ．， ｅｔ． ａｌ．， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣｙｔｏｋａｉｎｅＰｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｔｓ ｏｆ Ｍａｌａｓｓｅｚ．， Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ ７９， ９１２−９１８， ２００８．
参考文献４：特願２００９−２３１３９９
【００３１】
２．顎嚢胞治療剤の顎嚢胞由来細胞への作用
１）上記で継代培養した歯肉上皮細胞（３例）を２４穴プレートに播き、初代培養と同様の条件下でコンフルエントになるまで培養した。
２）Ｅｐｉ Ｌｉｆｅ ｍｅｄｉｕｍに１％ＰＳＮを加えた培地（ＥＬ−）で２４時間の増殖添加剤フリーで培養した後、ＥＬ−培地に、上記で調製した顎嚢胞治療剤（ＰＤ０８９８２８またはＰＤ１７３０７４）をそれぞれ終末濃度０．２μＭ、１μＭまたは５μＭとなるようにＥＬ−培地に加え、４８時間作用させた。
【００３２】
３．顎嚢胞由来細胞の細胞死の評価
細胞死はＷＳＴ‐８：Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学）にて評価した。
【００３３】
４．結果
その結果、図４に示したように、ＰＤ０８９８２８またはＰＤ１７３０７４を加えて作用させたものはいずれも濃度依存的に歯肉上皮細胞の細胞死を誘導することが確認された。従って、本発明の顎嚢胞治療剤は、歯肉上皮細胞とよく似た細胞であるとされているマラッセの上皮遺残由来細胞およびこれを由来とする嚢胞の裏層上皮の細胞死も誘導する可能性が高いことが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
嚢胞壁の線維芽細胞の細胞死を誘導する本発明の顎嚢胞治療剤に加え、本発明者が見出した炎症性メディエーターの産生の促進を阻害するｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分とする顎嚢胞治療剤とを組み合わせることにより、外科的切除以外の薬剤による包括的な顎嚢胞の予防または治療が可能となる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とする顎嚢胞治療剤。
【請求項２】
チロシンキナーゼ阻害剤がＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）またはＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ）の受容体チロシンキナーゼ阻害剤である請求項１に記載の顎嚢胞治療剤。
【請求項３】
チロシンキナーゼ阻害剤が１−（２−Ａｍｉｎｏ−６−（２，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｏ［２，３−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−７−ｙｌ）−３−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｕｒｅａまたは１−ｔ−Ｂｕｔｙｌ−３−（６−（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ）−ｐｙｒｉｄｏ［２，３−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−７−ｙｌ） ｕｒｅａである請求項１または２に記載の顎嚢胞治療剤。
【請求項４】
嚢胞内に局所投与して用いる請求項１〜３のいずれかに記載の顎嚢胞治療剤。
【請求項５】
顎嚢胞が歯根嚢胞または角化嚢胞性歯原性腫瘍である請求項１〜４のいずれかに記載の顎嚢胞治療剤。
【請求項１】
チロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とする顎嚢胞治療剤。
【請求項２】
チロシンキナーゼ阻害剤がＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）またはＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ）の受容体チロシンキナーゼ阻害剤である請求項１に記載の顎嚢胞治療剤。
【請求項３】
チロシンキナーゼ阻害剤が１−（２−Ａｍｉｎｏ−６−（２，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｏ［２，３−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−７−ｙｌ）−３−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｕｒｅａまたは１−ｔ−Ｂｕｔｙｌ−３−（６−（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ）−ｐｙｒｉｄｏ［２，３−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−７−ｙｌ） ｕｒｅａである請求項１または２に記載の顎嚢胞治療剤。
【請求項４】
嚢胞内に局所投与して用いる請求項１〜３のいずれかに記載の顎嚢胞治療剤。
【請求項５】
顎嚢胞が歯根嚢胞または角化嚢胞性歯原性腫瘍である請求項１〜４のいずれかに記載の顎嚢胞治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−１２３６５（Ｐ２０１２−１２３６５Ａ）
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５２８７２（Ｐ２０１０−１５２８７２）
【出願日】平成２２年７月５日（２０１０．７．５）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月５日（２０１０．７．５）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
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