５α−リダクターゼ阻害剤
本発明は、前立腺ガンや前立腺肥大症、男性型脱毛症、尋常性アクネ、脂漏等の男性ホルモンが関与する疾患の予防や治療のために有効な５α−リダクターゼ阻害剤を提供する。
本発明に係るラノスタン型トリテルペン類、特にガノデリックアシッドＤＭ（ganoderic acid DM）、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）、５−ラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−１５α，２６−ジヒドロキシ−３−オン（5-lanosta-7,9(11),24-triene-15a,26-dihydroxy-3-one）又はチロミシック酸（tyromycic acid）は、高い５α−リダクターゼ阻害活性を有し、前立腺肥大症の予防・治療剤として有効である。
本発明に係るラノスタン型トリテルペン類、特にガノデリックアシッドＤＭ（ganoderic acid DM）、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）、５−ラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−１５α，２６−ジヒドロキシ−３−オン（5-lanosta-7,9(11),24-triene-15a,26-dihydroxy-3-one）又はチロミシック酸（tyromycic acid）は、高い５α−リダクターゼ阻害活性を有し、前立腺肥大症の予防・治療剤として有効である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５α−リダクターゼ阻害作用を有し、前立腺ガンや前立腺肥大症、男性型脱毛症等の予防や治療に有効な５α−リダクターゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺ガンや前立腺肥大症、男性型脱毛症、尋常性アクネ、脂漏等の疾患は、男性ホルモン刺激の増大に起因することが知られている。
これら男性ホルモンが関与する種々の疾患は、男性ホルモンの主体であるテストステロンが重要な役割を有している。５α−リダクターゼはこのテストステロンをジヒドロテストステロンに変換する酵素で、その阻害剤は上記疾患の予防や治療のために有効である。
このため、これらの疾患の徴候は、５α−リダクターゼの活性を阻害することにより低減あるいは防止することができると考えられ、５α−リダクターゼを特異的に阻害する様々な阻害剤が見出され、合成されてきた。
【０００３】
特に、前立腺肥大症は、泌尿器科領域における老人性疾患のうちで最も重要なものの一つであるが、未だ本症の解明は十分にはなされていない。その治療には外科的摘除術が最も有効であるといわれているが、本症の患者は高齢者であり、手術を拒んだり、手術すること自体が不可能な場合も多く、摘除までに至らない初期の症状に対しては、他の治療法が望まれる。また、排尿障害による腎障害や愁疎が除去されるならば、むしろ保存的療法の方が望ましい。
近年、高齢化社会の到来に伴い、より優れた前立腺肥大症の治療および予防剤の必要性が益々高まっている。
【０００４】
従来、前立腺肥大症に伴う排尿障害を改善する薬剤としては、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニンおよびアミノ酢酸を配合したアミノ酸製剤、セルニチンポーレンエキスを含有する花粉製剤、オオウメガサソウ等の数種の植物エキスを含有する製剤等の経口剤が用いられている他、豚前立腺抽出物を含有する筋肉注射剤も汎用されている。
最近、前立腺の増殖した肥大結節がアンドロゲン依存性を有していることが明らかにされるに至り、前立腺肥大を直接抑制する効果の期待できる抗アンドロゲン剤として、酢酸クロルマジノン等の経口剤、オキセドロンおよびカプロン酸ゲストノロン等の筋肉注射剤が開発され、市販に供されている。
しかしながら、従来の阻害剤はステロイド構造又はステロイド類似構造を有しており、ホルモン様作用等の副作用が問題となるケースが多く、安全性の点から実用性に乏しく、また、筋肉注射は患者に苦痛を与え、局所硬結の恐れもあり、治療には比較的長期間を要するために通院という制約が生じるという種々の問題があった。
【０００５】
一方、マンネンタケ（霊芝）には数々の薬効が伝承されており、特にガンに効くキノコとして知られているが、様々な生理作用を及ぼす物質が存在することが証明されている。そして、本発明者らは、マンネンタケ（霊芝）のアルコール類等によって抽出した抽出物が、５α−リダクターゼ活性阻害作用を有し、前立腺の肥大を抑制することを見出し、先に出願した。しかしながら、マンネンタケ（霊芝）抽出物中には多数の化合物が存在していることが知られ、種々同定されているが、それらのうちどのような化合物が５α−リダクターゼ活性阻害作用を有しているか、知られていなかった。
【０００６】
【非特許文献１】菊地 徹，霊芝の生理活性成分の研究，Pharma Medica, 1988年，Vol. 6, 増刊号，pp. 110-125
【非特許文献２】FS Wang, H Cai, JS Yang, YM Zhang, CY Hou, JQ Liu, MJ Zhao (1997), Syudies on the ganoderic acid, a new constituents from the fruiting body of Ganoderma lucidum (Fr) Karst, Acta Pharmceutica Sinica, 32(6): 447-450
【非特許文献３】Antonio G. Gonzales et al., J. Nat. Prod., 62, 1700-1701 (1999)
【非特許文献４】Jiyuan Ma et al., J. Nat. Prod., 65, 1700-1701 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の課題は、マンネンタケ（霊芝）抽出物中の種々の化合物を検索し、それらの化合物の中から、前立腺ガンや前立腺肥大症、男性型脱毛症、尋常性アクネ、脂漏等の男性ホルモンが関与する疾患の予防や治療のために有効な化合物を見出し、それらを５α−リダクターゼ阻害剤及び前立腺肥大症の予防・治療剤として提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため、α−リダクターゼ阻害活性を指標として、マンネンタケからの抽出物を検索した結果、マンネンタケから抽出される化合物の中に、極めて高い５α−リダクターゼ作用を阻害する物質が存在することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［７］に記載した事項により特定される。
［１］ ラノスタン型トリテルペン類を有効成分として含有する５α−リダクターゼ阻害剤。
［２］ ラノスタン型トリテルペン類がマンネンタケ由来のものである、［１］記載の５α−リダクターゼ阻害剤。
［３］ ラノスタン型トリテルペン類が、ガノデリックアシッドＤＭ（ganoderic acid DM）、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）、５−ラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−１５α，２６−ジヒドロキシ−３−オン（5-lanosta-7,9(11),24-triene-15a,26-dihydroxy-3-one）又はチロミシック酸（tyromycic acid）である、［１］又は［２］記載の５α−リダクターゼ阻害剤。
【００１０】
［４］ １５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）。
［５］ ラノスタン型トリテルペン類を有効成分として含有する前立腺肥大症の予防・治療剤。
［６］ ラノスタン型トリテルペン類がマンネンタケ由来のものである、［５］記載の前立腺肥大症の予防・治療剤。
［７］ ラノスタン型トリテルペン類が、ガノデリックアシッドＤＭ（ganoderic acid DM）、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）、５−ラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−１５α，２６−ジヒドロキシ−３−オン（5-lanosta-7,9(11),24-triene-15a,26-dihydroxy-3-one）又はチロミシック酸（tyromycic acid）である［５］又は［６］記載の前立腺肥大症の予防・治療剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の５α−リダクターゼ阻害剤は、前立腺ガンや前立腺肥大症、男性型脱毛症、尋常性アクネ、脂漏等の男性ホルモンが関与する疾患の予防や治療のために有効であるとともに、合成ステロイド化合物ではなく、天然物であるため安全性に優れる。また、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）は、新規化合物であり、特に優れた５α−リダクターゼ阻害活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ガノデリックアシッドＤＭのＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルである。
【図２】ガノデリックアシッドＤＭによる５α−リダクターゼ阻害活性（inhibition activity）の濃度依存曲線である。
【図３】分画前のマンネンタケ抽出物による５α−リダクターゼ阻害活性（inhibition activity）の濃度依存曲線である。
【図４】実施例３で行ったマンネンタケ抽出物の分画スキームである。
【図５】実施例３で得られた、エタノール抽出物の分画物Ｆｒ．Ｇ−５のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６】実施例３で得られた、エタノール抽出物の分画物Ｆｒ．Ｇ−５中のＨＰＬＣ分析における保持時間１９．８分と２０．５分の成分のそれぞれのＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルである。
【図７】実施例４で得た新規化合物の、ＨＭＢＣスペクトルから得た相関図である。
【図８】１５−（Ｒ）−（＋）−ＭＴＰＡエステル（ａ）と１５−（Ｓ）−（−）−ＭＴＰＡエステル（ｂ）の１Ｈ−ＮＭＲのケミカルシフトの差を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の５α−リダクターゼ阻害剤及び前立腺肥大症の予防・治療剤は、ラノスタン型トリテルペン類を有効成分として含有する。本発明に係るラノスタン型トリテルペン類は、ラノスタン骨格を有し、ガノデリックアシッドＤＭのようなガノデリックアシッド類のみならず、２４−トリエン−１５α，２６−ジヒドロキシ−３−オン（5-lanosta-7,9(11),24-triene-15a,26-dihydroxy-3-one）のような他のアルコール類をも包含する。なかでも、ガノデリックアシッドＤＭ（ganoderic acid DM）、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）、５−ラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−１５α，２６−ジヒドロキシ−３−オン（5-lanosta-7,9(11),24-triene-15a,26-dihydroxy-3-one）及びチロミシック酸（tyromycic acid）が、高い５α−リダクターゼ阻害活性と前立腺肥大症の予防・治療効果を示す。
【００１４】
本発明におけるラノスタン型トリテルペン類は、種々の菌類から得られるが、一般的に霊芝と言われるマンネンタケ（万年茸）（Ganoderma lucidum）より得られた抽出物から得られる。
本発明に用いるマンネンタケ（万年茸）（Ganoderma lucidum）は、ヒダナシタケ目サルノコシカケ科に属する担子菌であり、古来中国では霊芝又は芝草と呼ばれ、日本ではレイシ、サイワイタケと呼ばれている、マンネンタケ目（Ganodermatales）に属するマンネンタケ科（Ganodermataceae）中のマンネンタケ属（Ganoderma）のキノコである。
【００１５】
本発明に用いるマンネンタケの抽出については、メタノール、ｎ−ヘキサン、エタノール、エーテル、酢酸エチル等の有機溶媒や水が用いられ、これらに含浸させ放置することにより抽出する、有機溶媒抽出法ならびにソックスレー抽出器を用いた加熱還流によるソックスレー抽出法が適用可能であるが、これらの方法に限定されるものではない。
例えば、メタノール抽出法については、霊芝（マンネンタケ）子実体５．０ｇを粉砕し、メタノール６０ｍｌを加え、室温で一日放置し、抽出液を取り出し、残渣にさらにメタノールを加えて抽出する方法である。この操作を計３回行い、得られた抽出液を合わせて濃縮・乾固させることにより、抽出物を調製する。
【００１６】
本発明におけるラノスタン型トリテルペン類の単離および精製は、実施例に記載する方法による、５α−リダクターゼ阻害活性を指標として、各種クロマトグラフィー（シリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相分取液体クロマトグラフィー等）によって分画操作を繰り返すことにより達成できるが、これらの方法に限定されるものではない。このようにして分画、単離、精製することにより、５α−リダクターゼ活性を有する、ガノデリックアシッドＤＭ（ganoderic acid DM）、ガノデレニックアシッド（ganoderenic acid）、等のガノデリックアシッド類、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）、チロミシック酸（tyromycic acid）等の酸類、５−ラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−１５α，２６−ジヒドロキシ−３−オン（5-lanosta-7,9(11),24-triene-15a,26-dihydroxy-3-one）、ガノデルマジオール（ganodermadiol）、ルシデュモルＢ（lucidumol B）、ガノデルマノノトリオール（ganodermanontriol）等のアルコール類を含む、種々のラノスタン型トリテルペン類が得られる。
【００１７】
特に、ガノデリックアシッドＤＭ（ganoderic acid DM）、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）、５−ラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−１５α，２６−ジヒドロキシ−３−オン（5-lanosta-7,9(11),24-triene-15a,26-dihydroxy-3-one）及びチロミシック酸（tyromycic acid）が、極めて高い５α−リダクターゼ阻害活性を示し、それらのＩＣ５０は、それぞれ１０．６μＭ、８．５μＭ、４１．９μＭ、２５１μＭである。ちなみに、ガノデリックアシッドＤＭは、その原料であるエタノール抽出物と比較して、その１／１９の濃度で同等の５α−リダクターゼ阻害活性を示す。
なお、それらの化合物のうち、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）は、文献に記載のない新規化合物である。
【００１８】
本発明の５α−リダクターゼ阻害剤中におけるラノスタン型トリテルペン類の含有量は、必要に応じて適宜選択すれば良いが、例えば単位投薬量形状あたり１μｇ〜１００ｍｇとすることができる。
【００１９】
本発明に係る５α−リダクターゼ阻害剤は、製薬的に許容される担体等の添加剤を含有し得る。具体的には、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、増粘剤；液状製剤における溶剤、分散剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等として配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物を用いることもできる。賦形剤の好適な例としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等が挙げられる。滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等が挙げられる。増粘剤の好適な例としては、例えば天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体等が挙げられる。溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マルクゴール、ゴマ油、トウモロコシ油等が挙げられる。分散剤の好適な例としては、例えば、ツイーン（Tween）８０、ＨＣＯ６０、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸クセリセリン等の界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。無痛化剤の好適な例としては、例えばベンジルアルコール等が挙げられる。防腐剤の好適な例としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜流酸塩、アスコルビン酸等が挙げられる。
【００２０】
本発明の５α−リダクターゼ阻害剤は、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、ドリンク剤等の経口投与の他、静脈内点滴もしくは注射等の全身経路による投与、あるいは筋肉内注射等の非経口投与、経腸投与、局所投与し得る。医薬製剤の具体例を以下に示す。
【００２１】
（１）錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤：本発明の医薬組成物に、例えば賦形剤、崩壊剤、結合剤または滑沢剤等を添加して圧縮成型し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のためのコーティングを行うことにより製造することができる。
【００２２】
（２）注射剤：本発明の阻害剤を、例えば分散剤、保存剤、等張化剤等と共に水性注射剤として、あるいはオリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油等の植物油、プロピレングリコール等に溶解、懸濁あるいは乳化して油性注射剤として成型することにより製造することができる。
【００２３】
（３）外用剤：本発明の阻害剤を固状、半固状または液状の組成物とすることにより製造される。例えば、上記固状の組成物は、該阻害剤をそのまま、あるいは賦形剤、増粘剤などを添加、混合して粉状とすることにより製造される。
上記液状の組成物は、注射剤の場合とほとんど同様で、油性あるいは水性懸濁剤とすることにより製造される。半固状の組成物は、水性または油性のゲル剤、あるいは軟膏状のものがよい。また、これらの組成物は、いずれも緩衝剤、防腐剤などを含んでいてもよい。
【００２４】
（４）座剤：本発明の阻害剤を油性または水性の固状、半固状あるいは液状の組成物とすることにより製造される。このような組成物に用いる油性基剤としては、例えば、高級脂肪酸のグリセリド（例えば、カカオ脂、ウイテプゾル類等）、中級脂肪酸（例えば、ミグリオール類等）、あるいは植物油（例えば、ゴマ油、大豆油、綿実油等）等が挙げられる。水性ゲル基剤としては、例えば天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体等が挙げられる。
【００２５】
本発明の５α−リダクターゼ阻害剤は、当該技術分野において従来から用いられている公知の抗腫瘍剤を含む他の治療薬と組み合わせて使用してもよい。かかる従来から用いられている抗腫瘍剤の好適な例としては、アドリアマイシン、シスプラチン、コルヒチン、ＣＣＮＵ（Lomastine)、ＢＣＮＵ（Carmustine) 、アクチノマイシンＤ、５−フルオロウラシル、チオテパ、サイトシンアラビノシド、シクロホスファミド、マイトマイシンＣ等の一種又は二種以上の混合物が挙げられる。
【００２６】
本発明の５α−リダクターゼ阻害剤は、一般に体重１ｋｇ当たり１．０μｇ〜１００ｍｇの１日当たり投与量で、１乃至数回に分けて投与されるが、薬学的な有効量及び投与方法又は投与手段、治療期間は対象患者や動物の病理状態に左右される。
【００２７】
本発明のガノデリックアシッド類は、５α−リダクターゼ阻害作用を有するので、哺乳動物、特にヒトにおける５α−リダクターゼによるジヒドロテストステロンの産生過剰に起因する疾患、例えば、前立腺ガンや前立腺肥大症、男性型脱毛症、尋常性アクネ、脂漏等の予防、治療に好適に用いることができる。また、その他の医薬品、医薬外品、化粧品等への応用も可能であり、例えば、育毛料、養毛料等にも利用できる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例をもって本発明を更に詳細に説明する。
実施例１
エタノールによる抽出
１５ｋｇのマンネンタケ（霊芝）子実体を、１２６ＬのＥｔＯＨ（９５％）に浸漬し、１６時間撹拌した。撹拌終了後、advantec東洋製濾紙Ｎｏ．２を用いて濾過し、濾過液をロータリーエバポレーターを用いて減圧下で濃縮した。濃縮液１Ｌに５倍量の純水を加え、凍結乾燥した。固体の抽出物として５７１．１ｇを得た。
【００２９】
５α−リダクターゼ阻害活性の測定
ＳＤ系雌ラット肝臓をホモジナイズしたものからミクロソーム画分を調製し、−８０℃で凍結保存しているものを５α−リダクターゼ粗酵素液とした。
反応系は全量３００μｌの系とした。［４−14Ｃ]−テストステロン（８ｎＣｉ、０．７μＭ、全テストステロン中の０．５％程度が放射活性をもつ基質）およびコールドのテストステロンを含む４．５ｍＭエタノール溶液１０μｌ（反応系の最終濃度が０．１５ｍＭ）、１ｍＭジチオトレイトールを含む２０ｍＭリン酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）２２０μｌ、サンプルのＤＭＳＯ溶液１０μｌを添加し、３７℃、１０分間インキュベートした。コントロールとしては、ＤＭＳＯのみを加えた。
インキュベート後、１ｍＭ−ＮＡＤＰＨ−ｂｕｆｆｅｒ溶液５０μｌと、先に調製した５α−リダクターゼ粗酵素液１０μｌを添加して反応をスタートした。３７℃、１０分間インキュベート後、３Ｍ−ＮａＯＨ水溶液を１０μｌ添加して反応を止めた。エーテル９００μｌを反応系に加えてボルテックスで攪拌することによってステロイド類を抽出し、このうち２００μｌをＴＬＣ板上にアプライした。展開溶媒として酢酸エチル：ｎ−ヘキサン（７：３）の混合溶媒で２度展開し、このＴＬＣ板上の放射活性をイメージングアナライザー（ＦＲＡ−５０００ＲＦ、Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ Ｃｏ． Ｌｔｄ．）で計測した。
なおここで、ｍＭ、Ｍとの記載は、ｍｍｏｌ／Ｌ、ｍｏｌ／Ｌを表す。
コントロール（阻害剤なし）の活性を酵素活性１００％として、下記式（１）及び式（２）のように計算し、またＩＣ５０を求めた。
５α−リダクターゼ活性（％）＝（ジヒドロテストステロンのスポットの放射活性／アプライした位置から溶媒を展開させた上限までのＴＬＣ板全体の放射活性）×１００ （１）
５α−リダクターゼ阻害活性（inhibition activity）（％）＝｛（コントロールの活性−サンプルの活性）／コントロールの活性｝×１００ （２）
【００３０】
マンネンタケ抽出物の分画
上記で得られたマンネンタケのエタノール抽出物（５７１．１ｇ）をシリカゲルカラム（１００×１０ｃｍ）で分画した。溶離液としてヘキサン−酢酸エチルグラジエント系で行った。さらに、５α−リダクターゼ阻害活性を指標に、ヘキサン−酢酸エチルグラジエント系で、シリカゲルカラムクロマトを繰り返すことにより分画し、５α−リダクターゼ活性成分（１７０ｍｇ）を単離した。この成分をシリカゲルＴＬＣ板上にｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝７０：３０で展開したときのＲｆ値が０．１４であった（ヨウ素で発色）。
この成分のＩＲ、ＮＭＲ、融点を以下に示す。
融点：２０３−２０５℃
ＩＲ：3402（OH）、1711、1679、1660（C=O）、1587ｃｍ−１
１Ｈおよび１３ＣＮＭＲデータ（δ（ｐｐｍ）、溶媒：ＣＤＣｌ３）を表１に示す。
【００３１】
【表１】
以上の分析値を文献１）の値と比較し、本成分をのガノデリックアシッドＤＭ（ganoderic acid）と同定した。
１）FS Wang, H Cai, JS Yang, YM Zhang, CY Hou, JQ Liu, MJ Zhao (1997), Studies on the ganoderic acid, a new constituents from the fruiting body of Ganoderma lucidum (Fr.) Karst, Acta Pharmaceutica Sinica, 32 (6): 447-450
【００３２】
また、以下の条件で測定したＨＰＬＣクロマトグラフ分析において、ガノデリックアシッドＤＭは、２０．７分の保持時間を有した。また、そのＵＶ−ＶＩＳスペクトルを図１に示す。ガノデリックアシッドＤＭは、２１８及び２５４ｎｍに極大吸収波長を有した。
ＨＰＬＣ測定条件
カラム：ＩｎｔｅｒｓｉｌＯＤＳ３（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）
流動相：メタノール：水（８０：２０）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＰＤＡ（フォトダイオードアレイ）検出器
【００３３】
ガノデリックアシッドＤＭとエタノール抽出物の５α−リダクターゼ阻害活性（inhibition
activity）
各種濃度のガノデリックアシッドＤＭとを用いて、５α−リダクターゼ阻害活性（inhibition activity）を測定し、濃度依存曲線を作成した。結果を図２に示す。濃度依存曲線から、ＩＣ５０は１０．６μＭ（５ｐｐｍ）であった。比較するために、分画前のマンネンタケ抽出物の５α−リダクターゼ阻害活性（inhibition activity）の濃度依存曲線を図３に示す。マンネンタケ抽出物のＩＣ５０は９３．６ｐｐｍであった。マンネンタケ抽出物のＩＣ５０は、ガノデリックアシッドＤＭのＩＣ５０より１９倍大きい値を示した。
【００３４】
実施例２
前立腺肥大モデル動物へのガノデリックアシッドＤＭの投与による抑制効果
in vitro実験において高い5α−リダクターゼ阻害活性を示すガノデリックアシッドＤＭが、in vivoで前立腺肥大を抑制するかを検証するために、前立腺肥大モデルラットを用い実験を行った。
３週齢ＳＤラット雄（日本チャールズリバー（株））を１週間予備飼育した後、精巣を除去しその４日後より連日７日間テストステロンを１００μｇ／ａ／０．２ｍｌ皮下投与した（前立腺肥大コントロール群）。実験群はテストステロン投与と同時に、ガノデリックアシッドＤＭを０．５％メチルセルロース溶液に懸濁させゾンデにて強制経口投与を行った。
ここで、ラットは室温２３．０＋０．５℃、湿度５５＋５％で午前７時より午後７時までの１２時間を明期とした明暗サイクル下で飼育、餌および水は自由に与えた。
１８時間絶食後、ペントバルビタール麻酔下で採血後、前立腺を摘出した。前立腺重量を測定し、体重比で表した。
その結果を表２に示す。
【００３５】
【表２】
表２よりガノデリックシッドＤＭは０．００１および０．０１ｍｇ／ｋｇ投与で有意に前立腺肥大を抑制した。
in vitroでの強い５α−リダクターゼ阻害活性を示すガノデリックシッドＤＭは、in vivoで前立腺肥大抑制効果を示した。
【００３６】
実施例３
実施例１で得たエタノール抽出物（５７１．１ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１００×１０ｃｍ）で分画した。各分画物はＴＬＣ（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝７０：３０、ヨウ素発色）によってグル−ピングし、Ｆｒ．Ａ（脂肪酸画分）、Ｆｒ．Ｂ(α−リダクターゼ阻害活性あり：ガノデリックアシッド類含有画分)とＦｒ．Ｃ（活性なし）画分を得た。Ｆｒ．Ｂには、５α−リダクターゼ阻害活性、前立腺肥大症抑制効果がともに観察された。Ｆｒ．Ｂをさらに図４に従って、溶出溶媒として酢酸エチルならびにヘキサンを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィー にて分画して、Ｆｒ．Ｇ（４．１ｇ）を得た。Ｆｒ．Ｇ−５は、２００ｐｐｍの濃度で４９％の５α−リダクターゼ阻害活性を示した。なお、実施例１のガノデリックアシッドＤＭは、Ｆｒ．Ｈ−５（２．７ｇ）に含まれていた。
Ｆｒ．Ｇ−５を実施例１に記載の条件でＨＰＬＣ分析したクロマトグラムを図５に示す。Ｆｒ．Ｇ−５には、ガノデリックアシッドＤＭの保持時間類似の保持時間１９．８分と２０．５分に２つの成分を含んでいた。このそれぞれの成分のＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルを図６に示す。いずれの成分もガノデリックアシッドＤＭに特徴的なＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルを示し、２１８及び２５４ｎｍに極大吸収波長を有していた。
【００３７】
実施例４
Ｆｒ．Ｇ−５を更に分画することにより、３種類の化合物を単離した。ＮＭＲ及びＦＡＢＭＳ分析の結果、そのうちの２化合物は、それらのデータが文献値と同一であったので、それぞれ、５−ラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−１５α，２６−ジヒドロキシ−３−オン（5-lanosta-7,9(11),24-triene-15a,26-dihydroxy-3-one）（Gonzalez, Antonio G. et al., J. Nat. Prod., 65(3), 417-421 (2002)）及びチロミシック酸（tyromycic acid）（Quang, Dang Ngoc et al., Chem. & Pharmaceutical Bull. 51(12) (2003)）と同定した。また、実施例１と同様にして測定したこれらの化合物の５α−リダクターゼ阻害活性のＩＣ５０は、それぞれ、４１．９μＭ、２５１μＭであった。
他の白色結晶化合物について、ＵＶ、１Ｄ及び２ＤＮＭＲ、ＦＡＢＭＳ、旋光度、新Ｍｏｓｈｅｒ法の各分析を行った。その結果、ＦＡＢＭＳデータから分子量は４６８であり、２５３ｎｍにα，β−不飽和カルボニルに特徴的な吸収を持っていた。ＮＭＲのデータ（表３に示す）から、７個のメチル基、1個の水酸基とｄｉｅｎｅ構造が観察された。
【００３８】
【表３】
ＨＭＢＣのスペクトルからＣ１５とＣ２６の相関を図７に示した。Ｃ１５位の水酸基の絶対配置は、以下のとおり、新Ｍｏｓｈｅｒ法を用いて測定した（図８）。この化合物と（Ｒ）−（＋）−ＭＴＰＡ及び（Ｓ）−（−）−ＭＴＰＡの試薬を６時間反応させ、分取ＴＬＣで生成して、１５−（Ｒ）−（＋）−ＭＴＰＡエステル（ａ）と１５−（Ｓ）−（−）−ＭＴＰＡエステル（ｂ）を得た。１Ｈ−ＮＭＲで（Ｓ）−（−）−ＭＴＰＡエステルのＨ−１６、Ｈ−１７プロトンシグナルは、（Ｒ）−（＋）−ＭＴＰＡエステルより高磁場で観察されるに対して、（Ｓ）−（−）−ＭＴＰＡエステルのＨ−１４及びＨ−６は、（Ｒ）−（＋）−ＭＴＰＡエステルより低磁場で観察された（図８）。よって、１５位の水酸基はαであった。
以上の結果より、 この化合物の構造は、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）と決定した。
実施例１と同様にして測定したこの化合物の５α−リダクターゼ阻害活性のＩＣ５０は、８．５μＭであった。
【００３９】
実施例５
前立腺肥大モデル動物へのＦｒ．Ｇ−５画分投与による抑制効果
実施例３と同様にテストステロン投与と同時に、Ｆｒ．Ｇ−５をゾンデにて強制経口投与を行い、実施例３と同様にラットを飼育し、餌および水は自由に与えた。
１８時間絶食後、ペントバルビタール麻酔下で採血後、前立腺を摘出した。前立腺重量を測定した。
結果を表３に示す。
【００４０】
【表４】
表４よりＦｒ．Ｇ−５画分０．０１ｍｇ／ｋｇ投与で有意に前立腺肥大を抑制した。
in vitroで５α−リダクターゼ阻害活性を示すｒ．Ｇ−５画分は、in vivoで前立腺肥大抑制効果を示した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５α−リダクターゼ阻害作用を有し、前立腺ガンや前立腺肥大症、男性型脱毛症等の予防や治療に有効な５α−リダクターゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺ガンや前立腺肥大症、男性型脱毛症、尋常性アクネ、脂漏等の疾患は、男性ホルモン刺激の増大に起因することが知られている。
これら男性ホルモンが関与する種々の疾患は、男性ホルモンの主体であるテストステロンが重要な役割を有している。５α−リダクターゼはこのテストステロンをジヒドロテストステロンに変換する酵素で、その阻害剤は上記疾患の予防や治療のために有効である。
このため、これらの疾患の徴候は、５α−リダクターゼの活性を阻害することにより低減あるいは防止することができると考えられ、５α−リダクターゼを特異的に阻害する様々な阻害剤が見出され、合成されてきた。
【０００３】
特に、前立腺肥大症は、泌尿器科領域における老人性疾患のうちで最も重要なものの一つであるが、未だ本症の解明は十分にはなされていない。その治療には外科的摘除術が最も有効であるといわれているが、本症の患者は高齢者であり、手術を拒んだり、手術すること自体が不可能な場合も多く、摘除までに至らない初期の症状に対しては、他の治療法が望まれる。また、排尿障害による腎障害や愁疎が除去されるならば、むしろ保存的療法の方が望ましい。
近年、高齢化社会の到来に伴い、より優れた前立腺肥大症の治療および予防剤の必要性が益々高まっている。
【０００４】
従来、前立腺肥大症に伴う排尿障害を改善する薬剤としては、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニンおよびアミノ酢酸を配合したアミノ酸製剤、セルニチンポーレンエキスを含有する花粉製剤、オオウメガサソウ等の数種の植物エキスを含有する製剤等の経口剤が用いられている他、豚前立腺抽出物を含有する筋肉注射剤も汎用されている。
最近、前立腺の増殖した肥大結節がアンドロゲン依存性を有していることが明らかにされるに至り、前立腺肥大を直接抑制する効果の期待できる抗アンドロゲン剤として、酢酸クロルマジノン等の経口剤、オキセドロンおよびカプロン酸ゲストノロン等の筋肉注射剤が開発され、市販に供されている。
しかしながら、従来の阻害剤はステロイド構造又はステロイド類似構造を有しており、ホルモン様作用等の副作用が問題となるケースが多く、安全性の点から実用性に乏しく、また、筋肉注射は患者に苦痛を与え、局所硬結の恐れもあり、治療には比較的長期間を要するために通院という制約が生じるという種々の問題があった。
【０００５】
一方、マンネンタケ（霊芝）には数々の薬効が伝承されており、特にガンに効くキノコとして知られているが、様々な生理作用を及ぼす物質が存在することが証明されている。そして、本発明者らは、マンネンタケ（霊芝）のアルコール類等によって抽出した抽出物が、５α−リダクターゼ活性阻害作用を有し、前立腺の肥大を抑制することを見出し、先に出願した。しかしながら、マンネンタケ（霊芝）抽出物中には多数の化合物が存在していることが知られ、種々同定されているが、それらのうちどのような化合物が５α−リダクターゼ活性阻害作用を有しているか、知られていなかった。
【０００６】
【非特許文献１】菊地 徹，霊芝の生理活性成分の研究，Pharma Medica, 1988年，Vol. 6, 増刊号，pp. 110-125
【非特許文献２】FS Wang, H Cai, JS Yang, YM Zhang, CY Hou, JQ Liu, MJ Zhao (1997), Syudies on the ganoderic acid, a new constituents from the fruiting body of Ganoderma lucidum (Fr) Karst, Acta Pharmceutica Sinica, 32(6): 447-450
【非特許文献３】Antonio G. Gonzales et al., J. Nat. Prod., 62, 1700-1701 (1999)
【非特許文献４】Jiyuan Ma et al., J. Nat. Prod., 65, 1700-1701 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の課題は、マンネンタケ（霊芝）抽出物中の種々の化合物を検索し、それらの化合物の中から、前立腺ガンや前立腺肥大症、男性型脱毛症、尋常性アクネ、脂漏等の男性ホルモンが関与する疾患の予防や治療のために有効な化合物を見出し、それらを５α−リダクターゼ阻害剤及び前立腺肥大症の予防・治療剤として提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため、α−リダクターゼ阻害活性を指標として、マンネンタケからの抽出物を検索した結果、マンネンタケから抽出される化合物の中に、極めて高い５α−リダクターゼ作用を阻害する物質が存在することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［７］に記載した事項により特定される。
［１］ ラノスタン型トリテルペン類を有効成分として含有する５α−リダクターゼ阻害剤。
［２］ ラノスタン型トリテルペン類がマンネンタケ由来のものである、［１］記載の５α−リダクターゼ阻害剤。
［３］ ラノスタン型トリテルペン類が、ガノデリックアシッドＤＭ（ganoderic acid DM）、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）、５−ラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−１５α，２６−ジヒドロキシ−３−オン（5-lanosta-7,9(11),24-triene-15a,26-dihydroxy-3-one）又はチロミシック酸（tyromycic acid）である、［１］又は［２］記載の５α−リダクターゼ阻害剤。
【００１０】
［４］ １５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）。
［５］ ラノスタン型トリテルペン類を有効成分として含有する前立腺肥大症の予防・治療剤。
［６］ ラノスタン型トリテルペン類がマンネンタケ由来のものである、［５］記載の前立腺肥大症の予防・治療剤。
［７］ ラノスタン型トリテルペン類が、ガノデリックアシッドＤＭ（ganoderic acid DM）、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）、５−ラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−１５α，２６−ジヒドロキシ−３−オン（5-lanosta-7,9(11),24-triene-15a,26-dihydroxy-3-one）又はチロミシック酸（tyromycic acid）である［５］又は［６］記載の前立腺肥大症の予防・治療剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の５α−リダクターゼ阻害剤は、前立腺ガンや前立腺肥大症、男性型脱毛症、尋常性アクネ、脂漏等の男性ホルモンが関与する疾患の予防や治療のために有効であるとともに、合成ステロイド化合物ではなく、天然物であるため安全性に優れる。また、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）は、新規化合物であり、特に優れた５α−リダクターゼ阻害活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ガノデリックアシッドＤＭのＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルである。
【図２】ガノデリックアシッドＤＭによる５α−リダクターゼ阻害活性（inhibition activity）の濃度依存曲線である。
【図３】分画前のマンネンタケ抽出物による５α−リダクターゼ阻害活性（inhibition activity）の濃度依存曲線である。
【図４】実施例３で行ったマンネンタケ抽出物の分画スキームである。
【図５】実施例３で得られた、エタノール抽出物の分画物Ｆｒ．Ｇ−５のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６】実施例３で得られた、エタノール抽出物の分画物Ｆｒ．Ｇ−５中のＨＰＬＣ分析における保持時間１９．８分と２０．５分の成分のそれぞれのＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルである。
【図７】実施例４で得た新規化合物の、ＨＭＢＣスペクトルから得た相関図である。
【図８】１５−（Ｒ）−（＋）−ＭＴＰＡエステル（ａ）と１５−（Ｓ）−（−）−ＭＴＰＡエステル（ｂ）の１Ｈ−ＮＭＲのケミカルシフトの差を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の５α−リダクターゼ阻害剤及び前立腺肥大症の予防・治療剤は、ラノスタン型トリテルペン類を有効成分として含有する。本発明に係るラノスタン型トリテルペン類は、ラノスタン骨格を有し、ガノデリックアシッドＤＭのようなガノデリックアシッド類のみならず、２４−トリエン−１５α，２６−ジヒドロキシ−３−オン（5-lanosta-7,9(11),24-triene-15a,26-dihydroxy-3-one）のような他のアルコール類をも包含する。なかでも、ガノデリックアシッドＤＭ（ganoderic acid DM）、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）、５−ラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−１５α，２６−ジヒドロキシ−３−オン（5-lanosta-7,9(11),24-triene-15a,26-dihydroxy-3-one）及びチロミシック酸（tyromycic acid）が、高い５α−リダクターゼ阻害活性と前立腺肥大症の予防・治療効果を示す。
【００１４】
本発明におけるラノスタン型トリテルペン類は、種々の菌類から得られるが、一般的に霊芝と言われるマンネンタケ（万年茸）（Ganoderma lucidum）より得られた抽出物から得られる。
本発明に用いるマンネンタケ（万年茸）（Ganoderma lucidum）は、ヒダナシタケ目サルノコシカケ科に属する担子菌であり、古来中国では霊芝又は芝草と呼ばれ、日本ではレイシ、サイワイタケと呼ばれている、マンネンタケ目（Ganodermatales）に属するマンネンタケ科（Ganodermataceae）中のマンネンタケ属（Ganoderma）のキノコである。
【００１５】
本発明に用いるマンネンタケの抽出については、メタノール、ｎ−ヘキサン、エタノール、エーテル、酢酸エチル等の有機溶媒や水が用いられ、これらに含浸させ放置することにより抽出する、有機溶媒抽出法ならびにソックスレー抽出器を用いた加熱還流によるソックスレー抽出法が適用可能であるが、これらの方法に限定されるものではない。
例えば、メタノール抽出法については、霊芝（マンネンタケ）子実体５．０ｇを粉砕し、メタノール６０ｍｌを加え、室温で一日放置し、抽出液を取り出し、残渣にさらにメタノールを加えて抽出する方法である。この操作を計３回行い、得られた抽出液を合わせて濃縮・乾固させることにより、抽出物を調製する。
【００１６】
本発明におけるラノスタン型トリテルペン類の単離および精製は、実施例に記載する方法による、５α−リダクターゼ阻害活性を指標として、各種クロマトグラフィー（シリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相分取液体クロマトグラフィー等）によって分画操作を繰り返すことにより達成できるが、これらの方法に限定されるものではない。このようにして分画、単離、精製することにより、５α−リダクターゼ活性を有する、ガノデリックアシッドＤＭ（ganoderic acid DM）、ガノデレニックアシッド（ganoderenic acid）、等のガノデリックアシッド類、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）、チロミシック酸（tyromycic acid）等の酸類、５−ラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−１５α，２６−ジヒドロキシ−３−オン（5-lanosta-7,9(11),24-triene-15a,26-dihydroxy-3-one）、ガノデルマジオール（ganodermadiol）、ルシデュモルＢ（lucidumol B）、ガノデルマノノトリオール（ganodermanontriol）等のアルコール類を含む、種々のラノスタン型トリテルペン類が得られる。
【００１７】
特に、ガノデリックアシッドＤＭ（ganoderic acid DM）、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）、５−ラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−１５α，２６−ジヒドロキシ−３−オン（5-lanosta-7,9(11),24-triene-15a,26-dihydroxy-3-one）及びチロミシック酸（tyromycic acid）が、極めて高い５α−リダクターゼ阻害活性を示し、それらのＩＣ５０は、それぞれ１０．６μＭ、８．５μＭ、４１．９μＭ、２５１μＭである。ちなみに、ガノデリックアシッドＤＭは、その原料であるエタノール抽出物と比較して、その１／１９の濃度で同等の５α−リダクターゼ阻害活性を示す。
なお、それらの化合物のうち、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）は、文献に記載のない新規化合物である。
【００１８】
本発明の５α−リダクターゼ阻害剤中におけるラノスタン型トリテルペン類の含有量は、必要に応じて適宜選択すれば良いが、例えば単位投薬量形状あたり１μｇ〜１００ｍｇとすることができる。
【００１９】
本発明に係る５α−リダクターゼ阻害剤は、製薬的に許容される担体等の添加剤を含有し得る。具体的には、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、増粘剤；液状製剤における溶剤、分散剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等として配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物を用いることもできる。賦形剤の好適な例としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等が挙げられる。滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等が挙げられる。増粘剤の好適な例としては、例えば天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体等が挙げられる。溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マルクゴール、ゴマ油、トウモロコシ油等が挙げられる。分散剤の好適な例としては、例えば、ツイーン（Tween）８０、ＨＣＯ６０、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸クセリセリン等の界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。無痛化剤の好適な例としては、例えばベンジルアルコール等が挙げられる。防腐剤の好適な例としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜流酸塩、アスコルビン酸等が挙げられる。
【００２０】
本発明の５α−リダクターゼ阻害剤は、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、ドリンク剤等の経口投与の他、静脈内点滴もしくは注射等の全身経路による投与、あるいは筋肉内注射等の非経口投与、経腸投与、局所投与し得る。医薬製剤の具体例を以下に示す。
【００２１】
（１）錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤：本発明の医薬組成物に、例えば賦形剤、崩壊剤、結合剤または滑沢剤等を添加して圧縮成型し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のためのコーティングを行うことにより製造することができる。
【００２２】
（２）注射剤：本発明の阻害剤を、例えば分散剤、保存剤、等張化剤等と共に水性注射剤として、あるいはオリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油等の植物油、プロピレングリコール等に溶解、懸濁あるいは乳化して油性注射剤として成型することにより製造することができる。
【００２３】
（３）外用剤：本発明の阻害剤を固状、半固状または液状の組成物とすることにより製造される。例えば、上記固状の組成物は、該阻害剤をそのまま、あるいは賦形剤、増粘剤などを添加、混合して粉状とすることにより製造される。
上記液状の組成物は、注射剤の場合とほとんど同様で、油性あるいは水性懸濁剤とすることにより製造される。半固状の組成物は、水性または油性のゲル剤、あるいは軟膏状のものがよい。また、これらの組成物は、いずれも緩衝剤、防腐剤などを含んでいてもよい。
【００２４】
（４）座剤：本発明の阻害剤を油性または水性の固状、半固状あるいは液状の組成物とすることにより製造される。このような組成物に用いる油性基剤としては、例えば、高級脂肪酸のグリセリド（例えば、カカオ脂、ウイテプゾル類等）、中級脂肪酸（例えば、ミグリオール類等）、あるいは植物油（例えば、ゴマ油、大豆油、綿実油等）等が挙げられる。水性ゲル基剤としては、例えば天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体等が挙げられる。
【００２５】
本発明の５α−リダクターゼ阻害剤は、当該技術分野において従来から用いられている公知の抗腫瘍剤を含む他の治療薬と組み合わせて使用してもよい。かかる従来から用いられている抗腫瘍剤の好適な例としては、アドリアマイシン、シスプラチン、コルヒチン、ＣＣＮＵ（Lomastine)、ＢＣＮＵ（Carmustine) 、アクチノマイシンＤ、５−フルオロウラシル、チオテパ、サイトシンアラビノシド、シクロホスファミド、マイトマイシンＣ等の一種又は二種以上の混合物が挙げられる。
【００２６】
本発明の５α−リダクターゼ阻害剤は、一般に体重１ｋｇ当たり１．０μｇ〜１００ｍｇの１日当たり投与量で、１乃至数回に分けて投与されるが、薬学的な有効量及び投与方法又は投与手段、治療期間は対象患者や動物の病理状態に左右される。
【００２７】
本発明のガノデリックアシッド類は、５α−リダクターゼ阻害作用を有するので、哺乳動物、特にヒトにおける５α−リダクターゼによるジヒドロテストステロンの産生過剰に起因する疾患、例えば、前立腺ガンや前立腺肥大症、男性型脱毛症、尋常性アクネ、脂漏等の予防、治療に好適に用いることができる。また、その他の医薬品、医薬外品、化粧品等への応用も可能であり、例えば、育毛料、養毛料等にも利用できる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例をもって本発明を更に詳細に説明する。
実施例１
エタノールによる抽出
１５ｋｇのマンネンタケ（霊芝）子実体を、１２６ＬのＥｔＯＨ（９５％）に浸漬し、１６時間撹拌した。撹拌終了後、advantec東洋製濾紙Ｎｏ．２を用いて濾過し、濾過液をロータリーエバポレーターを用いて減圧下で濃縮した。濃縮液１Ｌに５倍量の純水を加え、凍結乾燥した。固体の抽出物として５７１．１ｇを得た。
【００２９】
５α−リダクターゼ阻害活性の測定
ＳＤ系雌ラット肝臓をホモジナイズしたものからミクロソーム画分を調製し、−８０℃で凍結保存しているものを５α−リダクターゼ粗酵素液とした。
反応系は全量３００μｌの系とした。［４−14Ｃ]−テストステロン（８ｎＣｉ、０．７μＭ、全テストステロン中の０．５％程度が放射活性をもつ基質）およびコールドのテストステロンを含む４．５ｍＭエタノール溶液１０μｌ（反応系の最終濃度が０．１５ｍＭ）、１ｍＭジチオトレイトールを含む２０ｍＭリン酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）２２０μｌ、サンプルのＤＭＳＯ溶液１０μｌを添加し、３７℃、１０分間インキュベートした。コントロールとしては、ＤＭＳＯのみを加えた。
インキュベート後、１ｍＭ−ＮＡＤＰＨ−ｂｕｆｆｅｒ溶液５０μｌと、先に調製した５α−リダクターゼ粗酵素液１０μｌを添加して反応をスタートした。３７℃、１０分間インキュベート後、３Ｍ−ＮａＯＨ水溶液を１０μｌ添加して反応を止めた。エーテル９００μｌを反応系に加えてボルテックスで攪拌することによってステロイド類を抽出し、このうち２００μｌをＴＬＣ板上にアプライした。展開溶媒として酢酸エチル：ｎ−ヘキサン（７：３）の混合溶媒で２度展開し、このＴＬＣ板上の放射活性をイメージングアナライザー（ＦＲＡ−５０００ＲＦ、Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ Ｃｏ． Ｌｔｄ．）で計測した。
なおここで、ｍＭ、Ｍとの記載は、ｍｍｏｌ／Ｌ、ｍｏｌ／Ｌを表す。
コントロール（阻害剤なし）の活性を酵素活性１００％として、下記式（１）及び式（２）のように計算し、またＩＣ５０を求めた。
５α−リダクターゼ活性（％）＝（ジヒドロテストステロンのスポットの放射活性／アプライした位置から溶媒を展開させた上限までのＴＬＣ板全体の放射活性）×１００ （１）
５α−リダクターゼ阻害活性（inhibition activity）（％）＝｛（コントロールの活性−サンプルの活性）／コントロールの活性｝×１００ （２）
【００３０】
マンネンタケ抽出物の分画
上記で得られたマンネンタケのエタノール抽出物（５７１．１ｇ）をシリカゲルカラム（１００×１０ｃｍ）で分画した。溶離液としてヘキサン−酢酸エチルグラジエント系で行った。さらに、５α−リダクターゼ阻害活性を指標に、ヘキサン−酢酸エチルグラジエント系で、シリカゲルカラムクロマトを繰り返すことにより分画し、５α−リダクターゼ活性成分（１７０ｍｇ）を単離した。この成分をシリカゲルＴＬＣ板上にｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝７０：３０で展開したときのＲｆ値が０．１４であった（ヨウ素で発色）。
この成分のＩＲ、ＮＭＲ、融点を以下に示す。
融点：２０３−２０５℃
ＩＲ：3402（OH）、1711、1679、1660（C=O）、1587ｃｍ−１
１Ｈおよび１３ＣＮＭＲデータ（δ（ｐｐｍ）、溶媒：ＣＤＣｌ３）を表１に示す。
【００３１】
【表１】
以上の分析値を文献１）の値と比較し、本成分をのガノデリックアシッドＤＭ（ganoderic acid）と同定した。
１）FS Wang, H Cai, JS Yang, YM Zhang, CY Hou, JQ Liu, MJ Zhao (1997), Studies on the ganoderic acid, a new constituents from the fruiting body of Ganoderma lucidum (Fr.) Karst, Acta Pharmaceutica Sinica, 32 (6): 447-450
【００３２】
また、以下の条件で測定したＨＰＬＣクロマトグラフ分析において、ガノデリックアシッドＤＭは、２０．７分の保持時間を有した。また、そのＵＶ−ＶＩＳスペクトルを図１に示す。ガノデリックアシッドＤＭは、２１８及び２５４ｎｍに極大吸収波長を有した。
ＨＰＬＣ測定条件
カラム：ＩｎｔｅｒｓｉｌＯＤＳ３（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）
流動相：メタノール：水（８０：２０）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＰＤＡ（フォトダイオードアレイ）検出器
【００３３】
ガノデリックアシッドＤＭとエタノール抽出物の５α−リダクターゼ阻害活性（inhibition
activity）
各種濃度のガノデリックアシッドＤＭとを用いて、５α−リダクターゼ阻害活性（inhibition activity）を測定し、濃度依存曲線を作成した。結果を図２に示す。濃度依存曲線から、ＩＣ５０は１０．６μＭ（５ｐｐｍ）であった。比較するために、分画前のマンネンタケ抽出物の５α−リダクターゼ阻害活性（inhibition activity）の濃度依存曲線を図３に示す。マンネンタケ抽出物のＩＣ５０は９３．６ｐｐｍであった。マンネンタケ抽出物のＩＣ５０は、ガノデリックアシッドＤＭのＩＣ５０より１９倍大きい値を示した。
【００３４】
実施例２
前立腺肥大モデル動物へのガノデリックアシッドＤＭの投与による抑制効果
in vitro実験において高い5α−リダクターゼ阻害活性を示すガノデリックアシッドＤＭが、in vivoで前立腺肥大を抑制するかを検証するために、前立腺肥大モデルラットを用い実験を行った。
３週齢ＳＤラット雄（日本チャールズリバー（株））を１週間予備飼育した後、精巣を除去しその４日後より連日７日間テストステロンを１００μｇ／ａ／０．２ｍｌ皮下投与した（前立腺肥大コントロール群）。実験群はテストステロン投与と同時に、ガノデリックアシッドＤＭを０．５％メチルセルロース溶液に懸濁させゾンデにて強制経口投与を行った。
ここで、ラットは室温２３．０＋０．５℃、湿度５５＋５％で午前７時より午後７時までの１２時間を明期とした明暗サイクル下で飼育、餌および水は自由に与えた。
１８時間絶食後、ペントバルビタール麻酔下で採血後、前立腺を摘出した。前立腺重量を測定し、体重比で表した。
その結果を表２に示す。
【００３５】
【表２】
表２よりガノデリックシッドＤＭは０．００１および０．０１ｍｇ／ｋｇ投与で有意に前立腺肥大を抑制した。
in vitroでの強い５α−リダクターゼ阻害活性を示すガノデリックシッドＤＭは、in vivoで前立腺肥大抑制効果を示した。
【００３６】
実施例３
実施例１で得たエタノール抽出物（５７１．１ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１００×１０ｃｍ）で分画した。各分画物はＴＬＣ（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝７０：３０、ヨウ素発色）によってグル−ピングし、Ｆｒ．Ａ（脂肪酸画分）、Ｆｒ．Ｂ(α−リダクターゼ阻害活性あり：ガノデリックアシッド類含有画分)とＦｒ．Ｃ（活性なし）画分を得た。Ｆｒ．Ｂには、５α−リダクターゼ阻害活性、前立腺肥大症抑制効果がともに観察された。Ｆｒ．Ｂをさらに図４に従って、溶出溶媒として酢酸エチルならびにヘキサンを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィー にて分画して、Ｆｒ．Ｇ（４．１ｇ）を得た。Ｆｒ．Ｇ−５は、２００ｐｐｍの濃度で４９％の５α−リダクターゼ阻害活性を示した。なお、実施例１のガノデリックアシッドＤＭは、Ｆｒ．Ｈ−５（２．７ｇ）に含まれていた。
Ｆｒ．Ｇ−５を実施例１に記載の条件でＨＰＬＣ分析したクロマトグラムを図５に示す。Ｆｒ．Ｇ−５には、ガノデリックアシッドＤＭの保持時間類似の保持時間１９．８分と２０．５分に２つの成分を含んでいた。このそれぞれの成分のＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルを図６に示す。いずれの成分もガノデリックアシッドＤＭに特徴的なＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルを示し、２１８及び２５４ｎｍに極大吸収波長を有していた。
【００３７】
実施例４
Ｆｒ．Ｇ−５を更に分画することにより、３種類の化合物を単離した。ＮＭＲ及びＦＡＢＭＳ分析の結果、そのうちの２化合物は、それらのデータが文献値と同一であったので、それぞれ、５−ラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−１５α，２６−ジヒドロキシ−３−オン（5-lanosta-7,9(11),24-triene-15a,26-dihydroxy-3-one）（Gonzalez, Antonio G. et al., J. Nat. Prod., 65(3), 417-421 (2002)）及びチロミシック酸（tyromycic acid）（Quang, Dang Ngoc et al., Chem. & Pharmaceutical Bull. 51(12) (2003)）と同定した。また、実施例１と同様にして測定したこれらの化合物の５α−リダクターゼ阻害活性のＩＣ５０は、それぞれ、４１．９μＭ、２５１μＭであった。
他の白色結晶化合物について、ＵＶ、１Ｄ及び２ＤＮＭＲ、ＦＡＢＭＳ、旋光度、新Ｍｏｓｈｅｒ法の各分析を行った。その結果、ＦＡＢＭＳデータから分子量は４６８であり、２５３ｎｍにα，β−不飽和カルボニルに特徴的な吸収を持っていた。ＮＭＲのデータ（表３に示す）から、７個のメチル基、1個の水酸基とｄｉｅｎｅ構造が観察された。
【００３８】
【表３】
ＨＭＢＣのスペクトルからＣ１５とＣ２６の相関を図７に示した。Ｃ１５位の水酸基の絶対配置は、以下のとおり、新Ｍｏｓｈｅｒ法を用いて測定した（図８）。この化合物と（Ｒ）−（＋）−ＭＴＰＡ及び（Ｓ）−（−）−ＭＴＰＡの試薬を６時間反応させ、分取ＴＬＣで生成して、１５−（Ｒ）−（＋）−ＭＴＰＡエステル（ａ）と１５−（Ｓ）−（−）−ＭＴＰＡエステル（ｂ）を得た。１Ｈ−ＮＭＲで（Ｓ）−（−）−ＭＴＰＡエステルのＨ−１６、Ｈ−１７プロトンシグナルは、（Ｒ）−（＋）−ＭＴＰＡエステルより高磁場で観察されるに対して、（Ｓ）−（−）−ＭＴＰＡエステルのＨ−１４及びＨ−６は、（Ｒ）−（＋）−ＭＴＰＡエステルより低磁場で観察された（図８）。よって、１５位の水酸基はαであった。
以上の結果より、 この化合物の構造は、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）と決定した。
実施例１と同様にして測定したこの化合物の５α−リダクターゼ阻害活性のＩＣ５０は、８．５μＭであった。
【００３９】
実施例５
前立腺肥大モデル動物へのＦｒ．Ｇ−５画分投与による抑制効果
実施例３と同様にテストステロン投与と同時に、Ｆｒ．Ｇ−５をゾンデにて強制経口投与を行い、実施例３と同様にラットを飼育し、餌および水は自由に与えた。
１８時間絶食後、ペントバルビタール麻酔下で採血後、前立腺を摘出した。前立腺重量を測定した。
結果を表３に示す。
【００４０】
【表４】
表４よりＦｒ．Ｇ−５画分０．０１ｍｇ／ｋｇ投与で有意に前立腺肥大を抑制した。
in vitroで５α−リダクターゼ阻害活性を示すｒ．Ｇ−５画分は、in vivoで前立腺肥大抑制効果を示した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラノスタン型トリテルペン類を有効成分として含有する５α−リダクターゼ阻害剤。
【請求項２】
ラノスタン型トリテルペン類がマンネンタケ由来のものである、１記載の５α−リダクターゼ阻害剤。
【請求項３】
ラノスタン型トリテルペン類が、ガノデリックアシッドＤＭ（ganoderic acid DM）、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）、５−ラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−１５α，２６−ジヒドロキシ−３−オン（5-lanosta-7,9(11),24-triene-15a,26-dihydroxy-3-one）又はチロミシック酸（tyromycic acid）である、１又は２記載の５α−リダクターゼ阻害剤。
【請求項４】
１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）。
【請求項５】
ラノスタン型トリテルペン類を有効成分として含有する前立腺肥大症の予防・治療剤。
【請求項６】
ラノスタン型トリテルペン類がマンネンタケ由来のものである、５記載の前立腺肥大症の予防・治療剤。
【請求項７】
ラノスタン型トリテルペン類が、ガノデリックアシッドＤＭ（ganoderic acid DM）、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）、５−ラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−１５α，２６−ジヒドロキシ−３−オン（5-lanosta-7,9(11),24-triene-15a,26-dihydroxy-3-one）又はチロミシック酸（tyromycic acid）である５又は６記載の前立腺肥大症の予防・治療剤。
【請求項１】
ラノスタン型トリテルペン類を有効成分として含有する５α−リダクターゼ阻害剤。
【請求項２】
ラノスタン型トリテルペン類がマンネンタケ由来のものである、１記載の５α−リダクターゼ阻害剤。
【請求項３】
ラノスタン型トリテルペン類が、ガノデリックアシッドＤＭ（ganoderic acid DM）、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）、５−ラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−１５α，２６−ジヒドロキシ−３−オン（5-lanosta-7,9(11),24-triene-15a,26-dihydroxy-3-one）又はチロミシック酸（tyromycic acid）である、１又は２記載の５α−リダクターゼ阻害剤。
【請求項４】
１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）。
【請求項５】
ラノスタン型トリテルペン類を有効成分として含有する前立腺肥大症の予防・治療剤。
【請求項６】
ラノスタン型トリテルペン類がマンネンタケ由来のものである、５記載の前立腺肥大症の予防・治療剤。
【請求項７】
ラノスタン型トリテルペン類が、ガノデリックアシッドＤＭ（ganoderic acid DM）、１５α−ヒドロキシ−３−オキソラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−２６−オイックアシッド（15a-hydroxy-3-oxolanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid）、５−ラノスタ−７，９（１１），２４−トリエン−１５α，２６−ジヒドロキシ−３−オン（5-lanosta-7,9(11),24-triene-15a,26-dihydroxy-3-one）又はチロミシック酸（tyromycic acid）である５又は６記載の前立腺肥大症の予防・治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７９１６４
【国際公開日】平成１７年９月１日（２００５．９．１）
【発行日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１０１８８（Ｐ２００６−５１０１８８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００２０１３
【国際出願日】平成１７年２月１０日（２００５．２．１０）
【出願人】（８００００００３５）株式会社産学連携機構九州 (34)
【出願人】（０００１０５０５１）クロレラ工業株式会社 (8)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年９月１日（２００５．９．１）
【発行日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００２０１３
【国際出願日】平成１７年２月１０日（２００５．２．１０）
【出願人】（８００００００３５）株式会社産学連携機構九州 (34)
【出願人】（０００１０５０５１）クロレラ工業株式会社 (8)
【Ｆターム（参考）】
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