カチオン性オリゴヌクレオチド、ならびに関連の合成および使用の方法
【課題】診断上または臨床上のモニター目的のためのアンチセンス治療薬および核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて有用なカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを提供すること。
【解決手段】以下の構造（Ｉ）：
を有する少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドであって、ここで、Ｗ、ＸおよびＹ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、本明細書中に規定されるとおりであり、Ｐ＊は２つの異なる立体異性体的配置で存在し得る不斉的なリン原子を表し、そして、さらに結合は立体的に均一である、オリゴヌクレオチド。
【解決手段】以下の構造（Ｉ）：
を有する少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドであって、ここで、Ｗ、ＸおよびＹ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、本明細書中に規定されるとおりであり、Ｐ＊は２つの異なる立体異性体的配置で存在し得る不斉的なリン原子を表し、そして、さらに結合は立体的に均一である、オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は一般に核酸化学に関する。より詳細には、本発明は、カチオン性ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドに関する。さらに、本発明は、このようなオリゴヌクレオチドを調製するための方法および試薬に関する。本発明は、診断上または臨床上のモニター目的のためのアンチセンス治療および核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおける応用を有する。
【背景技術】
【０００２】
背景
改変されたヌクレオシド間ホスホジエステル結合を含む配列特異的オリゴヌクレオチドは、治療的応用のためのアンチセンス分子、および診断または治療の効力のモニター応用のための核酸ハイブリダイゼーションプローブとしての有用性を有する。
【０００３】
好結果のアンチセンス分子および核酸ハイブリダイゼーションプローブは、生理学的条件下で目的の一本鎖または二本鎖の標的核酸配列と特異的に結合しなければならない。このような分子およびプローブはまた、インタクトの細胞によって効果的に取り込まれなければならず、そしてヌクレアーゼ分解に対して抵抗性でなければならない。
【０００４】
ホスホジエステル骨格が、これらの規準を満足する試みにおいて改変されてきた。例えば、ホスホジエステル骨格は、ホスホネート骨格（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８０） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５５：９６５９−９６６５）、ホスホトリエステル骨格（Ｐｌｅｓｓら（１９７７） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６：１２３９−１２５０）またはホスホロチオエート骨格（Ｓｔｅｃら（１９８４） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １０６：６０７７−６０７９）で置換されてきた。
【０００５】
オリゴヌクレオチド骨格改変に対する１つのアプローチは、ヌクレオシド間ホスホジエステル（「ＰＤＥ」）結合の負の電荷を取り除いて中性骨格、例えば、メチルホスホネート（Ｖｙａｚｏｖｋｉｎａら（１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：２４０４−２４０９）、ホスホルアミデート（Ｊａｅｇｅｒら（１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：７２３７−７２４６）またはペプチド核酸（Ｅｇｈｏｌｍら（１９９２） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １１４：１８９５−１８９７）を生成することであった。
【０００６】
オリゴヌクレオチド骨格を改変するための別のアプローチは、アニオン性ＰＤＥ基をカチオン性基で置換することであった。カチオン性置換基は、ホスホルアミデート結合を介してヌクレオシド間リン原子に結合させてきた（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １１０：４４７０−４４７１）。カチオン性基はまた、アニオン性酸素がリン−炭素結合を介してカチオン性基で置換されているホスホネート誘導体を介してオリゴヌクレオチドに導入され得る。従って、骨格が交互の（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ）ホスホジエステルおよび立体異性体的に純粋な（２−アミノエチル）−ホスホネート結合からなるオリゴヌクレオチドの調製、ならびに（アミノメチル）−ホスホネートからなる骨格を含むオリゴヌクレオチドの調製は、それぞれ、Ｆａｔｈｉら（１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：５４１６−５４２４およびＦａｔｈｉら（１９９４） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：４７−５７に報告されている。
【０００７】
Ｐａｔｉｌら（１９９４） Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ． ４：２６６３−２６６６は、立体異性体的に純粋な改変ジヌクレオシドを使用して、交互の立体調節されたアニオン性ホスホロチオエートおよびアニオン性ＰＤＥ結合を有するデカチミジレートを合成する、ホスホロチオエートの立体異性体を含むオリゴチミジレートアナログの合成を報告した。
【０００８】
Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓら（１９９４） Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３：２１３５−２１４９は、予め生成したダイマーを使用して、メトキシホスホルアミデートヌクレオシド間結合を有するオリゴマーを調製した。さらに、オリゴ（ｄＴ）と比較した場合、メトキシホスホルアミデートヌクレオシド間結合を有するオリゴマーは、ポリ（ｄＡ）またはポリ（Ａ）とハイブリダイズしたときの温度安定性の減少を示した。
【０００９】
標準的なホスホジエステルヌクレオシド間結合のみを有するオリゴヌクレオチドより大きな標的核酸への親和性を有するカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドが当該分野において必要とされている。このようなオリゴヌクレオチドは、アンチセンス治療剤、および核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとして役立ち得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
従って、診断上または臨床上のモニター目的のためのアンチセンス治療薬および核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて有用なカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを提供することが本発明の目的である。
【００１１】
カチオン性ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを合成する方法を提供することが本発明の別の局面である。
【００１２】
カチオン性ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用する核酸ハイブリダイゼーションアッセイを提供することが、本発明のなお別の目的である。
【００１３】
本発明の１つの実施態様において、構造（Ｉ）を有するカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドが提供される。
【００１４】
【化１３】
ここで、
Ｗは、Ｏ、ＳおよびＳｅからなる群より選択される；
ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ４）Ｒ５からなる群より独立して選択され、ここでＲ４およびＲ５はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキル、ならびにＮＲ６（Ｒ６はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）からなる群より独立して選択される；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレンおよびＮＲ７（Ｒ７はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）からなる群より選択され、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯ、ＳまたはＮＲ７である；
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択される；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、１〜４のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲ２およびＲ３は、５員環または６員環のアルキルまたはアリール環、またはＮ、ＯもしくはＳを含む複素環を形成するよう結合され得る；そして
ここで、Ｐ＊は２つの異なる立体異性体的配置で存在し得る不斉的なリン原子を表し、
そして、さらにこの結合は立体的に均一（ｓｔｅｒｅｏｕｎｉｆｏｒｍ）である。
【００１５】
本発明の別の実施態様において、交互のカチオン性およびアニオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを提供する。ここで、カチオン性ヌクレオシド間結合は構造（ＩＩ）を有する。
【００１６】
【化１４】
ここで、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は上記の規定の通りであり、ただし、Ｗ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯまたはＳであり、ここでＰは、２つの異なる立体異性体的配置で存在し得るリン原子であってもよいしまたはそうでなくともよく、そしてさらにその結合は立体的に均一であってもよいしまたはそうでなくてもよい。
【００１７】
本発明のなお別の実施態様において、以下の構造（ＩＩ）を有する少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１８】
【化１５】
ここで、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は上記の規定の通りであり、ただし、Ｗ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯまたはＳである。
【００１９】
本発明のさらなる実施態様において、以下の構造（Ｉ）を有する少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを作成するための方法を提供する。
【００２０】
【化１６】
ここで、
Ｗは、Ｏ、ＳおよびＳｅからなる群より選択される；
ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ４）Ｒ５からなる群より独立して選択され、ここでＲ４およびＲ５はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキル、ならびにＮＲ６（Ｒ６はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）からなる群より独立して選択される；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレンおよびＮＲ７（Ｒ７はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）からなる群より選択され、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯ、ＳまたはＮＲ７である；
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択される；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、１〜４個のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲ２およびＲ３は、５員環または６員環のアルキルまたはアリール環、またはＮ、ＯもしくはＳを含む複素環を形成するよう結合され得る；そして
ここで、Ｐ＊は２つの異なる立体異性体的配置で存在し得る不斉的なリン原子を表し、そして、さらにこの結合は立体的に均一であり、この方法は、
（ａ）カチオン性ヌクレオシド間結合および３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ保護基を含む、保護されたカチオン性ヌクレオチドダイマーのポイントラセミ（ｐｏｉｎｔ ｒａｓｅｍｉｃ）混合物を合成する工程；
（ｂ）必要に応じて、上記混合物に立体異性体を溶解する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において単離されたカチオン性ヌクレオチドダイマーを脱保護する工程；
（ｄ）工程（ｃ）において提供された脱保護されたカチオン性ヌクレオチドダイマーを、Ｃｌ−Ｐ（Ｎ（ｉＰｒ）２）−Ｏ−ＢＣＥとの反応によって、対応する３’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮホスホルアミダイト誘導体に変換する工程；および
（ｅ）３’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮホスホルアミダイト誘導体を、オリゴヌクレオチド鎖の保護されていないヒドロキシル含有末端ユニットに結合する工程、
を含む。
【００２１】
本発明のなお別の実施態様において、核酸ハイブリダイゼーションアッセイを提供する。このアッセイは、
（ａ）少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を含む標識されたオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程；
（ｂ）このプローブを一本鎖分析物核酸にハイブリダイズさせて、標識された二重鎖を生成させる工程；および
（ｃ）この標識された二重鎖を検出する工程、
を含む。
【００２２】
さらに、本発明によって、以下が提供される。
（項目１）以下の構造（Ｉ）：
【００２３】
【化１】
を有する少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドであって、ここで；
Ｗは、Ｏ、ＳおよびＳｅからなる群より選択され；
ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ４）Ｒ５、およびＮＲ６からなる群より独立して選択され、ここでＲ４およびＲ５はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群より独立して選択され、Ｒ６はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレンおよびＮＲ７からなる群より選択され、ここで、Ｒ７はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯ、ＳまたはＮＲ７であり；
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、１〜４個のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲ２およびＲ３は、５員環もしくは６員環のアルキルもしくはアリール環、またはＮ−、Ｏ−もしくはＳ−を含む複素環を形成するよう結合され得；そして
ここで、Ｐ＊は２つの異なる立体異性体的配置で存在し得る不斉的なリン原子を表し、
そして、さらに該結合は立体的に均一である、オリゴヌクレオチド。
（項目２）項目１に記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで、前記ヌクレオシド間結合を含むヌクレオチドダイマーのポイントラセミ混合物がシリカゲルカラムクロマトグラフィーを使用して分割される場合、前記カチオン性ヌクレオシド間結合の立体異性体的配置が、最初に溶出した立体異性体の配置に対応する、オリゴヌクレオチド。
（項目３）項目１に記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで、前記ヌクレオシド間結合を含むヌクレオチドダイマーのポイントラセミ混合物がシリカゲルカラムクロマトグラフィーを使用して分割される場合、前記カチオン性ヌクレオシド間結合の立体異性体的配置が、二番目に溶出した立体異性体の配置に対応する、オリゴヌクレオチド。
（項目４）ＺがＮＲ７である、項目２に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目５）Ｒ７がＨである、項目４に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目６）ＸおよびＹがＯである、項目４に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目７）Ｒ１がＣ１〜Ｃ６アルキレンである、項目４に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目８）Ｒ１が（ＣＨ２）３である、項目７に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目９）Ｒ２およびＲ３がＣ１〜Ｃ６アルキルである、項目４に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１０）Ｒ２およびＲ３がＣＨ３である、項目９に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１１）ＷがＳである、項目４に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１２）ＺがＮＲ５である、項目１に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１３）Ｒ５がＨである、項目１２に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１４）Ｒ１がＣ１〜Ｃ６アルキレンである、項目１２に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１５）Ｒ１が（ＣＨ２）２である、項目１４に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１６）Ｒ２およびＲ３が１〜４個のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルである、項目１２に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１７）Ｒ２およびＲ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である、項目１６に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１８）以下の構造（Ｉ）：
【００２４】
【化２】
を有する少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドであって、ここで；
Ｗは、Ｓであり；
ＸおよびＹは、Ｏであり；
Ｚは、ＮＨであり；
Ｒ１は、（ＣＨ２）３であり；
Ｒ２およびＲ３は、ＣＨ３であり；そして
ここで、Ｐ＊は不斉的なリン原子を表し、その結果、結合は、該ヌクレオシド間結合を含むヌクレオチドダイマーのポイントラセミ混合物がシリカゲルカラムクロマトグラフィーを使用して分割される場合に最初に溶出した立体異性体の配置に対応する立体異性体的配置で存在する、オリゴヌクレオチド。
（項目１９）カチオン性およびアニオン性ヌクレオシド間結合を交互に有するオリゴヌクレオチドであって、ここで、該カチオン性ヌクレオシド間結合が以下の構造（ＩＩ）：
【００２５】
【化３】
を有し、ここで；
Ｗは、Ｏ、ＳおよびＳｅからなる群より選択され；
ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ４）Ｒ５、およびＮＲ６からなる群より独立して選択され、ここでＲ４およびＲ５はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群より独立して選択され、Ｒ６はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレンおよびＮＲ７からなる群より選択され、ここで、Ｒ７はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯまたはＳであり；
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、１〜４個のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲ２およびＲ３は、５員環もしくは６員環のアルキルもしくはアリール環、またはＮ−、Ｏ−もしくはＳ−を含む複素環を形成するように結合され得；そして
ここで、Ｐ＊は２つの異なる立体異性体的配置で存在してもよいししなくてもよいリン原子であり、
そして、さらに該結合は立体的に均一であってもよいしそうでなくてもよい、オリゴヌクレオチド。
（項目２０）ＺがＮＲ５である、項目１９に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２１）Ｒ５がＨである、項目２０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２２）ＸおよびＹがＯである、項目２０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２３）Ｒ１がＣ１〜Ｃ６アルキレンである、項目２０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２４）Ｒ１が（ＣＨ２）３である、項目２３に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２５）Ｒ２およびＲ３がＣ１〜Ｃ６アルキルである、項目２０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２６）Ｒ２およびＲ３がＣＨ３である、項目２５に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２７）ＷがＳである、項目２０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２８）Ｒ１がＣ１〜Ｃ６アルキレンである、項目２０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２９）Ｒ１が（ＣＨ２）２である、項目２８に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３０）Ｒ２およびＲ３が１〜４個のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルである、項目２０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３１）Ｒ２およびＲ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である、項目３０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３２）以下の構造（ＩＩ）：
【００２６】
【化４】
を有する少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドであって、ここで；
Ｗは、Ｏ、ＳおよびＳｅからなる群より選択され；
ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ４）Ｒ５、およびＮＲ６からなる群より独立して選択され、ここでＲ４およびＲ５はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群より独立して選択され、Ｒ６はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレンおよびＮＲ７からなる群より選択され、ここで、Ｒ７はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯまたはＳであり；
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、１〜４個のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲ２およびＲ３は、５員環もしくは６員環のアルキルもしくはアリール環、またはＮ−、Ｏ−もしくはＳ−を含む複素環を形成するように結合され得；そして
ここで、Ｐ＊は２つの異なる立体異性体的配置で存在してもよいししなくてもよいリン原子であり、
そして、さらに該結合は立体的に均一であってもよいしそうでなくてもよい、オリゴヌクレオチド。
（項目３３）以下の構造（Ｉ）：
【００２７】
【化５】
を有する少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを作製するための方法であって、ここで：
Ｗは、Ｏ、ＳおよびＳｅからなる群より選択され；
ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ４）Ｒ５および、ＮＲ６からなる群より独立して選択され、ここでＲ４およびＲ５はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群より独立して選択され、Ｒ６はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレンおよびＮＲ７からなる群より選択され、ここで、Ｒ７はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯ、ＳまたはＮＲ７であり；
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、１〜４個のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲ２およびＲ３は、５員環または６員環のアルキルまたはアリール環、またはＮ−、Ｏ−もしくはＳ−を含む複素環を形成するように結合され得；そして
ここで、Ｐ＊は２つの異なる立体異性体的配置で存在し得る不斉的なリン原子を表し、
そして、さらに該結合は該オリゴヌクレオチドの分子間で立体的に均一であり、該方法は、以下の工程：
（ａ）該カチオン性ヌクレオシド間結合および３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ保護基を含む、保護されたカチオン性ヌクレオチドダイマーのポイントラセミ混合物を合成する工程；
（ｂ）必要に応じて、該混合物中の該立体異性体を分割する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において単離された該カチオン性ヌクレオチドダイマーを脱保護する工程；
（ｄ）工程（ｃ）において提供された該脱保護されたカチオン性ヌクレオチドダイマーを、Ｃｌ−Ｐ（Ｎ（ｉＰｒ）２）−Ｏ−ＢＣＥとの反応によって、対応する３’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮホスホルアミダイト誘導体に変換する工程；および
（ｅ）該３’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮホスホルアミダイト誘導体を、オリゴヌクレオチド鎖の保護されていないヒドロキシル含有末端ユニットに結合する工程、
を包含する、方法。
（項目３４）核酸ハイブリダイゼーションアッセイであって、以下の工程：
（ａ）少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を含む標識されたオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程；
（ｂ）該プローブを一本鎖分析物核酸とハイブリダイズさせて標識された二重鎖を生成する工程；および
（ｃ）該標識された二重鎖を検出する工程
を包含する、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ。
（項目３５）前記カチオン性ヌクレオシド間結合が以下の構造（Ｉ）：
【００２８】
【化６】
を有する、項目３４に記載の核酸ハイブリダイゼーションアッセイであって、
ここで：
Ｗは、Ｏ、ＳおよびＳｅからなる群より選択され；
ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ４）Ｒ５、およびＮＲ６からなる群より独立して選択され、ここでＲ４およびＲ５はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群より独立して選択され、Ｒ６はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレンおよびＮＲ７からなる群より選択され、ここで、Ｒ７はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯ、ＳまたはＮＲ７であり；
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、１〜４個のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲ２およびＲ３は、５員環もしくは６員環のアルキルもしくはアリール環、またはＮ−、Ｏ−もしくはＳ−を含む複素環を形成するよう結合され得；そして
ここで、Ｐ＊は２つの異なる立体異性体的配置で存在し得る不斉的なリン原子を表し、
そしてさらに該結合は立体的に均一である、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ。
（項目３６）項目３４に記載の核酸ハイブリダイゼーションアッセイであって、ここで、前記オリゴヌクレオチドプローブは、カチオン性およびアニオン性ヌクレオシド間結合を交互に有し、ここで、該カチオン性ヌクレオシド間結合が以下の構造（ＩＩ）：
【００２９】
【化７】
を有し、ここで；
Ｗは、Ｏ、ＳおよびＳｅからなる群より選択され；
ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ４）Ｒ５、およびＮＲ６からなる群より独立して選択され、ここでＲ４およびＲ５はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群より独立して選択され、Ｒ６はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレンおよびＮＲ７からなる群より選択され、ここで、Ｒ７はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯまたはＳであり；
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、１〜４個のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲ２およびＲ３は、５員環もしくは６員環のアルキルもしくはアリール環、またはＮ−、Ｏ−もしくはＳ−を含む複素環を形成するように結合される、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ。
（項目３７）項目３４に記載の核酸ハイブリダイゼーションアッセイであって、ここで、前記カチオン性ヌクレオシド間結合が以下の構造（ＩＩ）：
【００３０】
【化８】
を有し、ここで；
Ｗは、Ｏ、ＳおよびＳｅからなる群より選択され；
ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ４）Ｒ５、およびＮＲ６からなる群より独立して選択され、ここでＲ４およびＲ５はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群より独立して選択され、Ｒ６はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレンおよびＮＲ７からなる群より選択され、ここで、Ｒ７はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯまたはＳであり；
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、１〜４個のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲ２およびＲ３は、５員環もしくは６員環のアルキルもしくはアリール環、またはＮ−、Ｏ−もしくはＳ−を含む複素環を形成するように結合される、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ。
【００３１】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴は、以下の説明に部分的に記載され、そして以下を検討する際に部分的に当業者に明らかになるか、または本発明の実施によって学ばれ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
定義および名称：
本発明を詳細に開示および記載する前に、本発明が特定のアッセイ方式、材料または試薬（これらはもちろん変化し得る）に限定されないことを理解すべきである。本明細書中で使用される用語は特定の実施態様を記載する目的のためだけであり、そして限定する意図はないことも理解すべきである。
【００３３】
本明細書および添付の請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに別のことを示さない限り、複数の指示物を含むことに注意しなければならない。従って、例えば、「カチオン性ヌクレオシド間結合」を含むオリゴヌクレオチドに対する言及は、２またはそれ以上のカチオン性ヌクレオシド間結合を含む複数のポリヌクレオチドも含む、などである。
【００３４】
本明細書および以下の請求の範囲において、以下の意味を有すると定義される多くの用語に対する言及がなされる：
本明細書において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２’−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリン塩基またはピリミジン塩基のＮーグリコシドまたはＣーグリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド骨格（例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））およびポリモルホリノ（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ；Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ， Ｉｎｃ．（Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ， Ｏｒｅｇｏｎ）からＮｅｕｇｅｎｅＴＭポリマーとして市販されている））、および他の合成配列特異的核酸ポリマー（ポリマーが、ＤＮＡおよびＲＮＡで見出されるように、塩基対合および塩基重層を可能にする配置でヌクレオベース（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）を含むことを提供する）を含む他のポリマーに対する一般名称である。用語「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」との間で長さの違いは意図されず、そしてこれらの用語は互換的に使用される。これらの用語は分子の一次構造のみをいう。従って、これらの用語は二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖のＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、およびＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとの間のハイブリッドを含み、そして公知のタイプの改変体（例えば、当該分野において公知である標識、メチル化、「キャップ（ｃａｐ）」、アナログでの１またはそれ以上の天然に存在するヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間改変体）、ならびに非改変形態のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドもまた含まれる。ヌクレオチド間改変体は、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメート、など）を有する改変体および負に荷電した結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有する改変体、３’−オキシリボース部分または３’−デオキシリボース部分の２’−Ｏ−ヌクレオチド間結合を含む改変体、ペンダント部分、例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリＬーリジンなどを含む）を含む改変体、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を有する改変体、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化力を有する金属など）を含む改変体、アルキル化剤を含む改変体、改変された結合（例えば、αアノマー核酸など）を有する改変体などである。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、公知のプリン塩基およびピリミジン塩基だけでなく、改変された他の複素環式塩基も含む部分を包含することが理解される。このような改変は、メチル化プリンまたはメチル化ピリミジン、アシル化プリンまたはアシル化ピリミジン、あるいは他の複素環を包含する。さらに、用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、従来のリボース糖およびデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も含む部分を包含する。改変されたヌクレオシドまたはヌクレオチドもまた糖部分に改変を含む。例えば、ここで、１またはそれより多いヒドロキシル基がハロゲン、脂肪族基で置換されているか、あるいはエーテル、アミンとして官能化されているなどである。
【００３６】
名称「３’」は、ヌクレオシド間結合の構造的な表示において使用される場合、結合に対して５’側に位置するヌクレオシドのリボース部分の３’炭素との結合をいう。名称「５’」は、ヌクレオシド間結合の構造的な表示において使用される場合、結合に対して３’側に位置するヌクレオシドのリボース部分の５’炭素との結合をいう。しかし、上記に示すように、本発明を、骨格の一部分としてリボース糖を含むオリゴヌクレオチドに限定する意図はない。従って、当業者は、本明細書中に示されるような、カチオン性ヌクレオシド間結合を含む新規なオリゴヌクレオチドが、伝統的な３’および５’ヌクレオシド間結合に限定される必要はないことを理解する。
【００３７】
用語「カチオン性」は、本明細書中で使用される場合、約９未満、好ましくは約８未満のｐＨで正の電荷を有する化学的部分をいう。より好ましくは、中性に近い水溶液中の場合、すなわち約ｐＨ４〜ｐＨ８の範囲、好ましくは約ｐＨ７、最も好ましくは約ｐＨ７．３において、カチオン性部分は陽子を得て正の電荷を帯びる。従って、「カチオン性ヌクレオシド間結合」は、上記の条件下で正に帯電している置換基化学部分を含むような結合である。「カチオン性オリゴヌクレオチド」は、本明細書中では、１またはそれより多いカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを示すために使用される。
【００３８】
用語「アルキル」または「低級アルキル」は、本明細書で使用される場合、１〜６個の炭素原子の、分枝または非分枝の飽和炭化水素基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル（「ｉＰｒ」）、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチルなど）をいう。用語「アルキレン」または「低級アルキレン」は、本明細書で使用される場合、１〜６個の炭素原子を含む、二官能性の飽和分枝または非分枝炭化水素鎖をいい、そして例えば、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−ＣＨ２−ＣＨ２−）、プロピレン（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、２−メチルプロピレン（−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−）、ヘキシレン（−（ＣＨ２）３−）などを含む。
【００３９】
用語「アルケニレン」または「低級アルケニレン」は、本明細書中で使用する場合、２〜６個の炭素原子および少なくとも１つの二重結合を含む、二官能性の分枝または非分枝の炭化水素鎖をいう。用語「アルキニレン」または「低級アルキニレン」は、本明細書中で使用する場合、２〜６個の炭素原子および少なくとも１つの三重結合を含む、二官能性の分枝または非分枝の炭化水素鎖をいう。
【００４０】
用語「アリール」は、本明細書中で使用される場合、１〜５の芳香族環を含む、代表的には、ハロゲンおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群より選択される１またはそれより多い置換基で置換されていないかまたは置換されているかのいずれかの芳香族種をいう。
【００４１】
用語「アリーレン」は二官能性芳香族部分をいい；「単環式アリーレン」はフェニレン基をいう。これらの基は上記で概説されるような４つまでの環置換基で置換されていてもよい。
【００４２】
用語「複素環」はその従来の意味で使用され、複素原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン）を含む置換または非置換の芳香族環式分子および非芳香族環式分子を包含する。このような複素環の例には、ピロール、ピロリジン、ピリジン、ピペリジン、モルホリン、キノリン、インドール、ピリミジン、ピペラジン、ピペコリン、イミダゾール、ベンズイミダゾール、プリンなどが含まれる。これらの基はまた、上記で概説したように、置換されていてもよい。
【００４３】
「精製（された）」または「均質な」とは、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列に言及する場合、同じタイプまたは立体異性体的配置の他の生物学的高分子が実質的に存在することなく、示された分子が存在することを意味する。用語「精製（された）」または「均質な」は、本明細書中で使用される場合、好ましくは少なくとも約９０重量％、より好ましくは少なくとも約９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも約９８重量％の同じタイプの生物学的高分子が存在することを意味する。
【００４４】
用語「立体異性体」はその従来の意味で使用され、少なくとも１つの不斉的な原子を有する化学的化合物（この化合物は、同じ数および種類の原子ならびに同じ原子配置を有するが空間的な関係は異なる、２つまたはそれ以上の形態で存在し得る）をいう。不斉的なヌクレオシド間リン原子の場合、２つの可能な立体異性体的配置が存在する。
【００４５】
用語「立体異性体的に純粋」または「立体化学的に純粋」とは、他の立体異性体が実質的に存在することなく１つの立体異性体が存在することを意味する。少なくとも１つの不斉的なヌクレオシド間リン原子を含む分子に言及する場合、この用語は、他の立体異性体的配置が実質的に存在することなく、その不斉的なヌクレオシド間リン原子の１つの立体異性体的配置が存在することを意味する。用語「立体化学的に純粋」は、本明細書中で使用される場合、好ましくは少なくとも約７０重量％、より好ましくは少なくとも約８０重量％、そして最も好ましくは少なくとも約９０重量％の特定の立体異性体的配置のダイマーまたはオリゴヌクレオチドが、他の立体異性体的配置を除外して存在することを意味する。立体異性体の「分割」は、立体異性体が互いに分離されて立体異性体的に純粋な異性体を生成し得る手段を示す。「ポイントラセミ混合物（ｐｏｉｎｔ ｒａｃｅｍｉｃ ｍｉｘｔｕｒｅ）」または「ポイントラセミ化合物（ｐｏｉｎｔ ｒａｃｅｍａｔｅ）」は、本明細書中で、特定の不斉的なリン原子での両立体異性体が存在する立体異性体の混合物であると定義される。このような「ポイントラセミ混合物」は、代表的には、４０％〜６０％のオーダーの１つの立体異性体、およびこれに対応して６０％〜４０％の他の立体異性体を含むが、必ずしも必要ではない。しかし、一般的には、２つの立体異性体は概ね等量で存在する。例えば、不斉的なヌクレオシド間リンを有するダイマーでは、あるいは１つのこのような不斉的なリンを有するオリゴヌクレオチドでは、ポイントラセミ混合物は、一般的に、概ね等量の各立体異性体を含む。
【００４６】
ヌクレオシド間結合が２つの異なる立体異性体的配置のうちの１つで存在し得るような、不斉的なリン原子を有する特定のカチオン性ヌクレオシド間結合に言及する場合、用語「立体的均一（ｓｔｅｒｅｏｕｎｉｆｏｒｍ）」は、このヌクレオシド間結合を含むこのような分子の実質的な部分が、異なる立体異性体的配置で存在する結合を有することを意図する。「実質的な部分」は、好ましくは７０％より大きい、より好ましくは８０％より大きい、そして最も好ましくは９０％より大きいこのようなヌクレオシド間結合が立体異性体的配置で存在することを意図する。
【００４７】
立体異性体は、当該分野で公知の任意の種々の方法によって分割され得る。例えば、いくつかのラセミ混合物を、同様な立体異性体的配置の分子が、可視的に不斉的な結晶に集合する様式で結晶化させる。このような結晶は物理学的に分離されて、立体化学的に純粋な立体異性体を生成し得る。
【００４８】
当該分野で周知である第２の方法は、ラセミ混合物が、第２の標準的な不斉的な分子と反応することを可能にする化学的手順を包含する。例えば、ラセミ化合物が酸である場合、光学的に活性なアミン（例えば、キニン、ブルシンまたはストリキニーネ）を使用してこの混合物を分割し得る。この方法は、標準的な物理学的手段（例えば、蒸留、結晶化、クロマトグラフィーなど）によって分離され得る２つの立体異性体を生成する。
【００４９】
ヌクレオシド間リンに結合した置換基を含むオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間リンでのキラリティーによって決定される異性体が、実際にジアステレオマーである。なぜなら、オリゴヌクレオチド骨格の糖成分がキラルであるからである。ジアステレオマーは従来の方法（例えば、蒸留、結晶化、クロマトグラフィーなど）によって分離され得る。
【００５０】
ジアステレオマーである立体異性体は、薄層クロマトグラフィー（「ＴＬＣ」）、またはアキラルな媒体を使用するカラムクロマトグラフィーを使用して分離され得る。立体異性体のＴＬＣ分割は、固相（例えば、シリカ）を含む適切なＴＬＣプレート上で行われ得る。これは、必要に応じてキラル試薬などを含み、そして立体異性体を分割するに効果的である。ＴＬＣによって分離された立体異性体は、ＴＬＣ基質およびプレートの展開に使用された溶媒中におけるそれらの差分（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）溶解性によって特徴付けられ得る。代表的には、差分溶解性は、特定の溶媒系におけるプレート上での化合物の移動を、プレートの展開に使用された溶媒系の移動に対して決定することによって表される。従って、プレートの展開後のプレート上の立体異性体の位置は、溶媒の先端の位置に対する、化合物が塗布されたスポットから移動した距離として表される。この比は、代表的には、立体異性体のＲｆと呼ばれる。カラムクロマトグラフィーによる立体異性体の分割もまた、固相マトリックス（例えば、シリカゲル）を使用して行われ得る。これは、必要に応じて、当該分野において周知の技術および試薬を使用するキラル試薬を含む。より高いＲｆ、すなわち特定の溶媒系中のＴＬＣプレート上でのより高い移動性を有するかまたはカラムから最初に溶出する立体異性体は、本明細書中では、「最初に溶出する」異性体と呼ばれる。一方、より低いＲｆを有するかまたはカラムから２番目に溶出する立体異性体は、本明細書中では、「２番目に溶出する」異性体と呼ばれる。
【００５１】
リン原子での絶対的な立体化学は、Ｆａｔｈｉら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（前出）によって記載されるように、Ｌｏｓｃｈｎｅｒら（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：５０８３−５０８８の２Ｄ−ＮＭＲ法によって決定され得る。絶対的な立体化学的配置もまた、当該分野において周知である従来の方法（例えば、旋光分散（ｏｐｔｉｃａｌ ｒｏｔａｔｏｒｙ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）または円二色性（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）測定）によって決定され得る。
【００５２】
「随意の」または「必要に応じて」は、後に記載される事象または状況が生じてもよくまたは生じなくてもよいこと、ならびにその記載がその事象または状況が生じる例および生じない例を包含することを意味する。例えば、語句「必要に応じて置換されたアルキレン」は、アルキレン部分が置換されていてもよく、または置換されていなくてもよいこと、ならびにこの記載が置換されていないアルキレンおよび置換が存在するアルキレンの両方を包含することを意味する。
【００５３】
新規なオリゴヌクレオチド
本発明の新規なオリゴヌクレオチドは、以下の構造（Ｉ）を有するカチオン性ヌクレオシド間結合を含む：
【００５４】
【化１７】
構造（Ｉ）については、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は上記の規定の通りである。
【００５５】
この構造において、Ｐ＊は、例えば、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、ホスホチオエステルまたはアルキルアミノホスホネート結合中に存在する不斉的なリン原子を表す。オリゴヌクレオチドは、アニオン性および／またはカチオン性ヌクレオシド間結合の任意の組み合わせを含み得る。オリゴヌクレオチドにおいて、カチオン性ヌクレオシド間結合は、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、ホスホチオエステル、アルキルアミノホスホネート結合の任意の組み合わせであり得る。
【００５６】
不斉的なリン原子の存在の結果として、カチオン性ヌクレオシド間結合は、２つの立体異性体的配置のうちの１つで存在し得る。オリゴヌクレオチドは、以下に記載および例示されるように、２つの立体異性体のうちのただ１つが予め決定された任意のヌクレオシド間結合に存在するよう、すなわちオリゴヌクレオチド中の予め決定されたヌクレオシド間結合が立体的均一であるように調製され得る。
【００５７】
上記のように、ＷはＯ、ＳおよびＳｅであり得る。特に好ましい実施態様において、Ｐ＊が不斉的なリン原子であり、そしてこのような結合のそれぞれが立体的均一である場合、ＷはＳである。
【００５８】
ＸおよびＹは、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ４）Ｒ５であり得、ここでＲ４およびＲ５はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキル、ならびにＮＲ６（Ｒ６はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）からなる群より独立して選択される。好ましくは、ＸおよびＹは独立してＯ、Ｓ、ＣＨ２、ＮＨであり、より好ましくは、ＸおよびＹは共にＯである。
【００５９】
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレンおよびＮＲ７（Ｒ７はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）であり得る。Ｐ＊が不斉的なリン原子であり、そして各カチオン性ヌクレオシド間結合が立体的均一であるとき、Ｗ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯ、ＳまたはＮＲ７である。好ましい立体的均一のカチオン性ヌクレオシド間結合において、ＺはＯまたはＮＨである。
【００６０】
本発明の他の好ましい実施態様において、カチオン性ヌクレオシド間結合は立体的均一である必要はない。これらの実施態様において、Ｗ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯまたはＳである。これらの実施態様のうちの１つのセットにおいて、オリゴヌクレオチドは、交互のカチオン性およびアニオン性ヌクレオシド間結合を含む。
【００６１】
Ｒ１は、低級アルキレン、低級アルケニレン、低級アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択される。従って、例えば、Ｒ１が結合である場合、ＺはＮＲ２Ｒ３に直接結合している。Ｒ１は、ヌクレオシド間リンとカチオン性中心との間のスペーサーを提供するよう選択され、そして核酸とハイブリダイズするための、カチオン性ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドの親和性を最適化するよう選ばれ得る。Ｒ１として有用な特に好ましい基には、（ＣＨ２）２または（ＣＨ２）３が含まれる。
【００６２】
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、低級アルキル、１〜４個のＮＨ２基で置換された低級アルキル、および単環式アリールの任意の組み合わせであり得る。あるいは、Ｒ２およびＲ３は、５員環または６員環のアルキルまたはアリール環、またはＮ、ＯもしくはＳを含む複素環を形成するよう結合され得る。Ｐ＊が不斉的なリン原子であり、そしてこのような結合のそれぞれが立体的均一である場合、Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ＣＨ３、または１個のＮＨ２基で末端を置換された低級アルキルであることが好ましい。より好ましくは、Ｒ２およびＲ３はＣＨ２ＮＨ２またはＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である。好ましい複素環には、ピロール、ピロリジン、ピリジン、ピペリジン、モルホリン、キノリン、インドール、ピリミジン、ピペラジン、ピペコリン、イミダゾール、ベンズイミダゾールおよびプリンが含まれ、これらはハロゲンまたはＣ１〜Ｃ６アルキルで置換されていなくてもあるいは置換されていてもよい。好ましい複素環には、イミダゾール、モルホリン、ピロリジン、ピペラジン、ピペコリン、メチルピペラジンが含まれる。
【００６３】
一般には、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、生理学的な条件下で加水分解に対して化学的に非感受性であり、ヌクレアーゼに対して抵抗性であるオリゴヌクレオチドを提供し、そして／あるいは相補的なオリゴヌクレオチドと安定な二重鎖を形成するカチオン性ヌクレオシド間結合を、オリゴヌクレオチドに提供するよう選ばれる。
【００６４】
１つの特に好ましい実施態様において、カチオン性ヌクレオシド間結合は下記の構造（ＩＩＩ）を有する
【００６５】
【化１８】
ここで、Ｐ＊は不斉的なリン原子を表し、その結果、この結合は、ヌクレオシド間結合を含むヌクレオチドダイマーのポイントラセミ混合物がシリカゲルカラムクロマトグラフィーを使用して分割される場合、最初に溶出した立体異性体の配置に対応する立体異性体的配置で存在する。
【００６６】
本明細書中で開示しそして特許請求したオリゴヌクレオチドは、カチオン性ヌクレオシド間結合によって置換される、任意の割合のアニオン性ＰＤＥ結合を有し得る。従って、オリゴヌクレオチドは、カチオン性ヌクレオシド間結合によって置換される、約１個程度のアニオン性ＰＤＥ結合を含み得、そしてカチオン性結合で置換される１００％程度のアニオン性ＰＤＥ結合を有し得る。負電荷と正電荷との割合は所望の正味の電荷を有するオリゴヌクレオチドを生成するよう変化し得る。オリゴヌクレオチドは、そこに組み込まれるカチオン性ヌクレオシド間結合の数に依存して、全体的に正、中性、または負の電荷を有し得る。
【００６７】
オリゴヌクレオチドは交互のアニオン性およびカチオン性ヌクレオシド間結合を含むよう調製され得る。本明細書の下記の実施例４に記載するように、交互のアニオン性およびカチオン性ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡと、アニオン性の対応物より安定な二重鎖を形成する。
【００６８】
アニオン性およびカチオン性ヌクレオシド間結合は、オリゴヌクレオチドじゅうにランダムに分布し得るか、またはアニオン性結合およびカチオン性結合のかたまりでオリゴヌクレオチド中に存在し得る。
【００６９】
本発明の１つの好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチド中の選択されたヌクレオシドの間に立体的均一なカチオン性ヌクレオシド間結合を有する。
【００７０】
カチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、従来のオリゴヌクレオチド合成技術を使用して調製され得る。例えば、その結合において予め決定された立体異性体的配置を有するカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、所望のホスホトリエステル、ホスホルアミデートまたはアルキルアミノホスホネート結合を有するダイマーブロックを合成し、ダイマーブロックの立体異性体を分割し、そしてダイマーブロックの分割された立体異性体を、固相オリゴヌクレオチド合成技術を使用してオリゴヌクレオチドに組み込むことによって調製され得る。最初に溶出する立体異性体または２番目に溶出する立体異性体のいずれかが、オリゴヌクレオチドに組み込まれ得る。例えば、以下の２つの立体異性体構造（ＩＶａ）および（ＩＶｂ）を有するカチオン性チミジレートダイマーは、実施例１に記載されそしてスキーム１に示されるように、５’−ＨＯ−Ｔ−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルジシリル（「ＴＢＤＭＳ」）をジメトキシトリチル（「ＤＭＴ」）−Ｔ−Ｏ−Ｐ（ＯＣＨ３）−Ｎ（ｉＰｒ）２と反応させることによって調製され得る。
【００７１】
【化１９】
（ここで、Ｔはチミジレートヌクレオシドを表す）
【００７２】
【化２０】
ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−Ｐ（ＯＣＨ３）−Ｎ（ＣＨＣＨ３）２（Ｖ）を、テトラゾール中で５’−ＨＯ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ（ＶＩ）と反応させた。この反応が本質的に終了した後、この反応混合物を濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、そしてＮａＨＣＯ３および８０％飽和ＮａＣｌで抽出した。有機相を乾燥させ、濾過し、そしてエバポレートして粗ホスファイト−トリエステル中間体（ＶＩＩ）を生成した。この中間体を、ヨウ素の存在下で３−ジアミノプロピルアミンと反応させた。最終反応の生成物は、粗ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−Ｐ（Ｏ）−（ＮＨ−（ＣＨ２）−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ（ＩＶａおよびＩＶｂ）のポイントラセミ混合物である。
【００７３】
さらに、このポイントラセミ化合物は、カチオン性ヌクレオシド間結合（この結合の配置は立体特異的である必要はない）を有するオリゴヌクレオチドを調製するために使用され得る。
【００７４】
カチオン性ホスホルアミデートヌクレオシド間結合を有するオリゴマーは、実施例６に記載される２段階法を用いて調製され得る。この反応は、メチルホスファイト−トリエステル結合を有する予め合成されたダイマーをジチオジピリジンで酸化して、活性化されたＳ−Ｐｙｒ−ホスホロチオジエステルを得ることを包含する。新たに形成された立体異性体は分割され得、そしてその後Ｓ−Ｐｙｒ基は３−ジメチルプロピルアミンのような反応アミンで置換されて、所望の立体化学的配置中に所望のホスホルアミデートジエステル結合を有するダイマーを生成する。
【００７５】
上記および実施例６に記載の２段階法は、カチオン性ホスホルアミデート結合オリゴマーの固相合成のために使用され得る。鎖伸張の間、オリゴマーをアミン溶液に曝さず、そして反応の終了時にすべてのＳ−Ｐｙｒ−ホスホロチオジエステル結合をホスホルアミデート結合に変換する。固相合成の間にヌクレオシド間結合を改変するこの方法は、ホスホルアミデート結合での立体特異性を生じない。
【００７６】
カチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを調製する他の方法は、当業者に明らかである。
【００７７】
カチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、核酸とで形成される二重鎖の安定性の増加の結果として、核酸に対するプローブとしての有用性を見出される。カチオン性および両性イオン性オリゴヌクレオチドは、核酸標的を含む二重鎖形成をさらに制御するために塩および／またはｐＨを使用する可能性を提供する。代表的には、オリゴヌクレオチドとＲＮＡ標的とのハイブリダイゼーションは、ＲＮＡにおける大規模な（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）２次構造および３次構造のために困難であり得る。しかし、低塩濃度で、これらの構造はよりずっと不安定である。ＲＮＡ標的と、塩濃度によって制御され得る、すなわち低塩で安定な二重鎖を形成するカチオン性オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖形成を可能にする。
【００７８】
例えば、増加した二重鎖安定性を有するオリゴヌクレオチドは、遺伝子研究、生物医学研究および臨床診断学において一般に使用される核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおける有用性を見出される。基本的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、一本鎖分析物核酸は、標識された一本鎖核酸プローブとハイブリダイズし、そして得られる標識された二重鎖を検出する。このようなアッセイにおけるハイブリダイゼーション工程は、適切なストリンジェンシー条件下で実施される。ストリンジェンシーは、熱力学的変数であるパラメータを変化させることによって制御され得る。このような変数は当該分野において周知であり、そしてホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度、ｐＨ、有機溶媒含有量、および温度を含む。好ましいストリンジェンシーの制御は、ｐＨおよび塩濃度である。ストリンジェンシーは分析物配列の長さおよび性質に依存して変化し得る。
【００７９】
この基本的なスキームの多様性は、正確性を向上させ、無関係（ｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ）の物質からの検出すべき二重鎖の分離を容易にし、そして／あるいは検出されるシグナルを増幅するように開発されてきた。１つのこのようなアッセイは、共有に譲渡されたＵｒｄｅａらの米国特許第４，８６８，１０５号に詳細に記載される（この開示は、本明細書中に参考として援用される）。さらに、塩濃度および／またはｐＨを変化させることによって二重鎖形成を制御する能力は、共有に譲渡されたＣｏｌｌｉｎｓらの米国特許出願第０８／２９８，０７３号（この開示は、本明細書中に参考として援用する）に記載されるように、非特異的なハイブリダイゼーションに起因するバックグランドノイズを減少させるために、カチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて特に有用とする。
【００８０】
カチオン性ヌクレオシド間結合を含むハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの構築が有用性を見出す別の応用は、アンチセンス化合物の設計においてである。アンチセンス化合物は、例えば、Ｃｈｉｎｇら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：１０００６−１００１０、Ｂｒｏｄｅｒら（１９９０）Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ． １１３：６０４−６１８、Ｌｏｒｅａｕら（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２７４：５３−５６、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１１５３５号、第ＷＯ９１／０９８６５号、第ＷＯ９１／０４７５３号、第ＷＯ９０／１３６４１号、第ＷＯ９１／１３０８０号、および第ＷＯ９１／０６６２９号に説明されるように、特定のタンパク質の産生を担うｍＲＮＡに結合し、そしてそのｍＲＮＡの生成を不能にするかまたは防ぐオリゴヌクレオチドである。従来のアンチセンス分子は、一般的に、種々のオリゴヌクレオチド種と反応し得る。三重構造（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズしたアンチセンス分子）もまた、アンチセンス機能を提供し得る。
【００８１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、これらを、アンチセンス分子として、天然に結合したオリゴヌクレオチドより望ましくする特性を有する。カチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、天然に存在するオリゴヌクレオチドを加水分解するヌクレアーゼに対してより抵抗性である。従って、カチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、細胞中でより長い半減期を有する。このようなオリゴヌクレオチドは、天然に存在する対応物より高い安定性で、細胞中の相補的なオリゴヌクレオチドと相互作用し得る。細胞中でのカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドによるこの実質的に安定な複合体の形成は、遺伝子発現の選択的な阻害を可能にする。
【００８２】
実験
本発明の実施には、他に指示しない限り、当該分野の技術の範囲内である合成有機化学、生化学、分子生物学などの従来の技術を用いる。このような技術は文献に十分に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔら編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）および一連の、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）を参照のこと。
【００８３】
本明細書中で言及されるすべての特許、特許出願、および刊行物は、前出および後出の両方とも、本明細書中で参考として援用される。
【００８４】
本発明は、その好ましい特定の実施態様に関して記載されるが、上記の説明および以下の実施例は、本発明の範囲を例示するが、限定しないことを意図することが理解される。本発明の範囲内の他の局面、利点および改変は、本発明に関連する分野における当業者に明白である。
【００８５】
以下の実施例において、使用された数字（例えば、量、温度など）に関して精確さを確実にするための努力がなされたが、いくらかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。温度は常に℃で与えられ、他に示されなければ、圧力は大気圧かまたはほぼ大気圧である。
【００８６】
ＮＭＲ分光学。以下の実施例において、ＮＭＲスペクトルはＶａｒｉａｎ ３００ＭＨｚ装置で記録した。３１Ｐスペクトルは１２１ＭＨｚにおいて、１４０ｐｐｍにセットされたトリメチルホスファイトに関して稼動させた。
【００８７】
高速液体クロマトグラフィー。逆相高速液体クロマトグラフィー（「ＲＰ−ＨＰＬＣ」）分析および精製を、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ ７．５）中５％のＣＨ３ＣＮへのＣＨ３ＣＮの０〜５０％グラジエント（２５分間）、流速１ｍＬ／分にて溶出させるＳｕｐｅｌｃｏ ＬＣ−１８ ５ミクロンカラム（２５ｃｍ×４．６ｍｍ）で行った。
【実施例】
【００８８】
実施例１
カチオンダイマー
ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳの合成
５’−ＨＯ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ（ＶＩ）（３．７グラム；１０．４ミリモル）およびテトラゾール（２０ミリモル）を乾燥アセトニトリル（２×１００ｍＬ）とともに共エバポレートし、そして残渣を乾燥アセトニトリル（５０ｍＬ）に溶解した。ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−Ｐ（ＯＣＨ３）−Ｎ（ｉＰｒ）２（Ｖ）（１０ミリモル）を、分液丸底フラスコ中の乾燥アセトニトリル（５０ｍＬ）に溶解し、次いで、ゆっくり５’−ＨＯ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ／テトラゾール溶液に５分間の時間をかけて添加した。シリカプレート上の薄層クロマトグラフィー分析を、２回、５％メタノール／ＣＨ２Ｃｌ２で展開した。ここで、ＤＭＴ陽性産物は、５’−ＨＯ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳよりわずかに速く移動し、反応が５分以内に完了した様であることを示した。
【００８９】
反応混合物を穏やかに濃縮して少量とし、４００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で希釈しそして有機相を５％ＮａＨＣＯ３水溶液（４００ｍＬ）および８０％飽和ＮａＣｌ水溶液（４００ｍＬ）で抽出した。有機相を固体ＮａＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートして乾燥した。残渣をトルエン（１００ｍＬ）およびアセトニトリル（２×２００ｍＬ）とともに共エバポレートして、１０グラムの粗製亜リン酸トリエステル中間体（ＶＩＩ）を得た。
【００９０】
粗製中間体を、さらなる精製を行わずに直接使用して、アセトニトリル（２００ｍＬ）に溶解した。希釈していない３−ジアミノプロピルアミン（１０ｍＬ；１６ミリモル）を溶液に直接添加し、続いて、急速撹拌しながら、ヨウ素（２．５３グラム；１０ミリモル）のアセトニトリル溶液（１００ｍＬ）を滴下して加えた。添加するとヨウ素の紫色は直ちに消失し、僅かに黄色が、添加の完了後に残った。反応混合物を４℃で１８時間放置した。
【００９１】
次いで、反応混合物を少量まで穏やかに濃縮し、そして４００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。この調製物の有機相を、１５％の亜硫酸水素ナトリウム（３００ｍＬ）、５％ＮａＨＣＯ３水溶液（２×４００ｍＬ）、そして８０％飽和ＮａＣｌ水溶液（２×４００ｍＬ）で抽出した。有機相を固体ＮａＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートして乾燥した。残渣を、トルエン（１００ｍＬ）およびアセトニトリル（２×２００ｍＬ）と共エバポレートし、１２グラムの粗製ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ（（ＩＶａ）および（ＩＶｂ））を得た。
【００９２】
生成物を、２％ ＴＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２中のメタノール（０〜６％）のグラジエントを用いてシリカゲルクロマトグラフィー（２％トリエチルアミン（「ＴＥＡ」）／ＣＨ２Ｃｌ２の溶媒系中に注いだ「６００ｍＬ」のＭｅｒｃｋシリカゲル６０）で分画し、１００ｍＬの画分を得た。画分１６〜２５をプールし、そして濃縮した。画分を上記のようにシリカゲルクロマトグラフィーにより、２％ ＴＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２中のメタノールの長い（ｄｒａｗｎ−ｏｕｔ）グラジエント（２％（８画分）、４％（１６画分）、５％（１６画分）および６％（１６画分）メタノール）で繰り返し、５０ｍＬの画分を採取した。３つのプールを単離した：＃１、画分１９〜２２；＃２、画分２３〜３２；そして＃３、画分３３〜４０。各プールを濃縮し、そしてトルエンおよびアセトニトリルとともに共エバポレートして、以下の特性を有する３つのプールを得た。
【００９３】
【化２１】
ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳの最初の精製物からのプール＃２を、さらにシリカゲルクロマトグラフィー（２％ＴＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２の溶媒系中に注いだ「４００ｍＬ」のＭｅｒｃｋシリカゲル６０）により、２％ ＴＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２中のメタノールのグラジエント（２％（１６個の５０−ｍＬ画分）、３％（８×５０ｍＬ、１０×２５ｍＬ）、４％（１６×５０ｍＬ）および５％（６×５０ｍＬ））を用いて、分画した。以下のように、３つのプールを単離した：プール＃１、画分２４〜３４：最初に溶出する異性体、１．６２グラム；プール＃２、画分２３〜３２：異性体の混合物、０．７３グラム；そしてプール＃３、画分３３〜４０：２番目に溶出する異性体、１．２グラム。
【００９４】
ＴＢＤＭＳ基の脱離は、テトラブチルアンモニウムフルオライド（「ＴＢＡＦ」）を用いて達成した。１９ｍＬのアセトニトリル中のシリカ精製したＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ（最初の精製物からのプール＃１（１．１４グラム；０．９５ミリモル））を、５当量のＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１ＭのＴＢＡＦの５ｍＬ）で２．５時間処理し、その時間で、反応は事実上完結した。反応混合物を２５０ｍＬの塩化メチレンで希釈し、そして５％ＮａＨＣＯ３水溶液（２５０ｍＬ）および８０％飽和ＮａＣｌ水溶液（２５０ｍＬ）で抽出した。有機相を固体ＮａＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして乾燥するまでエバポレートした。残渣をトルエン（１００ｍＬ）およびアセトニトリル（２×２００ｍＬ）とともに共エバポレートした。プール＃１からの粗製ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）−Ｎ（ＣＨ２）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−Ｈを、シリカゲルクロマトグラフィー（２％ＴＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２溶媒系中に注いだ「２５０ｍＬ」のＭｅｒｃｋシリカゲル６０）により、２％ ＴＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２中のメタノール（０〜１８％）のグラジエント（０％（４画分）、３％（４画分）、６％（８画分）、９％（８画分）、１２％（８画分）、１５％（８画分）、１８％（８画分））を用いて精製し、５０ｍＬの画分を採取した。画分３２〜４０をプールした。
【００９５】
プールした画分３２〜４０の濃縮により、純粋なＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−ＯＨ（最初に溶出する異性体；０．６１グラム；０．５７ミリモル）を得た。外部標準としてｄ６−ＤＭＳＯを用いたＣＨ２Ｃｌ２中の３１Ｐ ＮＭＲ：８．３ｐｐｍ（１００％）；外部標準としてｄ６−ＤＭＳＯを用いたＣＨ３ＣＮ中の３１Ｐ ＮＭＲ：８．８７ｐｐｍ（１００％）。
【００９６】
同様に、シリカ精製したＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ（最初の精製物からのプール＃３（０．８グラム；０．７ミリモル））を、５当量のＴＢＡＦで処理した。ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ（プール＃１）についての上記のような、後処理（ｗｏｒｋｕｐ）および精製により、純粋なＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−ＯＨ（より遅い異性体；０．５７グラム；０．５３ミリモル）を得た。３１Ｐ ＮＭＲ（外部標準としてｄ６−ＤＭＳＯを用いたＣＨ２Ｃｌ２）：８．５７ｐｐｍ（９８％）。
【００９７】
実施例２
ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−Ｐ（Ｎ（ｉＰｒ）２）−Ｏ−ＢＣＥ
の合成
ＤＩＰＥＡ（５．７ミリモル）を含有するＣＨ２Ｃｌ２中のＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−ＯＨ（最初に溶出する異性体；０．６１グラム；０．５７ミリモル）をＣｌ−Ｐ（Ｎ（ｉＰｒ）２）−Ｏ−ＢＣＥ（１．１４ミリモル；２倍過剰）と反応させた、ここで、ＢＣＥは、β−シアノエチルである。反応の進行を、２％ＴＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２中の８％メタノール中におけるＴＬＣによりモニターした。反応混合物を４℃にて１８時間放置した。反応混合物を２５０ｍＬの塩化メチレンで希釈し、そして５％ＮａＨＣＯ３水溶液（２５０ｍＬ）および８０％飽和ＮａＣｌ水溶液（２５０ｍＬ）で抽出した。有機相を固体ＮａＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして乾燥するまでエバポレートした。残渣をトルエン（５０ｍＬ）およびアセトニトリル（２×１００ｍＬ）とともに共エバポレートして、０．６グラムを得た（０．４７ミリモル）。３１Ｐ ＮＭＲ（外部標準としてｄ６−ＤＭＳＯを用いたＣＨ３ＣＮ）：１４８．５、１４８．３、８．８７ｐｐｍ（積分：ホスホルアミダイト対ホスホルアミデートの比１／１）。
【００９８】
ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−ＯＨ（２番目に溶出する異性体；０．５７グラム；０．５３ミリモル）を、同様の手順を用いて、ＢＣＥホスホルアミダイトに変換し、０．６グラムの生成物を得た。３１Ｐ ＮＭＲ（外部標準としてｄ６−ＤＭＳＯを用いたＣＨ３ＣＮ）：１４８．５、１４８．３、９．０７ｐｐｍ（積分：ホスホルアミダイト対ホスホルアミデートの比１／１）。
【００９９】
ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳの立体異性体を、ＴＬＣおよびシリカ上のカラムクロマトグラフィーにより、容易に分離した。しかし、３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ基の除去の後、それらをいずれの溶媒系におけるＴＬＣによっても分割できなかった。
【０１００】
ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−Ｐ（Ｎ（ｉＰｒ）２）−（Ｏ−ＢＣＥ）についてのＮＭＲデータ。
【０１０１】
（ａ）最初に溶出する異性体。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：９．０（ｓ、１Ｈ、ＮＨ、Ｄにより交換可能）；７．４８（ｓ、１Ｈ、Ｈ６）；７．４５（ｓ、１Ｈ、Ｈ６）；７．４５〜６．８（ｍ、１３Ｈ、トリチル）；６．１６（ｔ、１Ｈ、Ｈ１’）；６．１５（ｔ、１Ｈ、Ｈ１’）；５．０５（ｍ、１Ｈ、Ｈ３’）；４．１６（ｍ、１Ｈ、Ｈ３’）；４．１（ｍ、１Ｈ、Ｈ４’）；４．０５〜３．９（ｍ、２Ｈ、Ｈ５’、５’）；３．８５（ｍ、１Ｈ、Ｈ４’）；３．７５（ｓ、６Ｈ、ＯＣＨ３）；３．２８〜３．２１（ｍ、２Ｈ、Ｈ５’）；２．９〜２．７（ｍ、４Ｈ、ＮＣＨ２）；２．４６（ｍ、２Ｈ、Ｈ２’）；２．３（ｓ、６Ｈ）；２．０６（ｍ、２Ｈ、Ｈ２’）；１．７４（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）；１．７〜１．５（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２）；１．４３（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）；１．０（ｓ、９Ｈ）；０．０（ｓ、６Ｈ）；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：８．７５ｐｐｍ。
【０１０２】
（ｂ）２番目に溶出する異性体：３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：９．１ｐｐｍ。
【０１０３】
ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−３’−Ｏ−Ｐ（Ｎ（ｉＰｒ）２）−Ｏ−ＢＣＥについてのＮＭＲデータ。
【０１０４】
（ａ）最初に溶出する異性体：３１Ｐ ＮＭＲ：１４８．５ｐｐｍ、１４７．９ｐｐｍ、８．７５ｐｐｍ（ホスホルアミダイト／ホスホルアミデートの積分比＝１：１）。
【０１０５】
（ｂ）２番目に溶出する：１４８．４５ｐｐｍ、１４７．９６ｐｐｍ、９．１ｐｐｍ（ホスホルアミダイト／ホスホルアミデートの積分比＝１：１）。
【０１０６】
実施例３
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｕ（２’−Ｏ−（ＣＨ３））−３’−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−
５’−Ｏ−Ｕ（２’−Ｏ−（ＣＨ３））−３’−ＯＲの合成
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｕ（２’−Ｏ−（ＣＨ３））−３’−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−５’−Ｏ−Ｕ（２’−Ｏ−ＣＨ３）−３’−ＯＲ（ここでＲはＴＢＤＭＳ、ＨまたはＰ（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）−Ｎ（ｉＰｒ）２である）を、以下のように合成した。
【０１０７】
７．９ミリモルの５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｕ（２’−Ｏ−ＣＨ３）−３’−Ｏ−Ｐ（Ｏ−ＣＨ３）−Ｎ（ｉＰｒ）２（ＭＷ７２１）を、市販の５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｕ（２’−Ｏ−ＣＨ３）−３’−ＯＨ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入した）から調製した。５’−Ｏ−Ｕ（２’−Ｏ−ＣＨ３）−３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳを、５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｕ（２’−Ｏ−ＣＨ３）−３’−ＯＨ（Ｍｏｎｏｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から購入した）から調製した。５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｕ（２’−Ｏ−ＣＨ３）−３’−Ｏ−Ｐ（Ｏ−ＣＨ３）−Ｎ（ｉＰｒ）２（ＭＷ７２１０）（７．９ミリモル）と５’−Ｏ−Ｕ（２’−Ｏ−ＣＨ３）−３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ（８ミリモル）とを、テトラゾール（１６ミリモル）の存在下で、まずカップリングして、十分に保護された誘導体を調製し、ホスファイトトリエステル中間体を得た。ホスファイトトリエステル中間体（ＶＩＩ）（実質的に実施例１に記載の通り、水性後処理（ａｑｕｅｏｕｓ ｗｏｒｋｕｐ）の後に直接使用した）を、２倍過剰の３−ジメチルアミノプロピルアミンと混合し、そしてＣＨ３ＣＮ中の０．１Ｍヨウ素溶液８０ｍＬと反応させた。実施例１に記載の水性後処理の後、この反応で８．５４グラムの粗製生成物を得た。３１Ｐ−ＮＭＲ（外部標準としてｄ６−ＤＭＳＯを用いたＣＨ３ＣＮにおいて）：８．９および９．５ｐｐｍ。
【０１０８】
実施例１および２の記載と同様にシリカゲルクロマトグラフィー（「７００ｍＬ」のＭｅｒｃｋシリカゲル６０）による精製を行って、２つの画分プールを得た：最初に溶出する画分（画分番号３２〜４４、１．６９グラム、３１Ｐ−ＮＭＲ ８．９ｐｐｍ（１００％））および画分番号４７〜６０、低速、１．６２グラム、３１Ｐ−ＮＭＲ ８．９ｐｐｍ（＞５％）、９．５ｐｐｍ（８０％）、１０．２＋１０．７ｐｐｍ（合計１８％）（正体不明）。
【０１０９】
実施例４
立体規定ホスホルアミデート結合
を交互に有するカチオン性オリゴマーの調製
アニオン性および立体均一なカチオン性ホスホルアミデート結合を交互に有するオリゴヌクレオチドを、カチオン性の立体異性体的に純粋なＴｐ（＋）Ｔダイマーホスホルアミダイトを取り込むことにより調製した。ここで、Ｔｐ（＋）Ｔは、ヌクレオシド間のリン原子上のカチオン性ジメチルアミノプロピルアミド置換基を示し、そしてＴｐ（−）Ｔは、従来のホスホジエステルヌクレオシド間結合を示す。
【０１１０】
以下のオリゴマーを、実施例１〜３に記載した方法を用いて合成した：（Ｔｐ（＋）Ｔｐ）７Ｔ（最初に溶出する異性体を用いる）；（Ｔｐ（＋）Ｔｐ）７Ｔ（２番目に溶出する異性体を用いる）；および（Ｔｐ（＋）Ｔｐ）７Ｔ（ポイントラセミ化合物、すなわち、任意の１位置における第１および２番目に溶出する異性体のランダム混合物）。
【０１１１】
カチオン性ダイマーを用いたオリゴマー合成を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ＤＮＡ合成装置上で、１０分間のカップリング工程を用いて行った。ＤＭＴ−Ｔｐ（＋）Ｔ ＢＣＥ（最初に溶出する異性体または２番目に溶出する異性体、あるいはポイントラセミ化合物（ほぼ等量の第１および２番目に溶出する異性体））を、乾燥アセトニトリルに溶解して、０．１Ｍの濃度にした。合成したオリゴマー配列は、７サイクルのダイマー付加によるＤＭＴ−（Ｔｐ（＋）Ｔｐ）７Ｔであった；最終ＤＭＴは取り出されなかった。ＮＨ４ＯＨ水溶液を用いて（１時間／２０℃）、粗製オリゴマーを支持体から切断した。上清を濃縮し、そして残渣を４００μＬの水に再溶解した。２０分付近に１つの主要なピーク溶出を示したすべての場合、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による粗製オリゴマー生成物の分析を、実験のセクションに記載したように行った。
【０１１２】
完全長ＤＭＴ生成物を逆相ＨＰＬＣ（「ＲＰ−ＨＰＬＣ」）により、１００μＬ（約４３Ａ２６０単位）の注入により精製した。２０分付近のピーク溶出を集め（約１ｍＬ）、そしてエバポレートして乾燥した。残渣を２００μＬの８０％酢酸水溶液に１時間再溶解して、５’−末端のＤＭＴ基を除去した。酸溶液をエバポレートにより除去し、そして残渣を、１００μＬの８０％酢酸水溶液に再溶解した。溶液を１時間室温にて放置し、次いで、エバポレートして乾燥した。残渣を約０．５ｍＬの水に溶解した。水溶液を約０．５ｍＬの酢酸エチルで２回洗浄し、次いで凍結乾燥した。細かい粒子状の物質を遠心分離により除去した。脱トリチル化したオリゴマーを、最終的にＲＰ−ＨＰＬＣにより、上記と同じ手順を用いて精製した。
【０１１３】
実施例５
異性体分解によるダイマーブロックの調製
本実施例に記載する方法は、１つのモノマータイプを用いた、固体支持体上でのモノマー単位からのカチオン性オリゴマーの合成に使用し得る。この方法は、ヌクレオシドメチルホスホルアミダイトを用いて例証された。
【０１１４】
Ａ．ホスホロチオエートダイマーＴｐ（Ｓ）Ｔを、ピリジン中の２〜４倍過剰のＭｅＳＯ２−Ｃｌで処理した。出発物質を完全に消費して、２つの新たな３１Ｐ ＮＭＲシグナルを６７ｐｐｍ／６８ｐｐｍで得た。反応混合物をジメチルアミノプロピルアミン（「ＤＭＡＰＡ」）でクエンチしたとき、６７ｐｐｍ／６８ｐｐｍのシグナルは、直ちに、７２ｐｐｍ／７３ｐｐｍの新たなペアに置き替えられた；Ｎｕ−Ｏ−Ｐ−（Ｏ）（ＮＨ−Ｒ）−Ｏ−Ｎｕに対応する、８．８ｐｐｍ／９．４ｐｐｍのシグナルは、観察されなかった。
【０１１５】
Ｂ．２０℃にて、ＭｅＳＯ２−Ｃｌ（２０μＬ；２倍過剰）を、ピリジン中の５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−Ｐ（Ｓ）Ｏ−Ｏ−５’−Ｔ−３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ（０．２Ｍ溶液の０．６ｍＬ）に添加した。反応は、３１Ｐ ＮＭＲにより６７／６ｐｐｍおよび６７／０ｐｐｍの２つの新たなシグナルで判断されるように、数分で完了した。ＤＭＡＰＡ（ホスホロチオエートに対して４倍過剰）を添加し、そして反応を進行させた。５分より短い時間の後、３１Ｐ ＮＭＲは、６７．６ｐｐｍおよび６７．０ｐｐｍの２つのシグナルが完全に消失し、新たな７３．５ｐｐｍおよび７２．９ｐｐｍの、２つのシグナルに置き替えられたことを示した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、ＮａＨＣＯ３およびＮａＣｌで抽出した。粗製生成物のＴＬＣは、２つのＤＭＴ／糖陽性スポットを示し、これは、２％ＴＥＡ／８％ＭｅＯＨ／９０％ＣＨ２Ｃｌ２中で、５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−５’−Ｔ−３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳよりわずかに速く移動した。従って、反応は排他的に、いずれのＳ活性化を伴うことなくＯ活性化に導く。
【０１１６】
実施例６
カチオン性ヌクレオシド間ホスホルアミデート結合を有する
カチオン性ダイマーの調製
本実施例は、カチオン性ホスホルアミデート結合したオリゴマーの２段階合成を記載する。この反応は、メチルホスファイト−トリエステル結合を、ジチオジピリジンで酸化して、活性化Ｓ−Ｐｙｒ−ホスホロチオジエステルを得、続いてアミンで置換して所望のホスホルアミデートジエステル結合を得る工程を包含する。このスキームは、カチオン性ホスホルアミデート結合オリゴマーの固相合成に関して魅力的である。鎖延長の間、オリゴマーはアミン溶液に曝されず、そして反応の終了時にすべてのＳ−Ｐｙｒ−ホスホロチオジエステル結合は、ホスホルアミデート結合に変換される。
【０１１７】
トリエチルアミン（０．１ｍＬ）を、ＣＨ３ＣＮ中のＤＭＴ−Ｏ５’−Ｔ−Ｏ３’−Ｐ（Ｏ−（ＣＨ３））−Ｏ５’−Ｏ３’−ＴＢＤＭＳの溶液（０．３ｍＬ；０．２Ｍ）に添加した。ＣＨ３ＣＮ中の５倍過剰のジチオピリジン（０．３ｍＬ；１．０Ｍ）を添加し、そして反応を２０℃にて進行させた。反応の経過に続いてＮＭＲを行った。
【０１１８】
出発物質の２つの立体異性体に対応する最初の１４０ｐｐｍの２つのシグナルは、３時間後に消失し、そしてＤＭＴ−Ｏ５’−Ｔ−Ｏ３’−ＰＯ（Ｓ−Ｐｙｒ）−Ｏ５’−Ｔ−Ｏ３’−ＴＢＤＭＳの２つの立体異性体に対応する２０．３ｐｐｍ／２０．６ｐｐｍの新たな２つのシグナルに置き換わった。
【０１１９】
０．２ｍＬの３−ジメチルプロピルアミンを、ＮＭＲチューブに直接加えた。約１時間後、２０．３ｐｐｍ／２０．６ｐｐｍシグナルは、ＤＭＴ−Ｏ５’−Ｔ−Ｏ３’−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ５’−Ｔ−Ｏ３’−ＴＢＤＭＳの２つの立体異性体に対応する９．１ｐｐｍ／８．８ｐｐｍの２つの新たなシグナルに置き換わった。薄層クロマトグラフィー分析により、ヌクレオチド的な物質のみが、実施例１に記載の方法により調製された化合物の純種のサンプルとともに共移動することを確認した。
【０１２０】
実施例７
カチオン性ホスホルアミデート結合の
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション特性への効果
オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性へのカチオン性ヌクレオシド間結合の効果を、アニオン性およびカチオン性ホスホルアミデート結合を交互に有するオリゴヌクレオチドを用いて評価した。カチオン結合は立体異性体的に純粋であった。従って、カチオン性オリゴヌクレオチドを合成するのに用いたダイマーブロックは、実施例１に記載されたように調製した、立体異性体的に純粋なＴｐ（＋）Ｔダイマーホスホルアミデートであった。ポイントラセミの［Ｔｐ（＋）Ｔｐ（−）］７Ｔ（ここでｐ（＋）およびｐ（−）は上記に定義された通りである）を、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０〜４４７１に記載された通りに合成した。［Ｔｐ（＋）Ｔｐ（−）］７Ｔの構造を有するオリゴヌクレオチドアナログを、固体支持体上で、シリカゲルカラムから最初にまたは２番目に溶出する５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｔｐ（＋）Ｔ−３’−Ｐ（Ｎ（ｉＰｒ）２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮの純粋な立体異性体、あるいは最初に溶出する異性体と２番目に溶出する異性体とのポイントラセミ混合物のいずれかを用いて、標準的なホスホルアミダイト化学を用いて合成した。各合成の生成物を、ＲＰ−ＨＰＬＣによりＤＭＴ形態で精製し、続いて８０％酢酸水溶液で脱トリチル化した。最終生成物を貯蔵のために凍結乾燥した。
【０１２１】
陽性および陰性結合を交互に含有するカチオン性ホモチミジンオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を、ポリ（ｄＡ）およびポリ（Ａ）標的配列に対して評価した。１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．３）において、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ ２ ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計で、熱融解分析を行った。カチオン性オリゴヌクレオチドの濃度は約５μＭであった。１℃／分の温度勾配で、２６０ｎｍ、２８０ｎｍ、および３３０ｎｍにおいて、吸光度の変化を測定した。Ｔｍは、温度に対するＡ２６０のプロットにおける最大傾斜領域の中点に対応する温度である。
【０１２２】
二重鎖形成についてのオリゴヌクレオチド配列および融解温度を表１および２に示す。
【０１２３】
【化２２】
【０１２４】
【化２３】
【０１２５】
【化２４】
表１および表２のハイブリダイゼーションデータは、速く溶出する立体異性体形態に対応する立体異性体的ホスホルアミデート結合を有するカチオン性オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ標的と非常に安定な二重鎖を形成することを示す。加えて、試験したカチオン性オリゴヌクレオチド（最初に溶出する、またはポイントラセミ化合物）についての二重鎖安定性が示されたこれらのデータは、実質的に塩濃度非依存性であった。このハイブリダイゼーション挙動は、天然に発生する全アニオン性オリゴヌクレオチド（塩濃度に非常に依存するそのＤＮＡ標的と二重鎖を形成する）ときわめて異なる。一般的に、２番目に溶出する立体異性体に対応する立体異性体的ホスホルアミデート結合を有するカチオン性オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ標的との安定な二重鎖を形成しない。
【０１２６】
例えば、この実験において、正常な全アニオン性オリゴヌクレオチド−ポリ（ｄＡ）二重鎖についてのＴｍは、塩濃度が１．０Ｍから０．１Ｍまで、さらに塩添加なしまで下げられた場合、５３℃から３５℃まで、さらに２５℃まで減少した。対照的に、最初に溶出するＴｐ（＋）Ｔ異性体から調製されたカチオン性オリゴヌクレオチドは、塩濃度非依存性である最高のＴｍ値を有した。塩がない場合でさえ（この条件下では、天然オリゴマーに対する二重鎖安定性の劇的な損失が観察された）、最初に溶出するＴｐ（＋）Ｔ異性体から調製されたカチオン性オリゴヌクレオチドで得られたＴｍ値は５６℃であった。２番目に溶出するＴｐ（＋）Ｔ異性体から調製されたカチオン性オリゴヌクレオチドは、塩がない場合および０．１Ｍ ＮａＣｌの場合に、ポリ（ｄＡ）と安定な二重鎖を形成しなかった。１．０Ｍ ＮａＣｌの場合でさえ、２番目に溶出する異性体は、最初に溶出する異性体から調製されたカチオン性ヌクレオチドで得られたＴｍ値より低いＴｍ値（−１７℃）を示した。Ｔｐ（＋）Ｔのポイントラセミ混合物から調製されたカチオン性オリゴヌクレオチドは、塩濃度が０および低い場合、中間の安定性を有する二重鎖ＤＮＡ分子を形成した；しかし、ポイントラセミ化合物についてのＴｍ値は、塩非依存性であり、そして塩が添加されない場合、ポイントラセミ化合物で得られたＴｍ値は、全アニオン性オリゴヌクレオチドよりも大きかった。
【０１２７】
より高いＴｍ値を反映して、ポリ（Ａ）標的との二重鎖安定性は、最初に溶出するカチオン性オリゴマーについて、全アニオン性オリゴマーについてよりも高かった。２番目に溶出する異性体は、ポリ（Ａ）と安定な二重鎖を形成しなかったが、ポイントラセミ化合物は、中間の二重鎖安定性を示した。
【０１２８】
実施例８
カチオン性ホスホトリエステル結合の
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション特性への効果
（１）全標準ホスホジエステルヌクレオシド間結合（５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’）；（２）交互のアニオン性標準ＰＤＥ結合およびカチオン性ホスホルアミデートヌクレオシド間結合、ここでカチオン性Ｎ−置換基はジメチルアミノプロピルである（［Ｔｐ（Ｎ＋）Ｔｐ（−）］７Ｔと表す）（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １１０：４４７１〜４４７２）；および（３）交互の標準ＰＤＥ結合およびカチオン性ホスホトリエステルヌクレオシド間結合、ここでカチオン性置換基はジメチルアミノプロピル（「［Ｔｐ（Ｏ＋）Ｔｐ（−）７Ｔ］」と表す）である（固体支持体上で、標準的なホスホルアミダイト化学を用いて合成される）を有する３つのチミジンオリゴヌクレオチドを調製した。
【０１２９】
交互の陽性および陰性の結合を含有するカチオン性ホモチミジンオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を、ポリ（ｄＡ）に対して、実施例７に記載したように評価した。結果を表３に示す。
【０１３０】
【化２５】
表３のデータは、［Ｔｐ（Ｏ＋）Ｔｐ（−）］７Ｔオリゴマーが、塩濃度に非依存性であり、そして全アニオン性チミジン１５マーよりも、１０℃（０．１Ｍ ＮａＣｌ）および２１℃（ＮａＣｌなし）高いＴｍを有することを示す。加えて、［Ｔｐ（Ｏ＋）Ｔｐ（−）］７Ｔオリゴマーは、［Ｔｐ（Ｎ＋）Ｔｐ（−）］７Ｔオリゴマーよりも安定なポリ（ｄＡ）との二重鎖を形成する。
【０１３１】
実施例９
チミジンおよび２’−Ｏ−メチルウリジン両性イオン性誘導体の
二重鎖標的へのハイブリダイゼーション
両性イオン性のチミジンおよび２’−Ｏ−メチルウリジン誘導体の二重鎖標的ｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）へのハイブリダイゼーションを研究し、このようなオリゴヌクレオチドの、二本鎖ＤＮＡについてのプローブとしての有用性を示した。他のオリゴマーの非存在下で、ｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）は、高安定性のｄＴ．ｄＡ幹（ｓｔｅｍ）を有する自己相補的（ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）構造を形成する（０．１ Ｍ ＮａＣｌ中でＴｍ ６２℃；１ Ｍ ＮａＣｌ中でＴｍ ７８℃）。すべての立体均一両性イオン性オリゴマーを、上記実施例１から６までに記載した手順、またはＨｏｒｎら（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７：７４３〜７４５およびＣｈａｔｕｒｖｅｄｉら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：２３１８〜２３２３に記載された手順を用いて調製した。上記のように、より高いＲｆを有する立体異性体を、本明細書中で、「最初に溶出する」異性体と表し、より低いＲｆを有する立体異性体を、本明細書中で、「２番目に溶出する」異性体と表す。
【０１３２】
オリゴチミジレート誘導体の二重鎖標的ｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）に対する親和性は、プローブの電荷および立体化学ならびに溶液のイオン強度に強く依存する（表４）。両性イオン性異性体の１つ、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）は、０．１Ｍ ＮａＣｌ中でさえ、標的との比較的安定な三本鎖複合体を形成した。ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）とｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）との等モル混合物についての融解曲線は、両性イオン性鎖の二重鎖セグメントからの解離についての遷移（Ｔｍ ２４℃）、ならびにｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）の変性についての遷移（Ｔｍ ６８℃）を示した。そして０℃におけるｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）のｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）での滴定について滴定液対Ａ２６０のプロットは、ｄＴ．ｄＡ．ｄＴモチーフを有する複合体のために、２つのオリゴマーの等モル濃度での遷移点を示した（データは示さず）。同じ条件下で、ｄＴ１５も両性イオン性異性体オリゴマーｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）もｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）と顕著には相互作用しなかった。高塩溶液（０．１Ｍ ＮａＣｌ）では、ｄＴ１５は、ｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）に結合した（Ｔｍ ３０℃）。ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）により形成した複合体の安定性はまた、塩濃度の増大とともに増加した（１．０Ｍ ＮａＣｌ中でのＴｍ ３２℃）。しかし、Ｔｍの上昇は、全アニオン性プローブの場合よりも低かった。オリゴマーｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）は、１Ｍ ＮａＣｌ中でさえも、ｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）と顕著に結合しなかった。
【０１３３】
ホスホジエステルオリゴヌクレオチドプローブ中の２’−Ｏ−メチルウリジンによるチミジンの置換が、プローブとで形成される三本鎖複合体の安定性を増強することが示されている（Ｅｓｃｕｄｅら（１９９２）Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ ＩＩＩ、３１５：５２１〜５２５）ので、立体異性体的オリゴマー（Ｕ’＋Ｕ’−）７ｄＴ（最初に溶出する）および（Ｕ’＋Ｕ’−）７ｄＴ（２番目に溶出する）を調製して、二本鎖標的への両性イオン性オリゴヌクレオチドの結合に対するこの置換体の効果を調べた。（Ｕ’＋Ｕ’−）７ｄＴ（最初に溶出する）（Ｔｍ３５℃、０．１Ｍ ＮａＣｌ）は、チミジンアナログ、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）（Ｔｍ２４℃、０．１Ｍ ＮａＣｌ）よりも効果的にｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）に結合した。異性体オリゴマー（Ｕ’＋Ｕ’−）７ｄＴ（２番目に溶出する）も、その対応するホスホジエステルコントロールＵ’１４ｄＴも、これらの条件下ではｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）と顕著に相互作用しなかった。三本鎖複合体についての結果とは対照的に、２’−Ｏ−メチルウリジン誘導体（Ｕ’＋Ｕ’−）７ｄＴ（最初に溶出する）は、ポリ（ｄＡ）の等価物への結合が、チミジンアナログｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）より効果的でないことが見出された。０Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、および１．０Ｍ ＮａＣｌ溶液中での二本鎖複合体の形成についてのＴｍ値は、それぞれ、（Ｕ’＋Ｕ’−）７ｄＴ（最初に溶出する）について３５℃、３６℃、および４１℃であり、そしてｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）については、５８℃、５８℃、および５８℃であった（Ｈｏｒｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．前出を参照のこと）。
【０１３４】
【化２６】
混合ｄＴ、ｄＣオリゴマーｄ（Ｔ＋Ｔ−）２（Ｔ＋Ｃ−）５Ｔ（最初に溶出する）およびｄ（Ｔ＋Ｔ−）２（Ｔ＋Ｃ−）５Ｔ（２番目に溶出する）のデータを表５に示す。標的ｄ［Ａ５（ＧＡ）５Ｔ４（ＴＣ）５Ｔ５］は、用いた条件（ｐＨ ７．０においてＴｍ ６８℃、そしてｐＨ ６．０においてＴｍ ６７℃；０．１Ｍ ＮａＣｌ）下で自己会合する。ｄＴ、ｄＣペンタデカマーは、ｄＴまたはｄＵ’ペンタデカマーがｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）に結合する親和性よりも高い親和性で、ｄ［Ａ５（ＧＡ）５Ｔ４（ＴＣ）５Ｔ５］に結合し、そして、ｄＣを含有する三本鎖構造について予想された（Ｌｉｐｓｅｔｔ、Ｍ．Ｎ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２３９：１２５６〜１２６０（１９６４））ように、親和性は、ｐＨ ６において、ｐＨ ７の場合よりも大きかった。両性イオン性プローブの１つ、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）２（Ｔ＋Ｃ−）５Ｔｂ（最初に溶出する）、および標的ｄ［Ａ５（ＧＡ）５Ｔ４（ＴＣ）５Ｔ５］により、ｐＨ ７の低塩溶液（０．１Ｍ ＮａＣｌ）中で、三本鎖複合体の熱的安定性が形成された。Ｔｍ値は、対応する全ホスホジエステルプローブによって形成された複合体についてのＴｍ値よりも２３℃高かった。両性イオン性オリゴヌクレオチドの高い親和性が、配列ならびにイオン電荷およびリンにおける立体化学に依存することが、実験により示された。この実験で、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）は、不適合の標的、ｄ［Ａ５（ＧＡ）５Ｔ４（ＴＣ）５Ｔ５］とペアになり、そしてｄ（Ｔ＋Ｔ−）２（Ｔ＋Ｃ−）５Ｔｂ（最初に溶出する）は、同様に、ｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）とペアになった。これらの系のいずれもが、安定な三本鎖複合体を与えなかった（表４および５）。
【０１３５】
【化２７】
３つのペアの立体異性体的両性イオン性１５マーをこの研究のために調製した。第１のペアはチミジンから誘導され、第２のペアは２’−Ｏ−メチルウリジンから誘導され、そして第３のペアはチミジンおよびデオキシシチジンから誘導された。それぞれの場合において、所定のオリゴマーにおけるすべてのホスホルアミデート結合は、同じ形状を有した。熱変性実験は、三本鎖複合体の形成におけるこれらの交互カチオン性−アニオン性オリゴヌクレオチドの関係が、改変されたリン酸結合のキラリティに非常に依存することを示した。
【０１３６】
それぞれの場合、立体異性体的なプローブの１つ（最初に溶出する異性体と表される）は、対応する全ホスホジエステルプローブが結合するよりも効果的に相補的二本鎖ＤＮＡ標的に結合する。ｐＨ ７の０．１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中におけるＴｍの増強は、ｄＴおよびｄＴ、ｄＣ両性イオン性１５マー（ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）およびｄ（Ｔ＋Ｔ−）２（Ｔ＋Ｃ−）５Ｔ（最初に溶出する））について、２０℃のオーダーであり、そして２’−Ｏ−メチルウリジン誘導体（（Ｕ’＋Ｕ’−）７ｄＴ（最初に溶出する））について、約３５℃である。１Ｍ ＮａＣｌ溶液中におけるＴｍの増強は、比較して小さいが、しかし依然とし顕著である。プローブはいくつかのｄＣユニットを含むが、ｐＨ ７において、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）２（Ｔ＋Ｃ−）５Ｔ（最初に溶出する）の親和性が比較的高いことは注目すべきである。二本鎖標的に対するこの非対称的な混合塩基プローブの強力な結合は、２つのピリミジンおよび１つのプリン鎖から誘導された他の三本鎖複合体においてと同様に、第３の鎖がプリン鎖と平行に配向する構造と一致する。
【０１３７】
最初に溶出する立体異性体的オリゴマーでの結果と対照的に、リンにおける配置が反対であるホスホルアミデートオリゴマー（２番目に溶出する）は、二本鎖標的に対して非常に低い親和性を示した。異性体の絶対的配置がまだ確定的に指定されてなく、そして三本鎖複合体のジオメトリーについての構造的情報が限定されているので、これらの相違の理由についての推測は早尚である。しかしながら、興味深いことに、二本鎖ＤＮＡに対するオリゴヌクレオチドプローブの結合を有利にするホスホルアミデート連結における配置は、二本鎖複合体を得るための一本鎖標的への結合を有利にするものと同じである（Ｈｏｒｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．前出）。
【０１３８】
Ｇｒｙａｚｎｏｖらは、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’−Ｐ５’ホスホルアミデート誘導体がＤＮＡ二重鎖に結合して異常に安定なｐｙｒ．ｐｕｒ．ｐｙｒおよびｐｕｒ．ｐｕｒ．ｐｙｒ複合体を与えることを示している（Ｇｒｙａｚｎｏｖら、（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １１６：３１４３〜３１４４およびＧｒｙａｚｎｏｖら、（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：５７９８〜５８０）。Ｎｉｅｌｓｅｎらは、「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）が、鎖侵入により、適切なＤＮＡ配列と相互作用してＰＮＡ．ｐｕｒ．ＰＮＡ三本鎖セグメントを与えることを見出した（Ｎｉｅｌｓｅｎら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７〜１５００；Ｃｈｅｒｎｙら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：１６６７〜１６７０；およびＮｉｅｌｓｅｎら、（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１：１９７〜２００）。立体均一カチオン性ホスホルアミデート誘導体は、二本鎖ＤＮＡ標的に強力に結合するオリゴヌクレオチドアナログの別のファミリーを含む。これらの３つのファミリーは、物理的および化学的性質ならびに、疑いなく、生物学的系における挙動もまた、互いに異なるので、それらは、化学者に、特定のアプリケーションのためのＤＮＡ結合剤を調製（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ）する豊富な機会を提供する。
【０１３９】
実施例１０
Ｈｏｒｎら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．前出）は、以前に、１Ｍ ＮａＣｌ溶液におけるｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）とポリ（ｄＡ）との１／１ ｄＴ／ｄＡ混合物について、２６０ｎｍで得られた融解曲線の異常な特徴に言及した。融解曲線はＴｍ値で約２０℃異なる２つの遷移を示した。第１の遷移は、２つのｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）．ポリ（ｄＡ）二重鎖セグメントの可逆的な不均化から生じて、ｄＡ．ｄＡ．ｄＴモチーフおよびｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）の鎖を有する三重鎖を与えるようであり、そして第２の遷移は、遊離のポリ（ｄＡ）およびｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）を与える三重鎖の可逆的解離を示す。いくつかの証拠がこの結論を支持する。
【０１４０】
（ｉ）２つの遷移が、２８０ｎｍで測定した融解曲線、および２６０ｎｍで測定した融解曲線において現れる（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． 前出、を参照のこと）。２８０ｎｍ曲線中のより高い温度遷移は淡色（ｈｙｐｏｃｈｒｏｍｉｃ）である。特徴的には、ｄＴ．ｄＡ二重鎖およびｄＴ．ｄＡ．ｄＴ三重鎖の解離についての遷移は、これらの波長で濃色（ｈｙｐｅｒｃｈｒｏｍｉｃ）である。この結果は、新規構造を有する複合体の解離を示す。
【０１４１】
（ｉｉ）低塩溶液（０〜０．１Ｍ ＮａＣｌ）中で得られた融解曲線は、塩濃度に非依存的な１つの遷移（Ｔｍ約２２℃）を示した。塩濃度が増加するにつれて、第２の遷移が、次第により高い温度に現れた。第２の遷移についての塩依存性は、両性イオン性および２つのアニオン性鎖を含有する三本鎖複合体の解離についての予想と一致する。
【０１４２】
（ｉｉｉ）オリゴマーの溶液を８０℃から０℃までゆっくり冷却することによって得られる会合曲線は、遷移が完全に可逆的であることを示した。さらなる試験として、１Ｍ ＮａＣｌ中のｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）とポリ（ｄＡ）との１ｄＴ／１ｄＡ混合物を８０℃から２５℃まで冷却し、そしてその低い方の温度で２時間保持してゆっくりと平衡化を起こさせた。その２時間の間には吸光度の変化は起こらなかった。これは、系がこの温度において安定であることを示している。次いで、温度が、低い方の遷移についての範囲を超えて１８℃までさらに下げられた場合、２６０ｎｍでの吸光度は急速に低下し、そして２分間以内に平衡に達した。
【０１４３】
（ｉｖ）１ｄＴ／２ｄＡヌクレオチド比のｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）とポリ（ｄＡ）との混合物を０℃から８０℃まで加熱すると、１つの遷移（Ｔｍ ４２℃；１Ｍ ＮａＣｌ）が観察された。このことは、三本鎖複合体が過剰のｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）が存在しない場合、０℃で安定であることを例示している。
【０１４４】
（ｖ）これらの結果に一致して、１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ ７．０）中のｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）のポリ（ｄＡ）での滴定は、３０℃においては、０℃における場合の２倍のポリ（ｄＡ）を消費し、そしてその遷移点は、３０℃での１ｄＴ／２ｄＡ複合体、および０℃での１ｄＴ／１ｄＡ複合体の形成に対応した。コントロールとして、ｄＴ１５をまた同じ条件下でポリ（ｄＡ）により滴定した。これらの実験は、遷移点が、１．０Ｍ ＮａＣｌ中０℃、１．０Ｍ ＮａＣｌ中３０℃、および０．１Ｍ ＮａＣｌ中０℃での滴定について、予想通り、それぞれ２ｄＴ／１ｄＡ、１ｄＴ／１ｄＡ、および１ｄＴ／１ｄＡに対応することを示した。また、０．１Ｍ ＮａＣｌ中０℃でのｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）の滴定は、１ｄＴ／１ｄＡ比を与えた。
【０１４５】
（ｖｉ）１．０Ｍ ＮａＣｌ中で、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）と、ｄ（ＣＣＡ１５ＣＣ）の１つまたは２つの等価物との混合物を加熱すると、１つの遷移（Ｔｍ ２６℃）が見られた。この結果は、ポリ（ｄＡ）の場合の第２の遷移の出現が、ポリ（ｄＡ）がｄＡ．ｄＡ．ｄＴ三本鎖複合体を安定化するヘアピン構造に折り畳まれ得るという事実に関連し得ることを示唆した。したがって、本発明者らは、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）と、より短く、十分に規定されたオリゴマーｄ（Ａ１５Ｃ４Ａ１５）（これも、ヘアピン構造に折り畳まれ得る）とのハイブリダイゼーションを試験した。形成した複合体はいくらかより不安定であった（１．０Ｍ ＮａＣｌ中で、不均化反応についてＴｍ 約１７℃、そして三重鎖の解離についてＴｍ 約３２℃；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． 前出、を参照のこと）が、この標的は、実際に、ポリ（ｄＡ）の挙動を擬態した。ｄ（Ａ１５Ｃ４Ａ１５）単独についての加熱曲線との比較は、これらの遷移点が実際に、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）とこの標的オリゴヌクレオチドとの相互作用を反映していることを示した。ポリ（ｄＡ）の場合と同様に、遷移は可逆的であった。
【０１４６】
ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）およびポリ（ｄＡ）からの２つの異なる複合体の形成はさらに、ＣＤスペクトルデータ（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、前出を参照のこと）により支持される。５℃、１Ｍ ＮａＣｌ中で、等濃度のｄＴおよびｄＡユニットを含有するｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）とポリ（ｄＡ）との混合物のＣＤスペクトルは、０．１Ｍ ＮａＣｌ中での、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）とポリ（ｄＡ）との同じ組合せのＣＤスペクトル、ならびに０．１Ｍ ＮａＣｌ中および１Ｍ ＮａＣｌ中のポリ（ｄＴ）．ポリ（ｄＡ）のスペクトルと非常に類似している。２５５ｎｍ〜３００ｎｍの領域で観察される２つのピークおよび谷（ｔｒｏｕｇｈ）は特徴的であり（Ｗｅｌｌｓら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ５４：４６５〜４９７を参照のこと）、そしてポリ（ｄＴ）．ポリ（ｄＡ）の二重鎖のサインとしての役割を果たす。これらのすべての系におけるスペクトルの類似は、塩基のスタッキングがすべての場合においてほとんど同じであることを示す。したがって、これらのデータは、５℃、１Ｍ ＮａＣｌ中における、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）およびポリ（ｄＡ）から誘導された複合体についての従来の二重鎖構造を示す。ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）とポリ（ｄＡ）との溶液を２７℃まで加温した場合、非常に異なるスペクトルが得られた。２４７ｎｍにおける谷は深くなり、２５９ｎｍにおけるピークは減少し、２６８ｎｍにおける谷は消失し、そして２８２ｎｍにおけるピークは増大した。次いで、溶液を冷却したとき、２７℃において得られたスペクトルは容易に、０℃において得られたスペクトルに戻った。これらの変化は、溶液を加熱および冷却する際に観察されるＵＶ吸収の変化によく相関する。さらに、２７℃において得られるスペクトルは、遊離ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）とポリ（ｄＡ）との混合物について予想されたスペクトルとかなり異なる。本発明者らは、２７℃において得られたスペクトルが、ポリ（ｄＡ）およびｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）から誘導されたｄＡ．ｄＡ．ｄＴ三本鎖複合体の存在によるとする。この指摘は、２７℃の１Ｍ ＮａＣｌ中における、２ｄＡ／１ｄＴ比のポリ（ｄＡ）およびｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）のＣＤスペクトルが、２７℃での、１ｄＡ／ｄＴ比のポリ（ｄＡ）およびｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）について得られたスペクトルに類似しているであろうという予想、およびそれは５℃までの冷却の際に変化しないままであろうという予想に導く。これらの結果は実際に観察された。
【０１４７】
２７℃の１Ｍ ＮａＣｌ中における、オリゴマーｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）とポリ（ｄＡ）との１ｄＴ／１ｄＡ混合物についてのＣＤスペクトルは、ポリ（ｄＴ）．ポリ（ｄＡ）二重鎖のスペクトルに非常に類似している。ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）の場合と対照的に、ｄＡ．ｄＡ．ｄＴ三重鎖の形成についての証拠は見つからなかった。ＣＤスペクトルは、５℃に冷却する際に実際に変化せず、ポリ（ｄＡ）の第２の等価物の添加によって顕著に変化しなかった。これらの結果は、融解曲線からのデータを支持し、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）が、ポリ（ｄＡ）と二重鎖を形成するが、ｄＡ．ｄＡ．ｄＴ三重鎖は形成しないことを示している。
【０１４８】
驚くべき平衡のセットが、１Ｍ ＮａＣｌ溶液において２番目に溶出するｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ異性体およびポリ（ｄＡ）またはｄ（Ａ１５Ｃ４Ａ１５）を含有する系について見出された。２番目に溶出するｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ異性体およびポリ（ｄＡ）を１ｄＴ／１ｄＡの比で含有する系については、０℃において成分は二本鎖複合体を形成し；３０℃においては成分はｄＡ．ｄＡ．ｄＴ三本鎖複合体および遊離ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）の等価物として存在し；そして５０℃においては複合体は完全に解離する。状態間の遷移は、比較的鋭く（Ｔｍ ２２℃およびＴｍ ４２℃）、そして平衡は、溶液を加熱および冷却する際に共に急速に確立される。ｄ（Ａ１５Ｃ４Ａ１５）を含有する系は、同じスキームに適合するが、ｄＣ４鎖はリンカーとして作用し、２つのｄＡ１５セグメントの配向を容易にする。ホスホルアミデート結合の配置の重要性は、オリゴマーｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）が、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）とは対照的に、このタイプの三本鎖複合体を形成しなかったという事実によって示される。
【０１４９】
これらの平衡における２つの特徴は、いくつかの関連する先例がないわけではないが、通常ではない：（ｉ）排他的にｄＡ．ｄＡ．ｄＴ３つ組元素（ｔｒｉａｄ）を含有する安定な三本鎖複合体の形成；および（ｉｉ）二本鎖複合体の熱的に誘導された不均化による三本鎖複合体の形成。多くのｐｕｒ．ｐｕｒ．ｐｙｒ三重鎖の例が報告されている（Ｌｉｐｓｅｔｔ、（１９６４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２３９：１２５６〜１２６０；Ａｎｎａら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６〜４５９；Ｂｅａｌら、（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：２７７３〜２７７６；およびＰｉｌｃｈら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：６０８１〜６０８７、を代表的なケースとして参照のこと）が、記載されているｄＡ．ｄＡ．ｄＴの３つ組元素を含む安定な複合体はまた、ｄＧユニットもプリン鎖の１つに含む。Ｐｉｌｃｈら、は「グアニン残基の存在は、短いｐｕｒ．ｐｕｒ．ｐｙｒ三重鎖の安定化に重大であるようである」と記載している（Ｐｉｌｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、前出）。しかし、リボヌクレオチドファミリーについて、Ｂｒｏｉｔｍａｎら、（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：５１２０〜５１２４は、三本鎖複合体、ポリ（Ａ）．ポリ（Ａ）．ポリ（Ｕ）を記載している。これは、ポリ（Ａ）の重合度が約２８〜１５０の範囲にあるときに形成し得る。そしてＬａｕｃｅｒｉら、（１９９６）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ． ３５：２１５〜２１６は、低濃度のカチオン性ポルフィリンが、高分子量のポリ（Ａ）（＞４００ｂｐ）からのポリ（Ａ）．ポリ（Ａ）．ポリ（Ｕ）三本鎖複合体の形成を誘導することを示している。熱的に誘導された不均化に関して、ｐｙｒ．ｐｕｒ．ｐｙｒ複合体を与える例が、リボヌクレオチド［ポリ（Ａ）．ポリ（Ｕ）］（Ｍｉｌｅｓら、（１９６４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１４：１２９〜１３６；Ｓｔｅｖｅｎｓら（１９６４）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２：２９３〜３１４；およびＢｒｏｉｔｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、前出）、およびデオキシリボヌクレオチドポリマー［ポリ（ｄＴｄＣ）．ポリ（ｄＧｄＡ）］（Ｌｅｅら、（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ６：３０７３〜３０９１；Ｌｅｅら、（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：６６０３〜６６１３；およびＨａｍｐｅｌら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：４４５５〜４４５９）の両方について報告されている。
【０１５０】
オリゴヌクレオチドｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）を含むｄＡ．ｄＡ．ｄＴ複合体の異常な安定性、およびその形成に導く不均化反応は、プローブ中の立体均一側鎖の存在を反映しなければならないようである。このキラリティーを有する両性イオン性オリゴマーの性質は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに基づく新規な自己アセンブリー系を設計するのに有用であることを証明し得る。
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は一般に核酸化学に関する。より詳細には、本発明は、カチオン性ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドに関する。さらに、本発明は、このようなオリゴヌクレオチドを調製するための方法および試薬に関する。本発明は、診断上または臨床上のモニター目的のためのアンチセンス治療および核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおける応用を有する。
【背景技術】
【０００２】
背景
改変されたヌクレオシド間ホスホジエステル結合を含む配列特異的オリゴヌクレオチドは、治療的応用のためのアンチセンス分子、および診断または治療の効力のモニター応用のための核酸ハイブリダイゼーションプローブとしての有用性を有する。
【０００３】
好結果のアンチセンス分子および核酸ハイブリダイゼーションプローブは、生理学的条件下で目的の一本鎖または二本鎖の標的核酸配列と特異的に結合しなければならない。このような分子およびプローブはまた、インタクトの細胞によって効果的に取り込まれなければならず、そしてヌクレアーゼ分解に対して抵抗性でなければならない。
【０００４】
ホスホジエステル骨格が、これらの規準を満足する試みにおいて改変されてきた。例えば、ホスホジエステル骨格は、ホスホネート骨格（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８０） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５５：９６５９−９６６５）、ホスホトリエステル骨格（Ｐｌｅｓｓら（１９７７） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６：１２３９−１２５０）またはホスホロチオエート骨格（Ｓｔｅｃら（１９８４） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １０６：６０７７−６０７９）で置換されてきた。
【０００５】
オリゴヌクレオチド骨格改変に対する１つのアプローチは、ヌクレオシド間ホスホジエステル（「ＰＤＥ」）結合の負の電荷を取り除いて中性骨格、例えば、メチルホスホネート（Ｖｙａｚｏｖｋｉｎａら（１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：２４０４−２４０９）、ホスホルアミデート（Ｊａｅｇｅｒら（１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：７２３７−７２４６）またはペプチド核酸（Ｅｇｈｏｌｍら（１９９２） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １１４：１８９５−１８９７）を生成することであった。
【０００６】
オリゴヌクレオチド骨格を改変するための別のアプローチは、アニオン性ＰＤＥ基をカチオン性基で置換することであった。カチオン性置換基は、ホスホルアミデート結合を介してヌクレオシド間リン原子に結合させてきた（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １１０：４４７０−４４７１）。カチオン性基はまた、アニオン性酸素がリン−炭素結合を介してカチオン性基で置換されているホスホネート誘導体を介してオリゴヌクレオチドに導入され得る。従って、骨格が交互の（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ）ホスホジエステルおよび立体異性体的に純粋な（２−アミノエチル）−ホスホネート結合からなるオリゴヌクレオチドの調製、ならびに（アミノメチル）−ホスホネートからなる骨格を含むオリゴヌクレオチドの調製は、それぞれ、Ｆａｔｈｉら（１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：５４１６−５４２４およびＦａｔｈｉら（１９９４） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：４７−５７に報告されている。
【０００７】
Ｐａｔｉｌら（１９９４） Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ． ４：２６６３−２６６６は、立体異性体的に純粋な改変ジヌクレオシドを使用して、交互の立体調節されたアニオン性ホスホロチオエートおよびアニオン性ＰＤＥ結合を有するデカチミジレートを合成する、ホスホロチオエートの立体異性体を含むオリゴチミジレートアナログの合成を報告した。
【０００８】
Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓら（１９９４） Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３：２１３５−２１４９は、予め生成したダイマーを使用して、メトキシホスホルアミデートヌクレオシド間結合を有するオリゴマーを調製した。さらに、オリゴ（ｄＴ）と比較した場合、メトキシホスホルアミデートヌクレオシド間結合を有するオリゴマーは、ポリ（ｄＡ）またはポリ（Ａ）とハイブリダイズしたときの温度安定性の減少を示した。
【０００９】
標準的なホスホジエステルヌクレオシド間結合のみを有するオリゴヌクレオチドより大きな標的核酸への親和性を有するカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドが当該分野において必要とされている。このようなオリゴヌクレオチドは、アンチセンス治療剤、および核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとして役立ち得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
従って、診断上または臨床上のモニター目的のためのアンチセンス治療薬および核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて有用なカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを提供することが本発明の目的である。
【００１１】
カチオン性ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを合成する方法を提供することが本発明の別の局面である。
【００１２】
カチオン性ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用する核酸ハイブリダイゼーションアッセイを提供することが、本発明のなお別の目的である。
【００１３】
本発明の１つの実施態様において、構造（Ｉ）を有するカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドが提供される。
【００１４】
【化１３】
ここで、
Ｗは、Ｏ、ＳおよびＳｅからなる群より選択される；
ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ４）Ｒ５からなる群より独立して選択され、ここでＲ４およびＲ５はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキル、ならびにＮＲ６（Ｒ６はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）からなる群より独立して選択される；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレンおよびＮＲ７（Ｒ７はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）からなる群より選択され、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯ、ＳまたはＮＲ７である；
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択される；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、１〜４のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲ２およびＲ３は、５員環または６員環のアルキルまたはアリール環、またはＮ、ＯもしくはＳを含む複素環を形成するよう結合され得る；そして
ここで、Ｐ＊は２つの異なる立体異性体的配置で存在し得る不斉的なリン原子を表し、
そして、さらにこの結合は立体的に均一（ｓｔｅｒｅｏｕｎｉｆｏｒｍ）である。
【００１５】
本発明の別の実施態様において、交互のカチオン性およびアニオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを提供する。ここで、カチオン性ヌクレオシド間結合は構造（ＩＩ）を有する。
【００１６】
【化１４】
ここで、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は上記の規定の通りであり、ただし、Ｗ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯまたはＳであり、ここでＰは、２つの異なる立体異性体的配置で存在し得るリン原子であってもよいしまたはそうでなくともよく、そしてさらにその結合は立体的に均一であってもよいしまたはそうでなくてもよい。
【００１７】
本発明のなお別の実施態様において、以下の構造（ＩＩ）を有する少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１８】
【化１５】
ここで、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は上記の規定の通りであり、ただし、Ｗ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯまたはＳである。
【００１９】
本発明のさらなる実施態様において、以下の構造（Ｉ）を有する少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを作成するための方法を提供する。
【００２０】
【化１６】
ここで、
Ｗは、Ｏ、ＳおよびＳｅからなる群より選択される；
ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ４）Ｒ５からなる群より独立して選択され、ここでＲ４およびＲ５はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキル、ならびにＮＲ６（Ｒ６はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）からなる群より独立して選択される；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレンおよびＮＲ７（Ｒ７はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）からなる群より選択され、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯ、ＳまたはＮＲ７である；
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択される；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、１〜４個のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲ２およびＲ３は、５員環または６員環のアルキルまたはアリール環、またはＮ、ＯもしくはＳを含む複素環を形成するよう結合され得る；そして
ここで、Ｐ＊は２つの異なる立体異性体的配置で存在し得る不斉的なリン原子を表し、そして、さらにこの結合は立体的に均一であり、この方法は、
（ａ）カチオン性ヌクレオシド間結合および３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ保護基を含む、保護されたカチオン性ヌクレオチドダイマーのポイントラセミ（ｐｏｉｎｔ ｒａｓｅｍｉｃ）混合物を合成する工程；
（ｂ）必要に応じて、上記混合物に立体異性体を溶解する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において単離されたカチオン性ヌクレオチドダイマーを脱保護する工程；
（ｄ）工程（ｃ）において提供された脱保護されたカチオン性ヌクレオチドダイマーを、Ｃｌ−Ｐ（Ｎ（ｉＰｒ）２）−Ｏ−ＢＣＥとの反応によって、対応する３’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮホスホルアミダイト誘導体に変換する工程；および
（ｅ）３’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮホスホルアミダイト誘導体を、オリゴヌクレオチド鎖の保護されていないヒドロキシル含有末端ユニットに結合する工程、
を含む。
【００２１】
本発明のなお別の実施態様において、核酸ハイブリダイゼーションアッセイを提供する。このアッセイは、
（ａ）少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を含む標識されたオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程；
（ｂ）このプローブを一本鎖分析物核酸にハイブリダイズさせて、標識された二重鎖を生成させる工程；および
（ｃ）この標識された二重鎖を検出する工程、
を含む。
【００２２】
さらに、本発明によって、以下が提供される。
（項目１）以下の構造（Ｉ）：
【００２３】
【化１】
を有する少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドであって、ここで；
Ｗは、Ｏ、ＳおよびＳｅからなる群より選択され；
ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ４）Ｒ５、およびＮＲ６からなる群より独立して選択され、ここでＲ４およびＲ５はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群より独立して選択され、Ｒ６はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレンおよびＮＲ７からなる群より選択され、ここで、Ｒ７はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯ、ＳまたはＮＲ７であり；
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、１〜４個のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲ２およびＲ３は、５員環もしくは６員環のアルキルもしくはアリール環、またはＮ−、Ｏ−もしくはＳ−を含む複素環を形成するよう結合され得；そして
ここで、Ｐ＊は２つの異なる立体異性体的配置で存在し得る不斉的なリン原子を表し、
そして、さらに該結合は立体的に均一である、オリゴヌクレオチド。
（項目２）項目１に記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで、前記ヌクレオシド間結合を含むヌクレオチドダイマーのポイントラセミ混合物がシリカゲルカラムクロマトグラフィーを使用して分割される場合、前記カチオン性ヌクレオシド間結合の立体異性体的配置が、最初に溶出した立体異性体の配置に対応する、オリゴヌクレオチド。
（項目３）項目１に記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで、前記ヌクレオシド間結合を含むヌクレオチドダイマーのポイントラセミ混合物がシリカゲルカラムクロマトグラフィーを使用して分割される場合、前記カチオン性ヌクレオシド間結合の立体異性体的配置が、二番目に溶出した立体異性体の配置に対応する、オリゴヌクレオチド。
（項目４）ＺがＮＲ７である、項目２に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目５）Ｒ７がＨである、項目４に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目６）ＸおよびＹがＯである、項目４に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目７）Ｒ１がＣ１〜Ｃ６アルキレンである、項目４に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目８）Ｒ１が（ＣＨ２）３である、項目７に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目９）Ｒ２およびＲ３がＣ１〜Ｃ６アルキルである、項目４に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１０）Ｒ２およびＲ３がＣＨ３である、項目９に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１１）ＷがＳである、項目４に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１２）ＺがＮＲ５である、項目１に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１３）Ｒ５がＨである、項目１２に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１４）Ｒ１がＣ１〜Ｃ６アルキレンである、項目１２に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１５）Ｒ１が（ＣＨ２）２である、項目１４に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１６）Ｒ２およびＲ３が１〜４個のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルである、項目１２に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１７）Ｒ２およびＲ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である、項目１６に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１８）以下の構造（Ｉ）：
【００２４】
【化２】
を有する少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドであって、ここで；
Ｗは、Ｓであり；
ＸおよびＹは、Ｏであり；
Ｚは、ＮＨであり；
Ｒ１は、（ＣＨ２）３であり；
Ｒ２およびＲ３は、ＣＨ３であり；そして
ここで、Ｐ＊は不斉的なリン原子を表し、その結果、結合は、該ヌクレオシド間結合を含むヌクレオチドダイマーのポイントラセミ混合物がシリカゲルカラムクロマトグラフィーを使用して分割される場合に最初に溶出した立体異性体の配置に対応する立体異性体的配置で存在する、オリゴヌクレオチド。
（項目１９）カチオン性およびアニオン性ヌクレオシド間結合を交互に有するオリゴヌクレオチドであって、ここで、該カチオン性ヌクレオシド間結合が以下の構造（ＩＩ）：
【００２５】
【化３】
を有し、ここで；
Ｗは、Ｏ、ＳおよびＳｅからなる群より選択され；
ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ４）Ｒ５、およびＮＲ６からなる群より独立して選択され、ここでＲ４およびＲ５はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群より独立して選択され、Ｒ６はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレンおよびＮＲ７からなる群より選択され、ここで、Ｒ７はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯまたはＳであり；
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、１〜４個のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲ２およびＲ３は、５員環もしくは６員環のアルキルもしくはアリール環、またはＮ−、Ｏ−もしくはＳ−を含む複素環を形成するように結合され得；そして
ここで、Ｐ＊は２つの異なる立体異性体的配置で存在してもよいししなくてもよいリン原子であり、
そして、さらに該結合は立体的に均一であってもよいしそうでなくてもよい、オリゴヌクレオチド。
（項目２０）ＺがＮＲ５である、項目１９に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２１）Ｒ５がＨである、項目２０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２２）ＸおよびＹがＯである、項目２０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２３）Ｒ１がＣ１〜Ｃ６アルキレンである、項目２０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２４）Ｒ１が（ＣＨ２）３である、項目２３に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２５）Ｒ２およびＲ３がＣ１〜Ｃ６アルキルである、項目２０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２６）Ｒ２およびＲ３がＣＨ３である、項目２５に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２７）ＷがＳである、項目２０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２８）Ｒ１がＣ１〜Ｃ６アルキレンである、項目２０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２９）Ｒ１が（ＣＨ２）２である、項目２８に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３０）Ｒ２およびＲ３が１〜４個のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルである、項目２０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３１）Ｒ２およびＲ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である、項目３０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３２）以下の構造（ＩＩ）：
【００２６】
【化４】
を有する少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドであって、ここで；
Ｗは、Ｏ、ＳおよびＳｅからなる群より選択され；
ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ４）Ｒ５、およびＮＲ６からなる群より独立して選択され、ここでＲ４およびＲ５はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群より独立して選択され、Ｒ６はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレンおよびＮＲ７からなる群より選択され、ここで、Ｒ７はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯまたはＳであり；
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、１〜４個のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲ２およびＲ３は、５員環もしくは６員環のアルキルもしくはアリール環、またはＮ−、Ｏ−もしくはＳ−を含む複素環を形成するように結合され得；そして
ここで、Ｐ＊は２つの異なる立体異性体的配置で存在してもよいししなくてもよいリン原子であり、
そして、さらに該結合は立体的に均一であってもよいしそうでなくてもよい、オリゴヌクレオチド。
（項目３３）以下の構造（Ｉ）：
【００２７】
【化５】
を有する少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを作製するための方法であって、ここで：
Ｗは、Ｏ、ＳおよびＳｅからなる群より選択され；
ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ４）Ｒ５および、ＮＲ６からなる群より独立して選択され、ここでＲ４およびＲ５はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群より独立して選択され、Ｒ６はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレンおよびＮＲ７からなる群より選択され、ここで、Ｒ７はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯ、ＳまたはＮＲ７であり；
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、１〜４個のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲ２およびＲ３は、５員環または６員環のアルキルまたはアリール環、またはＮ−、Ｏ−もしくはＳ−を含む複素環を形成するように結合され得；そして
ここで、Ｐ＊は２つの異なる立体異性体的配置で存在し得る不斉的なリン原子を表し、
そして、さらに該結合は該オリゴヌクレオチドの分子間で立体的に均一であり、該方法は、以下の工程：
（ａ）該カチオン性ヌクレオシド間結合および３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ保護基を含む、保護されたカチオン性ヌクレオチドダイマーのポイントラセミ混合物を合成する工程；
（ｂ）必要に応じて、該混合物中の該立体異性体を分割する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において単離された該カチオン性ヌクレオチドダイマーを脱保護する工程；
（ｄ）工程（ｃ）において提供された該脱保護されたカチオン性ヌクレオチドダイマーを、Ｃｌ−Ｐ（Ｎ（ｉＰｒ）２）−Ｏ−ＢＣＥとの反応によって、対応する３’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮホスホルアミダイト誘導体に変換する工程；および
（ｅ）該３’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮホスホルアミダイト誘導体を、オリゴヌクレオチド鎖の保護されていないヒドロキシル含有末端ユニットに結合する工程、
を包含する、方法。
（項目３４）核酸ハイブリダイゼーションアッセイであって、以下の工程：
（ａ）少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を含む標識されたオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程；
（ｂ）該プローブを一本鎖分析物核酸とハイブリダイズさせて標識された二重鎖を生成する工程；および
（ｃ）該標識された二重鎖を検出する工程
を包含する、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ。
（項目３５）前記カチオン性ヌクレオシド間結合が以下の構造（Ｉ）：
【００２８】
【化６】
を有する、項目３４に記載の核酸ハイブリダイゼーションアッセイであって、
ここで：
Ｗは、Ｏ、ＳおよびＳｅからなる群より選択され；
ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ４）Ｒ５、およびＮＲ６からなる群より独立して選択され、ここでＲ４およびＲ５はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群より独立して選択され、Ｒ６はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレンおよびＮＲ７からなる群より選択され、ここで、Ｒ７はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯ、ＳまたはＮＲ７であり；
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、１〜４個のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲ２およびＲ３は、５員環もしくは６員環のアルキルもしくはアリール環、またはＮ−、Ｏ−もしくはＳ−を含む複素環を形成するよう結合され得；そして
ここで、Ｐ＊は２つの異なる立体異性体的配置で存在し得る不斉的なリン原子を表し、
そしてさらに該結合は立体的に均一である、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ。
（項目３６）項目３４に記載の核酸ハイブリダイゼーションアッセイであって、ここで、前記オリゴヌクレオチドプローブは、カチオン性およびアニオン性ヌクレオシド間結合を交互に有し、ここで、該カチオン性ヌクレオシド間結合が以下の構造（ＩＩ）：
【００２９】
【化７】
を有し、ここで；
Ｗは、Ｏ、ＳおよびＳｅからなる群より選択され；
ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ４）Ｒ５、およびＮＲ６からなる群より独立して選択され、ここでＲ４およびＲ５はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群より独立して選択され、Ｒ６はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレンおよびＮＲ７からなる群より選択され、ここで、Ｒ７はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯまたはＳであり；
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、１〜４個のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲ２およびＲ３は、５員環もしくは６員環のアルキルもしくはアリール環、またはＮ−、Ｏ−もしくはＳ−を含む複素環を形成するように結合される、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ。
（項目３７）項目３４に記載の核酸ハイブリダイゼーションアッセイであって、ここで、前記カチオン性ヌクレオシド間結合が以下の構造（ＩＩ）：
【００３０】
【化８】
を有し、ここで；
Ｗは、Ｏ、ＳおよびＳｅからなる群より選択され；
ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ４）Ｒ５、およびＮＲ６からなる群より独立して選択され、ここでＲ４およびＲ５はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群より独立して選択され、Ｒ６はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレンおよびＮＲ７からなる群より選択され、ここで、Ｒ７はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯまたはＳであり；
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、１〜４個のＮＨ２基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲ２およびＲ３は、５員環もしくは６員環のアルキルもしくはアリール環、またはＮ−、Ｏ−もしくはＳ−を含む複素環を形成するように結合される、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ。
【００３１】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴は、以下の説明に部分的に記載され、そして以下を検討する際に部分的に当業者に明らかになるか、または本発明の実施によって学ばれ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
定義および名称：
本発明を詳細に開示および記載する前に、本発明が特定のアッセイ方式、材料または試薬（これらはもちろん変化し得る）に限定されないことを理解すべきである。本明細書中で使用される用語は特定の実施態様を記載する目的のためだけであり、そして限定する意図はないことも理解すべきである。
【００３３】
本明細書および添付の請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに別のことを示さない限り、複数の指示物を含むことに注意しなければならない。従って、例えば、「カチオン性ヌクレオシド間結合」を含むオリゴヌクレオチドに対する言及は、２またはそれ以上のカチオン性ヌクレオシド間結合を含む複数のポリヌクレオチドも含む、などである。
【００３４】
本明細書および以下の請求の範囲において、以下の意味を有すると定義される多くの用語に対する言及がなされる：
本明細書において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２’−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリン塩基またはピリミジン塩基のＮーグリコシドまたはＣーグリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド骨格（例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））およびポリモルホリノ（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ；Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ， Ｉｎｃ．（Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ， Ｏｒｅｇｏｎ）からＮｅｕｇｅｎｅＴＭポリマーとして市販されている））、および他の合成配列特異的核酸ポリマー（ポリマーが、ＤＮＡおよびＲＮＡで見出されるように、塩基対合および塩基重層を可能にする配置でヌクレオベース（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）を含むことを提供する）を含む他のポリマーに対する一般名称である。用語「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」との間で長さの違いは意図されず、そしてこれらの用語は互換的に使用される。これらの用語は分子の一次構造のみをいう。従って、これらの用語は二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖のＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、およびＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとの間のハイブリッドを含み、そして公知のタイプの改変体（例えば、当該分野において公知である標識、メチル化、「キャップ（ｃａｐ）」、アナログでの１またはそれ以上の天然に存在するヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間改変体）、ならびに非改変形態のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドもまた含まれる。ヌクレオチド間改変体は、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメート、など）を有する改変体および負に荷電した結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有する改変体、３’−オキシリボース部分または３’−デオキシリボース部分の２’−Ｏ−ヌクレオチド間結合を含む改変体、ペンダント部分、例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリＬーリジンなどを含む）を含む改変体、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を有する改変体、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化力を有する金属など）を含む改変体、アルキル化剤を含む改変体、改変された結合（例えば、αアノマー核酸など）を有する改変体などである。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、公知のプリン塩基およびピリミジン塩基だけでなく、改変された他の複素環式塩基も含む部分を包含することが理解される。このような改変は、メチル化プリンまたはメチル化ピリミジン、アシル化プリンまたはアシル化ピリミジン、あるいは他の複素環を包含する。さらに、用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、従来のリボース糖およびデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も含む部分を包含する。改変されたヌクレオシドまたはヌクレオチドもまた糖部分に改変を含む。例えば、ここで、１またはそれより多いヒドロキシル基がハロゲン、脂肪族基で置換されているか、あるいはエーテル、アミンとして官能化されているなどである。
【００３６】
名称「３’」は、ヌクレオシド間結合の構造的な表示において使用される場合、結合に対して５’側に位置するヌクレオシドのリボース部分の３’炭素との結合をいう。名称「５’」は、ヌクレオシド間結合の構造的な表示において使用される場合、結合に対して３’側に位置するヌクレオシドのリボース部分の５’炭素との結合をいう。しかし、上記に示すように、本発明を、骨格の一部分としてリボース糖を含むオリゴヌクレオチドに限定する意図はない。従って、当業者は、本明細書中に示されるような、カチオン性ヌクレオシド間結合を含む新規なオリゴヌクレオチドが、伝統的な３’および５’ヌクレオシド間結合に限定される必要はないことを理解する。
【００３７】
用語「カチオン性」は、本明細書中で使用される場合、約９未満、好ましくは約８未満のｐＨで正の電荷を有する化学的部分をいう。より好ましくは、中性に近い水溶液中の場合、すなわち約ｐＨ４〜ｐＨ８の範囲、好ましくは約ｐＨ７、最も好ましくは約ｐＨ７．３において、カチオン性部分は陽子を得て正の電荷を帯びる。従って、「カチオン性ヌクレオシド間結合」は、上記の条件下で正に帯電している置換基化学部分を含むような結合である。「カチオン性オリゴヌクレオチド」は、本明細書中では、１またはそれより多いカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを示すために使用される。
【００３８】
用語「アルキル」または「低級アルキル」は、本明細書で使用される場合、１〜６個の炭素原子の、分枝または非分枝の飽和炭化水素基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル（「ｉＰｒ」）、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチルなど）をいう。用語「アルキレン」または「低級アルキレン」は、本明細書で使用される場合、１〜６個の炭素原子を含む、二官能性の飽和分枝または非分枝炭化水素鎖をいい、そして例えば、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−ＣＨ２−ＣＨ２−）、プロピレン（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、２−メチルプロピレン（−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−）、ヘキシレン（−（ＣＨ２）３−）などを含む。
【００３９】
用語「アルケニレン」または「低級アルケニレン」は、本明細書中で使用する場合、２〜６個の炭素原子および少なくとも１つの二重結合を含む、二官能性の分枝または非分枝の炭化水素鎖をいう。用語「アルキニレン」または「低級アルキニレン」は、本明細書中で使用する場合、２〜６個の炭素原子および少なくとも１つの三重結合を含む、二官能性の分枝または非分枝の炭化水素鎖をいう。
【００４０】
用語「アリール」は、本明細書中で使用される場合、１〜５の芳香族環を含む、代表的には、ハロゲンおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群より選択される１またはそれより多い置換基で置換されていないかまたは置換されているかのいずれかの芳香族種をいう。
【００４１】
用語「アリーレン」は二官能性芳香族部分をいい；「単環式アリーレン」はフェニレン基をいう。これらの基は上記で概説されるような４つまでの環置換基で置換されていてもよい。
【００４２】
用語「複素環」はその従来の意味で使用され、複素原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン）を含む置換または非置換の芳香族環式分子および非芳香族環式分子を包含する。このような複素環の例には、ピロール、ピロリジン、ピリジン、ピペリジン、モルホリン、キノリン、インドール、ピリミジン、ピペラジン、ピペコリン、イミダゾール、ベンズイミダゾール、プリンなどが含まれる。これらの基はまた、上記で概説したように、置換されていてもよい。
【００４３】
「精製（された）」または「均質な」とは、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列に言及する場合、同じタイプまたは立体異性体的配置の他の生物学的高分子が実質的に存在することなく、示された分子が存在することを意味する。用語「精製（された）」または「均質な」は、本明細書中で使用される場合、好ましくは少なくとも約９０重量％、より好ましくは少なくとも約９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも約９８重量％の同じタイプの生物学的高分子が存在することを意味する。
【００４４】
用語「立体異性体」はその従来の意味で使用され、少なくとも１つの不斉的な原子を有する化学的化合物（この化合物は、同じ数および種類の原子ならびに同じ原子配置を有するが空間的な関係は異なる、２つまたはそれ以上の形態で存在し得る）をいう。不斉的なヌクレオシド間リン原子の場合、２つの可能な立体異性体的配置が存在する。
【００４５】
用語「立体異性体的に純粋」または「立体化学的に純粋」とは、他の立体異性体が実質的に存在することなく１つの立体異性体が存在することを意味する。少なくとも１つの不斉的なヌクレオシド間リン原子を含む分子に言及する場合、この用語は、他の立体異性体的配置が実質的に存在することなく、その不斉的なヌクレオシド間リン原子の１つの立体異性体的配置が存在することを意味する。用語「立体化学的に純粋」は、本明細書中で使用される場合、好ましくは少なくとも約７０重量％、より好ましくは少なくとも約８０重量％、そして最も好ましくは少なくとも約９０重量％の特定の立体異性体的配置のダイマーまたはオリゴヌクレオチドが、他の立体異性体的配置を除外して存在することを意味する。立体異性体の「分割」は、立体異性体が互いに分離されて立体異性体的に純粋な異性体を生成し得る手段を示す。「ポイントラセミ混合物（ｐｏｉｎｔ ｒａｃｅｍｉｃ ｍｉｘｔｕｒｅ）」または「ポイントラセミ化合物（ｐｏｉｎｔ ｒａｃｅｍａｔｅ）」は、本明細書中で、特定の不斉的なリン原子での両立体異性体が存在する立体異性体の混合物であると定義される。このような「ポイントラセミ混合物」は、代表的には、４０％〜６０％のオーダーの１つの立体異性体、およびこれに対応して６０％〜４０％の他の立体異性体を含むが、必ずしも必要ではない。しかし、一般的には、２つの立体異性体は概ね等量で存在する。例えば、不斉的なヌクレオシド間リンを有するダイマーでは、あるいは１つのこのような不斉的なリンを有するオリゴヌクレオチドでは、ポイントラセミ混合物は、一般的に、概ね等量の各立体異性体を含む。
【００４６】
ヌクレオシド間結合が２つの異なる立体異性体的配置のうちの１つで存在し得るような、不斉的なリン原子を有する特定のカチオン性ヌクレオシド間結合に言及する場合、用語「立体的均一（ｓｔｅｒｅｏｕｎｉｆｏｒｍ）」は、このヌクレオシド間結合を含むこのような分子の実質的な部分が、異なる立体異性体的配置で存在する結合を有することを意図する。「実質的な部分」は、好ましくは７０％より大きい、より好ましくは８０％より大きい、そして最も好ましくは９０％より大きいこのようなヌクレオシド間結合が立体異性体的配置で存在することを意図する。
【００４７】
立体異性体は、当該分野で公知の任意の種々の方法によって分割され得る。例えば、いくつかのラセミ混合物を、同様な立体異性体的配置の分子が、可視的に不斉的な結晶に集合する様式で結晶化させる。このような結晶は物理学的に分離されて、立体化学的に純粋な立体異性体を生成し得る。
【００４８】
当該分野で周知である第２の方法は、ラセミ混合物が、第２の標準的な不斉的な分子と反応することを可能にする化学的手順を包含する。例えば、ラセミ化合物が酸である場合、光学的に活性なアミン（例えば、キニン、ブルシンまたはストリキニーネ）を使用してこの混合物を分割し得る。この方法は、標準的な物理学的手段（例えば、蒸留、結晶化、クロマトグラフィーなど）によって分離され得る２つの立体異性体を生成する。
【００４９】
ヌクレオシド間リンに結合した置換基を含むオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間リンでのキラリティーによって決定される異性体が、実際にジアステレオマーである。なぜなら、オリゴヌクレオチド骨格の糖成分がキラルであるからである。ジアステレオマーは従来の方法（例えば、蒸留、結晶化、クロマトグラフィーなど）によって分離され得る。
【００５０】
ジアステレオマーである立体異性体は、薄層クロマトグラフィー（「ＴＬＣ」）、またはアキラルな媒体を使用するカラムクロマトグラフィーを使用して分離され得る。立体異性体のＴＬＣ分割は、固相（例えば、シリカ）を含む適切なＴＬＣプレート上で行われ得る。これは、必要に応じてキラル試薬などを含み、そして立体異性体を分割するに効果的である。ＴＬＣによって分離された立体異性体は、ＴＬＣ基質およびプレートの展開に使用された溶媒中におけるそれらの差分（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）溶解性によって特徴付けられ得る。代表的には、差分溶解性は、特定の溶媒系におけるプレート上での化合物の移動を、プレートの展開に使用された溶媒系の移動に対して決定することによって表される。従って、プレートの展開後のプレート上の立体異性体の位置は、溶媒の先端の位置に対する、化合物が塗布されたスポットから移動した距離として表される。この比は、代表的には、立体異性体のＲｆと呼ばれる。カラムクロマトグラフィーによる立体異性体の分割もまた、固相マトリックス（例えば、シリカゲル）を使用して行われ得る。これは、必要に応じて、当該分野において周知の技術および試薬を使用するキラル試薬を含む。より高いＲｆ、すなわち特定の溶媒系中のＴＬＣプレート上でのより高い移動性を有するかまたはカラムから最初に溶出する立体異性体は、本明細書中では、「最初に溶出する」異性体と呼ばれる。一方、より低いＲｆを有するかまたはカラムから２番目に溶出する立体異性体は、本明細書中では、「２番目に溶出する」異性体と呼ばれる。
【００５１】
リン原子での絶対的な立体化学は、Ｆａｔｈｉら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（前出）によって記載されるように、Ｌｏｓｃｈｎｅｒら（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：５０８３−５０８８の２Ｄ−ＮＭＲ法によって決定され得る。絶対的な立体化学的配置もまた、当該分野において周知である従来の方法（例えば、旋光分散（ｏｐｔｉｃａｌ ｒｏｔａｔｏｒｙ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）または円二色性（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）測定）によって決定され得る。
【００５２】
「随意の」または「必要に応じて」は、後に記載される事象または状況が生じてもよくまたは生じなくてもよいこと、ならびにその記載がその事象または状況が生じる例および生じない例を包含することを意味する。例えば、語句「必要に応じて置換されたアルキレン」は、アルキレン部分が置換されていてもよく、または置換されていなくてもよいこと、ならびにこの記載が置換されていないアルキレンおよび置換が存在するアルキレンの両方を包含することを意味する。
【００５３】
新規なオリゴヌクレオチド
本発明の新規なオリゴヌクレオチドは、以下の構造（Ｉ）を有するカチオン性ヌクレオシド間結合を含む：
【００５４】
【化１７】
構造（Ｉ）については、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は上記の規定の通りである。
【００５５】
この構造において、Ｐ＊は、例えば、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、ホスホチオエステルまたはアルキルアミノホスホネート結合中に存在する不斉的なリン原子を表す。オリゴヌクレオチドは、アニオン性および／またはカチオン性ヌクレオシド間結合の任意の組み合わせを含み得る。オリゴヌクレオチドにおいて、カチオン性ヌクレオシド間結合は、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、ホスホチオエステル、アルキルアミノホスホネート結合の任意の組み合わせであり得る。
【００５６】
不斉的なリン原子の存在の結果として、カチオン性ヌクレオシド間結合は、２つの立体異性体的配置のうちの１つで存在し得る。オリゴヌクレオチドは、以下に記載および例示されるように、２つの立体異性体のうちのただ１つが予め決定された任意のヌクレオシド間結合に存在するよう、すなわちオリゴヌクレオチド中の予め決定されたヌクレオシド間結合が立体的均一であるように調製され得る。
【００５７】
上記のように、ＷはＯ、ＳおよびＳｅであり得る。特に好ましい実施態様において、Ｐ＊が不斉的なリン原子であり、そしてこのような結合のそれぞれが立体的均一である場合、ＷはＳである。
【００５８】
ＸおよびＹは、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ４）Ｒ５であり得、ここでＲ４およびＲ５はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキル、ならびにＮＲ６（Ｒ６はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）からなる群より独立して選択される。好ましくは、ＸおよびＹは独立してＯ、Ｓ、ＣＨ２、ＮＨであり、より好ましくは、ＸおよびＹは共にＯである。
【００５９】
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルキニレンおよびＮＲ７（Ｒ７はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）であり得る。Ｐ＊が不斉的なリン原子であり、そして各カチオン性ヌクレオシド間結合が立体的均一であるとき、Ｗ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯ、ＳまたはＮＲ７である。好ましい立体的均一のカチオン性ヌクレオシド間結合において、ＺはＯまたはＮＨである。
【００６０】
本発明の他の好ましい実施態様において、カチオン性ヌクレオシド間結合は立体的均一である必要はない。これらの実施態様において、Ｗ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯまたはＳである。これらの実施態様のうちの１つのセットにおいて、オリゴヌクレオチドは、交互のカチオン性およびアニオン性ヌクレオシド間結合を含む。
【００６１】
Ｒ１は、低級アルキレン、低級アルケニレン、低級アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択される。従って、例えば、Ｒ１が結合である場合、ＺはＮＲ２Ｒ３に直接結合している。Ｒ１は、ヌクレオシド間リンとカチオン性中心との間のスペーサーを提供するよう選択され、そして核酸とハイブリダイズするための、カチオン性ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドの親和性を最適化するよう選ばれ得る。Ｒ１として有用な特に好ましい基には、（ＣＨ２）２または（ＣＨ２）３が含まれる。
【００６２】
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、低級アルキル、１〜４個のＮＨ２基で置換された低級アルキル、および単環式アリールの任意の組み合わせであり得る。あるいは、Ｒ２およびＲ３は、５員環または６員環のアルキルまたはアリール環、またはＮ、ＯもしくはＳを含む複素環を形成するよう結合され得る。Ｐ＊が不斉的なリン原子であり、そしてこのような結合のそれぞれが立体的均一である場合、Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ＣＨ３、または１個のＮＨ２基で末端を置換された低級アルキルであることが好ましい。より好ましくは、Ｒ２およびＲ３はＣＨ２ＮＨ２またはＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である。好ましい複素環には、ピロール、ピロリジン、ピリジン、ピペリジン、モルホリン、キノリン、インドール、ピリミジン、ピペラジン、ピペコリン、イミダゾール、ベンズイミダゾールおよびプリンが含まれ、これらはハロゲンまたはＣ１〜Ｃ６アルキルで置換されていなくてもあるいは置換されていてもよい。好ましい複素環には、イミダゾール、モルホリン、ピロリジン、ピペラジン、ピペコリン、メチルピペラジンが含まれる。
【００６３】
一般には、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、生理学的な条件下で加水分解に対して化学的に非感受性であり、ヌクレアーゼに対して抵抗性であるオリゴヌクレオチドを提供し、そして／あるいは相補的なオリゴヌクレオチドと安定な二重鎖を形成するカチオン性ヌクレオシド間結合を、オリゴヌクレオチドに提供するよう選ばれる。
【００６４】
１つの特に好ましい実施態様において、カチオン性ヌクレオシド間結合は下記の構造（ＩＩＩ）を有する
【００６５】
【化１８】
ここで、Ｐ＊は不斉的なリン原子を表し、その結果、この結合は、ヌクレオシド間結合を含むヌクレオチドダイマーのポイントラセミ混合物がシリカゲルカラムクロマトグラフィーを使用して分割される場合、最初に溶出した立体異性体の配置に対応する立体異性体的配置で存在する。
【００６６】
本明細書中で開示しそして特許請求したオリゴヌクレオチドは、カチオン性ヌクレオシド間結合によって置換される、任意の割合のアニオン性ＰＤＥ結合を有し得る。従って、オリゴヌクレオチドは、カチオン性ヌクレオシド間結合によって置換される、約１個程度のアニオン性ＰＤＥ結合を含み得、そしてカチオン性結合で置換される１００％程度のアニオン性ＰＤＥ結合を有し得る。負電荷と正電荷との割合は所望の正味の電荷を有するオリゴヌクレオチドを生成するよう変化し得る。オリゴヌクレオチドは、そこに組み込まれるカチオン性ヌクレオシド間結合の数に依存して、全体的に正、中性、または負の電荷を有し得る。
【００６７】
オリゴヌクレオチドは交互のアニオン性およびカチオン性ヌクレオシド間結合を含むよう調製され得る。本明細書の下記の実施例４に記載するように、交互のアニオン性およびカチオン性ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡと、アニオン性の対応物より安定な二重鎖を形成する。
【００６８】
アニオン性およびカチオン性ヌクレオシド間結合は、オリゴヌクレオチドじゅうにランダムに分布し得るか、またはアニオン性結合およびカチオン性結合のかたまりでオリゴヌクレオチド中に存在し得る。
【００６９】
本発明の１つの好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチド中の選択されたヌクレオシドの間に立体的均一なカチオン性ヌクレオシド間結合を有する。
【００７０】
カチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、従来のオリゴヌクレオチド合成技術を使用して調製され得る。例えば、その結合において予め決定された立体異性体的配置を有するカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、所望のホスホトリエステル、ホスホルアミデートまたはアルキルアミノホスホネート結合を有するダイマーブロックを合成し、ダイマーブロックの立体異性体を分割し、そしてダイマーブロックの分割された立体異性体を、固相オリゴヌクレオチド合成技術を使用してオリゴヌクレオチドに組み込むことによって調製され得る。最初に溶出する立体異性体または２番目に溶出する立体異性体のいずれかが、オリゴヌクレオチドに組み込まれ得る。例えば、以下の２つの立体異性体構造（ＩＶａ）および（ＩＶｂ）を有するカチオン性チミジレートダイマーは、実施例１に記載されそしてスキーム１に示されるように、５’−ＨＯ−Ｔ−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルジシリル（「ＴＢＤＭＳ」）をジメトキシトリチル（「ＤＭＴ」）−Ｔ−Ｏ−Ｐ（ＯＣＨ３）−Ｎ（ｉＰｒ）２と反応させることによって調製され得る。
【００７１】
【化１９】
（ここで、Ｔはチミジレートヌクレオシドを表す）
【００７２】
【化２０】
ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−Ｐ（ＯＣＨ３）−Ｎ（ＣＨＣＨ３）２（Ｖ）を、テトラゾール中で５’−ＨＯ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ（ＶＩ）と反応させた。この反応が本質的に終了した後、この反応混合物を濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、そしてＮａＨＣＯ３および８０％飽和ＮａＣｌで抽出した。有機相を乾燥させ、濾過し、そしてエバポレートして粗ホスファイト−トリエステル中間体（ＶＩＩ）を生成した。この中間体を、ヨウ素の存在下で３−ジアミノプロピルアミンと反応させた。最終反応の生成物は、粗ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−Ｐ（Ｏ）−（ＮＨ−（ＣＨ２）−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ（ＩＶａおよびＩＶｂ）のポイントラセミ混合物である。
【００７３】
さらに、このポイントラセミ化合物は、カチオン性ヌクレオシド間結合（この結合の配置は立体特異的である必要はない）を有するオリゴヌクレオチドを調製するために使用され得る。
【００７４】
カチオン性ホスホルアミデートヌクレオシド間結合を有するオリゴマーは、実施例６に記載される２段階法を用いて調製され得る。この反応は、メチルホスファイト−トリエステル結合を有する予め合成されたダイマーをジチオジピリジンで酸化して、活性化されたＳ−Ｐｙｒ−ホスホロチオジエステルを得ることを包含する。新たに形成された立体異性体は分割され得、そしてその後Ｓ−Ｐｙｒ基は３−ジメチルプロピルアミンのような反応アミンで置換されて、所望の立体化学的配置中に所望のホスホルアミデートジエステル結合を有するダイマーを生成する。
【００７５】
上記および実施例６に記載の２段階法は、カチオン性ホスホルアミデート結合オリゴマーの固相合成のために使用され得る。鎖伸張の間、オリゴマーをアミン溶液に曝さず、そして反応の終了時にすべてのＳ−Ｐｙｒ−ホスホロチオジエステル結合をホスホルアミデート結合に変換する。固相合成の間にヌクレオシド間結合を改変するこの方法は、ホスホルアミデート結合での立体特異性を生じない。
【００７６】
カチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを調製する他の方法は、当業者に明らかである。
【００７７】
カチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、核酸とで形成される二重鎖の安定性の増加の結果として、核酸に対するプローブとしての有用性を見出される。カチオン性および両性イオン性オリゴヌクレオチドは、核酸標的を含む二重鎖形成をさらに制御するために塩および／またはｐＨを使用する可能性を提供する。代表的には、オリゴヌクレオチドとＲＮＡ標的とのハイブリダイゼーションは、ＲＮＡにおける大規模な（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）２次構造および３次構造のために困難であり得る。しかし、低塩濃度で、これらの構造はよりずっと不安定である。ＲＮＡ標的と、塩濃度によって制御され得る、すなわち低塩で安定な二重鎖を形成するカチオン性オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖形成を可能にする。
【００７８】
例えば、増加した二重鎖安定性を有するオリゴヌクレオチドは、遺伝子研究、生物医学研究および臨床診断学において一般に使用される核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおける有用性を見出される。基本的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、一本鎖分析物核酸は、標識された一本鎖核酸プローブとハイブリダイズし、そして得られる標識された二重鎖を検出する。このようなアッセイにおけるハイブリダイゼーション工程は、適切なストリンジェンシー条件下で実施される。ストリンジェンシーは、熱力学的変数であるパラメータを変化させることによって制御され得る。このような変数は当該分野において周知であり、そしてホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度、ｐＨ、有機溶媒含有量、および温度を含む。好ましいストリンジェンシーの制御は、ｐＨおよび塩濃度である。ストリンジェンシーは分析物配列の長さおよび性質に依存して変化し得る。
【００７９】
この基本的なスキームの多様性は、正確性を向上させ、無関係（ｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ）の物質からの検出すべき二重鎖の分離を容易にし、そして／あるいは検出されるシグナルを増幅するように開発されてきた。１つのこのようなアッセイは、共有に譲渡されたＵｒｄｅａらの米国特許第４，８６８，１０５号に詳細に記載される（この開示は、本明細書中に参考として援用される）。さらに、塩濃度および／またはｐＨを変化させることによって二重鎖形成を制御する能力は、共有に譲渡されたＣｏｌｌｉｎｓらの米国特許出願第０８／２９８，０７３号（この開示は、本明細書中に参考として援用する）に記載されるように、非特異的なハイブリダイゼーションに起因するバックグランドノイズを減少させるために、カチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて特に有用とする。
【００８０】
カチオン性ヌクレオシド間結合を含むハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの構築が有用性を見出す別の応用は、アンチセンス化合物の設計においてである。アンチセンス化合物は、例えば、Ｃｈｉｎｇら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：１０００６−１００１０、Ｂｒｏｄｅｒら（１９９０）Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ． １１３：６０４−６１８、Ｌｏｒｅａｕら（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２７４：５３−５６、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１１５３５号、第ＷＯ９１／０９８６５号、第ＷＯ９１／０４７５３号、第ＷＯ９０／１３６４１号、第ＷＯ９１／１３０８０号、および第ＷＯ９１／０６６２９号に説明されるように、特定のタンパク質の産生を担うｍＲＮＡに結合し、そしてそのｍＲＮＡの生成を不能にするかまたは防ぐオリゴヌクレオチドである。従来のアンチセンス分子は、一般的に、種々のオリゴヌクレオチド種と反応し得る。三重構造（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズしたアンチセンス分子）もまた、アンチセンス機能を提供し得る。
【００８１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、これらを、アンチセンス分子として、天然に結合したオリゴヌクレオチドより望ましくする特性を有する。カチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、天然に存在するオリゴヌクレオチドを加水分解するヌクレアーゼに対してより抵抗性である。従って、カチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、細胞中でより長い半減期を有する。このようなオリゴヌクレオチドは、天然に存在する対応物より高い安定性で、細胞中の相補的なオリゴヌクレオチドと相互作用し得る。細胞中でのカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドによるこの実質的に安定な複合体の形成は、遺伝子発現の選択的な阻害を可能にする。
【００８２】
実験
本発明の実施には、他に指示しない限り、当該分野の技術の範囲内である合成有機化学、生化学、分子生物学などの従来の技術を用いる。このような技術は文献に十分に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔら編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）および一連の、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）を参照のこと。
【００８３】
本明細書中で言及されるすべての特許、特許出願、および刊行物は、前出および後出の両方とも、本明細書中で参考として援用される。
【００８４】
本発明は、その好ましい特定の実施態様に関して記載されるが、上記の説明および以下の実施例は、本発明の範囲を例示するが、限定しないことを意図することが理解される。本発明の範囲内の他の局面、利点および改変は、本発明に関連する分野における当業者に明白である。
【００８５】
以下の実施例において、使用された数字（例えば、量、温度など）に関して精確さを確実にするための努力がなされたが、いくらかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。温度は常に℃で与えられ、他に示されなければ、圧力は大気圧かまたはほぼ大気圧である。
【００８６】
ＮＭＲ分光学。以下の実施例において、ＮＭＲスペクトルはＶａｒｉａｎ ３００ＭＨｚ装置で記録した。３１Ｐスペクトルは１２１ＭＨｚにおいて、１４０ｐｐｍにセットされたトリメチルホスファイトに関して稼動させた。
【００８７】
高速液体クロマトグラフィー。逆相高速液体クロマトグラフィー（「ＲＰ−ＨＰＬＣ」）分析および精製を、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ ７．５）中５％のＣＨ３ＣＮへのＣＨ３ＣＮの０〜５０％グラジエント（２５分間）、流速１ｍＬ／分にて溶出させるＳｕｐｅｌｃｏ ＬＣ−１８ ５ミクロンカラム（２５ｃｍ×４．６ｍｍ）で行った。
【実施例】
【００８８】
実施例１
カチオンダイマー
ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳの合成
５’−ＨＯ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ（ＶＩ）（３．７グラム；１０．４ミリモル）およびテトラゾール（２０ミリモル）を乾燥アセトニトリル（２×１００ｍＬ）とともに共エバポレートし、そして残渣を乾燥アセトニトリル（５０ｍＬ）に溶解した。ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−Ｐ（ＯＣＨ３）−Ｎ（ｉＰｒ）２（Ｖ）（１０ミリモル）を、分液丸底フラスコ中の乾燥アセトニトリル（５０ｍＬ）に溶解し、次いで、ゆっくり５’−ＨＯ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ／テトラゾール溶液に５分間の時間をかけて添加した。シリカプレート上の薄層クロマトグラフィー分析を、２回、５％メタノール／ＣＨ２Ｃｌ２で展開した。ここで、ＤＭＴ陽性産物は、５’−ＨＯ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳよりわずかに速く移動し、反応が５分以内に完了した様であることを示した。
【００８９】
反応混合物を穏やかに濃縮して少量とし、４００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で希釈しそして有機相を５％ＮａＨＣＯ３水溶液（４００ｍＬ）および８０％飽和ＮａＣｌ水溶液（４００ｍＬ）で抽出した。有機相を固体ＮａＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートして乾燥した。残渣をトルエン（１００ｍＬ）およびアセトニトリル（２×２００ｍＬ）とともに共エバポレートして、１０グラムの粗製亜リン酸トリエステル中間体（ＶＩＩ）を得た。
【００９０】
粗製中間体を、さらなる精製を行わずに直接使用して、アセトニトリル（２００ｍＬ）に溶解した。希釈していない３−ジアミノプロピルアミン（１０ｍＬ；１６ミリモル）を溶液に直接添加し、続いて、急速撹拌しながら、ヨウ素（２．５３グラム；１０ミリモル）のアセトニトリル溶液（１００ｍＬ）を滴下して加えた。添加するとヨウ素の紫色は直ちに消失し、僅かに黄色が、添加の完了後に残った。反応混合物を４℃で１８時間放置した。
【００９１】
次いで、反応混合物を少量まで穏やかに濃縮し、そして４００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。この調製物の有機相を、１５％の亜硫酸水素ナトリウム（３００ｍＬ）、５％ＮａＨＣＯ３水溶液（２×４００ｍＬ）、そして８０％飽和ＮａＣｌ水溶液（２×４００ｍＬ）で抽出した。有機相を固体ＮａＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートして乾燥した。残渣を、トルエン（１００ｍＬ）およびアセトニトリル（２×２００ｍＬ）と共エバポレートし、１２グラムの粗製ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ（（ＩＶａ）および（ＩＶｂ））を得た。
【００９２】
生成物を、２％ ＴＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２中のメタノール（０〜６％）のグラジエントを用いてシリカゲルクロマトグラフィー（２％トリエチルアミン（「ＴＥＡ」）／ＣＨ２Ｃｌ２の溶媒系中に注いだ「６００ｍＬ」のＭｅｒｃｋシリカゲル６０）で分画し、１００ｍＬの画分を得た。画分１６〜２５をプールし、そして濃縮した。画分を上記のようにシリカゲルクロマトグラフィーにより、２％ ＴＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２中のメタノールの長い（ｄｒａｗｎ−ｏｕｔ）グラジエント（２％（８画分）、４％（１６画分）、５％（１６画分）および６％（１６画分）メタノール）で繰り返し、５０ｍＬの画分を採取した。３つのプールを単離した：＃１、画分１９〜２２；＃２、画分２３〜３２；そして＃３、画分３３〜４０。各プールを濃縮し、そしてトルエンおよびアセトニトリルとともに共エバポレートして、以下の特性を有する３つのプールを得た。
【００９３】
【化２１】
ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳの最初の精製物からのプール＃２を、さらにシリカゲルクロマトグラフィー（２％ＴＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２の溶媒系中に注いだ「４００ｍＬ」のＭｅｒｃｋシリカゲル６０）により、２％ ＴＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２中のメタノールのグラジエント（２％（１６個の５０−ｍＬ画分）、３％（８×５０ｍＬ、１０×２５ｍＬ）、４％（１６×５０ｍＬ）および５％（６×５０ｍＬ））を用いて、分画した。以下のように、３つのプールを単離した：プール＃１、画分２４〜３４：最初に溶出する異性体、１．６２グラム；プール＃２、画分２３〜３２：異性体の混合物、０．７３グラム；そしてプール＃３、画分３３〜４０：２番目に溶出する異性体、１．２グラム。
【００９４】
ＴＢＤＭＳ基の脱離は、テトラブチルアンモニウムフルオライド（「ＴＢＡＦ」）を用いて達成した。１９ｍＬのアセトニトリル中のシリカ精製したＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ（最初の精製物からのプール＃１（１．１４グラム；０．９５ミリモル））を、５当量のＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１ＭのＴＢＡＦの５ｍＬ）で２．５時間処理し、その時間で、反応は事実上完結した。反応混合物を２５０ｍＬの塩化メチレンで希釈し、そして５％ＮａＨＣＯ３水溶液（２５０ｍＬ）および８０％飽和ＮａＣｌ水溶液（２５０ｍＬ）で抽出した。有機相を固体ＮａＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして乾燥するまでエバポレートした。残渣をトルエン（１００ｍＬ）およびアセトニトリル（２×２００ｍＬ）とともに共エバポレートした。プール＃１からの粗製ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）−Ｎ（ＣＨ２）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−Ｈを、シリカゲルクロマトグラフィー（２％ＴＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２溶媒系中に注いだ「２５０ｍＬ」のＭｅｒｃｋシリカゲル６０）により、２％ ＴＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２中のメタノール（０〜１８％）のグラジエント（０％（４画分）、３％（４画分）、６％（８画分）、９％（８画分）、１２％（８画分）、１５％（８画分）、１８％（８画分））を用いて精製し、５０ｍＬの画分を採取した。画分３２〜４０をプールした。
【００９５】
プールした画分３２〜４０の濃縮により、純粋なＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−ＯＨ（最初に溶出する異性体；０．６１グラム；０．５７ミリモル）を得た。外部標準としてｄ６−ＤＭＳＯを用いたＣＨ２Ｃｌ２中の３１Ｐ ＮＭＲ：８．３ｐｐｍ（１００％）；外部標準としてｄ６−ＤＭＳＯを用いたＣＨ３ＣＮ中の３１Ｐ ＮＭＲ：８．８７ｐｐｍ（１００％）。
【００９６】
同様に、シリカ精製したＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ（最初の精製物からのプール＃３（０．８グラム；０．７ミリモル））を、５当量のＴＢＡＦで処理した。ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ（プール＃１）についての上記のような、後処理（ｗｏｒｋｕｐ）および精製により、純粋なＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−ＯＨ（より遅い異性体；０．５７グラム；０．５３ミリモル）を得た。３１Ｐ ＮＭＲ（外部標準としてｄ６−ＤＭＳＯを用いたＣＨ２Ｃｌ２）：８．５７ｐｐｍ（９８％）。
【００９７】
実施例２
ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−Ｐ（Ｎ（ｉＰｒ）２）−Ｏ−ＢＣＥ
の合成
ＤＩＰＥＡ（５．７ミリモル）を含有するＣＨ２Ｃｌ２中のＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−ＯＨ（最初に溶出する異性体；０．６１グラム；０．５７ミリモル）をＣｌ−Ｐ（Ｎ（ｉＰｒ）２）−Ｏ−ＢＣＥ（１．１４ミリモル；２倍過剰）と反応させた、ここで、ＢＣＥは、β−シアノエチルである。反応の進行を、２％ＴＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２中の８％メタノール中におけるＴＬＣによりモニターした。反応混合物を４℃にて１８時間放置した。反応混合物を２５０ｍＬの塩化メチレンで希釈し、そして５％ＮａＨＣＯ３水溶液（２５０ｍＬ）および８０％飽和ＮａＣｌ水溶液（２５０ｍＬ）で抽出した。有機相を固体ＮａＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして乾燥するまでエバポレートした。残渣をトルエン（５０ｍＬ）およびアセトニトリル（２×１００ｍＬ）とともに共エバポレートして、０．６グラムを得た（０．４７ミリモル）。３１Ｐ ＮＭＲ（外部標準としてｄ６−ＤＭＳＯを用いたＣＨ３ＣＮ）：１４８．５、１４８．３、８．８７ｐｐｍ（積分：ホスホルアミダイト対ホスホルアミデートの比１／１）。
【００９８】
ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−ＯＨ（２番目に溶出する異性体；０．５７グラム；０．５３ミリモル）を、同様の手順を用いて、ＢＣＥホスホルアミダイトに変換し、０．６グラムの生成物を得た。３１Ｐ ＮＭＲ（外部標準としてｄ６−ＤＭＳＯを用いたＣＨ３ＣＮ）：１４８．５、１４８．３、９．０７ｐｐｍ（積分：ホスホルアミダイト対ホスホルアミデートの比１／１）。
【００９９】
ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−ＴＢＤＭＳの立体異性体を、ＴＬＣおよびシリカ上のカラムクロマトグラフィーにより、容易に分離した。しかし、３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ基の除去の後、それらをいずれの溶媒系におけるＴＬＣによっても分割できなかった。
【０１００】
ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−Ｏ−Ｐ（Ｎ（ｉＰｒ）２）−（Ｏ−ＢＣＥ）についてのＮＭＲデータ。
【０１０１】
（ａ）最初に溶出する異性体。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：９．０（ｓ、１Ｈ、ＮＨ、Ｄにより交換可能）；７．４８（ｓ、１Ｈ、Ｈ６）；７．４５（ｓ、１Ｈ、Ｈ６）；７．４５〜６．８（ｍ、１３Ｈ、トリチル）；６．１６（ｔ、１Ｈ、Ｈ１’）；６．１５（ｔ、１Ｈ、Ｈ１’）；５．０５（ｍ、１Ｈ、Ｈ３’）；４．１６（ｍ、１Ｈ、Ｈ３’）；４．１（ｍ、１Ｈ、Ｈ４’）；４．０５〜３．９（ｍ、２Ｈ、Ｈ５’、５’）；３．８５（ｍ、１Ｈ、Ｈ４’）；３．７５（ｓ、６Ｈ、ＯＣＨ３）；３．２８〜３．２１（ｍ、２Ｈ、Ｈ５’）；２．９〜２．７（ｍ、４Ｈ、ＮＣＨ２）；２．４６（ｍ、２Ｈ、Ｈ２’）；２．３（ｓ、６Ｈ）；２．０６（ｍ、２Ｈ、Ｈ２’）；１．７４（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）；１．７〜１．５（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２）；１．４３（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）；１．０（ｓ、９Ｈ）；０．０（ｓ、６Ｈ）；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：８．７５ｐｐｍ。
【０１０２】
（ｂ）２番目に溶出する異性体：３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：９．１ｐｐｍ。
【０１０３】
ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−Ｔ−３’−Ｏ−Ｐ（Ｎ（ｉＰｒ）２）−Ｏ−ＢＣＥについてのＮＭＲデータ。
【０１０４】
（ａ）最初に溶出する異性体：３１Ｐ ＮＭＲ：１４８．５ｐｐｍ、１４７．９ｐｐｍ、８．７５ｐｐｍ（ホスホルアミダイト／ホスホルアミデートの積分比＝１：１）。
【０１０５】
（ｂ）２番目に溶出する：１４８．４５ｐｐｍ、１４７．９６ｐｐｍ、９．１ｐｐｍ（ホスホルアミダイト／ホスホルアミデートの積分比＝１：１）。
【０１０６】
実施例３
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｕ（２’−Ｏ−（ＣＨ３））−３’−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−
５’−Ｏ−Ｕ（２’−Ｏ−（ＣＨ３））−３’−ＯＲの合成
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｕ（２’−Ｏ−（ＣＨ３））−３’−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−５’−Ｏ−Ｕ（２’−Ｏ−ＣＨ３）−３’−ＯＲ（ここでＲはＴＢＤＭＳ、ＨまたはＰ（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）−Ｎ（ｉＰｒ）２である）を、以下のように合成した。
【０１０７】
７．９ミリモルの５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｕ（２’−Ｏ−ＣＨ３）−３’−Ｏ−Ｐ（Ｏ−ＣＨ３）−Ｎ（ｉＰｒ）２（ＭＷ７２１）を、市販の５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｕ（２’−Ｏ−ＣＨ３）−３’−ＯＨ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入した）から調製した。５’−Ｏ−Ｕ（２’−Ｏ−ＣＨ３）−３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳを、５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｕ（２’−Ｏ−ＣＨ３）−３’−ＯＨ（Ｍｏｎｏｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から購入した）から調製した。５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｕ（２’−Ｏ−ＣＨ３）−３’−Ｏ−Ｐ（Ｏ−ＣＨ３）−Ｎ（ｉＰｒ）２（ＭＷ７２１０）（７．９ミリモル）と５’−Ｏ−Ｕ（２’−Ｏ−ＣＨ３）−３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ（８ミリモル）とを、テトラゾール（１６ミリモル）の存在下で、まずカップリングして、十分に保護された誘導体を調製し、ホスファイトトリエステル中間体を得た。ホスファイトトリエステル中間体（ＶＩＩ）（実質的に実施例１に記載の通り、水性後処理（ａｑｕｅｏｕｓ ｗｏｒｋｕｐ）の後に直接使用した）を、２倍過剰の３−ジメチルアミノプロピルアミンと混合し、そしてＣＨ３ＣＮ中の０．１Ｍヨウ素溶液８０ｍＬと反応させた。実施例１に記載の水性後処理の後、この反応で８．５４グラムの粗製生成物を得た。３１Ｐ−ＮＭＲ（外部標準としてｄ６−ＤＭＳＯを用いたＣＨ３ＣＮにおいて）：８．９および９．５ｐｐｍ。
【０１０８】
実施例１および２の記載と同様にシリカゲルクロマトグラフィー（「７００ｍＬ」のＭｅｒｃｋシリカゲル６０）による精製を行って、２つの画分プールを得た：最初に溶出する画分（画分番号３２〜４４、１．６９グラム、３１Ｐ−ＮＭＲ ８．９ｐｐｍ（１００％））および画分番号４７〜６０、低速、１．６２グラム、３１Ｐ−ＮＭＲ ８．９ｐｐｍ（＞５％）、９．５ｐｐｍ（８０％）、１０．２＋１０．７ｐｐｍ（合計１８％）（正体不明）。
【０１０９】
実施例４
立体規定ホスホルアミデート結合
を交互に有するカチオン性オリゴマーの調製
アニオン性および立体均一なカチオン性ホスホルアミデート結合を交互に有するオリゴヌクレオチドを、カチオン性の立体異性体的に純粋なＴｐ（＋）Ｔダイマーホスホルアミダイトを取り込むことにより調製した。ここで、Ｔｐ（＋）Ｔは、ヌクレオシド間のリン原子上のカチオン性ジメチルアミノプロピルアミド置換基を示し、そしてＴｐ（−）Ｔは、従来のホスホジエステルヌクレオシド間結合を示す。
【０１１０】
以下のオリゴマーを、実施例１〜３に記載した方法を用いて合成した：（Ｔｐ（＋）Ｔｐ）７Ｔ（最初に溶出する異性体を用いる）；（Ｔｐ（＋）Ｔｐ）７Ｔ（２番目に溶出する異性体を用いる）；および（Ｔｐ（＋）Ｔｐ）７Ｔ（ポイントラセミ化合物、すなわち、任意の１位置における第１および２番目に溶出する異性体のランダム混合物）。
【０１１１】
カチオン性ダイマーを用いたオリゴマー合成を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ＤＮＡ合成装置上で、１０分間のカップリング工程を用いて行った。ＤＭＴ−Ｔｐ（＋）Ｔ ＢＣＥ（最初に溶出する異性体または２番目に溶出する異性体、あるいはポイントラセミ化合物（ほぼ等量の第１および２番目に溶出する異性体））を、乾燥アセトニトリルに溶解して、０．１Ｍの濃度にした。合成したオリゴマー配列は、７サイクルのダイマー付加によるＤＭＴ−（Ｔｐ（＋）Ｔｐ）７Ｔであった；最終ＤＭＴは取り出されなかった。ＮＨ４ＯＨ水溶液を用いて（１時間／２０℃）、粗製オリゴマーを支持体から切断した。上清を濃縮し、そして残渣を４００μＬの水に再溶解した。２０分付近に１つの主要なピーク溶出を示したすべての場合、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による粗製オリゴマー生成物の分析を、実験のセクションに記載したように行った。
【０１１２】
完全長ＤＭＴ生成物を逆相ＨＰＬＣ（「ＲＰ−ＨＰＬＣ」）により、１００μＬ（約４３Ａ２６０単位）の注入により精製した。２０分付近のピーク溶出を集め（約１ｍＬ）、そしてエバポレートして乾燥した。残渣を２００μＬの８０％酢酸水溶液に１時間再溶解して、５’−末端のＤＭＴ基を除去した。酸溶液をエバポレートにより除去し、そして残渣を、１００μＬの８０％酢酸水溶液に再溶解した。溶液を１時間室温にて放置し、次いで、エバポレートして乾燥した。残渣を約０．５ｍＬの水に溶解した。水溶液を約０．５ｍＬの酢酸エチルで２回洗浄し、次いで凍結乾燥した。細かい粒子状の物質を遠心分離により除去した。脱トリチル化したオリゴマーを、最終的にＲＰ−ＨＰＬＣにより、上記と同じ手順を用いて精製した。
【０１１３】
実施例５
異性体分解によるダイマーブロックの調製
本実施例に記載する方法は、１つのモノマータイプを用いた、固体支持体上でのモノマー単位からのカチオン性オリゴマーの合成に使用し得る。この方法は、ヌクレオシドメチルホスホルアミダイトを用いて例証された。
【０１１４】
Ａ．ホスホロチオエートダイマーＴｐ（Ｓ）Ｔを、ピリジン中の２〜４倍過剰のＭｅＳＯ２−Ｃｌで処理した。出発物質を完全に消費して、２つの新たな３１Ｐ ＮＭＲシグナルを６７ｐｐｍ／６８ｐｐｍで得た。反応混合物をジメチルアミノプロピルアミン（「ＤＭＡＰＡ」）でクエンチしたとき、６７ｐｐｍ／６８ｐｐｍのシグナルは、直ちに、７２ｐｐｍ／７３ｐｐｍの新たなペアに置き替えられた；Ｎｕ−Ｏ−Ｐ−（Ｏ）（ＮＨ−Ｒ）−Ｏ−Ｎｕに対応する、８．８ｐｐｍ／９．４ｐｐｍのシグナルは、観察されなかった。
【０１１５】
Ｂ．２０℃にて、ＭｅＳＯ２−Ｃｌ（２０μＬ；２倍過剰）を、ピリジン中の５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−Ｐ（Ｓ）Ｏ−Ｏ−５’−Ｔ−３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ（０．２Ｍ溶液の０．６ｍＬ）に添加した。反応は、３１Ｐ ＮＭＲにより６７／６ｐｐｍおよび６７／０ｐｐｍの２つの新たなシグナルで判断されるように、数分で完了した。ＤＭＡＰＡ（ホスホロチオエートに対して４倍過剰）を添加し、そして反応を進行させた。５分より短い時間の後、３１Ｐ ＮＭＲは、６７．６ｐｐｍおよび６７．０ｐｐｍの２つのシグナルが完全に消失し、新たな７３．５ｐｐｍおよび７２．９ｐｐｍの、２つのシグナルに置き替えられたことを示した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、ＮａＨＣＯ３およびＮａＣｌで抽出した。粗製生成物のＴＬＣは、２つのＤＭＴ／糖陽性スポットを示し、これは、２％ＴＥＡ／８％ＭｅＯＨ／９０％ＣＨ２Ｃｌ２中で、５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｔ−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−５’−Ｔ−３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳよりわずかに速く移動した。従って、反応は排他的に、いずれのＳ活性化を伴うことなくＯ活性化に導く。
【０１１６】
実施例６
カチオン性ヌクレオシド間ホスホルアミデート結合を有する
カチオン性ダイマーの調製
本実施例は、カチオン性ホスホルアミデート結合したオリゴマーの２段階合成を記載する。この反応は、メチルホスファイト−トリエステル結合を、ジチオジピリジンで酸化して、活性化Ｓ−Ｐｙｒ−ホスホロチオジエステルを得、続いてアミンで置換して所望のホスホルアミデートジエステル結合を得る工程を包含する。このスキームは、カチオン性ホスホルアミデート結合オリゴマーの固相合成に関して魅力的である。鎖延長の間、オリゴマーはアミン溶液に曝されず、そして反応の終了時にすべてのＳ−Ｐｙｒ−ホスホロチオジエステル結合は、ホスホルアミデート結合に変換される。
【０１１７】
トリエチルアミン（０．１ｍＬ）を、ＣＨ３ＣＮ中のＤＭＴ−Ｏ５’−Ｔ−Ｏ３’−Ｐ（Ｏ−（ＣＨ３））−Ｏ５’−Ｏ３’−ＴＢＤＭＳの溶液（０．３ｍＬ；０．２Ｍ）に添加した。ＣＨ３ＣＮ中の５倍過剰のジチオピリジン（０．３ｍＬ；１．０Ｍ）を添加し、そして反応を２０℃にて進行させた。反応の経過に続いてＮＭＲを行った。
【０１１８】
出発物質の２つの立体異性体に対応する最初の１４０ｐｐｍの２つのシグナルは、３時間後に消失し、そしてＤＭＴ−Ｏ５’−Ｔ−Ｏ３’−ＰＯ（Ｓ−Ｐｙｒ）−Ｏ５’−Ｔ−Ｏ３’−ＴＢＤＭＳの２つの立体異性体に対応する２０．３ｐｐｍ／２０．６ｐｐｍの新たな２つのシグナルに置き換わった。
【０１１９】
０．２ｍＬの３−ジメチルプロピルアミンを、ＮＭＲチューブに直接加えた。約１時間後、２０．３ｐｐｍ／２０．６ｐｐｍシグナルは、ＤＭＴ−Ｏ５’−Ｔ−Ｏ３’−ＰＯ（ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ５’−Ｔ−Ｏ３’−ＴＢＤＭＳの２つの立体異性体に対応する９．１ｐｐｍ／８．８ｐｐｍの２つの新たなシグナルに置き換わった。薄層クロマトグラフィー分析により、ヌクレオチド的な物質のみが、実施例１に記載の方法により調製された化合物の純種のサンプルとともに共移動することを確認した。
【０１２０】
実施例７
カチオン性ホスホルアミデート結合の
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション特性への効果
オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性へのカチオン性ヌクレオシド間結合の効果を、アニオン性およびカチオン性ホスホルアミデート結合を交互に有するオリゴヌクレオチドを用いて評価した。カチオン結合は立体異性体的に純粋であった。従って、カチオン性オリゴヌクレオチドを合成するのに用いたダイマーブロックは、実施例１に記載されたように調製した、立体異性体的に純粋なＴｐ（＋）Ｔダイマーホスホルアミデートであった。ポイントラセミの［Ｔｐ（＋）Ｔｐ（−）］７Ｔ（ここでｐ（＋）およびｐ（−）は上記に定義された通りである）を、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０〜４４７１に記載された通りに合成した。［Ｔｐ（＋）Ｔｐ（−）］７Ｔの構造を有するオリゴヌクレオチドアナログを、固体支持体上で、シリカゲルカラムから最初にまたは２番目に溶出する５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｔｐ（＋）Ｔ−３’−Ｐ（Ｎ（ｉＰｒ）２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮの純粋な立体異性体、あるいは最初に溶出する異性体と２番目に溶出する異性体とのポイントラセミ混合物のいずれかを用いて、標準的なホスホルアミダイト化学を用いて合成した。各合成の生成物を、ＲＰ−ＨＰＬＣによりＤＭＴ形態で精製し、続いて８０％酢酸水溶液で脱トリチル化した。最終生成物を貯蔵のために凍結乾燥した。
【０１２１】
陽性および陰性結合を交互に含有するカチオン性ホモチミジンオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を、ポリ（ｄＡ）およびポリ（Ａ）標的配列に対して評価した。１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．３）において、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ ２ ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計で、熱融解分析を行った。カチオン性オリゴヌクレオチドの濃度は約５μＭであった。１℃／分の温度勾配で、２６０ｎｍ、２８０ｎｍ、および３３０ｎｍにおいて、吸光度の変化を測定した。Ｔｍは、温度に対するＡ２６０のプロットにおける最大傾斜領域の中点に対応する温度である。
【０１２２】
二重鎖形成についてのオリゴヌクレオチド配列および融解温度を表１および２に示す。
【０１２３】
【化２２】
【０１２４】
【化２３】
【０１２５】
【化２４】
表１および表２のハイブリダイゼーションデータは、速く溶出する立体異性体形態に対応する立体異性体的ホスホルアミデート結合を有するカチオン性オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ標的と非常に安定な二重鎖を形成することを示す。加えて、試験したカチオン性オリゴヌクレオチド（最初に溶出する、またはポイントラセミ化合物）についての二重鎖安定性が示されたこれらのデータは、実質的に塩濃度非依存性であった。このハイブリダイゼーション挙動は、天然に発生する全アニオン性オリゴヌクレオチド（塩濃度に非常に依存するそのＤＮＡ標的と二重鎖を形成する）ときわめて異なる。一般的に、２番目に溶出する立体異性体に対応する立体異性体的ホスホルアミデート結合を有するカチオン性オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ標的との安定な二重鎖を形成しない。
【０１２６】
例えば、この実験において、正常な全アニオン性オリゴヌクレオチド−ポリ（ｄＡ）二重鎖についてのＴｍは、塩濃度が１．０Ｍから０．１Ｍまで、さらに塩添加なしまで下げられた場合、５３℃から３５℃まで、さらに２５℃まで減少した。対照的に、最初に溶出するＴｐ（＋）Ｔ異性体から調製されたカチオン性オリゴヌクレオチドは、塩濃度非依存性である最高のＴｍ値を有した。塩がない場合でさえ（この条件下では、天然オリゴマーに対する二重鎖安定性の劇的な損失が観察された）、最初に溶出するＴｐ（＋）Ｔ異性体から調製されたカチオン性オリゴヌクレオチドで得られたＴｍ値は５６℃であった。２番目に溶出するＴｐ（＋）Ｔ異性体から調製されたカチオン性オリゴヌクレオチドは、塩がない場合および０．１Ｍ ＮａＣｌの場合に、ポリ（ｄＡ）と安定な二重鎖を形成しなかった。１．０Ｍ ＮａＣｌの場合でさえ、２番目に溶出する異性体は、最初に溶出する異性体から調製されたカチオン性ヌクレオチドで得られたＴｍ値より低いＴｍ値（−１７℃）を示した。Ｔｐ（＋）Ｔのポイントラセミ混合物から調製されたカチオン性オリゴヌクレオチドは、塩濃度が０および低い場合、中間の安定性を有する二重鎖ＤＮＡ分子を形成した；しかし、ポイントラセミ化合物についてのＴｍ値は、塩非依存性であり、そして塩が添加されない場合、ポイントラセミ化合物で得られたＴｍ値は、全アニオン性オリゴヌクレオチドよりも大きかった。
【０１２７】
より高いＴｍ値を反映して、ポリ（Ａ）標的との二重鎖安定性は、最初に溶出するカチオン性オリゴマーについて、全アニオン性オリゴマーについてよりも高かった。２番目に溶出する異性体は、ポリ（Ａ）と安定な二重鎖を形成しなかったが、ポイントラセミ化合物は、中間の二重鎖安定性を示した。
【０１２８】
実施例８
カチオン性ホスホトリエステル結合の
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション特性への効果
（１）全標準ホスホジエステルヌクレオシド間結合（５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’）；（２）交互のアニオン性標準ＰＤＥ結合およびカチオン性ホスホルアミデートヌクレオシド間結合、ここでカチオン性Ｎ−置換基はジメチルアミノプロピルである（［Ｔｐ（Ｎ＋）Ｔｐ（−）］７Ｔと表す）（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １１０：４４７１〜４４７２）；および（３）交互の標準ＰＤＥ結合およびカチオン性ホスホトリエステルヌクレオシド間結合、ここでカチオン性置換基はジメチルアミノプロピル（「［Ｔｐ（Ｏ＋）Ｔｐ（−）７Ｔ］」と表す）である（固体支持体上で、標準的なホスホルアミダイト化学を用いて合成される）を有する３つのチミジンオリゴヌクレオチドを調製した。
【０１２９】
交互の陽性および陰性の結合を含有するカチオン性ホモチミジンオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を、ポリ（ｄＡ）に対して、実施例７に記載したように評価した。結果を表３に示す。
【０１３０】
【化２５】
表３のデータは、［Ｔｐ（Ｏ＋）Ｔｐ（−）］７Ｔオリゴマーが、塩濃度に非依存性であり、そして全アニオン性チミジン１５マーよりも、１０℃（０．１Ｍ ＮａＣｌ）および２１℃（ＮａＣｌなし）高いＴｍを有することを示す。加えて、［Ｔｐ（Ｏ＋）Ｔｐ（−）］７Ｔオリゴマーは、［Ｔｐ（Ｎ＋）Ｔｐ（−）］７Ｔオリゴマーよりも安定なポリ（ｄＡ）との二重鎖を形成する。
【０１３１】
実施例９
チミジンおよび２’−Ｏ−メチルウリジン両性イオン性誘導体の
二重鎖標的へのハイブリダイゼーション
両性イオン性のチミジンおよび２’−Ｏ−メチルウリジン誘導体の二重鎖標的ｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）へのハイブリダイゼーションを研究し、このようなオリゴヌクレオチドの、二本鎖ＤＮＡについてのプローブとしての有用性を示した。他のオリゴマーの非存在下で、ｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）は、高安定性のｄＴ．ｄＡ幹（ｓｔｅｍ）を有する自己相補的（ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）構造を形成する（０．１ Ｍ ＮａＣｌ中でＴｍ ６２℃；１ Ｍ ＮａＣｌ中でＴｍ ７８℃）。すべての立体均一両性イオン性オリゴマーを、上記実施例１から６までに記載した手順、またはＨｏｒｎら（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７：７４３〜７４５およびＣｈａｔｕｒｖｅｄｉら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：２３１８〜２３２３に記載された手順を用いて調製した。上記のように、より高いＲｆを有する立体異性体を、本明細書中で、「最初に溶出する」異性体と表し、より低いＲｆを有する立体異性体を、本明細書中で、「２番目に溶出する」異性体と表す。
【０１３２】
オリゴチミジレート誘導体の二重鎖標的ｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）に対する親和性は、プローブの電荷および立体化学ならびに溶液のイオン強度に強く依存する（表４）。両性イオン性異性体の１つ、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）は、０．１Ｍ ＮａＣｌ中でさえ、標的との比較的安定な三本鎖複合体を形成した。ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）とｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）との等モル混合物についての融解曲線は、両性イオン性鎖の二重鎖セグメントからの解離についての遷移（Ｔｍ ２４℃）、ならびにｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）の変性についての遷移（Ｔｍ ６８℃）を示した。そして０℃におけるｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）のｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）での滴定について滴定液対Ａ２６０のプロットは、ｄＴ．ｄＡ．ｄＴモチーフを有する複合体のために、２つのオリゴマーの等モル濃度での遷移点を示した（データは示さず）。同じ条件下で、ｄＴ１５も両性イオン性異性体オリゴマーｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）もｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）と顕著には相互作用しなかった。高塩溶液（０．１Ｍ ＮａＣｌ）では、ｄＴ１５は、ｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）に結合した（Ｔｍ ３０℃）。ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）により形成した複合体の安定性はまた、塩濃度の増大とともに増加した（１．０Ｍ ＮａＣｌ中でのＴｍ ３２℃）。しかし、Ｔｍの上昇は、全アニオン性プローブの場合よりも低かった。オリゴマーｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）は、１Ｍ ＮａＣｌ中でさえも、ｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）と顕著に結合しなかった。
【０１３３】
ホスホジエステルオリゴヌクレオチドプローブ中の２’−Ｏ−メチルウリジンによるチミジンの置換が、プローブとで形成される三本鎖複合体の安定性を増強することが示されている（Ｅｓｃｕｄｅら（１９９２）Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ ＩＩＩ、３１５：５２１〜５２５）ので、立体異性体的オリゴマー（Ｕ’＋Ｕ’−）７ｄＴ（最初に溶出する）および（Ｕ’＋Ｕ’−）７ｄＴ（２番目に溶出する）を調製して、二本鎖標的への両性イオン性オリゴヌクレオチドの結合に対するこの置換体の効果を調べた。（Ｕ’＋Ｕ’−）７ｄＴ（最初に溶出する）（Ｔｍ３５℃、０．１Ｍ ＮａＣｌ）は、チミジンアナログ、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）（Ｔｍ２４℃、０．１Ｍ ＮａＣｌ）よりも効果的にｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）に結合した。異性体オリゴマー（Ｕ’＋Ｕ’−）７ｄＴ（２番目に溶出する）も、その対応するホスホジエステルコントロールＵ’１４ｄＴも、これらの条件下ではｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）と顕著に相互作用しなかった。三本鎖複合体についての結果とは対照的に、２’−Ｏ−メチルウリジン誘導体（Ｕ’＋Ｕ’−）７ｄＴ（最初に溶出する）は、ポリ（ｄＡ）の等価物への結合が、チミジンアナログｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）より効果的でないことが見出された。０Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、および１．０Ｍ ＮａＣｌ溶液中での二本鎖複合体の形成についてのＴｍ値は、それぞれ、（Ｕ’＋Ｕ’−）７ｄＴ（最初に溶出する）について３５℃、３６℃、および４１℃であり、そしてｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）については、５８℃、５８℃、および５８℃であった（Ｈｏｒｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．前出を参照のこと）。
【０１３４】
【化２６】
混合ｄＴ、ｄＣオリゴマーｄ（Ｔ＋Ｔ−）２（Ｔ＋Ｃ−）５Ｔ（最初に溶出する）およびｄ（Ｔ＋Ｔ−）２（Ｔ＋Ｃ−）５Ｔ（２番目に溶出する）のデータを表５に示す。標的ｄ［Ａ５（ＧＡ）５Ｔ４（ＴＣ）５Ｔ５］は、用いた条件（ｐＨ ７．０においてＴｍ ６８℃、そしてｐＨ ６．０においてＴｍ ６７℃；０．１Ｍ ＮａＣｌ）下で自己会合する。ｄＴ、ｄＣペンタデカマーは、ｄＴまたはｄＵ’ペンタデカマーがｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）に結合する親和性よりも高い親和性で、ｄ［Ａ５（ＧＡ）５Ｔ４（ＴＣ）５Ｔ５］に結合し、そして、ｄＣを含有する三本鎖構造について予想された（Ｌｉｐｓｅｔｔ、Ｍ．Ｎ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２３９：１２５６〜１２６０（１９６４））ように、親和性は、ｐＨ ６において、ｐＨ ７の場合よりも大きかった。両性イオン性プローブの１つ、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）２（Ｔ＋Ｃ−）５Ｔｂ（最初に溶出する）、および標的ｄ［Ａ５（ＧＡ）５Ｔ４（ＴＣ）５Ｔ５］により、ｐＨ ７の低塩溶液（０．１Ｍ ＮａＣｌ）中で、三本鎖複合体の熱的安定性が形成された。Ｔｍ値は、対応する全ホスホジエステルプローブによって形成された複合体についてのＴｍ値よりも２３℃高かった。両性イオン性オリゴヌクレオチドの高い親和性が、配列ならびにイオン電荷およびリンにおける立体化学に依存することが、実験により示された。この実験で、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）は、不適合の標的、ｄ［Ａ５（ＧＡ）５Ｔ４（ＴＣ）５Ｔ５］とペアになり、そしてｄ（Ｔ＋Ｔ−）２（Ｔ＋Ｃ−）５Ｔｂ（最初に溶出する）は、同様に、ｄ（Ｔ１５Ｃ４Ａ１５）とペアになった。これらの系のいずれもが、安定な三本鎖複合体を与えなかった（表４および５）。
【０１３５】
【化２７】
３つのペアの立体異性体的両性イオン性１５マーをこの研究のために調製した。第１のペアはチミジンから誘導され、第２のペアは２’−Ｏ−メチルウリジンから誘導され、そして第３のペアはチミジンおよびデオキシシチジンから誘導された。それぞれの場合において、所定のオリゴマーにおけるすべてのホスホルアミデート結合は、同じ形状を有した。熱変性実験は、三本鎖複合体の形成におけるこれらの交互カチオン性−アニオン性オリゴヌクレオチドの関係が、改変されたリン酸結合のキラリティに非常に依存することを示した。
【０１３６】
それぞれの場合、立体異性体的なプローブの１つ（最初に溶出する異性体と表される）は、対応する全ホスホジエステルプローブが結合するよりも効果的に相補的二本鎖ＤＮＡ標的に結合する。ｐＨ ７の０．１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中におけるＴｍの増強は、ｄＴおよびｄＴ、ｄＣ両性イオン性１５マー（ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）およびｄ（Ｔ＋Ｔ−）２（Ｔ＋Ｃ−）５Ｔ（最初に溶出する））について、２０℃のオーダーであり、そして２’−Ｏ−メチルウリジン誘導体（（Ｕ’＋Ｕ’−）７ｄＴ（最初に溶出する））について、約３５℃である。１Ｍ ＮａＣｌ溶液中におけるＴｍの増強は、比較して小さいが、しかし依然とし顕著である。プローブはいくつかのｄＣユニットを含むが、ｐＨ ７において、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）２（Ｔ＋Ｃ−）５Ｔ（最初に溶出する）の親和性が比較的高いことは注目すべきである。二本鎖標的に対するこの非対称的な混合塩基プローブの強力な結合は、２つのピリミジンおよび１つのプリン鎖から誘導された他の三本鎖複合体においてと同様に、第３の鎖がプリン鎖と平行に配向する構造と一致する。
【０１３７】
最初に溶出する立体異性体的オリゴマーでの結果と対照的に、リンにおける配置が反対であるホスホルアミデートオリゴマー（２番目に溶出する）は、二本鎖標的に対して非常に低い親和性を示した。異性体の絶対的配置がまだ確定的に指定されてなく、そして三本鎖複合体のジオメトリーについての構造的情報が限定されているので、これらの相違の理由についての推測は早尚である。しかしながら、興味深いことに、二本鎖ＤＮＡに対するオリゴヌクレオチドプローブの結合を有利にするホスホルアミデート連結における配置は、二本鎖複合体を得るための一本鎖標的への結合を有利にするものと同じである（Ｈｏｒｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．前出）。
【０１３８】
Ｇｒｙａｚｎｏｖらは、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’−Ｐ５’ホスホルアミデート誘導体がＤＮＡ二重鎖に結合して異常に安定なｐｙｒ．ｐｕｒ．ｐｙｒおよびｐｕｒ．ｐｕｒ．ｐｙｒ複合体を与えることを示している（Ｇｒｙａｚｎｏｖら、（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １１６：３１４３〜３１４４およびＧｒｙａｚｎｏｖら、（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：５７９８〜５８０）。Ｎｉｅｌｓｅｎらは、「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）が、鎖侵入により、適切なＤＮＡ配列と相互作用してＰＮＡ．ｐｕｒ．ＰＮＡ三本鎖セグメントを与えることを見出した（Ｎｉｅｌｓｅｎら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７〜１５００；Ｃｈｅｒｎｙら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：１６６７〜１６７０；およびＮｉｅｌｓｅｎら、（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１：１９７〜２００）。立体均一カチオン性ホスホルアミデート誘導体は、二本鎖ＤＮＡ標的に強力に結合するオリゴヌクレオチドアナログの別のファミリーを含む。これらの３つのファミリーは、物理的および化学的性質ならびに、疑いなく、生物学的系における挙動もまた、互いに異なるので、それらは、化学者に、特定のアプリケーションのためのＤＮＡ結合剤を調製（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ）する豊富な機会を提供する。
【０１３９】
実施例１０
Ｈｏｒｎら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．前出）は、以前に、１Ｍ ＮａＣｌ溶液におけるｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）とポリ（ｄＡ）との１／１ ｄＴ／ｄＡ混合物について、２６０ｎｍで得られた融解曲線の異常な特徴に言及した。融解曲線はＴｍ値で約２０℃異なる２つの遷移を示した。第１の遷移は、２つのｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）．ポリ（ｄＡ）二重鎖セグメントの可逆的な不均化から生じて、ｄＡ．ｄＡ．ｄＴモチーフおよびｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）の鎖を有する三重鎖を与えるようであり、そして第２の遷移は、遊離のポリ（ｄＡ）およびｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）を与える三重鎖の可逆的解離を示す。いくつかの証拠がこの結論を支持する。
【０１４０】
（ｉ）２つの遷移が、２８０ｎｍで測定した融解曲線、および２６０ｎｍで測定した融解曲線において現れる（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． 前出、を参照のこと）。２８０ｎｍ曲線中のより高い温度遷移は淡色（ｈｙｐｏｃｈｒｏｍｉｃ）である。特徴的には、ｄＴ．ｄＡ二重鎖およびｄＴ．ｄＡ．ｄＴ三重鎖の解離についての遷移は、これらの波長で濃色（ｈｙｐｅｒｃｈｒｏｍｉｃ）である。この結果は、新規構造を有する複合体の解離を示す。
【０１４１】
（ｉｉ）低塩溶液（０〜０．１Ｍ ＮａＣｌ）中で得られた融解曲線は、塩濃度に非依存的な１つの遷移（Ｔｍ約２２℃）を示した。塩濃度が増加するにつれて、第２の遷移が、次第により高い温度に現れた。第２の遷移についての塩依存性は、両性イオン性および２つのアニオン性鎖を含有する三本鎖複合体の解離についての予想と一致する。
【０１４２】
（ｉｉｉ）オリゴマーの溶液を８０℃から０℃までゆっくり冷却することによって得られる会合曲線は、遷移が完全に可逆的であることを示した。さらなる試験として、１Ｍ ＮａＣｌ中のｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）とポリ（ｄＡ）との１ｄＴ／１ｄＡ混合物を８０℃から２５℃まで冷却し、そしてその低い方の温度で２時間保持してゆっくりと平衡化を起こさせた。その２時間の間には吸光度の変化は起こらなかった。これは、系がこの温度において安定であることを示している。次いで、温度が、低い方の遷移についての範囲を超えて１８℃までさらに下げられた場合、２６０ｎｍでの吸光度は急速に低下し、そして２分間以内に平衡に達した。
【０１４３】
（ｉｖ）１ｄＴ／２ｄＡヌクレオチド比のｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）とポリ（ｄＡ）との混合物を０℃から８０℃まで加熱すると、１つの遷移（Ｔｍ ４２℃；１Ｍ ＮａＣｌ）が観察された。このことは、三本鎖複合体が過剰のｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）が存在しない場合、０℃で安定であることを例示している。
【０１４４】
（ｖ）これらの結果に一致して、１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ ７．０）中のｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）のポリ（ｄＡ）での滴定は、３０℃においては、０℃における場合の２倍のポリ（ｄＡ）を消費し、そしてその遷移点は、３０℃での１ｄＴ／２ｄＡ複合体、および０℃での１ｄＴ／１ｄＡ複合体の形成に対応した。コントロールとして、ｄＴ１５をまた同じ条件下でポリ（ｄＡ）により滴定した。これらの実験は、遷移点が、１．０Ｍ ＮａＣｌ中０℃、１．０Ｍ ＮａＣｌ中３０℃、および０．１Ｍ ＮａＣｌ中０℃での滴定について、予想通り、それぞれ２ｄＴ／１ｄＡ、１ｄＴ／１ｄＡ、および１ｄＴ／１ｄＡに対応することを示した。また、０．１Ｍ ＮａＣｌ中０℃でのｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）の滴定は、１ｄＴ／１ｄＡ比を与えた。
【０１４５】
（ｖｉ）１．０Ｍ ＮａＣｌ中で、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）と、ｄ（ＣＣＡ１５ＣＣ）の１つまたは２つの等価物との混合物を加熱すると、１つの遷移（Ｔｍ ２６℃）が見られた。この結果は、ポリ（ｄＡ）の場合の第２の遷移の出現が、ポリ（ｄＡ）がｄＡ．ｄＡ．ｄＴ三本鎖複合体を安定化するヘアピン構造に折り畳まれ得るという事実に関連し得ることを示唆した。したがって、本発明者らは、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）と、より短く、十分に規定されたオリゴマーｄ（Ａ１５Ｃ４Ａ１５）（これも、ヘアピン構造に折り畳まれ得る）とのハイブリダイゼーションを試験した。形成した複合体はいくらかより不安定であった（１．０Ｍ ＮａＣｌ中で、不均化反応についてＴｍ 約１７℃、そして三重鎖の解離についてＴｍ 約３２℃；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． 前出、を参照のこと）が、この標的は、実際に、ポリ（ｄＡ）の挙動を擬態した。ｄ（Ａ１５Ｃ４Ａ１５）単独についての加熱曲線との比較は、これらの遷移点が実際に、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）とこの標的オリゴヌクレオチドとの相互作用を反映していることを示した。ポリ（ｄＡ）の場合と同様に、遷移は可逆的であった。
【０１４６】
ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）およびポリ（ｄＡ）からの２つの異なる複合体の形成はさらに、ＣＤスペクトルデータ（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、前出を参照のこと）により支持される。５℃、１Ｍ ＮａＣｌ中で、等濃度のｄＴおよびｄＡユニットを含有するｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）とポリ（ｄＡ）との混合物のＣＤスペクトルは、０．１Ｍ ＮａＣｌ中での、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）とポリ（ｄＡ）との同じ組合せのＣＤスペクトル、ならびに０．１Ｍ ＮａＣｌ中および１Ｍ ＮａＣｌ中のポリ（ｄＴ）．ポリ（ｄＡ）のスペクトルと非常に類似している。２５５ｎｍ〜３００ｎｍの領域で観察される２つのピークおよび谷（ｔｒｏｕｇｈ）は特徴的であり（Ｗｅｌｌｓら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ５４：４６５〜４９７を参照のこと）、そしてポリ（ｄＴ）．ポリ（ｄＡ）の二重鎖のサインとしての役割を果たす。これらのすべての系におけるスペクトルの類似は、塩基のスタッキングがすべての場合においてほとんど同じであることを示す。したがって、これらのデータは、５℃、１Ｍ ＮａＣｌ中における、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）およびポリ（ｄＡ）から誘導された複合体についての従来の二重鎖構造を示す。ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）とポリ（ｄＡ）との溶液を２７℃まで加温した場合、非常に異なるスペクトルが得られた。２４７ｎｍにおける谷は深くなり、２５９ｎｍにおけるピークは減少し、２６８ｎｍにおける谷は消失し、そして２８２ｎｍにおけるピークは増大した。次いで、溶液を冷却したとき、２７℃において得られたスペクトルは容易に、０℃において得られたスペクトルに戻った。これらの変化は、溶液を加熱および冷却する際に観察されるＵＶ吸収の変化によく相関する。さらに、２７℃において得られるスペクトルは、遊離ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）とポリ（ｄＡ）との混合物について予想されたスペクトルとかなり異なる。本発明者らは、２７℃において得られたスペクトルが、ポリ（ｄＡ）およびｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）から誘導されたｄＡ．ｄＡ．ｄＴ三本鎖複合体の存在によるとする。この指摘は、２７℃の１Ｍ ＮａＣｌ中における、２ｄＡ／１ｄＴ比のポリ（ｄＡ）およびｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）のＣＤスペクトルが、２７℃での、１ｄＡ／ｄＴ比のポリ（ｄＡ）およびｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）について得られたスペクトルに類似しているであろうという予想、およびそれは５℃までの冷却の際に変化しないままであろうという予想に導く。これらの結果は実際に観察された。
【０１４７】
２７℃の１Ｍ ＮａＣｌ中における、オリゴマーｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）とポリ（ｄＡ）との１ｄＴ／１ｄＡ混合物についてのＣＤスペクトルは、ポリ（ｄＴ）．ポリ（ｄＡ）二重鎖のスペクトルに非常に類似している。ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）の場合と対照的に、ｄＡ．ｄＡ．ｄＴ三重鎖の形成についての証拠は見つからなかった。ＣＤスペクトルは、５℃に冷却する際に実際に変化せず、ポリ（ｄＡ）の第２の等価物の添加によって顕著に変化しなかった。これらの結果は、融解曲線からのデータを支持し、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）が、ポリ（ｄＡ）と二重鎖を形成するが、ｄＡ．ｄＡ．ｄＴ三重鎖は形成しないことを示している。
【０１４８】
驚くべき平衡のセットが、１Ｍ ＮａＣｌ溶液において２番目に溶出するｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ異性体およびポリ（ｄＡ）またはｄ（Ａ１５Ｃ４Ａ１５）を含有する系について見出された。２番目に溶出するｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ異性体およびポリ（ｄＡ）を１ｄＴ／１ｄＡの比で含有する系については、０℃において成分は二本鎖複合体を形成し；３０℃においては成分はｄＡ．ｄＡ．ｄＴ三本鎖複合体および遊離ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）の等価物として存在し；そして５０℃においては複合体は完全に解離する。状態間の遷移は、比較的鋭く（Ｔｍ ２２℃およびＴｍ ４２℃）、そして平衡は、溶液を加熱および冷却する際に共に急速に確立される。ｄ（Ａ１５Ｃ４Ａ１５）を含有する系は、同じスキームに適合するが、ｄＣ４鎖はリンカーとして作用し、２つのｄＡ１５セグメントの配向を容易にする。ホスホルアミデート結合の配置の重要性は、オリゴマーｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（最初に溶出する）が、ｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）とは対照的に、このタイプの三本鎖複合体を形成しなかったという事実によって示される。
【０１４９】
これらの平衡における２つの特徴は、いくつかの関連する先例がないわけではないが、通常ではない：（ｉ）排他的にｄＡ．ｄＡ．ｄＴ３つ組元素（ｔｒｉａｄ）を含有する安定な三本鎖複合体の形成；および（ｉｉ）二本鎖複合体の熱的に誘導された不均化による三本鎖複合体の形成。多くのｐｕｒ．ｐｕｒ．ｐｙｒ三重鎖の例が報告されている（Ｌｉｐｓｅｔｔ、（１９６４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２３９：１２５６〜１２６０；Ａｎｎａら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６〜４５９；Ｂｅａｌら、（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：２７７３〜２７７６；およびＰｉｌｃｈら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：６０８１〜６０８７、を代表的なケースとして参照のこと）が、記載されているｄＡ．ｄＡ．ｄＴの３つ組元素を含む安定な複合体はまた、ｄＧユニットもプリン鎖の１つに含む。Ｐｉｌｃｈら、は「グアニン残基の存在は、短いｐｕｒ．ｐｕｒ．ｐｙｒ三重鎖の安定化に重大であるようである」と記載している（Ｐｉｌｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、前出）。しかし、リボヌクレオチドファミリーについて、Ｂｒｏｉｔｍａｎら、（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：５１２０〜５１２４は、三本鎖複合体、ポリ（Ａ）．ポリ（Ａ）．ポリ（Ｕ）を記載している。これは、ポリ（Ａ）の重合度が約２８〜１５０の範囲にあるときに形成し得る。そしてＬａｕｃｅｒｉら、（１９９６）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ． ３５：２１５〜２１６は、低濃度のカチオン性ポルフィリンが、高分子量のポリ（Ａ）（＞４００ｂｐ）からのポリ（Ａ）．ポリ（Ａ）．ポリ（Ｕ）三本鎖複合体の形成を誘導することを示している。熱的に誘導された不均化に関して、ｐｙｒ．ｐｕｒ．ｐｙｒ複合体を与える例が、リボヌクレオチド［ポリ（Ａ）．ポリ（Ｕ）］（Ｍｉｌｅｓら、（１９６４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１４：１２９〜１３６；Ｓｔｅｖｅｎｓら（１９６４）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２：２９３〜３１４；およびＢｒｏｉｔｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、前出）、およびデオキシリボヌクレオチドポリマー［ポリ（ｄＴｄＣ）．ポリ（ｄＧｄＡ）］（Ｌｅｅら、（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ６：３０７３〜３０９１；Ｌｅｅら、（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：６６０３〜６６１３；およびＨａｍｐｅｌら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：４４５５〜４４５９）の両方について報告されている。
【０１５０】
オリゴヌクレオチドｄ（Ｔ＋Ｔ−）７Ｔ（２番目に溶出する）を含むｄＡ．ｄＡ．ｄＴ複合体の異常な安定性、およびその形成に導く不均化反応は、プローブ中の立体均一側鎖の存在を反映しなければならないようである。このキラリティーを有する両性イオン性オリゴマーの性質は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに基づく新規な自己アセンブリー系を設計するのに有用であることを証明し得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載されるようなカチオン性オリゴヌクレオチド。
【請求項１】
本願明細書に記載されるようなカチオン性オリゴヌクレオチド。
【公開番号】特開２００８−１３５７１（Ｐ２００８−１３５７１Ａ）
【公開日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２０８６７０（Ｐ２００７−２０８６７０）
【出願日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【分割の表示】特願平９−５０８６９３の分割
【原出願日】平成８年８月１日（１９９６．８．１）
【出願人】（５０００９５３３３）バイエル コーポレイション (8)
【出願人】（５０７２７０６２１）ノースウェスタン ユニバーシティ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【分割の表示】特願平９−５０８６９３の分割
【原出願日】平成８年８月１日（１９９６．８．１）
【出願人】（５０００９５３３３）バイエル コーポレイション (8)
【出願人】（５０７２７０６２１）ノースウェスタン ユニバーシティ (1)
【Ｆターム（参考）】
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