カンキツ類の種の判別方法
【課題】カンキツ類全体を包含する種レベルの判別を可能にすることを目的とする。
【解決手段】カンキツ類の種の判別方法であって、被検カンキツ類におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法。
【解決手段】カンキツ類の種の判別方法であって、被検カンキツ類におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カンキツ類の種の判別方法、カンキツ類交配種の両親種の判別方法、および被検試料に含まれるカンキツ類の種を判別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カンキツ類は世界でもっとも消費される果物の一つであり、様々な栽培品種が存在する。また、日本薬局方第１４局では陳皮の基原植物としてウンシュウミカン（Citrus unshiu）、オオベニミカン（C. reticulata）、枳実の基原植物としてダイダイ（C. aurantium var. daidai）、酸橙（C. aurantium）およびナツミカン（C. natsudaidai）が収載されており、生薬としても使用されている。
【０００３】
カンキツ類には多数の種が含まれ、さらにそれらの交配種も栽培、流通しており、これらの形態情報からの鑑別には高度の熟練を必要とし、生薬として流通する果皮や未熟果実では鑑別は非常に困難である。従って、例えば、枳実として流通する生薬の中に、ダイダイ、酸橙、ナツミカン以外の種が混入しているかどうかの鑑別は困難である。
【０００４】
これまで、形態や化学成分の比較によって、ミカン類、シトロン類、ザボン類の３種が現在の主要なカンキツ類品種の母種と推定されており、葉緑体ＤＮＡ、アロザイム解析などの各種分子マーカーもこれを支持している。さらに、品質保証、品種保護の観点からマイクロサテライトマーカーなどを用いた品種鑑別技術に関して多数の報告がなされている。しかし、上記のようなマーカーは、細かい品種の鑑別には有効だが、カンキツ類全体を包含する種レベルの鑑別には不適当であった。
【０００５】
一方近年の分子遺伝学の発展は、生物分類学における方法論に多大な影響を与えた。すなわちこれまでの形態学的な分類に加えて、ある特定の遺伝子を選択して、生物種についてその塩基配列を比較することにより、遺伝子の類似性からその進化の過程を推定し、分類することが可能となった。
【０００６】
生物種による遺伝子の差異の度合いは、基本的な生命活動をつかさどる蛋白質をコードする遺伝子で驚くほど保存されている一方、多くの遺伝子ではそれぞれの蛋白質の機能の分散に従って変化し、もはや同一起源であるかどうかの判断さえ難しいものまで様々である。従って分類の対象となる生物種の範囲に応じて適切な遺伝子領域を選択することで、例えば鯨と他の哺乳類との関係のような、広い範囲の近縁関係から、カラスの地域差のような、ごく限定された範囲内の詳細な分類まで可能となる。このような進化上の相対距離の推定及び分類に最も一般的に利用される遺伝子としては、リボソームＲＮＡ遺伝子（非特許文献１）やミトコンドリアの遺伝子（非特許文献２）等が数多く報告されている。
【０００７】
真核生物リボソームＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されたＲＮＡがプロセッシングを受けて、いくつかの断片に分かれ、リボソームを構成する小サブユニット（ＳＳ；Small Subunit）と大サブユニット（ＬＳ；Large Subunit）に組み込まれる。小サブユニットに組み込まれるＲＮＡは１８ＳｒＲＮＡとよばれ、約１９００（酵母）ないし２０００塩基（ヒト）から成り、大サブユニットに組み込まれるＲＮＡは２８ＳｒＲＮＡと５．８ＳｒＲＮＡの２種類で、２８ＳｒＲＮＡは約４７００（酵母）ないし５０００塩基、５．８ＳｒＲＮＡは約１６０塩基（酵母またはヒト）からなる。
【０００８】
これらをコードするＤＮＡは、ｒＲＮＡ遺伝子上、すなわちリボソームＲＮＡをコードする核リボソームＤＮＡ上に、１８Ｓ、５．８Ｓ、２８Ｓの順に縦列にならび、１８Ｓと５．８Ｓ、５．８Ｓと２８Ｓの間はＩＴＳ（Internal Transcribed Spacer）とよばれる非コード領域によって分断されている。
【０００９】
上記リボソームＲＮＡをコードするリボソームＤＮＡ内のＩＴＳは、植物に普遍的であり、多くの植物についてその存在が報告されている。しかし、カンキツ類の多数の種・品種についてその塩基配列を決定して分類し、それに基づいて種の同定や交配種の両親種の判別を行った例はない。
【非特許文献１】Bruce Alberts et al., Essential Cell Biology, Garland Publishing Inc., 439-440, 1998
【非特許文献２】宝来聰、細胞工学、14巻、1031〜1035、1995
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、カンキツ類を、種レベルで判別する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、多数のカンキツ類の真正種について、そのリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を決定しこれを系統学的に分類した。そして、得られたＩＴＳ領域の塩基配列を、被検カンキツ類のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することにより、被検カンキツ類の種を判別できること、カンキツ類交配種の両親種を判別できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）カンキツ類の種の判別方法であって、被検カンキツ類におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法。
（２）被検カンキツ類のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、配列番号１〜２５の塩基配列の少なくとも１つと比較する工程を含む、（１）記載の方法。
（３）カンキツ類交配種の両親種の判別方法であって、被検カンキツ類におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法。
（４）被検カンキツ類のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、配列番号１〜２５の塩基配列の少なくとも１つと比較する工程を含む、（３）記載の方法。
（５）被検試料に含まれるカンキツ類の種を判別する方法であって、被検試料に含まれるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法。
（６）被検試料に含まれるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、配列番号１〜２５の塩基配列の少なくとも１つと比較する工程を含む、（５）記載の方法。
（７）被検試料が生薬である、（５）または（６）記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、カンキツ類を種レベルで判別することが可能になる。また、本発明により、カンキツ類の成熟果実以外、例えば葉や枝を用いた場合でも、種を判別することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
リボソームＲＮＡは、すべての生物の生命活動に不可欠な蛋白合成に関わっており、これをコードする遺伝子であるリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）はほとんどの生物でゲノム内に複数コピー存在し、真核生物では数百から数万コピー存在することが知られている。ｒＤＮＡは、真核生物では一般に１８ＳｒＲＮＡ、５．８ＳｒＲＮＡ、２８ＳｒＲＮＡをコードする領域（それぞれ、１８ＳｒＤＮＡ、５．８ＳｒＤＮＡ、２８ＳｒＤＮＡという）が連続して存在し、反復配列を繰り返している。そして、１８Ｓと５．８Ｓの間、５．８Ｓと２８Ｓの間にそれぞれＩＴＳ（Intenal Transcribed Spacer）１およびＩＴＳ２が存在する。本明細書においては、上記２つのＩＴＳとその間にある５．８Ｓおよび２８ＳｒＤＮＡの３’側の１４塩基をまとめて便宜上ＩＴＳ領域と称する（図１および図２参照）。
【００１５】
リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）配列は、生物の分類に広く用いられている。その理由としては、真核生物のなかで最も単純な酵母から非常に複雑な哺乳動物にいたるまで広く保存されている一方、一部ＩＴＳのようにプロセッシングの過程で捨てられる配列については、ある程度大きな変異が期待できるからである。本発明のように、交配種の差を見るには、配列間のある程度の差異が必要であるが、あまりにも差異の度合いが強い場合は配列の決定や増幅プライマーに問題が生じたりすることがある。その点リボソームＤＮＡのＩＴＳを中心とする配列決定では、保存性の高いＳＳ領域やＬＳ領域を足がかりに、分散度の高いＩＴＳを探索できる。
【００１６】
カンキツ類とは、ミカン科ミカン亜科内のカラタチ(Poncirus)属、キンカン(Fortunella)属、カンキツ(Citrus)属の３属に含まれる植物の総称である。具体的には、ダイダイ（Citrus aurantium var. daidai）、ウンシュウミカン(Citrus unshiu)、キシュウミカン(Citrus kinokuni)、スンキ（Citrus sunki）、チチュウカイマンダリン（Citrus delicosa）、ビロロ（Citrus montana）、シトロン（Citrus medica）、ポンカン（Citrus reticulata）、香円（Citrus wilsonii）、酸橙（Citrus aurantium）、スイートオレンジ(Citrus sinensis)、レモン(Citrus limon)、クレオパトラマンダリン（Citrus reshni）、カブヤオ（Citrus macroptera）、ライム（Citrus aurantifolia）、タヒチライム（Citrus latifolia）、ザボン（Citrus grandis）、キヌカワ（Citrus glaberima）、オオベニミカン（Citrus tangerina）、ハッサク（Citrus hassaku）、サンポウカン（Citrus sulcata）、コベニミカン(Citrus erythrosa)、ヤツシロ(Citrus yatsushiro)、ケラジ（Citrus keraji）、タチバナ（Citrus tachibana）、サンキツ（Citrus sunki）、シイクワシャー（Citrus depressa）、コウジ（Citrus leiocarpa）、ユズ（Citrus junos）、ベルガモット（Citrus bergamia）、イヨカン（Citrus iyo）、ヒュウガナツ（Citrus tamurana）、シュンコウカン(Citrus shunkokan)、トウキンカン（Citrus madurensis）、スダチ（Citrus sudachi）、カボス（Citrus sphaerocarpa）、ナツミカン（Citrus natsudaidai）、グレープフルーツ（Citrus paradisi）、プルット（Citrus hystrix）、カラタチ（Poncirus trifoliata）、キンカン（Fortunella japonica）などが挙げられる。
【００１７】
本発明者らは、多種のカンキツ類の真正種について、リボソームＤＮＡのＩＴＳ領域のダイレクトシーケンシングを行った。その結果、複数種の塩基配列のＩＴＳ領域を有するもの（ヘテロ性）と、単一の塩基配列のＩＴＳ領域のみを有するものとがあった。カンキツ類の真正種とは、その他公知の手段、例えば、形態、化学成分の調査、系統維持、あるいはクローン栽培されたものであることに基づいて、特定の種のカンキツ類であることが確認されているカンキツ類植物をさす。カンキツ類のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列はある程度の分散を示し、複数種の塩基配列が見出されたが、見出された複数のＩＴＳ領域の種類をリボタイプ（ribotype）と称する。
【００１８】
本発明者らは、リボソームＤＮＡのＩＴＳ領域のダイレクトシーケンシングの結果、カラタチ、キシュウミカン、スンキ、チチュウカイマンダリン、ビロロ、シトロン、プルットおよびカブヤオのＩＴＳ領域の塩基配列がヘテロ性を有しないこと、従って、カンキツ類の野生種または野生種に近い種であることを見出した。
【００１９】
また、ヘテロ性を有していたカンキツ類について、ＩＴＳ領域のクローニングを行い、各種リボタイプの塩基配列を決定した。その結果、配列番号１〜２５のいずれかの塩基配列からなる２５種のリボタイプが同定された。得られたリボタイプと、そのリボタイプを有するカンキツ類の種について、以下の表１に示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】
上記表１に従って、被検カンキツ類の種を判別することができる。表１において、レモンは、配列番号１６と配列番号１０の欄に記載されているが、これは、レモンがこれら２種のＩＴＳ領域のリボタイプを有することを意味する。一方、キシュウミカンやシトロンは１カ所にしか記載されていないが、これは単一のリボタイプのみを有すること、すなわちヘテロ性を有しないことを意味する。このようにＩＴＳ領域にヘテロ性を有しない種を表中※印で示している。
【００２２】
従って、一実施形態において本発明は、カンキツ類の種の判別方法であって、被検カンキツ類におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を決定し、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法に関する。
【００２３】
上記のとおり本発明者らは、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列として、配列番号１〜２５のいずれかの塩基配列からなる２５種のＩＴＳ領域のリボタイプを決定した。従って、被検カンキツ類におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列をこれらと比較し、被検カンキツ類がいずれのリボタイプを有するかを判別することにより、種を判別することができる。
【００２４】
例えば、被検カンキツ類が、配列番号１０の塩基配列からなるＩＴＳ領域のリボタイプと、配列番号１６の塩基配列からなるＩＴＳ領域のリボタイプとを有する場合、当該被検カンキツ類は同じリボタイプを有するレモンであると判別することができる。
【００２５】
同様に、被検カンキツ類が、配列番号１１の塩基配列からなるＩＴＳ領域のリボタイプと、配列番号１９の塩基配列からなるＩＴＳ領域のリボタイプと、配列番号２０の塩基配列からなるＩＴＳ領域のリボタイプとを有する場合、当該被検カンキツ類は同じリボタイプを有するウンシュウミカンであると判別することができる。
【００２６】
本発明において、被検カンキツ類から得られたリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列とを比較する場合、必ずしも１００％同一であることを必要としない。本発明におけるＩＴＳ領域のうち、ＩＴＳ１とＩＴＳ２の塩基配列において、通常９７％以上同一、より好ましくは９９％以上同一であれば、同一のリボタイプと判定することができる。また、数個、すなわち１〜５個、好ましくは１〜２個の塩基において、欠失、置換、挿入または付加等が生じていても、同一のリボタイプと判定することができる。
【００２７】
これまでカンキツ類の種の判別は成熟果実の形態に基づいてなされることが多かったが、本発明により、カンキツ類の成熟果実以外、例えば、種子、果皮、未熟果実、葉、枝などを用いて、種を判別することが可能になる。また、生薬としての乾燥果皮などについても種の判別が可能になる。
【００２８】
配列番号１〜２５のいずれかの塩基配列からなるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域において、ＩＴＳ１、５．８Ｓ、ＩＴＳ２、２８Ｓに該当する部分は、図２に示す通りである。
【００２９】
また、各種リボタイプの塩基配列を系統学的に分類した結果、配列番号１の塩基配列からなるＩＴＳ領域はカラタチ属の母種に由来すること、配列番号２〜４のいずれかの塩基配列からなる３種のＩＴＳ領域はキンカン属の母種に由来すること、配列番号５〜７のいずれかの塩基配列からなる３種のＩＴＳ領域はそれぞれ不明母種Ａ〜Ｃに由来すること、配列番号８〜１１のいずれかの塩基配列からなる４種のＩＴＳ領域はミカン類の母種に由来すること、配列番号１２〜１５のいずれかの塩基配列からなる４種のＩＴＳ領域はパペダ類の母種に由来すること、配列番号１６の塩基配列からなるＩＴＳ領域はシトロン類の母種に由来すること、配列番号１７〜２０のいずれかの塩基配列からなる４種のＩＴＳ領域は不明母種Ｄに由来すること、配列番号２１〜２５のいずれかの塩基配列からなる５種のＩＴＳ領域はザボン類の母種に由来することを見出した。なお、リボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列の系統学的分類に関しては、Baldwin et al., Annals of the Missouri Botanical Garden, 82：247-277., 1995による総論があり、雑種由来の植物の両親種推定としてはSang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6813-6817, 1995がある。
【００３０】
上記分類に基づき、カンキツ類交配種の両親種を判別することができる。ポンカンと清見オレンジ（スイートオレンジとウンシュウミカンの交配種）との交配種であることが知られているデコポン（不知火）について、リボソームＤＮＡのＩＴＳ領域をクローニングし塩基配列を決定した。その結果、ポンカンから得られるミカン母種由来の配列番号９の塩基配列からなるリボタイプと、スイートオレンジから得られる配列番号１０の塩基配列からなるリボタイプと、ウンシュウミカンから得られる不明母種Ｄ由来の配列番号１９または２０の塩基配列からなるリボタイプが検出された。これは、被検カンキツ類のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を決定することにより、カンキツ類交配種の両親種の母種を判別できることを示している。
【００３１】
従って、一実施形態において本発明は、カンキツ類交配種の両親種の判別方法であって、被検カンキツ類におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法に関する。上記系統学的分類から、カラタチ属、キンカン属、不明母種Ａ〜Ｃ、ミカン類、パペダ類、シトロン類、不明母種Ｄ、ザボン類のいずれを母種とした交配種であるかを判別することができる。このような判別を行うことによって、どの交配種が系統学的に近い種であるかを判別することもできる。
【００３２】
例えば、ミカン類母種由来の配列番号１０の塩基配列からなるＩＴＳ領域のリボタイプと、シトロン類母種由来の配列番号１６の塩基配列からなるＩＴＳ領域のリボタイプとを有するレモンは、ミカン類とシトロン類との交配種であると推定することができる。
【００３３】
また、ミカン類母種由来の配列番号９の塩基配列からなるＩＴＳ領域のリボタイプと、ザボン類母種由来の配列番号２３および２４の塩基配列からなるＩＴＳ領域のリボタイプとを有するダイダイは、ミカン類とザボン類との交配種であると推定することができる。
【００３４】
陳皮および枳実などの生薬は、薬局方で指定されたカンキツ類のみを含む必要があるが、生薬として流通する果皮や未熟果実では、該当するカンキツ類以外を含んでいないかどうかの判別は非常に困難である。しかし、本発明に基づき、生薬等の被検試料から、当該試料に含まれるカンキツ類由来のＤＮＡを抽出し、リボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を決定することにより、被検試料に含まれるカンキツ類の種を判別することができ、カンキツ類異種の混入を検出することができる。
【００３５】
従って一実施形態において本発明は、被検試料に含まれるカンキツ類の種を判別する方法であって、被検試料に含まれるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法に関する。
【００３６】
被検試料としては、カンキツ類を含む可能性のあるものであれば特に制限されないが、例えば、生薬および漢方薬を含む医薬品、食品、飲料、化粧品などが挙げられる。
【００３７】
例えば、被検生薬において、その生薬の基原植物として収載されるカンキツ類が有するリボタイプのみが検出された場合、当該被検生薬は真正な生薬と判別できる。一方、その生薬の基原植物として収載されるカンキツ類が有するリボタイプ以外のリボタイプが検出された場合は、当該被検生薬は真正な生薬でないと判別できる。
【００３８】
被検カンキツ類のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を決定して比較する方法としては、被検カンキツ類からＤＮＡ抽出し、それを鋳型としてＰＣＲによって増幅し、ダイレクトシーケンシングを行うかクローニングを行って、塩基配列を決定する方法が挙げられる。ＰＣＲ、ダイレクトシーケンシング、クローニングおよび塩基配列決定は、いずれも定法により行うことができる。ＰＣＲに用いるプライマーとしては、公知のユニバーサルプライマーを使用できる（White T. J. et al., 1990, Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, In PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White, Eds.) pp. 315 - 322. Academic Press, San Diego)。また、カンキツ類のリボソームＤＮＡの塩基配列に基づいてプライマー配列を決定し、常法に従って合成することもできる。
【００３９】
ＩＴＳ全領域ではなく、鑑別に有効な部分領域を増幅するためのプライマーセットを用いることもできる。ＩＴＳ１の部分領域については、例えば、フォワードプライマーとして5’-AGG ATC ATT GTC GAA ACC TGC-3’（配列番号２８）を、リバースプライマーとして5’-TCT CTC GTT AGA TTT CCT TGG C-3’（配列番号２９）を用いて増幅することができる。ＩＴＳ２の部分領域については、例えば、フォワードプライマーとして5’-AAA GCC TCT CGW GCT CCC GCC G-3’（配列番号３０）を、リバースプライマーとして公知のユニバーサルプライマー（ITS4）（White T. J. et al., 1990、前掲）を用いて増幅することができる。上記プライマーの塩基配列において連続する１５〜２０塩基からなる塩基配列も同様にプライマーとして用いることができる。
【００４０】
一実施形態において被検カンキツ類または被検試料に含まれるカンキツ類のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を決定し、カンキツ類真正種のものと比較する方法は、１）被検カンキツ類または被検試料からＤＮＡを抽出する工程、２）ＩＴＳ領域をクローニングする工程、３）ＩＴＳ領域の塩基配列を決定する工程、および４）得られた塩基配列を配列番号１〜２５の塩基配列の少なくとも１つと比較する工程を含む。
【００４１】
配列番号１〜２５のいずれかの塩基配列からなるＩＴＳ領域を増幅するためのプライマーとしては、それぞれ、配列番号１〜２５のいずれかの塩基配列またはそれに相補的な塩基配列のうちの、連続する１５〜４０塩基長、好ましくは２０〜３０塩基長の塩基配列からなるプライマーが挙げられる。
【００４２】
一般的に塩基配列に基づく判別・分類方法としては、一定領域の塩基配列全体を比較する方法、１ないし数カ所の特定部位の塩基の違いを比較する方法、あるいは１ないし数カ所の特定部位の塩基の違いを複数組み合わせ、パターン化して比較する方法がある。
【００４３】
一定領域の塩基配列全体を比較する方法としては、判別・分類の対象となるサンプルの一定領域の塩基配列を決定し、既知の塩基配列と比較し、その相同性の割合で判定する方法がある。一般に生物種は近接する種であっても、進化の過程を反映して微妙にその相同性に違いをみせるので、サンプルの配列は必ずしも既知の配列と１００％同一ではないことが多い。このような場合にも、相同性の割合を求めることにより、相対的な類縁関係の推測を容易に行うことができる。
【００４４】
１ないし数カ所の特定部位の塩基の違いを利用する方法としては、ＰＣＲプライマーによる判別がある。塩基配列を比較し、相違のある領域にＰＣＲプライマーを設定し、どのプライマーによって増幅されるかによって判別する方法である。この場合非相同的な領域だけでなく、相同的な領域にもプライマーを設定し、インターナルコントロールとするのが望ましい。増幅が見られないのは、反応の失敗ではなくサンプルのリボソームＤＮＡの配列によるものであることを確認するためである。上記ＰＣＲプライマーによる判別方法において、プライマーを設定する領域として、ＩＴＳ領域（配列番号１〜２５）のうち、ＩＴＳ１またはＩＴＳ２の配列を用いる。
【００４５】
上記の特定のプライマーによってリボソームＤＮＡが増幅するかどうかで判別する方法は、ＰＣＲ以外の増幅法であってもよい。例えばＬＡＭＰ法（栄研化学）、ＩＣＡＮ法（宝酒造）のプライマーとして設定することも可能である。
【００４６】
分類は必ずしも核酸の増幅によるものでなくてもよい。例えば1本鎖の核酸同士をハイブリダイズさせて、それを電気的に検出する方法は、非常に感度が良いので、核酸の増幅なしで検出が可能である。１本鎖のプローブを上記増幅法と同様に非相同的な領域に設定することにより、ハイブリダイズしたかどうかで配列を確認できる。
【００４７】
また、１ないし数カ所の特定部位の塩基の違いを比較する方法による判別・分類は、ＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法でも可能である。判別の対象となる何種類かの塩基配列を比較し、制限酵素による切断に違いのある部分を見つけ、増幅されたＤＮＡ断片にその部分が含まれるように、プライマーを設定する。増幅したＤＮＡ断片がその制限酵素によって切断されるか否かによって配列の違いが判断できる。切断の有無は通常の電気泳動法等によって容易に判定可能である。
【００４８】
さらに、上記の特定部位における塩基の違いを複数組み合わせ、パターン化して比較する方法がある。例えば、上記プライマー法で、いくつかのプライマー対を用いる方法や、あるいは上記ＲＦＬＰ法で、比較的広い領域を増幅し、複数の制限酵素で切断し、それぞれの切断パターンによって判別することも可能である。このＲＦＬＰ法では、上述のプライマーによる判別法と同様、ＩＴＳ領域は、切断パターンが多様であり、制限酵素の選択肢も多く、望ましい。さらに、ＩＴＳ領域内のＩＴＳ１またはＩＴＳ２は、種による相違を最も反映していると考えられるので、パターン作成にこれらの領域を含めることは、より望ましい。
【００４９】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の範囲は実施例に限定されない。
【実施例】
【００５０】
１．DNA抽出
押葉もしくは生食用果実サンプルから約200 mgの葉もしくは果皮を採り、DNeasy(R) Plant Mini Kit (Qiagen)を用いて全DNAを抽出した。
【００５１】
２．ダイレクトシーケンス解析
各サンプルの核DNA上のITS領域を、まずWhite et al. (1990)より報告されているユニバーサルプライマー: forward primer - ITS5 (5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G- 3’)、reverse primer - ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC- 3’)、およびサーマルサイクラーPJ2000 (Applied Biosystems)にてPCR増幅した（White T. J. et al., 1990, Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In PCR Rrotocols, A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White, Eds.), pp. 315 - 322. Academic Press, San Diego）。
【００５２】
反応液の組成は以下のとおりである：10 x GeneTaq-Buffer (Nippon Gene) 5μl, dNTP mix (Nippon Gene) 4μl, forward primer (ITS5: 10pmol/μl) 1μl, reverse primer (ITS4: 10pmol/μl) 1μl, templateDNA 1.25μl, Gene-Taq (Nippon Gene) 0.25μl, DMSO 5μl, D.W. 32.5μl (大塚蒸留水)。
【００５３】
反応サイクルは(94℃, 1 min; 48℃, 2 min; 72℃, 3 min) x 30 cycles, (72℃, 7 min) x 1 cycleとした。
【００５４】
PCR反応液は2.0%アガロースゲルを用いて電気泳動してDNAをサイズごとに分離し、目標サイズのDNAバンドだけを切り出してGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham biotech)を用いて精製した。
【００５５】
精製産物をBigDye Terminator Cycle Sequencing Kit ver. 3.1 とModel 3100 automated sequencer (Applied Biosystems)を用いて塩基配列を決定した。シーケンシングの際には増幅に用いたプライマーを用い、5’末端，3’末端の双方から配列を決定し、両者を比較して塩基配列を確定した。
【００５６】
その結果、カラタチ（Poncirus trifoliata）、キシュウミカン(Citrus kinokuni)、スンキ（Citrus sunki）、チチュウカイマンダリン（Citrus delicosa）、ビロロ（Citrus montana）、シトロン（Citrus medica）、プルット（Citrus hystrix）およびカブヤオ（Citrus macroptera）のＩＴＳ領域の塩基配列がヘテロ性を有しないことが示された。これらの種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列は、それぞれ、カラタチ（配列番号１）、スンキ（配列番号９）、チチュウカイマンダリン（配列番号１０）、キシュウミカン（配列番号１１）、プルット（配列番号１２）、ビロロ（配列番号１３）、カブヤオ（配列番号１５）およびシトロン（配列番号１６）として決定された。
【００５７】
３．クローニング解析
ITS領域においてゲノム内多型が見られたサンプルについては、ITS領域のPCR産物をクローニングすることにより、その構成リボタイプを分離した。クローニングにはpT7 Blunt Cloning Kit (Novagen) を用い、アンピシリン添加LB培地に展開後に得られたコロニーを爪楊枝でピックアップし、PCR反応液中に入れ、目標領域をPCR増幅することによりインサートチェックを行った。PCR溶液の組成はダイレクトシーケンスと同様だが、使用したサーマルサイクラーはGeneAmp model 9700 (Applied Biosystems)、１サンプルあたりの反応液は20μl、反応サイクルは(94℃, 1 min; 48℃, 1 min; 72℃, 2 min) x 35 cycles, (72℃, 7 min) x 1 cycleとした。反応液はアガロースゲルによる分離精製を行わず、エタノール沈殿 (反応液＋1μl sodium acetate＋50μl 100% EtOH、遠心分離15,000rpm x 30min → 転倒デカンテーション → ＋100μl 70% EtOH、遠心分離15,000rpm x 10min → 転倒デカンテーション、遠心脱気による乾燥5min) により精製し、その後はダイレクトシーケンス解析同様に塩基配列を決定した。
【００５８】
その結果、キンカンからは配列番号２〜４のいずれかの塩基配列からなる３種のリボタイプが得られた。スイートオレンジからは配列番号５、１０、１８または２５のいずれかの塩基配列からなる４種のリボタイプが得られた。ユズからは配列番号６〜８または９のいずれかの塩基配列からなる４種のリボタイプが得られた。ポンカンからは配列番号９、１０または２５のいずれかの塩基配列からなる３種のリボタイプが得られた。ダイダイからは配列番号１０、２３または２４のいずれかの塩基配列からなる３種のリボタイプが得られた。レモンからは配列番号１０または１６の塩基配列からなる２種のリボタイプが得られた。イヨカンからは配列番号１０、２０または２５の塩基配列からなる３種のリボタイプが得られた。グレープフルーツからは配列番号１０、２１または２５の塩基配列からなる３種のリボタイプが得られた。ナツミカンからは配列番号１１、１７または２２の塩基配列からなる３種のリボタイプが得られた。ライムからは配列番号１４または１６の塩基配列からなる２種のリボタイプが得られた。ハッサクからは配列番号１９〜２２のいずれかの塩基配列からなる４種のリボタイプが得られた。ザボンからは配列番号２１または２２の塩基配列からなる３種のリボタイプが得られた。
【００５９】
上記のように得られた配列番号１〜２５のいずれかの塩基配列からなる２５種のＩＴＳ領域の塩基配列を最節約法に基づきPAUP 4.0b10(Swofford, D.L., 2002. PAUP* beta version. Phylogenetic analysis using parsimony (*and other methods). Sinauer Associated, Sunderland, MA)を用いて計算し、得られた137の等しく最節約な系統樹の厳密合意樹を求めると、図３に示す系統樹が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】リボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の概略図を示す。
【図２−１】本発明で得られたリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域のアライメント、ならびにＩＴＳ１、５．８Ｓ、ＩＴＳ２および２８Ｓの位置を示す。
【図２−２】図２−１の続き。
【図２−３】図２−２の続き。
【図２−４】図２−３の続き。
【図２−５】図２−４の続き。
【図２−６】図２−５の続き。
【図２−７】図２−６の続き。
【図２−８】図２−７の続き。
【図３】本発明で多種のカンキツ類についてリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を系統学的に分類した結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カンキツ類の種の判別方法、カンキツ類交配種の両親種の判別方法、および被検試料に含まれるカンキツ類の種を判別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カンキツ類は世界でもっとも消費される果物の一つであり、様々な栽培品種が存在する。また、日本薬局方第１４局では陳皮の基原植物としてウンシュウミカン（Citrus unshiu）、オオベニミカン（C. reticulata）、枳実の基原植物としてダイダイ（C. aurantium var. daidai）、酸橙（C. aurantium）およびナツミカン（C. natsudaidai）が収載されており、生薬としても使用されている。
【０００３】
カンキツ類には多数の種が含まれ、さらにそれらの交配種も栽培、流通しており、これらの形態情報からの鑑別には高度の熟練を必要とし、生薬として流通する果皮や未熟果実では鑑別は非常に困難である。従って、例えば、枳実として流通する生薬の中に、ダイダイ、酸橙、ナツミカン以外の種が混入しているかどうかの鑑別は困難である。
【０００４】
これまで、形態や化学成分の比較によって、ミカン類、シトロン類、ザボン類の３種が現在の主要なカンキツ類品種の母種と推定されており、葉緑体ＤＮＡ、アロザイム解析などの各種分子マーカーもこれを支持している。さらに、品質保証、品種保護の観点からマイクロサテライトマーカーなどを用いた品種鑑別技術に関して多数の報告がなされている。しかし、上記のようなマーカーは、細かい品種の鑑別には有効だが、カンキツ類全体を包含する種レベルの鑑別には不適当であった。
【０００５】
一方近年の分子遺伝学の発展は、生物分類学における方法論に多大な影響を与えた。すなわちこれまでの形態学的な分類に加えて、ある特定の遺伝子を選択して、生物種についてその塩基配列を比較することにより、遺伝子の類似性からその進化の過程を推定し、分類することが可能となった。
【０００６】
生物種による遺伝子の差異の度合いは、基本的な生命活動をつかさどる蛋白質をコードする遺伝子で驚くほど保存されている一方、多くの遺伝子ではそれぞれの蛋白質の機能の分散に従って変化し、もはや同一起源であるかどうかの判断さえ難しいものまで様々である。従って分類の対象となる生物種の範囲に応じて適切な遺伝子領域を選択することで、例えば鯨と他の哺乳類との関係のような、広い範囲の近縁関係から、カラスの地域差のような、ごく限定された範囲内の詳細な分類まで可能となる。このような進化上の相対距離の推定及び分類に最も一般的に利用される遺伝子としては、リボソームＲＮＡ遺伝子（非特許文献１）やミトコンドリアの遺伝子（非特許文献２）等が数多く報告されている。
【０００７】
真核生物リボソームＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されたＲＮＡがプロセッシングを受けて、いくつかの断片に分かれ、リボソームを構成する小サブユニット（ＳＳ；Small Subunit）と大サブユニット（ＬＳ；Large Subunit）に組み込まれる。小サブユニットに組み込まれるＲＮＡは１８ＳｒＲＮＡとよばれ、約１９００（酵母）ないし２０００塩基（ヒト）から成り、大サブユニットに組み込まれるＲＮＡは２８ＳｒＲＮＡと５．８ＳｒＲＮＡの２種類で、２８ＳｒＲＮＡは約４７００（酵母）ないし５０００塩基、５．８ＳｒＲＮＡは約１６０塩基（酵母またはヒト）からなる。
【０００８】
これらをコードするＤＮＡは、ｒＲＮＡ遺伝子上、すなわちリボソームＲＮＡをコードする核リボソームＤＮＡ上に、１８Ｓ、５．８Ｓ、２８Ｓの順に縦列にならび、１８Ｓと５．８Ｓ、５．８Ｓと２８Ｓの間はＩＴＳ（Internal Transcribed Spacer）とよばれる非コード領域によって分断されている。
【０００９】
上記リボソームＲＮＡをコードするリボソームＤＮＡ内のＩＴＳは、植物に普遍的であり、多くの植物についてその存在が報告されている。しかし、カンキツ類の多数の種・品種についてその塩基配列を決定して分類し、それに基づいて種の同定や交配種の両親種の判別を行った例はない。
【非特許文献１】Bruce Alberts et al., Essential Cell Biology, Garland Publishing Inc., 439-440, 1998
【非特許文献２】宝来聰、細胞工学、14巻、1031〜1035、1995
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、カンキツ類を、種レベルで判別する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、多数のカンキツ類の真正種について、そのリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を決定しこれを系統学的に分類した。そして、得られたＩＴＳ領域の塩基配列を、被検カンキツ類のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することにより、被検カンキツ類の種を判別できること、カンキツ類交配種の両親種を判別できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）カンキツ類の種の判別方法であって、被検カンキツ類におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法。
（２）被検カンキツ類のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、配列番号１〜２５の塩基配列の少なくとも１つと比較する工程を含む、（１）記載の方法。
（３）カンキツ類交配種の両親種の判別方法であって、被検カンキツ類におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法。
（４）被検カンキツ類のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、配列番号１〜２５の塩基配列の少なくとも１つと比較する工程を含む、（３）記載の方法。
（５）被検試料に含まれるカンキツ類の種を判別する方法であって、被検試料に含まれるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法。
（６）被検試料に含まれるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、配列番号１〜２５の塩基配列の少なくとも１つと比較する工程を含む、（５）記載の方法。
（７）被検試料が生薬である、（５）または（６）記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、カンキツ類を種レベルで判別することが可能になる。また、本発明により、カンキツ類の成熟果実以外、例えば葉や枝を用いた場合でも、種を判別することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
リボソームＲＮＡは、すべての生物の生命活動に不可欠な蛋白合成に関わっており、これをコードする遺伝子であるリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）はほとんどの生物でゲノム内に複数コピー存在し、真核生物では数百から数万コピー存在することが知られている。ｒＤＮＡは、真核生物では一般に１８ＳｒＲＮＡ、５．８ＳｒＲＮＡ、２８ＳｒＲＮＡをコードする領域（それぞれ、１８ＳｒＤＮＡ、５．８ＳｒＤＮＡ、２８ＳｒＤＮＡという）が連続して存在し、反復配列を繰り返している。そして、１８Ｓと５．８Ｓの間、５．８Ｓと２８Ｓの間にそれぞれＩＴＳ（Intenal Transcribed Spacer）１およびＩＴＳ２が存在する。本明細書においては、上記２つのＩＴＳとその間にある５．８Ｓおよび２８ＳｒＤＮＡの３’側の１４塩基をまとめて便宜上ＩＴＳ領域と称する（図１および図２参照）。
【００１５】
リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）配列は、生物の分類に広く用いられている。その理由としては、真核生物のなかで最も単純な酵母から非常に複雑な哺乳動物にいたるまで広く保存されている一方、一部ＩＴＳのようにプロセッシングの過程で捨てられる配列については、ある程度大きな変異が期待できるからである。本発明のように、交配種の差を見るには、配列間のある程度の差異が必要であるが、あまりにも差異の度合いが強い場合は配列の決定や増幅プライマーに問題が生じたりすることがある。その点リボソームＤＮＡのＩＴＳを中心とする配列決定では、保存性の高いＳＳ領域やＬＳ領域を足がかりに、分散度の高いＩＴＳを探索できる。
【００１６】
カンキツ類とは、ミカン科ミカン亜科内のカラタチ(Poncirus)属、キンカン(Fortunella)属、カンキツ(Citrus)属の３属に含まれる植物の総称である。具体的には、ダイダイ（Citrus aurantium var. daidai）、ウンシュウミカン(Citrus unshiu)、キシュウミカン(Citrus kinokuni)、スンキ（Citrus sunki）、チチュウカイマンダリン（Citrus delicosa）、ビロロ（Citrus montana）、シトロン（Citrus medica）、ポンカン（Citrus reticulata）、香円（Citrus wilsonii）、酸橙（Citrus aurantium）、スイートオレンジ(Citrus sinensis)、レモン(Citrus limon)、クレオパトラマンダリン（Citrus reshni）、カブヤオ（Citrus macroptera）、ライム（Citrus aurantifolia）、タヒチライム（Citrus latifolia）、ザボン（Citrus grandis）、キヌカワ（Citrus glaberima）、オオベニミカン（Citrus tangerina）、ハッサク（Citrus hassaku）、サンポウカン（Citrus sulcata）、コベニミカン(Citrus erythrosa)、ヤツシロ(Citrus yatsushiro)、ケラジ（Citrus keraji）、タチバナ（Citrus tachibana）、サンキツ（Citrus sunki）、シイクワシャー（Citrus depressa）、コウジ（Citrus leiocarpa）、ユズ（Citrus junos）、ベルガモット（Citrus bergamia）、イヨカン（Citrus iyo）、ヒュウガナツ（Citrus tamurana）、シュンコウカン(Citrus shunkokan)、トウキンカン（Citrus madurensis）、スダチ（Citrus sudachi）、カボス（Citrus sphaerocarpa）、ナツミカン（Citrus natsudaidai）、グレープフルーツ（Citrus paradisi）、プルット（Citrus hystrix）、カラタチ（Poncirus trifoliata）、キンカン（Fortunella japonica）などが挙げられる。
【００１７】
本発明者らは、多種のカンキツ類の真正種について、リボソームＤＮＡのＩＴＳ領域のダイレクトシーケンシングを行った。その結果、複数種の塩基配列のＩＴＳ領域を有するもの（ヘテロ性）と、単一の塩基配列のＩＴＳ領域のみを有するものとがあった。カンキツ類の真正種とは、その他公知の手段、例えば、形態、化学成分の調査、系統維持、あるいはクローン栽培されたものであることに基づいて、特定の種のカンキツ類であることが確認されているカンキツ類植物をさす。カンキツ類のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列はある程度の分散を示し、複数種の塩基配列が見出されたが、見出された複数のＩＴＳ領域の種類をリボタイプ（ribotype）と称する。
【００１８】
本発明者らは、リボソームＤＮＡのＩＴＳ領域のダイレクトシーケンシングの結果、カラタチ、キシュウミカン、スンキ、チチュウカイマンダリン、ビロロ、シトロン、プルットおよびカブヤオのＩＴＳ領域の塩基配列がヘテロ性を有しないこと、従って、カンキツ類の野生種または野生種に近い種であることを見出した。
【００１９】
また、ヘテロ性を有していたカンキツ類について、ＩＴＳ領域のクローニングを行い、各種リボタイプの塩基配列を決定した。その結果、配列番号１〜２５のいずれかの塩基配列からなる２５種のリボタイプが同定された。得られたリボタイプと、そのリボタイプを有するカンキツ類の種について、以下の表１に示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】
上記表１に従って、被検カンキツ類の種を判別することができる。表１において、レモンは、配列番号１６と配列番号１０の欄に記載されているが、これは、レモンがこれら２種のＩＴＳ領域のリボタイプを有することを意味する。一方、キシュウミカンやシトロンは１カ所にしか記載されていないが、これは単一のリボタイプのみを有すること、すなわちヘテロ性を有しないことを意味する。このようにＩＴＳ領域にヘテロ性を有しない種を表中※印で示している。
【００２２】
従って、一実施形態において本発明は、カンキツ類の種の判別方法であって、被検カンキツ類におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を決定し、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法に関する。
【００２３】
上記のとおり本発明者らは、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列として、配列番号１〜２５のいずれかの塩基配列からなる２５種のＩＴＳ領域のリボタイプを決定した。従って、被検カンキツ類におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列をこれらと比較し、被検カンキツ類がいずれのリボタイプを有するかを判別することにより、種を判別することができる。
【００２４】
例えば、被検カンキツ類が、配列番号１０の塩基配列からなるＩＴＳ領域のリボタイプと、配列番号１６の塩基配列からなるＩＴＳ領域のリボタイプとを有する場合、当該被検カンキツ類は同じリボタイプを有するレモンであると判別することができる。
【００２５】
同様に、被検カンキツ類が、配列番号１１の塩基配列からなるＩＴＳ領域のリボタイプと、配列番号１９の塩基配列からなるＩＴＳ領域のリボタイプと、配列番号２０の塩基配列からなるＩＴＳ領域のリボタイプとを有する場合、当該被検カンキツ類は同じリボタイプを有するウンシュウミカンであると判別することができる。
【００２６】
本発明において、被検カンキツ類から得られたリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列とを比較する場合、必ずしも１００％同一であることを必要としない。本発明におけるＩＴＳ領域のうち、ＩＴＳ１とＩＴＳ２の塩基配列において、通常９７％以上同一、より好ましくは９９％以上同一であれば、同一のリボタイプと判定することができる。また、数個、すなわち１〜５個、好ましくは１〜２個の塩基において、欠失、置換、挿入または付加等が生じていても、同一のリボタイプと判定することができる。
【００２７】
これまでカンキツ類の種の判別は成熟果実の形態に基づいてなされることが多かったが、本発明により、カンキツ類の成熟果実以外、例えば、種子、果皮、未熟果実、葉、枝などを用いて、種を判別することが可能になる。また、生薬としての乾燥果皮などについても種の判別が可能になる。
【００２８】
配列番号１〜２５のいずれかの塩基配列からなるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域において、ＩＴＳ１、５．８Ｓ、ＩＴＳ２、２８Ｓに該当する部分は、図２に示す通りである。
【００２９】
また、各種リボタイプの塩基配列を系統学的に分類した結果、配列番号１の塩基配列からなるＩＴＳ領域はカラタチ属の母種に由来すること、配列番号２〜４のいずれかの塩基配列からなる３種のＩＴＳ領域はキンカン属の母種に由来すること、配列番号５〜７のいずれかの塩基配列からなる３種のＩＴＳ領域はそれぞれ不明母種Ａ〜Ｃに由来すること、配列番号８〜１１のいずれかの塩基配列からなる４種のＩＴＳ領域はミカン類の母種に由来すること、配列番号１２〜１５のいずれかの塩基配列からなる４種のＩＴＳ領域はパペダ類の母種に由来すること、配列番号１６の塩基配列からなるＩＴＳ領域はシトロン類の母種に由来すること、配列番号１７〜２０のいずれかの塩基配列からなる４種のＩＴＳ領域は不明母種Ｄに由来すること、配列番号２１〜２５のいずれかの塩基配列からなる５種のＩＴＳ領域はザボン類の母種に由来することを見出した。なお、リボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列の系統学的分類に関しては、Baldwin et al., Annals of the Missouri Botanical Garden, 82：247-277., 1995による総論があり、雑種由来の植物の両親種推定としてはSang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6813-6817, 1995がある。
【００３０】
上記分類に基づき、カンキツ類交配種の両親種を判別することができる。ポンカンと清見オレンジ（スイートオレンジとウンシュウミカンの交配種）との交配種であることが知られているデコポン（不知火）について、リボソームＤＮＡのＩＴＳ領域をクローニングし塩基配列を決定した。その結果、ポンカンから得られるミカン母種由来の配列番号９の塩基配列からなるリボタイプと、スイートオレンジから得られる配列番号１０の塩基配列からなるリボタイプと、ウンシュウミカンから得られる不明母種Ｄ由来の配列番号１９または２０の塩基配列からなるリボタイプが検出された。これは、被検カンキツ類のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を決定することにより、カンキツ類交配種の両親種の母種を判別できることを示している。
【００３１】
従って、一実施形態において本発明は、カンキツ類交配種の両親種の判別方法であって、被検カンキツ類におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法に関する。上記系統学的分類から、カラタチ属、キンカン属、不明母種Ａ〜Ｃ、ミカン類、パペダ類、シトロン類、不明母種Ｄ、ザボン類のいずれを母種とした交配種であるかを判別することができる。このような判別を行うことによって、どの交配種が系統学的に近い種であるかを判別することもできる。
【００３２】
例えば、ミカン類母種由来の配列番号１０の塩基配列からなるＩＴＳ領域のリボタイプと、シトロン類母種由来の配列番号１６の塩基配列からなるＩＴＳ領域のリボタイプとを有するレモンは、ミカン類とシトロン類との交配種であると推定することができる。
【００３３】
また、ミカン類母種由来の配列番号９の塩基配列からなるＩＴＳ領域のリボタイプと、ザボン類母種由来の配列番号２３および２４の塩基配列からなるＩＴＳ領域のリボタイプとを有するダイダイは、ミカン類とザボン類との交配種であると推定することができる。
【００３４】
陳皮および枳実などの生薬は、薬局方で指定されたカンキツ類のみを含む必要があるが、生薬として流通する果皮や未熟果実では、該当するカンキツ類以外を含んでいないかどうかの判別は非常に困難である。しかし、本発明に基づき、生薬等の被検試料から、当該試料に含まれるカンキツ類由来のＤＮＡを抽出し、リボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を決定することにより、被検試料に含まれるカンキツ類の種を判別することができ、カンキツ類異種の混入を検出することができる。
【００３５】
従って一実施形態において本発明は、被検試料に含まれるカンキツ類の種を判別する方法であって、被検試料に含まれるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法に関する。
【００３６】
被検試料としては、カンキツ類を含む可能性のあるものであれば特に制限されないが、例えば、生薬および漢方薬を含む医薬品、食品、飲料、化粧品などが挙げられる。
【００３７】
例えば、被検生薬において、その生薬の基原植物として収載されるカンキツ類が有するリボタイプのみが検出された場合、当該被検生薬は真正な生薬と判別できる。一方、その生薬の基原植物として収載されるカンキツ類が有するリボタイプ以外のリボタイプが検出された場合は、当該被検生薬は真正な生薬でないと判別できる。
【００３８】
被検カンキツ類のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を決定して比較する方法としては、被検カンキツ類からＤＮＡ抽出し、それを鋳型としてＰＣＲによって増幅し、ダイレクトシーケンシングを行うかクローニングを行って、塩基配列を決定する方法が挙げられる。ＰＣＲ、ダイレクトシーケンシング、クローニングおよび塩基配列決定は、いずれも定法により行うことができる。ＰＣＲに用いるプライマーとしては、公知のユニバーサルプライマーを使用できる（White T. J. et al., 1990, Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, In PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White, Eds.) pp. 315 - 322. Academic Press, San Diego)。また、カンキツ類のリボソームＤＮＡの塩基配列に基づいてプライマー配列を決定し、常法に従って合成することもできる。
【００３９】
ＩＴＳ全領域ではなく、鑑別に有効な部分領域を増幅するためのプライマーセットを用いることもできる。ＩＴＳ１の部分領域については、例えば、フォワードプライマーとして5’-AGG ATC ATT GTC GAA ACC TGC-3’（配列番号２８）を、リバースプライマーとして5’-TCT CTC GTT AGA TTT CCT TGG C-3’（配列番号２９）を用いて増幅することができる。ＩＴＳ２の部分領域については、例えば、フォワードプライマーとして5’-AAA GCC TCT CGW GCT CCC GCC G-3’（配列番号３０）を、リバースプライマーとして公知のユニバーサルプライマー（ITS4）（White T. J. et al., 1990、前掲）を用いて増幅することができる。上記プライマーの塩基配列において連続する１５〜２０塩基からなる塩基配列も同様にプライマーとして用いることができる。
【００４０】
一実施形態において被検カンキツ類または被検試料に含まれるカンキツ類のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を決定し、カンキツ類真正種のものと比較する方法は、１）被検カンキツ類または被検試料からＤＮＡを抽出する工程、２）ＩＴＳ領域をクローニングする工程、３）ＩＴＳ領域の塩基配列を決定する工程、および４）得られた塩基配列を配列番号１〜２５の塩基配列の少なくとも１つと比較する工程を含む。
【００４１】
配列番号１〜２５のいずれかの塩基配列からなるＩＴＳ領域を増幅するためのプライマーとしては、それぞれ、配列番号１〜２５のいずれかの塩基配列またはそれに相補的な塩基配列のうちの、連続する１５〜４０塩基長、好ましくは２０〜３０塩基長の塩基配列からなるプライマーが挙げられる。
【００４２】
一般的に塩基配列に基づく判別・分類方法としては、一定領域の塩基配列全体を比較する方法、１ないし数カ所の特定部位の塩基の違いを比較する方法、あるいは１ないし数カ所の特定部位の塩基の違いを複数組み合わせ、パターン化して比較する方法がある。
【００４３】
一定領域の塩基配列全体を比較する方法としては、判別・分類の対象となるサンプルの一定領域の塩基配列を決定し、既知の塩基配列と比較し、その相同性の割合で判定する方法がある。一般に生物種は近接する種であっても、進化の過程を反映して微妙にその相同性に違いをみせるので、サンプルの配列は必ずしも既知の配列と１００％同一ではないことが多い。このような場合にも、相同性の割合を求めることにより、相対的な類縁関係の推測を容易に行うことができる。
【００４４】
１ないし数カ所の特定部位の塩基の違いを利用する方法としては、ＰＣＲプライマーによる判別がある。塩基配列を比較し、相違のある領域にＰＣＲプライマーを設定し、どのプライマーによって増幅されるかによって判別する方法である。この場合非相同的な領域だけでなく、相同的な領域にもプライマーを設定し、インターナルコントロールとするのが望ましい。増幅が見られないのは、反応の失敗ではなくサンプルのリボソームＤＮＡの配列によるものであることを確認するためである。上記ＰＣＲプライマーによる判別方法において、プライマーを設定する領域として、ＩＴＳ領域（配列番号１〜２５）のうち、ＩＴＳ１またはＩＴＳ２の配列を用いる。
【００４５】
上記の特定のプライマーによってリボソームＤＮＡが増幅するかどうかで判別する方法は、ＰＣＲ以外の増幅法であってもよい。例えばＬＡＭＰ法（栄研化学）、ＩＣＡＮ法（宝酒造）のプライマーとして設定することも可能である。
【００４６】
分類は必ずしも核酸の増幅によるものでなくてもよい。例えば1本鎖の核酸同士をハイブリダイズさせて、それを電気的に検出する方法は、非常に感度が良いので、核酸の増幅なしで検出が可能である。１本鎖のプローブを上記増幅法と同様に非相同的な領域に設定することにより、ハイブリダイズしたかどうかで配列を確認できる。
【００４７】
また、１ないし数カ所の特定部位の塩基の違いを比較する方法による判別・分類は、ＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法でも可能である。判別の対象となる何種類かの塩基配列を比較し、制限酵素による切断に違いのある部分を見つけ、増幅されたＤＮＡ断片にその部分が含まれるように、プライマーを設定する。増幅したＤＮＡ断片がその制限酵素によって切断されるか否かによって配列の違いが判断できる。切断の有無は通常の電気泳動法等によって容易に判定可能である。
【００４８】
さらに、上記の特定部位における塩基の違いを複数組み合わせ、パターン化して比較する方法がある。例えば、上記プライマー法で、いくつかのプライマー対を用いる方法や、あるいは上記ＲＦＬＰ法で、比較的広い領域を増幅し、複数の制限酵素で切断し、それぞれの切断パターンによって判別することも可能である。このＲＦＬＰ法では、上述のプライマーによる判別法と同様、ＩＴＳ領域は、切断パターンが多様であり、制限酵素の選択肢も多く、望ましい。さらに、ＩＴＳ領域内のＩＴＳ１またはＩＴＳ２は、種による相違を最も反映していると考えられるので、パターン作成にこれらの領域を含めることは、より望ましい。
【００４９】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の範囲は実施例に限定されない。
【実施例】
【００５０】
１．DNA抽出
押葉もしくは生食用果実サンプルから約200 mgの葉もしくは果皮を採り、DNeasy(R) Plant Mini Kit (Qiagen)を用いて全DNAを抽出した。
【００５１】
２．ダイレクトシーケンス解析
各サンプルの核DNA上のITS領域を、まずWhite et al. (1990)より報告されているユニバーサルプライマー: forward primer - ITS5 (5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G- 3’)、reverse primer - ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC- 3’)、およびサーマルサイクラーPJ2000 (Applied Biosystems)にてPCR増幅した（White T. J. et al., 1990, Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In PCR Rrotocols, A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White, Eds.), pp. 315 - 322. Academic Press, San Diego）。
【００５２】
反応液の組成は以下のとおりである：10 x GeneTaq-Buffer (Nippon Gene) 5μl, dNTP mix (Nippon Gene) 4μl, forward primer (ITS5: 10pmol/μl) 1μl, reverse primer (ITS4: 10pmol/μl) 1μl, templateDNA 1.25μl, Gene-Taq (Nippon Gene) 0.25μl, DMSO 5μl, D.W. 32.5μl (大塚蒸留水)。
【００５３】
反応サイクルは(94℃, 1 min; 48℃, 2 min; 72℃, 3 min) x 30 cycles, (72℃, 7 min) x 1 cycleとした。
【００５４】
PCR反応液は2.0%アガロースゲルを用いて電気泳動してDNAをサイズごとに分離し、目標サイズのDNAバンドだけを切り出してGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham biotech)を用いて精製した。
【００５５】
精製産物をBigDye Terminator Cycle Sequencing Kit ver. 3.1 とModel 3100 automated sequencer (Applied Biosystems)を用いて塩基配列を決定した。シーケンシングの際には増幅に用いたプライマーを用い、5’末端，3’末端の双方から配列を決定し、両者を比較して塩基配列を確定した。
【００５６】
その結果、カラタチ（Poncirus trifoliata）、キシュウミカン(Citrus kinokuni)、スンキ（Citrus sunki）、チチュウカイマンダリン（Citrus delicosa）、ビロロ（Citrus montana）、シトロン（Citrus medica）、プルット（Citrus hystrix）およびカブヤオ（Citrus macroptera）のＩＴＳ領域の塩基配列がヘテロ性を有しないことが示された。これらの種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列は、それぞれ、カラタチ（配列番号１）、スンキ（配列番号９）、チチュウカイマンダリン（配列番号１０）、キシュウミカン（配列番号１１）、プルット（配列番号１２）、ビロロ（配列番号１３）、カブヤオ（配列番号１５）およびシトロン（配列番号１６）として決定された。
【００５７】
３．クローニング解析
ITS領域においてゲノム内多型が見られたサンプルについては、ITS領域のPCR産物をクローニングすることにより、その構成リボタイプを分離した。クローニングにはpT7 Blunt Cloning Kit (Novagen) を用い、アンピシリン添加LB培地に展開後に得られたコロニーを爪楊枝でピックアップし、PCR反応液中に入れ、目標領域をPCR増幅することによりインサートチェックを行った。PCR溶液の組成はダイレクトシーケンスと同様だが、使用したサーマルサイクラーはGeneAmp model 9700 (Applied Biosystems)、１サンプルあたりの反応液は20μl、反応サイクルは(94℃, 1 min; 48℃, 1 min; 72℃, 2 min) x 35 cycles, (72℃, 7 min) x 1 cycleとした。反応液はアガロースゲルによる分離精製を行わず、エタノール沈殿 (反応液＋1μl sodium acetate＋50μl 100% EtOH、遠心分離15,000rpm x 30min → 転倒デカンテーション → ＋100μl 70% EtOH、遠心分離15,000rpm x 10min → 転倒デカンテーション、遠心脱気による乾燥5min) により精製し、その後はダイレクトシーケンス解析同様に塩基配列を決定した。
【００５８】
その結果、キンカンからは配列番号２〜４のいずれかの塩基配列からなる３種のリボタイプが得られた。スイートオレンジからは配列番号５、１０、１８または２５のいずれかの塩基配列からなる４種のリボタイプが得られた。ユズからは配列番号６〜８または９のいずれかの塩基配列からなる４種のリボタイプが得られた。ポンカンからは配列番号９、１０または２５のいずれかの塩基配列からなる３種のリボタイプが得られた。ダイダイからは配列番号１０、２３または２４のいずれかの塩基配列からなる３種のリボタイプが得られた。レモンからは配列番号１０または１６の塩基配列からなる２種のリボタイプが得られた。イヨカンからは配列番号１０、２０または２５の塩基配列からなる３種のリボタイプが得られた。グレープフルーツからは配列番号１０、２１または２５の塩基配列からなる３種のリボタイプが得られた。ナツミカンからは配列番号１１、１７または２２の塩基配列からなる３種のリボタイプが得られた。ライムからは配列番号１４または１６の塩基配列からなる２種のリボタイプが得られた。ハッサクからは配列番号１９〜２２のいずれかの塩基配列からなる４種のリボタイプが得られた。ザボンからは配列番号２１または２２の塩基配列からなる３種のリボタイプが得られた。
【００５９】
上記のように得られた配列番号１〜２５のいずれかの塩基配列からなる２５種のＩＴＳ領域の塩基配列を最節約法に基づきPAUP 4.0b10(Swofford, D.L., 2002. PAUP* beta version. Phylogenetic analysis using parsimony (*and other methods). Sinauer Associated, Sunderland, MA)を用いて計算し、得られた137の等しく最節約な系統樹の厳密合意樹を求めると、図３に示す系統樹が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】リボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の概略図を示す。
【図２−１】本発明で得られたリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域のアライメント、ならびにＩＴＳ１、５．８Ｓ、ＩＴＳ２および２８Ｓの位置を示す。
【図２−２】図２−１の続き。
【図２−３】図２−２の続き。
【図２−４】図２−３の続き。
【図２−５】図２−４の続き。
【図２−６】図２−５の続き。
【図２−７】図２−６の続き。
【図２−８】図２−７の続き。
【図３】本発明で多種のカンキツ類についてリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を系統学的に分類した結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンキツ類の種の判別方法であって、被検カンキツ類におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法。
【請求項２】
被検カンキツ類のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、配列番号１〜２５の塩基配列の少なくとも１つと比較する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
カンキツ類交配種の両親種の判別方法であって、被検カンキツ類におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法。
【請求項４】
被検カンキツ類のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、配列番号１〜２５の塩基配列の少なくとも１つと比較する工程を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
被検試料に含まれるカンキツ類の種を判別する方法であって、被検試料に含まれるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法。
【請求項６】
被検試料に含まれるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、配列番号１〜２５の塩基配列の少なくとも１つと比較する工程を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
被検試料が生薬である、請求項５または６記載の方法。
【請求項１】
カンキツ類の種の判別方法であって、被検カンキツ類におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法。
【請求項２】
被検カンキツ類のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、配列番号１〜２５の塩基配列の少なくとも１つと比較する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
カンキツ類交配種の両親種の判別方法であって、被検カンキツ類におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法。
【請求項４】
被検カンキツ類のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、配列番号１〜２５の塩基配列の少なくとも１つと比較する工程を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
被検試料に含まれるカンキツ類の種を判別する方法であって、被検試料に含まれるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、カンキツ類真正種におけるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法。
【請求項６】
被検試料に含まれるリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、配列番号１〜２５の塩基配列の少なくとも１つと比較する工程を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
被検試料が生薬である、請求項５または６記載の方法。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図２−５】
【図２−６】
【図２−７】
【図２−８】
【図３】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図２−５】
【図２−６】
【図２−７】
【図２−８】
【図３】
【公開番号】特開２００７−２５９７５５（Ｐ２００７−２５９７５５Ａ）
【公開日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−８９０７１（Ｐ２００６−８９０７１）
【出願日】平成１８年３月２８日（２００６．３．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年１０月１日 園芸学会発行の「園芸学会雑誌 第７４巻別冊２−２００５−（園芸学会平成１７年度秋季大会研究発表）」に発表
【出願人】（０００００３６６５）株式会社ツムラ (43)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２８日（２００６．３．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年１０月１日 園芸学会発行の「園芸学会雑誌 第７４巻別冊２−２００５−（園芸学会平成１７年度秋季大会研究発表）」に発表
【出願人】（０００００３６６５）株式会社ツムラ (43)
【Ｆターム（参考）】
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