トマトにおいて抵抗性対立遺伝子を連結するための方法
【課題】TYLCVに対して抵抗性であり、Meloidogyne arenaria、Meloidogyne incognita及びMeloidogyne javanicaから成る群より選択される少なくとも１つのネコブセンチュウ種に対して高度に抵抗性であることを特徴とする、トマトを提供する。
【解決手段】ゲノム内に少なくとも１個のトマト黄化葉巻ウイルス（TYLCV）抵抗性対立遺伝子及び少なくとも１個のネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を含むトマトであって、前記抵抗性対立遺伝子が１つの染色体上の異なる座に相引相で存在するトマト。
【解決手段】ゲノム内に少なくとも１個のトマト黄化葉巻ウイルス（TYLCV）抵抗性対立遺伝子及び少なくとも１個のネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を含むトマトであって、前記抵抗性対立遺伝子が１つの染色体上の異なる座に相引相で存在するトマト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、Ｌ．）において商業的に重要な密接に連鎖する遺伝子を集積（ｐｙｒａｍｉｄｉｎｇ）させるための方法に関する。特に、本発明は、最も有効なトマト黄化葉巻ウイルス抵抗性遺伝子（Ｔｙ−１）及び最も有効なセンチュウ抵抗性遺伝子（Ｍｉ−１）を、これらの密接に連鎖する遺伝子が単一単位であるかのごとくに共遺伝されるように、相引相（シス相）で含むトマト植物を作出することに関する。
【背景技術】
【０００２】
文書で記録されている２００以上の栽培トマトの病害が存在する（Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｔｏｍａｔｏ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ．Ｂ．Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｐ．Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｅ．Ｓｔａｌｌ，Ｔ．Ａ．Ｚｉｔｔｅｒ編集（１９９７）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）。これらの病原体によって引き起こされる被害に対抗するために、栽培者は、典型的には栽培慣例及び農薬の使用を含む総合害虫管理戦略を用いる。栽培慣例の一例は、トマト植物の上方にネットを張ることであり、これは病害を運ぶ昆虫が作物に感染するのを排除するのに有効でありうる、物理的障壁を提供する。
【０００３】
数多くの調査研究が植物病害に対する有効なトランスジェニックアプローチを明らかにしているにもかかわらず、栽培者が使用できる、何らかの病原体に抵抗性のトランスジェニックトマト品種は現在のところ存在しない。さらに、特にＥＵでは、一般民衆の抵抗という問題が残されており、これが、規制承認を得るための高いコストと合わせて、この有望なテクノロジーを商業トマト栽培において使用することを事実上妨げてきた。
【０００４】
伝統的な交配アプローチを使用した近代的栽培品種への病害抵抗性遺伝子の移入は、植物病害の大部分に対抗するために使用しうる有効なテクノロジーとなってきた。その連続的な成功の故に、このアプローチはなおも学術的及び商業的トマト育種プログラムにおける第一の焦点である。
【０００５】
何百ものトマト病原体の中で、線虫及びトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）によって引き起こされる病害は商業的栽培者にとって最も重要なものに含まれる。線虫は汎発流行性であり、その分布はほとんど北極から南極にまで及ぶ。その広い分布に加えて、様々な種の線虫が、大部分の植物及び動物を含む多様な宿主範囲を有する病原体である。例えば線虫は、ヒトにおける蟯虫疾患（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓが病原体である）からトマトの根こぶ病まで多様な疾病を引き起こす。５０種以上のネコブセンチュウが存在するが、トマトに感染する３つの最も重要な種は、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ａｒｅｎａｒｉａ、Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ及びＭ．ｊａｖａｎｉｃａである。
【０００６】
ネコブ種のセンチュウは、それらの感染が植物において生じさせる根構造の種類によって命名される。感染が成功すると、線虫は植物においてその根を肥厚させるエリシターを生産し、根に１ｍｍから１０ｍｍのこぶ又はふしの形成を生じさせる。これらの変化は植物から線虫への栄養分の輸送を促進する。感染し、形態的に変化した根は、同時に植物に水と栄養分を供給する能力が低下する。植物は、この栄養分摂取についての能力低下を地上で観察できる一般的な活力低下で明示する。感染植物はまた、発育阻害、萎凋及び黄白化（クロロシス）などのより特異的な病徴を示すこともある。線虫個体群は成長期の間に形成されるので、萎凋はより著明になり、果実形成が影響を受けることもある。
【０００７】
ネコブセンチュウの化学的防除は有効であり、殺線虫剤、臭化メチルはＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ種のすべてに対して卓越した防除を提供する。農薬施用についての健康上の懸念及びオゾン枯渇に対する懸念を含む様々な理由から、臭化メチルの使用は世界中で低減されつつある。この化学的防除剤の最終的な禁止は、トマトにおける線虫病害を防除するための代替法を開発することの重要性を強調する。
【０００８】
ＴＹＬＣＶはジェミニウイルスであり、Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ属に分類される。ほとんどすべての土壌に遍在する線虫と異なり、トマト黄化葉巻ウイルスの分布は、このウイルスを伝搬する昆虫ベクターであるコナジラミ、Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉの範囲によって限定される。
【０００９】
商業的トマト生産は、より低い労働力コスト、より良好な輸送及び北米自由貿易協定や世界貿易機関協定のような条約によって、過去２５年間に世界中で温帯からより熱帯の生育領域へとシフトした。この地理的なシフトはＢ．ｔａｂａｃｉの分布と一致する。それ故、トマト生育領域が熱帯気候へ移行すると共に、ＴＹＬＣＶによって引き起こされる病害がより著明になってきた。ＴＹＬＣＶはコナジラミの摂食によって速やかにトマトへと伝搬されうる。ひとたび植物に入ると、ウイルスは複製し、植物全体に広まるが、典型的にはその師部に限定される。ＴＹＬＣＶは、植物において、巻葉及び黄化から、節間の長さの短縮と花の生育停止によって引き起こされる発育阻害までの範囲にわたる深刻な病徴を生じさせる。同時に、これは低木様の外観を有する植物を生じさせる。収穫の損害は深刻になりうる；１９９０年代初期には、ドミニカ共和国におけるトマト収穫高の約９５％が失われ、またフロリダでは１シーズンで（１９９１−１９９２年）約１億４千万ドルの損失が報告された（Ｍｏｆｆａｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８６：１８３５）。
【００１０】
コナジラミの化学的防除は有効でありうるが、商業的トマト生産における農薬の誤った使用は、２０以上の異なるトマト感染性ベゴモウイルスを媒介することができる農薬抵抗性Ｂ．ｔａｂａｃｉをもたらした（Ｍｏｒａｌｅｓ（２００１）Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ；ＰｏｌｓｔｏｎとＡｎｄｅｒｓｏｎ（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ８１：１３５８−１３６９；Ｚｅｉｄａｎら（１９９９）Ａｓｉａ Ｔｒｏｐ．Ｒｅｓ．Ｅｘｔ．１：１０７−１１５）。
【００１１】
トマトにおける線虫防除のための主要な化学的選択肢が徐々に消失しつつあるのと同様に、昆虫ベクターが農薬に抵抗性になりつつあることや農薬の使用に対する一般大衆の健康上の懸念に及ぶ理由から、ＴＹＬＣＶについての化学的防除選択肢も減少しつつある。トランスジェニック抵抗性栽培品種を生産することに付随する高い開発コストは、遺伝子工学アプローチを使用したＴＹＬＣＶ抵抗性栽培品種の開発にとっても同様に障害である。当業者は、それ故、線虫、ジェミニウイルス（ＴＹＬＣＶ）及びトマト生産における他の植物病害の防除のためのこれらの化学的防除戦略及びトランスジェニック戦略に対する代替策の必要性を認識する。天然に生じる抵抗性遺伝子の移入は、今日やはり、トマト病原体を防除するための最も有効な選択肢である。
【００１２】
抵抗性表現型の遺伝は定量的及び多遺伝子性でありうるが、植物においては、個々の単一遺伝子座によって制御される多くの優性から半優性抵抗性遺伝子を有することは一般的である。植物の抵抗性遺伝子はしばしば、特異的病原体がコードされたリガンドに結合する受容体として働くタンパク質をコードする。植物によるこの病原体特異的認識とその後の応答は、１９４０年代後期にＦｌｏｒによって最初に記述された現象であり、「遺伝子対遺伝子」抵抗性と称される（Ｆｌｏｒ（１９７１）Ａｎｎ．Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ９：２７５−２９６）によって総説された）。この特異的受容体−リガンド複合体は、最終的に抵抗性表現型をもたらすシグナル伝達経路の引き金となる（Ｂａｋｅｒら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：７２６−７３３；Ｓｔａｓｋａｗｉｃｚら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：６６１−６６７）。この病原体攻撃の認識に対応して、宿主は、細胞壁の強化、酸化バースト、防御遺伝子発現の誘導、及び時として、過敏性反応と呼ばれる感染部位での迅速な細胞死によって応答しうる。
【００１３】
ほとんどの育種目的のために、商業的育種家は、しばしば「栽培型」と称される生殖質を取り扱う。この生殖質は、園芸成績について評価したとき一般に良好に機能するので、育種がより容易である。栽培型の性能優位型は、しばしば対立遺伝子の多様性の欠如によって相殺される。これは、育種家が栽培生殖質を扱うときに受け入れる交換取引である−よりよい全体成績であるが対立遺伝子多様性の欠如。遺伝的に多様なソースで育種するときよりも栽培材料で作業するときのほうが進行が速いので、育種家は一般にこの交換取引を受け入れる。
【００１４】
これに対し、育種家が広い種内交配又は種間交配のいずれかを行うときは、逆の交換取引が起こる。これらの例では、育種家は、典型的には栽培生殖質を非栽培型と交配する。そのような交配において、育種家は非栽培型からの新規対立遺伝子へのアクセスを獲得することができるが、供与交配親に関連する遺伝子ひきずりを克服しなければならない。この育種戦略に関する難しさに加えて、このアプローチは受胎能又は生殖能の問題のためにしばしば失敗に終わる。
【００１５】
Ｌ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ、Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ、Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ、Ｌ．ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ、Ｌ．ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ、Ｌ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉｉ、Ｌ．ｃｅｒａｓｉｆｏｒｍｅ及びＬ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍを含む栽培トマトと交配することができる多くの野生類縁が存在する。野生種と栽培Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍの間の遺伝距離は、種間交配を行うこと及び付加形質を有する新しい商業的栽培品種を成功裏に作出することの両方の難しさと相関する（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｂｒｅｅｄｉｎｇ．ＭＡ ＳｔｅｖｅｎｓとＣＭ Ｒｉｃｋ．Ｔｈｅ ｔｏｍａｔｏ ｃｒｏｐ：Ａ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔより。ＪＧ ＡｔｈｅｒｔｏｎとＪ Ｒｕｄｉｃｈ編集。Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ（１９９４）Ｌｏｎｄｏｎ）。例えば、Ｌ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ、Ｌ．ｃｅｒａｓｉｆｏｒｍｅ、Ｌ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉｉ、Ｌ．ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ及びＬ．ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍのような種は、近代的トマトへの遺伝子移入のための供与体として使用するのに最も容易な野生種である。これに対し、Ｌ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ、Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ及びＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍは近代的トマトへの形質移入がはるかに難しい種である（同上）。これらのより遠い類縁種を使用するときは、初期世代交雑のために橋渡し種及び胚救済を使用しなければならないこともまれでない。これらの余分な工程を実施しても、重大な分離異常、受胎能の問題、低い組換え及び遺伝子ひきずりに直面することがある。後期世代でも、ゲノムの移入領域内での組換えの抑制が、良好な商業的栽培品種を作出するのに十分な程度まで遺伝子ひきずりを低下させる上で主要な障害となる。
【００１６】
それ故、野生種において有用な形質を特定し、栽培種への移入のためにその形質を標的しうるが、成功するという保証はない。ほとんどの成功を収めた商業的トマト育種家も、その経歴全体を通じて、商業的栽培品種を作出するための野生種からの遺伝子移入を完全に成功させてはいない。成功への障壁は、遺伝子移入が困難であるか又は不可能な場合がある野生ゲノムの領域を生じうる、分離異常を含む。さらに、近代的トマトの野生種の一部は、自家受粉することができないことを意味する、自家不和合性である。自家不和合性の結果として、これらの植物は極めて異質性であり、多くの座に異なる対立遺伝子を有する。これらの野生種の高度な異質性はまた、対象とする最も有効な遺伝子の移入を妨げることがある。
【００１７】
栽培化された作物の野生類縁から新規対立遺伝子を移入することに関する難しさは多くの作物に及び、トマトでは線虫抵抗性の遺伝子移入に例示される。Ｂａｉｌｅｙ（（１９４１）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．３８：５７３−５７５）は、初めて、野生種Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍを線虫抵抗性のための潜在的ソースとして特定した。Ｓｍｉｔｈ（（１９４４）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．４４：４１３−４１６）は、その後、線虫抵抗性形質を含む種間雑種を成功裏に回収するために胚救済法を使用した。ＧｉｌｂｅｒｔとＭｃＧｕｉｒｅ（（１９５５）はこの遺伝子座Ｍｉを作出し、その後Ｍｉを６番染色体に位置決定した（Ｇｌｉｂｅｒｔ（１９５８）Ｔｏｍａｔｏ Ｇｅｎｅｔ．Ｃｏｏｐ．Ｒｅｐ．８：１５−１７）。Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍに由来するＭｉ遺伝子座の抵抗性対立遺伝子はＭｉ−１対立遺伝子と呼ばれる。Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍからの感受性対立遺伝子は野生型対立遺伝子と称され、「＋」で表わされる。Ｍｉ−１抵抗性対立遺伝子を含むすべての商業的トマト栽培品種はＳｍｉｔｈによって作出された種間雑種に由来すると考えられる。同型接合Ｍｉ−１系統は１９４９年に早くも開発されたが（ＦｒａｚｉｅｒとＤｅｎｎｅｔｔ（１９４９）、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．５４：２２５−２３６）、Ｍｉ−１対立遺伝子が商業的栽培品種において一般的に使用され始めたのは１９７０年代半ばからであった。２つの開発がこの商業上の実現を導いた。第一に、ＲｉｃｋとＦｏｂｅｓがアルカリホスファターゼ（Ａｐｓ）と呼ばれるアイソザイムマーカーとＭｉ遺伝子座の間の連鎖を報告した（（１９７４）Ｔｏｍａｔｏ Ｇｅｎｅｔ．Ｃｏｏｐ．Ｒｅｐ．２４：２５）。分子マーカー試験の早期使用により、育種家は病理試験を実施せずに形質を追跡することが可能になった。第二に、雑種トマト栽培品種が商業的栽培家によってより広く受け入れられようになった。６０年間にわたるＭｉ−１対立遺伝子に関する育種にもかかわらず、ストレス条件下での局所的な壊死応答（Ｈｏら（１９９２）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，２：９７１）、より小さな果実及びより少ない結実を含む、Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍからのＭｉ−１移入に関連する重大な遺伝子ひきずりが現在も存在する。
【００１８】
育種家は、Ｍｉ−１対立遺伝子が異型接合体として存在するときに有効であり、線虫抵抗性形質を１つの親だけから雑種に送達することを可能にすることを認めた。これは次に、育種家が、６番染色体のこの領域内にｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ遺伝子を有する第二の近交系親を使用することによって遺伝子ひきずりの大部分を克服することを可能にした。雑種栽培品種の作出はこの育種戦略の実施を可能にした。優性Ｍｉ−１対立遺伝子を近交系親の一方に交配し、遺伝子ひきずりの大部分を隠すことを可能にする周辺のｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ対立遺伝子と共に感受性対立遺伝子（「＋」）を第二の近交系親に交配した。異型接合状態で遺伝子ひきずりを不顕化できたことは、それぞれストレス条件下での局所的な壊死応答、より小さな果実サイズ及びより少ない結実を不顕化する能力の故に、植物の全般的健康状態、果実の大きさ及び果実の収量に影響を及ぼす遺伝子がゲノムのこの領域内に存在することの間接的証拠を提供する。
【００１９】
植物抵抗性遺伝子はゲノム内でクラスターを形成することが示されており、トマトでは、一般にセントロメアの近くで認められる。Ｍｉ遺伝子座は、６番染色体上のセントロメアに近い、これらの病害抵抗性クラスターの１つに位置する。Ｍｉ抵抗性遺伝子座を有することに加えて、ジェミニウイルスについての他の抵抗性遺伝子、Ｏｉｄｉｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（ｖａｎ ｄｅ Ｂｅｅｋら（１９９４）Ｔｈｅｏｒｅｔ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８９：４６７−４７３）及びＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍレース２及び５についての２つの抵抗性遺伝子（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．（１９９３）６：３４１−３４７）は、６番染色体のこのセントロメア領域においてすべて遺伝的に密接に連鎖する。
【００２０】
何十年を経た後も、Ｍｉ−１遺伝子移入の困難さは、その形質に関連する遺伝子ひきずりを低減することができなかった。この困難さについての代替的な説明は、Ｍｉ−１抵抗性遺伝子が多面発現性であり、直接遺伝子ひきずりに寄与すること、あるいは遺伝子ひきずり低下の前進を制限する、このゲノム領域内における組換えの抑制が存在することである。様々な実験アプローチがこの問題を取り上げてきた。遺伝学と細胞遺伝学の組合せを使用して、Ｚｈｏｎｇら（（１９９９）Ｔｈｅｏｒｅｔ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９８：３６５−３７０）は、トマトのゲノムサイズを基礎として、〜１ｃＭの遺伝距離の遺伝学的評価に基づき、Ｍｉ遺伝子座とＡｐｓ遺伝子座の間の物理的距離は約７５０，０００塩基対であるはずであることを示した。それらの蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の結果は、しかしながら、この物理的距離が実際には４０，０００，０００塩基対であることを明らかにした。これらの遺伝子座の間の遺伝距離と物理的距離の相違から、Ｚｈｏｎｇらは、Ｍｉ遺伝子座付近での組換えがこのゲノムについての平均と比較して約５０倍低いと予測した。Ｋａｌｏｓｈｉａｎら（（１９９８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５７：３７６−３８５）は、比較遺伝学アプローチを採用して、Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ × Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍの交配はＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ × Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ由来の個体群と比較してこの領域内での組換えが８倍高いことを示した。これらの実験に加えて、セントロメア領域では一般に組換えが抑制されることは周知である。Ｍｉｌｌｉｇａｎら（１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １０：１３０７−１３２０）は、クローン化したＭｉ抵抗性遺伝子を感受性栽培品種、Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒに導入するためにトランスジェニック相補性を利用した。これらの相補性試験で多面発現効果が認められなかったことは、Ｍｉ移入に関連する園芸上の欠陥が遺伝子ひきずりによるものであることを強く示唆する。これらの試験は、６番染色体のこの領域内に病害抵抗性遺伝子を移入することに伴う困難さへの洞察を提供した。
【００２１】
１９９８年に、Ｋａｌｏｓｈｉａｎらは、ＡｐｓアイソザイムマーカーよりもＭｉ遺伝子座により近い、ＲＥＸ−１と呼ばれる共優性のＰＣＲに基づく分子マーカーを記述した（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５７：３７６−３８５）。このＤＮＡに基づくマーカーは速やかにトマト育種プログラムに採用され、新しい線虫抵抗性雑種栽培品種の開発を大きく促進した。
【００２２】
トマト育種業界は学術公表文献を通してＭｉ−１線虫抵抗性対立遺伝子の移入におけるその進歩を速やかに開示したが、この難しい育種アプローチの成功の可能性が低いことは、この分野におけるいくつかの特許（米国特許第６，４１４，２２６号、同第６，０９６，９４４号、同第５，８６６，７６４号及び同第６，６３９，１３２号）の発行の際に米国特許商標庁によって認識された。
【００２３】
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に対する抵抗性についてはほぼ４０年間にわたって報告されてきた。Ｃｏｈｅｎは、１９６４年に早くもいくつかの耐性遺伝子型を報告し（ＣｏｈｅｎとＨａｒｐａｚ（１９６４）Ｅｎｔｏｍｏｌ．Ｅｘｐ．Ａｐｐｌ．７：１５５−１６６）、その後、Ｌ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｒｉｕｍ及びＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍがより高いレベルのＴＹＬＣＶ抵抗性を含むと特定した（ＣｏｈｅｎとＮｉｔｚａｎｙ（１９６６）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ５６：１１２７−１１３１）。１９９０年代に、ＰｉｌｏｗｓｋｉとＣｏｈｅｎは、５個の劣性遺伝子と共にＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ（ＰＩ１２６９３５）からの耐性を報告した（Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ７４：２４８−２５０）。Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎらは、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅにおけるＴＹＬＣＶ抵抗性を発見し（（１９９４）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ８４：９２８−９３３）、その後Ｈｏｏｇｓｔｒａｔｅｎ（米国特許第６，４１４，２２６号）は独立してＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅにおけるＴＹＬＣＶ抵抗性を確認した。この抵抗性遺伝子座はＴｙ遺伝子座と称され、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからの抵抗性対立遺伝子はＴｙ−１と命名された。
【００２４】
Ｍｉ遺伝子座と同様に、Ｔｙ遺伝子座の感受性対立遺伝子は野生型又は「＋」と称される。ＺａｍｉｒらはＴｙ遺伝子座を６番染色体のセントロメア領域に位置づけた（（１９９４）Ｔｈｅｏｒｅｔ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８８：１４１−１４６）。Ｔｙ−１対立遺伝子は優性対立遺伝子として働き、それ故Ｔｙ−１対立遺伝子に固定された系統又は異型接合（Ｔｙ−１／「＋」）の両方がＴＹＬＣＶに抵抗性である。
【００２５】
Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからのＴｙ−１抵抗性遺伝子を含む近交系トマト系統ＦＤＲ１６−２０４５も、Ｍｉ遺伝子座付近に移入されたＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからの抵抗性遺伝子の故に線虫に対する抵抗性を付与する（Ｈｏｏｇｓｔｒａｔｅｎ、米国特許第６，４１４，２２６号）。線虫及びジェミニウイルスについてのこれら２つの抵抗性遺伝子がＦＤＲ１６−２０４５系統において共遺伝されることは、Ｔｙ遺伝子座とＭｉ遺伝子座が遺伝的に近接して位置することを明らかにする。Ｍｉ遺伝子座の線虫抵抗性対立遺伝子は、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからＦＤＲ１６−２０４５系統に移入されたとき、Ｍｉ−Ｊと称される。ＦＤＲ１６−２０４５系統は、育種家が、Ｍｉ及びＴｙ遺伝子座に「＋」型対立遺伝子を有する第二の近交系交配親を使用することにより、遺伝子ひきずりの大部分を隠す能力を備えた、線虫及びジェミニウイルスについての有効な抵抗性対立遺伝子を含む商業的雑種を作出することを可能にするので、貴重な交配近交系である。この移入からの遺伝子ひきずりは、ストレス条件下での自己壊死、より長い節間、より小さな果実サイズ及びより少ない結実として発現されうる。
【００２６】
しかし、病理試験を通して、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからのＭｉ−Ｊ対立遺伝子はＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍからのＭｉ−１対立遺伝子ほど有効ではないことが認められた。これは、Ｍｉ−Ｊ対立遺伝子をＦ１雑種においてＭｉ遺伝子座の「＋」感受性対立遺伝子と対合させたとき特に明らかである。分子学的手法を使用して、発明者はＭｉ遺伝子座の３つの可能な対立遺伝子（Ｍｉ−１、Ｍｉ−Ｊ及び「＋」）を識別するための分子マーカー試験を設計することができた。
【００２７】
トマト育種家は、それ故、これらの移入に付随する遺伝子ひきずりを隠す能力を保持しながら、６番染色体のセントロメア領域に位置づけられる多数の抵抗性遺伝子を送達することの限界に直面する。雑種栽培品種の６番染色体のこの領域に位置づけられるすべての既知の抵抗性遺伝子を集積させるために、育種家は、線虫抵抗性遺伝子Ｍｉ−１を含むＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍからの移入を有するものを一方の交配親とし、ＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子Ｔｙ−１を含むＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからの移入を有するもの、Ｏｉｄｉｕｍについての抵抗性遺伝子を含むＬ．ｈｉｒｓｕｔｕｍからの移入を有するもの、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍのレースについての抵抗性遺伝子を含むＬ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍからの移入を含むもの、及びさらにこれらの移入の一部に関連する遺伝子ひきずりを隠すためのｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍからの「＋」型対立遺伝子を含むものをもう一方の親としなければならない。雑種栽培品種を作製するためには２つの親系統しか選ぶことができないので、この作業は育種家にとって不可能である。このジレンマはまた、Ｈｏら（（１９９２）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ２：９７１−９８２、図６参照）によって及びＬｉｈａｒｓｋａら（（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ ３９：４８５−４９１、図１参照）によって図式的に示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
それ故、最初にＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅから移入されたＴＹＬＣＶ抵抗性について最も有効な対立遺伝子、Ｔｙ−１と共に、最初にＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍから移入された線虫抵抗性について最も有効な対立遺伝子、Ｍｉ−１を含む、組換えが強く抑制されることが知られているゲノムのこの領域内での組換え事象を特定する必要性が現在も存在する。このように近位の密接に連鎖する対立遺伝子は、相引相又はシス相であると称される。シス相の有効な抵抗性対立遺伝子のそのような組合せは、トマト育種家が、遺伝子ひきずりを隠すため、又はＯｉｄｉｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍあるいはこの病害クラスター内のまだ発見されていない抵抗性対立遺伝子などの付加的な抵抗性遺伝子を送達するために第二の近交系親を選択する自由を保持しながら、ＴＹＬＣＶ及び線虫に対して最も有効な抵抗性を有するトマト雑種を作出することを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明により、そのゲノム内に少なくとも１個のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）抵抗性対立遺伝子及び少なくとも１個のネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を含み、前記抵抗性対立遺伝子が１つの染色体上の異なる座に相引相で存在すること、及びその植物がＴＹＬＣＶに対して抵抗性であり、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ａｒｅｎａｒｉａ、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ及びＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａから成る群より選択される少なくとも１つのネコブセンチュウ種に対して高度に抵抗性であることを特徴とする、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物が提供される。
【００３０】
また、そのゲノム内に少なくとも１個のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）抵抗性対立遺伝子及び少なくとも１個のネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を含み、前記抵抗性対立遺伝子が１つの染色体上の異なる座に相引相で存在すること、及びその植物が、ＴＹＬＣＶ及びＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ａｒｅｎａｒｉａ、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ及びＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａから選択される少なくとも１つのネコブセンチュウ種の両方に対して抵抗性であって、前記ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子がＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからのＭｉ−Ｊ対立遺伝子ではないことを特徴とする、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物が提供される。
【００３１】
１つの好ましい実施態様では、約１．０未満のネコブセンチュウ抵抗性スコアを有する本発明の植物が提供され、さらなる好ましい実施態様では、約０．５未満のネコブセンチュウ抵抗性スコア、より好ましくは約０．２５未満、さらに一層好ましくは約０．０５未満のネコブセンチュウ抵抗性スコアが提供される。１つの実施態様では、前記植物は雑種植物である。
【００３２】
１つの好ましい実施態様では、ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子はＴｙ−１と称される対立遺伝子である。もう１つの好ましい実施態様では、ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子はＭｉ−１と称される対立遺伝子である。さらなる好ましい実施態様では、ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及びネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子は、それぞれＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｃｈｉｌｅｎｓｅ及びＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍからである。
【００３３】
好ましくは、ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及びネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子は非トランスジェニックである。
【００３４】
本発明のもう１つの局面では、そのようなＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物の果実又は種子が提供される。
【００３５】
本発明は、近交系商業的Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物を提供しうる、あるいは本発明に従った植物はもう１つ別のＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物との交配における親として使用しうる。本発明は、それ故、本発明の植物を、ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子を持たず、且つネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を持たない近交系植物と交雑する方法によって生産される雑種Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物を提供する。
【００３６】
本発明のこの局面の好ましい実施態様では、ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及びネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子の両方が異型接合である雑種Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物が提供される。良好な園芸特性を有するそのような雑種植物がより好ましく、またＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及びネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を与える野生トマト種の遺伝子移入に通常付随する遺伝子ひきずりが大きく低下した雑種植物がさらに一層好ましい。
【００３７】
好ましくは、前記雑種植物は、野生種Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｃｈｉｌｅｎｓｅに関連するもののような大きく低下した遺伝子ひきずり作用、及び野生種Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍに関連するもののような大きく低下した遺伝子ひきずり作用を示す。より好ましくは、前記雑種植物は、自己壊死、より長い節間、より小さな果実、より少ない結実及び園芸的に劣る植物構造から成る病徴群より選択される遺伝子ひきずり病徴が大きく低下している。
【００３８】
前記ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及び前記ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子の遺伝子座は、前記染色体上の同じ病害抵抗性クラスター内で生じる。それ故、本発明のさらに一層好ましい実施態様では、前記クラスター内の少なくとも１個の付加的な病害抵抗性対立遺伝子が、Ｔｙ−１ ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及びＭｉ−１ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子に対して相反相又はトランス相で提供される。本発明のこの局面の１つの代替的実施態様では、前記付加的病害抵抗性対立遺伝子は、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍレース２、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍレース５及びＯｉｄｉｕｍから成る群より選択される病害に対する抵抗性を付与する。
【００３９】
本発明の様々な実施態様の例を、以下の図面を参照しながら詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、Ｔｙ＋（配列番号１１）及びＴｙ−１（配列番号１０）対立遺伝子近くのマーカー遺伝子座のポリヌクレオチド配列の比較、及び斜線の箱で表わした、前記ポリヌクレオチド配列の間での１９個の一塩基多型の特定を示す。円は、Ｔｙ−１配列内の塩基対９７−９８及びＴｙ＋配列内の塩基対９６−９７における２個の隣接多型を特定し、Ｔｙ−１対立遺伝子においてのみＴａｑＩ制限酵素認識部位が生じる。
【図２】図２は、Ｍｉ＋、Ｍｉ−１及びＭｉ−Ｊ対立遺伝子近くのマーカー遺伝子座のポリヌクレオチド配列の比較、及び斜線の箱で表わした、前記ポリヌクレオチド配列の間での２０個の一塩基多型の特定を示す。円は、塩基対６０３及び７５４における多型を特定する。
【図３】図３は、Ｍｉ遺伝子座における様々な対立遺伝子の組合せを含む、５つの植物遺伝子型の平均線虫抵抗性等級を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は、組換え事象から生産され、最初にＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅから移入されたＴｙ−１とシス相で、最初にＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍから移入されたＭｉ−１を含むトマト植物（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）を提供する。
【００４２】
（定義）
植物学用語：リンネは植物分類の父とみなされている。彼は初めて近代的なトマトをＳｏｌａｎｕｍ（ナス属）として分類したが、その学名は長年にわたってＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍであった。同様に、Ｌ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ、Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ、Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ、Ｌ．ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ、Ｌ．ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ、Ｌ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉｉ、Ｌ．ｃｅｒａｓｉｆｏｒｍｅ及びＬ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍのような近代的トマトの野生類縁はＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ属の中に分類された。過去数年にわたって、これらの種の名称を再分類すべきかどうかについてトマト研究者と植物学者の間で論争が為されてきた。近代的トマトについての新たに提案された学名は、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍである。同様に、野生種の名前も変更される可能性がある。Ｌ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉはＳｏｌａｎｕｍ ｐｅｎｎｅｌｌｉｉに、Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍはＳ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓになる可能性があり、Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍは、Ｓ．「Ｎ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ」とＳ．「Ｃａｌｌｅｊｏｎ ｄｅ Ｈｕａｙｌｅｓ」、Ｓ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ及びＳ．ｃｏｒｎｅｌｉｏｍｕｅｌｌｅｒｉに分けられ、Ｌ．ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍはＳ．ｎｅｏｒｉｃｋｉｉに、Ｌ．ｃｈｍｉｅｉｌｅｗｓｋｉｉはＳ．ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉに、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅはＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅに、Ｌ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅはＳ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ又はＳ．ｇａｌａｐａｇｅｎｓｅに、及びＬ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍはＳ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍになるかもしれない（Ｓｏｌａｎａｃｅａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ（２００５）ＳｐｏｏｎｅｒとＫｎａｐｐ； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｇｎ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ｈｅｌｐ／ａｂｏｕｔ／ｓｏｌａｎｕｍ＿ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．ｈｔｍｌ）。
【００４３】
このように、明瞭化のためにトマト及びその類縁についての名称が変更になるかもしれないが、近代的トマト及びその野生類縁は、すべてＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ属に含まれる既存の名称を使用して定義する。
【００４４】
線虫：ネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ種）は土壌中に一般的に存在し、大部分は広い宿主範囲を有していて、多くの一年生及び多年生作物で問題を引き起こす。トマトは最も深刻な影響を受けるものの１つであり、線虫はすべてのトマト生育地域で問題を生じさせる。ネコブセンチュウは特定が困難であり、５０種以上が特定されているが、少数の種（例えばＭ．ｊａｖａｎｉｃａ、Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ及びＭ．ａｒｅｎａｒｉａ）がトマト栽培者にとっての問題の大部分を引き起こす。
【００４５】
ここで使用するとき、「対立遺伝子」の語は、特定の座の遺伝子の１つ以上の選択的形態のいずれかを意味し、それらの対立遺伝子はすべて特定遺伝子座の１つの形質又は特徴に関する。生物の二倍体細胞では、所与の遺伝子の対立遺伝子は１つの染色体上の特定の位置又は座に位置する。相同染色体の対の各々の染色体上に１個の対立遺伝子が存在する。二倍体植物種は、特定遺伝子座に多数の異なる対立遺伝子を含みうる。
【００４６】
ここで使用するとき、「（遺伝子）座」の語は、例えば遺伝子又は遺伝マーカーが認められる染色体上の特定の場所又は部位を意味する。「Ｍｉ遺伝子座」は、ここでは１個以上の対立遺伝子が位置し、植物又は植物組織が有するネコブセンチュウ抵抗性の程度を決定する、トマトゲノム内の位置を指す。「Ｔｙ遺伝子座」の語は、ここでは１個以上の対立遺伝子が位置し、植物又は植物組織が有するＴＹＬＣＶ抵抗性の程度を決定する、トマトゲノム内の位置を指す。
【００４７】
ここで使用するとき、「相引相」及び「シス相」の語は、２つの異なる座の対立遺伝子が１つの（相同）染色体上で互いに連鎖して起こる遺伝的状態を指す。例えば、対立遺伝子Ｔｙ−１とＭｉ−１が１つの相同染色体上に位置するとき、これらの対立遺伝子は「相引相」である。これに対し、対立遺伝子Ｔｙ−１とＭｉ−１が１つの相同対の異なる相同染色体上に位置するとき、それらは「相反相」又は「トランス相」であるという。
【００４８】
「組換え」又は「組換え事象」は、ここでは交叉及び相同染色体の独立した組合せの結果として生じる新しい遺伝子構造を有する植物を指す。
【００４９】
「ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子」は、ゲノム内に存在するとき、トマト黄化葉巻ウイルス感染及び／又は被害に対する「抵抗性」又は「中間抵抗性」を付与する対立遺伝子を指す。１又は複数の植物が、「ＴＹＬＣＶ抵抗性アッセイ」（以下参照）を使用して０−１の間あるいは０又は１に等しい平均病害スコアを有するとき、その１又は複数の植物はＴＹＬＣＶに対して「抵抗性」であるという。１又は複数の植物が、ＴＹＬＣＶ抵抗性アッセイを使用して約２の平均病害スコアを有するとき、その１又は複数の植物は「中間」ＴＹＬＣＶ抵抗性を有するという。約３以上の平均病害スコアを有する植物は感受性であるという。
【００５０】
「ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子」は、ゲノム内に存在するとき、Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ、Ｍ．ｊａｖａｎｉｃａ及びＭ．ａｒｅｎａｒｉａから選択される少なくとも１つ又はそれ以上の線虫種に対する抵抗性を付与する対立遺伝子を指す。１又は複数の植物が、「ネコブセンチュウ抵抗性アッセイ」（以下参照）を使用して約０．１未満の平均病害スコアを有するとき、その１又は複数の植物はこれらのネコブセンチュウ種の少なくとも１つに対して「高度抵抗性」であるという。例えばＭｉ−１／Ｍｉ−１植物及びＭｉ−１／＋植物は高度抵抗性である。１又は複数の植物が、約０．１以上であるが１．０未満の平均病害スコアを有するとき、その１又は複数の植物は「中間抵抗性」を有するという（例えば対立遺伝子ＭｉＪ／ＭｉＪを有する植物）。１．０以上であるが２．０未満の平均病害スコアを有する植物は「軽度抵抗性」を有するといい（例えば対立遺伝子ＭｉＪ／＋を有する植物）、２．０以上の平均病害スコアを有する植物は感受性であるという（例えば対立遺伝子＋／＋を有する植物）。
【００５１】
「ＴＹＬＣＶ抵抗性アッセイ」は、複数の植物を自然のＴＹＬＣＶ感染が起こる圃場において生育させ、実施例においてさらに説明するように、０−４の尺度を用いて感染後の１つ以上の時点で病害症状を評価し、及びＴｙ遺伝子座に特定対立遺伝子組成物（遺伝子型）を有する複数の植物について平均病害等級を決定することを指す。
【００５２】
「線虫抵抗性アッセイ」は、複数の植物を、Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ、Ｍ．ｊａｖａｎｉｃａ又はＭ．ａｒｅｎａｒｉａ接種材料を接種した土壌において生育させ、実施例においてさらに説明するように、約２８日後に０−４の等級で根こぶを評価し、及びＭｉ遺伝子座に特定対立遺伝子組成物（遺伝子型）を有する複数の植物について平均病害等級を決定することを指す。
【００５３】
ここで使用するとき、「異型接合」の語は、２個の異なる対立遺伝子が１つの特定遺伝子座にあるが、二倍体生物の細胞における相同染色体の対応する対上に個別に位置するときに存在する遺伝的状態を意味する（例えばＭｉ−１／＋）。逆に、ここで使用するとき、「同型接合」は、２個の同一対立遺伝子が１つの特定遺伝子座にあるが、二倍体生物の細胞における相同染色体の対応する対上に個別に位置するときに存在する遺伝的状態を意味する（例えばＭｉ−１／Ｍｉ−１）。
【００５４】
ここで使用するとき、「植物」の語は、植物全体、あるいは植物細胞、植物プロトプラスト、そこからトマト植物が再生することができる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物細胞クランプ及び植物中の無傷の植物細胞などの、その何らかの部分又は誘導体、あるいは胚、花粉、卵、果実（例えば収穫されたトマト）、花、葉、種子、根、根端等のような植物の部分を包含する。
【００５５】
「分子アッセイ」（又は試験）は、Ｍｉ又はＴｙ遺伝子座における特定対立遺伝子の存在又は不在を（直接又は間接的に）指示する（ＤＮＡに基づく）アッセイを指す。加えて、分子アッセイは、特定対立遺伝子が個々の植物においてＴｙ又はＭｉ遺伝子座で同型接合であるか又は異型接合であるかを決定することを可能にする。例えば、１つの実施態様では、Ｍｉ又はＴｙ遺伝子座に関係する核酸をＰＣＲプライマーを用いて増幅し、その増幅産物を酵素で消化して、前記増幅産物の電気泳動分離パターンに基づき、個々の植物中にＭｉ又はＴｙ対立遺伝子が存在するかどうか及びＭｉ又はＴｙ遺伝子座の対立遺伝子の接合生殖性（すなわち各々の座の遺伝子型）を決定することができる。例は、ＳＣＡＲ、ＣＡＰＳ及び同様のアッセイである。
【００５６】
ここで使用するとき、「品種」又は「栽培品種」の語は、所与の遺伝子型又は遺伝子型の組合せから生じる特徴の発現によって定義できる、最も低い既知等級の単一植物分類群内の植物グループを意味する。
【００５７】
ここで使用するとき、「野生型」の語は、Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ内で認められる天然に生じる対立遺伝子を意味する。線虫抵抗性遺伝子座Ｍｉ及びＴＹＬＣＶ遺伝子座Ｔｙで、Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍからのこれらの野生型対立遺伝子はこれらの病原体に対する感受性を与え、ここではＭｉ＋及びＴｙ＋、又は単に「＋」と称される。
【００５８】
ここで使用するとき、「変異体」又は「多型変異体」の語は、所与の核酸配列に本質的に類似する核酸配列を指す。例えば、「その変異体」又は「配列番号１から１１のいずれかの変異体」の語は、そのポリヌクレオチド配列から１個以上（例えば２個、３個、４個、５個又はそれ以上）のヌクレオチドが欠失している（欠失変異体）又は１個以上のヌクレオチドが他のヌクレオチドで置換されている（置換変異体）又は１個以上のヌクレオチドが前記ポリヌクレオチド配列に挿入されている（挿入変異体）、ポリヌクレオチド配列を指す。
【００５９】
配列番号１から１１の変異体は、配列番号１から１１のいずれかに「本質的に類似」するヌクレオチド配列を含む。配列番号１から１１に本質的に類似する配列は、例えばデフォルトパラメータを用いるＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムと共に、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムを使用して最適に整列したとき、配列番号１から１１の１つ以上の配列に少なくとも約９０％、より好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％又はそれ以上の核酸配列同一性を有する核酸配列である。ＧＡＰデフォルトパラメータは、ギャップ生成ペナルティー＝５０（ヌクレオチド）及びギャップ伸長ペナルティー＝３（ヌクレオチド）である。ヌクレオチドについては、使用するデフォルト評価マトリックスはｎｗｓｇａｐｄｎａ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２、ＰＮＡＳ ８９：９１５−９１９）である。配列アラインメント及びパーセンテージ配列同一性についてのスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．，９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ９２１２１−３７５２，ＵＳＡから入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３又はＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）についてのオープンソースソフトウエア（現在のバージョン２．７．１−０７）などのコンピュータプログラムを使用して決定しうる。変異体はまた、これらの配列のいずれかの断片又は部分を包含する。
【００６０】
（本発明に従った植物及び植物の部分）
１つの実施態様では、本発明は最初にＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅから移入されたＴｙ−１とシス相で、最初にＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍから移入されたＭｉ−１対立遺伝子をそのゲノム内に含むトマト植物（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、ならびにそのような植物の細胞及び組織、種子又は果実を提供する。これらの植物は、例えば、各々が（好ましくは固定された）対象対立遺伝子（ここではＭｉ−１又はＴｙ−１）を含む、公的に入手可能な商業品種を交雑することによって、及び前記交雑から得たＦ２植物から、又はさらなる自家受粉又はＦ１の交雑によって得たさらなる世代から（例えばＦ２又は戻し交雑個体群）、Ｍｉ−１とＴｙ−１をシス相で含む組換え植物を選抜することによって、作製することができる。組換えの発生率が非常に低く、数多くの事象を必要とするので、選抜は、好ましくはＳＣＡＲ又はＣＡＰＳアッセイなどの１つ以上のＭｉ対立遺伝子特異的分子アッセイ又は対立遺伝子識別分子アッセイを用いて実施する。例えば、実施例で述べるような、ここでは「Ｔｙ遺伝子座についてのＳＣＡＲアッセイ」、「Ｍｉ遺伝子座についてのＳＣＡＲアッセイＮｏ．１」及び「Ｍｉ遺伝子座についてのＳＣＡＲアッセイＮｏ．２」と称する３つのＳＣＡＲアッセイの１つ以上を使用しうる。これらのアッセイでは、ＰＣＲ反応において３つのプライマー対（配列番号１と２、配列番号３と４及び配列番号５と６）を使用し、次に酵素制限して、ＰＣＲ増幅産物間の多型を検出するために得られた断片の検出を実施する。
【００６１】
常用実験を使用して同様のアッセイを開発できることは明白である。例えばプライマー配列のいずれかの「変異体」、あるいはＭｉ及びＴｙ遺伝子座上又はそれらの近くのゲノムの他の部分にハイブリダイズするプライマー又はプローブが使用しうる。
【００６２】
Ｍｉ−１とＴｙ−１をシス相で含む植物は、同型接合又は異型接合でありうる。これらの植物は、例えば雑種又は近交系を生成するために前記対立遺伝子を１つの単位として他のトマト植物に移入するためのさらなる交雑において使用しうる。好ましい実施態様では、相同染色体上にＭｉ−１及びＴｙ−１対立遺伝子を相引相で含み、感受性である雑種植物、あるいは相同染色体上にＭｉ＋及びＴｙ＋対立遺伝子を含む雑種植物が提供される。これらの植物は、Ｍｉ−１及びＴｙ−１対立遺伝子が同型接合状態で存在するとき通常これらの対立遺伝子に結びつく遺伝子ひきずり病徴が有意に低いか又は全くないという利点を有する。
【００６３】
遺伝子ひきずり病徴は、Ｍｉ−１及びＴｙ−１対立遺伝子を持たない植物と比較して、自己壊死、より長い節間、より小さな果実、より少ない結実及び園芸的に劣る構造の群から選択される１つ以上の病徴を指す。当業者は、遺伝子ひきずりのそのような病徴が栽培者による近交系又は雑種植物系統の商業的受け入れに好ましくない影響を及ぼすことを認識する。一般に、有害レベルの遺伝子ひきずりの存在は、これらの病徴の１つ以上が、その植物系統が商業的に受け入れられなくなる程度に存在することによって判定されうる。
【００６４】
本発明のトマト植物は、約０．２５未満、好ましくは約０．２未満、より好ましくは約０．１未満あるいは０．０３又は０．０２などの約０．０５未満の平均線虫抵抗性スコアを有する。さらに、これらの植物はＴＹＬＣＶに抵抗性であり、上述したアッセイで測定するとき、１．０以下の平均ＴＹＬＣＶ抵抗性スコアを有する。
【００６５】
（他の線虫及びＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子を含む植物）
もう１つの実施態様では、本発明は、上記組換え体を作製及び／又は選抜する方法、ならびに、好ましくはＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍの６番染色体上に、少なくとも１個のＭｉ抵抗性対立遺伝子及び少なくとも１個のＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子を相引相（シス相）で有する他の組換え体を作製及び／又は選抜するための方法を提供する。そのような植物は、Ｍ．ａｒｅｎａｒｉａ、Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ及び／又はＭ．ｊａｖａｎｉｃａ種の線虫に対して高度、中間又は軽度抵抗性を有すること、及びここで述べる抵抗性アッセイを使用するときＴＹＬＣＶに対して抵抗性又は中間抵抗性を有することによって特徴付けられる。また、この方法を用いて作製される組換え事象、ならびにこれらの植物の組織、細胞、種子及び果実、及びＭｉ及びＴｙ抵抗性対立遺伝子をシス相で含む雑種又は近交系色物を生成するためのこれらの植物の使用も提供される。但し、Ｔｙ−１対立遺伝子と相引相でＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからのＭｉ−Ｊ対立遺伝子を含む植物は、先行技術（米国特許第６，４１４，２２６号）において既に偶然に自然発生しているので、そのような植物は本発明に従って作製されなかったが、明白に除外される。いかなる場合も、Ｔｙ−１対立遺伝子と相引相でＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからのＭｉ−Ｊ対立遺伝子を含む植物は高いレベルの線虫抵抗性を示さない、すなわちここで定義するような高度抵抗性ではない。それ故、ＴＹＬＣＶに対する抵抗性及び線虫に対する高度抵抗性を付与する植物が特に好ましい。
【００６６】
１つの実施態様では、本発明は、ネコブセンチュウに対する抵抗性を付与する対立遺伝子と相引相でＴＹＬＣＶに対する抵抗性を付与する対立遺伝子を含むトマト植物を作製することに関する。ＴＹＬＣＶに対する抵抗性を付与する対立遺伝子及びネコブセンチュウに対する抵抗性をコードする対立遺伝子は、もともと、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｃｅｒａｓｉｆｏｒｍｅ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｃｈｅｅｓｍａｎｉｉ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｈｉｒｓｕｔｕｍ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｃｈｉｌｅｎｓｅ又はＳｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｉｄｅｓなどの、但しこれらに限定されない、異なる生殖質ソース（すなわちトマトの異なる種）に由来しうる。
【００６７】
それ故、１つの実施態様では、２つの遺伝子座に相引相で少なくとも１個のＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及び少なくとも１個のネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を含むＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物を作製するための方法が提供され、その方法は、（ａ）ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子を含むＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ植物を、ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を含むＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ植物と交雑すること、（ｂ）前記交雑の子孫を、１つ以上の分子アッセイを使用して２つの遺伝子座の各々における前記抵抗性対立遺伝子の存在に関して分析すること、及び（ｃ）前記抵抗性対立遺伝子を相引相で含む１つ以上の植物を選抜すること、の工程を含む。
【００６８】
場合により、抵抗性アッセイを前記方法のいずれかの段階で実施しうる。さらなる任意の工程（ｄ）は、得られた植物を自家受粉させること又は得られた植物をもう１つ別のトマト植物と交雑して雑種植物を作出することを含む。好ましい実施態様では、前記法によって得られる植物はＴＹＬＣＶに抵抗性であり、線虫に高度抵抗性（定義したように）である。
【００６９】
工程（ａ）の出発植物は、実施例の中で述べるように病理試験を用いて選抜することができる。それらは、野生又は栽培植物、あるいは突然変異誘発又は形質転換植物などの改変された植物であってもよい。例えば、ＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ Ｉｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；ＭｃＣａｌｌｕｍら、２０００、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １８：４５５及びＭｃＣａｌｌｕｍら、２０００、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３、４３９−４４２）又はＥＣＯＴＩＬＬＩＮＧ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、２００４、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｐｒｅｖｉｅｗ ２００４年５月２１日）などのアプローチを使用して、改変された病原体抵抗性及び／又はＴｙ又はＭｉ遺伝子座の対立遺伝子における突然変異を有する植物を作製及び／又は選抜しうる。これらの植物は、その後、Ｔｙ及びＭｉ抵抗性対立遺伝子のソースとして使用しうる。
【００７０】
次に、（以下で述べる）本発明に従った１つ以上の分子アッセイを使用して、交雑の子孫を分析する。分析し、その中から植物を選抜する子孫は、所望交雑／選抜計画及び使用する植物中に存在する対立遺伝子に依存して、Ｆ２、Ｆ３世代等、戻し交雑世代（ＢＣ１、ＢＣ２等）等のような様々な世代の子孫のいずれかでありうる。分子アッセイは、好ましくはＦ２植物に関して実施する。また、病理アッセイ及び／又は１つ以上の分子アッセイを使用して異なる世代の子孫を繰り返し試験しうる。１つの世代においていくつかの分子アッセイを実施しうるか、あるいは異なる世代において１つ以上の異なるアッセイを実施しうる。それ故、工程（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）を数回反復しうる。その目的は、所望Ｔｙ及びＭｉ抵抗性対立遺伝子を相引相で含む組換え体を特定すること（工程ｃ）である。この方法では、いかなるＴｙ抵抗性対立遺伝子をいかなるＭｉ抵抗性対立遺伝子と組み合わせてもよい（相引相で）。
【００７１】
前記植物は、例えばＴｙ遺伝子座又はその近く、及びＭｉ遺伝子座又はその近くの核酸配列に基づき、分子アッセイを使用して他の植物から識別することができる。これらの分析は、これら２つの遺伝子座の対立遺伝子構造を決定することを可能にする。例えば、本発明に従った植物は、Ｍｉ遺伝子座の近くに配列番号８又は基本的にそれに類似する（及びＭｉ遺伝子座のＭｉ抵抗性対立遺伝子を指示する）核酸配列、あるいはＴｙ遺伝子座の近くに配列番号１０又は基本的にそれに類似する（及び連鎖Ｔｙ遺伝子座のＴｙ抵抗性対立遺伝子を指示する）核酸配列を含み、それによってこれらの領域は相引相で連結される。好ましくは、本文中別の箇所で述べるような１つ以上のＰＣＲベースのアッセイを使用して、Ｍｉ遺伝子座とＴｙ遺伝子座の異なる遺伝子型を識別し、所望対立遺伝子を相引相で有する組換え植物を選抜する。
【００７２】
Ｍｉ及びＴｙ抵抗性対立遺伝子を相引相で含む組換え植物の選抜及びこの単一メンデル単位の他の植物への移入は、分子生物学、植物病理学及び伝統的交雑手法の組合せを用いて達成しうる。好ましいアプローチでは、本発明は、分子生物学手法を使用して、ＴＹＬＣＶ抵抗性とネコブセンチュウ抵抗性についての所望対立遺伝子を栽培トマトのゲノム内にシス相で導入するためにＴｙ及びＭｉ遺伝子座の種々の対立遺伝子を識別する。本発明は、典型的にこれらの形質に結びつく遺伝子ひきずりを隠す植物育種家の能力を保持しながら、またＴｙ及びＭｉ抵抗性をＯｉｄｉｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍについての抵抗性遺伝子又はこの遺伝子クラスター内に存在するまだ発見されていない抵抗性遺伝子と組み合わせる自由を保持しながら、ＴＹＬＣＶ及びネコブセンチュウの両方に多数の抵抗性を有するトマト雑種の育種を促進させる。
【００７３】
限定ではなく例として、本発明は、好ましくは６番染色体上に位置するシス相の共遺伝単位として、いずれかのＴｙ抵抗性対立遺伝子およびいずれかのＭｉ抵抗性対立遺伝子を相引相で含むトマト生殖質の開発を提供する。ひとたび高いレベルの（例えばＴｙ−１及びＭｉ−１によって提供される抵抗性レベルと同等の）抵抗性を有する植物が特定されれば、Ｍｉ及びＴｉ遺伝子座に密接に関連する、ここで開示する核酸領域を配列決定することができ、その（関連マーカー領域の）配列情報を使用して、それらの植物において認められる対立遺伝子についての分子アッセイを開発することができる。当業者には明白であるように、様々な生殖質においてＭｉ又はＴｙ抵抗性対立遺伝子を特定するための代替的な方法が存在する。そのような方法のさらなる詳細を下記で述べる。
【００７４】
先に述べたように、本発明は分子生物学、植物病理学及び伝統的交雑手法の組合せを使用する。１つの実施態様では、使用する分子生物学手法は、例えば、下記でより詳細に論じる、Ｍｉ及び／又はＴｙ遺伝子座に関連する核酸領域にハイブリダイズする（及び増幅する）核酸プライマーを用いたマーカーアッセイを含む。本発明は、Ｔｙ−１及びＭｉ−１対立遺伝子を含む、実施例で開示する特定アッセイだけでなく、ネコブセンチュウに対する抵抗性をコードする対立遺伝子と相引相でＴＹＬＣＶに対する抵抗性をコードする対立遺伝子をトマトに移入するために開発され、使用されうるいかなるアッセイも考慮する。例えば、本発明は、Ｔｙ及び／又はＭｉ遺伝子座の何らかの変異体（例えばオーソローグ又は進化的に分岐した天然対立遺伝子又は突然変異誘発によって生成される対立遺伝子）をトマトに移入すること及びシス相で対立遺伝子を含む植物を生成することを考慮する。
【００７５】
またここでは、前述した方法のいずれかによって入手しうる植物、及びもう１つ別のＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物との交雑における親としてのそれらの植物の使用が提供される。本発明は、技術的にいかなる意味においてもトマトの１つ又はそれ以上の特定品種に限定されず、トマト植物（近交系、雑種等を含む）に一般的に適用されることに留意すべきである。
【００７６】
（本発明に従った分子アッセイ）
植物のＴｙ遺伝子座におけるＴｙ−１及びＴｙ＋の存在又は不在、及びＭｉ遺伝子座のＭｉ−１、Ｍｉ−Ｊ及び／又はＭｉ＋を識別するいくつかの分子アッセイがここで提供される。これらのアッセイの１つ以上がマーカーアシスト選抜において、すなわち、Ｍｉ及びＴｙ遺伝子座における植物の対立遺伝子構造を決定するため及び所望Ｍｉ及びＴｙ抵抗性対立遺伝子を有する植物を選抜するために使用できる。常套的分子生物学手法を使用して、何らかのＭｉ及びＴｙ抵抗性対立遺伝子に関する同様のアッセイを開発することができる。例えば、配列番号７から９（又は変異体核酸配列）又は配列番号１０又は１１（又はその変異体）の１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、３０又はそれ以上の連続ヌクレオチドの断片は、ＰＣＲプライマー対又は核酸ハイブリダイゼーションのためのプローブを設計するため、及びそのようなプライマー対によって増幅される領域又はそのようなプローブがハイブリダイズする核酸配列の核酸情報に基づく識別分子アッセイを開発するために使用しうる。開発するアッセイの正確なタイプは、それがＭｉ抵抗性対立遺伝子とＴｙ抵抗性対立遺伝子、及びＭｉ及び／又はＴｙ遺伝子座の同型接合／異型接合を識別することができる限り、重要ではない。アッセイの様々なタイプの例を下記及び実施例に示す。
【００７７】
本発明の方法においてマーカーアシスト選抜を実施するために、対象トマト植物又は植物の部分を、例えば、最初に、当技術分野において既知の手法であるＤＮＡ抽出に供する（Ｈｎｅｔｋｏｖｓｋｙら、Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．，３６（２）：３９３−４００（１９９６）参照）。ひとたび抽出が完了すれば、増幅切断多型配列（ＣＡＰＳ）アッセイ（Ａｋｏｐｙａｎｚら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０：６２２１−６２２５（１９９２）及びＫｏｎｉｅｃｚｎｙ ＆ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，４：４０３−４１０（１９９３）参照）又はＳＣＡＲアッセイを含むがこれらに限定されない分子アッセイを実施することができる。ＳＣＡＲアッセイは、ＰＣＲによって遺伝子座（Ｔｙ遺伝子座又はＭｉ遺伝子座の近くの特定遺伝子座）のＤＮＡを増幅し、その後制限酵素で消化することを含む。核酸配列間の多型は、例えば異なる大きさの制限断片を生じることにより、異なる対立遺伝子（Ｍｉ＋、Ｍｉ−Ｊ及び／又はＭｉ−１対立遺伝子などであるが、これらに限定されない）を識別する。
【００７８】
トマト植物のゲノム内のＴｙ及び／又はＭｉ遺伝子座にどの対立遺伝子が存在するかを特定し、もし前記対立遺伝子が存在する場合は、それらの対立遺伝子が同型接合又は異型接合のいずれの状態で存在するかを特定するために、これらのアッセイでは核酸プライマー及び酵素を使用する。両方の遺伝子座から得た情報を使用して、Ｔｙ及びＭｉ遺伝子座に相引相（すなわちシス相）で特定の対立遺伝子組合せを有する植物を特定する。
【００７９】
マーカーアシスト選抜試験を作成するために、当業者は、供与体ソース（すなわち病害抵抗性形質を含む生殖質）からのＤＮＡ配列を、受容体ソース（すなわち特定病原体についての感受性「＋」体を含む生殖質）からの対応するＤＮＡ配列と比較することから始める。あるいは、対象形質に遺伝的に密接に関連するゲノム内の対応する位置で供与体と受容体からのＤＮＡの配列比較を実施する。Ｔｙ及びＭｉ遺伝子座については、これらの形質付近での多型の特定は当技術分野において既知である（Ｚａｍｉｒら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８８：１４１（１９９４）及びＷｉｌｌｉａｍｓｏｎら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８７：７５７（１９９４）参照）。Ｔｙ−１対立遺伝子に関して、Ｚａｍｉｒらは、Ｔａｎｓｋｌｅｙ（Ｔａｎｓｋｌｅｙら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３２：１１４１（１９９２））によって最初に位置決定された、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）ＴＧ９７がＴｙ遺伝子座に密接に関連することを認めた。同様に、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎらは、ＲＥＸ−１遺伝子座がＭｉ遺伝子座に密接に関連することを認めた。
【００８０】
１つの実施態様では、使用する分子アッセイはＳＣＡＲアッセイであるか、又は実施例に見られるようにいくつかのＳＣＡＲアッセイである。例えば、配列番号１０は、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからのＴｙ−１対立遺伝子近くのポリヌクレオチドＬＡ１９６９を提供する。配列番号１１は、ＴＧ９７遺伝子座のＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍからの野生型Ｔｙ＋対立遺伝子の近くのポリヌクレオチド配列を提供する。図１は、これら２つの配列間に存在するいくつかの一塩基多型（ＳＮＰ）を強調した、これらの配列の比較を示す。ＳＮＰは、一般にＩＮＤＥＬＳと呼ばれる置換突然変異体、挿入又は欠失突然変異体でありうる。対立遺伝子間の多型を利用して、当業者は、ＳＮＰについてのマーカーアシストアッセイ及びプライマー（又はプローブ）を開発できることを認識する。そのようなアッセイは、感受性Ｔｙ＋対立遺伝子から抵抗性Ｔｙ−１対立遺伝子を識別するために使用できる。例えば、配列番号１と２のプライマー対は約３９８ｂｐの断片を増幅する（例えばゲノムトマトＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ増幅を使用して）。次にその増幅産物をＴａｑＩ酵素（配列Ｔ↓ＣＧＡを認識し、制限する）と共にインキュベートすると、Ｔｙ−１対立遺伝子を含む植物から増幅した３９８ｂｐ産物の約９５ｂｐと約３０３ｂｐの２つの核酸断片への制限を生じる。Ｔｙ−１について同型接合の植物は、それ故、これら２つの断片を生じるが（例えばゲル上のバンド等として視覚化される）、Ｔｙ＋について同型接合の植物は約３９８ｂｐの単一断片を生じる。異型接合植物（Ｔｙ−１／Ｔｙ＋）は３つの断片すべてを生産する。
【００８１】
同様に、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８７：７５７−７６３（１９９４）によって公表されたデータに基づき、Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ及びＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅのポリヌクレオチド配列をＲＥＸ−１と称されるＭｉ近くの遺伝子座で決定した。これら３つのポリヌクレオチド配列を配列番号７（Ｍｉ＋に特異的）、８（Ｍｉ−１）及び９（Ｍｉ−Ｊ）に示す。これらのポリヌクレオチド配列の比較を図２に示す。図２はこれら３つの配列間で２０のＳＮＰを明らかにしている。
【００８２】
ここで述べるＳＣＡＲアッセイは他の分子アッセイによって容易に修正又は置換でき、及びＴｙ及び／又はＭｉ遺伝子座のいかなる対立遺伝子についても容易に開発できることは明白である。また、前記アッセイは、２個以上のヌクレオチドの欠失、挿入又は置換などのＳＮＰ以外の他の多型にも基づきうる。
【００８３】
既に述べたように、配列番号７から１１の全部又は一部、あるいはその何らかの変異体又はゲノム内の隣接領域の全部又は一部にハイブリダイズし、増幅する特異的又は縮重プライマーを設計することができる。あるいは、抵抗性対立遺伝子の部分を直接増幅する又はＭｉ及びＴｙ遺伝子座の近くの他の核酸領域を増幅するためのプライマーも設計しうる。さらに、所望する場合は、米国特許第５，４６４，７４６号、同第５，４２４，４１４号及び同第４，９４８，８８２号に述べられているものを含むがこれらに限定されない、当技術分野で既知の手法を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡからのＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイなどの、但しこれに限定されない、他のマーカーアシスト選抜アッセイにおける使用のために本発明のプライマーを修飾することができる。
【００８４】
新しいＴｙ又はＭｉ抵抗性対立遺伝子を識別する新しい分子試験を設計するために、当業者は、例えば、最初にＭｉ又はＴｙ遺伝子座上又はその近くのマーカー遺伝子座のＤＮＡ配列を決定し（例えばここで述べるＰＣＲ増幅とプライマー対及びその増幅産物の配列決定を使用して）、次に他のマーカー配列（Ｍｉ及びＴｙ遺伝子座上又はその近くの他の対立遺伝子）の対応するＤＮＡと配列を比較することを認識する。このＤＮＡ比較により、当業者は、新しい配列多型あるいはこれまで他の比較ではカバーされていなかった既存の多型が残存するかどうかを特定できよう。これらのデータを使用して、新しい分子試験を設計するか、又はシス相のＴｙ及びＭｉ遺伝子座における何らかの対立遺伝子の組合せの選抜を容易にするために既存の試験を利用することができる。
【００８５】
上述したのと同様の方法が、ネコブセンチュウに対する抵抗性をコードする対立遺伝子を選抜及び／又は移入するために使用できる。限定ではなく一例として、トマト植物のゲノムにおけるＭｉ−１対立遺伝子の存在を判定するためのアッセイを述べる。Ｍｉ−１対立遺伝子の存在を判定するためのアッセイは、先に述べたＴｙ−１対立遺伝子を特定するために使用したのと同様の方法で決定できる。しかし、検討する植物がおそらくＭｉ−Ｊ対立遺伝子を含むと考えられる場合、植物のゲノムにおけるＭｉ−１対立遺伝子の存在の特定は、実施例で述べるような２つの分子アッセイを実施することを含みうるが、必ずしも含まない。いずれの場合も、これらのアッセイを実施する順序は決定的に重要ではない。
【００８６】
上述したアッセイは、Ｔｙ抵抗性対立遺伝子とＭｉ抵抗性対立遺伝子を相引相で含むトマト植物の交雑及び／又は選抜を容易にするための育種プログラムにおいて個別に及び集合的に使用できる。
【００８７】
これらの方法がどのように使用できるかについての非制限的な１つの例を、Ｍｉ−１とＴｙ−１を相引相で含む植物の選抜に関して以下で述べる。第一近交系トマト系統を第二近交系トマト系統と交雑させて雑種植物を生産しうる。交雑において使用する１つのトマト植物はＴｙ−１対立遺伝子をそのゲノム内に含み、第二の植物はＭｉ−１対立遺伝子をそのゲノム内に含む。生じた植物（Ｆ１雑種）を、次に、自家受粉させ、受精させて、播種する（Ｆ２種子）。そのＦ２種子からＦ２植物を生育させる（又はさらに自家受粉又は交雑させる、例えば交雑親の１つと戻し交配させる）。次にこれらの植物を、当技術分野で既知の手法である（Ｈｎｅｔｋｏｖｓｋｙら、１９９６、Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．，３６（２）：３９３−４００参照）ＤＮＡ抽出に供し、破砕された組織試料に関して直接ＰＣＲを実施する。
【００８８】
それ故、上述したアッセイは、異型接合状態のＴｙ−１対立遺伝子及び同型接合状態のＭｉ−１対立遺伝子を含むＦ２植物（又は他の子孫）を特定するために使用できる。あるいは、同型接合状態のＴｙ−１対立遺伝子及び異型接合状態のＭｉ−１対立遺伝子を含むＦ２植物を特定することができる。そこで、前述したＳＣＡＲアッセイなどの１つ以上の分子アッセイを使用して、Ｔｙ−１とＭｉ−１を相引相で含む組換え植物を特定することができる。
【００８９】
ＴｙとＭｉ遺伝子座の間での組換え率は低いので、Ｆ２世代の組換え体を見出すことはまれである。ここで述べるアッセイはまた、Ｔｙ−１及び／又はＭｉ−１対立遺伝子が同型接合又は異型接合状態で植物のゲノム内に存在するかどうかを判定するためにも使用できる。アッセイの結果に依存して、さらなる交配及び分子特定指摘が必要になりうる。例えば、育種プログラムの目標が近交系を作出することであり、及び試験する特定トマト植物についての上記アッセイの１つ以上の結果が、その植物がＭｉ−１対立遺伝子を同型接合状態でそのゲノム内に含み、Ｔｙ−１対立遺伝子を異型接合状態で含むことを明らかにする場合、その植物及びその子孫が、自殖後、Ｍｉ−１対立遺伝子とＴｙ−１対立遺伝子の両方を同型接合状態でそのゲノム内に含むと判定されるまで、前記植物をさらなる自家受精、交配及び／又はここで述べるアッセイの１つ以上を用いた分子特定指摘に供しうる。ひとたびＭｉ−１及びＴｙ−１対立遺伝子が相引相又はシス相で作出されれば、それらは共に遺伝される。多抵抗性対立遺伝子のこの遺伝ブロックは、植物育種家に、第二近交系親による野生種移入の遺伝子ひきずり作用を隠すことを可能にしつつ、新しい雑種を作出する上での柔軟性を提供する。また、Ｏｉｄｉｕｍ及びＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ抵抗性遺伝子などの他の抵抗性遺伝子との組合せも容易に可能である。
【００９０】
上記で簡単に述べたように、本発明の方法は、新しい、より優れた近交系を作出するために使用できる。これらの近交系は、ＴＹＬＣＶ及びネコブセンチュウに対して抵抗性であり、同時に他の商業的に望ましい特性を有する雑種トマト植物を作出するためのその後の育種において使用できる。そのような近交系は、速やかな育種を促進する単一共遺伝性単位としてのＴｙ−１及びＭｉ−１対立遺伝子の移入を可能にするので、育種において有用である。さらに、前記方法はまた、近交系が実際にＴｙ−１対立遺伝子及びＭｉ−１対立遺伝子を同型接合状態でそのゲノム内に含み、その同型接合性を保持していることを確認する上で有用である。ひとたびこの確認が得られれば、その近交系は、Ｔｙ−１対立遺伝子とＭｉ−１対立遺伝子を単一共遺伝単位として雑種トマト植物に移入するために第二近交系との交雑において使用できる。その第二代近交系は、遺伝子ひきずり作用を隠すための野生種対立遺伝子Ｔｙ＋及びＭｉ＋を担うことができる。
【００９１】
（本発明に従ったキット）
さらなる実施態様では、Ｍｉ及び／又はＴｙ遺伝子座の対立遺伝子組成物を判定するための分子アッセイが提供される。そのようなアッセイは、１つ以上のトマト植物からＤＮＡを抽出すること、少なくとも１つのＰＣＲプライマー対を使用してＭｉ及び／又はＴｙ遺伝子座上のＤＮＡの部分又はそれらに関連するＤＮＡの部分を増幅すること、場合により１つ以上の制限酵素で増幅産物を制限すること、及び前記ＤＮＡ断片を視覚化することを含む。
【００９２】
さらに、Ｍｉ遺伝子座及びＴｙ遺伝子座における植物又は植物組織の対立遺伝子構造を判定するための検出キットが提供される。そのようなキットは、配列番号１と２、配列番号３と４及び／又は配列番号５と６、あるいはその変異体などの、１つ以上のプライマー対を含む。さらに、指示書及び場合により植物材料又はＤＮＡ（例えば対照組織の）が含まれうる。
【００９３】
（実施例）
線虫抵抗性についての効力評価
ＦＤＲ１６−２０４５系統は米国特許第６，４１４，２２６号の対象である。この系統はＴｙ遺伝子座にＴｙ−１対立遺伝子を含む；この対立遺伝子の由来は、近代的トマトＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍの野生類縁、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからの移入であった。Ｔｙ−１対立遺伝子は、商業的に重要な病原体、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に対する抵抗性を与える。ＦＤＲ１６−２０４５系統は、この移入と共遺伝される、Ｍｉ遺伝子座近くのＭｉ−Ｊ対立遺伝子を含む。Ｍｉ−Ｊ対立遺伝子は、もう１つの商業的に重要な病原体であるネコブセンチュウに対する抵抗性を与える。交配及び病理実験において、Ｍｉ−Ｊ対立遺伝子によって与えられる抵抗性のレベルは、代替対立遺伝子、Ｍｉ遺伝子座のＭｉ−１ほどにはネコブセンチュウに対して有効でない。これは、Ｍｉ−Ｊ対立遺伝子がＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍからの「＋」型感受性対立遺伝子と対合した異型接合状態で存在するときに特に明らかである。それ故、ここで述べる一連の病理実験は、Ｍｉ−１及びＭｉ−Ｊ抵抗性対立遺伝子を使用して抵抗性レベルを定量する。
【実施例１】
【００９４】
Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａに対する抵抗性を測定するための病理試験
トマトにおけるネコブセンチュウ病の病原菌であるＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａに対する抵抗性を評価するために生病原菌アッセイを使用した。抵抗性等級は、こぶ形成の程度と大きさに基づく。表１は、ネコブセンチュウ抵抗性を判定するための等級採点システムを示す。Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａの病害症状について採点するために０から４までの尺度を使用した（表１）。
【００９５】
【表１】
【００９６】
感受性トマト系統からの植物を２ヶ月間感染させることによってＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ接種材料を作製した。この時点で、感染植物の根は病原体からの成熟卵塊を示す。接種材料の作製のために根を採取し、４から５ｃｍの断片に切断した。試験は、感染接種材料の存在下で種子を発芽させる。種子を、泥炭、バーミキュライト及び砂の土壌混合物（それぞれ４：１：１）を含む温室ベンチに播く。１つの系統からの種子を約４ｃｍずつ離して畦に播き、畦と畦の間は４．５から５ｃｍとした。接種材料のために、各々の畦の間に約１２ｃｍの間隔で小さな穴を作った。これらの穴に、作製した接種材料２又は３片を差し込み、土壌で覆った。畦の各々の側に接種材料を交互に配置することにより、各々の種子は接種材料から約６から７ｃｍの距離であった。実生を発芽させ、温室において毎日の温度範囲２２から２６℃で生育させた。播種後２８日目に各々の植物を引き抜き、根をこぶの存在について検査することによって等級付けを実施した。
【００９７】
試験は、交配系統、雑種及び対照系統に関して２回実施した。線虫抵抗性についての病理試験の結果を表２に示す。
【００９８】
【表２】
【００９９】
左側の欄が試験した系統の名称である。これらは、交配系統、雑種系統及び対照系統を含む項に分けられている。次の欄にはＭｉ及びＴｙ遺伝子座の遺伝子型を列記している。これらの遺伝子型はここで述べる分子マーカー試験によって決定した。その次の５つの欄のシリーズは、２回の別々の時点に採点した試験についての等級スコアを含む。最後の５つの欄はこれら２回の試験の結果を合計している。
【０１００】
Ｔｙ及びＭｉ遺伝子座に種々の遺伝子型を有する１４の試料が存在するので、表２の成績傾向を認識するのは難しいと考えられる。１４の試料のうち、５つの遺伝子型だけがＭｉ遺伝子座に存在する。１つの遺伝子型は、Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍからの感受性対立遺伝子について同型接合である。これを＋／＋と称する。２番目の遺伝子型は異型接合であり、感受性「＋」対立遺伝子と対合したＭｉ−Ｊ対立遺伝子を有する。３番目の遺伝子型は、同型接合状態のＭｉ−Ｊ対立遺伝子を有する。４番目と５番目の遺伝子型は、それぞれ同型接合として及び「＋」対立遺伝子との異型接合として存在する、Ｍｉ−１対立遺伝子を含む。
【０１０１】
表２のデータをＭｉ遺伝子座の遺伝子型に従って要約し、平均すると、線虫抵抗性についての種々の対立遺伝子組合せの効力が明らかになる（図３）。図３において、表２に認められる遺伝子型についての平均病害等級を示す。表２の系統をＭｉ遺伝子座の遺伝子型に従って分析した。これらの遺伝子型分類をＹ軸に示す。Ｘ軸は、これらの５つの遺伝子型分類についての平均病害等級を表わす。
【０１０２】
図３は、最初にＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍから移入したＭｉ−１対立遺伝子が線虫に対する最も強力なレベルの抵抗性を与えることを示す。また、その抵抗性は、Ｍｉ−１が異型接合（感受性「＋」対立遺伝子との）として存在するか又は同型接合として存在するかに関わりなく強力であることも明らかである。これは、遺伝子型Ｍｉ−１／Ｍｉ−１及びＭｉ−１／＋が線虫抵抗性に関して高度抵抗性の表現型を付与することを明らかにしている。この「高度抵抗性」クラスは、ここで述べる方法によって判定した、０．１未満の平均抵抗性スコアを有すると定義される。
【０１０３】
その次に最も抵抗性のクラスは、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｎｓｅから移入した、同型接合状態のＭｉ−Ｊ対立遺伝子を有する系統からである。この抵抗性のクラスは「中間抵抗性」と定義され、０．１以上であるが１．０未満の平均採点範囲内である。近交系ＦＤＲ１６−２０４５は、それ故、中間レベルの抵抗性を有すると採点される。
【０１０４】
「軽度抵抗性」と定義される３番目の抵抗性クラスは、感受性対立遺伝子「＋」と対合した、異型接合状態のＭｉ−Ｊ対立遺伝子を有する系統に例示される。このクラスは１．０以上であるが２．０未満の平均抵抗性等級を有する。近交系ＦＤＲ１６−２０４５を、雑種栽培品種を作出するための近交系親として使用する場合、及び第二の親が感受性「＋」対立遺伝子を含む場合、その雑種は軽度の抵抗性だけを示す。中間抵抗性及び軽度抵抗性クラス内のＭｉ−Ｊ対立遺伝子の成績を比較したとき、この遺伝子が半優性的に働くことは明白である。
【０１０５】
最後のクラスは感受性と定義され、Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍからの感受性対立遺伝子について同型接合又は＋／＋である系統を含む。この感受性クラスは、２以上の平均病害等級スコアを有すると定義される。
【０１０６】
これらの試験結果は、Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ（Ｍｉ−１）、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｎｓｅ（Ｍｉ−Ｊ）及びＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（「＋」）からの対立遺伝子を使用したトマト交雑において達成されうる種々の抵抗性レベルを示す。これらのデータに基づき、トマト育種家は、Ｔｙ遺伝子座の抵抗性対立遺伝子（Ｔｙ−１）を含む近交系をＭｉ遺伝子座の最良抵抗性対立遺伝子（Ｍｉ−１）を含む近交系と交雑することによって雑種栽培品種を作出することができる。この戦略には、しかしながら、２つの決定的に重要な制限がある。第一に、育種家が、６番染色体のセントロメア領域内の病害クラスターに位置づけられる他の病害抵抗性遺伝子を送達する可能性を排除する。この領域に位置することが知られている他の病害抵抗性遺伝子の例は、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ抵抗性遺伝子、レース２及びレース５、及びＯｉｄｉｕｍについての抵抗性遺伝子である。第二に、育種家は、各々が野生種に由来し、各々遺伝効力を生じることが知られている２つの領域を移入するので、これは、近代的トマト（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）からの遺伝子を使用することによる遺伝子ひきずり作用を隠す能力を制限する。
【０１０７】
ここで述べるシス相のＴｙ−１及びＭｉ−１トマト植物は、これらの制限に対抗しうる対立遺伝子の新規組合せを提供し、トマト育種家に、多数の病害抵抗性を備えた栽培品種を作出するためのより多くの選択を可能にする。
【実施例２】
【０１０８】
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に対する抵抗性を判定するためのプロトコール この実施例は、トマト植物がＴＹＬＣＶに対して抵抗性、中間抵抗性又は感受性であるかどうかを判定するためのプロトコールを述べる。
【０１０９】
Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉを通してＴＹＬＣＶの自然感染が存在する圃場において植物を生育させる。ウイルス病原体の動きは様々な政府機関によって管理されうるので（検疫病（ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ））、自然に起こる圃場感染はウイルスが地方病性である区域において抵抗性を測定する好ましい方法である。例えば、米国農務省は通常、ＴＹＬＣＶ病原体が通常は存在しない米国の大半のトマト生育領域にＴＹＬＣＶ病原体を持ち込むことを許可しない。ウイルスの伝播のために昆虫（Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ）を飼育する必要があるので、管理条件下で病害スクリーニングを実施することは厄介である。
【０１１０】
０から４の尺度を使用して（表３）ＴＹＬＣＶの病害症状について採点した：
【０１１１】
【表３】
【０１１２】
植物系統又は品種を、平均スコアが０−１であるときＴＹＬＣＶに対して抵抗性、平均スコアが約２であるとき中間抵抗性、及び平均スコアが３以上であるとき感受性と等級付ける。あるいは、当技術分野で知られているＴＹＬＣＶを判定するためのプロトコールも使用できる。「Ｔｏｍａｔｏ Ｙｅｌｌｏｗ Ｌｅａｆ Ｃｕｒｌ Ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ Ｓａｒｄｉｎｉａ ｉｓ ａ ｗｈｉｔｅｆｌｙ−ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ」；Ａ．Ｋｅｙｙｒ−Ｐｏｕｒ，Ｍ．Ｂｅｎｄａｈｍａｎｅ，Ｖ．Ｍａｔｚｅｉｔ，Ｇ．Ｐ．Ａｃｏｔｔｏ，Ｓ．Ｃｒｅｓｐｉ，Ｂ．Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ１９，ｐ．６７６３−６７６９；Ｔｏｍａｔｏ Ｙｅｌｌｏｗ Ｌｅａｆ Ｃｕｒｌ Ｖｉｒｕｓ：ａ ｗｈｉｔｅｆｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ」，Ｎ．Ｎａｖｏｔ，Ｅ．Ｐｉｃｈｅｒｓｋｙ，Ｍ．Ｚｅｉｄａｎ，Ｄ．Ｚａｍｉｒ，Ｈ．Ｃｚｏｓｎｅｋ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８５，１９９１，ｐ．１５１−１６１。
【０１１３】
（Ｍｉ及びＴｙ遺伝子座の対立遺伝子組成物を識別するための分子試験）
３つの分子マーカー試験の組合せを使用して、Ｍｉ及びＴｙ遺伝子座の遺伝子型を決定した。Ｔｙ遺伝子座では、２つの可能な対立遺伝子、Ｔｙ−１と「＋」を識別するのに１つの共優性分子マーカー試験しか必要としない。当業者は、共優性アッセイが、二対立遺伝子座の３つの対立遺伝子の可能性を識別することができる試験として定義されていることを認識する。これらの遺伝子座で、３つの遺伝子型を各々同型接合クラス及び異型接合クラスについて採点することができる。典型的に、配列決定特性指摘増幅領域（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ）又はＳＣＡＲアッセイ、増幅切断多型部位又はＣＡＰＳアッセイ、及び一塩基多型又はＳＮＰアッセイのようなマーカーアッセイはすべて典型的には共優性アッセイである。これに対し、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）及び増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）は典型的には優性マーカーであり、共優性マーカーほど多くの情報を提供しない。Ｍｉ遺伝子座では、３つの対立遺伝子（Ｍｉ−１、Ｍｉ−Ｊ及び「＋」）の間の可能な組合せを決定するためには２つの試験が必要である。いかなる意味においても限定ではないが、ここで述べるマーカーアッセイはすべてＳＣＡＲ型アッセイである。
【０１１４】
大部分の他の分子マーカー試験と同様に、実施するＳＣＡＲアッセイは、非常に小量の出発物質からＤＮＡを約１０億倍に増幅することができる、ポリメラーゼ連鎖反応又はＰＣＲを使用する。ＰＣＲの使用は当業者に周知であり、研究者は試験を実施するためにごく小量の植物試料を採取するだけでよい。１ｃｍ2未満の葉物質、好ましくは活発に生育している幼若組織がこれらの試験を実施するために必要である。これはごく小量の試料であるので、これらのマーカー試験は通常非破壊的と称される。それらは、試料の採取がいかなる意味でも植物の発育を妨げないので非破壊的とみなされる。それ故、この小量の試料はその後の多くの試験、すなわち病理試験、果実の生化学的分析、収量試験又は園芸的評価からの結果に影響を及ぼさない。非破壊的であることに加えて、ＳＣＡＲアッセイはまた、付加的な時間的利点を提供する。典型的には、対象遺伝子座の遺伝子型を２４時間以内に確認することができる。
【０１１５】
使用する３つの分子マーカー試験は各々、ゲノムＤＮＡの単離を必要とする。
【実施例３】
【０１１６】
マーカー試験のためのトマトＤＮＡの単離
いかなる意味においても限定ではなく、その後の分子マーカー試験用のトマトＤＮＡを抽出するために以下のプロトコールが使用できる。当業者は、先行技術において多くのＤＮＡ抽出プロトコールが使用可能であることを認識する。このプロトコールの中で述べるすべての化学物質は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉから入手できる。手順は次の工程を含む：
１．およそ９６穴マイクロタイタープレートフォーマットのウエルの大きさの植物部分を収集する。好ましくは、種子試料を使用するか、又は若葉から組織試料を採取する。
２．抽出緩衝液１５０μｌ（２００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；２５０ｍＭ ＮａＣｌ；２５ｍＭ ＥＤＴＡ；０．５％ＳＤＳ）を試料に加えて、組織を浸軟する。
３．１５℃、１９００×ｇで１５分間プレートを遠心分離する。
４．上清分画１００μｌを、各々のウエルに２．５Ｍ酢酸カリウム１００μｌ（ｐＨ６．５）が入った新しい９６穴プレートに移す。２００ｒｐｍで約２分間振とうして混合する。
５．１５℃、１９００×ｇで１５分間プレートを遠心分離する。
６．上清分画７５μｌを、イソプロパノール７５μｌを含む新しい９６穴プレートに移す。混合し、次に２００ｒｐｍで２分間振とうする。
７．１５℃、１９００×ｇで１５分間プレートを遠心分離する。
８．上清分画を除去し、ペレット分画に７０％エタノール２００μｌを加える。２００ｒｐｍで５分間振とうし、その後−２０℃で一晩インキュベートする。
９．１５℃、１９００×ｇで１５分間プレートを遠心分離する。
１０．上清分画を除去する。ペレットに７０％エタノール２００μｌを加え、室温で１時間放置して前記アルコールでペレットを洗浄する。
１１．１５℃、１９００×ｇで１５分間プレートを遠心分離する。
１２．上清分画を廃棄し、ペレット分画を室温で乾燥する。これを約１時間かけて実施する。
１３．ペレット分画を３７℃で１５分間、ＴＥ１００μｌ（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５μｇ／ｍｌ ＲＮＡアーゼＡ）に溶解する。ＰＣＲ工程へ進まない場合は、前記ＤＮＡを４℃又は−２０℃で保存することができる。
【実施例４】
【０１１７】
ＳＣＡＲアッセイのための一般的ＰＣＲ条件
３つのＳＣＡＲマーカーアッセイの各々は、同様のデザインと実施法を共有する。各々のアッセイは、ＰＣＲ反応においてＤＮＡ合成を開始させるために使用されるのでプライマーと称される、一対の特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む。これらのプライマーは、典型的には１５−２５ヌクレオチドの長さである；これらの長さのヌクレオチドは、増幅するマーカー遺伝子座の基質のＤＮＡ配列に対応する。これらのプライマーは、典型的には１００から１，０００塩基対のアンプリコンの合成を促進するように設計される。当業者は、ＳＣＡＲ型アッセイを創出するためにこれらのプライマーをどのようにして設計するかを認知しており、しばしばその設計を助けるために公的に入手可能なＰｒｉｍｅｒ３ソフトウエア（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のようなソフトウエアプログラムを使用する。プライマーは当技術分野で既知の方法を用いて合成するか又は多くのオリゴヌクレオチド注文製造会社から購入することができる。これらのアッセイで使用したプライマーはすべてＯｐｅｒｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡから購入した。ＰＣＲ反応における他の試薬は、多くの商業的供給業者から購入することができる；ここで述べるアッセイでは、我々は、４つのデオキシリボヌクレオチド−５’三リン酸（ｄＮＴＰ）をＰｈａｒｍａｃｉａ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩより、ＰＣＲ緩衝液及びＴａｑポリメラーゼ酵素をｔｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡより購入した。当業者は、使用できる多くの種類のＰＣＲ装置及びアッセイ条件が存在するので、ＳＣＡＲアッセイを実施するのにある程度の柔軟性があることを認識する。ｔｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡからの９７００型ＰＣＲ装置を、３つのアッセイの各々について以下の実施パラメータと共に使用した。９４℃で２分間の初期変性工程に続いて３５サイクルの増幅を実施した。各々の増幅サイクルは、９２℃、３０秒、次に５０℃、３０秒、次に７２℃、９０秒の３工程であった。３５回のサイクル後、試料を５分間７２℃に保持した。これでＰＣＲ増幅アッセイは終了するが、研究者が回収するまで最終反応物を２５℃に保持するようにＰＣＲ装置をプログラムした。
【０１１８】
当業者は、ＰＣＲアッセイ条件にはかなりの柔軟性が許容されることを認識する。ＤＮＡ鋳型１μＬ、２つのアッセイ特異的ＰＣＲプライマー各々１０ピコモル、４つのｄＮＴＰの各々について最終容量２００μＭ、１０ＸＰＣＲ緩衝液２．５μＬ、及びＴａｑポリメラーゼ１．２５単位でＰＣＲ反応物を調製した。反応物の最終容量を２５μＬにするために無菌水を使用した。
【０１１９】
各々のＳＣＡＲアッセイはまた、ＰＣＲ反応が完了した後いかにして多型を明らかにするかについても共通性を有する。各々の試験に関して、ＰＣＲ反応からのＤＮＡの増幅領域は多型制限酵素認識部位を含みうる。選択（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）対立遺伝子はこの認識部位を持つ場合と持たない場合がある。ＰＣＲ産物を特異的制限酵素で消化するとき、アンプリコンは、その制限酵素部位が存在しないために切断されないか、又は２つの断片へと非対称に消化される。遺伝子座の遺伝子型は、これらの断片をアガロースゲルで電気泳動分離し、ＤＮＡに結合する染料、臭化エチジウムでゲルを染色して、次に紫外線でＤＮＡを励起して断片を視覚化することによって決定することができる。ＰＣＲ反応からの断片の大きさは、それらを、アガロースゲルで近くのレーンに電気泳動される既知の大きさの標準品と比較することによって決定される。ＳＣＡＲアッセイのうちの２つは、多型を明らかにするために制限酵素ＴａｑＩを使用する。これらのアッセイに関しては、１０Ｘ制限酵素緩衝液３μＬ、ＴａｑＩ制限酵素０．２５μＬ及び水１．７５μＬをＰＣＲ反応後に加え、６５℃で約３時間インキュベートする。３番目のアッセイは、遺伝子型を明らかにするために制限酵素ＮｌａＩＩＩを使用する。この試験では、１０Ｘ制限酵素緩衝液３．５μＬ、ＮｌａＩＩＩ ０．２５μＬ及び水６．２５μＬをＰＣＲ反応後に加え、次に３７℃で約３時間インキュベートする。当業者は、制限酵素及び緩衝液が多くの商業的販売者によって市販されていることを認識する。本発明者らはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄｓ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡからの試薬を使用した。制限酵素による消化後、当技術分野で周知の方法に従って（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、生成物を１−２％（ｗ／ｖ）アガロースゲルでの電気泳動によって分離した。
【実施例５】
【０１２０】
Ｔｙ遺伝子座のＳＣＡＲ試験
Ｚａｍｉｒは、Ｔｙ−１遺伝子をＴＧ９７と呼ばれる制限断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカーの近くに位置決定した（（１９９４）Ｔｈｅｏｒｅｔ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８８：１４１−１４６）。ＲＦＬＰアッセイは実施がより難しく、植物に対して破壊的で、コストがかかり、実施にも時間がかかるので、「＋」対立遺伝子と抵抗性対立遺伝子Ｔｙ−１の両方を基質として使用してＲＦＬＰ遺伝子座を配列決定することにより、このＲＦＬＰをＳＣＡＲマーカーアッセイに変換した。これらの配列の比較によって多型制限部位を発見することができた。
【０１２１】
ＳＣＡＲ試験は、以下の特異的プライマー対を使用してここで述べるように実施する。
【０１２２】
配列番号１：5' TAA TCC GTC GTT ACC TCT CCT T 3'及び
配列番号２：5' CGG ATG ACT TCA ATA GCA ATG A 3'。
【０１２３】
多型は、ＰＣＲ後に制限酵素ＴａｑＩでの消化によって明らかにすることができる。Ｔｙ−１対立遺伝子が同型接合として存在する場合は、この対立遺伝子から生産されるアンプリコンはＴａｑＩ制限酵素部位を含むので、３９８塩基対のＰＣＲアンプリコンは９５と３０３塩基対の断片に消化される。「＋」対立遺伝子が同型接合として存在する場合は、３９８塩基対のＰＣＲアンプリコンはＴａｑＩ酵素によって消化されない。異型接合試料については、ＰＣＲ反応の約半分が９５と３０３塩基対の断片に消化され、ＰＣＲ反応の約半分は消化されない。電気泳動によって分離したとき、異型接合は９５、３０３及び３９８塩基対の長さの３つの断片を有する。このようにして、Ｔｙ遺伝子座の遺伝子型を迅速且つ正確に決定することができる。
【実施例６】
【０１２４】
Ｍｉ遺伝子座のＳＣＡＲ試験Ｎｏ．１（Ｍｉ−１又はＭｉ−Ｊ対立遺伝子を「＋」対立遺伝子から識別する）
Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら（Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８７：７５７−７６３（１９９４））によって公表されたデータに基づき、Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ及びＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅのポリヌクレオチド配列を、ＲＥＸ−１と称されるＭｉ近くの遺伝子座で決定した。
【０１２５】
ＳＣＡＲ試験を、以下の特異的プライマー対を使用してここで述べるように実施する。
【０１２６】
配列番号３：5' AAC CGT GGA CTT TGC TTT GAC T 3'及び
配列番号４：5' TAA GAA CAG GGA CTC AGA GGA TGA 3'。
【０１２７】
Ｔｙ遺伝子座についてここで述べるＳＣＡＲアッセイと同様に、Ｍｉ遺伝子座のＳＣＡＲアッセイＮｏ．１も多型ＴａｑＩ制限酵素認識部位を使用する。多型は、ＰＣＲ産物を制限酵素ＴａｑＩで消化することによって明らかにすることができる。Ｍｉ−１対立遺伝子又はＭｉ−Ｊ対立遺伝子が同型接合として存在する場合、又はＭｉ−１対立遺伝子とＭｉ−Ｊ対立遺伝子が異型接合として存在する場合は、これらの対立遺伝子はＴａｑＩ制限認識部位を含むので、５９５塩基対のＰＣＲアンプリコンは１４５と４５０塩基対断片に消化される。「＋」型対立遺伝子が同型接合として存在する場合は、５９５塩基対のＰＣＲアンプリコンはＴａｑＩ酵素によって消化されない。異型接合試料（Ｍｉ−１／＋又はＭｉ−Ｊ／＋）については、ＰＣＲ反応の約半分が１４５と４５０塩基対の断片に消化され、ＰＣＲ反応の約半分は消化されない。電気泳動によって分離したとき、これらの異型接合は１４５、４５０及び５９５塩基対の長さの３つの断片を有する。このようにして、抵抗性対立遺伝子（Ｍｉ−１又はＭｉ−Ｊ）が存在するかどうか、又は感受性対立遺伝子（「＋」）が存在するかどうか、又は抵抗性対立遺伝子（Ｍｉ−１又はＭｉ−Ｊ）と感受性対立遺伝子（「＋」）が異型接合として存在するかどうかを判定することができる。
【実施例７】
【０１２８】
Ｍｉ遺伝子座のＳＣＡＲ試験Ｎｏ．２（Ｍｉ−ＪをＭｉ−１又は「＋」対立遺伝子から識別する）
上記実施例５で述べたＳＣＡＲ試験はＭｉ−１対立遺伝子とＭｉ−Ｊ抵抗性対立遺伝子を識別することができないので、ＲＥＸ−１マーカーにおけるもう１つのＳＣＡＲアッセイを開発した。この試験は、このマーカー遺伝子座のＭｉ−１、Ｍｉ−Ｊ及び「＋」対立遺伝子を配列決定することによって開発された。残念ながら、３つの対立遺伝子の各々について異なる多型を有する単一ヌクレオチドは存在しなかった。一塩基多型はＮｌａＩＩＩと呼ばれる制限酵素認識部位において発見された。明細には、Ｍｉ−Ｊ対立遺伝子はこの認識部位を含んだが、Ｍｉ−１及び「＋」対立遺伝子はこの認識部位を含まなかった。
【０１２９】
この多型に基づき、第二のＳＣＡＲアッセイを開発し、これは、以下の特異的プライマー対を使用してここで述べるように実施することができる：
配列番号５：5' CTA CGG AGG ATG CAA ATA GAA
配列番号６：5' AAT CAT TAT TGT CAC ACT TCC CC。
【０１３０】
ＰＣＲ反応後、反応物をここで述べる方法により制限酵素ＮｌａＩＩＩで消化することによって多型を明らかにすることができる。Ｍｉ−Ｊ対立遺伝子が存在する場合は、２８２塩基対のアンプリコンは１２４と１５８塩基対の断片に消化される。Ｍｉ−１対立遺伝子又は「＋」対立遺伝子が存在する場合は、アンプリコンはＮｌａＩＩＩ酵素によって消化されない。異型接合（Ｍｉ−Ｊ／Ｍｉ−１又はＭｉ−Ｊ／＋）は３つの断片すべて（１２４、１５８及び２８２塩基対）を有する。Ｍｉ遺伝子座の両方のＳＣＡＲアッセイを使用して（実施例５及び６）、３つの可能な対立遺伝子（Ｍｉ−１、Ｍｉ−Ｊ又は「＋」）のどの組合せが存在するかに関わらず、Ｍｉ遺伝子座の遺伝子型を決定することができる。
【実施例８】
【０１３１】
Ｍｉ及びＴｙ遺伝子座で最も有効な対立遺伝子を組み合わせるための交雑プロトコール 各々密接に連鎖する対象固定遺伝子を含む２つの親系統から出発して、当業者は、これらの対象形質をシス相で組み合わせるという目標を達成するためにいくつかの可能な戦略があることを認識する。これらの戦略はすべて、しかしながら、Ｆ１雑種を作製するために各々対象形質を含む親系統を交雑することから始まる。好ましくは、親系統は各々、対象形質の１つについて固定されているべきである。Ｆ１雑種は自家受粉させて分離Ｆ２個体群を作出するか、又はいずれかの親系統に戻し交配することができる。交雑戦略に関わりなく、当業者は、Ｆ１植物が減数分裂の過程を通して配偶子を生産するとき対象新規組換え体が作出できることを認識する。
【０１３２】
いかなる意味においても限定ではなく、Ｍｉ及びＴｙ遺伝子をシス相で組み合わせるためにＦ２戦略を採用した。明細には、近交系交雑系統ＦＩＲ１６−１７６とＦＤＲ１６−２０４５の間の交雑を１９９７年秋にＮｉｍｅｓ，Ｆｒａｎｃｅにおいて実施した。これらの交雑系統はいずれもＳｅｍｉｎｉｓ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｓｅｅｄｓ，Ｉｎｃ．のトマト育種プログラムからである。近交系ＦＩＲ１６−１７６は、Ｔｙ遺伝子座に感受性対立遺伝子「＋」を含み、近くのＭｉ遺伝子座にＭｉ−１対立遺伝子を含む。米国特許第６，４１４，２２６号の対象である近交系ＦＤＲ１６−２０４５は、Ｔｙ遺伝子座にＴｙ−１対立遺伝子を含み、近くのＭｉ遺伝子座にＭｉ−Ｊ対立遺伝子を含む。Ｎｏ．１６５２８１７と称されるＦ１植物は、それ故、親遺伝子型を表わす、Ｔｙ及びＭｉ遺伝子座の対立遺伝子のシス対合の対を含む。これらの対合は一般に、共に下線を付しており、下線はそれらの遺伝子座が遺伝的に連鎖することを表わす。例えば、Ｆ１植物はシス対合の「＋」Ｍｉ−１及びＴｙ−１ Ｍｉ−Ｊを有する。親が減数分裂を受けたときに組換えが起こりうるはずであるが、これらの系統の各々がＭｉ及びＴｙ遺伝子座に固定されていたため有効な組換えは起こらなかった。
【０１３３】
Ｆ１植物Ｎｏ．１６５２８１７を自家受粉させたＦ２個体群を作出した。Ｆ１植物は減数分裂を通して配偶子を生産したので、それらの配偶子の大部分はもとの親からの対立遺伝子組合せ（「＋」Ｍｉ−１及びＴｙ−１ Ｍｉ−Ｊ）を保持する。Ｔｙ遺伝子座とＭｉ遺伝子座の遺伝距離が、組換え体配偶子（「＋」Ｍｉ−Ｊ及びＴｙ−１ Ｍｉ−１）が生産される相対頻度を決定する。Ｔｙ及びＭｉ遺伝子座は近接して位置し、数多くの研究者が６番染色体のこの領域では組換えが抑制されることを示しているので、当業者は、組換え型配偶子の数は親配偶子と比較して非常に低いことを予測する。
【０１３４】
その後、Ｔｙ−１及びＭｉ−１対立遺伝子をシス相で有する組換え体を特定するために、ここで述べる一連の分子試験を開発した。というのは、表現型病理学スクリーニングを通してこのシス対合を特定するには何年にもわたる多世代スクリーニングを行わなければ不可能だったからである。当業者は、このシス対合の表現型特定が可能であることを認識するが、ここで述べる分子特定法が対立遺伝子のこの有用な組合せを特定するためのより速く且つはるかに効率的な方法であることは明白である。
【０１３５】
２０００年１月に、Ｆ１雑種１６５２８１７の自家受粉に由来する５０４のＦ２種子をＤＮＡ抽出（実施例３）のために試料採取し、ここで述べる方法（実施例４及び５）を用いて各々の試料についてＴｙ遺伝子座の遺伝子型を決定した。１２７植物が感受性対立遺伝子「＋」について同型接合であり、これらの植物は廃棄した。Ｔｙ−１対立遺伝子について異型接合（Ｔｙ−１／「＋」）であるか又はＴｙ−１対立遺伝子について同型接合（Ｔｙ−１／Ｔｙ−１）である残りの３７７植物をここで述べる方法（実施例４、６、７）によって分析し、近くのＭｉ遺伝子座の遺伝子型を決定した。１個の好ましい対立遺伝子を異型接合（Ｔｙ−１又はＭｉ−１のいずれか）として含み、且つ他の好ましい対立遺伝子（Ｔｙ−１又はＭｉ−１のいずれか）が同型接合として固定されている植物を、Ｔｙ−１及びＭｉ−１対立遺伝子をシス相で有するとして選抜した。
【０１３６】
６番染色体のこの領域では組換えが抑制されることが広く文書で記録されているので、組換え体は予想されなかった。それ故、８個のそのような組換え体が発見されたことは意外であった。Ｋａｌｏｓｈｉａｎら（（１９８８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５７：３７６−３８５）は、ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ対ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍの交雑を実施したとき、ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ対ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍの交雑と比べてこの領域での組換え頻度が約８倍高いことを示した。組換え体の比較的高い回収率についてのこの可能な説明をもってしても、実施した交雑はＫａｌｏｓｈｉａｎら（同上）のｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ対ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍではなくこのゲノム領域内のｈｉｒｓｕｔｕｍとｐｅｒｕｖｉａｎｕｍのＤＮＡを含むので、前記事象はやはり予想外であった。
【０１３７】
Ｍｉ−１及びＴｙ−１遺伝子導入は、別々に遺伝子ひきずりを引き起こすことが知られている。それ故、発見された８個の組換え体の各々はおそらくユニークな組換え事象であるので、これはこれらの形質の移入に付随する遺伝子ひきずりを低下させる好機であった。多くの園芸的評価を実施し、これらの評価から、改良に向けてＮｏ．２０とＮｏ．２５１と称する２つの植物を選抜した。これらの植物はいずれもＴｙ−１対立遺伝子について異型接合（Ｔｙ−１／「＋」）であり、Ｍｉ−１対立遺伝子について同型接合であった。これらの植物はいずれも、それ故、Ｔｙ−１対立遺伝子とＭｉ対立遺伝子をシス相で含むが、この好ましいシス相の組合せは固定されていない。
【０１３８】
２０００年の春に、Ｆ２植物Ｎｏ．２０及びＮｏ．２５１を自家受粉させたＦ３個体群を作出した。これらの個体群をそれぞれ９７．５２８１．Ｍ２０及び９７．５２８１．Ｍ２５１と称した。ここで述べる方法（実施例３から７）を用いて、Ｔｙ−１及びＭｉ−１対立遺伝子を両方の事象について同型接合状態で固定した。
【０１３９】
分子試験が抵抗性表現型を正確に予測することを保証するために、植物Ｎｏ．２０及びＮｏ．２５１に由来するこれらの固定系統（９７．５２８１．Ｍ２０．Ｍ．１．１、９７．５２８１．Ｍ２５１．Ｍ．１．１、９７．５２８１．Ｍ２５１．Ｍ２．１）を、ここで述べる方法（実施例１）に従ってネコブセンチュウ抵抗性に関して試験した。表２は、ユニークシス配置のＴｙ−１及びＭｉ−１対立遺伝子を有するこれらの系統がネコブセンチュウに対して高度抵抗性であることを示している。
【０１４０】
これらの同じ系統（９７．５２８１．Ｍ２０．Ｍ．１．１、９７．５２８１．Ｍ２５１．Ｍ．１．１、９７．５２８１．Ｍ２５１．Ｍ２．１）を、ここで述べる方法（実施例２）を用いて、Ａｎｔａｌｙａ，ＴｕｒｋｅｙにおいてＴＹＬＣＶについても試験した。ユニークシス配置のＴｙ−１及びＭｉ−１対立遺伝子を有するこれらの系統はＴＹＬＣＶに対して抵抗性であった。
【０１４１】
シス相のＴｙ−１及びＭｉ−１の有効な抵抗性対立遺伝子のこの組合せは、トマト育種家が、遺伝子ひきずりを隠すため、あるいはＯｉｄｉｕｍ又はＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ又はこの病害クラスター内のまだ発見されていない抵抗性対立遺伝子についての付加的な抵抗性遺伝子を送達するための第二の近交系親を選択する自由を保持しながら、ＴＹＬＣＶに抵抗性であり、線虫に高度抵抗性であるトマト雑種を作出することを可能にする。この新規アプローチは、トマト栽培家に、専ら防除のための化学農薬に頼ることなく、あるいはトランスジェニック抵抗性戦略に基づくことなく、許容される園芸品質で、多くの病害病原体を防除する可能性を提供する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、Ｌ．）において商業的に重要な密接に連鎖する遺伝子を集積（ｐｙｒａｍｉｄｉｎｇ）させるための方法に関する。特に、本発明は、最も有効なトマト黄化葉巻ウイルス抵抗性遺伝子（Ｔｙ−１）及び最も有効なセンチュウ抵抗性遺伝子（Ｍｉ−１）を、これらの密接に連鎖する遺伝子が単一単位であるかのごとくに共遺伝されるように、相引相（シス相）で含むトマト植物を作出することに関する。
【背景技術】
【０００２】
文書で記録されている２００以上の栽培トマトの病害が存在する（Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｔｏｍａｔｏ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ．Ｂ．Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｐ．Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｅ．Ｓｔａｌｌ，Ｔ．Ａ．Ｚｉｔｔｅｒ編集（１９９７）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）。これらの病原体によって引き起こされる被害に対抗するために、栽培者は、典型的には栽培慣例及び農薬の使用を含む総合害虫管理戦略を用いる。栽培慣例の一例は、トマト植物の上方にネットを張ることであり、これは病害を運ぶ昆虫が作物に感染するのを排除するのに有効でありうる、物理的障壁を提供する。
【０００３】
数多くの調査研究が植物病害に対する有効なトランスジェニックアプローチを明らかにしているにもかかわらず、栽培者が使用できる、何らかの病原体に抵抗性のトランスジェニックトマト品種は現在のところ存在しない。さらに、特にＥＵでは、一般民衆の抵抗という問題が残されており、これが、規制承認を得るための高いコストと合わせて、この有望なテクノロジーを商業トマト栽培において使用することを事実上妨げてきた。
【０００４】
伝統的な交配アプローチを使用した近代的栽培品種への病害抵抗性遺伝子の移入は、植物病害の大部分に対抗するために使用しうる有効なテクノロジーとなってきた。その連続的な成功の故に、このアプローチはなおも学術的及び商業的トマト育種プログラムにおける第一の焦点である。
【０００５】
何百ものトマト病原体の中で、線虫及びトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）によって引き起こされる病害は商業的栽培者にとって最も重要なものに含まれる。線虫は汎発流行性であり、その分布はほとんど北極から南極にまで及ぶ。その広い分布に加えて、様々な種の線虫が、大部分の植物及び動物を含む多様な宿主範囲を有する病原体である。例えば線虫は、ヒトにおける蟯虫疾患（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓが病原体である）からトマトの根こぶ病まで多様な疾病を引き起こす。５０種以上のネコブセンチュウが存在するが、トマトに感染する３つの最も重要な種は、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ａｒｅｎａｒｉａ、Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ及びＭ．ｊａｖａｎｉｃａである。
【０００６】
ネコブ種のセンチュウは、それらの感染が植物において生じさせる根構造の種類によって命名される。感染が成功すると、線虫は植物においてその根を肥厚させるエリシターを生産し、根に１ｍｍから１０ｍｍのこぶ又はふしの形成を生じさせる。これらの変化は植物から線虫への栄養分の輸送を促進する。感染し、形態的に変化した根は、同時に植物に水と栄養分を供給する能力が低下する。植物は、この栄養分摂取についての能力低下を地上で観察できる一般的な活力低下で明示する。感染植物はまた、発育阻害、萎凋及び黄白化（クロロシス）などのより特異的な病徴を示すこともある。線虫個体群は成長期の間に形成されるので、萎凋はより著明になり、果実形成が影響を受けることもある。
【０００７】
ネコブセンチュウの化学的防除は有効であり、殺線虫剤、臭化メチルはＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ種のすべてに対して卓越した防除を提供する。農薬施用についての健康上の懸念及びオゾン枯渇に対する懸念を含む様々な理由から、臭化メチルの使用は世界中で低減されつつある。この化学的防除剤の最終的な禁止は、トマトにおける線虫病害を防除するための代替法を開発することの重要性を強調する。
【０００８】
ＴＹＬＣＶはジェミニウイルスであり、Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ属に分類される。ほとんどすべての土壌に遍在する線虫と異なり、トマト黄化葉巻ウイルスの分布は、このウイルスを伝搬する昆虫ベクターであるコナジラミ、Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉの範囲によって限定される。
【０００９】
商業的トマト生産は、より低い労働力コスト、より良好な輸送及び北米自由貿易協定や世界貿易機関協定のような条約によって、過去２５年間に世界中で温帯からより熱帯の生育領域へとシフトした。この地理的なシフトはＢ．ｔａｂａｃｉの分布と一致する。それ故、トマト生育領域が熱帯気候へ移行すると共に、ＴＹＬＣＶによって引き起こされる病害がより著明になってきた。ＴＹＬＣＶはコナジラミの摂食によって速やかにトマトへと伝搬されうる。ひとたび植物に入ると、ウイルスは複製し、植物全体に広まるが、典型的にはその師部に限定される。ＴＹＬＣＶは、植物において、巻葉及び黄化から、節間の長さの短縮と花の生育停止によって引き起こされる発育阻害までの範囲にわたる深刻な病徴を生じさせる。同時に、これは低木様の外観を有する植物を生じさせる。収穫の損害は深刻になりうる；１９９０年代初期には、ドミニカ共和国におけるトマト収穫高の約９５％が失われ、またフロリダでは１シーズンで（１９９１−１９９２年）約１億４千万ドルの損失が報告された（Ｍｏｆｆａｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８６：１８３５）。
【００１０】
コナジラミの化学的防除は有効でありうるが、商業的トマト生産における農薬の誤った使用は、２０以上の異なるトマト感染性ベゴモウイルスを媒介することができる農薬抵抗性Ｂ．ｔａｂａｃｉをもたらした（Ｍｏｒａｌｅｓ（２００１）Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ；ＰｏｌｓｔｏｎとＡｎｄｅｒｓｏｎ（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ８１：１３５８−１３６９；Ｚｅｉｄａｎら（１９９９）Ａｓｉａ Ｔｒｏｐ．Ｒｅｓ．Ｅｘｔ．１：１０７−１１５）。
【００１１】
トマトにおける線虫防除のための主要な化学的選択肢が徐々に消失しつつあるのと同様に、昆虫ベクターが農薬に抵抗性になりつつあることや農薬の使用に対する一般大衆の健康上の懸念に及ぶ理由から、ＴＹＬＣＶについての化学的防除選択肢も減少しつつある。トランスジェニック抵抗性栽培品種を生産することに付随する高い開発コストは、遺伝子工学アプローチを使用したＴＹＬＣＶ抵抗性栽培品種の開発にとっても同様に障害である。当業者は、それ故、線虫、ジェミニウイルス（ＴＹＬＣＶ）及びトマト生産における他の植物病害の防除のためのこれらの化学的防除戦略及びトランスジェニック戦略に対する代替策の必要性を認識する。天然に生じる抵抗性遺伝子の移入は、今日やはり、トマト病原体を防除するための最も有効な選択肢である。
【００１２】
抵抗性表現型の遺伝は定量的及び多遺伝子性でありうるが、植物においては、個々の単一遺伝子座によって制御される多くの優性から半優性抵抗性遺伝子を有することは一般的である。植物の抵抗性遺伝子はしばしば、特異的病原体がコードされたリガンドに結合する受容体として働くタンパク質をコードする。植物によるこの病原体特異的認識とその後の応答は、１９４０年代後期にＦｌｏｒによって最初に記述された現象であり、「遺伝子対遺伝子」抵抗性と称される（Ｆｌｏｒ（１９７１）Ａｎｎ．Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ９：２７５−２９６）によって総説された）。この特異的受容体−リガンド複合体は、最終的に抵抗性表現型をもたらすシグナル伝達経路の引き金となる（Ｂａｋｅｒら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：７２６−７３３；Ｓｔａｓｋａｗｉｃｚら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：６６１−６６７）。この病原体攻撃の認識に対応して、宿主は、細胞壁の強化、酸化バースト、防御遺伝子発現の誘導、及び時として、過敏性反応と呼ばれる感染部位での迅速な細胞死によって応答しうる。
【００１３】
ほとんどの育種目的のために、商業的育種家は、しばしば「栽培型」と称される生殖質を取り扱う。この生殖質は、園芸成績について評価したとき一般に良好に機能するので、育種がより容易である。栽培型の性能優位型は、しばしば対立遺伝子の多様性の欠如によって相殺される。これは、育種家が栽培生殖質を扱うときに受け入れる交換取引である−よりよい全体成績であるが対立遺伝子多様性の欠如。遺伝的に多様なソースで育種するときよりも栽培材料で作業するときのほうが進行が速いので、育種家は一般にこの交換取引を受け入れる。
【００１４】
これに対し、育種家が広い種内交配又は種間交配のいずれかを行うときは、逆の交換取引が起こる。これらの例では、育種家は、典型的には栽培生殖質を非栽培型と交配する。そのような交配において、育種家は非栽培型からの新規対立遺伝子へのアクセスを獲得することができるが、供与交配親に関連する遺伝子ひきずりを克服しなければならない。この育種戦略に関する難しさに加えて、このアプローチは受胎能又は生殖能の問題のためにしばしば失敗に終わる。
【００１５】
Ｌ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ、Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ、Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ、Ｌ．ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ、Ｌ．ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ、Ｌ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉｉ、Ｌ．ｃｅｒａｓｉｆｏｒｍｅ及びＬ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍを含む栽培トマトと交配することができる多くの野生類縁が存在する。野生種と栽培Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍの間の遺伝距離は、種間交配を行うこと及び付加形質を有する新しい商業的栽培品種を成功裏に作出することの両方の難しさと相関する（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｂｒｅｅｄｉｎｇ．ＭＡ ＳｔｅｖｅｎｓとＣＭ Ｒｉｃｋ．Ｔｈｅ ｔｏｍａｔｏ ｃｒｏｐ：Ａ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔより。ＪＧ ＡｔｈｅｒｔｏｎとＪ Ｒｕｄｉｃｈ編集。Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ（１９９４）Ｌｏｎｄｏｎ）。例えば、Ｌ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ、Ｌ．ｃｅｒａｓｉｆｏｒｍｅ、Ｌ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉｉ、Ｌ．ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ及びＬ．ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍのような種は、近代的トマトへの遺伝子移入のための供与体として使用するのに最も容易な野生種である。これに対し、Ｌ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ、Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ及びＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍは近代的トマトへの形質移入がはるかに難しい種である（同上）。これらのより遠い類縁種を使用するときは、初期世代交雑のために橋渡し種及び胚救済を使用しなければならないこともまれでない。これらの余分な工程を実施しても、重大な分離異常、受胎能の問題、低い組換え及び遺伝子ひきずりに直面することがある。後期世代でも、ゲノムの移入領域内での組換えの抑制が、良好な商業的栽培品種を作出するのに十分な程度まで遺伝子ひきずりを低下させる上で主要な障害となる。
【００１６】
それ故、野生種において有用な形質を特定し、栽培種への移入のためにその形質を標的しうるが、成功するという保証はない。ほとんどの成功を収めた商業的トマト育種家も、その経歴全体を通じて、商業的栽培品種を作出するための野生種からの遺伝子移入を完全に成功させてはいない。成功への障壁は、遺伝子移入が困難であるか又は不可能な場合がある野生ゲノムの領域を生じうる、分離異常を含む。さらに、近代的トマトの野生種の一部は、自家受粉することができないことを意味する、自家不和合性である。自家不和合性の結果として、これらの植物は極めて異質性であり、多くの座に異なる対立遺伝子を有する。これらの野生種の高度な異質性はまた、対象とする最も有効な遺伝子の移入を妨げることがある。
【００１７】
栽培化された作物の野生類縁から新規対立遺伝子を移入することに関する難しさは多くの作物に及び、トマトでは線虫抵抗性の遺伝子移入に例示される。Ｂａｉｌｅｙ（（１９４１）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．３８：５７３−５７５）は、初めて、野生種Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍを線虫抵抗性のための潜在的ソースとして特定した。Ｓｍｉｔｈ（（１９４４）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．４４：４１３−４１６）は、その後、線虫抵抗性形質を含む種間雑種を成功裏に回収するために胚救済法を使用した。ＧｉｌｂｅｒｔとＭｃＧｕｉｒｅ（（１９５５）はこの遺伝子座Ｍｉを作出し、その後Ｍｉを６番染色体に位置決定した（Ｇｌｉｂｅｒｔ（１９５８）Ｔｏｍａｔｏ Ｇｅｎｅｔ．Ｃｏｏｐ．Ｒｅｐ．８：１５−１７）。Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍに由来するＭｉ遺伝子座の抵抗性対立遺伝子はＭｉ−１対立遺伝子と呼ばれる。Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍからの感受性対立遺伝子は野生型対立遺伝子と称され、「＋」で表わされる。Ｍｉ−１抵抗性対立遺伝子を含むすべての商業的トマト栽培品種はＳｍｉｔｈによって作出された種間雑種に由来すると考えられる。同型接合Ｍｉ−１系統は１９４９年に早くも開発されたが（ＦｒａｚｉｅｒとＤｅｎｎｅｔｔ（１９４９）、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．５４：２２５−２３６）、Ｍｉ−１対立遺伝子が商業的栽培品種において一般的に使用され始めたのは１９７０年代半ばからであった。２つの開発がこの商業上の実現を導いた。第一に、ＲｉｃｋとＦｏｂｅｓがアルカリホスファターゼ（Ａｐｓ）と呼ばれるアイソザイムマーカーとＭｉ遺伝子座の間の連鎖を報告した（（１９７４）Ｔｏｍａｔｏ Ｇｅｎｅｔ．Ｃｏｏｐ．Ｒｅｐ．２４：２５）。分子マーカー試験の早期使用により、育種家は病理試験を実施せずに形質を追跡することが可能になった。第二に、雑種トマト栽培品種が商業的栽培家によってより広く受け入れられようになった。６０年間にわたるＭｉ−１対立遺伝子に関する育種にもかかわらず、ストレス条件下での局所的な壊死応答（Ｈｏら（１９９２）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，２：９７１）、より小さな果実及びより少ない結実を含む、Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍからのＭｉ−１移入に関連する重大な遺伝子ひきずりが現在も存在する。
【００１８】
育種家は、Ｍｉ−１対立遺伝子が異型接合体として存在するときに有効であり、線虫抵抗性形質を１つの親だけから雑種に送達することを可能にすることを認めた。これは次に、育種家が、６番染色体のこの領域内にｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ遺伝子を有する第二の近交系親を使用することによって遺伝子ひきずりの大部分を克服することを可能にした。雑種栽培品種の作出はこの育種戦略の実施を可能にした。優性Ｍｉ−１対立遺伝子を近交系親の一方に交配し、遺伝子ひきずりの大部分を隠すことを可能にする周辺のｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ対立遺伝子と共に感受性対立遺伝子（「＋」）を第二の近交系親に交配した。異型接合状態で遺伝子ひきずりを不顕化できたことは、それぞれストレス条件下での局所的な壊死応答、より小さな果実サイズ及びより少ない結実を不顕化する能力の故に、植物の全般的健康状態、果実の大きさ及び果実の収量に影響を及ぼす遺伝子がゲノムのこの領域内に存在することの間接的証拠を提供する。
【００１９】
植物抵抗性遺伝子はゲノム内でクラスターを形成することが示されており、トマトでは、一般にセントロメアの近くで認められる。Ｍｉ遺伝子座は、６番染色体上のセントロメアに近い、これらの病害抵抗性クラスターの１つに位置する。Ｍｉ抵抗性遺伝子座を有することに加えて、ジェミニウイルスについての他の抵抗性遺伝子、Ｏｉｄｉｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（ｖａｎ ｄｅ Ｂｅｅｋら（１９９４）Ｔｈｅｏｒｅｔ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８９：４６７−４７３）及びＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍレース２及び５についての２つの抵抗性遺伝子（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．（１９９３）６：３４１−３４７）は、６番染色体のこのセントロメア領域においてすべて遺伝的に密接に連鎖する。
【００２０】
何十年を経た後も、Ｍｉ−１遺伝子移入の困難さは、その形質に関連する遺伝子ひきずりを低減することができなかった。この困難さについての代替的な説明は、Ｍｉ−１抵抗性遺伝子が多面発現性であり、直接遺伝子ひきずりに寄与すること、あるいは遺伝子ひきずり低下の前進を制限する、このゲノム領域内における組換えの抑制が存在することである。様々な実験アプローチがこの問題を取り上げてきた。遺伝学と細胞遺伝学の組合せを使用して、Ｚｈｏｎｇら（（１９９９）Ｔｈｅｏｒｅｔ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９８：３６５−３７０）は、トマトのゲノムサイズを基礎として、〜１ｃＭの遺伝距離の遺伝学的評価に基づき、Ｍｉ遺伝子座とＡｐｓ遺伝子座の間の物理的距離は約７５０，０００塩基対であるはずであることを示した。それらの蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の結果は、しかしながら、この物理的距離が実際には４０，０００，０００塩基対であることを明らかにした。これらの遺伝子座の間の遺伝距離と物理的距離の相違から、Ｚｈｏｎｇらは、Ｍｉ遺伝子座付近での組換えがこのゲノムについての平均と比較して約５０倍低いと予測した。Ｋａｌｏｓｈｉａｎら（（１９９８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５７：３７６−３８５）は、比較遺伝学アプローチを採用して、Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ × Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍの交配はＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ × Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ由来の個体群と比較してこの領域内での組換えが８倍高いことを示した。これらの実験に加えて、セントロメア領域では一般に組換えが抑制されることは周知である。Ｍｉｌｌｉｇａｎら（１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １０：１３０７−１３２０）は、クローン化したＭｉ抵抗性遺伝子を感受性栽培品種、Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒに導入するためにトランスジェニック相補性を利用した。これらの相補性試験で多面発現効果が認められなかったことは、Ｍｉ移入に関連する園芸上の欠陥が遺伝子ひきずりによるものであることを強く示唆する。これらの試験は、６番染色体のこの領域内に病害抵抗性遺伝子を移入することに伴う困難さへの洞察を提供した。
【００２１】
１９９８年に、Ｋａｌｏｓｈｉａｎらは、ＡｐｓアイソザイムマーカーよりもＭｉ遺伝子座により近い、ＲＥＸ−１と呼ばれる共優性のＰＣＲに基づく分子マーカーを記述した（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５７：３７６−３８５）。このＤＮＡに基づくマーカーは速やかにトマト育種プログラムに採用され、新しい線虫抵抗性雑種栽培品種の開発を大きく促進した。
【００２２】
トマト育種業界は学術公表文献を通してＭｉ−１線虫抵抗性対立遺伝子の移入におけるその進歩を速やかに開示したが、この難しい育種アプローチの成功の可能性が低いことは、この分野におけるいくつかの特許（米国特許第６，４１４，２２６号、同第６，０９６，９４４号、同第５，８６６，７６４号及び同第６，６３９，１３２号）の発行の際に米国特許商標庁によって認識された。
【００２３】
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に対する抵抗性についてはほぼ４０年間にわたって報告されてきた。Ｃｏｈｅｎは、１９６４年に早くもいくつかの耐性遺伝子型を報告し（ＣｏｈｅｎとＨａｒｐａｚ（１９６４）Ｅｎｔｏｍｏｌ．Ｅｘｐ．Ａｐｐｌ．７：１５５−１６６）、その後、Ｌ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｒｉｕｍ及びＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍがより高いレベルのＴＹＬＣＶ抵抗性を含むと特定した（ＣｏｈｅｎとＮｉｔｚａｎｙ（１９６６）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ５６：１１２７−１１３１）。１９９０年代に、ＰｉｌｏｗｓｋｉとＣｏｈｅｎは、５個の劣性遺伝子と共にＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ（ＰＩ１２６９３５）からの耐性を報告した（Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ７４：２４８−２５０）。Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎらは、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅにおけるＴＹＬＣＶ抵抗性を発見し（（１９９４）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ８４：９２８−９３３）、その後Ｈｏｏｇｓｔｒａｔｅｎ（米国特許第６，４１４，２２６号）は独立してＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅにおけるＴＹＬＣＶ抵抗性を確認した。この抵抗性遺伝子座はＴｙ遺伝子座と称され、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからの抵抗性対立遺伝子はＴｙ−１と命名された。
【００２４】
Ｍｉ遺伝子座と同様に、Ｔｙ遺伝子座の感受性対立遺伝子は野生型又は「＋」と称される。ＺａｍｉｒらはＴｙ遺伝子座を６番染色体のセントロメア領域に位置づけた（（１９９４）Ｔｈｅｏｒｅｔ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８８：１４１−１４６）。Ｔｙ−１対立遺伝子は優性対立遺伝子として働き、それ故Ｔｙ−１対立遺伝子に固定された系統又は異型接合（Ｔｙ−１／「＋」）の両方がＴＹＬＣＶに抵抗性である。
【００２５】
Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからのＴｙ−１抵抗性遺伝子を含む近交系トマト系統ＦＤＲ１６−２０４５も、Ｍｉ遺伝子座付近に移入されたＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからの抵抗性遺伝子の故に線虫に対する抵抗性を付与する（Ｈｏｏｇｓｔｒａｔｅｎ、米国特許第６，４１４，２２６号）。線虫及びジェミニウイルスについてのこれら２つの抵抗性遺伝子がＦＤＲ１６−２０４５系統において共遺伝されることは、Ｔｙ遺伝子座とＭｉ遺伝子座が遺伝的に近接して位置することを明らかにする。Ｍｉ遺伝子座の線虫抵抗性対立遺伝子は、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからＦＤＲ１６−２０４５系統に移入されたとき、Ｍｉ−Ｊと称される。ＦＤＲ１６−２０４５系統は、育種家が、Ｍｉ及びＴｙ遺伝子座に「＋」型対立遺伝子を有する第二の近交系交配親を使用することにより、遺伝子ひきずりの大部分を隠す能力を備えた、線虫及びジェミニウイルスについての有効な抵抗性対立遺伝子を含む商業的雑種を作出することを可能にするので、貴重な交配近交系である。この移入からの遺伝子ひきずりは、ストレス条件下での自己壊死、より長い節間、より小さな果実サイズ及びより少ない結実として発現されうる。
【００２６】
しかし、病理試験を通して、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからのＭｉ−Ｊ対立遺伝子はＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍからのＭｉ−１対立遺伝子ほど有効ではないことが認められた。これは、Ｍｉ−Ｊ対立遺伝子をＦ１雑種においてＭｉ遺伝子座の「＋」感受性対立遺伝子と対合させたとき特に明らかである。分子学的手法を使用して、発明者はＭｉ遺伝子座の３つの可能な対立遺伝子（Ｍｉ−１、Ｍｉ−Ｊ及び「＋」）を識別するための分子マーカー試験を設計することができた。
【００２７】
トマト育種家は、それ故、これらの移入に付随する遺伝子ひきずりを隠す能力を保持しながら、６番染色体のセントロメア領域に位置づけられる多数の抵抗性遺伝子を送達することの限界に直面する。雑種栽培品種の６番染色体のこの領域に位置づけられるすべての既知の抵抗性遺伝子を集積させるために、育種家は、線虫抵抗性遺伝子Ｍｉ−１を含むＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍからの移入を有するものを一方の交配親とし、ＴＹＬＣＶ抵抗性遺伝子Ｔｙ−１を含むＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからの移入を有するもの、Ｏｉｄｉｕｍについての抵抗性遺伝子を含むＬ．ｈｉｒｓｕｔｕｍからの移入を有するもの、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍのレースについての抵抗性遺伝子を含むＬ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍからの移入を含むもの、及びさらにこれらの移入の一部に関連する遺伝子ひきずりを隠すためのｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍからの「＋」型対立遺伝子を含むものをもう一方の親としなければならない。雑種栽培品種を作製するためには２つの親系統しか選ぶことができないので、この作業は育種家にとって不可能である。このジレンマはまた、Ｈｏら（（１９９２）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ２：９７１−９８２、図６参照）によって及びＬｉｈａｒｓｋａら（（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ ３９：４８５−４９１、図１参照）によって図式的に示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
それ故、最初にＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅから移入されたＴＹＬＣＶ抵抗性について最も有効な対立遺伝子、Ｔｙ−１と共に、最初にＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍから移入された線虫抵抗性について最も有効な対立遺伝子、Ｍｉ−１を含む、組換えが強く抑制されることが知られているゲノムのこの領域内での組換え事象を特定する必要性が現在も存在する。このように近位の密接に連鎖する対立遺伝子は、相引相又はシス相であると称される。シス相の有効な抵抗性対立遺伝子のそのような組合せは、トマト育種家が、遺伝子ひきずりを隠すため、又はＯｉｄｉｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍあるいはこの病害クラスター内のまだ発見されていない抵抗性対立遺伝子などの付加的な抵抗性遺伝子を送達するために第二の近交系親を選択する自由を保持しながら、ＴＹＬＣＶ及び線虫に対して最も有効な抵抗性を有するトマト雑種を作出することを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明により、そのゲノム内に少なくとも１個のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）抵抗性対立遺伝子及び少なくとも１個のネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を含み、前記抵抗性対立遺伝子が１つの染色体上の異なる座に相引相で存在すること、及びその植物がＴＹＬＣＶに対して抵抗性であり、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ａｒｅｎａｒｉａ、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ及びＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａから成る群より選択される少なくとも１つのネコブセンチュウ種に対して高度に抵抗性であることを特徴とする、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物が提供される。
【００３０】
また、そのゲノム内に少なくとも１個のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）抵抗性対立遺伝子及び少なくとも１個のネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を含み、前記抵抗性対立遺伝子が１つの染色体上の異なる座に相引相で存在すること、及びその植物が、ＴＹＬＣＶ及びＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ａｒｅｎａｒｉａ、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ及びＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａから選択される少なくとも１つのネコブセンチュウ種の両方に対して抵抗性であって、前記ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子がＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからのＭｉ−Ｊ対立遺伝子ではないことを特徴とする、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物が提供される。
【００３１】
１つの好ましい実施態様では、約１．０未満のネコブセンチュウ抵抗性スコアを有する本発明の植物が提供され、さらなる好ましい実施態様では、約０．５未満のネコブセンチュウ抵抗性スコア、より好ましくは約０．２５未満、さらに一層好ましくは約０．０５未満のネコブセンチュウ抵抗性スコアが提供される。１つの実施態様では、前記植物は雑種植物である。
【００３２】
１つの好ましい実施態様では、ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子はＴｙ−１と称される対立遺伝子である。もう１つの好ましい実施態様では、ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子はＭｉ−１と称される対立遺伝子である。さらなる好ましい実施態様では、ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及びネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子は、それぞれＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｃｈｉｌｅｎｓｅ及びＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍからである。
【００３３】
好ましくは、ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及びネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子は非トランスジェニックである。
【００３４】
本発明のもう１つの局面では、そのようなＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物の果実又は種子が提供される。
【００３５】
本発明は、近交系商業的Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物を提供しうる、あるいは本発明に従った植物はもう１つ別のＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物との交配における親として使用しうる。本発明は、それ故、本発明の植物を、ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子を持たず、且つネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を持たない近交系植物と交雑する方法によって生産される雑種Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物を提供する。
【００３６】
本発明のこの局面の好ましい実施態様では、ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及びネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子の両方が異型接合である雑種Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物が提供される。良好な園芸特性を有するそのような雑種植物がより好ましく、またＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及びネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を与える野生トマト種の遺伝子移入に通常付随する遺伝子ひきずりが大きく低下した雑種植物がさらに一層好ましい。
【００３７】
好ましくは、前記雑種植物は、野生種Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｃｈｉｌｅｎｓｅに関連するもののような大きく低下した遺伝子ひきずり作用、及び野生種Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍに関連するもののような大きく低下した遺伝子ひきずり作用を示す。より好ましくは、前記雑種植物は、自己壊死、より長い節間、より小さな果実、より少ない結実及び園芸的に劣る植物構造から成る病徴群より選択される遺伝子ひきずり病徴が大きく低下している。
【００３８】
前記ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及び前記ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子の遺伝子座は、前記染色体上の同じ病害抵抗性クラスター内で生じる。それ故、本発明のさらに一層好ましい実施態様では、前記クラスター内の少なくとも１個の付加的な病害抵抗性対立遺伝子が、Ｔｙ−１ ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及びＭｉ−１ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子に対して相反相又はトランス相で提供される。本発明のこの局面の１つの代替的実施態様では、前記付加的病害抵抗性対立遺伝子は、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍレース２、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍレース５及びＯｉｄｉｕｍから成る群より選択される病害に対する抵抗性を付与する。
【００３９】
本発明の様々な実施態様の例を、以下の図面を参照しながら詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、Ｔｙ＋（配列番号１１）及びＴｙ−１（配列番号１０）対立遺伝子近くのマーカー遺伝子座のポリヌクレオチド配列の比較、及び斜線の箱で表わした、前記ポリヌクレオチド配列の間での１９個の一塩基多型の特定を示す。円は、Ｔｙ−１配列内の塩基対９７−９８及びＴｙ＋配列内の塩基対９６−９７における２個の隣接多型を特定し、Ｔｙ−１対立遺伝子においてのみＴａｑＩ制限酵素認識部位が生じる。
【図２】図２は、Ｍｉ＋、Ｍｉ−１及びＭｉ−Ｊ対立遺伝子近くのマーカー遺伝子座のポリヌクレオチド配列の比較、及び斜線の箱で表わした、前記ポリヌクレオチド配列の間での２０個の一塩基多型の特定を示す。円は、塩基対６０３及び７５４における多型を特定する。
【図３】図３は、Ｍｉ遺伝子座における様々な対立遺伝子の組合せを含む、５つの植物遺伝子型の平均線虫抵抗性等級を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は、組換え事象から生産され、最初にＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅから移入されたＴｙ−１とシス相で、最初にＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍから移入されたＭｉ−１を含むトマト植物（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）を提供する。
【００４２】
（定義）
植物学用語：リンネは植物分類の父とみなされている。彼は初めて近代的なトマトをＳｏｌａｎｕｍ（ナス属）として分類したが、その学名は長年にわたってＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍであった。同様に、Ｌ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ、Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ、Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ、Ｌ．ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ、Ｌ．ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ、Ｌ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉｉ、Ｌ．ｃｅｒａｓｉｆｏｒｍｅ及びＬ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍのような近代的トマトの野生類縁はＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ属の中に分類された。過去数年にわたって、これらの種の名称を再分類すべきかどうかについてトマト研究者と植物学者の間で論争が為されてきた。近代的トマトについての新たに提案された学名は、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍである。同様に、野生種の名前も変更される可能性がある。Ｌ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉはＳｏｌａｎｕｍ ｐｅｎｎｅｌｌｉｉに、Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍはＳ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓになる可能性があり、Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍは、Ｓ．「Ｎ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ」とＳ．「Ｃａｌｌｅｊｏｎ ｄｅ Ｈｕａｙｌｅｓ」、Ｓ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ及びＳ．ｃｏｒｎｅｌｉｏｍｕｅｌｌｅｒｉに分けられ、Ｌ．ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍはＳ．ｎｅｏｒｉｃｋｉｉに、Ｌ．ｃｈｍｉｅｉｌｅｗｓｋｉｉはＳ．ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉに、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅはＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅに、Ｌ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅはＳ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ又はＳ．ｇａｌａｐａｇｅｎｓｅに、及びＬ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍはＳ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍになるかもしれない（Ｓｏｌａｎａｃｅａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ（２００５）ＳｐｏｏｎｅｒとＫｎａｐｐ； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｇｎ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ｈｅｌｐ／ａｂｏｕｔ／ｓｏｌａｎｕｍ＿ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．ｈｔｍｌ）。
【００４３】
このように、明瞭化のためにトマト及びその類縁についての名称が変更になるかもしれないが、近代的トマト及びその野生類縁は、すべてＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ属に含まれる既存の名称を使用して定義する。
【００４４】
線虫：ネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ種）は土壌中に一般的に存在し、大部分は広い宿主範囲を有していて、多くの一年生及び多年生作物で問題を引き起こす。トマトは最も深刻な影響を受けるものの１つであり、線虫はすべてのトマト生育地域で問題を生じさせる。ネコブセンチュウは特定が困難であり、５０種以上が特定されているが、少数の種（例えばＭ．ｊａｖａｎｉｃａ、Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ及びＭ．ａｒｅｎａｒｉａ）がトマト栽培者にとっての問題の大部分を引き起こす。
【００４５】
ここで使用するとき、「対立遺伝子」の語は、特定の座の遺伝子の１つ以上の選択的形態のいずれかを意味し、それらの対立遺伝子はすべて特定遺伝子座の１つの形質又は特徴に関する。生物の二倍体細胞では、所与の遺伝子の対立遺伝子は１つの染色体上の特定の位置又は座に位置する。相同染色体の対の各々の染色体上に１個の対立遺伝子が存在する。二倍体植物種は、特定遺伝子座に多数の異なる対立遺伝子を含みうる。
【００４６】
ここで使用するとき、「（遺伝子）座」の語は、例えば遺伝子又は遺伝マーカーが認められる染色体上の特定の場所又は部位を意味する。「Ｍｉ遺伝子座」は、ここでは１個以上の対立遺伝子が位置し、植物又は植物組織が有するネコブセンチュウ抵抗性の程度を決定する、トマトゲノム内の位置を指す。「Ｔｙ遺伝子座」の語は、ここでは１個以上の対立遺伝子が位置し、植物又は植物組織が有するＴＹＬＣＶ抵抗性の程度を決定する、トマトゲノム内の位置を指す。
【００４７】
ここで使用するとき、「相引相」及び「シス相」の語は、２つの異なる座の対立遺伝子が１つの（相同）染色体上で互いに連鎖して起こる遺伝的状態を指す。例えば、対立遺伝子Ｔｙ−１とＭｉ−１が１つの相同染色体上に位置するとき、これらの対立遺伝子は「相引相」である。これに対し、対立遺伝子Ｔｙ−１とＭｉ−１が１つの相同対の異なる相同染色体上に位置するとき、それらは「相反相」又は「トランス相」であるという。
【００４８】
「組換え」又は「組換え事象」は、ここでは交叉及び相同染色体の独立した組合せの結果として生じる新しい遺伝子構造を有する植物を指す。
【００４９】
「ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子」は、ゲノム内に存在するとき、トマト黄化葉巻ウイルス感染及び／又は被害に対する「抵抗性」又は「中間抵抗性」を付与する対立遺伝子を指す。１又は複数の植物が、「ＴＹＬＣＶ抵抗性アッセイ」（以下参照）を使用して０−１の間あるいは０又は１に等しい平均病害スコアを有するとき、その１又は複数の植物はＴＹＬＣＶに対して「抵抗性」であるという。１又は複数の植物が、ＴＹＬＣＶ抵抗性アッセイを使用して約２の平均病害スコアを有するとき、その１又は複数の植物は「中間」ＴＹＬＣＶ抵抗性を有するという。約３以上の平均病害スコアを有する植物は感受性であるという。
【００５０】
「ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子」は、ゲノム内に存在するとき、Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ、Ｍ．ｊａｖａｎｉｃａ及びＭ．ａｒｅｎａｒｉａから選択される少なくとも１つ又はそれ以上の線虫種に対する抵抗性を付与する対立遺伝子を指す。１又は複数の植物が、「ネコブセンチュウ抵抗性アッセイ」（以下参照）を使用して約０．１未満の平均病害スコアを有するとき、その１又は複数の植物はこれらのネコブセンチュウ種の少なくとも１つに対して「高度抵抗性」であるという。例えばＭｉ−１／Ｍｉ−１植物及びＭｉ−１／＋植物は高度抵抗性である。１又は複数の植物が、約０．１以上であるが１．０未満の平均病害スコアを有するとき、その１又は複数の植物は「中間抵抗性」を有するという（例えば対立遺伝子ＭｉＪ／ＭｉＪを有する植物）。１．０以上であるが２．０未満の平均病害スコアを有する植物は「軽度抵抗性」を有するといい（例えば対立遺伝子ＭｉＪ／＋を有する植物）、２．０以上の平均病害スコアを有する植物は感受性であるという（例えば対立遺伝子＋／＋を有する植物）。
【００５１】
「ＴＹＬＣＶ抵抗性アッセイ」は、複数の植物を自然のＴＹＬＣＶ感染が起こる圃場において生育させ、実施例においてさらに説明するように、０−４の尺度を用いて感染後の１つ以上の時点で病害症状を評価し、及びＴｙ遺伝子座に特定対立遺伝子組成物（遺伝子型）を有する複数の植物について平均病害等級を決定することを指す。
【００５２】
「線虫抵抗性アッセイ」は、複数の植物を、Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ、Ｍ．ｊａｖａｎｉｃａ又はＭ．ａｒｅｎａｒｉａ接種材料を接種した土壌において生育させ、実施例においてさらに説明するように、約２８日後に０−４の等級で根こぶを評価し、及びＭｉ遺伝子座に特定対立遺伝子組成物（遺伝子型）を有する複数の植物について平均病害等級を決定することを指す。
【００５３】
ここで使用するとき、「異型接合」の語は、２個の異なる対立遺伝子が１つの特定遺伝子座にあるが、二倍体生物の細胞における相同染色体の対応する対上に個別に位置するときに存在する遺伝的状態を意味する（例えばＭｉ−１／＋）。逆に、ここで使用するとき、「同型接合」は、２個の同一対立遺伝子が１つの特定遺伝子座にあるが、二倍体生物の細胞における相同染色体の対応する対上に個別に位置するときに存在する遺伝的状態を意味する（例えばＭｉ−１／Ｍｉ−１）。
【００５４】
ここで使用するとき、「植物」の語は、植物全体、あるいは植物細胞、植物プロトプラスト、そこからトマト植物が再生することができる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物細胞クランプ及び植物中の無傷の植物細胞などの、その何らかの部分又は誘導体、あるいは胚、花粉、卵、果実（例えば収穫されたトマト）、花、葉、種子、根、根端等のような植物の部分を包含する。
【００５５】
「分子アッセイ」（又は試験）は、Ｍｉ又はＴｙ遺伝子座における特定対立遺伝子の存在又は不在を（直接又は間接的に）指示する（ＤＮＡに基づく）アッセイを指す。加えて、分子アッセイは、特定対立遺伝子が個々の植物においてＴｙ又はＭｉ遺伝子座で同型接合であるか又は異型接合であるかを決定することを可能にする。例えば、１つの実施態様では、Ｍｉ又はＴｙ遺伝子座に関係する核酸をＰＣＲプライマーを用いて増幅し、その増幅産物を酵素で消化して、前記増幅産物の電気泳動分離パターンに基づき、個々の植物中にＭｉ又はＴｙ対立遺伝子が存在するかどうか及びＭｉ又はＴｙ遺伝子座の対立遺伝子の接合生殖性（すなわち各々の座の遺伝子型）を決定することができる。例は、ＳＣＡＲ、ＣＡＰＳ及び同様のアッセイである。
【００５６】
ここで使用するとき、「品種」又は「栽培品種」の語は、所与の遺伝子型又は遺伝子型の組合せから生じる特徴の発現によって定義できる、最も低い既知等級の単一植物分類群内の植物グループを意味する。
【００５７】
ここで使用するとき、「野生型」の語は、Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ内で認められる天然に生じる対立遺伝子を意味する。線虫抵抗性遺伝子座Ｍｉ及びＴＹＬＣＶ遺伝子座Ｔｙで、Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍからのこれらの野生型対立遺伝子はこれらの病原体に対する感受性を与え、ここではＭｉ＋及びＴｙ＋、又は単に「＋」と称される。
【００５８】
ここで使用するとき、「変異体」又は「多型変異体」の語は、所与の核酸配列に本質的に類似する核酸配列を指す。例えば、「その変異体」又は「配列番号１から１１のいずれかの変異体」の語は、そのポリヌクレオチド配列から１個以上（例えば２個、３個、４個、５個又はそれ以上）のヌクレオチドが欠失している（欠失変異体）又は１個以上のヌクレオチドが他のヌクレオチドで置換されている（置換変異体）又は１個以上のヌクレオチドが前記ポリヌクレオチド配列に挿入されている（挿入変異体）、ポリヌクレオチド配列を指す。
【００５９】
配列番号１から１１の変異体は、配列番号１から１１のいずれかに「本質的に類似」するヌクレオチド配列を含む。配列番号１から１１に本質的に類似する配列は、例えばデフォルトパラメータを用いるＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムと共に、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムを使用して最適に整列したとき、配列番号１から１１の１つ以上の配列に少なくとも約９０％、より好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％又はそれ以上の核酸配列同一性を有する核酸配列である。ＧＡＰデフォルトパラメータは、ギャップ生成ペナルティー＝５０（ヌクレオチド）及びギャップ伸長ペナルティー＝３（ヌクレオチド）である。ヌクレオチドについては、使用するデフォルト評価マトリックスはｎｗｓｇａｐｄｎａ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２、ＰＮＡＳ ８９：９１５−９１９）である。配列アラインメント及びパーセンテージ配列同一性についてのスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．，９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ９２１２１−３７５２，ＵＳＡから入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３又はＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）についてのオープンソースソフトウエア（現在のバージョン２．７．１−０７）などのコンピュータプログラムを使用して決定しうる。変異体はまた、これらの配列のいずれかの断片又は部分を包含する。
【００６０】
（本発明に従った植物及び植物の部分）
１つの実施態様では、本発明は最初にＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅから移入されたＴｙ−１とシス相で、最初にＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍから移入されたＭｉ−１対立遺伝子をそのゲノム内に含むトマト植物（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、ならびにそのような植物の細胞及び組織、種子又は果実を提供する。これらの植物は、例えば、各々が（好ましくは固定された）対象対立遺伝子（ここではＭｉ−１又はＴｙ−１）を含む、公的に入手可能な商業品種を交雑することによって、及び前記交雑から得たＦ２植物から、又はさらなる自家受粉又はＦ１の交雑によって得たさらなる世代から（例えばＦ２又は戻し交雑個体群）、Ｍｉ−１とＴｙ−１をシス相で含む組換え植物を選抜することによって、作製することができる。組換えの発生率が非常に低く、数多くの事象を必要とするので、選抜は、好ましくはＳＣＡＲ又はＣＡＰＳアッセイなどの１つ以上のＭｉ対立遺伝子特異的分子アッセイ又は対立遺伝子識別分子アッセイを用いて実施する。例えば、実施例で述べるような、ここでは「Ｔｙ遺伝子座についてのＳＣＡＲアッセイ」、「Ｍｉ遺伝子座についてのＳＣＡＲアッセイＮｏ．１」及び「Ｍｉ遺伝子座についてのＳＣＡＲアッセイＮｏ．２」と称する３つのＳＣＡＲアッセイの１つ以上を使用しうる。これらのアッセイでは、ＰＣＲ反応において３つのプライマー対（配列番号１と２、配列番号３と４及び配列番号５と６）を使用し、次に酵素制限して、ＰＣＲ増幅産物間の多型を検出するために得られた断片の検出を実施する。
【００６１】
常用実験を使用して同様のアッセイを開発できることは明白である。例えばプライマー配列のいずれかの「変異体」、あるいはＭｉ及びＴｙ遺伝子座上又はそれらの近くのゲノムの他の部分にハイブリダイズするプライマー又はプローブが使用しうる。
【００６２】
Ｍｉ−１とＴｙ−１をシス相で含む植物は、同型接合又は異型接合でありうる。これらの植物は、例えば雑種又は近交系を生成するために前記対立遺伝子を１つの単位として他のトマト植物に移入するためのさらなる交雑において使用しうる。好ましい実施態様では、相同染色体上にＭｉ−１及びＴｙ−１対立遺伝子を相引相で含み、感受性である雑種植物、あるいは相同染色体上にＭｉ＋及びＴｙ＋対立遺伝子を含む雑種植物が提供される。これらの植物は、Ｍｉ−１及びＴｙ−１対立遺伝子が同型接合状態で存在するとき通常これらの対立遺伝子に結びつく遺伝子ひきずり病徴が有意に低いか又は全くないという利点を有する。
【００６３】
遺伝子ひきずり病徴は、Ｍｉ−１及びＴｙ−１対立遺伝子を持たない植物と比較して、自己壊死、より長い節間、より小さな果実、より少ない結実及び園芸的に劣る構造の群から選択される１つ以上の病徴を指す。当業者は、遺伝子ひきずりのそのような病徴が栽培者による近交系又は雑種植物系統の商業的受け入れに好ましくない影響を及ぼすことを認識する。一般に、有害レベルの遺伝子ひきずりの存在は、これらの病徴の１つ以上が、その植物系統が商業的に受け入れられなくなる程度に存在することによって判定されうる。
【００６４】
本発明のトマト植物は、約０．２５未満、好ましくは約０．２未満、より好ましくは約０．１未満あるいは０．０３又は０．０２などの約０．０５未満の平均線虫抵抗性スコアを有する。さらに、これらの植物はＴＹＬＣＶに抵抗性であり、上述したアッセイで測定するとき、１．０以下の平均ＴＹＬＣＶ抵抗性スコアを有する。
【００６５】
（他の線虫及びＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子を含む植物）
もう１つの実施態様では、本発明は、上記組換え体を作製及び／又は選抜する方法、ならびに、好ましくはＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍの６番染色体上に、少なくとも１個のＭｉ抵抗性対立遺伝子及び少なくとも１個のＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子を相引相（シス相）で有する他の組換え体を作製及び／又は選抜するための方法を提供する。そのような植物は、Ｍ．ａｒｅｎａｒｉａ、Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ及び／又はＭ．ｊａｖａｎｉｃａ種の線虫に対して高度、中間又は軽度抵抗性を有すること、及びここで述べる抵抗性アッセイを使用するときＴＹＬＣＶに対して抵抗性又は中間抵抗性を有することによって特徴付けられる。また、この方法を用いて作製される組換え事象、ならびにこれらの植物の組織、細胞、種子及び果実、及びＭｉ及びＴｙ抵抗性対立遺伝子をシス相で含む雑種又は近交系色物を生成するためのこれらの植物の使用も提供される。但し、Ｔｙ−１対立遺伝子と相引相でＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからのＭｉ−Ｊ対立遺伝子を含む植物は、先行技術（米国特許第６，４１４，２２６号）において既に偶然に自然発生しているので、そのような植物は本発明に従って作製されなかったが、明白に除外される。いかなる場合も、Ｔｙ−１対立遺伝子と相引相でＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからのＭｉ−Ｊ対立遺伝子を含む植物は高いレベルの線虫抵抗性を示さない、すなわちここで定義するような高度抵抗性ではない。それ故、ＴＹＬＣＶに対する抵抗性及び線虫に対する高度抵抗性を付与する植物が特に好ましい。
【００６６】
１つの実施態様では、本発明は、ネコブセンチュウに対する抵抗性を付与する対立遺伝子と相引相でＴＹＬＣＶに対する抵抗性を付与する対立遺伝子を含むトマト植物を作製することに関する。ＴＹＬＣＶに対する抵抗性を付与する対立遺伝子及びネコブセンチュウに対する抵抗性をコードする対立遺伝子は、もともと、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｃｅｒａｓｉｆｏｒｍｅ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｃｈｅｅｓｍａｎｉｉ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｈｉｒｓｕｔｕｍ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｃｈｉｌｅｎｓｅ又はＳｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｉｄｅｓなどの、但しこれらに限定されない、異なる生殖質ソース（すなわちトマトの異なる種）に由来しうる。
【００６７】
それ故、１つの実施態様では、２つの遺伝子座に相引相で少なくとも１個のＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及び少なくとも１個のネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を含むＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物を作製するための方法が提供され、その方法は、（ａ）ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子を含むＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ植物を、ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を含むＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ植物と交雑すること、（ｂ）前記交雑の子孫を、１つ以上の分子アッセイを使用して２つの遺伝子座の各々における前記抵抗性対立遺伝子の存在に関して分析すること、及び（ｃ）前記抵抗性対立遺伝子を相引相で含む１つ以上の植物を選抜すること、の工程を含む。
【００６８】
場合により、抵抗性アッセイを前記方法のいずれかの段階で実施しうる。さらなる任意の工程（ｄ）は、得られた植物を自家受粉させること又は得られた植物をもう１つ別のトマト植物と交雑して雑種植物を作出することを含む。好ましい実施態様では、前記法によって得られる植物はＴＹＬＣＶに抵抗性であり、線虫に高度抵抗性（定義したように）である。
【００６９】
工程（ａ）の出発植物は、実施例の中で述べるように病理試験を用いて選抜することができる。それらは、野生又は栽培植物、あるいは突然変異誘発又は形質転換植物などの改変された植物であってもよい。例えば、ＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ Ｉｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；ＭｃＣａｌｌｕｍら、２０００、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １８：４５５及びＭｃＣａｌｌｕｍら、２０００、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３、４３９−４４２）又はＥＣＯＴＩＬＬＩＮＧ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、２００４、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｐｒｅｖｉｅｗ ２００４年５月２１日）などのアプローチを使用して、改変された病原体抵抗性及び／又はＴｙ又はＭｉ遺伝子座の対立遺伝子における突然変異を有する植物を作製及び／又は選抜しうる。これらの植物は、その後、Ｔｙ及びＭｉ抵抗性対立遺伝子のソースとして使用しうる。
【００７０】
次に、（以下で述べる）本発明に従った１つ以上の分子アッセイを使用して、交雑の子孫を分析する。分析し、その中から植物を選抜する子孫は、所望交雑／選抜計画及び使用する植物中に存在する対立遺伝子に依存して、Ｆ２、Ｆ３世代等、戻し交雑世代（ＢＣ１、ＢＣ２等）等のような様々な世代の子孫のいずれかでありうる。分子アッセイは、好ましくはＦ２植物に関して実施する。また、病理アッセイ及び／又は１つ以上の分子アッセイを使用して異なる世代の子孫を繰り返し試験しうる。１つの世代においていくつかの分子アッセイを実施しうるか、あるいは異なる世代において１つ以上の異なるアッセイを実施しうる。それ故、工程（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）を数回反復しうる。その目的は、所望Ｔｙ及びＭｉ抵抗性対立遺伝子を相引相で含む組換え体を特定すること（工程ｃ）である。この方法では、いかなるＴｙ抵抗性対立遺伝子をいかなるＭｉ抵抗性対立遺伝子と組み合わせてもよい（相引相で）。
【００７１】
前記植物は、例えばＴｙ遺伝子座又はその近く、及びＭｉ遺伝子座又はその近くの核酸配列に基づき、分子アッセイを使用して他の植物から識別することができる。これらの分析は、これら２つの遺伝子座の対立遺伝子構造を決定することを可能にする。例えば、本発明に従った植物は、Ｍｉ遺伝子座の近くに配列番号８又は基本的にそれに類似する（及びＭｉ遺伝子座のＭｉ抵抗性対立遺伝子を指示する）核酸配列、あるいはＴｙ遺伝子座の近くに配列番号１０又は基本的にそれに類似する（及び連鎖Ｔｙ遺伝子座のＴｙ抵抗性対立遺伝子を指示する）核酸配列を含み、それによってこれらの領域は相引相で連結される。好ましくは、本文中別の箇所で述べるような１つ以上のＰＣＲベースのアッセイを使用して、Ｍｉ遺伝子座とＴｙ遺伝子座の異なる遺伝子型を識別し、所望対立遺伝子を相引相で有する組換え植物を選抜する。
【００７２】
Ｍｉ及びＴｙ抵抗性対立遺伝子を相引相で含む組換え植物の選抜及びこの単一メンデル単位の他の植物への移入は、分子生物学、植物病理学及び伝統的交雑手法の組合せを用いて達成しうる。好ましいアプローチでは、本発明は、分子生物学手法を使用して、ＴＹＬＣＶ抵抗性とネコブセンチュウ抵抗性についての所望対立遺伝子を栽培トマトのゲノム内にシス相で導入するためにＴｙ及びＭｉ遺伝子座の種々の対立遺伝子を識別する。本発明は、典型的にこれらの形質に結びつく遺伝子ひきずりを隠す植物育種家の能力を保持しながら、またＴｙ及びＭｉ抵抗性をＯｉｄｉｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍについての抵抗性遺伝子又はこの遺伝子クラスター内に存在するまだ発見されていない抵抗性遺伝子と組み合わせる自由を保持しながら、ＴＹＬＣＶ及びネコブセンチュウの両方に多数の抵抗性を有するトマト雑種の育種を促進させる。
【００７３】
限定ではなく例として、本発明は、好ましくは６番染色体上に位置するシス相の共遺伝単位として、いずれかのＴｙ抵抗性対立遺伝子およびいずれかのＭｉ抵抗性対立遺伝子を相引相で含むトマト生殖質の開発を提供する。ひとたび高いレベルの（例えばＴｙ−１及びＭｉ−１によって提供される抵抗性レベルと同等の）抵抗性を有する植物が特定されれば、Ｍｉ及びＴｉ遺伝子座に密接に関連する、ここで開示する核酸領域を配列決定することができ、その（関連マーカー領域の）配列情報を使用して、それらの植物において認められる対立遺伝子についての分子アッセイを開発することができる。当業者には明白であるように、様々な生殖質においてＭｉ又はＴｙ抵抗性対立遺伝子を特定するための代替的な方法が存在する。そのような方法のさらなる詳細を下記で述べる。
【００７４】
先に述べたように、本発明は分子生物学、植物病理学及び伝統的交雑手法の組合せを使用する。１つの実施態様では、使用する分子生物学手法は、例えば、下記でより詳細に論じる、Ｍｉ及び／又はＴｙ遺伝子座に関連する核酸領域にハイブリダイズする（及び増幅する）核酸プライマーを用いたマーカーアッセイを含む。本発明は、Ｔｙ−１及びＭｉ−１対立遺伝子を含む、実施例で開示する特定アッセイだけでなく、ネコブセンチュウに対する抵抗性をコードする対立遺伝子と相引相でＴＹＬＣＶに対する抵抗性をコードする対立遺伝子をトマトに移入するために開発され、使用されうるいかなるアッセイも考慮する。例えば、本発明は、Ｔｙ及び／又はＭｉ遺伝子座の何らかの変異体（例えばオーソローグ又は進化的に分岐した天然対立遺伝子又は突然変異誘発によって生成される対立遺伝子）をトマトに移入すること及びシス相で対立遺伝子を含む植物を生成することを考慮する。
【００７５】
またここでは、前述した方法のいずれかによって入手しうる植物、及びもう１つ別のＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ植物との交雑における親としてのそれらの植物の使用が提供される。本発明は、技術的にいかなる意味においてもトマトの１つ又はそれ以上の特定品種に限定されず、トマト植物（近交系、雑種等を含む）に一般的に適用されることに留意すべきである。
【００７６】
（本発明に従った分子アッセイ）
植物のＴｙ遺伝子座におけるＴｙ−１及びＴｙ＋の存在又は不在、及びＭｉ遺伝子座のＭｉ−１、Ｍｉ−Ｊ及び／又はＭｉ＋を識別するいくつかの分子アッセイがここで提供される。これらのアッセイの１つ以上がマーカーアシスト選抜において、すなわち、Ｍｉ及びＴｙ遺伝子座における植物の対立遺伝子構造を決定するため及び所望Ｍｉ及びＴｙ抵抗性対立遺伝子を有する植物を選抜するために使用できる。常套的分子生物学手法を使用して、何らかのＭｉ及びＴｙ抵抗性対立遺伝子に関する同様のアッセイを開発することができる。例えば、配列番号７から９（又は変異体核酸配列）又は配列番号１０又は１１（又はその変異体）の１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、３０又はそれ以上の連続ヌクレオチドの断片は、ＰＣＲプライマー対又は核酸ハイブリダイゼーションのためのプローブを設計するため、及びそのようなプライマー対によって増幅される領域又はそのようなプローブがハイブリダイズする核酸配列の核酸情報に基づく識別分子アッセイを開発するために使用しうる。開発するアッセイの正確なタイプは、それがＭｉ抵抗性対立遺伝子とＴｙ抵抗性対立遺伝子、及びＭｉ及び／又はＴｙ遺伝子座の同型接合／異型接合を識別することができる限り、重要ではない。アッセイの様々なタイプの例を下記及び実施例に示す。
【００７７】
本発明の方法においてマーカーアシスト選抜を実施するために、対象トマト植物又は植物の部分を、例えば、最初に、当技術分野において既知の手法であるＤＮＡ抽出に供する（Ｈｎｅｔｋｏｖｓｋｙら、Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．，３６（２）：３９３−４００（１９９６）参照）。ひとたび抽出が完了すれば、増幅切断多型配列（ＣＡＰＳ）アッセイ（Ａｋｏｐｙａｎｚら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０：６２２１−６２２５（１９９２）及びＫｏｎｉｅｃｚｎｙ ＆ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，４：４０３−４１０（１９９３）参照）又はＳＣＡＲアッセイを含むがこれらに限定されない分子アッセイを実施することができる。ＳＣＡＲアッセイは、ＰＣＲによって遺伝子座（Ｔｙ遺伝子座又はＭｉ遺伝子座の近くの特定遺伝子座）のＤＮＡを増幅し、その後制限酵素で消化することを含む。核酸配列間の多型は、例えば異なる大きさの制限断片を生じることにより、異なる対立遺伝子（Ｍｉ＋、Ｍｉ−Ｊ及び／又はＭｉ−１対立遺伝子などであるが、これらに限定されない）を識別する。
【００７８】
トマト植物のゲノム内のＴｙ及び／又はＭｉ遺伝子座にどの対立遺伝子が存在するかを特定し、もし前記対立遺伝子が存在する場合は、それらの対立遺伝子が同型接合又は異型接合のいずれの状態で存在するかを特定するために、これらのアッセイでは核酸プライマー及び酵素を使用する。両方の遺伝子座から得た情報を使用して、Ｔｙ及びＭｉ遺伝子座に相引相（すなわちシス相）で特定の対立遺伝子組合せを有する植物を特定する。
【００７９】
マーカーアシスト選抜試験を作成するために、当業者は、供与体ソース（すなわち病害抵抗性形質を含む生殖質）からのＤＮＡ配列を、受容体ソース（すなわち特定病原体についての感受性「＋」体を含む生殖質）からの対応するＤＮＡ配列と比較することから始める。あるいは、対象形質に遺伝的に密接に関連するゲノム内の対応する位置で供与体と受容体からのＤＮＡの配列比較を実施する。Ｔｙ及びＭｉ遺伝子座については、これらの形質付近での多型の特定は当技術分野において既知である（Ｚａｍｉｒら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８８：１４１（１９９４）及びＷｉｌｌｉａｍｓｏｎら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８７：７５７（１９９４）参照）。Ｔｙ−１対立遺伝子に関して、Ｚａｍｉｒらは、Ｔａｎｓｋｌｅｙ（Ｔａｎｓｋｌｅｙら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３２：１１４１（１９９２））によって最初に位置決定された、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）ＴＧ９７がＴｙ遺伝子座に密接に関連することを認めた。同様に、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎらは、ＲＥＸ−１遺伝子座がＭｉ遺伝子座に密接に関連することを認めた。
【００８０】
１つの実施態様では、使用する分子アッセイはＳＣＡＲアッセイであるか、又は実施例に見られるようにいくつかのＳＣＡＲアッセイである。例えば、配列番号１０は、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからのＴｙ−１対立遺伝子近くのポリヌクレオチドＬＡ１９６９を提供する。配列番号１１は、ＴＧ９７遺伝子座のＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍからの野生型Ｔｙ＋対立遺伝子の近くのポリヌクレオチド配列を提供する。図１は、これら２つの配列間に存在するいくつかの一塩基多型（ＳＮＰ）を強調した、これらの配列の比較を示す。ＳＮＰは、一般にＩＮＤＥＬＳと呼ばれる置換突然変異体、挿入又は欠失突然変異体でありうる。対立遺伝子間の多型を利用して、当業者は、ＳＮＰについてのマーカーアシストアッセイ及びプライマー（又はプローブ）を開発できることを認識する。そのようなアッセイは、感受性Ｔｙ＋対立遺伝子から抵抗性Ｔｙ−１対立遺伝子を識別するために使用できる。例えば、配列番号１と２のプライマー対は約３９８ｂｐの断片を増幅する（例えばゲノムトマトＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ増幅を使用して）。次にその増幅産物をＴａｑＩ酵素（配列Ｔ↓ＣＧＡを認識し、制限する）と共にインキュベートすると、Ｔｙ−１対立遺伝子を含む植物から増幅した３９８ｂｐ産物の約９５ｂｐと約３０３ｂｐの２つの核酸断片への制限を生じる。Ｔｙ−１について同型接合の植物は、それ故、これら２つの断片を生じるが（例えばゲル上のバンド等として視覚化される）、Ｔｙ＋について同型接合の植物は約３９８ｂｐの単一断片を生じる。異型接合植物（Ｔｙ−１／Ｔｙ＋）は３つの断片すべてを生産する。
【００８１】
同様に、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８７：７５７−７６３（１９９４）によって公表されたデータに基づき、Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ及びＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅのポリヌクレオチド配列をＲＥＸ−１と称されるＭｉ近くの遺伝子座で決定した。これら３つのポリヌクレオチド配列を配列番号７（Ｍｉ＋に特異的）、８（Ｍｉ−１）及び９（Ｍｉ−Ｊ）に示す。これらのポリヌクレオチド配列の比較を図２に示す。図２はこれら３つの配列間で２０のＳＮＰを明らかにしている。
【００８２】
ここで述べるＳＣＡＲアッセイは他の分子アッセイによって容易に修正又は置換でき、及びＴｙ及び／又はＭｉ遺伝子座のいかなる対立遺伝子についても容易に開発できることは明白である。また、前記アッセイは、２個以上のヌクレオチドの欠失、挿入又は置換などのＳＮＰ以外の他の多型にも基づきうる。
【００８３】
既に述べたように、配列番号７から１１の全部又は一部、あるいはその何らかの変異体又はゲノム内の隣接領域の全部又は一部にハイブリダイズし、増幅する特異的又は縮重プライマーを設計することができる。あるいは、抵抗性対立遺伝子の部分を直接増幅する又はＭｉ及びＴｙ遺伝子座の近くの他の核酸領域を増幅するためのプライマーも設計しうる。さらに、所望する場合は、米国特許第５，４６４，７４６号、同第５，４２４，４１４号及び同第４，９４８，８８２号に述べられているものを含むがこれらに限定されない、当技術分野で既知の手法を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡからのＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイなどの、但しこれに限定されない、他のマーカーアシスト選抜アッセイにおける使用のために本発明のプライマーを修飾することができる。
【００８４】
新しいＴｙ又はＭｉ抵抗性対立遺伝子を識別する新しい分子試験を設計するために、当業者は、例えば、最初にＭｉ又はＴｙ遺伝子座上又はその近くのマーカー遺伝子座のＤＮＡ配列を決定し（例えばここで述べるＰＣＲ増幅とプライマー対及びその増幅産物の配列決定を使用して）、次に他のマーカー配列（Ｍｉ及びＴｙ遺伝子座上又はその近くの他の対立遺伝子）の対応するＤＮＡと配列を比較することを認識する。このＤＮＡ比較により、当業者は、新しい配列多型あるいはこれまで他の比較ではカバーされていなかった既存の多型が残存するかどうかを特定できよう。これらのデータを使用して、新しい分子試験を設計するか、又はシス相のＴｙ及びＭｉ遺伝子座における何らかの対立遺伝子の組合せの選抜を容易にするために既存の試験を利用することができる。
【００８５】
上述したのと同様の方法が、ネコブセンチュウに対する抵抗性をコードする対立遺伝子を選抜及び／又は移入するために使用できる。限定ではなく一例として、トマト植物のゲノムにおけるＭｉ−１対立遺伝子の存在を判定するためのアッセイを述べる。Ｍｉ−１対立遺伝子の存在を判定するためのアッセイは、先に述べたＴｙ−１対立遺伝子を特定するために使用したのと同様の方法で決定できる。しかし、検討する植物がおそらくＭｉ−Ｊ対立遺伝子を含むと考えられる場合、植物のゲノムにおけるＭｉ−１対立遺伝子の存在の特定は、実施例で述べるような２つの分子アッセイを実施することを含みうるが、必ずしも含まない。いずれの場合も、これらのアッセイを実施する順序は決定的に重要ではない。
【００８６】
上述したアッセイは、Ｔｙ抵抗性対立遺伝子とＭｉ抵抗性対立遺伝子を相引相で含むトマト植物の交雑及び／又は選抜を容易にするための育種プログラムにおいて個別に及び集合的に使用できる。
【００８７】
これらの方法がどのように使用できるかについての非制限的な１つの例を、Ｍｉ−１とＴｙ−１を相引相で含む植物の選抜に関して以下で述べる。第一近交系トマト系統を第二近交系トマト系統と交雑させて雑種植物を生産しうる。交雑において使用する１つのトマト植物はＴｙ−１対立遺伝子をそのゲノム内に含み、第二の植物はＭｉ−１対立遺伝子をそのゲノム内に含む。生じた植物（Ｆ１雑種）を、次に、自家受粉させ、受精させて、播種する（Ｆ２種子）。そのＦ２種子からＦ２植物を生育させる（又はさらに自家受粉又は交雑させる、例えば交雑親の１つと戻し交配させる）。次にこれらの植物を、当技術分野で既知の手法である（Ｈｎｅｔｋｏｖｓｋｙら、１９９６、Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．，３６（２）：３９３−４００参照）ＤＮＡ抽出に供し、破砕された組織試料に関して直接ＰＣＲを実施する。
【００８８】
それ故、上述したアッセイは、異型接合状態のＴｙ−１対立遺伝子及び同型接合状態のＭｉ−１対立遺伝子を含むＦ２植物（又は他の子孫）を特定するために使用できる。あるいは、同型接合状態のＴｙ−１対立遺伝子及び異型接合状態のＭｉ−１対立遺伝子を含むＦ２植物を特定することができる。そこで、前述したＳＣＡＲアッセイなどの１つ以上の分子アッセイを使用して、Ｔｙ−１とＭｉ−１を相引相で含む組換え植物を特定することができる。
【００８９】
ＴｙとＭｉ遺伝子座の間での組換え率は低いので、Ｆ２世代の組換え体を見出すことはまれである。ここで述べるアッセイはまた、Ｔｙ−１及び／又はＭｉ−１対立遺伝子が同型接合又は異型接合状態で植物のゲノム内に存在するかどうかを判定するためにも使用できる。アッセイの結果に依存して、さらなる交配及び分子特定指摘が必要になりうる。例えば、育種プログラムの目標が近交系を作出することであり、及び試験する特定トマト植物についての上記アッセイの１つ以上の結果が、その植物がＭｉ−１対立遺伝子を同型接合状態でそのゲノム内に含み、Ｔｙ−１対立遺伝子を異型接合状態で含むことを明らかにする場合、その植物及びその子孫が、自殖後、Ｍｉ−１対立遺伝子とＴｙ−１対立遺伝子の両方を同型接合状態でそのゲノム内に含むと判定されるまで、前記植物をさらなる自家受精、交配及び／又はここで述べるアッセイの１つ以上を用いた分子特定指摘に供しうる。ひとたびＭｉ−１及びＴｙ−１対立遺伝子が相引相又はシス相で作出されれば、それらは共に遺伝される。多抵抗性対立遺伝子のこの遺伝ブロックは、植物育種家に、第二近交系親による野生種移入の遺伝子ひきずり作用を隠すことを可能にしつつ、新しい雑種を作出する上での柔軟性を提供する。また、Ｏｉｄｉｕｍ及びＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ抵抗性遺伝子などの他の抵抗性遺伝子との組合せも容易に可能である。
【００９０】
上記で簡単に述べたように、本発明の方法は、新しい、より優れた近交系を作出するために使用できる。これらの近交系は、ＴＹＬＣＶ及びネコブセンチュウに対して抵抗性であり、同時に他の商業的に望ましい特性を有する雑種トマト植物を作出するためのその後の育種において使用できる。そのような近交系は、速やかな育種を促進する単一共遺伝性単位としてのＴｙ−１及びＭｉ−１対立遺伝子の移入を可能にするので、育種において有用である。さらに、前記方法はまた、近交系が実際にＴｙ−１対立遺伝子及びＭｉ−１対立遺伝子を同型接合状態でそのゲノム内に含み、その同型接合性を保持していることを確認する上で有用である。ひとたびこの確認が得られれば、その近交系は、Ｔｙ−１対立遺伝子とＭｉ−１対立遺伝子を単一共遺伝単位として雑種トマト植物に移入するために第二近交系との交雑において使用できる。その第二代近交系は、遺伝子ひきずり作用を隠すための野生種対立遺伝子Ｔｙ＋及びＭｉ＋を担うことができる。
【００９１】
（本発明に従ったキット）
さらなる実施態様では、Ｍｉ及び／又はＴｙ遺伝子座の対立遺伝子組成物を判定するための分子アッセイが提供される。そのようなアッセイは、１つ以上のトマト植物からＤＮＡを抽出すること、少なくとも１つのＰＣＲプライマー対を使用してＭｉ及び／又はＴｙ遺伝子座上のＤＮＡの部分又はそれらに関連するＤＮＡの部分を増幅すること、場合により１つ以上の制限酵素で増幅産物を制限すること、及び前記ＤＮＡ断片を視覚化することを含む。
【００９２】
さらに、Ｍｉ遺伝子座及びＴｙ遺伝子座における植物又は植物組織の対立遺伝子構造を判定するための検出キットが提供される。そのようなキットは、配列番号１と２、配列番号３と４及び／又は配列番号５と６、あるいはその変異体などの、１つ以上のプライマー対を含む。さらに、指示書及び場合により植物材料又はＤＮＡ（例えば対照組織の）が含まれうる。
【００９３】
（実施例）
線虫抵抗性についての効力評価
ＦＤＲ１６−２０４５系統は米国特許第６，４１４，２２６号の対象である。この系統はＴｙ遺伝子座にＴｙ−１対立遺伝子を含む；この対立遺伝子の由来は、近代的トマトＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍの野生類縁、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅからの移入であった。Ｔｙ−１対立遺伝子は、商業的に重要な病原体、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に対する抵抗性を与える。ＦＤＲ１６−２０４５系統は、この移入と共遺伝される、Ｍｉ遺伝子座近くのＭｉ−Ｊ対立遺伝子を含む。Ｍｉ−Ｊ対立遺伝子は、もう１つの商業的に重要な病原体であるネコブセンチュウに対する抵抗性を与える。交配及び病理実験において、Ｍｉ−Ｊ対立遺伝子によって与えられる抵抗性のレベルは、代替対立遺伝子、Ｍｉ遺伝子座のＭｉ−１ほどにはネコブセンチュウに対して有効でない。これは、Ｍｉ−Ｊ対立遺伝子がＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍからの「＋」型感受性対立遺伝子と対合した異型接合状態で存在するときに特に明らかである。それ故、ここで述べる一連の病理実験は、Ｍｉ−１及びＭｉ−Ｊ抵抗性対立遺伝子を使用して抵抗性レベルを定量する。
【実施例１】
【００９４】
Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａに対する抵抗性を測定するための病理試験
トマトにおけるネコブセンチュウ病の病原菌であるＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａに対する抵抗性を評価するために生病原菌アッセイを使用した。抵抗性等級は、こぶ形成の程度と大きさに基づく。表１は、ネコブセンチュウ抵抗性を判定するための等級採点システムを示す。Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａの病害症状について採点するために０から４までの尺度を使用した（表１）。
【００９５】
【表１】
【００９６】
感受性トマト系統からの植物を２ヶ月間感染させることによってＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ接種材料を作製した。この時点で、感染植物の根は病原体からの成熟卵塊を示す。接種材料の作製のために根を採取し、４から５ｃｍの断片に切断した。試験は、感染接種材料の存在下で種子を発芽させる。種子を、泥炭、バーミキュライト及び砂の土壌混合物（それぞれ４：１：１）を含む温室ベンチに播く。１つの系統からの種子を約４ｃｍずつ離して畦に播き、畦と畦の間は４．５から５ｃｍとした。接種材料のために、各々の畦の間に約１２ｃｍの間隔で小さな穴を作った。これらの穴に、作製した接種材料２又は３片を差し込み、土壌で覆った。畦の各々の側に接種材料を交互に配置することにより、各々の種子は接種材料から約６から７ｃｍの距離であった。実生を発芽させ、温室において毎日の温度範囲２２から２６℃で生育させた。播種後２８日目に各々の植物を引き抜き、根をこぶの存在について検査することによって等級付けを実施した。
【００９７】
試験は、交配系統、雑種及び対照系統に関して２回実施した。線虫抵抗性についての病理試験の結果を表２に示す。
【００９８】
【表２】
【００９９】
左側の欄が試験した系統の名称である。これらは、交配系統、雑種系統及び対照系統を含む項に分けられている。次の欄にはＭｉ及びＴｙ遺伝子座の遺伝子型を列記している。これらの遺伝子型はここで述べる分子マーカー試験によって決定した。その次の５つの欄のシリーズは、２回の別々の時点に採点した試験についての等級スコアを含む。最後の５つの欄はこれら２回の試験の結果を合計している。
【０１００】
Ｔｙ及びＭｉ遺伝子座に種々の遺伝子型を有する１４の試料が存在するので、表２の成績傾向を認識するのは難しいと考えられる。１４の試料のうち、５つの遺伝子型だけがＭｉ遺伝子座に存在する。１つの遺伝子型は、Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍからの感受性対立遺伝子について同型接合である。これを＋／＋と称する。２番目の遺伝子型は異型接合であり、感受性「＋」対立遺伝子と対合したＭｉ−Ｊ対立遺伝子を有する。３番目の遺伝子型は、同型接合状態のＭｉ−Ｊ対立遺伝子を有する。４番目と５番目の遺伝子型は、それぞれ同型接合として及び「＋」対立遺伝子との異型接合として存在する、Ｍｉ−１対立遺伝子を含む。
【０１０１】
表２のデータをＭｉ遺伝子座の遺伝子型に従って要約し、平均すると、線虫抵抗性についての種々の対立遺伝子組合せの効力が明らかになる（図３）。図３において、表２に認められる遺伝子型についての平均病害等級を示す。表２の系統をＭｉ遺伝子座の遺伝子型に従って分析した。これらの遺伝子型分類をＹ軸に示す。Ｘ軸は、これらの５つの遺伝子型分類についての平均病害等級を表わす。
【０１０２】
図３は、最初にＬ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍから移入したＭｉ−１対立遺伝子が線虫に対する最も強力なレベルの抵抗性を与えることを示す。また、その抵抗性は、Ｍｉ−１が異型接合（感受性「＋」対立遺伝子との）として存在するか又は同型接合として存在するかに関わりなく強力であることも明らかである。これは、遺伝子型Ｍｉ−１／Ｍｉ−１及びＭｉ−１／＋が線虫抵抗性に関して高度抵抗性の表現型を付与することを明らかにしている。この「高度抵抗性」クラスは、ここで述べる方法によって判定した、０．１未満の平均抵抗性スコアを有すると定義される。
【０１０３】
その次に最も抵抗性のクラスは、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｎｓｅから移入した、同型接合状態のＭｉ−Ｊ対立遺伝子を有する系統からである。この抵抗性のクラスは「中間抵抗性」と定義され、０．１以上であるが１．０未満の平均採点範囲内である。近交系ＦＤＲ１６−２０４５は、それ故、中間レベルの抵抗性を有すると採点される。
【０１０４】
「軽度抵抗性」と定義される３番目の抵抗性クラスは、感受性対立遺伝子「＋」と対合した、異型接合状態のＭｉ−Ｊ対立遺伝子を有する系統に例示される。このクラスは１．０以上であるが２．０未満の平均抵抗性等級を有する。近交系ＦＤＲ１６−２０４５を、雑種栽培品種を作出するための近交系親として使用する場合、及び第二の親が感受性「＋」対立遺伝子を含む場合、その雑種は軽度の抵抗性だけを示す。中間抵抗性及び軽度抵抗性クラス内のＭｉ−Ｊ対立遺伝子の成績を比較したとき、この遺伝子が半優性的に働くことは明白である。
【０１０５】
最後のクラスは感受性と定義され、Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍからの感受性対立遺伝子について同型接合又は＋／＋である系統を含む。この感受性クラスは、２以上の平均病害等級スコアを有すると定義される。
【０１０６】
これらの試験結果は、Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ（Ｍｉ−１）、Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｎｓｅ（Ｍｉ−Ｊ）及びＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（「＋」）からの対立遺伝子を使用したトマト交雑において達成されうる種々の抵抗性レベルを示す。これらのデータに基づき、トマト育種家は、Ｔｙ遺伝子座の抵抗性対立遺伝子（Ｔｙ−１）を含む近交系をＭｉ遺伝子座の最良抵抗性対立遺伝子（Ｍｉ−１）を含む近交系と交雑することによって雑種栽培品種を作出することができる。この戦略には、しかしながら、２つの決定的に重要な制限がある。第一に、育種家が、６番染色体のセントロメア領域内の病害クラスターに位置づけられる他の病害抵抗性遺伝子を送達する可能性を排除する。この領域に位置することが知られている他の病害抵抗性遺伝子の例は、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ抵抗性遺伝子、レース２及びレース５、及びＯｉｄｉｕｍについての抵抗性遺伝子である。第二に、育種家は、各々が野生種に由来し、各々遺伝効力を生じることが知られている２つの領域を移入するので、これは、近代的トマト（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）からの遺伝子を使用することによる遺伝子ひきずり作用を隠す能力を制限する。
【０１０７】
ここで述べるシス相のＴｙ−１及びＭｉ−１トマト植物は、これらの制限に対抗しうる対立遺伝子の新規組合せを提供し、トマト育種家に、多数の病害抵抗性を備えた栽培品種を作出するためのより多くの選択を可能にする。
【実施例２】
【０１０８】
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に対する抵抗性を判定するためのプロトコール この実施例は、トマト植物がＴＹＬＣＶに対して抵抗性、中間抵抗性又は感受性であるかどうかを判定するためのプロトコールを述べる。
【０１０９】
Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉを通してＴＹＬＣＶの自然感染が存在する圃場において植物を生育させる。ウイルス病原体の動きは様々な政府機関によって管理されうるので（検疫病（ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ））、自然に起こる圃場感染はウイルスが地方病性である区域において抵抗性を測定する好ましい方法である。例えば、米国農務省は通常、ＴＹＬＣＶ病原体が通常は存在しない米国の大半のトマト生育領域にＴＹＬＣＶ病原体を持ち込むことを許可しない。ウイルスの伝播のために昆虫（Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ）を飼育する必要があるので、管理条件下で病害スクリーニングを実施することは厄介である。
【０１１０】
０から４の尺度を使用して（表３）ＴＹＬＣＶの病害症状について採点した：
【０１１１】
【表３】
【０１１２】
植物系統又は品種を、平均スコアが０−１であるときＴＹＬＣＶに対して抵抗性、平均スコアが約２であるとき中間抵抗性、及び平均スコアが３以上であるとき感受性と等級付ける。あるいは、当技術分野で知られているＴＹＬＣＶを判定するためのプロトコールも使用できる。「Ｔｏｍａｔｏ Ｙｅｌｌｏｗ Ｌｅａｆ Ｃｕｒｌ Ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ Ｓａｒｄｉｎｉａ ｉｓ ａ ｗｈｉｔｅｆｌｙ−ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ」；Ａ．Ｋｅｙｙｒ−Ｐｏｕｒ，Ｍ．Ｂｅｎｄａｈｍａｎｅ，Ｖ．Ｍａｔｚｅｉｔ，Ｇ．Ｐ．Ａｃｏｔｔｏ，Ｓ．Ｃｒｅｓｐｉ，Ｂ．Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ１９，ｐ．６７６３−６７６９；Ｔｏｍａｔｏ Ｙｅｌｌｏｗ Ｌｅａｆ Ｃｕｒｌ Ｖｉｒｕｓ：ａ ｗｈｉｔｅｆｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ」，Ｎ．Ｎａｖｏｔ，Ｅ．Ｐｉｃｈｅｒｓｋｙ，Ｍ．Ｚｅｉｄａｎ，Ｄ．Ｚａｍｉｒ，Ｈ．Ｃｚｏｓｎｅｋ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８５，１９９１，ｐ．１５１−１６１。
【０１１３】
（Ｍｉ及びＴｙ遺伝子座の対立遺伝子組成物を識別するための分子試験）
３つの分子マーカー試験の組合せを使用して、Ｍｉ及びＴｙ遺伝子座の遺伝子型を決定した。Ｔｙ遺伝子座では、２つの可能な対立遺伝子、Ｔｙ−１と「＋」を識別するのに１つの共優性分子マーカー試験しか必要としない。当業者は、共優性アッセイが、二対立遺伝子座の３つの対立遺伝子の可能性を識別することができる試験として定義されていることを認識する。これらの遺伝子座で、３つの遺伝子型を各々同型接合クラス及び異型接合クラスについて採点することができる。典型的に、配列決定特性指摘増幅領域（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ）又はＳＣＡＲアッセイ、増幅切断多型部位又はＣＡＰＳアッセイ、及び一塩基多型又はＳＮＰアッセイのようなマーカーアッセイはすべて典型的には共優性アッセイである。これに対し、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）及び増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）は典型的には優性マーカーであり、共優性マーカーほど多くの情報を提供しない。Ｍｉ遺伝子座では、３つの対立遺伝子（Ｍｉ−１、Ｍｉ−Ｊ及び「＋」）の間の可能な組合せを決定するためには２つの試験が必要である。いかなる意味においても限定ではないが、ここで述べるマーカーアッセイはすべてＳＣＡＲ型アッセイである。
【０１１４】
大部分の他の分子マーカー試験と同様に、実施するＳＣＡＲアッセイは、非常に小量の出発物質からＤＮＡを約１０億倍に増幅することができる、ポリメラーゼ連鎖反応又はＰＣＲを使用する。ＰＣＲの使用は当業者に周知であり、研究者は試験を実施するためにごく小量の植物試料を採取するだけでよい。１ｃｍ2未満の葉物質、好ましくは活発に生育している幼若組織がこれらの試験を実施するために必要である。これはごく小量の試料であるので、これらのマーカー試験は通常非破壊的と称される。それらは、試料の採取がいかなる意味でも植物の発育を妨げないので非破壊的とみなされる。それ故、この小量の試料はその後の多くの試験、すなわち病理試験、果実の生化学的分析、収量試験又は園芸的評価からの結果に影響を及ぼさない。非破壊的であることに加えて、ＳＣＡＲアッセイはまた、付加的な時間的利点を提供する。典型的には、対象遺伝子座の遺伝子型を２４時間以内に確認することができる。
【０１１５】
使用する３つの分子マーカー試験は各々、ゲノムＤＮＡの単離を必要とする。
【実施例３】
【０１１６】
マーカー試験のためのトマトＤＮＡの単離
いかなる意味においても限定ではなく、その後の分子マーカー試験用のトマトＤＮＡを抽出するために以下のプロトコールが使用できる。当業者は、先行技術において多くのＤＮＡ抽出プロトコールが使用可能であることを認識する。このプロトコールの中で述べるすべての化学物質は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉから入手できる。手順は次の工程を含む：
１．およそ９６穴マイクロタイタープレートフォーマットのウエルの大きさの植物部分を収集する。好ましくは、種子試料を使用するか、又は若葉から組織試料を採取する。
２．抽出緩衝液１５０μｌ（２００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；２５０ｍＭ ＮａＣｌ；２５ｍＭ ＥＤＴＡ；０．５％ＳＤＳ）を試料に加えて、組織を浸軟する。
３．１５℃、１９００×ｇで１５分間プレートを遠心分離する。
４．上清分画１００μｌを、各々のウエルに２．５Ｍ酢酸カリウム１００μｌ（ｐＨ６．５）が入った新しい９６穴プレートに移す。２００ｒｐｍで約２分間振とうして混合する。
５．１５℃、１９００×ｇで１５分間プレートを遠心分離する。
６．上清分画７５μｌを、イソプロパノール７５μｌを含む新しい９６穴プレートに移す。混合し、次に２００ｒｐｍで２分間振とうする。
７．１５℃、１９００×ｇで１５分間プレートを遠心分離する。
８．上清分画を除去し、ペレット分画に７０％エタノール２００μｌを加える。２００ｒｐｍで５分間振とうし、その後−２０℃で一晩インキュベートする。
９．１５℃、１９００×ｇで１５分間プレートを遠心分離する。
１０．上清分画を除去する。ペレットに７０％エタノール２００μｌを加え、室温で１時間放置して前記アルコールでペレットを洗浄する。
１１．１５℃、１９００×ｇで１５分間プレートを遠心分離する。
１２．上清分画を廃棄し、ペレット分画を室温で乾燥する。これを約１時間かけて実施する。
１３．ペレット分画を３７℃で１５分間、ＴＥ１００μｌ（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５μｇ／ｍｌ ＲＮＡアーゼＡ）に溶解する。ＰＣＲ工程へ進まない場合は、前記ＤＮＡを４℃又は−２０℃で保存することができる。
【実施例４】
【０１１７】
ＳＣＡＲアッセイのための一般的ＰＣＲ条件
３つのＳＣＡＲマーカーアッセイの各々は、同様のデザインと実施法を共有する。各々のアッセイは、ＰＣＲ反応においてＤＮＡ合成を開始させるために使用されるのでプライマーと称される、一対の特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む。これらのプライマーは、典型的には１５−２５ヌクレオチドの長さである；これらの長さのヌクレオチドは、増幅するマーカー遺伝子座の基質のＤＮＡ配列に対応する。これらのプライマーは、典型的には１００から１，０００塩基対のアンプリコンの合成を促進するように設計される。当業者は、ＳＣＡＲ型アッセイを創出するためにこれらのプライマーをどのようにして設計するかを認知しており、しばしばその設計を助けるために公的に入手可能なＰｒｉｍｅｒ３ソフトウエア（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のようなソフトウエアプログラムを使用する。プライマーは当技術分野で既知の方法を用いて合成するか又は多くのオリゴヌクレオチド注文製造会社から購入することができる。これらのアッセイで使用したプライマーはすべてＯｐｅｒｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡから購入した。ＰＣＲ反応における他の試薬は、多くの商業的供給業者から購入することができる；ここで述べるアッセイでは、我々は、４つのデオキシリボヌクレオチド−５’三リン酸（ｄＮＴＰ）をＰｈａｒｍａｃｉａ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩより、ＰＣＲ緩衝液及びＴａｑポリメラーゼ酵素をｔｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡより購入した。当業者は、使用できる多くの種類のＰＣＲ装置及びアッセイ条件が存在するので、ＳＣＡＲアッセイを実施するのにある程度の柔軟性があることを認識する。ｔｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡからの９７００型ＰＣＲ装置を、３つのアッセイの各々について以下の実施パラメータと共に使用した。９４℃で２分間の初期変性工程に続いて３５サイクルの増幅を実施した。各々の増幅サイクルは、９２℃、３０秒、次に５０℃、３０秒、次に７２℃、９０秒の３工程であった。３５回のサイクル後、試料を５分間７２℃に保持した。これでＰＣＲ増幅アッセイは終了するが、研究者が回収するまで最終反応物を２５℃に保持するようにＰＣＲ装置をプログラムした。
【０１１８】
当業者は、ＰＣＲアッセイ条件にはかなりの柔軟性が許容されることを認識する。ＤＮＡ鋳型１μＬ、２つのアッセイ特異的ＰＣＲプライマー各々１０ピコモル、４つのｄＮＴＰの各々について最終容量２００μＭ、１０ＸＰＣＲ緩衝液２．５μＬ、及びＴａｑポリメラーゼ１．２５単位でＰＣＲ反応物を調製した。反応物の最終容量を２５μＬにするために無菌水を使用した。
【０１１９】
各々のＳＣＡＲアッセイはまた、ＰＣＲ反応が完了した後いかにして多型を明らかにするかについても共通性を有する。各々の試験に関して、ＰＣＲ反応からのＤＮＡの増幅領域は多型制限酵素認識部位を含みうる。選択（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）対立遺伝子はこの認識部位を持つ場合と持たない場合がある。ＰＣＲ産物を特異的制限酵素で消化するとき、アンプリコンは、その制限酵素部位が存在しないために切断されないか、又は２つの断片へと非対称に消化される。遺伝子座の遺伝子型は、これらの断片をアガロースゲルで電気泳動分離し、ＤＮＡに結合する染料、臭化エチジウムでゲルを染色して、次に紫外線でＤＮＡを励起して断片を視覚化することによって決定することができる。ＰＣＲ反応からの断片の大きさは、それらを、アガロースゲルで近くのレーンに電気泳動される既知の大きさの標準品と比較することによって決定される。ＳＣＡＲアッセイのうちの２つは、多型を明らかにするために制限酵素ＴａｑＩを使用する。これらのアッセイに関しては、１０Ｘ制限酵素緩衝液３μＬ、ＴａｑＩ制限酵素０．２５μＬ及び水１．７５μＬをＰＣＲ反応後に加え、６５℃で約３時間インキュベートする。３番目のアッセイは、遺伝子型を明らかにするために制限酵素ＮｌａＩＩＩを使用する。この試験では、１０Ｘ制限酵素緩衝液３．５μＬ、ＮｌａＩＩＩ ０．２５μＬ及び水６．２５μＬをＰＣＲ反応後に加え、次に３７℃で約３時間インキュベートする。当業者は、制限酵素及び緩衝液が多くの商業的販売者によって市販されていることを認識する。本発明者らはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄｓ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡからの試薬を使用した。制限酵素による消化後、当技術分野で周知の方法に従って（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、生成物を１−２％（ｗ／ｖ）アガロースゲルでの電気泳動によって分離した。
【実施例５】
【０１２０】
Ｔｙ遺伝子座のＳＣＡＲ試験
Ｚａｍｉｒは、Ｔｙ−１遺伝子をＴＧ９７と呼ばれる制限断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカーの近くに位置決定した（（１９９４）Ｔｈｅｏｒｅｔ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８８：１４１−１４６）。ＲＦＬＰアッセイは実施がより難しく、植物に対して破壊的で、コストがかかり、実施にも時間がかかるので、「＋」対立遺伝子と抵抗性対立遺伝子Ｔｙ−１の両方を基質として使用してＲＦＬＰ遺伝子座を配列決定することにより、このＲＦＬＰをＳＣＡＲマーカーアッセイに変換した。これらの配列の比較によって多型制限部位を発見することができた。
【０１２１】
ＳＣＡＲ試験は、以下の特異的プライマー対を使用してここで述べるように実施する。
【０１２２】
配列番号１：5' TAA TCC GTC GTT ACC TCT CCT T 3'及び
配列番号２：5' CGG ATG ACT TCA ATA GCA ATG A 3'。
【０１２３】
多型は、ＰＣＲ後に制限酵素ＴａｑＩでの消化によって明らかにすることができる。Ｔｙ−１対立遺伝子が同型接合として存在する場合は、この対立遺伝子から生産されるアンプリコンはＴａｑＩ制限酵素部位を含むので、３９８塩基対のＰＣＲアンプリコンは９５と３０３塩基対の断片に消化される。「＋」対立遺伝子が同型接合として存在する場合は、３９８塩基対のＰＣＲアンプリコンはＴａｑＩ酵素によって消化されない。異型接合試料については、ＰＣＲ反応の約半分が９５と３０３塩基対の断片に消化され、ＰＣＲ反応の約半分は消化されない。電気泳動によって分離したとき、異型接合は９５、３０３及び３９８塩基対の長さの３つの断片を有する。このようにして、Ｔｙ遺伝子座の遺伝子型を迅速且つ正確に決定することができる。
【実施例６】
【０１２４】
Ｍｉ遺伝子座のＳＣＡＲ試験Ｎｏ．１（Ｍｉ−１又はＭｉ−Ｊ対立遺伝子を「＋」対立遺伝子から識別する）
Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら（Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８７：７５７−７６３（１９９４））によって公表されたデータに基づき、Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ及びＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅのポリヌクレオチド配列を、ＲＥＸ−１と称されるＭｉ近くの遺伝子座で決定した。
【０１２５】
ＳＣＡＲ試験を、以下の特異的プライマー対を使用してここで述べるように実施する。
【０１２６】
配列番号３：5' AAC CGT GGA CTT TGC TTT GAC T 3'及び
配列番号４：5' TAA GAA CAG GGA CTC AGA GGA TGA 3'。
【０１２７】
Ｔｙ遺伝子座についてここで述べるＳＣＡＲアッセイと同様に、Ｍｉ遺伝子座のＳＣＡＲアッセイＮｏ．１も多型ＴａｑＩ制限酵素認識部位を使用する。多型は、ＰＣＲ産物を制限酵素ＴａｑＩで消化することによって明らかにすることができる。Ｍｉ−１対立遺伝子又はＭｉ−Ｊ対立遺伝子が同型接合として存在する場合、又はＭｉ−１対立遺伝子とＭｉ−Ｊ対立遺伝子が異型接合として存在する場合は、これらの対立遺伝子はＴａｑＩ制限認識部位を含むので、５９５塩基対のＰＣＲアンプリコンは１４５と４５０塩基対断片に消化される。「＋」型対立遺伝子が同型接合として存在する場合は、５９５塩基対のＰＣＲアンプリコンはＴａｑＩ酵素によって消化されない。異型接合試料（Ｍｉ−１／＋又はＭｉ−Ｊ／＋）については、ＰＣＲ反応の約半分が１４５と４５０塩基対の断片に消化され、ＰＣＲ反応の約半分は消化されない。電気泳動によって分離したとき、これらの異型接合は１４５、４５０及び５９５塩基対の長さの３つの断片を有する。このようにして、抵抗性対立遺伝子（Ｍｉ−１又はＭｉ−Ｊ）が存在するかどうか、又は感受性対立遺伝子（「＋」）が存在するかどうか、又は抵抗性対立遺伝子（Ｍｉ−１又はＭｉ−Ｊ）と感受性対立遺伝子（「＋」）が異型接合として存在するかどうかを判定することができる。
【実施例７】
【０１２８】
Ｍｉ遺伝子座のＳＣＡＲ試験Ｎｏ．２（Ｍｉ−ＪをＭｉ−１又は「＋」対立遺伝子から識別する）
上記実施例５で述べたＳＣＡＲ試験はＭｉ−１対立遺伝子とＭｉ−Ｊ抵抗性対立遺伝子を識別することができないので、ＲＥＸ−１マーカーにおけるもう１つのＳＣＡＲアッセイを開発した。この試験は、このマーカー遺伝子座のＭｉ−１、Ｍｉ−Ｊ及び「＋」対立遺伝子を配列決定することによって開発された。残念ながら、３つの対立遺伝子の各々について異なる多型を有する単一ヌクレオチドは存在しなかった。一塩基多型はＮｌａＩＩＩと呼ばれる制限酵素認識部位において発見された。明細には、Ｍｉ−Ｊ対立遺伝子はこの認識部位を含んだが、Ｍｉ−１及び「＋」対立遺伝子はこの認識部位を含まなかった。
【０１２９】
この多型に基づき、第二のＳＣＡＲアッセイを開発し、これは、以下の特異的プライマー対を使用してここで述べるように実施することができる：
配列番号５：5' CTA CGG AGG ATG CAA ATA GAA
配列番号６：5' AAT CAT TAT TGT CAC ACT TCC CC。
【０１３０】
ＰＣＲ反応後、反応物をここで述べる方法により制限酵素ＮｌａＩＩＩで消化することによって多型を明らかにすることができる。Ｍｉ−Ｊ対立遺伝子が存在する場合は、２８２塩基対のアンプリコンは１２４と１５８塩基対の断片に消化される。Ｍｉ−１対立遺伝子又は「＋」対立遺伝子が存在する場合は、アンプリコンはＮｌａＩＩＩ酵素によって消化されない。異型接合（Ｍｉ−Ｊ／Ｍｉ−１又はＭｉ−Ｊ／＋）は３つの断片すべて（１２４、１５８及び２８２塩基対）を有する。Ｍｉ遺伝子座の両方のＳＣＡＲアッセイを使用して（実施例５及び６）、３つの可能な対立遺伝子（Ｍｉ−１、Ｍｉ−Ｊ又は「＋」）のどの組合せが存在するかに関わらず、Ｍｉ遺伝子座の遺伝子型を決定することができる。
【実施例８】
【０１３１】
Ｍｉ及びＴｙ遺伝子座で最も有効な対立遺伝子を組み合わせるための交雑プロトコール 各々密接に連鎖する対象固定遺伝子を含む２つの親系統から出発して、当業者は、これらの対象形質をシス相で組み合わせるという目標を達成するためにいくつかの可能な戦略があることを認識する。これらの戦略はすべて、しかしながら、Ｆ１雑種を作製するために各々対象形質を含む親系統を交雑することから始まる。好ましくは、親系統は各々、対象形質の１つについて固定されているべきである。Ｆ１雑種は自家受粉させて分離Ｆ２個体群を作出するか、又はいずれかの親系統に戻し交配することができる。交雑戦略に関わりなく、当業者は、Ｆ１植物が減数分裂の過程を通して配偶子を生産するとき対象新規組換え体が作出できることを認識する。
【０１３２】
いかなる意味においても限定ではなく、Ｍｉ及びＴｙ遺伝子をシス相で組み合わせるためにＦ２戦略を採用した。明細には、近交系交雑系統ＦＩＲ１６−１７６とＦＤＲ１６−２０４５の間の交雑を１９９７年秋にＮｉｍｅｓ，Ｆｒａｎｃｅにおいて実施した。これらの交雑系統はいずれもＳｅｍｉｎｉｓ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｓｅｅｄｓ，Ｉｎｃ．のトマト育種プログラムからである。近交系ＦＩＲ１６−１７６は、Ｔｙ遺伝子座に感受性対立遺伝子「＋」を含み、近くのＭｉ遺伝子座にＭｉ−１対立遺伝子を含む。米国特許第６，４１４，２２６号の対象である近交系ＦＤＲ１６−２０４５は、Ｔｙ遺伝子座にＴｙ−１対立遺伝子を含み、近くのＭｉ遺伝子座にＭｉ−Ｊ対立遺伝子を含む。Ｎｏ．１６５２８１７と称されるＦ１植物は、それ故、親遺伝子型を表わす、Ｔｙ及びＭｉ遺伝子座の対立遺伝子のシス対合の対を含む。これらの対合は一般に、共に下線を付しており、下線はそれらの遺伝子座が遺伝的に連鎖することを表わす。例えば、Ｆ１植物はシス対合の「＋」Ｍｉ−１及びＴｙ−１ Ｍｉ−Ｊを有する。親が減数分裂を受けたときに組換えが起こりうるはずであるが、これらの系統の各々がＭｉ及びＴｙ遺伝子座に固定されていたため有効な組換えは起こらなかった。
【０１３３】
Ｆ１植物Ｎｏ．１６５２８１７を自家受粉させたＦ２個体群を作出した。Ｆ１植物は減数分裂を通して配偶子を生産したので、それらの配偶子の大部分はもとの親からの対立遺伝子組合せ（「＋」Ｍｉ−１及びＴｙ−１ Ｍｉ−Ｊ）を保持する。Ｔｙ遺伝子座とＭｉ遺伝子座の遺伝距離が、組換え体配偶子（「＋」Ｍｉ−Ｊ及びＴｙ−１ Ｍｉ−１）が生産される相対頻度を決定する。Ｔｙ及びＭｉ遺伝子座は近接して位置し、数多くの研究者が６番染色体のこの領域では組換えが抑制されることを示しているので、当業者は、組換え型配偶子の数は親配偶子と比較して非常に低いことを予測する。
【０１３４】
その後、Ｔｙ−１及びＭｉ−１対立遺伝子をシス相で有する組換え体を特定するために、ここで述べる一連の分子試験を開発した。というのは、表現型病理学スクリーニングを通してこのシス対合を特定するには何年にもわたる多世代スクリーニングを行わなければ不可能だったからである。当業者は、このシス対合の表現型特定が可能であることを認識するが、ここで述べる分子特定法が対立遺伝子のこの有用な組合せを特定するためのより速く且つはるかに効率的な方法であることは明白である。
【０１３５】
２０００年１月に、Ｆ１雑種１６５２８１７の自家受粉に由来する５０４のＦ２種子をＤＮＡ抽出（実施例３）のために試料採取し、ここで述べる方法（実施例４及び５）を用いて各々の試料についてＴｙ遺伝子座の遺伝子型を決定した。１２７植物が感受性対立遺伝子「＋」について同型接合であり、これらの植物は廃棄した。Ｔｙ−１対立遺伝子について異型接合（Ｔｙ−１／「＋」）であるか又はＴｙ−１対立遺伝子について同型接合（Ｔｙ−１／Ｔｙ−１）である残りの３７７植物をここで述べる方法（実施例４、６、７）によって分析し、近くのＭｉ遺伝子座の遺伝子型を決定した。１個の好ましい対立遺伝子を異型接合（Ｔｙ−１又はＭｉ−１のいずれか）として含み、且つ他の好ましい対立遺伝子（Ｔｙ−１又はＭｉ−１のいずれか）が同型接合として固定されている植物を、Ｔｙ−１及びＭｉ−１対立遺伝子をシス相で有するとして選抜した。
【０１３６】
６番染色体のこの領域では組換えが抑制されることが広く文書で記録されているので、組換え体は予想されなかった。それ故、８個のそのような組換え体が発見されたことは意外であった。Ｋａｌｏｓｈｉａｎら（（１９８８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５７：３７６−３８５）は、ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ対ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍの交雑を実施したとき、ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ対ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍの交雑と比べてこの領域での組換え頻度が約８倍高いことを示した。組換え体の比較的高い回収率についてのこの可能な説明をもってしても、実施した交雑はＫａｌｏｓｈｉａｎら（同上）のｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ対ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍではなくこのゲノム領域内のｈｉｒｓｕｔｕｍとｐｅｒｕｖｉａｎｕｍのＤＮＡを含むので、前記事象はやはり予想外であった。
【０１３７】
Ｍｉ−１及びＴｙ−１遺伝子導入は、別々に遺伝子ひきずりを引き起こすことが知られている。それ故、発見された８個の組換え体の各々はおそらくユニークな組換え事象であるので、これはこれらの形質の移入に付随する遺伝子ひきずりを低下させる好機であった。多くの園芸的評価を実施し、これらの評価から、改良に向けてＮｏ．２０とＮｏ．２５１と称する２つの植物を選抜した。これらの植物はいずれもＴｙ−１対立遺伝子について異型接合（Ｔｙ−１／「＋」）であり、Ｍｉ−１対立遺伝子について同型接合であった。これらの植物はいずれも、それ故、Ｔｙ−１対立遺伝子とＭｉ対立遺伝子をシス相で含むが、この好ましいシス相の組合せは固定されていない。
【０１３８】
２０００年の春に、Ｆ２植物Ｎｏ．２０及びＮｏ．２５１を自家受粉させたＦ３個体群を作出した。これらの個体群をそれぞれ９７．５２８１．Ｍ２０及び９７．５２８１．Ｍ２５１と称した。ここで述べる方法（実施例３から７）を用いて、Ｔｙ−１及びＭｉ−１対立遺伝子を両方の事象について同型接合状態で固定した。
【０１３９】
分子試験が抵抗性表現型を正確に予測することを保証するために、植物Ｎｏ．２０及びＮｏ．２５１に由来するこれらの固定系統（９７．５２８１．Ｍ２０．Ｍ．１．１、９７．５２８１．Ｍ２５１．Ｍ．１．１、９７．５２８１．Ｍ２５１．Ｍ２．１）を、ここで述べる方法（実施例１）に従ってネコブセンチュウ抵抗性に関して試験した。表２は、ユニークシス配置のＴｙ−１及びＭｉ−１対立遺伝子を有するこれらの系統がネコブセンチュウに対して高度抵抗性であることを示している。
【０１４０】
これらの同じ系統（９７．５２８１．Ｍ２０．Ｍ．１．１、９７．５２８１．Ｍ２５１．Ｍ．１．１、９７．５２８１．Ｍ２５１．Ｍ２．１）を、ここで述べる方法（実施例２）を用いて、Ａｎｔａｌｙａ，ＴｕｒｋｅｙにおいてＴＹＬＣＶについても試験した。ユニークシス配置のＴｙ−１及びＭｉ−１対立遺伝子を有するこれらの系統はＴＹＬＣＶに対して抵抗性であった。
【０１４１】
シス相のＴｙ−１及びＭｉ−１の有効な抵抗性対立遺伝子のこの組合せは、トマト育種家が、遺伝子ひきずりを隠すため、あるいはＯｉｄｉｕｍ又はＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ又はこの病害クラスター内のまだ発見されていない抵抗性対立遺伝子についての付加的な抵抗性遺伝子を送達するための第二の近交系親を選択する自由を保持しながら、ＴＹＬＣＶに抵抗性であり、線虫に高度抵抗性であるトマト雑種を作出することを可能にする。この新規アプローチは、トマト栽培家に、専ら防除のための化学農薬に頼ることなく、あるいはトランスジェニック抵抗性戦略に基づくことなく、許容される園芸品質で、多くの病害病原体を防除する可能性を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのゲノム内に少なくとも１個のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）抵抗性対立遺伝子及び少なくとも１個のネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を含むリコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）植物であって、前記抵抗性対立遺伝子が１つの染色体上の異なる座に相引相で存在すること、及び前記植物がＴＹＬＣＶに対して抵抗性であること、及び前記植物が、アレニアネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ａｒｅｎａｒｉａ）、サツマイモネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）及びジャワネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ）から成る群より選択される少なくとも１つのネコブセンチュウ種に対して高度に抵抗性であることを特徴とする、リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）植物。
【請求項２】
約０．１未満のネコブセンチュウ抵抗性スコアを有する、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
約０．０５未満のネコブセンチュウ抵抗性スコアを有する、請求項１に記載の植物。
【請求項４】
約０．０４未満のネコブセンチュウ抵抗性スコアを有する、請求項１に記載の植物。
【請求項５】
約０．０３未満のネコブセンチュウ抵抗性スコアを有する、請求項１に記載の植物。
【請求項６】
前記ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子がＴｙ−１と称される対立遺伝子である、請求項１に記載の植物。
【請求項７】
前記ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子がＭｉ−１と称される対立遺伝子である、請求項１に記載の植物。
【請求項８】
前記染色体が６番染色体である、請求項１に記載の植物。
【請求項９】
前記ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及び前記ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子が非トランスジェニックである、請求項１に記載の植物。
【請求項１０】
前記ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及び前記ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子が、それぞれリコペルシコン・チレンセ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｃｈｉｌｅｎｓｅ）及びリコペルシコン・ペルヴィアヌム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）からである、請求項１に記載の植物。
【請求項１１】
請求項１に記載の植物の果実又は種子。
【請求項１２】
請求項１に記載の植物を、前記ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子を持たず、且つ前記ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を持たない近交系植物と交雑する方法によって生産される雑種リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）植物。
【請求項１３】
前記ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及び前記ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子の両方が異型接合である、請求項１に記載の雑種リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）植物。
【請求項１４】
良好な園芸特性を有する、請求項１３に記載の植物。
【請求項１５】
前記ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及び前記ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を付与する野生トマト種の遺伝子移入に通常付随する測定可能な遺伝子引きずり（ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｒａｇ）を有さない、請求項１３に記載の植物。
【請求項１６】
前記遺伝子引きずり作用が野生種リコペルシコン・チレンセ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｃｈｉｌｅｎｓｅ）に関連するものである、請求項１５に記載の植物。
【請求項１７】
前記遺伝子引きずり作用が野生種リコペルシコン・ペルヴィアヌム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）に関連するものである、請求項１５に記載の植物。
【請求項１８】
自己壊死、より長い節間、より小さな果実、より少ない結実及び園芸的に劣る植物構造から成る病徴群から選択される遺伝子引きずり病徴を有さない、請求項１５に記載の植物。
【請求項１９】
前記ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及び前記ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子の座が前記染色体上の同じ病害抵抗性クラスター内に生じる、請求項１３に記載の植物。
【請求項２０】
前記クラスター内に少なくとも１個の付加的な病害抵抗性対立遺伝子を含み、前記付加的病害抵抗性対立遺伝子が、前記ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及び前記ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を有する前記染色体に対してトランス相の染色体上に位置する、請求項１９に記載の植物。
【請求項２１】
前記付加的病害抵抗性対立遺伝子が、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）レース２、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）レース５及びオイディウム（Ｏｉｄｉｕｍ）から成る群より選択される病害に対する抵抗性を与える、請求項２０に記載の植物。
【請求項２２】
もう１つ別のリコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）植物との交雑における親としての、請求項１に記載の植物の使用。
【請求項２３】
請求項１に記載の近交系の商業的リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）植物。
【請求項１】
そのゲノム内に少なくとも１個のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）抵抗性対立遺伝子及び少なくとも１個のネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を含むリコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）植物であって、前記抵抗性対立遺伝子が１つの染色体上の異なる座に相引相で存在すること、及び前記植物がＴＹＬＣＶに対して抵抗性であること、及び前記植物が、アレニアネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ａｒｅｎａｒｉａ）、サツマイモネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）及びジャワネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ）から成る群より選択される少なくとも１つのネコブセンチュウ種に対して高度に抵抗性であることを特徴とする、リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）植物。
【請求項２】
約０．１未満のネコブセンチュウ抵抗性スコアを有する、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
約０．０５未満のネコブセンチュウ抵抗性スコアを有する、請求項１に記載の植物。
【請求項４】
約０．０４未満のネコブセンチュウ抵抗性スコアを有する、請求項１に記載の植物。
【請求項５】
約０．０３未満のネコブセンチュウ抵抗性スコアを有する、請求項１に記載の植物。
【請求項６】
前記ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子がＴｙ−１と称される対立遺伝子である、請求項１に記載の植物。
【請求項７】
前記ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子がＭｉ−１と称される対立遺伝子である、請求項１に記載の植物。
【請求項８】
前記染色体が６番染色体である、請求項１に記載の植物。
【請求項９】
前記ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及び前記ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子が非トランスジェニックである、請求項１に記載の植物。
【請求項１０】
前記ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及び前記ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子が、それぞれリコペルシコン・チレンセ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｃｈｉｌｅｎｓｅ）及びリコペルシコン・ペルヴィアヌム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）からである、請求項１に記載の植物。
【請求項１１】
請求項１に記載の植物の果実又は種子。
【請求項１２】
請求項１に記載の植物を、前記ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子を持たず、且つ前記ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を持たない近交系植物と交雑する方法によって生産される雑種リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）植物。
【請求項１３】
前記ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及び前記ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子の両方が異型接合である、請求項１に記載の雑種リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）植物。
【請求項１４】
良好な園芸特性を有する、請求項１３に記載の植物。
【請求項１５】
前記ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及び前記ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を付与する野生トマト種の遺伝子移入に通常付随する測定可能な遺伝子引きずり（ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｒａｇ）を有さない、請求項１３に記載の植物。
【請求項１６】
前記遺伝子引きずり作用が野生種リコペルシコン・チレンセ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｃｈｉｌｅｎｓｅ）に関連するものである、請求項１５に記載の植物。
【請求項１７】
前記遺伝子引きずり作用が野生種リコペルシコン・ペルヴィアヌム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）に関連するものである、請求項１５に記載の植物。
【請求項１８】
自己壊死、より長い節間、より小さな果実、より少ない結実及び園芸的に劣る植物構造から成る病徴群から選択される遺伝子引きずり病徴を有さない、請求項１５に記載の植物。
【請求項１９】
前記ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及び前記ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子の座が前記染色体上の同じ病害抵抗性クラスター内に生じる、請求項１３に記載の植物。
【請求項２０】
前記クラスター内に少なくとも１個の付加的な病害抵抗性対立遺伝子を含み、前記付加的病害抵抗性対立遺伝子が、前記ＴＹＬＣＶ抵抗性対立遺伝子及び前記ネコブセンチュウ抵抗性対立遺伝子を有する前記染色体に対してトランス相の染色体上に位置する、請求項１９に記載の植物。
【請求項２１】
前記付加的病害抵抗性対立遺伝子が、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）レース２、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）レース５及びオイディウム（Ｏｉｄｉｕｍ）から成る群より選択される病害に対する抵抗性を与える、請求項２０に記載の植物。
【請求項２２】
もう１つ別のリコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）植物との交雑における親としての、請求項１に記載の植物の使用。
【請求項２３】
請求項１に記載の近交系の商業的リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）植物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−１８３３０８（Ｐ２００９−１８３３０８Ａ）
【公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１２７２０４（Ｐ２００９−１２７２０４）
【出願日】平成２１年５月２７日（２００９．５．２７）
【分割の表示】特願２００５−３３９２８（Ｐ２００５−３３９２８）の分割
【原出願日】平成１７年２月１０日（２００５．２．１０）
【出願人】（５００１９５０３５）セミニス・ベジタブル・シーズ・インコーポレイテツド (17)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｅｍｉｎｉｓ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｓｅｅｄｓ，Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月２７日（２００９．５．２７）
【分割の表示】特願２００５−３３９２８（Ｐ２００５−３３９２８）の分割
【原出願日】平成１７年２月１０日（２００５．２．１０）
【出願人】（５００１９５０３５）セミニス・ベジタブル・シーズ・インコーポレイテツド (17)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｅｍｉｎｉｓ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｓｅｅｄｓ，Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
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