フラビウイルス科ファミリーのウイルスに対して抗ウイルス特性を有するキメラペプチド分子
本発明は、フラビウイルス科ファミリーのウイルスのＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼの活性化を阻害する少なくとも１つの部分及び細胞透過性部分を含有する一次構造を有し、ウイルスによる感染を阻害するか、又は軽減することができるキメラペプチドに関する。本発明はまた、前記キメラペプチドを含有し、フラビウイルス科ファミリーのウイルスが原因である感染を予防及び／又は治療するための医薬化合物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、製薬業界に関し、より具体的には、一次構造がフラビウイルス科ファミリーのウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害する少なくとも１個の部分を保持するキメラペプチドに関し、これらのキメラペプチドは細胞透過性部分も含み、ウイルス感染を阻害又は軽減することができる。本発明はまた、フラビウイルス科ファミリーのウイルスが原因の感染を予防及び／又は治療するためのキメラペプチドを含有する医薬化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラビウイルス科ファミリーは、３種類の属、フラビウイルス、ヘパシウイルス及びペスチウイルスの１種に属するエンベロープ型プラス一本鎖ＲＮＡウイルスによって構成される。フラビウイルス属は、７０種を上回るウイルスを含み、それらの多くがヒト及びその他の種の関連疾患を引き起こす。この属の構成要素は、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）、デング熱ウイルス（ＤＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）及びその他である。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、ヘパシウイルスの原型である。ペスチウイルス属の構成要素として、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、ボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）及びその他が発見されている。
【０００３】
フラビウイルス科ファミリーの異なる属に属するウイルスは、抗原の交差反応を示さず、異なる生物学的特性を示すが、ウイルス粒子形態、ゲノム組成及び複製方法などの面では明らかな類似性を示す（Ｌｅｙｓｓｅｎ，Ｐ．、Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ，Ｅ．、Ｎｅｙｔｓ，Ｊ．２０００「フラビウイルス科による感染治療の展望（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ．）」Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．、３：６７〜８２；Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．１９９６．「フラビウイルス科：ウイルス及び複製（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」９３１〜９６０頁；Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ及びＰ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ編、Ｆｉｅｌｄｓ ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３版、１巻、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．；Ｗｅｓｔａｗａｙ，Ｅ．Ｇ．１９８７．「フラビウイルス複製方法（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ）」Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３３：４５〜９０）。
【０００４】
ＨＣＶは、世界的に重要な健康問題となっている。ＷＨＯによると、世界人口の約３％がこのウイルスに感染しており、慢性的キャリアの１億７０００万人超が肝硬変及び／又は肝臓癌を発症する危険があることが指摘されている（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｐａｎｅｌ．ＥＡＳＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ、Ｐａｒｉｓ，２６〜２８ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９９９、Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ．Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．、１９９９、３０、９５６）。毎年約３〜４００万例のＨＣＶによる新たな感染が世界中で発生している（Ｔａｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｐａｕｓｅ，Ａ．、Ｓｈｉ，Ｙ．＆ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１、８６７〜８８１）。感染した患者の少なくとも８５％が慢性的感染に進行する（Ａｌｔｅｒ，Ｍ．Ｊ．、Ｅ．Ｅ．Ｍａｓｔ、Ｌ．Ａ．Ｍｏｙｅｒ及びＨ．Ｓ．Ｍａｒｇｏｌｉｓ．１９９８．Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ．ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．１２：１３〜２６）。慢性Ｃ型肝炎は、症候性にせよ無症候性にせよ肝硬変及び／又は癌になることが多い。１０〜２０年間実施した追跡研究によって、患者の２０〜３０％が肝硬変を発症し、これらの患者の１〜５％がさらに１０年後には癌を発症し得ることが示された（Ｄｕｔｔａ，Ｕ．、Ｊ．Ｋｅｎｃｈ，Ｋ．Ｂｙｔｈ，Ｍ．Ｈ．Ｋｈａｎ，Ｒ．Ｌｉｎ，Ｃ．Ｌｉｄｄｌｅ及びＧ．Ｃ．Ｆａｒｒｅｌｌ．１９９８．「肝細胞の増殖及び肝細胞癌の発症：慢性Ｃ型肝炎における症例対照研究（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａ ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ．）」Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２９：１２７９〜１２８４；Ｐｏｎｔｉｓｓｏ，Ｐ．、Ｃ．Ｂｅｌｌｕｃｏ，Ｒ．Ｂｅｒｔｏｒｅｌｌｅ，Ｌ．Ｄｅ Ｍｏｌｉｎｅｒ，Ｌ．Ｃｈｉｅｃｏ Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｄ．Ｎｉｔｔｉ，Ｍ．Ｌｉｓｅ及びＡ．Ａｌｂｅｒｔｉ．１９９８．「ヒト肝細胞癌に関係するＣ型肝炎ウイルス感染：コーカサス人患者におけるｐ５３異常との関連性の欠如（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｌａｃｋ ｏｆ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐ５３ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｃａｕｃａｓｉａｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ．）」Ｃａｎｃｅｒ ８３：１４８９〜１４９４）。合衆国ではＨＣＶが原因の年間死亡数は、２００８年で３５０００件に至り得る見込みである（Ｄｕｔｔａ，Ｕ．、Ｊ．Ｋｅｎｃｈ、Ｋ．Ｂｙｔｈ、Ｍ．Ｈ．Ｋｈａｎ、Ｒ．Ｌｉｎ、Ｃ．Ｌｉｄｄｌｅ及びＧ．Ｃ．Ｆａｒｒｅｌｌ．１９９８．「肝細胞の増殖及び肝細胞癌の発症：慢性Ｃ型肝炎における症例対照研究（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａ ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ．）」Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２９：１２７９〜１２８４；Ｐｏｎｔｉｓｓｏ，Ｐ．、Ｃ．Ｂｅｌｌｕｃｏ、Ｒ．Ｂｅｒｔｏｒｅｌｌｅ、Ｌ．Ｄｅ Ｍｏｌｉｎｅｒ、Ｌ．Ｃｈｉｅｃｏ Ｂｉａｎｃｈｉ、Ｄ．Ｎｉｔｔｉ、Ｍ．Ｌｉｓｅ及びＡ．Ａｌｂｅｒｔｉ．１９９８．「ヒト肝細胞癌に関係するＣ型肝炎ウイルス感染：コーカサス人患者におけるｐ５３異常との関連性の欠如（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｌａｃｋ ｏｆ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐ５３ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｃａｕｃａｓｉａｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ．）」Ｃａｎｃｅｒ ８３：１４８９〜１４９４）。
【０００５】
現在、ＦＤＡによって認可された抗ＨＣＶ治療は、インターフェロン単独療法及びインターフェロン−リバビリン併用療法である（Ｄｙｍｏｃｋ，Ｂ．Ｗ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｄｒｕｇｓ ２００１、６（１）、１３及びその中の参考文献）。最近、ペグ化されたインターフェロン変種の使用が承認され、これらの治療の治療効果が増大しているが、まだ理想からは遠くかけ離れている。この疾患は重篤であるため、より効果的な新規治療が必要とされている。
【０００６】
ヒトに感染するフラビウイルスは、マダニ及び蚊などの節足動物によって伝染し、そのことがこれらの疾患の根絶を困難にしている（Ｍｏｎａｔｈ，Ｔ．Ｐ．及びＦ．Ｘ．Ｈｅｉｎｚ．１９９６．Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ、９６１〜１０３４頁、Ｉｎ Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ及びＰ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ編、Ｆｉｅｌｄｓ ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３版、１巻、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．）。黄熱病は、今もなお出血熱の重要な原因であり、ワクチンが既に使用できるにもかかわらず、死亡率は５０％と高い。
【０００７】
デングウイルスは、熱帯地方で大流行しており、その再出現は、ますます世界的な公衆衛生問題である。年間約１億のデングウイルス感染が起こっており、２５億人が流行地域に居住している、と推定される（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｄ．Ｊ．１９９８．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１１、４８０〜４９６；Ｍｏｎａｔｈ，Ｔ．Ｐ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１、２３９５〜２４００）。１９９０〜１９９８の期間、ＷＨＯに報告されたデング出血熱（ＤＨＦ）の平均症例数は、１５０００例の死亡を含めて１年当たり５１４１３９例であったが、実際の罹患数は数倍であると考えられる。しかし、ワクチンも特異的な抗ウイルス治療薬も市販されていない。デングウイルス複合体は、遺伝的及び抗原的に関連した４種類の異なるウイルス又は血清型（ＶＤ１〜ＶＤ４）によって構成されている。ＤＶは、蚊、主にネッタイシマカによってヒトに伝染する。感染は、無症候性及び良性から未分化型熱性疾患又はＤＨＦのようなより重度の徴候及び致死性デングショック症候群（ＤＳＳ）まで様々な異なる臨床徴候を引き起こす。最も重度の臨床徴候は、２種類の異なる血清型の連続感染に関連していることが多い（Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．「デングウイルスの中和及び抗体依存性増強（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓｅｓ．）」Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．６０：４２１〜６７、４２１〜４６７、２００３．Ｈａｍｍｏｎ ＷＭｃ．「フィリピン及びタイの子供達の新規出血熱（Ｎｅｗ ｈａｅｍｏｒｒａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈａｉｌａｎｄ．）」Ｔｒａｎｓ Ａｓｓｏｃ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ １９６０；７３：１４０〜１５５）。疫学的研究が実施され、異なる血清型による連続感染が重度の疾患の危険因子である証拠が示された（Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．「デングウイルスの中和及び抗体依存性増強（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓｅｓ．）」Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．６０：４２１〜６７、４２１〜４６７、２００３。Ｈａｍｍｏｎ ＷＭｃ．「フィリピン及びタイの子供達における新規出血熱（Ｎｅｗ ｈａｅｍｏｒｒａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈａｉｌａｎｄ．）」Ｔｒａｎｓ Ａｓｓｏｃ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ １９６０；７３：１４０〜１５５）。この現象は、「抗体依存性増強（ＡＤＥ））の理論によって説明されており、感染力の増加が感染細胞のＦＣ受容体によって媒介されるウイルスのより効果的な細胞侵入と関連することを指摘している（Ｈａｌｓｔｅａｄ ＳＢ．「デング熱の病変形成：分子生物学への挑戦（Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ：ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｔｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．）」Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８；２３９：４７６〜４８１）。
【０００８】
その他のフラビウイルスは、世界的なウイルス性脳炎の主な原因であるＪＥＶである。アジアでは１年間に約５００００例が生じ、死亡率は３０％と高く、症例の３０％において長期間持続する神経性疾患が生じる（Ｋａｌｉｔａ，Ｊ．、及びＵ．Ｋ．Ｍｉｓｒａ．１９９８．「日本脳炎におけるＥＥＧ：臨床放射線学的関連（ＥＥＧ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ：ａ ｃｌｉｎｉｃｏｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ．）」Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ．Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．１０６：２３８〜２４３；Ｋａｌｕｚｏｖａ，Ｍ．、Ｅ．Ｅｌｅｃｋｏｖａ，Ｅ．Ｚｕｆｆｏｖａ，Ｊ．Ｐａｓｔｏｒｅｋ，Ｓ．Ｋａｌｕｚ，Ｏ．Ｋｏｚｕｃｈ及びＭ．Ｌａｂｕｄａ．１９９４．「弱毒化マダニ媒介性脳炎ウイルス変異体の復帰病原性は、推定ウイルスエンベロープタンパク質のアミノ酸配列における変化を伴わない（Ｒｅｖｅｒｔｅｄ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｍｕｔａｎｔ ｉｓ ｎｏｔ ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｄｅｄｕｃｅｄ ｖｉｒａｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．）」Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ．３８：１３３〜１４０）。
【０００９】
重症の脳炎はまた、ＴＢＥＶのようなその他のフラビウイルスによって引き起こされ、このウイルスには２種類のサブタイプ、関連死亡率が２０％である東型及び１〜２％である西型がある（Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．及びＣ．Ｗ．Ｍａｎｄｌ．１９９３．「マダニ媒介性脳炎ウイルスの分子生物学（Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ．）」ＡＰＭＩＳ １０１：７３５〜７４５）；オーストラリアにおけるマレー渓谷脳炎（ＭＶＥ）（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ，Ｊ．Ｓ．、及びＡ．Ｋ．Ｂｒｏｏｍ．１９９５．「オーストラリアのＸ疾患、マレー渓谷脳炎及びフランスの関係（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｘ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｆｒｅｎｃｈ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ．）」Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：７９〜９０）；合衆国西部におけるＳＬＥＶ並びにアフリカ、中東及び地中海で流行するＷＮＶはまた、最近合衆国で大流行した。１９９９年に合衆国に出現してから、非常に迅速に拡大し、約１５０００人が感染し、死者は６００人を上回った。しかし、現在のところ、有用なワクチンや、ＷＮＶを防御する薬物はない（ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ，Ｋ．Ｍ．、Ｐｅｎｓａｅｒｔ，Ｍ．Ｂ．及びＮａｕｗｙｎｃｋ，Ｈ．Ｊ．（２００５）「脊椎動物界における西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｔｈｅ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｗｏｒｌｄ．）」Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１５０、６３７〜６５７）。
【００１０】
出血性の徴候は、死亡率が０．５〜３％であるロシアのオムスク出血熱ウイルス（ＯＨＦＶ）及びインドのキャサヌール森林病ウイルス（ＫＦＤＶ）のようなその他のフラビウイルスによって引き起こされる（Ｍｏｎａｔｈ，Ｔ．Ｐ．及びＦ．Ｘ．Ｈｅｉｎｚ．１９９６．Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ、９６１〜１０３４頁、Ｉｎ Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ及びＰ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ編、Ｆｉｅｌｄｓ ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３版、１巻、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．）。
【００１１】
その他のフラビウイルス、跳躍病ウイルス（ＬＩＶ）は主にヒツジに感染するが、時折ヒト感染も報告されてきた（Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｍ．Ｍ．、Ｈ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＪ．Ａ．Ｍａｃｌｅｏｄ．１９９１．「人における跳躍病：忘れられた病気（Ｌｏｕｐｉｎｇ ｉｌｌ ｉｎ ｍａｎ：ａ ｆｏｒｇｏｔｔｅｎ ｄｉｓｅａｓｅ．）」Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．２３：２４１〜２４９）。
【００１２】
ペスチウイルスＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ及びＢＤＶは、動物において重大な疾患を引き起こす。これらのウイルスは、その他の宿主においてはより軽度の疾患を引き起こすが、それぞれの宿主においては、通常死に至る重度の疾患を引き起こす。しばしば、感染は、口腔鼻又は胎盤経路によって生じる。後者は、残りの家畜にとって脅威となる持続性感染に関与する（Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｓ．、Ｐ．Ｍ．Ｒｏｅｈｅ及びＧ．Ｉｂａｔａ．１９９５．「実験用ブタ及びヒツジにおけるボーダー病及び近縁ウイルス感染の比較研究（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｂｏｒｄｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐｉｇｓ ａｎｄ ｓｈｅｅｐ．）」Ｂｒ．Ｖｅｔ．Ｊ．１５１：１８１〜１８７）。
【００１３】
いくつかのフラビウイルス科ファミリーは、類似の複製方法を共有すると推定される。ウイルス複製サイクルは、宿主細胞表面へのウイルスの付着によって開始する。デングウイルスの場合、ウイルスは、細胞との相互作用の最初の部位であり得るグリコサミノグリカンに結合することが示された。ウイルスがＤＣ−ＳＩＧＮに結合することも示されたが、これらの分子の役割は、細胞表面上又はｉｎ ｖｉｖｏにおける第２の複製部位に広がったウイルスのウイルス濃度に関係するようである。ウイルスは最初に結合した後、エンドサイトーシスによるウイルスの細胞内侵入を媒介する親和性の高い受容体及び／又は共受容体と相互作用する。ＷＮＶの場合、αｖβ３インテグリンが、これらの手段として役立つことができると仮定された（Ｃｈｕ，Ｊ．Ｊ−Ｈ．及びＮｇ，Ｍ．−Ｌ．、２００４．「西ナイルウイルスと、αｖβ３インテグリンとの相互作用は、ウイルスの細胞内侵入を媒介する（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ Ｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ αｖβ３ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｍｅｄｉａｔｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｅｎｔｒｙ ｉｎｔｏ Ｃｅｌｌｓ．）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７９、５４５３３〜５４５４１）。ＨＣＶは細胞受容体ＣＤ８１に結合することも示された（Ｐｉｌｅｒｉ，Ｐ．、Ｙ．Ｕｅｍａｔｓｕ、Ｓ．Ｃａｍｐａｇｎｏｌｉ，Ｇ．Ｇａｌｌｉ、Ｆ．Ｆａｌｕｇｉ、Ｒ．Ｐｅｔｒａｃｃａ、Ａ．Ｊ．Ｗｅｉｎｅｒ、Ｍ．Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、Ｄ．Ｒｏｓａ、Ｇ．Ｇｒａｎｄｉ及びＳ．Ａｂｒｉｇｎａｎｉ．１９９８．「Ｃ型肝炎ウイルスのＣＤ８１への結合（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｔｏ ＣＤ８１．）」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：９３８〜９４１）。ウイルスが一旦エンドサイトーシス区画に局在すると、この区画のｐＨが下降してウイルスと細胞膜との間の融合プロセスを誘導し、このプロセスはウイルスエンベロープの融合タンパク質の構造変化によって媒介される。このプロセスによって、ウイルスキャプシドが細胞質中に解放され、その後細胞質にウイルスＲＮＡが放出される。
【００１４】
細胞質中で、ウイルスのゲノムＲＮＡは非翻訳５′領域（５′ＵＴＲ）を介してリボソームと相互作用し、ウイルス固有のオープンリーディングフレームの翻訳を引き起こす。このように、フラビウイルスの場合では、３種類の構造タンパク質（Ｃ、プレＭ及びＥ）及び５種類の非構造タンパク質（ＮＳ１〜５）を含む前駆体ウイルスポリタンパク質が合成される。次に、このポリタンパク質は、翻訳と同時に、及び翻訳後に修飾され、ウイルスの個々の成熟した機能的タンパク質が形成される。関連補因子と共にウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、マイナス一本鎖ＲＮＡのコピーを生成し、これはその後ゲノムプラス一本鎖ウイルスＲＮＡの合成の鋳型として使用される。複製に関連するウイルスタンパク質は、小胞体（ＥＲ）に関連すると考えられる膜状構造と結合する。
【００１５】
複製完了後、ゲノムＲＮＡはヌクレオキャプシドと結合し、未熟なウイルス粒子がＥＲの内腔に発芽し（発芽はＥＲの膜又はウイルスによって誘導された関連膜状構造で生じる）、ウイルスタンパク質を含有する脂質エンベロープによって覆われる。細胞外経路を通過して、エンベロープタンパク質はグリコシル化され、成熟して、成熟したウイルス粒子を最終的に細胞外空間へ放出する。
【００１６】
フラビウイルス科の複製には、前駆体ポリタンパク質が正確にプロセシングされるためにＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ（非構造タンパク質ＮＳ３の最初の１８０個の残基の近隣に局在している）が必要であり、これは抗ウイルス薬の設計に関して魅力的な潜在的標的を構成する（Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｋ．Ｊ．、Ｎａｌｌ，Ｔ．Ａ．、Ｓｔｏｅｒｍｅｒ，Ｍ．Ｊ．、Ｆａｎｇ，Ｎ．Ｘ．、Ｔｙｎｄａｌｌ，Ｊ．Ｄ．、Ｆａｉｒｌｉｅ，Ｄ．Ｐ．及びＹｏｕｎｇ，Ｐ．Ｒ．（２００５）「西ナイルウイルスＮＳ３プロテアーゼの部位特異的変異誘発及び動態の研究は、鍵となる酵素−基質相互作用を明らかにする（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ Ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０、２８９６〜２９０３．ＳＨＩＲＹＡＥＶ，Ｓ．Ａ．、ＲＡＴＮＩＫＯＶ，Ｂ．Ｉ．、ＣＨＥＫＡＮＯＶ，Ａ．Ｖ．、ＳＩＫＯＲＡ，Ｓ．、ＲＯＺＡＮＯＶ，Ｄ．Ｖ．、ＧＯＤＺＩＫ，Ａ．、ＷＡＮＧ，Ｊ．、ＳＭＩＴＨ，Ｊ．Ｗ．、ＨＵＡＮＧ，Ｚ．、ＬＩＮＤＢＥＲＧ，Ｉ．、ＳＡＭＵＥＬ，Ｍ．Ａ．、ＤＩＡＭＯＮＤ，Ｍ．Ｓ．及びＡｌｅｘ Ｙ．ＳＴＲＯＮＧＩＮ，Ａ．Ｙ．、２００６．「西ナイルウイルスＮＳ３プロセシングプロテイナーゼの切断標的及びＤ−アルギニンをベースにした阻害剤（Ｃｌｅａｖａｇｅ ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｄ−ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ．）」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３９３、５０３〜５１１．Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖ，Ａ．Ａ．；Ｍｉｈａｌｉｋ，Ｋ．；Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ，Ｓ．Ｍ．；Ｒｉｃｅ、Ｃ．Ｍ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０００、７４、２０４６；Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｒ．；Ｌｏｈｍａｎｎ，Ｖ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２０００、８１、１６３１．Ｍａｔｕｓａｎ，Ａ．Ｅ．、Ｋｅｌｌｅｙ，Ｐ．Ｇ．、Ｐｒｙｏｒ，Ｍ．Ｊ．、Ｗｈｉｓｓｔｏｃｋ，Ｊ．Ｃ．、Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ａ．Ｄ．及びＷｒｉｇｈｔ，Ｐ．Ｊ．（２００１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２、１６４７〜１６５６）。
【００１７】
フラビウイルスでは、このプロテアーゼは接合部、ＮＳ２Ａ／ＮＳ２Ｂ、ＮＳ２Ｂ／ＮＳ３、ＮＳ３／ＮＳ４Ａ及びＮＳ４Ｎ／ＮＳ５でのタンパク質分解性切断並びにＣ、ＮＳ３及びＮＳ４Ａでの内部切断を担う（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｔ．Ｊ．、Ｎｅｓｔｏｒｏｗｉｃｚ，Ａ．、Ａｍｂｅｒｇ，Ｓ．Ｍ．及びＲｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．（１９９３）「黄熱病ウイルスＮＳ２Ｂタンパク質の変異誘発：タンパク質分解性プロセシング、ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３複合体形成及びウイルス複製に対する影響（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ ＮＳ２Ｂ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７、６７９７〜６８０７．Ｊａｎ，Ｌ．Ｒ．、Ｙａｎｇ，Ｃ．Ｓ．、Ｔｒｅｎｔ，Ｄ．Ｗ、Ｆａｌｇｏｕｔ，Ｂ．及びＬａｉ，Ｃ．Ｊ．（１９９５）「日本脳炎ウイルス非構造タンパク質：ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３複合体のプロセシング及び異種プロテアーゼ（Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．）」Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６、５７３〜５８０．Ｌｏｂｉｇｓ，Ｍ．（１９９３）「フラビウイルスのプレメンブレン（ｐｒｅｍｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質切断及びスパイクヘテロ２量体分泌にはウイルスプロテイナーゼＮＳ３の機能が必要である（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｐｒｅｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ｓｐｉｋｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｒｅｑｕｉｒｅ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ＮＳ３．）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０、６２１８〜６２２２．Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖ，Ｖ．Ｆ．及びＣｏｍｐａｎｓ，Ｒ．Ｗ．（１９９４）「西ナイルウイルスキャプシドタンパク質細胞内型のウイルスＮＳ２Ｂ−ＮＳ３プロテアーゼによるプロセシング：ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究（Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｏｒｍ ｏｆ ｔｈｅ ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３ ｐｒｏｔｅａｓｅ：ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｔｕｄｙ．）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８、５７６５〜５７７１）。
【００１８】
ＨＣＶでは、ＮＳ３ｐｒｏは、タンパク質ＮＳ２−ＮＳ５Ｂの間に含まれる部分のウイルスポリタンパク質のタンパク質分解性プロセシングを媒介する（Ｒ．Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ、１９９９「Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３／４Ａプロテイナーゼ：異常酵素の構造及び機能及び抗ウイルス治療のための主要標的の解明（Ｔｈｅ ＮＳ３／４Ａ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ：ｕｎｒａｖｅｌｌｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｕｎｕｓｕａｌ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ａ ｐｒｉｍｅ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ．）」Ｊ．Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．６、１６５〜）。
【００１９】
ウイルスタンパク質をプロセシングするウイルス複製サイクルにおいてＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼが果たす中心的役割の他に、このタンパク質はまた、サイトゾルをプロセシングすることができるので、細胞損傷及び病理発生の様々な機構に関与することができるであろう（Ｓｈｉｒｙａｅｖ，Ｓ．Ａ．、Ｒａｔｎｉｋｏｖ，Ｂ．Ｉ．、Ｃｈｅｋａｎｏｖ，Ａ．Ｖ．、Ｓｉｋｏｒａ，Ｓ．、Ｒｏｚａｎｏｖ，Ｄ．Ｖ．、Ｇｏｄｚｉｋ，Ａ、Ｗａｎｇ，Ｊ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｗ．、Ｈｕａｎｇ，Ｚ．、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，Ｉ．、Ｓａｍｕｅｌ，Ｍ．Ａ．、Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｍ．Ｓ．及びＳｔｒｏｎｇｉｎ，Ａ．Ｙ．（２００５）「西ナイルウイルスＮＳ３プロセシングプロテイナーゼの切断標的及び（Ｄ）−アルギニンをベースにした阻害剤（Ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ（Ｄ）−ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ．）」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３９３、５０３〜５１１）。
【００２０】
こうして、ＷＮＶのＮＳ３プロテアーゼが神経ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のタンパク質分解性切断を引き起こすことが示された。ＤＶ及びＷＮＶに関して、ＮＳ３はウイルス媒介性アポトーシスの誘導に関与することが示唆された（Ｒａｍａｎａｔｈａｎ，Ｍ．Ｐ．、Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｊ．Ａ．、Ｐａｎｋｈｏｎｇ，Ｐ．、Ｃｈａｔｔｅｒｇｏｏｎ，Ｍ．、Ａｔｔａｔｉｐｐａｈｏｌｋｕｎ，Ｗ．、Ｄａｎｇ，Ｋ．、Ｓｈａｈ，Ｎ．及びＷｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．（２００５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ｄｏｉ：１０／１０１６／ｊ．ｖｉｒｏｌ．２００５．０８．０４３）。
【００２１】
最適な機能のためには、ＮＳ３プロテアーゼは、その他のウイルス性タンパク質又は補因子、フラビウイルスではＮＳ２Ｂタンパク質、並びにヘパシウイルス及びペスチウイルスではＮＳ４Ａとの相互作用が必要である。ＤＶでは、ＮＳ２Ｂが存在すると、ＮＳ３のタンパク質分解活性の３３００倍から６６００倍の増大が誘導される（Ｙｕｓｏｆ，Ｒ．、Ｃｌｕｍ，Ｓ．、Ｗｅｔｚｅｌ，Ｍ．、Ｍｕｒｔｈｙ，Ｈ．Ｍ．＆ Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ，Ｒ．、２０００．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、９９６３〜９９６９）。
【００２２】
ＨＣＶでは、ＮＳ３のＮＳ４Ａへの結合には、ＮＳ３／４Ａ、ＮＳ４Ａ／Ｂ及びＮＳ４Ｂ／５Ａでのタンパク質分解性切断が必要で、接合部ＮＳ５Ａ／Ｂでのプロセシングの効率が増大する（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ Ｒ、Ａｈｌｂｏｒｎ ＬＬ、Ｍｏｕｓ Ｊ、Ｊａｃｏｂｓｅｎ Ｈ．「Ｃ型肝炎ウイルスポリタンパク質プロセシングの動態及び構造分析（Ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９４；６：５０４５〜５０５５．Ｆａｉｌｌａ Ｃ、Ｔｏｍｅｉ Ｌ、Ｄｅ Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ Ｒ．「ＮＳ３及びＮＳ４ＡはいずれもＣ型肝炎ウイルス非構造タンパク質のタンパク質分解性プロセシングに必要である（Ｂｏｔｈ ＮＳ３ ａｎｄ ＮＳ４Ａ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｃ ｖｉｒｕｓ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９４；６：３７５３〜３７６０．Ｌｉｎ Ｃ、Ｐｒａｇａｉ ＢＭ， Ｇｒａｋｏｕｉ Ａ、Ｘｕ Ｊ、Ｒｉｃｅ ＣＭ．「Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３セリンプロテイナーゼ：トランス切断の必要性及びプロセシングの動態（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ：ｔｒａｎｓ−ｃｌｅａｖａｇｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ．）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９４；６：８１４７〜８１５７．Ｔａｎｊｉ Ｙ、Ｈｉｊｉｋａｔａ Ｍ、Ｓａｔｏｈ Ｓ、Ｋａｎｅｋｏ Ｔ、Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ Ｋ．「Ｃ型肝炎ウイルスがコードする非構造タンパク質ＮＳ４Ａはウイルスタンパク質プロセシングにおいて多種多様な機能を有する（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＳ４Ａ ｈａｓ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９５；６：１５７５〜１５８１）。ＮＳ４Ａ断片をＮＳ３ｐｒｏに１０倍モル過剰で付加すると、触媒効率係数Ｋｃａｔ／Ｋｍが約４０倍増加する（ＳＨＩＭＩＺＵ，Ｙ、ＹＡＭＡＪＩ，Ｋ．、ＭＡＳＵＨＯ，Ｙ．、ＹＯＫＯＴＡ，Ｔ．、ＩＮＯＵＥ，Ｈ．、ＳＵＤＯ，Ｋ．、ＳＡＴＯＨ，Ｓ．ｙ ＳＨＩＭＯＴＯＨＮＯ，Ｋ．１９９６．「ＮＳ５Ａ／５Ｂ部位のＣ型肝炎ウイルスＮＳ３プロテアーゼによる切断増強に必要なＮＳ４Ａの配列の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｎ ＮＳ４Ａ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ＮＳ５Ａ／５Ｂ Ｓｉｔｅ ｂｙ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ Ｐｒｏｔｅａｓｅ．）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７０、１２７〜１３２）。
【００２３】
ＮＳ３ｐｒｏ及びＤＶのＮＳ３ｐｒｏ−ＮＳ２Ｂ複合体及びＷＮＶのＮＳ３−ＮＳ２Ｂとペプチド阻害剤によって形成された複合体の結晶構造が実験的に決定された（Ｍｕｒｔｈｙ，Ｈ．Ｍ．、Ｃｌｕｍ，Ｓ．＆ Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ，Ｒ．、１９９９．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４、５５７３〜５５８０．Ｍｕｒｔｈｙ，Ｈ．Ｍ．、Ｊｕｄｇｅ，Ｋ．、ＤｅＬｕｃａｓ，Ｌ．＆ Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ，Ｒ．、２０００．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０１、７５９〜７６７．Ｅｒｂｅｌ Ｐ、Ｓｃｈｉｅｒｉｎｇ Ｎ、Ｄ’Ａｒｃｙ Ａ、Ｒｅｎａｔｕｓ Ｍ、Ｋｒｏｅｍｅｒ Ｍ、Ｌｉｍ ＳＰ、Ｙｉｎ Ｚ、Ｋｅｌｌｅｒ ＴＨ、Ｖａｓｕｄｅｖａｎ ＳＧ、Ｈｏｍｍｅｌ Ｕ．、２００６．「デングウイルス及び西ナイルウイルスのフラビウイルスＮＳ３プロテアーゼの活性化の構造的基盤（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌａｖｉｖｉｒａｌ ＮＳ３ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｆｒｏｍ ｄｅｎｇｕｅ ａｎｄ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ．）」Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）。同様に、ＨＣＶのＮＳ３ｐｒｏ及びＮＳ３ｐｒｏ／ＮＳ４Ａ複合体の結晶構造も決定された（Ｌｏｖｅ，Ｒ．Ａ．、Ｐａｒｇｅ，Ｈ．Ｅ．、Ｗｉｃｋｅｒｓｈａｍ，Ｊ．Ａ．、Ｈｏｓｔｏｍｓｋｙ，Ｚ．、Ｈａｂｕｋａ，Ｎ．、Ｍｏｏｍａｗ，Ｅ．Ｗ．、Ａｄａｃｈｉ，Ｔ．、Ｈｏｓｔｏｍｓｋａ，Ｚ．、１９９６．「Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３プロテイナーゼの結晶構造によって、トリプシン様折り畳み構造及び亜鉛結合部位の構造が明らかになる（Ｔｈｅ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｔｒｙｐｓｉｎ−ｌｉｋｅ ｆｏｌｄ ａｎｄ ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｚｉｎｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ．）」Ｃｅｌｌ．８７、３３１〜３４２．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｌ．、Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ，Ｋ．Ａ．、Ｌｉｎ，Ｃ．、Ｆｏｘ，Ｔ．、Ｄｗｙｅｒ，Ｍ．Ｄ．、Ｌａｎｄｒｏ，Ｊ．Ａ．、Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｓ．Ｐ．、Ｍａｒｋｌａｎｄ，Ｗ、Ｌｅｐｒｅ，Ｃ．Ａ．、Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｅ．Ｔ．、Ｈａｒｂｅｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．、Ｍｕｒｃｋｏ，Ｍ．Ａ．、Ｃａｒｏｎ，Ｐ．Ｒ．、Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．、１９９６．「合成ＮＳ４Ａ補因子ペプチドと結合したＣ型肝炎ウイルスＮＳ３プロテアーゼドメインの結晶構造（Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＮＳ４Ａ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ．）」Ｃｅｌｌ．８７、３４３〜５３５．Ｅｒｒａｔｕｍ ｉｎ：Ｃｅｌｌ、８９：１５９、１９９７）。
【００２４】
ＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼは、２個のベータバレル及びこれらのドメインの間に生じた隙間に位置する触媒性のＨｉｓ５１−Ａｓｐ７５−Ｓｅｒ１３５３連構造を含むキモトリプシン様折り畳み構造をとる。ＮＳ２Ｂタンパク質の結合は、ＮＳ３ｐｒｏの三次構造に大きな変化を誘導し、Ｎ及びＣ末端ドメインの両方に影響を及ぼし、位置及び二次構造部分の範囲の変化が含まれる。
【００２５】
ＮＳ３ｐｒｏ−ＮＳ２Ｂ活性化プロテアーゼとペプチド阻害剤によって形成された複合体の構造は、ＮＳ２ＢがＮＳ３ｐｒｏの周りにベルトを形成し、主に伸長した構造をとり、５本のベータ鎖を含むことを示している。
【００２６】
最初の３本の鎖は、ＮＳ３タンパク質のベータ鎖に関連し、鎖Ｔｒｐ５３−Ａｌａ５８（ＷＮＶでの番号）は、Ｎ末端ベータバレルに対応するＮＳ３ベータ鎖Ｇｌｙ２１−Ｍｅｔ２６と逆平行にあり、ベータ鎖Ｇｌｕ６７−Ｉｌｅ６８及びＡｒｇ７５−Ａｓｐ７６はＮＳ３Ｃ末端ベータバレルのベータ鎖Ｂ２ａｙＢ２ｂと平行である。
【００２７】
鎖４及び５はベータヘアピンを形成し、これはＮ末端ベータバレルのＥ１ｂ−Ｆ１ループを含有する基質結合部位と相互作用する。Ｃ末端バレルのＥ２ｂ−Ｆ２ベータヘアピンの下のＮＳ２Ｂの折り畳み構造は、基質認識に重要な残基（Ｇｌｙ１５１、Ｇｌｙ１５３及びＴｙｒ１６１）の配置をもたらすＮＳ３のこの領域での立体的変化を誘導する。残基Ｔｙｒ１６１は、Ｐ１位のアルギニンとカチオン−パイ相互作用を形成する。残基Ａｓｐ８２−Ｇｌｙ８３の主鎖カルボニル基及びＮＳ２ＢのＡｓｎ８４の原子Ｏｄ１に関連した負の静電ポテンシャルは、Ｐ２位のアルギニンのグアニジニウム基の正の電荷との相互作用に有利となる。このように、これらはＳ２部位の構造に関与している。したがって、ＮＳ３にＮＳ２Ｂが結合することによって、酵素活性部位の必須要素が完全になり、タンパク質折り畳み構造の熱力学的な安定性にも寄与する。これらの事実は、このプロテアーゼの活性化プロセスを理解するための構造的基盤となる。
【００２８】
ＨＣＶの場合、ＮＳ３活性化は、フラビウイルスのＮＳ２Ｂの鎖１と構造的に対応するＮＳ４Ａのベータ鎖Ｔｈｒ２０−Ｌｅｕ３１の結合によって媒介される（ＳＨＩＭＩＺＵ，Ｙ．、ＹＡＭＡＪＩ，Ｋ．、ＭＡＳＵＨＯ，Ｙ．、ＹＯＫＯＴＡ，Ｔ．、ＩＮＯＵＥ，Ｈ．、ＳＵＤＯ，Ｋ．、ＳＡＴＯＨ，Ｓ．ｙ ＳＨＩＭＯＴＯＨＮＯ，Ｋ．１９９６．「ＮＳ５Ａ／５Ｂ部位のＣ型肝炎ウイルスＮＳ３プロテアーゼによる切断増強に必要なＮＳ４Ａの配列の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｎ ＮＳ４Ａ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ＮＳ５Ａ／５Ｂ Ｓｉｔｅ ｂｙ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ Ｐｒｏｔｅａｓｅ．）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７０、１２７〜１３２）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
フラビウイルス科に対する抗ウイルス分子を得るために実施されている最近の取り組みの中で、ＮＳ３阻害に基づいた取り組みは、活性部位を標的とする阻害剤の開発に主に焦点が当てられている。これらの取り組みは、非常に期待が持たれるものと思われ、ＨＣＶに対する薬剤を開発する中で達成された最近の結果によって支持される。しかし、これらの経験によってまた、これらの取り組みに固有の問題が明白に示された。より重要なものの１つは、エスケープ変異体の発生である。ＲＮＡウイルスのポリメラーゼは、忠実度が比較的低く、ＨＣＶの場合、ウイルスゲノムコピー当たり１個の変異を導入する。この手段によって開発された分子は非常に強力であるが、有用な存続期間は限られているという事実が生じる。抗ウイルス治療に必要な薬剤カクテルに基づいた治療的介入が導入された。１薬剤に対して生じたエスケープ変異体は、同一活性部位を標的とするその他の薬剤の抗ウイルス活性からしばしば免れることができることも観察された。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明は、ＮＳ３プロテアーゼ活性化プロセスを阻害する概念に基づいたフラビウイルス科に対する抗ウイルス薬の設計を目的とする新規方法について記載する。この概念の鍵となる取り組みは、ＮＳ３とその補因子（ＮＳ２Ｂ又はＮＳ４Ａ）との間の相互作用を遮断し、したがって活性型ＮＳ３プロテアーゼの正確な折り畳み構造を妨害することができるペプチド性分子及び／又は薬剤を設計することである。このような分子は、補因子との相互作用に関与するＮＳ３プロテアーゼの領域に結合して、補因子と競合し、かつ／又は不活性型プロテアーゼの構造を安定化することができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の利点は、これらの分子に対するエスケープ変異体の生じる確率が、活性部位に対して基質と競合する活性型プロテアーゼの阻害剤と比較して低いことが予測されることである。本発明の分子は、ウイルス複製サイクルに必須のタンパク質−タンパク質相互作用に関与するＮＳ３の結合部位に結合し、したがって、ＮＳ３のこれらの領域で生じた変異はさらに、補因子を代償的に変異させるはずである。
【００３２】
その他の利点は、これらの分子が示す阻害活性の高い特異性である。これは、ＮＳ３上の結合部位はウイルス性プロテアーゼに本質的に特異的であり、宿主セリンプロテアーゼには存在しないという事実に基づく。さらに、宿主のリンプロテアーゼは、ＮＳ３に非常に類似した特異性を示す活性部位を有し、したがって、活性部位遮断薬剤の毒性の潜在的な標的となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】ＮＰ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化のペプチド阻害剤の設計。フラビウイルスのＮＳ２Ｂタンパク質配列の複数の配列のアラインメント。本明細書で記載した活性化阻害剤部分は、二重矢印で強調し、薄い（濃い）灰色の矢印はＮＳ３ｐｒｏのＮ末端（Ｃ末端）ベータバレルドメインに結合した部分に相当する。
【図１Ｂ】ＮＰ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化のペプチド阻害剤の設計。フラビウイルスのＮＳ２Ｂ−ＮＳ３ｐｒｏ複合体の３次元構造モデル。ＮＳ３ｐｒｏのＮ末端ベータバレルドメインに結合したＤＶ２のＮＳ２ＢのＤ５０−Ｅ６２部分及びＣ末端ドメインに結合したＤＶ２のＮＳ２ＢのＳ７０−Ｇ８２部分を強調している。
【図１Ｃ】ＮＰ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化のペプチド阻害剤の設計。ＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化阻害部分Ｄ５０−Ｅ６２及びＳ７０−Ｉ８６−ＧＧＧＧＲＲ。後のペプチドのＣ末端伸長部分は、プロテアーゼの活性部位に結合し、プロテアーゼとその基質との相互作用を遮断する。
【図１Ｄ】ＮＰ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化のペプチド阻害剤の設計。不活性型立体構造のＮＳ３ｐｒｏ（ＮＳ２Ｂを有さないタンパク質の構造）及び本発明のコンピュータによって設計されたペプチドによって形成された複合体のモデル。
【図２】ベロ細胞におけるデング２ウイルスによる感染の阻害のアッセイ。Ａ：ウイルスを細胞に添加する前にプレインキュベートした、及びプレインキュベートしなかったペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの存在によるプラークの数の減少割合。Ｂ：プレインキュベートした（ｐｒｅ）、及びプレインキュベートしなかった（ｎｏ ｐｒｅ）様々な濃度のペプチドＴＡＴ及びＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの抗ウイルス活性のアッセイ。
【図３】ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの抗ウイルス活性に対するインキュベーション時間の影響。ＰＸ１：関連のない陰性対照ペプチド（関連のない配列とのＴＡＴペプチド融合物、Ｐ１０：ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴ（ＤＶのＮＳ２ＢのペプチドとのＴＡＴ融合物、表１のペプチド番号１）。アッセイしたプレインキュベーション時間は、０、３０、６０及び１８０分であった。
【図４】ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの抗ウイルス活性に対する内部移行の役割。Ａ：ペプチドと共にプレインキュベーションした後、ウイルスを細胞に添加した時点でペプチドは培地中に残存している。Ｂ：ペプチドは、ウイルスを細胞に添加する前に様々な洗浄によって培地から回収する。ｐＮＲ＋ＴＡＴ：表１のペプチド１８番。ｐＮＲ＋ＴＡＴペプチドは、実験の陰性対照である。その一次構造は、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの類似体で、［Ｉ］部分はペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴと同一のアミノ酸組成を有するが、配列は入れ替わっていた（表１のペプチド１８）。
【図５】ペプチドの抗ウイルス活性に対する固有の透過性ペプチド及びＥＲ保持シグナルの効果。ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴ：表１のペプチド１、ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ｐＰ２：表１のペプチド２、細胞透過性部分はペネトラチンである。ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ｐＲＲ：表１のペプチド３、細胞透過性ペプチドとしてのデカアルギニン、ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴ＋ＫＤＥＬ：表１のペプチド４、ｐＮＲ＋ＴＡＴ：表１のペプチド１８、陰性対照：ＮＳ２Ｂｄｅｎ２、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの部分［Ｉ］。
【図６】同種及び異種のＤＶの血清型に対するペプチドの抗ウイルス活性。ペプチドの抗ウイルス活性は、ＶＤ１（Ａ）、ＶＤ３（Ｂ）及びＶＤ２（Ｃ）の存在下でウイルスプラークの数の減少によって試験した。ロゼッタ：ＤＶ２のＮＳ３ｐｒｏのＮ末端ドメインに結合するようにコンピュータによって設計されたペプチド（表１のペプチド５）；ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ｐｏｌｉＲ：表１のペプチド３、細胞透過性ペプチドとしてのデカアルギニン；ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴ：表１のペプチド１；ＮＳ２Ｂｄｅｎ１＋ＴＡＴ：表１のペプチド６、ＮＳ２Ｂｐｅｒｍｕｔａｄｏ＋ＴＡＴ；表１のペプチド１８、実験の陰性対照。ＮＳ２Ｂｐｅｒｍｕｔａｄｏ＋ＴＡＴの一次構造はペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの類似体であり、［Ｉ］部分は、ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴと同一なアミノ酸組成を有するが、この配列は入れ替わっていた。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明では、フラビウイルス科による感染を阻害し、一次構造が以下の式によって記載することができるキメラペプチド様分子を記載する。
［Ｐ］−［Ｌ１］−［Ｉ］−［Ｌ２］−［Ｔ］又は［Ｉ］−［Ｌ３］−［Ｐ］−［Ｌ４］−［Ｔ］
（式中、［Ｐ］は「細胞透過性ペプチド」のアミノ酸配列で、通常１０〜３０個のアミノ酸であり、ペプチド様分子全体を細胞の細胞質内に内部移行させ、粗面小胞体（ＲＥＲ）近傍に接近させることができ、［Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４］は０〜６個の残基のリンカー配列であり、［Ｉ］はＮＳ３ｐｒｏ活性化阻害剤配列であり、活性型又は不活性型立体構造のフラビウイルスのＮＳ３ｐｒｏタンパク質のＣ末端ベータバレルのベータ鎖Ｂ２ａ及びＢ２ｂ又はＮ末端ベータバレルのベータ鎖Ａ１（又はペスチウイルス若しくはヘパシウイルスの構造的に対応する領域）の少なくとも１個のアミノ酸と接触する残基を含有し、［Ｔ］は０〜１０個の残基のアミノ酸配列であり、通常ＥＲ中における（配列ＫＤＥＬ、ＫＫＸＸ及びＬＲＲＲＲＬのような）１個若しくは２個の保持シグナルであり、又はフラビウイルスのＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼのＰ１及びＰ２基質結合部位に結合する能力を有する配列ＸＲＲである。
【００３５】
より具体的には、本発明によって設計されたペプチドはＤＶによるウイルス感染を阻害できることを示した。
【００３６】
陽イオン細胞透過性ペプチド
本発明は、フラビウイルス科ファミリーのウイルスのウイルス感染を阻害することができるキメラペプチドの設計について記載する。設計されたペプチドは、ウイルスＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼの活性化を阻害する［Ｉ］部分を含有する。しかし、本発明では、部分［Ｉ］に対応するアミノ酸配列を有する合成ペプチドは、標的細胞を透過することができず、したがって、細胞系及びｉｎ ｖｉｖｏにおいてウイルス感染を阻害しないことを示している。ウイルス感染の阻害は、［Ｉ］部分と細胞を透過する［Ｐ］部分を組み合わせて実現される。
【００３７】
ある種のタンパク質から得られたいくつかのペプチドは、細胞を透過し、細胞質及び核に接近する能力を備えている。これらのペプチドは、細胞透過性ペプチド又はタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）として知られている（Ｊｏｌｉｏｔ，Ａ．及びＰｒｏｃｈｉａｎｔｚ，Ａ．（２００４）「導入ペプチド」：技術から生理学まで（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｆｒｏｍ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．））Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６、１８９〜９６．Ｓｎｙｄｅｒ，Ｅ．Ｌ．及びＤｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．（２００４）「薬剤送達における細胞透過性ペプチド（Ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．）」Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１、３８９〜９３．Ｄｅｓｈａｙｅｓ，Ｓ．、Ｍｏｒｒｉｓ，Ｍ．Ｃ．、Ｄｉｖｉｔａ，Ｇ．及びＨｅｉｔｚ，Ｆ．（２００５）「細胞透過性ペプチド：治療薬細胞内送達のための手段（Ｃｅｌｌｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．）」Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６２、１８３９〜４９）。最も研究されたＰＴＤは、ＨＩＶ転写因子ＴＡＴ、キイロショウジョウバエのホメオボックスアンテナペディア（ペネトラチン）及び単純疱疹ウイルスのタンパク質ＶＰ２２などのタンパク質から得られた陽イオンペプチドである。これらのペプチドは、生物学的活性を高めるために、細胞中にカーゴ分子を導入するため有望な担体として非常に興味が高まっており、これらのカーゴは薬剤様低分子又は遺伝子及びタンパク質のように天然では多種多様である。治療上関心の持たれる分子のための媒介物としてのＰＴＤの可能性が細胞系及び動物モデルでも示された（Ｂｅｅｒｅｎｓ，Ａ．Ｍ．、Ａｌ Ｈａｄｉｔｈｙ，Ａ．Ｆ．、Ｒｏｔｓ，Ｍ．Ｇ．及びＨａｉｓｍａ，Ｈ．Ｊ．（２００３）「タンパク質伝達ドメイン及び遺伝子治療におけるそれらの用途（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｔｉｌｉｔｙ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．）」Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３、４８６〜９４．Ｗａｄｉａ，Ｊ．Ｓ．及びＤｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．（２００３）「完全長タンパク質のＴＡＴ媒介伝達による細胞機能の調節（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ ＴＡＴ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）」Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．４、９７〜１０４．）。Ｗａｄｉａ，Ｊ．Ｓ．及びＤｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．（２００５）「癌の治療におけるＴＡＴ媒介伝達によるタンパク質及びペプチド薬剤の膜透過送達（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｒｕｇｓ ｂｙ ＴＡＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．）」ＡｄＶ．Ｄｒｕｇ ＤｅｌｉＶｅｒｙ ＲｅＶ．５７、５７９〜９６．Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｃ．、Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇｅｒ，Ｕ．、Ｏｒｔｉｚ，Ａ．、Ｔａｂａｔｔ，Ｋ．、Ｐｌａｎｋ，Ｃ．、Ｍｕｌｌｅｒ，Ｒ．Ｈ．及びＲｏｓｅｎｅｃｋｅｒ，Ｊ．（２００４）「ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおける２量体ＨＩＶ−１ ＴＡＴペプチドをベースにした新規の固形脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）遺伝子ベクター製剤の適用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｓｏｌｉｄ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ＳＬＮ）−ｇｅｎｅ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ｄｉｍｅｒｉｃ ＨＩＶ−１ ＴＡＴ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．）」Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１、１６６２〜９）。
【００３８】
これらのペプチドが原形質膜、エンドサイトーシス区画及び核の膜などの細胞膜系によって形成された生物学的障壁を通って細胞質及び核に接近することができる機構を解明するために膨大な量の研究が行われてきた。近年、以前に報告された低温及び生理学的温度でのＰＴＤの細胞局在及び細胞侵入に関する培養細胞におけるいくつかの観察は、固定方法及びペプチドの原形質膜への非特異的結合によって生じた人為的結果によるものであることが示された（Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｊ．Ｐ．、Ｍｅｌｉｋｏｖ，Ｋ．、Ｖｉｖｅｓ，Ｅ．、Ｒａｍｏｓ，Ｃ．、Ｖｅｒｂｅｕｒｅ，Ｂ．、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．、Ｃｈｅｒｎｏｍｏｒｄｉｋ，Ｌ．Ｖ．及びＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．（２００３）「細胞透過性ペプチド。細胞摂取機構の再評価（Ｃｅｌｌｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ａ ｒｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ．）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８、５８５〜９０．Ｖｉｖｅｓ，Ｅ．、Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｊ．Ｐ．、Ｒｉｓｐａｌ，Ｃ．及びＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．（２００３）「ＴＡＴペプチド内部移行：侵入機構の探索（ＴＡＴ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ：ｓｅｅｋｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｅｎｔｒｙ．）」Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．４、１２５〜３２）。最新の結果では、エンドサイトーシスがＰＴＤの細胞内侵入において必須の役割を果たすことを示唆している。しかし、これらのペプチドの細胞内輸送の詳細で一般的に受け入れられている説明はまだなされていない。
【００３９】
ＴＡＴペプチド融合タンパク質が原形質膜カベオラを介して中性カベオソームを通過し細胞内へ侵入することが最初に報告されたが、より最近の研究では、カベオラは必要なく、ＴＡＴペプチド細胞侵入はマクロピノサイトーシスによって生じることが示された（Ｆｅｒｒａｒｉ，Ａ．、Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ，Ｖ．、Ａｒｃａｎｇｅｌｉ，Ｃ．、Ｆｉｔｔｉｐａｌｄｉ，Ａ．、Ｇｉａｃｃａ，Ｍ．及びＢｅｌｔｒａｍ，Ｆ．（２００３）「実時間で視覚化した細胞外ＨＩＶ−１ｔａｔ融合タンパク質のカベオラ媒介性内部移行（Ｃａｖｅｏｌａｅｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＨＩＶ−１ ｔａｔ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ．）」Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．８、２８４〜９４。Ｗａｄｉａ，Ｊ．Ｓ．、Ｓｔａｎ，Ｒ．Ｖ．及びＤｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．（２００４）「伝達可能なＴＡＴ−ＨＡ膜融合性ペプチドは、マクロピノサイトーシス後の脂質ラフトのＴＡＴ融合タンパク質の脱出を増大させる（Ｔｒａｎｓｄｕｃｉｂｌｅ ＴＡＴ−ＨＡ ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｅｓｃａｐｅ ｏｆ ＴＡＴ−ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｆｔｅｒ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔ ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ．）」Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０、３１０〜５）。仮定されたエンドサイトーシス媒介性細胞侵入と矛盾せず、ＰＴＤは初期及びリサイクリングエンドソーム内に認められた。しかし、ＰＴＤに結合した分子によって示された生物学的活性は、これらのペプチドがサイトゾルに接近する未知の機構によってエンドサイトーシス区画から少なくとも部分的に脱出することを示している。内部移行したＴＡＴペプチドとゴルジマーカーＢＯＤＩＰＹ−セラミドとの共存が報告されており、リソトラッカーで標識した後期エンドソーム及びリソソームでは視覚化が不十分であることと一致している（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｋ．、Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋ，Ｍ．及びＢｒｏｃｋ，Ｒ．２００４．「陽イオン細胞透過性ペプチドの細胞内での動態の段階的解析（Ａ ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆａｔｅ ｏｆ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｃｅｌｌｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９、１２６２５〜３５）。
【００４０】
これらのデータは、これらのペプチドが初期エンドソームから直接ゴルジ体に輸送され得ることを示唆しており、これはゴルジ体からペプチドが逆方向輸送された後、ＥＲからサイトゾルにペプチドが侵入する可能性と一致する。しかし、その他の研究では、酸性の後期エンドサイトーシス構造及びリソソームにおけるペプチドの共存が報告されている。このような結果は、ＴＡＴペプチド、オクタアルギニン、ＴＡＴタンパク質及びリポソームとＴＡＴペプチドの結合体が報告されている（Ａｌ−Ｔａｅｉ，Ｓ．、Ｐｅｎｎｉｎｇ，Ｎ．Ａ．、Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．、Ｆｕｔａｋｉ，Ｓ．、Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｔ．、Ｎａｋａｓｅ，Ｉ．及びＪｏｎｅｓ，Ａ．Ｔ．２００６．「タンパク質伝達ドメインＨＩＶ−１ ＴＡＴペプチド及びオクタアルギニンの細胞内輸送及び動態。薬剤送達媒体としてそれらを利用する意義（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｆｆｉｃ ａｎｄ Ｆａｔｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎｓ ＨＩＶ−Ｉ ＴＡＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｏｃｔａａｒｇｉｎｉｎｅ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｉｒ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｃｔｏｒｓ．）」Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１７、９０〜１００．Ｆｒｅｔｚ，Ｍ．Ｍ．、Ｋｏｎｉｎｇ，Ｇ．Ａ．、Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ，Ｅ．、Ｊｉｓｋｏｏｔ，Ｗ．及びＳｔｏｒｍ，Ｇ．（２００４）「ＯＶＣＡＲ−３細胞はエンドサイトーシスによってＴＡＴ−ペプチド修飾リポソームを内部移行する（ＯＶＣＡＲ−３ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ ＴＡＴ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｂｙ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ．）」Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １６６５、４８〜５６．Ｖｅｎｄｅｖｉｌｌｅ，Ａ．、Ｒａｙｎｅ，Ｆ．、Ｂｏｎｈｏｕｒｅ，Ａ．、Ｂｅｔｔａｃｈｅ，Ｎ．、Ｍｏｎｔｃｏｕｒｒｉｅｒ，Ｐ．及びＢｅａｕｍｅｌｌｅ，Ｂ．（２００４）「ＨＩＶ−１ Ｔａｔは、細胞膜被覆小窩を使用してＴ細胞に侵入した後で、酸性化エンドソームから移動し生物学的応答を惹起する（ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ｅｎｔｅｒｓ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｃｏａｔｅｄ ｐｉｔｓ ｂｅｆｏｒｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ ｆｒｏｍ ａｃｉｄｉｆｉｅｄ ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｅｌｉｃｉｔｉｎｇ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．）」Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １５、２３４７〜６０）。
【００４１】
しかし、ＰＴＤは、細胞の種類、ＰＴＤの性質、温度、カーゴなどのいくつかの要素に応じて、細胞侵入及び細胞内輸送の様々な異なる機構を利用し得る可能性がある。
【００４２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、フラビウイルス科によるウイルス感染を阻害するキメラペプチドの２種類の形態的変種、
［Ｐ］−［Ｌ１］−［Ｉ］−［Ｌ２］−［Ｔ］又は［Ｉ］−［Ｌ３］−［Ｐ］−［Ｌ４］−［Ｔ］
について記載する。
【００４３】
［Ｐ］として透過性ペプチドは、カーゴ分子を細胞内に輸送する能力を備えた陽イオンペプチドから選択されることが好ましいが、それだけに限定はされない。可能性のある陽イオンペプチドとして、ペネトラチン、Ｒ９ノナペプチド又はＲ１０デカペプチド又はＴＡＴペプチドなどの７〜１０個の残基のポリアルギニンを選択することができるが、類似の透過能力を示す１０〜３０個の残基のその他の任意のペプチド配列を選択することができる。これらの透過性陽イオンペプチドは、エンドサイトーシスによって細胞の細胞質に透過する能力を有し、ＥＲによる輸送に関与している可能性がある。この特性は、前駆体ポリタンパク質合成及びプロセシングが実施され、ペプチド抗ウイルス活性の標的の場となるＲＥＲの近傍にペプチドが局在することを保証するので、これらのペプチドの生物学的活性に有利である。
【００４４】
或いは、その他の細胞透過性ペプチドも、タンパク質分解に非常に耐性がある陽イオンデンドリマー型ペプチド又はＤ−アミノ酸を含むペプチドのような［Ｐ］部分として使用することができよう。陽イオンペプチドはまた、本発明のペプチドのｉｎ ｖｉｖｏにおける良好な体内分布を保証し、フラビウイルス科に感染した器官及び組織における有利な有効濃度がモノクローナル抗体のような大きな分子と比較して高レベルになるようにする。１つの例として、ＴＢＥ、ＷＮＶ、ＪＥＶ、ＳＬＥＶ及びＫＶのような脳炎を引き起こすフラビウイルス科感染を治療するために、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できるペプチドの使用を挙げることができる。ＢＢＢを通過する分子輸送は、脳内疾患の治療を目的とした小分子薬物にとっても手強い問題である（Ｔｅｍｓａｍａｎｉ，Ｊ．及びＶｉｄａｌ，Ｐ．２００４．「薬剤送達のための細胞透過性ペプチドの使用（Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．）」Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ ９、１０１２〜１０１９）。
【００４５】
ＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ阻害配列［Ｉ］は、タンパク質ＮＳ３とフラビウイルスのＮＳ２Ｂ（又はＮＳ３とヘパシウイルス及びペスチウイルスのＮＳ４Ａの間）との間の相互作用を阻害又は変更する能力を有し、このようにして、プロテアーゼ活性化プロセスに必要なＮＳ３ｐｒｏの正確な折り畳み構造に影響を及ぼす。本発明の一実施形態では、［Ｉ］はＤＶ２のタンパク質のＮＳ２Ｂの配列Ａｓｐ５０−Ｇｌｕ６２、又はその他のフラビウイルスの相同な配列である。この配列は、活性ＮＳ３ｐｒｏタンパク質のＮ末端ベータバレルに位置する残基と接触するタンパク質ＮＳ２Ｂのベータ鎖１に対応する残基を含有する。したがって、本発明で記載した形態によるペプチドは、ＮＳ３ｐｒｏタンパク質が折り畳まれる間、その活性型構造の使用について補因子ＮＳ２Ｂタンパク質の天然の配列と競合する。完全な活性化にはＮ末端ドメインだけでなく、Ｃ末端ベータバレルの構造の再編成も必要なので、不活性型ＮＳ３ｐｒｏ−ペプチド複合体の形成がもたらされる。プロテアーゼ活性化には、タンパク質ＮＳ２ＢのＧｌｕ６６−Ｉｌｅ８６領域がＮＳ３ｐｒｏのＣ末端ドメインにさらに結合することが必要であろう。さらに、部分［Ｉ］の結合は、これらのペプチドのＮ又はＣ末端伸長がＮＳ３の表面形態を変化させ、ウイルス及び／又は宿主タンパク質の相互作用を妨害することができるように、タンパク質ＮＳ３に対する本発明のペプチドのアンカーとして役立つ。このような相互作用には、基質認識及び／又はウイルス複製複合体の立体構造及び／又は機能に関連したその他の相互作用が含まれる。したがって、本発明の一実施形態では、第一の形態変種に対応する［Ｐ］部分は、細胞透過特性を有する以外に、フラビウイルスＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼの阻害剤でもあるポリ−Ｄ−アルギニンである（ＳＨＩＲＹＡＥＶ，Ｓ．Ａ．、ＲＡＴＮＩＫＯＶ，Ｂ．Ｉ．、ＣＨＥＫＡＮＯＶ，Ａ．Ｖ．、ＳＩＫＯＲＡ，Ｓ．、ＲＯＺＡＮＯＶ，Ｄ．Ｖ．、ＧＯＤＺＩＫ，Ａ．、ＷＡＮＧ，Ｊ．、ＳＭＩＴＨ，Ｊ．Ｗ．、ＨＵＡＮＧ，Ｚ．、ＬＩＮＤＢＥＲＧ，Ｉ．、ＳＡＭＵＥＬ，Ｍ．Ａ．、ＤＩＡＭＯＮＤ，Ｍ．Ｓ．及びＡｌｅｘ Ｙ．ＳＴＲＯＮＧＩＮ，Ａ．Ｙ．、２００６．「西ナイルウイルスＮＳ３プロセシングプロテイナーゼの切断標的及びＤ−アルギニンをベースにした阻害剤（Ｃｌｅａｖａｇｅ ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｄ−ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ．）」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３９３、５０３〜５１１）。したがって、［Ｉ］部分／アンカーのＮＳ３ｐｒｏへの結合は、プロテアーゼの基質結合部位におけるポリＡｒｇペプチドの適合性を高め、ペプチドによって固定された同じ鎖（シス阻害）又は異なる鎖（トランス阻害）によく対応する。類似の方法で、ヘパシウイルス及びペスチウイルスの阻害ペプチドには、フラビウイルスのＮＳ２Ｂタンパク質のベータ鎖１と構造的に類似したＮＳ４Ａタンパク質のＴｈｒ２０−Ｌｅｕ３１領域（ＨＣＶの番号）に対応する部分が［Ｉ］配列として組み込まれる。
【００４６】
フラビウイルスに適用した第２の実施形態では、［Ｉ］部分はＮＳ２Ｂ配列のいかなる特定の部分にも関係しないが、ＮＳ３ｐｒｏタンパク質に結合し、不活性型立体構造でＮ末端バレルを安定化する能力を備えたペプチド配列である。この場合、ペプチド配列はＤＶ２のＮＳ３ｐｒｏタンパク質のＴｙｒ２３−Ｔｙｒ３３に対応する部分、又はその他のフラビウイルスの対応する相同な領域と接触する。さらに、［Ｉ］部分はまた、タンパク質ＮＳ３ｐｒｏのＡｌａ１−Ｇｌｙ１４及びＡｌａ５６−Ｍｅｔ５９部分の残基との構造的接触を安定化させる。したがって、これらのペプチドはタンパク質ＮＳ３の天然の折り畳み構造を妨害することによって阻害効果を促進し、プロテアーゼの不活性型構造を導く折り畳み経路を誘導する。
【００４７】
このような［Ｉ］配列は、コンビナトリアルライブラリーを使用する理論的方法及び／又は実験的方法によって得ることができよう。理論的方法による設計の場合、本発明には、コンピュータによる分子モデリングの１種又は様々な方法の使用及び不活性型立体構造のタンパク質ＮＳ３ｐｒｏの三次構造モデルの使用が含まれる。コンピュータモデリング及び不活性型ＮＳ３ｐｒｏタンパク質の３Ｄ構造モデルの空間座標を使用すると、Ｎ末端ベータバレルのベータ鎖Ａ１に対応する部分を備えた逆平行ベータ鎖を形成する伸長型立体構造のポリペプチド主鎖を設計することができる。さらに、側鎖及びそのコンホマーの化学的特性がエネルギー的に有利な原子接触を意味するように、ポリペプチド鎖の側鎖を設計することができる。本発明には、ペプチド配列及び立体構造空間、ペプチド、さらにプロテアーゼの側鎖回転異性体空間をコンピュータ手段によって探索することと、得られたモデルのエネルギー評価によって、ペプチド−タンパク質相互作用の親和性が潜在的に高いことを示す最も有利なペプチド変種を選択することを組み合わせることが必要である。不活性型ＮＳ３ｐｒｏ構造モデルに対応する座標は、ｘ線回折及び／又はＮＭＲの方法によって、又はコンピュータモデリング法によって得られたモデルを使用することによって得られた実験データから引き出すことができた。ＤＶ２の場合、座標はタンパク質データバンク（ＰＤＢ）の１ＢＥＦファイルから入手することができた。その他のフラビウイルスについては、相同性モデリングの方法によって３Ｄモデルを得ることができる。
【００４８】
本発明では、本発明のこの第２の実施形態にしたがって設計した［Ｉ］配列：ＱＷＰＡＬＰＫＩＥＡＱＤＧを記載する。図１Ｄは、この実施形態に対応するＮＳ３ｐｒｏ−［Ｉ］複合体の３次元構造のコンピュータモデルを示している。このモデルによれば、［Ｉ］部分は、ＮＳ３ｐｒｏ（ＤＶ２番号付け）の部分Ｇｌｙ２９−Ｙ３３に関連して伸長型ベータ鎖構造をとる。
【００４９】
さらに、本発明の第２の実施形態で記載したペプチドと類似の特性を有する［Ｉ］配列を得るために、合成ペプチドのコンビナトリアルライブラリー又はファージディスプレイペプチドライブラリーを使用することができよう。この場合、組換えＮＳ３ｐｒｏタンパク質は、リガンド選択又はバイオパニングの標的として使用される。
【００５０】
本発明のその他の実施形態では、［Ｉ］部分はＤＶ２のタンパク質ＮＳ２Ｂの配列Ｓｅｒ７０−Ｇｌｙ８２、又はその他のフラビウイルスの相同な配列にある。この配列は、活性型ＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼの一部と接触し、形成するタンパク質ＮＳ２Ｂのベータ鎖３及び４を含有する。したがって、本発明で記載した形態によるペプチドは、ＮＳ３ｐｒｏタンパク質が活性型立体構造に折り畳まれる間に補因子ＮＳ２Ｂタンパク質の対応する部分と競合し、接合部ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３でのタンパク質分解性プロセシングを阻止する。これらのペプチドは基質結合部位、特に酵素触媒活性に必須のＰ２部位での正確な立体配置を妨害するので、不活性型ＮＳ３ｐｒｏ−ペプチド複合体の形成を誘導する。
【００５１】
さらに、本発明のペプチドに対応する［Ｉ］部分の結合は、これらのペプチドのＮ末端又はＣ末端伸長がＮＳ３の表面形態を変更し、このタンパク質とその他のウイルス又は宿主タンパク質との相互作用を妨害することができるように、タンパク質ＮＳ３に対するアンカーとして作用する。
【００５２】
以前のペプチド（表１のペプチド１０）に関連した実施形態では、［Ｉ］部分はＤＶ２のＮＳ２Ｂタンパク質の配列Ｓｅｒ７０−Ｉｌｅ８６又はその他のフラビウイルスの相同配列にある。この領域には、ベータ鎖３及び４の他に、ＮＳ２Ｂのベータ鎖５も含まれる。この場合、最初の形態学的変種に対応するペプチドには、Ｃ末端カルボキシル基と共に、３個又は４個の残基の［Ｌ２］部分及びトリペプチドＸＲＲから成る［Ｔ］部分を含むＣ末端伸長が含まれる。これらのペプチドの配列は、活性型立体構造をとるＮＳ３タンパク質への結合と矛盾せず、ベータ鎖５及び鎖４と５の間のループはＰ２部位の正確な形成を保証する。
【００５３】
さらに、部分［Ｉ］の結合は、活性化に必要なＣ末端ベータバレルにおける構造変化、例えば、Ｇｌｙ１５１、Ｇｌｙ１５３及びＴｙｒ１６１のような基質認識に関与する重要な残基を配置させるＥ２ｂ−Ｆ２ベータヘアピンの方向の変化を促進する。しかし、形成された複合体は、［Ｌ２］部分が、位置Ｓ１及びＳ２を占めるジペプチドＲＲと共に［Ｔ］部分の基質結合部位へのさらなる結合を可能にする安定化リンカーとして作用するので、不活性である。したがって、プロテアーゼ活性部位は、ペプチドによって遮断される。
【００５４】
本発明の部分［Ｌ１］、［Ｌ２］、［Ｌ３］及び［Ｌ４］は、形態学的変形形態に応じて、部分［Ｐ］、［Ｉ］及び［Ｔ］を連結する０〜６個の残基のリンカー配列である。これらのリンカー部分は、柔軟性をもたらす、主に小さな、かつ／又は極性のアミノ酸（Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ベータＡｌａ）を含有する。これらのリンカー部分はまた、ＮＳ３ｐｒｏタンパク質の残基と有利に相互作用することができる配列から成ることができ、本発明のペプチドにさらなる安定化効果をもたらす。
【００５５】
本発明の［Ｔ］部分は、ペプチドのＣ末端に位置する、アミノ酸０個から１０個の配列である。一実施形態では、［Ｔ］部分は、ＫＤＥＬ配列のようなＥＲ保持シグナルである。このシグナルを付加することによって、ＥＲへの逆方向輸送によるペプチドの輸送が促進される。ＥＲ内のペプチド濃度の増加は、サイトゾルへのペプチドの輸送の増加に寄与する。ＥＲ近傍における効果的なペプチド濃度の増加が引き起こされ、ウイルスポリタンパク質の合成、特にＮＳ３ｐｒｏの合成が生じる。
【００５６】
ＫＤＥＬシグナルのペプチド配列への組み込みは、ＥＲによる逆方向輸送が陽イオンペプチドのサイトゾルへの透過経路であると推定されるので、［Ｐ］部分としての陽イオン細胞透過性ペプチドの存在と適合する。この透過方法には、初期エンドソームからＥＲへのトランス−ゴルジネットワーク（ＴＧＮ）を介したペプチドの輸送が関与する。配列ＫＤＥＬは、ペプチドをＥＲに輸送するＴＧＮに存在するＫＤＥＬ受容体と相互作用し、ＥＲでペプチドは放出される。ＥＲ内腔からサイトゾルへのペプチド輸送は効率のよいプロセスで、トランスロコン複合体のＳｅｃ６１タンパク質によって形成されたＥＲ膜に存在するチャンネルを通じて行われる。サイトゾルへのこの透過方法は、コレラ毒素、リシン及びシュードモナスの外毒素Ａなどのような細菌毒素によって利用される。
【００５７】
細胞透過性ペプチドとしてのＦＧヘアピンベース部分の使用。ＤＶの細胞侵入に対するこの部分の阻害効果。
本発明の斬新さは、様々な機能を備えた部分又はモジュール、すなわち、抗ウイルス活性を備えた部分、細胞透過性ペプチド、輸送及び細胞内局在のためのシグナル、脂質付加などのシグナルを組み合わせたこれらのペプチドによって表されるモジュラー構造である。したがって、細胞及びｉｎ ｖｉｖｏにおいてペプチドの機能的活性を最大限にする非常に様々な情報を配列に組み込むために、２０〜３０個の残基のペプチドの能力を利用することができる。本発明では、ペプチド設計において二機能又は多機能モジュールも組み入れた。
【００５８】
本発明のペプチドによって表された抗ウイルス活性は、主にＮＳ３プロテアーゼ活性化プロセスの阻害に基づいている。ウイルスプロテアーゼ活性化プロセスの阻害剤として本発明で記載した［Ｉ］部分又はモジュールは、ＮＳ３ｐｒｏタンパク質に結合し、このタンパク質と、プロテアーゼの活性化に必要なフラビウイルスのウイルスタンパク質ＮＳ２Ｂ（ヘパシウイルスのＮＳ４Ａ）との間の相互作用を遮断する能力を有する。しかし、この部分の存在は、ペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいてウイルス感染を遮断できることを保証はしない。したがって、実施例３において、ＤＶ２のタンパク質ＮＳ２Ｂに対応する部分Ｓｅｒ７０−Ｇｌｙ８２が、細胞透過性ペプチドと一緒に同じポリペプチド鎖内に存在する場合にのみ、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてウイルス感染を阻害できることを示す。ウイルス感染を阻害するために、本発明のペプチドは細胞を透過し、サイトゾルに接近し、ＥＲ膜のサイトゾル面で折り畳みが生じるＮＳ３ｐｒｏタンパク質に結合することが必要である。
【００５９】
本発明の一実施形態では、細胞透過性部分として、ＤＶ１−４のエンベロープタンパク質のドメインＩＩＩのＦＧベータヘアピンに対応する配列を使用する。本発明では、これらの配列をベースにした［Ｐ］部分が細胞内に様々なペプチドカーゴを輸送できることを示している。以前に、ＤＶ１−２のＦＧヘアピンの配列に基づいた環状ペプチドが細胞受容体ＬＲＰ１と相互作用することが示された（特許出願：「フラビウイルス感染を予防及び治療するための方法及び分子（Ｍｅｔｏｄｏｓ ｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｓ ｐａｒａ ｌａ ｐｒｅｖｅｎｃｉｏｎ ｙ ｅｌ ｔｒａｔａｍｉｅｎｔｏ ｄｅ ｌａ ｉｎｆｅｃｃｉｏｎ ｃｏｎ Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ．）」ＣＵ ２００６−００９１．Ｈｕｅｒｔａ Ｖ、Ｃｈｉｎｅａ Ｇ、Ｆｌｅｉｔａｓ Ｎ、Ｍａｒｔｉｎ ＡＭ、Ｓａｒｒｉａ Ｍ、Ｇｕｉｒｏｌａ Ｏ、Ｔｏｌｅｄｏ ＰＧ、Ｓａｎｃｈｅｚ Ａ、Ｂｅｓａｄａ ＶＡ、Ｒｅｙｅｓ Ｏ、Ｇａｒａｙ ＨＥ、Ｃａｂｒａｌｅｓ Ａ、Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ Ａ、Ｐａｄｒｏｎ ＧＲ、Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＬＪ）。
【００６０】
ＬＲＰ１受容体は約３０個の天然のリガンド、中でも百日咳外毒素Ａと相互作用し、細胞内へ内部移行させることが知られている（Ｈｅｒｚ Ｊ、Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ＤＫ．（２００１）：「ＬＲＰ：多機能捕捉剤及びシグナル伝達受容体（ＬＲＰ：ａ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．）」Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：７７９〜８４．Ｋｏｕｎｎａｓ ＭＺ、Ｍｏｒｒｉｓ ＲＥ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＭＲ、ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ ＤＪ、Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ＤＫ、Ｓａｅｌｉｎｇｅｒ ＣＢ、１９９２．「アルファ２−マクログロブリン受容体／低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質はシュードモナス外毒素Ａと結合し内部移行させる（Ｔｈｅ ａｌｐｈａ ２−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｓ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｏｔｏｘｉｎ Ａ．）」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７：１２４２０〜１２４２３）。この受容体は、大多数の細胞の種類、組織及び器官で発現している。ＤＶはまた、多くの細胞系及び器官に感染する能力を有し、したがって、感染の疑いのある細胞への効果的な内部移行を実現するために、ＦＧヘアピンの配列に基づいた細胞透過性ペプチドを含有するペプチドを使用することは非常に好ましい。ＬＲＰ１の発現は、フラビウイルス科によって引き起こされる疾患の主要な標的器官である肝臓及び脳で高い。例えば、ＴＢＥ及びＪＥＶ複合体のウイルスは脳炎を引き起こし、ＹＦＶは主に内臓親和性で肝炎を引き起こす。同じ理由で、この部分はまた、本発明で記載した抗ＨＣＶペプチドに見られるように、ＨＣＶに対して効果的であろう。
【００６１】
特にデング感染の阻害剤として本発明で記載したキメラペプチドの場合、ＦＧヘアピンをベースにしたモジュールは二機能特性を有する。細胞透過性部分として既に記載された役割の他に、この部分はまた、それ自体抗ＤＶ抗ウイルス活性を示す。以前に、ＦＧヘアピンをベースにしたペプチドは、ウイルスが原形質膜に付着した後に起こるステップが関与する機構によって、ＤＶの感染増殖性細胞侵入を阻害することが示された（特許出願：「フラビウイルス感染を予防及び治療するための方法及び分子（Ｍｅｔｏｄｏｓ ｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｓ ｐａｒａ ｌａ ｐｒｅｖｅｎｃｉｏｎ ｙ ｅｌ ｔｒａｔａｍｉｅｎｔｏ ｄｅ ｌａ ｉｎｆｅｃｃｉｏｎ ｃｏｎ Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ．）」ＣＵ ２００６−００９１．Ｈｕｅｒｔａ Ｖ、Ｃｈｉｎｅａ Ｇ、Ｆｌｅｉｔａｓ Ｎ、Ｍａｒｔｉｎ ＡＭ、Ｓａｒｒｉａ Ｍ、Ｇｕｉｒｏｌａ Ｏ、Ｔｏｌｅｄｏ ＰＧ、Ｓａｎｃｈｅｚ Ａ、Ｂｅｓａｄａ ＶＡ、Ｒｅｙｅｓ Ｏ、Ｇａｒａｙ ＨＥ、Ｃａｂｒａｌｅｓ Ａ、Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ Ａ、Ｐａｄｒｏｎ ＧＲ、Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＬＪ）。これらのペプチドは、ウイルスが細胞内に侵入するとき溶液中に存在すると、高い効率でウイルス感染を阻害する。さらに、実施例２で示したように、ＦＧヘアピンをベースにした細胞透過性部分を有さず、その抗ウイルス効果がＮＳ３プロテアーゼ阻害モジュールのみに基づいている本発明のペプチドは、ウイルスと同時に媒体に投与された場合、効果は弱い。（ＦＧヘアピン部分が欠落した）これらのペプチドは、ウイルスを添加する前に細胞とプレインキュベーションした場合、最大限の抗ウイルス活性を示し、ＮＳ３プロテアーゼの活性化を阻害するために、阻害機構は細胞透過性及び効果的な細胞内局在を必要とすることと一致している。
【００６２】
したがって、本発明の新規要素は、細胞侵入阻害剤（細胞透過性ペプチドでもある）及びウイルスプロテアーゼ活性化阻害部分の組み合わせにある。
【００６３】
したがって、これらのキメラペプチドは、ウイルス感染の開始に対するペプチド添加時点間の関係を考慮すると、これらの部分の１つのみをベースにしたペプチドと比較してより有利な生物学的活性特性を有する。
【００６４】
細胞透過性及び細胞内動態。Ｎ末端脂質付加及びＥＲにおける保持。
本発明はまた、既に記載したキメラペプチドの脂質付加に適用される。本明細書で記載した脂質付加は一般的に、ペプチドのＮ末端のミリストイル化又はパルミトイル化である。本特許では、ミリストイル化として、アミド結合の手段によってペプチドのＮ末端基にミリスチン酸ＣＨ３（ＣＨ２）１２ＣＯ２Ｈを共有結合させることによってペプチドを化学修飾し、化学構造ＣＨ３（ＣＨ２）１２ＣＯ２−ＮＨ−Ｐ（Ｐはミリストイル化されたペプチドのアミノ酸配列である）を得ることを意味する。同様に、パルミトイル化によって、ＣＨ３（ＣＨ２）１４ＣＯ２Ｈパルミチン基の付加が生じる。脂質付加として、本明細書ではまた、ペプチドのＮ末端伸長として付加されたアミノ酸残基ＳＥＲ及び／又はＴＹＲの側鎖への脂質鎖の共有結合を意味する。主にＮＳ３プロテアーゼの活性化阻害に基づいた抗ウイルス活性を発揮させるために、本発明のペプチドは、細胞の種々の膜系から成る様々な生物学的障壁を通過することが必要である。
【００６５】
これらのペプチドは、細胞外空間から、抗ウイルス効果に最適な最終目的地、ＥＲのサイトゾル面に移行することが必要である。一般的に、脂質付加は、生物学的膜との相互作用に関して有利な特性であるペプチド親脂質性を高める。本発明では当初、ペプチドの脂質付加と、ペプチドの生物学的活性を高めるいくつかの輸送及び細胞局在シグナル（配列）の付加とを組み合わせた。したがって、この設計は、細胞に対するペプチド抗ウイルス活性の発現に関与した様々なステップ、原形質膜への吸着、細胞透過性、細胞内輸送／逆方向輸送、ＥＲ膜への細胞内局在及びＮＳ３ｐｒｏタンパク質との相互作用の効果を高めることが目的である。
【００６６】
ペプチド脂質付加に適した脂質（類）の化学的性質の選択は、小さなことではない。本発明のキメラペプチド設計の１つの前提は、化学修飾が抗ウイルス作用に関与する様々なプロセス、すなわち、原形質膜への結合、細胞透過性／エンドサイトーシス、細胞内輸送／逆方向輸送、サイトゾルへの輸送及びＮＳ３ｐｒｏへの結合に関するペプチドの物理化学的及び機能的特性に有利な影響を及ぼすように、ペプチドに対する化学結合に特異的な脂質（類）を選択することである。このプロセスの間、ペプチドは様々な生物物理学的特性の膜と相互作用し、様々な細胞内区画間の輸送に関与するであろう。個々のステップに関して最適な脂質がその他のステップに関しては有害であり得るので、本発明の抗ウイルスペプチドの脂質付加は指示されない。一例として、ＥＲ膜との相互作用を考慮すると、モノ飽和グリセロ脂質が潜在的に有利である。これらの脂質は、膜にはよくあり（Ｋｅｅｎａｎ Ｔ．Ｗ．及びＭｏｒｒｅａ，Ｄ．Ｊ．「ラット肝臓から単離したゴルジ体のリン脂質の種類及び脂肪酸組成並びにその他の細胞画分との比較（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｃｌａｓｓ ａｎｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｏｌｇｉ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｃｅｌｌ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ．）」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９：１９〜２５、１９７０）、スフィンゴ脂質、ステロール及び二飽和リン脂質の豊富な原形質膜と比較して高い流動性及び厚みの薄さが特徴である。したがって、ＥＲ膜への挿入に適した比較的短い鎖の不飽和脂質は、原形質膜では好ましくないであろう。この種類の脂質は、エンドサイトーシスに関与する脂質ラフトなどのスフィンゴ脂質及びコレステロールに富んだドメインから分離された原形質膜の最も流動性のあるドメインに局在すると有利である。疎水性尾部の性質が異なる脂質類似体のエンドサイトーシス経路の今までの様々な分析によって、短い尾部のある不飽和脂質は、エンドサイトーシス後、エンドサイトーシスリサイクリング区画（ＥＲＣ）を介して原形質膜に効率よく再利用され、長い尾部のある飽和脂質はエンドサイトーシス経路によって後期エンドソーム及びリソソームに送り出されることが示された（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｓ．、Ｓｏｅ，Ｔ．Ｔ及びＭａｘｆｉｅｌｄ，Ｆ．Ｒ．１９９９．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１４４、１２７１〜１２８４；Ｋｏｖａｌ，Ｍ．及びＲ．Ｅ．Ｐａｇａｎｏ、１９８９．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０８：２１６９〜２１８１；Ｍａｙｏｒ，Ｓ．、Ｊ．Ｆ．Ｐｒｅｓｌｅｙ及びＦ．Ｒ．Ｍａｘｆｉｅｌｄ、１９９３．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２１：１２５７〜１２６９；Ｓａｎｄｈｏｆｆ，Ｋ．及びＡ．Ｋｌｅｉｎ．、１９９４．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６：１０３〜１０７）。
【００６７】
以前の研究で、細胞透過性及び対応する細胞内標的におけるペプチドの生物学的活性を促進するペプチドミリストイル化の例が報告されている（Ｐ．Ｊ．Ｂｅｒｇｍａｎ，Ｋ．Ｒ．Ｇｒａｖｉｔｔ，Ｃ．Ａ．Ｏ’Ｂｒｉａｎ「ヒト乳癌細胞において多剤耐性回復薬として作用するＮ−ミリストイル化タンパク質キナーゼＣ−アルファ偽基質ペプチドはＰ−糖タンパク質基質ではない（Ａｎ Ｎ−ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ−ａｌｐｈａ ｐｓｅｕｄｏｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈａｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｖｅｒｓａｌ ａｇｅｎｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｎｏｔ ａ Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０（１９９７）４５３〜４５６．Ｂ．Ｒ．Ｋｅｌｅｍｅｎ、Ｋ．Ｈｓｉａｏ、Ｓ．Ａ．Ｇｏｕｅｌｉ、「細胞透過性ペプチドを使用したマイトジェン活性化タンパク質キナーゼのｉｎ ｖｉｖｏにおける選択的阻害（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２００２）８７４１〜８７４８．Ｔ．Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚ、Ｄ．Ｂ．ｄｅ Ｂｏｎｔ、Ｊ．ｄｅ Ｗｉｄｔ、Ｒ．Ｍ．Ｌｉｓｋａｍｐ、Ｈ．Ｌ．Ｐｌｏｅｇｈ、「ミリストイル化偽基質ペプチド、新規のタンパク質キナーゼＣ阻害剤（Ａ ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｅｄ ｐｓｅｕｄｏｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐｅｐｔｉｄｅ， ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１９９３）１９８２〜１９８６）。
【００６８】
しかし、ミリストイル化自体は、ペプチドの細胞への透過性を保証しない。実際に、細胞内に透過しないミリストイル化ペプチドの例があり、透過性はまた、ペプチドの性質に依存し、正味の電荷が正で、酸と疎水性残基の間に塩基性残基が均一に分布した特性が有利である、と仮定している（Ｃａｒｒｉｇａｎ，Ｃ．Ｎ．、Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ，Ｂ．２００５、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４１ ２９０〜２９８）。
【００６９】
本発明のペプチドと細胞との相互作用における最初の段階は、原形質膜への付着及び／又は膜上に存在する分子への結合である。ミリストイル基又はパルミトイル基の付加は、本発明のペプチドの親脂質性を高め、原形質膜へのペプチドの結合を促進する。脂質の存在の他に、本発明のペプチドは、膜中に存在する分子と相互作用する細胞透過性ペプチドの配列を含有する。一例は、グルコサミノグリカン、特にヘパリン様ヘパラン硫酸と相互作用する陽イオン細胞透過性ペプチドの場合である。
【００７０】
ヘパラン硫酸への結合は、陽イオンペプチドの細胞透過性に必須であることが示された。それらはまた、陰イオン脂質及びタンパク質のような原形質膜のその他の負に荷電した分子と相互作用することができる。同様に、エンドサイトーシスの細胞受容体と相互作用するその他のペプチドは、担体又は細胞内へのカーゴ分子の侵入を促進する細胞透過性ペプチドとして機能することができる。したがって、本発明のペプチドの脂質付加は、原形質膜への結合親和性を高め、さらにアンカー部位を提供する。
【００７１】
一般的に、ミリストイル化シグナルと並置して塩基性残基の集団を含有するミリストイル化タンパク質は、コレステロール及びスフィンゴ脂質の豊富な膜と有利に相互作用し（ＭｃＣａｂｅ，Ｊ．Ｂ及びＢｅｒｔｈｉａｕｍｅ，Ｌ．Ｇ．（１９９９）「細胞内局在における脂肪アシル化アミノ末端ドメインの機能的役割（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ｆａｔｔｙ ａｃｙｌａｔｅｄ ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．）」Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １０、３７７１〜３７８６．ＭｃＣａｂｅ，Ｊ．Ｂ．及びＢｅｒｔｈｉａｕｍｅ，Ｌ．Ｇ．（２００１）「Ｎ末端タンパク質のアシル化は、コレステロール、スフィンゴ脂質の豊富な膜に対する局在をもたらすが、脂質ラフト／カベオラへの局在はもたらさない（Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｃｙｌａｔｉｏｎ Ｃｏｎｆｅｒｓ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ， Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ Ｂｕｔ Ｎｏｔ ｔｏ Ｌｉｐｉｄ Ｒａｆｔｓ／Ｃａｖｅｏｌａｅ．）」Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １２、３６０１〜３６１７）、コレステロール及びスフィンゴ脂質はエンドサイトーシスプロセス及びタンパク質の様々な細胞内小器官及び細胞の特定の膜への輸送に関与する脂質ラフトの成分である（ＪＯＯＳＴ Ｃ．Ｍ．ＨＯＬＴＨＵＩＳ、ＴＨＯＭＡＳ ＰＯＭＯＲＳＫＩ、ＲＥＮＥＡ’Ｊ．ＲＡＧＧＥＲＳ、ＨＥＩＮ ＳＰＲＯＮＧ及びＧＥＲＲＩＴ ＶＡＮ ＭＥＥＲ．２００１．「細胞内膜輸送におけるスフィンゴ脂質の構成能力（Ｔｈｅ Ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ ｉｎ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．）」Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８１、１６８９〜１７２３．Ｓｉｍｏｎｓ，Ｋ．及びＩｋｏｎｅｎ，Ｅ．１９９７．「細胞膜における機能的ラフト（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒａｆｔｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．）」Ｎａｔｕｒｅ、３８７：５６９〜５７２）。したがって、ミリストイル化は、本発明のペプチド、特に、陽イオン細胞透過性ペプチド及び／又はＥＲ膜のサイトゾル面で保持するためのシグナルとしてのポリアルギニンを含有するペプチドの細胞透過能力に有利である。実際に、ある種の正電荷を含有する脂質付加されたペプチドは、細胞を透過することができることが示された（Ｃａｒｒｉｇａｎ，Ｃ．Ｎ．、Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ，Ｂ．２００５、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４１ ２９０〜２９８）。
【００７２】
スフィンゴ糖脂質及びコレステロールが豊富な膜の界面活性剤不溶性の特殊微小領域（ＤＲＭ）は、様々な細菌毒（コレラ毒素、リシン、滋賀毒素など）の細胞内への内部移行に必要で、ＧＭ１ガングリオシド及びスフィンゴ脂質Ｇｂ３のようなこれらのＤＲＭに結合した分子は、エンドサイトーシスによって細胞を透過するこれらの毒素のいくつかの受容体である（Ｓｐａｎｇｌｅｒ，Ｂ．Ｄ．（１９９２）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５６、６２２〜６４７．Ｆｕｊｉｎａｇａ Ｙ、Ｗｏｌｆ ＡＡ、Ｒｏｄｉｇｈｉｅｒｏ Ｃ、Ｗｈｅｅｌｅｒ ＴＥ、Ｔｓａｉ Ｂ、Ａｌｌｅｎ Ｌ、Ｊｏｂｌｉｎｇ ＭＧ、Ｒａｐｏｐｏｒｔ ＴＡ、Ｈｏｌｍｅｓ ＲＫ、Ｌｅｎｃｅｒ ＷＩ．２００３．「脂質ラフトに結合するガングリオシドは、コレラ及び関連毒素の原形質膜から小胞体への輸送を媒介する（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ ｔｈａｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｗｉｔｈ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｃｈｏｌｅｒａ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏｘｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｏ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．）」Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １４：４７８３〜４７９３．Ｆａｌｇｕｉｅｒｅｓ Ｔ、Ｍａｌｌａｒｄ Ｆ、Ｂａｒｏｎ Ｃ、Ｈａｎａｕ Ｄ、Ｌｉｎｇｗｏｏｄ Ｃ、Ｇｏｕｄ Ｂ、Ｓａｌａｍｅｒｏ Ｊ、Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ｌ．２００１．「滋賀毒素Ｂサブユニットの界面活性剤不溶性膜領域に関連した逆方向輸送経路へのターゲティング（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｔｏ ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｒｏｕｔｅ ｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．）」Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １２：２４５３〜２４６８）。
【００７３】
これらの毒素は、エンドソームからＥＲへの輸送に直接又はＴＧＮを介して関連する逆方向輸送プロセスを通過した後、サイトゾルにおいて活性を発揮する（Ｓａｎｄｖｉｇ Ｋ、ｖａｎ Ｄｅｕｒｓ Ｂ．２００２．「タンパク質毒素によって利用される膜輸送（Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｆｆｉｃ ｅｘｐｌｏｉｔｅｄ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｘｉｎｓ．）」Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １８：１〜２４）。次に、これらの毒素は、また逆方向輸送によってＥＲからサイトゾルへ通過し、見かけ上ＥＲ関連分解機構（ＥＲＡＤ）を使用する（Ｌｏｒｄ，Ｊ．Ｍ．及びＲｏｂｅｒｔｓ，Ｌ．Ｍ．（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４０、７３３〜７３６．Ｌｏｒｄ，Ｊ．Ｍ．、Ｄｅｅｋｓ，Ｅ．、Ｍａｒｓｄｅｎ，Ｃ．Ｊ．、Ｍｏｏｒｅ，Ｋ．、Ｐａｔｅｍａｎ，Ｃ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｃ．、Ｓｐｏｏｎｅｒ，Ｒ．Ａ．、Ｗａｔｓｏｎ，Ｐ．及びＲｏｂｅｒｔｓ，Ｌ．Ｍ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３１、１２６０〜１２６２．ＡｂｕＪａｒｏｕｒ，Ｒ．Ｊ．、Ｄａｌａｌ，Ｓ．、Ｈａｎｓｏｎ，Ｐ．Ｉ．及びＤｒａｐｅｒ，Ｒ．Ｋ．２００５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０、１５８６５〜１５８７１）。
【００７４】
したがって、スフィンゴ脂質の豊富な膜ドメインにおいて本発明の脂質付加ペプチドが共存する可能性は、細菌毒素によって使用される前述の脂質依存性逆方向輸送に基づいた細胞透過機構を使用するそれらの潜在的能力と一致するだろう。
【００７５】
本発明のその他の実施形態では、設計されたペプチドは、細胞透過性ペプチドとして、ＤＶ３のエンベロープタンパク質のドメインＩＩＩのＦＧヘアピン又は血清型１、２及び４の相同ペプチドを使用する。以前に、これらのペプチドは細胞受容体ＬＲＰ１に結合することが示された（特許出願：「フラビウイルス感染を予防及び治療するための方法及び分子（Ｍｅｔｏｄｏｓ ｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｓ ｐａｒａ ｌａ ｐｒｅｖｅｎｃｉｏｎ ｙ ｅｌ ｔｒａｔａｍｉｅｎｔｏ ｄｅ ｌａ ｉｎｆｅｃｃｉｏｎ ｃｏｎ Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ．）」ＣＵ ２００６−００９１．Ｈｕｅｒｔａ Ｖ、Ｃｈｉｎｅａ Ｇ、Ｆｌｅｉｔａｓ Ｎ、Ｍａｒｔｉｎ ＡＭ、Ｓａｒｒｉａ Ｍ、Ｇｕｉｒｏｌａ Ｏ、Ｔｏｌｅｄｏ ＰＧ、Ｓａｎｃｈｅｚ Ａ、Ｂｅｓａｄａ ＶＡ、Ｒｅｙｅｓ Ｏ、Ｇａｒａｙ ＨＥ、Ｃａｂｒａｌｅｓ Ａ、Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ Ａ、Ｐａｄｒｏｎ ＧＲ、Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＬＪ）。この受容体は、約３０個のリガンドのエンドサイトーシスを媒介し、百日咳外毒素ＰＴｘによる細胞侵入に使用される（Ｈｅｒｚ Ｊ、Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ＤＫ．（２００１）「ＬＲＰ：多機能捕捉剤及びシグナル伝達受容体（ＬＲＰ：ａ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．）」Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：７７９〜８４．Ｋｏｕｎｎａｓ ＭＺ、Ｍｏｒｒｉｓ ＲＥ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＭＲ、ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ ＤＪ、Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ＤＫ、Ｓａｅｌｉｎｇｅｒ ＣＢ．「アルファ２−マクログロブリン受容体／低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質は、シュードモナス外毒素Ａに結合し内部移行させる（Ｔｈｅ ａｌｐｈａ ２−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｓ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｏｔｏｘｉｎ Ａ．）」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９２；２６７：１２４２０〜１２４２３）。
【００７６】
本発明では、ＦＧヘアピンに対応するペプチドが、ペプチドカーゴの細胞侵入を媒介できることを示した。これらのＦＧヘアピンを含有するペプチドの脂質付加（ミリストイル化又はパルミトイル化）は、脂質膜におけるペプチドの分配を増強することによって細胞受容体への効果的な親和性を高めるだろう。このペプチド脂質付加はまた、ＬＲＰ１受容体によって媒介されるエンドサイトーシスを介したペプチドの細胞透過能力の上昇と一致する。
【００７７】
１つの可能性として、これらのペプチドはＰＴｘと類似の方法で細胞に透過する。この毒素は、エンドソームから、ＴＧＮ、ＥＲを順次通過してサイトゾルまで逆方向輸送されてサイトゾルに接近する。ＰＴｘは、ＬＲＰ１相互作用によって媒介される少なくとも２種類の逆方向輸送経路、ａ）脂質依存性経路及びｂ）脂質独立経路を使用する能力を有する（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｃ．、Ｓｐｏｏｎｅｒ，Ｒ．Ａ．、Ｗａｔｓｏｎ，Ｐ．Ｄ．、Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｌ．、Ｈｏｄｇｅ，Ｔ．Ｗ、Ａｍｅｓｓｏｕ，Ｍ．、Ｊｏｈａｎｎｅｓ，Ｌ．、Ｌｏｒｄ，Ｊ．Ｍ．及びＲｏｂｅｒｔｓ，Ｌ．Ｍ．、２００６．「内部移行したシュードモナス外毒素Ａは、小胞体に到達するために複数の経路を使用することができる（Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｅｘｏｔｏｘｉｎ Ａ ｃａｎ Ｅｘｐｌｏｉｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐａｔｈｗａｙｓ ｔｏ Ｒｅａｃｈ ｔｈｅ Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．）」Ｔｒａｆｆｉｃ、７：３７９〜３９３）。脂質依存性経路は、原形質膜の脂質ラフトのＬＲＰ１分子の２０％の局在に関与するものと考えられる。脂質付加され、ＬＰＲ１と相互作用する能力を備えた本発明のペプチドは、より効果的に脂質依存性経路を使用できる可能性があり、特に（ＥＲ保持シグナルとして付加された）ポリアルギニンの塩基性集団を含むペプチドは、コレステロール及びスフィンゴ脂質の豊富なラフト隣接膜ドメインに局在するために有利な組成を有する。
【００７８】
本発明のその他の実施形態は、Ｃ末端にＫＤＥＬシグナルを有するペプチドである。これらのペプチドは、ＥＲの内腔での保持に機能的なＫＤＥＬシグナルを形成するために、カルボキシＣ末端を含んで合成される（Ｔｅａｓｄａｌｅ，Ｒ．Ｄ．＆ Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．、１９９６．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２、２７〜５４）。このシグナルのペプチド配列への付加は、ゴルジ体からＥＲへの逆方向輸送及びＥＲの内腔におけるこれらのペプチドの保持に有利に関与する。したがって、このシグナルは、逆方向輸送経路の少なくとも一部を使用するペプチドのサイトゾルへの透過性に関与する。効率の高い輸送は、ペプチドの高いサイトゾル濃度をもたらし、したがって、ＮＳ３プロテアーゼ活性化の阻害活性がより強くなる。実施例３において、本発明のペプチドにＫＤＥＬシグナルを付加すると、ペプチドの抗ウイルス活性の増加をもたらすことができることを示した。
【００７９】
ＫＤＥＬシグナルの付加は、Ｎ末端に脂質が結合した又は結合していない本発明のペプチドに有効である。これは、このシグナルがＥＲの可溶性タンパク質及びＩＩ型膜タンパク質の両方に見出されたという事実と一致する。ＥＲの内腔に存在する本発明の脂質付加されたペプチドは、ＩＩ型膜タンパク質と類似の形態をとる。
【００８０】
ＦＧヘアピン関連細胞透過性部分を有する本発明のペプチドの場合、ＫＤＥＬシグナルの付加は、これらのペプチドに受容体ＬＲＰ１の順方向輸送を妨害する能力をさらにもたらし、したがって、原形質膜上のそれらの受容体発現レベルの減少を導く。したがって、これらの配列／シグナルの組み合わせは、原形質膜の受容体の発現が減少している細胞へのウイルスの侵入に対して間接的な負の効果を有し、この効果はウイルスの細胞侵入を遮断する前述したＦＧヘアピンをベースにしたペプチドの直接的効果に付け加えられる。以前の証明によって、ＦＧヘアピンをベースにしたペプチドは、ＬＲＰ１とそのシャペロン受容体関連タンパク質ＲＡＰとの相互作用に有利に働くことが示された（特許出願：「フラビウイルス感染を予防及び治療するための方法及び分子（Ｍｅｔｏｄｏｓ ｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｓ ｐａｒａ ｌａ ｐｒｅｖｅｎｃｉｏｎ ｙ ｅｌ ｔｒａｔａｍｉｅｎｔｏ ｄｅ ｌａ ｉｎｆｅｃｃｉｏｎ ｃｏｎ Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ．）」ＣＵ２００６−００９１．Ｈｕｅｒｔａ Ｖ、Ｃｈｉｎｅａ Ｇ、Ｆｌｅｉｔａｓ Ｎ、Ｍａｒｔｉｎ ＡＭ、Ｓａｒｒｉａ Ｍ、Ｇｕｉｒｏｌａ Ｏ、Ｔｏｌｅｄｏ ＰＧ、Ｓａｎｃｈｅｚ Ａ、Ｂｅｓａｄａ ＶＡ、Ｒｅｙｅｓ Ｏ、Ｇａｒａｙ ＨＥ、Ｃａｂｒａｌｅｓ Ａ、Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ Ａ、Ｐａｄｒｏｎ ＧＲ、Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＬＪ）。これらのペプチドは、原形質膜通過中に細胞外への経路に存在する細胞内ＬＲＰ１と相互作用することができることを意味する。これらのペプチドはまた、ＫＤＥＬシグナルを含有するので、細胞内複合体ペプチド−ＬＲＰ１及び／又はペプチド−ＬＲＰ１／ＲＡＰはＫＤＥＬ受容体に結合することができ、したがってゴルジ体からＥＲに通過し、ＬＲＰ１の原形質膜への輸送に影響を及ぼし、ＬＲＰ１が媒介するウイルスの細胞侵入に間接的に影響を及ぼす。
【００８１】
本発明のペプチドの一般的な特性は、それらがＮＳ３プロテアーゼ活性の阻害に基づいて抗ウイルス活性を表すことである。プロテアーゼ活性化の阻害は、タンパク質ＮＳ２Ｂ（ヘパシウイルスではＮＳ４Ａ）とＮＳ３ｐｒｏドメインとの相互作用を特異的に遮断することによって実施され、この相互作用はプロテアーゼの正確な折り畳み及び完全な活性に必要な条件である。
【００８２】
プロテアーゼＮＳ３のタンパク質折り畳み及び活性化並びにコアタンパク質及び非構造タンパク質の残部の折り畳み及びプロセシングは、ＥＲ膜のサイトゾル面で生じる。したがって、本発明のペプチドの抗ウイルス活性の増強方法は、ＥＲ膜での細胞内局在の増加にある。この目的で、ペプチドのＮ末端に化学的に脂質付加することができた（ミリストイル化又はパルミトイル化）。脂質付加されたペプチドは、脂質膜と有利に相互作用する能力を有する。（脂質部分に支持された）脂質付加されたペプチドとＥＲ膜の良好な結合によって、ペプチドとＮＳ３ｐｒｏタンパク質との間の相互作用の見かけの効果的な親和性、すなわち、以下の要素、１）局所ペプチド濃度の増加、２）（膜の平面の）２方向で生じる生体分子の相互作用及び３）膜での脂質付加されたペプチドの迅速な外側への拡散に関連した効果が増大する。さらに、ＥＲ膜のサイトゾル面に関連するとき、Ｎ末端が脂質付加されたペプチドはＩ型膜タンパク質と形態学的に類似し、したがって、正確な局在だけでなく、ウイルスＮＳ２Ｂタンパク質（ヘパシウイルスのＮＳ４Ａ）に類似した膜に関する方向性も獲得する。
【００８３】
一般的に、パルミトイル化及び／又は塩基性集団のような他のシグナルがないとき、サイトゾルタンパク質のミリストイル化は、主にＥＲ膜でのこれらのタンパク質の局在を誘導する（ＭｃＣａｂｅ，Ｊ．Ｂ．及びＢｅｒｔｈｉａｕｍｅ，Ｌ．Ｇ．（１９９９）．「細胞内局在における脂肪アシル化アミノ末端ドメインの機能的役割（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ｆａｔｔｙ ａｃｙｌａｔｅｄ ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．）」Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １０、３７７１〜３７８６）。ミリスチン酸自体の膜への結合は余り強くなく、ＥＲ膜中のペプチドの保持全体を保証しない。しかし、ＥＲ膜は細胞内膜の６０％を構成し、膜の残部に関してペプチドの著しく有効な濃度が保証される。ミリストイル化に加えて、塩基性集団も存在すると、サイトゾルタンパク質は主に原形質膜の内面及びエンドソーム内に局在する。
【００８４】
本発明の様々なペプチドは、原形質膜の外面に局在する負に荷電した分子との有利な相互作用も保証する細胞透過性ペプチドとして陽イオン部分を含有する。本発明のいくつかのペプチドは、ＥＲ保持／方向変更シグナルでもある陽イオン部分としてアルギニンの集団を含有する（Ｔｅａｓｄａｌｅ，Ｒ．Ｄ．＆ Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２、２７〜５４．Ｚｅｒａｎｇｕｅ，Ｎ．、Ｓｃｈｗａｐｐａｃｈ，Ｂ．、Ｊａｎ，Ｙ．Ｎ．＆ Ｊａｎ，Ｌ．Ｙ．（１９９９）Ｎｅｕｒｏｎ ２２、５３７〜５４８．Ｓｃｈｕｔｚｅ，Ｍ．Ｐ．、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ａ．＆ Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．１３、１６９６〜１７０５）。これらのペプチドは、同時に両方の特性、効率的な細胞透過性及び主にＥＲ膜のサイトゾル面における細胞内局在を表す目的で設計された。ＥＲへのアルギニンをベースにした輸送シグナルは、効率が高く、膜タンパク質の品質管理機構に重要な役割を果たす（Ｃｈａｎｇ，Ｘ．Ｂ．、Ｃｕｉ，Ｌ．、Ｈｏｕ，Ｙ．Ｘ．、Ｊｅｎｓｅｎ，Ｔ．Ｊ．、Ａｌｅｋｓａｎｄｒｏｖ，Ａ．Ａ．、Ｍｅｎｇｏｓ，Ａ．＆ Ｒｉｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｒ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ４、１３７〜１４２．Ｍａｒｇｅｔａ−Ｍｉｔｒｏｖｉｃ，Ｍ．、Ｊａｎ，Ｙ．Ｎ．＆ Ｊａｎ，Ｌ．Ｙ．（２０００）Ｎｅｕｒｏｎ ２７、９７〜１０６）。
【００８５】
Ｉ型膜タンパク質のＣ末端に限定されているジリシンシグナルとは異なり、アルギニンをベースにしたシグナルは、Ｎ末端及びＣ末端並びにサイトゾル面に局在した内部ループを含む、一連の膜タンパク質の多くの位置で見出される。アルギニンをベースにした保持シグナルの多用途性は、それらとＣ末端ＫＤＥＬシグナルを一緒にしたペプチドを設計するために、本発明で使用した。したがって、これらのシグナルを含有する本発明のいくつかの脂質付加されたペプチドは、細胞内に侵入し、逆方向輸送によってサイトゾルに移行し、ＥＲに移行する間にＫＤＥＬシグナルに有利で、その後アルギニンをベースにしたシグナルによって支持されるＥＲ膜のサイトゾル面に保持される。
【００８６】
本発明の一実施形態では、配列がＥＲ膜のサイトゾル面に保持されるための２個の連続した推定保持シグナルを含有する、脂質付加されたペプチドの設計を含めた。得られた配列は、ＬＲＲＲＲＬＲＲＲＲＬで、中央のＬｅｕ残基で重複した２個の連続したＬＲＲＲＲＬ配列に相当する。疎水性残基が前にある４個の連続したアルギニンの配列は、ＲＥ保持配列の典型である（Ｚｅｒａｎｇｕｅ，Ｎ．、Ｍａｌａｎ，Ｍ．Ｊ．、Ｆｒｉｅｄ，Ｓ．Ｒ．、Ｄａｚｉｎ，Ｐ．Ｆ．、Ｊａｎ，Ｙ．Ｎ．、Ｊａｎ，Ｌ．Ｙ．及びＳｃｈｗａｐｐａｃｈ，Ｂ．２００１．ＰＮＡＳ、９８：２４３１〜２４３６）。これらに関して、本発明の新規態様の１つは、得られた配列が効果的なＲＥ保持シグナル及び細胞透過性ペプチドでもある二様性を有することである。得られた配列の細胞透過特性は、ポリアルギニン配列と類似した非常に効果的な陽イオンＰＴＤである８個のアルギニン残基によってもたらされる。
【実施例】
【００８７】
（実施例１）
フラビウイルス科感染のキメラペプチド阻害剤の設計及び合成
本発明で記載したフラビウイルス科感染のキメラペプチド阻害剤は、以下の形態による一次構造を有し、
［Ｐ］−［Ｌ１］−［Ｉ］−［Ｌ２］−［Ｔ］又は［Ｉ］−［Ｌ３］−［Ｐ］−［Ｌ４］−［Ｔ］
式中、［Ｐ］は通常１０〜３０個の残基の細胞透過性ペプチドのアミノ酸配列であり、ペプチド分子全体の細胞の細胞質内への内部移行を促進し、ＲＥＲ近傍に接近させる能力を備えており、［Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４］は０〜６個の残基のリンカー配列であり、［Ｉ］はＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼの活性化を遮断するアミノ酸配列であり、この部分の残基はフラビウイルスのＮＳ３ｐｒｏタンパク質のＣ末端ベータバレルドメインのベータ鎖Ｂ２ａ及びＢ２ｂ又はＮ末端ベータバレルドメインのベータ鎖Ａ１（又はヘパシウイルス若しくはペスチウイルスの構造的に対応する領域）の少なくとも１個のアミノ酸と接触し、ＮＳ３ｐｒｏタンパク質は活性型又は不活性型立体構造であり（図１）、［Ｔ］は、通常、配列ＫＤＥＬ及びＬＲＲＲＲＬのようなＥＲ中における１個若しくは２個の保持シグナルである０〜１０個の残基の配列又はプロテアーゼ活性部位に結合する能力を示す配列ＸＲＲである。
【００８８】
表１及び２は、形態１及び２それぞれによるキメラペプチドの配列を示す。基本的なペプチドの設計は、プロテアーゼ活性化阻害剤部分［Ｉ］及び細胞透過性部分［Ｐ］の存在に基づく。［Ｉ］として、部分には、ＤＶ１〜４のＮＳ２Ｂタンパク質の配列Ｄ５０−Ｅ６２、Ｓ７０−Ｇ８２及びＳ７０−Ｉ８６が含まれる。ＷＮＶ及びＨＣＶの対応する配列も含まれる。部分Ｄ５０−Ｅ６２は、ＮＳ３ｐｒｏのＮ末端ドメインに結合し、部分Ｓ７０−Ｇ８２及びＳ７０−Ｉ８６はＣ末端ドメインに結合する（図１Ａ〜Ｃ）。
表１ 形態［Ｐ］−［Ｌ１］−［Ｉ］−［Ｌ２］−［Ｔ］によるキメラペプチドの設計
【表１】
＊：カルボキシルＣ末端。Ｍｙｒ−：ミリストイル基のペプチドのＮ末端への共有結合。Ｐａｌ−：パルミトイル基のペプチドのＮ末端への共有結合。ｂＡ：ベータ−アラニン。ＦＧ−ｄｅｎ３：ＤＶ３のエンベロープタンパク質のドメインＩＩＩのＦＧヘアピンに対応する配列、ジスルフィド結合によって結合した２個のシステインがこの部分のＮ及びＣ末端に付加されている。
表２ 形態［Ｉ］−［Ｌ３］−［Ｐ］−［Ｌ４］−［Ｔ］によるキメラペプチドの設計
【表２】
＊：カルボキシルＣ末端。Ｍｙｒ−：ミリストイル基のペプチドのＮ末端への共有結合。Ｐａｌ−：パルミトイル基のペプチドのＮ末端への共有結合。ｂＡ：ベータ−アラニン。ＦＧ−ｄｅｎ３：ＤＶ３のエンベロープタンパク質のドメインＩＩＩのＦＧヘアピンに対応する配列、ジスルフィド結合によって結合した２個のシステインがこの部分のＮ及びＣ末端に付加されている。
【００８９】
本発明はまた、フラビウイルス科ファミリーのその他のメンバーに対する抗ウイルスキメラペプチドの設計に関する。その他のフラビウイルス科に対するペプチド阻害剤には、［Ｉ］部分として、ＮＳ２Ｂタンパク質配列（フラビウイルス）又はＮＳ４Ａ（ヘパシウイルス）に対応する類似部分が含まれる。本発明の配列のリストには、［Ｉ］部分がその他のフラビウイルス（ＹＦＶ、ＪＥＶ、ＴＢＥ、ＷＮＶ）及びヘパシウイルスＨＣＶに対応する、表１及び２に示されたものの他のキメラペプチド類似体が含まれる。
【００９０】
［Ｐ］部分として、ＴＡＴペプチド、Ｒ１０、ペネトラチン、陽イオン配列ＬＲＲＲＲＬＲＲＲＲＬ及びＬＲＲＲＲＬ−ｂＡｌａ−ＲＲＲＲＬ及びＤＶ３のエンベロープタンパク質の部分Ｓ３７６−Ｗ３９１（ドメインＩＩＩのループＦＧ）が考えられる。後者の部分は、Ｎ末端及びＣ末端にシステインを含み、ジスルフィド結合を形成し、エンベロープタンパク質の３次元構造に認められるベータヘアピン構造を安定化する。
【００９１】
末端［Ｔ］部分として、ＥＲ保持シグナルＬＲＲＲＲＬ、ＫＤＥＬ及びそれらの組み合わせＬＲＲＲＲＬＫＤＥＬが含まれる。これらのシグナルの存在は、ＥＲにおけるペプチドの効果的な局在を高め、抗ウイルス活性に有利な影響を与える。［Ｔ］部分として、トリペプチドＧＧＧによって配列Ｓ７０〜Ｉ８６の［Ｉ］部分に結合した配列ＧＲＲも含まれる。図１Ｃに示したように、この一次構造を有するペプチドは、ＮＳ３ｐｒｏタンパク質のＣ末端ドメインに結合し、ＧＲＲ部分はプロテアーゼ活性部位に局在し、基質との相互作用を遮断する。リンカー部分として、表１及び２にトリペプチドＧＧＧ、ジペプチドＧＧ及びアミノ酸ベータアラニンが含まれる。
【００９２】
Ｎ末端がミリストイル化及びパルミトイル化されたペプチドも含まれる。これらのペプチドの脂質付加は、原形質膜への付着効率、細胞侵入及び最終的なＲＥ膜への局在を高める。脂質付加は、化学的方法によって実施される。表１及び２において、脂質は、Ｎ末端又はＮ末端ベータアラニン残基に直接結合する。
【００９３】
表１及び２に含まれる様々なペプチド部分は、複数のシグナル機能を表す。部分ＬＲＲＲＲＬＲＲＲＲＬ及びＬＲＲＲＲＬ−ｂＡｌａ−ＲＲＲＲＬは、細胞透過性ペプチドである以外に、２個の連続したＥＲ保持シグナルを含む。
【００９４】
ＤＶ３のエンベロープタンパク質の領域Ｓ３７６−Ｗ３９１の配列に対応する［Ｐ］部分はまた、細胞透過性ペプチドである以外に、細胞内へのウイルス侵入の阻害剤である。したがって、本発明のペプチドにおけるこれらの部分の使用は、これらのペプチドの阻害効果を高める。
【００９５】
本発明のペプチドは、単独で、又は融合タンパク質の一部として、化学合成又は組換えＤＮＡ技術によって得ることができた。融合タンパク質として発現させると、発現レベル及び宿主プロテアーゼによる分解に対するペプチドの安定性を高めることができる。これらのペプチド配列は、特定のプロテアーゼの基質配列に対応するリンカーによって融合タンパク質に結合させることができ、したがって、このペプチドは、連続したタンパク質分解及び精製によって単離することができる。
【００９６】
ペプチド合成
固相ペプチド合成は、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ方法を使用して、Ｆｍｏｃ−ＡＭ−ＭＢＨＡで実施した（Ｂａｒａｎｙ，Ｇ及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．９９（１９７７）７３６３〜７３６５）。合成は、多孔性フリットを装着した１０ｍｌシリンジで手動によって実施し、反応物及び溶媒は全て真空濾過によって廃棄した。アミノ酸は、ＤＩＣ／ＨＯＢｔで活性化して結合させ、ニンヒドリンアッセイによって結合反応の完了をモニターした（Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．、Ｃｏｌｅｓｃｏｔｔ，Ｒ．Ｌ．、Ｂｏｓｓｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｄ．、Ｃｏｏｋ，Ｐ．Ｉ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４（１９７０）５９５〜５９８）。
【００９７】
合成したペプチドは、ＴＦＡ／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（９４％／２．５％／２．５％／１％）の溶液で処理することによって樹脂から脱離させ、エーテルで沈殿させ、７２時間凍結乾燥した。ジスルフィド結合の形成によるペプチドの環化は、ＤＭＳＯで酸化させることによって実施した（Ａｎｄｒｅｕ，Ｄ．、Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，Ｆ．、Ｓｏｌ，Ｎ．Ａ．、Ｍｕｎｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．、Ｆｅｒｒｅｒ，Ｍ．及びＢａｒａｎｙ，Ｇ．、Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｍ．Ｗ．及びＤｕｎｎ，Ｂ．Ｍ．編、「ペプチド合成方法、分子生物学的方法（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、１９９４、９１〜１６９頁）。いずれの場合も、ペプチドはＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、収集した画分は分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによって再度分析した。各ペプチドの最終調製物は、クロマトグラフィーによる純度が９９％以上である画分を収集することによって得られた。各最終調製物のペプチドの量は、ＥＳＩ−ＭＳ質量分析によって確認した。
【００９８】
質量スペクトルは、Ｚスプレー電子噴霧イオン化源を装着した、八角型（ｏｃｔａｇｏｎａｌ ｇｅｏｍｅｔｒｙ）ＱＴＯＦ−２ＴＭを有するハイブリッド質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、ＵＫ）で取得した。
【００９９】
スペクトルの獲得及びプロセシングのために使用したソフトウェアは、ＭａｓｓＬｉｎｘ、バージョン３．５（Ｗａｔｅｒｓ、ＵＳＡ）であった。
【０１００】
（実施例２）
ベロ細胞におけるウイルス感染の阻害
本発明で記載したキメラペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける抗ウイルス活性を検証するために、ペプチドをベロ細胞におけるプラーク減少中和アッセイ（ＰＲＮＴ）で試験した。ベロ細胞は、２４ウェルプレートで約９０％コンフルエンスまで増殖させ、ＦＣＳを含まないＭＥＭ培地で２回洗浄した。ペプチド希釈物は、特定のアッセイにしたがって添加し、通常３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウイルスは感染効率０．１で添加し、その後３７℃で１時間引き続きインキュベートした。ある種の実験では、ペプチドは（プレインキュベーションしないで）ウイルスと同時に添加するか、又はペプチドプレインキュベーション時間を変更した。２回目のインキュベーションの終了時に、未結合のウイルスを洗浄によって排除し、溶解性プラークの出現を抑えるために、細胞を高密度培地（非必須アミノ酸、１％ＦＣＳ、１％カルボキシメチルセルロースを補給したＭＥＭ）で３７℃で５日間インキュベートした。プラークは、酢酸ナトリウム０．１５Ｍｏｌ／Ｌに溶かした０．１％ナフトールブルーブラックで染色することによって視覚化した。各アッセイの実験点毎に複製を２つ使用して、３回の独立した測定を実施した。阻害割合は、式、
【化１】
にしたがって計算した。
【０１０１】
図２は、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴ（表１のペプチド１）が、用量依存的に、ＤＶ２による感染を阻害し、ＩＣ５０が約５０〜６０μＭであることを示している。このペプチドは、このアッセイ条件で、細胞に対して毒性の徴候を示さなかった。ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの配列は、２個の必須のモジュール、細胞透過性部分ＴＡＴ及びプロテアーゼのＣ末端ドメインを標的化するプロテアーゼＮＳ３ｐｒｏ活性化阻害剤部分を含有する。ＴＡＴペプチドは、抗ウイルス活性を示さず、プラークの数の増加を引き起こす（図２Ｂ）。この結果は、ペプチド設計と矛盾せず、抗ウイルス活性は、ＶＤ２（Ｓ１６８０３株）に特異的に関連した部分に存在する。ＴＡＴペプチドの存在下で認められたウイルス感染増強は、このペプチドのＰＴＤ特性によって促進されたウイルスの細胞への侵入の増加が関連し得る。ＰＴＤによって媒介されるウイルスの細胞透過性増加は、その他の系で既に観察されている（Ｇｒａｔｔｏｎ ＪＰ，Ｙｕ Ｊ、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ＪＷ他、「細胞透過性ペプチドは、細胞摂取及び細胞内及びｉｎ ｖｉｖｏにおける複製欠損ウイルスの治療遺伝子輸送を高める（Ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．）」Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００３；９：３５７〜６３）。
【０１０２】
ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの配列におけるＴＡＴペプチド部分の存在は、ＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化阻害剤部分［Ｉ］自体がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて抗ウイルス活性を示さないので、抗ウイルス活性に必要である（図５）。
【０１０３】
図２は、キメラペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの抗ウイルス活性は、ウイルスを添加する前にペプチドを細胞と１時間プレインキュベートすれば増大することを示している。この結果は、ペプチドの抗ウイルス活性の標的が細胞内現象であり、プレインキュベーションによって大量のペプチドを細胞内に透過させ、ウイルス複製開始前にＥＲ膜に局在させるという事実と一致する。
【０１０４】
ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの抗ウイルス活性に対するプレインキュベーションの効果を特徴付けるために、プラーク減少中和、プレインキュベーション時間とペプチド用量との間の関係を研究した。陰性対照として、ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴに類似した構造を表す非関連キメラペプチドを使用した。このペプチドは、Ｎ末端にＴＡＴペプチドの配列、Ｃ末端にヒト乳頭腫ウイルスのタンパク質Ｅ７に結合を示した配列を含有する。図３は、ペプチド濃度が１００μＭ未満の場合、プレインキュベーションが抗ウイルス活性に必要で、この活性はプレインキュベーション時間が０時間と１時間との間で増加することを示している。この結果は、抗ウイルス効果の標的が細胞内に局在すること、及び細胞外空間からサイトゾルへペプチドを輸送することが必要であることと一致する。
【０１０５】
しかし、プレインキュベーションの１時間と３時間との間には、大きな差は認められない。可能性のある１つの説明は、これらの時間で、サイトゾル中のペプチド蓄積の動態とペプチドの細胞内分解との間が平衡に達するということであろう。
【０１０６】
陰性対照ペプチドは、アッセイした条件のいずれにおいても抗ウイルス活性を示さず、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの抗ウイルス効果が特にＮＳ２Ｂタンパク質に対応する部分の配列によることを示している。
【０１０７】
図４は、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの抗ウイルス活性が細胞内効果に関連していることを示す他の証拠を示す。この場合、既に記載された通常のアッセイ条件の他に（図４Ａ）、ウイルスを添加する前に、細胞を連続的に洗浄することによってペプチドを培地から回収したとき、ペプチドの抗ウイルス活性も測定した（図４Ｂ）。両方のアッセイ条件下において、ペプチドの抗ウイルス活性は非常に類似しており、抗ウイルス効果は既に内部移行したペプチドに左右されることを示している。これらのアッセイにおいて、表１のペプチド１８は陰性対照として使用された。このペプチドは、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴと類似した設計であるが、Ｃ末端部分はＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴのＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化阻害剤［Ｉ］部分と同じ長さ及びアミノ酸組成の配列から成っているが、元の配列がランダム化されていた。このペプチドは、いずれの条件においても抗ウイルス活性を示さず、ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの抗ウイルス活性は、ＮＳ２Ｂの選択された配列断片に左右されることを示している。
【０１０８】
（実施例３）
ペプチドの抗ウイルス活性に対する細胞透過性ペプチドの性質及びＥＲ保持シグナルの効果
細胞透過性ペプチド及びＥＲ保持シグナルの本発明のペプチドの抗ウイルス活性に対する役割を決定するために、表１のペプチド番号１、２、３及び４のベロ細胞のＶＤ２によるウイルス感染の阻害を実施例２で記載したアッセイを使用して試験した。
【０１０９】
ペプチド２及び３は、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴ（ペプチド１）と類似の一次構造を有するが、細胞透過性部分としてそれぞれペネトラチン及びデカアルギニンを表す。ペプチド４は、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴのＣ末端にＫＤＥＬシグナルが付加されている。ペプチド４のＣ末端基は、ＥＲ保持シグナルを機能させるために、カルボキシである。
【０１１０】
図５及び表３は、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２−ｐＲＲ（表１のペプチド３）がより高い抗ウイルス活性、すなわち、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴよりほとんど一桁大きな効力を表すことを示している。可能性のある１つの説明は、デカアルギニンペプチドは、細胞の細胞内環境においてタンパク質分解により耐性であることである（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｋ．、Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋ，Ｍ．及びＢｒｏｃｋ，Ｒ．２００４．「陽イオン細胞透過性ペプチドの細胞内での動態の段階的分析（Ａ ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆａｔｅ ｏｆ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９、１２６２５〜３５）。ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２−ｐＰ２（ペプチド２）は、ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴと類似の抗ウイルス活性を示すが、顕著な細胞傷害性を示す。ＫＤＥＬシグナルを付加すると、ペプチドの抗ウイルス活性が少し増加し、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴはサイトゾルに接近するために少なくとも部分的に逆方向輸送を使用することが示唆される。
【０１１１】
細胞透過性部分を欠落したペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２は、抗ウイルス活性を阻害せず、この種類の部分の包含が本発明のペプチドに必要であることを示している。
表３ ベロ細胞におけるペプチドのＰＲＮＴ５０及び細胞傷害性（ＣＴＥ）
【表３】
ＣＴＥ：細胞傷害性効果、値は、単層の５０％まで障害を与えるペプチド濃度を示す。
【０１１２】
（実施例４）
同種及び異種ウイルスに対するペプチドの抗ウイルス活性
抗ウイルス薬に期待される特性は、少なくとも関連する最も類似したウイルスに対して、広範囲の抗ウイルス活性を有することである。デングウイルスに対する抗ウイルス分子の開発においてもこのことは事実で、１）デングは実際に４種の異なるウイルスの複合体であり、２）早期の特異的な診断には困難があり、３）感染した国では、デングはしばしば風土性があり、複数の血清型の同時循環が生じる。
【０１１３】
４種類のデング血清型は、構造的及び非構造的タンパク質が類似のアミノ酸配列（同一性７０〜８０％）を有する関連ウイルスである。したがって、ＮＳ２Ｂ及び／又はＮＳ３ｐｒｏのアミノ酸配列の違いが本発明のペプチドの異種ウイルスに対する感染阻害能力に影響を及ぼし得ることは合理的である。
【０１１４】
本発明のペプチドの抗ウイルス活性の交差反応性及び血清型特異性を評価するために、表１のペプチド１、３及び６のベロ細胞のＤＶ１〜３によるウイルス感染の阻害を実施例２で記載したアッセイを使用して試験した。試験したウイルス株は、ＤＶ１のＷｅｓｔ Ｐａｃ ７４、ＤＶ２のＳ１６８０３及びＤＶ３のＣＨ５３４８９であった。ペプチド６（ＮＳ２Ｂｄｅｎ１＋ＴＡＴ）は、ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴと類似の一次構造を有するが、ＤＶ１のタンパク質ＮＳ２Ｂに対応するＮＳ３活性阻害剤部分を有する。コンピュータ方法によって設計されたペプチド５の分析も含めた。
【０１１５】
図６は、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ｐＲＲ（表１のペプチド３）が３種類の血清型に対して同等の効力であることを示している。ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴはまた、抗ウイルス活性が低いが血清型１〜３を阻害する。しかし、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ１＋ＴＡＴ（ペプチド６）は、血清型１及び３に対して部分的な阻害しか示さない。この結果は、血清型１及び３が互いに系統学的に近く、それらのタンパク質はより類似している事実と一致する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、製薬業界に関し、より具体的には、一次構造がフラビウイルス科ファミリーのウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害する少なくとも１個の部分を保持するキメラペプチドに関し、これらのキメラペプチドは細胞透過性部分も含み、ウイルス感染を阻害又は軽減することができる。本発明はまた、フラビウイルス科ファミリーのウイルスが原因の感染を予防及び／又は治療するためのキメラペプチドを含有する医薬化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラビウイルス科ファミリーは、３種類の属、フラビウイルス、ヘパシウイルス及びペスチウイルスの１種に属するエンベロープ型プラス一本鎖ＲＮＡウイルスによって構成される。フラビウイルス属は、７０種を上回るウイルスを含み、それらの多くがヒト及びその他の種の関連疾患を引き起こす。この属の構成要素は、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）、デング熱ウイルス（ＤＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）及びその他である。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、ヘパシウイルスの原型である。ペスチウイルス属の構成要素として、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、ボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）及びその他が発見されている。
【０００３】
フラビウイルス科ファミリーの異なる属に属するウイルスは、抗原の交差反応を示さず、異なる生物学的特性を示すが、ウイルス粒子形態、ゲノム組成及び複製方法などの面では明らかな類似性を示す（Ｌｅｙｓｓｅｎ，Ｐ．、Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ，Ｅ．、Ｎｅｙｔｓ，Ｊ．２０００「フラビウイルス科による感染治療の展望（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ．）」Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．、３：６７〜８２；Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．１９９６．「フラビウイルス科：ウイルス及び複製（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」９３１〜９６０頁；Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ及びＰ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ編、Ｆｉｅｌｄｓ ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３版、１巻、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．；Ｗｅｓｔａｗａｙ，Ｅ．Ｇ．１９８７．「フラビウイルス複製方法（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ）」Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３３：４５〜９０）。
【０００４】
ＨＣＶは、世界的に重要な健康問題となっている。ＷＨＯによると、世界人口の約３％がこのウイルスに感染しており、慢性的キャリアの１億７０００万人超が肝硬変及び／又は肝臓癌を発症する危険があることが指摘されている（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｐａｎｅｌ．ＥＡＳＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ、Ｐａｒｉｓ，２６〜２８ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９９９、Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ．Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．、１９９９、３０、９５６）。毎年約３〜４００万例のＨＣＶによる新たな感染が世界中で発生している（Ｔａｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｐａｕｓｅ，Ａ．、Ｓｈｉ，Ｙ．＆ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１、８６７〜８８１）。感染した患者の少なくとも８５％が慢性的感染に進行する（Ａｌｔｅｒ，Ｍ．Ｊ．、Ｅ．Ｅ．Ｍａｓｔ、Ｌ．Ａ．Ｍｏｙｅｒ及びＨ．Ｓ．Ｍａｒｇｏｌｉｓ．１９９８．Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ．ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．１２：１３〜２６）。慢性Ｃ型肝炎は、症候性にせよ無症候性にせよ肝硬変及び／又は癌になることが多い。１０〜２０年間実施した追跡研究によって、患者の２０〜３０％が肝硬変を発症し、これらの患者の１〜５％がさらに１０年後には癌を発症し得ることが示された（Ｄｕｔｔａ，Ｕ．、Ｊ．Ｋｅｎｃｈ，Ｋ．Ｂｙｔｈ，Ｍ．Ｈ．Ｋｈａｎ，Ｒ．Ｌｉｎ，Ｃ．Ｌｉｄｄｌｅ及びＧ．Ｃ．Ｆａｒｒｅｌｌ．１９９８．「肝細胞の増殖及び肝細胞癌の発症：慢性Ｃ型肝炎における症例対照研究（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａ ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ．）」Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２９：１２７９〜１２８４；Ｐｏｎｔｉｓｓｏ，Ｐ．、Ｃ．Ｂｅｌｌｕｃｏ，Ｒ．Ｂｅｒｔｏｒｅｌｌｅ，Ｌ．Ｄｅ Ｍｏｌｉｎｅｒ，Ｌ．Ｃｈｉｅｃｏ Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｄ．Ｎｉｔｔｉ，Ｍ．Ｌｉｓｅ及びＡ．Ａｌｂｅｒｔｉ．１９９８．「ヒト肝細胞癌に関係するＣ型肝炎ウイルス感染：コーカサス人患者におけるｐ５３異常との関連性の欠如（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｌａｃｋ ｏｆ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐ５３ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｃａｕｃａｓｉａｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ．）」Ｃａｎｃｅｒ ８３：１４８９〜１４９４）。合衆国ではＨＣＶが原因の年間死亡数は、２００８年で３５０００件に至り得る見込みである（Ｄｕｔｔａ，Ｕ．、Ｊ．Ｋｅｎｃｈ、Ｋ．Ｂｙｔｈ、Ｍ．Ｈ．Ｋｈａｎ、Ｒ．Ｌｉｎ、Ｃ．Ｌｉｄｄｌｅ及びＧ．Ｃ．Ｆａｒｒｅｌｌ．１９９８．「肝細胞の増殖及び肝細胞癌の発症：慢性Ｃ型肝炎における症例対照研究（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａ ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ．）」Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２９：１２７９〜１２８４；Ｐｏｎｔｉｓｓｏ，Ｐ．、Ｃ．Ｂｅｌｌｕｃｏ、Ｒ．Ｂｅｒｔｏｒｅｌｌｅ、Ｌ．Ｄｅ Ｍｏｌｉｎｅｒ、Ｌ．Ｃｈｉｅｃｏ Ｂｉａｎｃｈｉ、Ｄ．Ｎｉｔｔｉ、Ｍ．Ｌｉｓｅ及びＡ．Ａｌｂｅｒｔｉ．１９９８．「ヒト肝細胞癌に関係するＣ型肝炎ウイルス感染：コーカサス人患者におけるｐ５３異常との関連性の欠如（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｌａｃｋ ｏｆ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐ５３ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｃａｕｃａｓｉａｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ．）」Ｃａｎｃｅｒ ８３：１４８９〜１４９４）。
【０００５】
現在、ＦＤＡによって認可された抗ＨＣＶ治療は、インターフェロン単独療法及びインターフェロン−リバビリン併用療法である（Ｄｙｍｏｃｋ，Ｂ．Ｗ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｄｒｕｇｓ ２００１、６（１）、１３及びその中の参考文献）。最近、ペグ化されたインターフェロン変種の使用が承認され、これらの治療の治療効果が増大しているが、まだ理想からは遠くかけ離れている。この疾患は重篤であるため、より効果的な新規治療が必要とされている。
【０００６】
ヒトに感染するフラビウイルスは、マダニ及び蚊などの節足動物によって伝染し、そのことがこれらの疾患の根絶を困難にしている（Ｍｏｎａｔｈ，Ｔ．Ｐ．及びＦ．Ｘ．Ｈｅｉｎｚ．１９９６．Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ、９６１〜１０３４頁、Ｉｎ Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ及びＰ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ編、Ｆｉｅｌｄｓ ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３版、１巻、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．）。黄熱病は、今もなお出血熱の重要な原因であり、ワクチンが既に使用できるにもかかわらず、死亡率は５０％と高い。
【０００７】
デングウイルスは、熱帯地方で大流行しており、その再出現は、ますます世界的な公衆衛生問題である。年間約１億のデングウイルス感染が起こっており、２５億人が流行地域に居住している、と推定される（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｄ．Ｊ．１９９８．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１１、４８０〜４９６；Ｍｏｎａｔｈ，Ｔ．Ｐ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１、２３９５〜２４００）。１９９０〜１９９８の期間、ＷＨＯに報告されたデング出血熱（ＤＨＦ）の平均症例数は、１５０００例の死亡を含めて１年当たり５１４１３９例であったが、実際の罹患数は数倍であると考えられる。しかし、ワクチンも特異的な抗ウイルス治療薬も市販されていない。デングウイルス複合体は、遺伝的及び抗原的に関連した４種類の異なるウイルス又は血清型（ＶＤ１〜ＶＤ４）によって構成されている。ＤＶは、蚊、主にネッタイシマカによってヒトに伝染する。感染は、無症候性及び良性から未分化型熱性疾患又はＤＨＦのようなより重度の徴候及び致死性デングショック症候群（ＤＳＳ）まで様々な異なる臨床徴候を引き起こす。最も重度の臨床徴候は、２種類の異なる血清型の連続感染に関連していることが多い（Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．「デングウイルスの中和及び抗体依存性増強（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓｅｓ．）」Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．６０：４２１〜６７、４２１〜４６７、２００３．Ｈａｍｍｏｎ ＷＭｃ．「フィリピン及びタイの子供達の新規出血熱（Ｎｅｗ ｈａｅｍｏｒｒａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈａｉｌａｎｄ．）」Ｔｒａｎｓ Ａｓｓｏｃ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ １９６０；７３：１４０〜１５５）。疫学的研究が実施され、異なる血清型による連続感染が重度の疾患の危険因子である証拠が示された（Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．「デングウイルスの中和及び抗体依存性増強（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓｅｓ．）」Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．６０：４２１〜６７、４２１〜４６７、２００３。Ｈａｍｍｏｎ ＷＭｃ．「フィリピン及びタイの子供達における新規出血熱（Ｎｅｗ ｈａｅｍｏｒｒａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈａｉｌａｎｄ．）」Ｔｒａｎｓ Ａｓｓｏｃ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ １９６０；７３：１４０〜１５５）。この現象は、「抗体依存性増強（ＡＤＥ））の理論によって説明されており、感染力の増加が感染細胞のＦＣ受容体によって媒介されるウイルスのより効果的な細胞侵入と関連することを指摘している（Ｈａｌｓｔｅａｄ ＳＢ．「デング熱の病変形成：分子生物学への挑戦（Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ：ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｔｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．）」Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８；２３９：４７６〜４８１）。
【０００８】
その他のフラビウイルスは、世界的なウイルス性脳炎の主な原因であるＪＥＶである。アジアでは１年間に約５００００例が生じ、死亡率は３０％と高く、症例の３０％において長期間持続する神経性疾患が生じる（Ｋａｌｉｔａ，Ｊ．、及びＵ．Ｋ．Ｍｉｓｒａ．１９９８．「日本脳炎におけるＥＥＧ：臨床放射線学的関連（ＥＥＧ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ：ａ ｃｌｉｎｉｃｏｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ．）」Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ．Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．１０６：２３８〜２４３；Ｋａｌｕｚｏｖａ，Ｍ．、Ｅ．Ｅｌｅｃｋｏｖａ，Ｅ．Ｚｕｆｆｏｖａ，Ｊ．Ｐａｓｔｏｒｅｋ，Ｓ．Ｋａｌｕｚ，Ｏ．Ｋｏｚｕｃｈ及びＭ．Ｌａｂｕｄａ．１９９４．「弱毒化マダニ媒介性脳炎ウイルス変異体の復帰病原性は、推定ウイルスエンベロープタンパク質のアミノ酸配列における変化を伴わない（Ｒｅｖｅｒｔｅｄ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｍｕｔａｎｔ ｉｓ ｎｏｔ ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｄｅｄｕｃｅｄ ｖｉｒａｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．）」Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ．３８：１３３〜１４０）。
【０００９】
重症の脳炎はまた、ＴＢＥＶのようなその他のフラビウイルスによって引き起こされ、このウイルスには２種類のサブタイプ、関連死亡率が２０％である東型及び１〜２％である西型がある（Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．及びＣ．Ｗ．Ｍａｎｄｌ．１９９３．「マダニ媒介性脳炎ウイルスの分子生物学（Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ．）」ＡＰＭＩＳ １０１：７３５〜７４５）；オーストラリアにおけるマレー渓谷脳炎（ＭＶＥ）（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ，Ｊ．Ｓ．、及びＡ．Ｋ．Ｂｒｏｏｍ．１９９５．「オーストラリアのＸ疾患、マレー渓谷脳炎及びフランスの関係（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｘ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｆｒｅｎｃｈ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ．）」Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：７９〜９０）；合衆国西部におけるＳＬＥＶ並びにアフリカ、中東及び地中海で流行するＷＮＶはまた、最近合衆国で大流行した。１９９９年に合衆国に出現してから、非常に迅速に拡大し、約１５０００人が感染し、死者は６００人を上回った。しかし、現在のところ、有用なワクチンや、ＷＮＶを防御する薬物はない（ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ，Ｋ．Ｍ．、Ｐｅｎｓａｅｒｔ，Ｍ．Ｂ．及びＮａｕｗｙｎｃｋ，Ｈ．Ｊ．（２００５）「脊椎動物界における西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｔｈｅ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｗｏｒｌｄ．）」Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１５０、６３７〜６５７）。
【００１０】
出血性の徴候は、死亡率が０．５〜３％であるロシアのオムスク出血熱ウイルス（ＯＨＦＶ）及びインドのキャサヌール森林病ウイルス（ＫＦＤＶ）のようなその他のフラビウイルスによって引き起こされる（Ｍｏｎａｔｈ，Ｔ．Ｐ．及びＦ．Ｘ．Ｈｅｉｎｚ．１９９６．Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ、９６１〜１０３４頁、Ｉｎ Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ及びＰ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ編、Ｆｉｅｌｄｓ ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３版、１巻、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．）。
【００１１】
その他のフラビウイルス、跳躍病ウイルス（ＬＩＶ）は主にヒツジに感染するが、時折ヒト感染も報告されてきた（Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｍ．Ｍ．、Ｈ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＪ．Ａ．Ｍａｃｌｅｏｄ．１９９１．「人における跳躍病：忘れられた病気（Ｌｏｕｐｉｎｇ ｉｌｌ ｉｎ ｍａｎ：ａ ｆｏｒｇｏｔｔｅｎ ｄｉｓｅａｓｅ．）」Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．２３：２４１〜２４９）。
【００１２】
ペスチウイルスＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ及びＢＤＶは、動物において重大な疾患を引き起こす。これらのウイルスは、その他の宿主においてはより軽度の疾患を引き起こすが、それぞれの宿主においては、通常死に至る重度の疾患を引き起こす。しばしば、感染は、口腔鼻又は胎盤経路によって生じる。後者は、残りの家畜にとって脅威となる持続性感染に関与する（Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｓ．、Ｐ．Ｍ．Ｒｏｅｈｅ及びＧ．Ｉｂａｔａ．１９９５．「実験用ブタ及びヒツジにおけるボーダー病及び近縁ウイルス感染の比較研究（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｂｏｒｄｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐｉｇｓ ａｎｄ ｓｈｅｅｐ．）」Ｂｒ．Ｖｅｔ．Ｊ．１５１：１８１〜１８７）。
【００１３】
いくつかのフラビウイルス科ファミリーは、類似の複製方法を共有すると推定される。ウイルス複製サイクルは、宿主細胞表面へのウイルスの付着によって開始する。デングウイルスの場合、ウイルスは、細胞との相互作用の最初の部位であり得るグリコサミノグリカンに結合することが示された。ウイルスがＤＣ−ＳＩＧＮに結合することも示されたが、これらの分子の役割は、細胞表面上又はｉｎ ｖｉｖｏにおける第２の複製部位に広がったウイルスのウイルス濃度に関係するようである。ウイルスは最初に結合した後、エンドサイトーシスによるウイルスの細胞内侵入を媒介する親和性の高い受容体及び／又は共受容体と相互作用する。ＷＮＶの場合、αｖβ３インテグリンが、これらの手段として役立つことができると仮定された（Ｃｈｕ，Ｊ．Ｊ−Ｈ．及びＮｇ，Ｍ．−Ｌ．、２００４．「西ナイルウイルスと、αｖβ３インテグリンとの相互作用は、ウイルスの細胞内侵入を媒介する（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ Ｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ αｖβ３ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｍｅｄｉａｔｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｅｎｔｒｙ ｉｎｔｏ Ｃｅｌｌｓ．）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７９、５４５３３〜５４５４１）。ＨＣＶは細胞受容体ＣＤ８１に結合することも示された（Ｐｉｌｅｒｉ，Ｐ．、Ｙ．Ｕｅｍａｔｓｕ、Ｓ．Ｃａｍｐａｇｎｏｌｉ，Ｇ．Ｇａｌｌｉ、Ｆ．Ｆａｌｕｇｉ、Ｒ．Ｐｅｔｒａｃｃａ、Ａ．Ｊ．Ｗｅｉｎｅｒ、Ｍ．Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、Ｄ．Ｒｏｓａ、Ｇ．Ｇｒａｎｄｉ及びＳ．Ａｂｒｉｇｎａｎｉ．１９９８．「Ｃ型肝炎ウイルスのＣＤ８１への結合（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｔｏ ＣＤ８１．）」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：９３８〜９４１）。ウイルスが一旦エンドサイトーシス区画に局在すると、この区画のｐＨが下降してウイルスと細胞膜との間の融合プロセスを誘導し、このプロセスはウイルスエンベロープの融合タンパク質の構造変化によって媒介される。このプロセスによって、ウイルスキャプシドが細胞質中に解放され、その後細胞質にウイルスＲＮＡが放出される。
【００１４】
細胞質中で、ウイルスのゲノムＲＮＡは非翻訳５′領域（５′ＵＴＲ）を介してリボソームと相互作用し、ウイルス固有のオープンリーディングフレームの翻訳を引き起こす。このように、フラビウイルスの場合では、３種類の構造タンパク質（Ｃ、プレＭ及びＥ）及び５種類の非構造タンパク質（ＮＳ１〜５）を含む前駆体ウイルスポリタンパク質が合成される。次に、このポリタンパク質は、翻訳と同時に、及び翻訳後に修飾され、ウイルスの個々の成熟した機能的タンパク質が形成される。関連補因子と共にウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、マイナス一本鎖ＲＮＡのコピーを生成し、これはその後ゲノムプラス一本鎖ウイルスＲＮＡの合成の鋳型として使用される。複製に関連するウイルスタンパク質は、小胞体（ＥＲ）に関連すると考えられる膜状構造と結合する。
【００１５】
複製完了後、ゲノムＲＮＡはヌクレオキャプシドと結合し、未熟なウイルス粒子がＥＲの内腔に発芽し（発芽はＥＲの膜又はウイルスによって誘導された関連膜状構造で生じる）、ウイルスタンパク質を含有する脂質エンベロープによって覆われる。細胞外経路を通過して、エンベロープタンパク質はグリコシル化され、成熟して、成熟したウイルス粒子を最終的に細胞外空間へ放出する。
【００１６】
フラビウイルス科の複製には、前駆体ポリタンパク質が正確にプロセシングされるためにＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ（非構造タンパク質ＮＳ３の最初の１８０個の残基の近隣に局在している）が必要であり、これは抗ウイルス薬の設計に関して魅力的な潜在的標的を構成する（Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｋ．Ｊ．、Ｎａｌｌ，Ｔ．Ａ．、Ｓｔｏｅｒｍｅｒ，Ｍ．Ｊ．、Ｆａｎｇ，Ｎ．Ｘ．、Ｔｙｎｄａｌｌ，Ｊ．Ｄ．、Ｆａｉｒｌｉｅ，Ｄ．Ｐ．及びＹｏｕｎｇ，Ｐ．Ｒ．（２００５）「西ナイルウイルスＮＳ３プロテアーゼの部位特異的変異誘発及び動態の研究は、鍵となる酵素−基質相互作用を明らかにする（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ Ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０、２８９６〜２９０３．ＳＨＩＲＹＡＥＶ，Ｓ．Ａ．、ＲＡＴＮＩＫＯＶ，Ｂ．Ｉ．、ＣＨＥＫＡＮＯＶ，Ａ．Ｖ．、ＳＩＫＯＲＡ，Ｓ．、ＲＯＺＡＮＯＶ，Ｄ．Ｖ．、ＧＯＤＺＩＫ，Ａ．、ＷＡＮＧ，Ｊ．、ＳＭＩＴＨ，Ｊ．Ｗ．、ＨＵＡＮＧ，Ｚ．、ＬＩＮＤＢＥＲＧ，Ｉ．、ＳＡＭＵＥＬ，Ｍ．Ａ．、ＤＩＡＭＯＮＤ，Ｍ．Ｓ．及びＡｌｅｘ Ｙ．ＳＴＲＯＮＧＩＮ，Ａ．Ｙ．、２００６．「西ナイルウイルスＮＳ３プロセシングプロテイナーゼの切断標的及びＤ−アルギニンをベースにした阻害剤（Ｃｌｅａｖａｇｅ ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｄ−ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ．）」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３９３、５０３〜５１１．Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖ，Ａ．Ａ．；Ｍｉｈａｌｉｋ，Ｋ．；Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ，Ｓ．Ｍ．；Ｒｉｃｅ、Ｃ．Ｍ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０００、７４、２０４６；Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｒ．；Ｌｏｈｍａｎｎ，Ｖ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２０００、８１、１６３１．Ｍａｔｕｓａｎ，Ａ．Ｅ．、Ｋｅｌｌｅｙ，Ｐ．Ｇ．、Ｐｒｙｏｒ，Ｍ．Ｊ．、Ｗｈｉｓｓｔｏｃｋ，Ｊ．Ｃ．、Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ａ．Ｄ．及びＷｒｉｇｈｔ，Ｐ．Ｊ．（２００１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２、１６４７〜１６５６）。
【００１７】
フラビウイルスでは、このプロテアーゼは接合部、ＮＳ２Ａ／ＮＳ２Ｂ、ＮＳ２Ｂ／ＮＳ３、ＮＳ３／ＮＳ４Ａ及びＮＳ４Ｎ／ＮＳ５でのタンパク質分解性切断並びにＣ、ＮＳ３及びＮＳ４Ａでの内部切断を担う（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｔ．Ｊ．、Ｎｅｓｔｏｒｏｗｉｃｚ，Ａ．、Ａｍｂｅｒｇ，Ｓ．Ｍ．及びＲｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．（１９９３）「黄熱病ウイルスＮＳ２Ｂタンパク質の変異誘発：タンパク質分解性プロセシング、ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３複合体形成及びウイルス複製に対する影響（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ ＮＳ２Ｂ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７、６７９７〜６８０７．Ｊａｎ，Ｌ．Ｒ．、Ｙａｎｇ，Ｃ．Ｓ．、Ｔｒｅｎｔ，Ｄ．Ｗ、Ｆａｌｇｏｕｔ，Ｂ．及びＬａｉ，Ｃ．Ｊ．（１９９５）「日本脳炎ウイルス非構造タンパク質：ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３複合体のプロセシング及び異種プロテアーゼ（Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．）」Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６、５７３〜５８０．Ｌｏｂｉｇｓ，Ｍ．（１９９３）「フラビウイルスのプレメンブレン（ｐｒｅｍｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質切断及びスパイクヘテロ２量体分泌にはウイルスプロテイナーゼＮＳ３の機能が必要である（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｐｒｅｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ｓｐｉｋｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｒｅｑｕｉｒｅ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ＮＳ３．）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０、６２１８〜６２２２．Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖ，Ｖ．Ｆ．及びＣｏｍｐａｎｓ，Ｒ．Ｗ．（１９９４）「西ナイルウイルスキャプシドタンパク質細胞内型のウイルスＮＳ２Ｂ−ＮＳ３プロテアーゼによるプロセシング：ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究（Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｏｒｍ ｏｆ ｔｈｅ ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３ ｐｒｏｔｅａｓｅ：ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｔｕｄｙ．）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８、５７６５〜５７７１）。
【００１８】
ＨＣＶでは、ＮＳ３ｐｒｏは、タンパク質ＮＳ２−ＮＳ５Ｂの間に含まれる部分のウイルスポリタンパク質のタンパク質分解性プロセシングを媒介する（Ｒ．Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ、１９９９「Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３／４Ａプロテイナーゼ：異常酵素の構造及び機能及び抗ウイルス治療のための主要標的の解明（Ｔｈｅ ＮＳ３／４Ａ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ：ｕｎｒａｖｅｌｌｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｕｎｕｓｕａｌ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ａ ｐｒｉｍｅ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ．）」Ｊ．Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．６、１６５〜）。
【００１９】
ウイルスタンパク質をプロセシングするウイルス複製サイクルにおいてＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼが果たす中心的役割の他に、このタンパク質はまた、サイトゾルをプロセシングすることができるので、細胞損傷及び病理発生の様々な機構に関与することができるであろう（Ｓｈｉｒｙａｅｖ，Ｓ．Ａ．、Ｒａｔｎｉｋｏｖ，Ｂ．Ｉ．、Ｃｈｅｋａｎｏｖ，Ａ．Ｖ．、Ｓｉｋｏｒａ，Ｓ．、Ｒｏｚａｎｏｖ，Ｄ．Ｖ．、Ｇｏｄｚｉｋ，Ａ、Ｗａｎｇ，Ｊ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｗ．、Ｈｕａｎｇ，Ｚ．、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，Ｉ．、Ｓａｍｕｅｌ，Ｍ．Ａ．、Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｍ．Ｓ．及びＳｔｒｏｎｇｉｎ，Ａ．Ｙ．（２００５）「西ナイルウイルスＮＳ３プロセシングプロテイナーゼの切断標的及び（Ｄ）−アルギニンをベースにした阻害剤（Ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ（Ｄ）−ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ．）」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３９３、５０３〜５１１）。
【００２０】
こうして、ＷＮＶのＮＳ３プロテアーゼが神経ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のタンパク質分解性切断を引き起こすことが示された。ＤＶ及びＷＮＶに関して、ＮＳ３はウイルス媒介性アポトーシスの誘導に関与することが示唆された（Ｒａｍａｎａｔｈａｎ，Ｍ．Ｐ．、Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｊ．Ａ．、Ｐａｎｋｈｏｎｇ，Ｐ．、Ｃｈａｔｔｅｒｇｏｏｎ，Ｍ．、Ａｔｔａｔｉｐｐａｈｏｌｋｕｎ，Ｗ．、Ｄａｎｇ，Ｋ．、Ｓｈａｈ，Ｎ．及びＷｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．（２００５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ｄｏｉ：１０／１０１６／ｊ．ｖｉｒｏｌ．２００５．０８．０４３）。
【００２１】
最適な機能のためには、ＮＳ３プロテアーゼは、その他のウイルス性タンパク質又は補因子、フラビウイルスではＮＳ２Ｂタンパク質、並びにヘパシウイルス及びペスチウイルスではＮＳ４Ａとの相互作用が必要である。ＤＶでは、ＮＳ２Ｂが存在すると、ＮＳ３のタンパク質分解活性の３３００倍から６６００倍の増大が誘導される（Ｙｕｓｏｆ，Ｒ．、Ｃｌｕｍ，Ｓ．、Ｗｅｔｚｅｌ，Ｍ．、Ｍｕｒｔｈｙ，Ｈ．Ｍ．＆ Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ，Ｒ．、２０００．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、９９６３〜９９６９）。
【００２２】
ＨＣＶでは、ＮＳ３のＮＳ４Ａへの結合には、ＮＳ３／４Ａ、ＮＳ４Ａ／Ｂ及びＮＳ４Ｂ／５Ａでのタンパク質分解性切断が必要で、接合部ＮＳ５Ａ／Ｂでのプロセシングの効率が増大する（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ Ｒ、Ａｈｌｂｏｒｎ ＬＬ、Ｍｏｕｓ Ｊ、Ｊａｃｏｂｓｅｎ Ｈ．「Ｃ型肝炎ウイルスポリタンパク質プロセシングの動態及び構造分析（Ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９４；６：５０４５〜５０５５．Ｆａｉｌｌａ Ｃ、Ｔｏｍｅｉ Ｌ、Ｄｅ Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ Ｒ．「ＮＳ３及びＮＳ４ＡはいずれもＣ型肝炎ウイルス非構造タンパク質のタンパク質分解性プロセシングに必要である（Ｂｏｔｈ ＮＳ３ ａｎｄ ＮＳ４Ａ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｃ ｖｉｒｕｓ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９４；６：３７５３〜３７６０．Ｌｉｎ Ｃ、Ｐｒａｇａｉ ＢＭ， Ｇｒａｋｏｕｉ Ａ、Ｘｕ Ｊ、Ｒｉｃｅ ＣＭ．「Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３セリンプロテイナーゼ：トランス切断の必要性及びプロセシングの動態（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ：ｔｒａｎｓ−ｃｌｅａｖａｇｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ．）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９４；６：８１４７〜８１５７．Ｔａｎｊｉ Ｙ、Ｈｉｊｉｋａｔａ Ｍ、Ｓａｔｏｈ Ｓ、Ｋａｎｅｋｏ Ｔ、Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ Ｋ．「Ｃ型肝炎ウイルスがコードする非構造タンパク質ＮＳ４Ａはウイルスタンパク質プロセシングにおいて多種多様な機能を有する（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＳ４Ａ ｈａｓ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９５；６：１５７５〜１５８１）。ＮＳ４Ａ断片をＮＳ３ｐｒｏに１０倍モル過剰で付加すると、触媒効率係数Ｋｃａｔ／Ｋｍが約４０倍増加する（ＳＨＩＭＩＺＵ，Ｙ、ＹＡＭＡＪＩ，Ｋ．、ＭＡＳＵＨＯ，Ｙ．、ＹＯＫＯＴＡ，Ｔ．、ＩＮＯＵＥ，Ｈ．、ＳＵＤＯ，Ｋ．、ＳＡＴＯＨ，Ｓ．ｙ ＳＨＩＭＯＴＯＨＮＯ，Ｋ．１９９６．「ＮＳ５Ａ／５Ｂ部位のＣ型肝炎ウイルスＮＳ３プロテアーゼによる切断増強に必要なＮＳ４Ａの配列の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｎ ＮＳ４Ａ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ＮＳ５Ａ／５Ｂ Ｓｉｔｅ ｂｙ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ Ｐｒｏｔｅａｓｅ．）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７０、１２７〜１３２）。
【００２３】
ＮＳ３ｐｒｏ及びＤＶのＮＳ３ｐｒｏ−ＮＳ２Ｂ複合体及びＷＮＶのＮＳ３−ＮＳ２Ｂとペプチド阻害剤によって形成された複合体の結晶構造が実験的に決定された（Ｍｕｒｔｈｙ，Ｈ．Ｍ．、Ｃｌｕｍ，Ｓ．＆ Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ，Ｒ．、１９９９．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４、５５７３〜５５８０．Ｍｕｒｔｈｙ，Ｈ．Ｍ．、Ｊｕｄｇｅ，Ｋ．、ＤｅＬｕｃａｓ，Ｌ．＆ Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ，Ｒ．、２０００．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０１、７５９〜７６７．Ｅｒｂｅｌ Ｐ、Ｓｃｈｉｅｒｉｎｇ Ｎ、Ｄ’Ａｒｃｙ Ａ、Ｒｅｎａｔｕｓ Ｍ、Ｋｒｏｅｍｅｒ Ｍ、Ｌｉｍ ＳＰ、Ｙｉｎ Ｚ、Ｋｅｌｌｅｒ ＴＨ、Ｖａｓｕｄｅｖａｎ ＳＧ、Ｈｏｍｍｅｌ Ｕ．、２００６．「デングウイルス及び西ナイルウイルスのフラビウイルスＮＳ３プロテアーゼの活性化の構造的基盤（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌａｖｉｖｉｒａｌ ＮＳ３ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｆｒｏｍ ｄｅｎｇｕｅ ａｎｄ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ．）」Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）。同様に、ＨＣＶのＮＳ３ｐｒｏ及びＮＳ３ｐｒｏ／ＮＳ４Ａ複合体の結晶構造も決定された（Ｌｏｖｅ，Ｒ．Ａ．、Ｐａｒｇｅ，Ｈ．Ｅ．、Ｗｉｃｋｅｒｓｈａｍ，Ｊ．Ａ．、Ｈｏｓｔｏｍｓｋｙ，Ｚ．、Ｈａｂｕｋａ，Ｎ．、Ｍｏｏｍａｗ，Ｅ．Ｗ．、Ａｄａｃｈｉ，Ｔ．、Ｈｏｓｔｏｍｓｋａ，Ｚ．、１９９６．「Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３プロテイナーゼの結晶構造によって、トリプシン様折り畳み構造及び亜鉛結合部位の構造が明らかになる（Ｔｈｅ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｔｒｙｐｓｉｎ−ｌｉｋｅ ｆｏｌｄ ａｎｄ ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｚｉｎｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ．）」Ｃｅｌｌ．８７、３３１〜３４２．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｌ．、Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ，Ｋ．Ａ．、Ｌｉｎ，Ｃ．、Ｆｏｘ，Ｔ．、Ｄｗｙｅｒ，Ｍ．Ｄ．、Ｌａｎｄｒｏ，Ｊ．Ａ．、Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｓ．Ｐ．、Ｍａｒｋｌａｎｄ，Ｗ、Ｌｅｐｒｅ，Ｃ．Ａ．、Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｅ．Ｔ．、Ｈａｒｂｅｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．、Ｍｕｒｃｋｏ，Ｍ．Ａ．、Ｃａｒｏｎ，Ｐ．Ｒ．、Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．、１９９６．「合成ＮＳ４Ａ補因子ペプチドと結合したＣ型肝炎ウイルスＮＳ３プロテアーゼドメインの結晶構造（Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＮＳ４Ａ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ．）」Ｃｅｌｌ．８７、３４３〜５３５．Ｅｒｒａｔｕｍ ｉｎ：Ｃｅｌｌ、８９：１５９、１９９７）。
【００２４】
ＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼは、２個のベータバレル及びこれらのドメインの間に生じた隙間に位置する触媒性のＨｉｓ５１−Ａｓｐ７５−Ｓｅｒ１３５３連構造を含むキモトリプシン様折り畳み構造をとる。ＮＳ２Ｂタンパク質の結合は、ＮＳ３ｐｒｏの三次構造に大きな変化を誘導し、Ｎ及びＣ末端ドメインの両方に影響を及ぼし、位置及び二次構造部分の範囲の変化が含まれる。
【００２５】
ＮＳ３ｐｒｏ−ＮＳ２Ｂ活性化プロテアーゼとペプチド阻害剤によって形成された複合体の構造は、ＮＳ２ＢがＮＳ３ｐｒｏの周りにベルトを形成し、主に伸長した構造をとり、５本のベータ鎖を含むことを示している。
【００２６】
最初の３本の鎖は、ＮＳ３タンパク質のベータ鎖に関連し、鎖Ｔｒｐ５３−Ａｌａ５８（ＷＮＶでの番号）は、Ｎ末端ベータバレルに対応するＮＳ３ベータ鎖Ｇｌｙ２１−Ｍｅｔ２６と逆平行にあり、ベータ鎖Ｇｌｕ６７−Ｉｌｅ６８及びＡｒｇ７５−Ａｓｐ７６はＮＳ３Ｃ末端ベータバレルのベータ鎖Ｂ２ａｙＢ２ｂと平行である。
【００２７】
鎖４及び５はベータヘアピンを形成し、これはＮ末端ベータバレルのＥ１ｂ−Ｆ１ループを含有する基質結合部位と相互作用する。Ｃ末端バレルのＥ２ｂ−Ｆ２ベータヘアピンの下のＮＳ２Ｂの折り畳み構造は、基質認識に重要な残基（Ｇｌｙ１５１、Ｇｌｙ１５３及びＴｙｒ１６１）の配置をもたらすＮＳ３のこの領域での立体的変化を誘導する。残基Ｔｙｒ１６１は、Ｐ１位のアルギニンとカチオン−パイ相互作用を形成する。残基Ａｓｐ８２−Ｇｌｙ８３の主鎖カルボニル基及びＮＳ２ＢのＡｓｎ８４の原子Ｏｄ１に関連した負の静電ポテンシャルは、Ｐ２位のアルギニンのグアニジニウム基の正の電荷との相互作用に有利となる。このように、これらはＳ２部位の構造に関与している。したがって、ＮＳ３にＮＳ２Ｂが結合することによって、酵素活性部位の必須要素が完全になり、タンパク質折り畳み構造の熱力学的な安定性にも寄与する。これらの事実は、このプロテアーゼの活性化プロセスを理解するための構造的基盤となる。
【００２８】
ＨＣＶの場合、ＮＳ３活性化は、フラビウイルスのＮＳ２Ｂの鎖１と構造的に対応するＮＳ４Ａのベータ鎖Ｔｈｒ２０−Ｌｅｕ３１の結合によって媒介される（ＳＨＩＭＩＺＵ，Ｙ．、ＹＡＭＡＪＩ，Ｋ．、ＭＡＳＵＨＯ，Ｙ．、ＹＯＫＯＴＡ，Ｔ．、ＩＮＯＵＥ，Ｈ．、ＳＵＤＯ，Ｋ．、ＳＡＴＯＨ，Ｓ．ｙ ＳＨＩＭＯＴＯＨＮＯ，Ｋ．１９９６．「ＮＳ５Ａ／５Ｂ部位のＣ型肝炎ウイルスＮＳ３プロテアーゼによる切断増強に必要なＮＳ４Ａの配列の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｎ ＮＳ４Ａ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ＮＳ５Ａ／５Ｂ Ｓｉｔｅ ｂｙ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ Ｐｒｏｔｅａｓｅ．）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７０、１２７〜１３２）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
フラビウイルス科に対する抗ウイルス分子を得るために実施されている最近の取り組みの中で、ＮＳ３阻害に基づいた取り組みは、活性部位を標的とする阻害剤の開発に主に焦点が当てられている。これらの取り組みは、非常に期待が持たれるものと思われ、ＨＣＶに対する薬剤を開発する中で達成された最近の結果によって支持される。しかし、これらの経験によってまた、これらの取り組みに固有の問題が明白に示された。より重要なものの１つは、エスケープ変異体の発生である。ＲＮＡウイルスのポリメラーゼは、忠実度が比較的低く、ＨＣＶの場合、ウイルスゲノムコピー当たり１個の変異を導入する。この手段によって開発された分子は非常に強力であるが、有用な存続期間は限られているという事実が生じる。抗ウイルス治療に必要な薬剤カクテルに基づいた治療的介入が導入された。１薬剤に対して生じたエスケープ変異体は、同一活性部位を標的とするその他の薬剤の抗ウイルス活性からしばしば免れることができることも観察された。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明は、ＮＳ３プロテアーゼ活性化プロセスを阻害する概念に基づいたフラビウイルス科に対する抗ウイルス薬の設計を目的とする新規方法について記載する。この概念の鍵となる取り組みは、ＮＳ３とその補因子（ＮＳ２Ｂ又はＮＳ４Ａ）との間の相互作用を遮断し、したがって活性型ＮＳ３プロテアーゼの正確な折り畳み構造を妨害することができるペプチド性分子及び／又は薬剤を設計することである。このような分子は、補因子との相互作用に関与するＮＳ３プロテアーゼの領域に結合して、補因子と競合し、かつ／又は不活性型プロテアーゼの構造を安定化することができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の利点は、これらの分子に対するエスケープ変異体の生じる確率が、活性部位に対して基質と競合する活性型プロテアーゼの阻害剤と比較して低いことが予測されることである。本発明の分子は、ウイルス複製サイクルに必須のタンパク質−タンパク質相互作用に関与するＮＳ３の結合部位に結合し、したがって、ＮＳ３のこれらの領域で生じた変異はさらに、補因子を代償的に変異させるはずである。
【００３２】
その他の利点は、これらの分子が示す阻害活性の高い特異性である。これは、ＮＳ３上の結合部位はウイルス性プロテアーゼに本質的に特異的であり、宿主セリンプロテアーゼには存在しないという事実に基づく。さらに、宿主のリンプロテアーゼは、ＮＳ３に非常に類似した特異性を示す活性部位を有し、したがって、活性部位遮断薬剤の毒性の潜在的な標的となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】ＮＰ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化のペプチド阻害剤の設計。フラビウイルスのＮＳ２Ｂタンパク質配列の複数の配列のアラインメント。本明細書で記載した活性化阻害剤部分は、二重矢印で強調し、薄い（濃い）灰色の矢印はＮＳ３ｐｒｏのＮ末端（Ｃ末端）ベータバレルドメインに結合した部分に相当する。
【図１Ｂ】ＮＰ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化のペプチド阻害剤の設計。フラビウイルスのＮＳ２Ｂ−ＮＳ３ｐｒｏ複合体の３次元構造モデル。ＮＳ３ｐｒｏのＮ末端ベータバレルドメインに結合したＤＶ２のＮＳ２ＢのＤ５０−Ｅ６２部分及びＣ末端ドメインに結合したＤＶ２のＮＳ２ＢのＳ７０−Ｇ８２部分を強調している。
【図１Ｃ】ＮＰ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化のペプチド阻害剤の設計。ＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化阻害部分Ｄ５０−Ｅ６２及びＳ７０−Ｉ８６−ＧＧＧＧＲＲ。後のペプチドのＣ末端伸長部分は、プロテアーゼの活性部位に結合し、プロテアーゼとその基質との相互作用を遮断する。
【図１Ｄ】ＮＰ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化のペプチド阻害剤の設計。不活性型立体構造のＮＳ３ｐｒｏ（ＮＳ２Ｂを有さないタンパク質の構造）及び本発明のコンピュータによって設計されたペプチドによって形成された複合体のモデル。
【図２】ベロ細胞におけるデング２ウイルスによる感染の阻害のアッセイ。Ａ：ウイルスを細胞に添加する前にプレインキュベートした、及びプレインキュベートしなかったペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの存在によるプラークの数の減少割合。Ｂ：プレインキュベートした（ｐｒｅ）、及びプレインキュベートしなかった（ｎｏ ｐｒｅ）様々な濃度のペプチドＴＡＴ及びＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの抗ウイルス活性のアッセイ。
【図３】ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの抗ウイルス活性に対するインキュベーション時間の影響。ＰＸ１：関連のない陰性対照ペプチド（関連のない配列とのＴＡＴペプチド融合物、Ｐ１０：ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴ（ＤＶのＮＳ２ＢのペプチドとのＴＡＴ融合物、表１のペプチド番号１）。アッセイしたプレインキュベーション時間は、０、３０、６０及び１８０分であった。
【図４】ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの抗ウイルス活性に対する内部移行の役割。Ａ：ペプチドと共にプレインキュベーションした後、ウイルスを細胞に添加した時点でペプチドは培地中に残存している。Ｂ：ペプチドは、ウイルスを細胞に添加する前に様々な洗浄によって培地から回収する。ｐＮＲ＋ＴＡＴ：表１のペプチド１８番。ｐＮＲ＋ＴＡＴペプチドは、実験の陰性対照である。その一次構造は、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの類似体で、［Ｉ］部分はペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴと同一のアミノ酸組成を有するが、配列は入れ替わっていた（表１のペプチド１８）。
【図５】ペプチドの抗ウイルス活性に対する固有の透過性ペプチド及びＥＲ保持シグナルの効果。ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴ：表１のペプチド１、ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ｐＰ２：表１のペプチド２、細胞透過性部分はペネトラチンである。ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ｐＲＲ：表１のペプチド３、細胞透過性ペプチドとしてのデカアルギニン、ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴ＋ＫＤＥＬ：表１のペプチド４、ｐＮＲ＋ＴＡＴ：表１のペプチド１８、陰性対照：ＮＳ２Ｂｄｅｎ２、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの部分［Ｉ］。
【図６】同種及び異種のＤＶの血清型に対するペプチドの抗ウイルス活性。ペプチドの抗ウイルス活性は、ＶＤ１（Ａ）、ＶＤ３（Ｂ）及びＶＤ２（Ｃ）の存在下でウイルスプラークの数の減少によって試験した。ロゼッタ：ＤＶ２のＮＳ３ｐｒｏのＮ末端ドメインに結合するようにコンピュータによって設計されたペプチド（表１のペプチド５）；ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ｐｏｌｉＲ：表１のペプチド３、細胞透過性ペプチドとしてのデカアルギニン；ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴ：表１のペプチド１；ＮＳ２Ｂｄｅｎ１＋ＴＡＴ：表１のペプチド６、ＮＳ２Ｂｐｅｒｍｕｔａｄｏ＋ＴＡＴ；表１のペプチド１８、実験の陰性対照。ＮＳ２Ｂｐｅｒｍｕｔａｄｏ＋ＴＡＴの一次構造はペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの類似体であり、［Ｉ］部分は、ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴと同一なアミノ酸組成を有するが、この配列は入れ替わっていた。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明では、フラビウイルス科による感染を阻害し、一次構造が以下の式によって記載することができるキメラペプチド様分子を記載する。
［Ｐ］−［Ｌ１］−［Ｉ］−［Ｌ２］−［Ｔ］又は［Ｉ］−［Ｌ３］−［Ｐ］−［Ｌ４］−［Ｔ］
（式中、［Ｐ］は「細胞透過性ペプチド」のアミノ酸配列で、通常１０〜３０個のアミノ酸であり、ペプチド様分子全体を細胞の細胞質内に内部移行させ、粗面小胞体（ＲＥＲ）近傍に接近させることができ、［Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４］は０〜６個の残基のリンカー配列であり、［Ｉ］はＮＳ３ｐｒｏ活性化阻害剤配列であり、活性型又は不活性型立体構造のフラビウイルスのＮＳ３ｐｒｏタンパク質のＣ末端ベータバレルのベータ鎖Ｂ２ａ及びＢ２ｂ又はＮ末端ベータバレルのベータ鎖Ａ１（又はペスチウイルス若しくはヘパシウイルスの構造的に対応する領域）の少なくとも１個のアミノ酸と接触する残基を含有し、［Ｔ］は０〜１０個の残基のアミノ酸配列であり、通常ＥＲ中における（配列ＫＤＥＬ、ＫＫＸＸ及びＬＲＲＲＲＬのような）１個若しくは２個の保持シグナルであり、又はフラビウイルスのＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼのＰ１及びＰ２基質結合部位に結合する能力を有する配列ＸＲＲである。
【００３５】
より具体的には、本発明によって設計されたペプチドはＤＶによるウイルス感染を阻害できることを示した。
【００３６】
陽イオン細胞透過性ペプチド
本発明は、フラビウイルス科ファミリーのウイルスのウイルス感染を阻害することができるキメラペプチドの設計について記載する。設計されたペプチドは、ウイルスＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼの活性化を阻害する［Ｉ］部分を含有する。しかし、本発明では、部分［Ｉ］に対応するアミノ酸配列を有する合成ペプチドは、標的細胞を透過することができず、したがって、細胞系及びｉｎ ｖｉｖｏにおいてウイルス感染を阻害しないことを示している。ウイルス感染の阻害は、［Ｉ］部分と細胞を透過する［Ｐ］部分を組み合わせて実現される。
【００３７】
ある種のタンパク質から得られたいくつかのペプチドは、細胞を透過し、細胞質及び核に接近する能力を備えている。これらのペプチドは、細胞透過性ペプチド又はタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）として知られている（Ｊｏｌｉｏｔ，Ａ．及びＰｒｏｃｈｉａｎｔｚ，Ａ．（２００４）「導入ペプチド」：技術から生理学まで（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｆｒｏｍ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．））Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６、１８９〜９６．Ｓｎｙｄｅｒ，Ｅ．Ｌ．及びＤｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．（２００４）「薬剤送達における細胞透過性ペプチド（Ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．）」Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１、３８９〜９３．Ｄｅｓｈａｙｅｓ，Ｓ．、Ｍｏｒｒｉｓ，Ｍ．Ｃ．、Ｄｉｖｉｔａ，Ｇ．及びＨｅｉｔｚ，Ｆ．（２００５）「細胞透過性ペプチド：治療薬細胞内送達のための手段（Ｃｅｌｌｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．）」Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６２、１８３９〜４９）。最も研究されたＰＴＤは、ＨＩＶ転写因子ＴＡＴ、キイロショウジョウバエのホメオボックスアンテナペディア（ペネトラチン）及び単純疱疹ウイルスのタンパク質ＶＰ２２などのタンパク質から得られた陽イオンペプチドである。これらのペプチドは、生物学的活性を高めるために、細胞中にカーゴ分子を導入するため有望な担体として非常に興味が高まっており、これらのカーゴは薬剤様低分子又は遺伝子及びタンパク質のように天然では多種多様である。治療上関心の持たれる分子のための媒介物としてのＰＴＤの可能性が細胞系及び動物モデルでも示された（Ｂｅｅｒｅｎｓ，Ａ．Ｍ．、Ａｌ Ｈａｄｉｔｈｙ，Ａ．Ｆ．、Ｒｏｔｓ，Ｍ．Ｇ．及びＨａｉｓｍａ，Ｈ．Ｊ．（２００３）「タンパク質伝達ドメイン及び遺伝子治療におけるそれらの用途（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｔｉｌｉｔｙ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．）」Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３、４８６〜９４．Ｗａｄｉａ，Ｊ．Ｓ．及びＤｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．（２００３）「完全長タンパク質のＴＡＴ媒介伝達による細胞機能の調節（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ ＴＡＴ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）」Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．４、９７〜１０４．）。Ｗａｄｉａ，Ｊ．Ｓ．及びＤｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．（２００５）「癌の治療におけるＴＡＴ媒介伝達によるタンパク質及びペプチド薬剤の膜透過送達（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｒｕｇｓ ｂｙ ＴＡＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．）」ＡｄＶ．Ｄｒｕｇ ＤｅｌｉＶｅｒｙ ＲｅＶ．５７、５７９〜９６．Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｃ．、Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇｅｒ，Ｕ．、Ｏｒｔｉｚ，Ａ．、Ｔａｂａｔｔ，Ｋ．、Ｐｌａｎｋ，Ｃ．、Ｍｕｌｌｅｒ，Ｒ．Ｈ．及びＲｏｓｅｎｅｃｋｅｒ，Ｊ．（２００４）「ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおける２量体ＨＩＶ−１ ＴＡＴペプチドをベースにした新規の固形脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）遺伝子ベクター製剤の適用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｓｏｌｉｄ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ＳＬＮ）−ｇｅｎｅ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ｄｉｍｅｒｉｃ ＨＩＶ−１ ＴＡＴ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．）」Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１、１６６２〜９）。
【００３８】
これらのペプチドが原形質膜、エンドサイトーシス区画及び核の膜などの細胞膜系によって形成された生物学的障壁を通って細胞質及び核に接近することができる機構を解明するために膨大な量の研究が行われてきた。近年、以前に報告された低温及び生理学的温度でのＰＴＤの細胞局在及び細胞侵入に関する培養細胞におけるいくつかの観察は、固定方法及びペプチドの原形質膜への非特異的結合によって生じた人為的結果によるものであることが示された（Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｊ．Ｐ．、Ｍｅｌｉｋｏｖ，Ｋ．、Ｖｉｖｅｓ，Ｅ．、Ｒａｍｏｓ，Ｃ．、Ｖｅｒｂｅｕｒｅ，Ｂ．、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．、Ｃｈｅｒｎｏｍｏｒｄｉｋ，Ｌ．Ｖ．及びＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．（２００３）「細胞透過性ペプチド。細胞摂取機構の再評価（Ｃｅｌｌｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ａ ｒｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ．）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８、５８５〜９０．Ｖｉｖｅｓ，Ｅ．、Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｊ．Ｐ．、Ｒｉｓｐａｌ，Ｃ．及びＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．（２００３）「ＴＡＴペプチド内部移行：侵入機構の探索（ＴＡＴ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ：ｓｅｅｋｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｅｎｔｒｙ．）」Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．４、１２５〜３２）。最新の結果では、エンドサイトーシスがＰＴＤの細胞内侵入において必須の役割を果たすことを示唆している。しかし、これらのペプチドの細胞内輸送の詳細で一般的に受け入れられている説明はまだなされていない。
【００３９】
ＴＡＴペプチド融合タンパク質が原形質膜カベオラを介して中性カベオソームを通過し細胞内へ侵入することが最初に報告されたが、より最近の研究では、カベオラは必要なく、ＴＡＴペプチド細胞侵入はマクロピノサイトーシスによって生じることが示された（Ｆｅｒｒａｒｉ，Ａ．、Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ，Ｖ．、Ａｒｃａｎｇｅｌｉ，Ｃ．、Ｆｉｔｔｉｐａｌｄｉ，Ａ．、Ｇｉａｃｃａ，Ｍ．及びＢｅｌｔｒａｍ，Ｆ．（２００３）「実時間で視覚化した細胞外ＨＩＶ−１ｔａｔ融合タンパク質のカベオラ媒介性内部移行（Ｃａｖｅｏｌａｅｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＨＩＶ−１ ｔａｔ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ．）」Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．８、２８４〜９４。Ｗａｄｉａ，Ｊ．Ｓ．、Ｓｔａｎ，Ｒ．Ｖ．及びＤｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．（２００４）「伝達可能なＴＡＴ−ＨＡ膜融合性ペプチドは、マクロピノサイトーシス後の脂質ラフトのＴＡＴ融合タンパク質の脱出を増大させる（Ｔｒａｎｓｄｕｃｉｂｌｅ ＴＡＴ−ＨＡ ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｅｓｃａｐｅ ｏｆ ＴＡＴ−ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｆｔｅｒ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔ ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ．）」Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０、３１０〜５）。仮定されたエンドサイトーシス媒介性細胞侵入と矛盾せず、ＰＴＤは初期及びリサイクリングエンドソーム内に認められた。しかし、ＰＴＤに結合した分子によって示された生物学的活性は、これらのペプチドがサイトゾルに接近する未知の機構によってエンドサイトーシス区画から少なくとも部分的に脱出することを示している。内部移行したＴＡＴペプチドとゴルジマーカーＢＯＤＩＰＹ−セラミドとの共存が報告されており、リソトラッカーで標識した後期エンドソーム及びリソソームでは視覚化が不十分であることと一致している（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｋ．、Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋ，Ｍ．及びＢｒｏｃｋ，Ｒ．２００４．「陽イオン細胞透過性ペプチドの細胞内での動態の段階的解析（Ａ ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆａｔｅ ｏｆ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｃｅｌｌｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９、１２６２５〜３５）。
【００４０】
これらのデータは、これらのペプチドが初期エンドソームから直接ゴルジ体に輸送され得ることを示唆しており、これはゴルジ体からペプチドが逆方向輸送された後、ＥＲからサイトゾルにペプチドが侵入する可能性と一致する。しかし、その他の研究では、酸性の後期エンドサイトーシス構造及びリソソームにおけるペプチドの共存が報告されている。このような結果は、ＴＡＴペプチド、オクタアルギニン、ＴＡＴタンパク質及びリポソームとＴＡＴペプチドの結合体が報告されている（Ａｌ−Ｔａｅｉ，Ｓ．、Ｐｅｎｎｉｎｇ，Ｎ．Ａ．、Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．、Ｆｕｔａｋｉ，Ｓ．、Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｔ．、Ｎａｋａｓｅ，Ｉ．及びＪｏｎｅｓ，Ａ．Ｔ．２００６．「タンパク質伝達ドメインＨＩＶ−１ ＴＡＴペプチド及びオクタアルギニンの細胞内輸送及び動態。薬剤送達媒体としてそれらを利用する意義（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｆｆｉｃ ａｎｄ Ｆａｔｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎｓ ＨＩＶ−Ｉ ＴＡＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｏｃｔａａｒｇｉｎｉｎｅ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｉｒ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｃｔｏｒｓ．）」Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１７、９０〜１００．Ｆｒｅｔｚ，Ｍ．Ｍ．、Ｋｏｎｉｎｇ，Ｇ．Ａ．、Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ，Ｅ．、Ｊｉｓｋｏｏｔ，Ｗ．及びＳｔｏｒｍ，Ｇ．（２００４）「ＯＶＣＡＲ−３細胞はエンドサイトーシスによってＴＡＴ−ペプチド修飾リポソームを内部移行する（ＯＶＣＡＲ−３ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ ＴＡＴ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｂｙ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ．）」Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １６６５、４８〜５６．Ｖｅｎｄｅｖｉｌｌｅ，Ａ．、Ｒａｙｎｅ，Ｆ．、Ｂｏｎｈｏｕｒｅ，Ａ．、Ｂｅｔｔａｃｈｅ，Ｎ．、Ｍｏｎｔｃｏｕｒｒｉｅｒ，Ｐ．及びＢｅａｕｍｅｌｌｅ，Ｂ．（２００４）「ＨＩＶ−１ Ｔａｔは、細胞膜被覆小窩を使用してＴ細胞に侵入した後で、酸性化エンドソームから移動し生物学的応答を惹起する（ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ｅｎｔｅｒｓ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｃｏａｔｅｄ ｐｉｔｓ ｂｅｆｏｒｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ ｆｒｏｍ ａｃｉｄｉｆｉｅｄ ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｅｌｉｃｉｔｉｎｇ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．）」Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １５、２３４７〜６０）。
【００４１】
しかし、ＰＴＤは、細胞の種類、ＰＴＤの性質、温度、カーゴなどのいくつかの要素に応じて、細胞侵入及び細胞内輸送の様々な異なる機構を利用し得る可能性がある。
【００４２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、フラビウイルス科によるウイルス感染を阻害するキメラペプチドの２種類の形態的変種、
［Ｐ］−［Ｌ１］−［Ｉ］−［Ｌ２］−［Ｔ］又は［Ｉ］−［Ｌ３］−［Ｐ］−［Ｌ４］−［Ｔ］
について記載する。
【００４３】
［Ｐ］として透過性ペプチドは、カーゴ分子を細胞内に輸送する能力を備えた陽イオンペプチドから選択されることが好ましいが、それだけに限定はされない。可能性のある陽イオンペプチドとして、ペネトラチン、Ｒ９ノナペプチド又はＲ１０デカペプチド又はＴＡＴペプチドなどの７〜１０個の残基のポリアルギニンを選択することができるが、類似の透過能力を示す１０〜３０個の残基のその他の任意のペプチド配列を選択することができる。これらの透過性陽イオンペプチドは、エンドサイトーシスによって細胞の細胞質に透過する能力を有し、ＥＲによる輸送に関与している可能性がある。この特性は、前駆体ポリタンパク質合成及びプロセシングが実施され、ペプチド抗ウイルス活性の標的の場となるＲＥＲの近傍にペプチドが局在することを保証するので、これらのペプチドの生物学的活性に有利である。
【００４４】
或いは、その他の細胞透過性ペプチドも、タンパク質分解に非常に耐性がある陽イオンデンドリマー型ペプチド又はＤ−アミノ酸を含むペプチドのような［Ｐ］部分として使用することができよう。陽イオンペプチドはまた、本発明のペプチドのｉｎ ｖｉｖｏにおける良好な体内分布を保証し、フラビウイルス科に感染した器官及び組織における有利な有効濃度がモノクローナル抗体のような大きな分子と比較して高レベルになるようにする。１つの例として、ＴＢＥ、ＷＮＶ、ＪＥＶ、ＳＬＥＶ及びＫＶのような脳炎を引き起こすフラビウイルス科感染を治療するために、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できるペプチドの使用を挙げることができる。ＢＢＢを通過する分子輸送は、脳内疾患の治療を目的とした小分子薬物にとっても手強い問題である（Ｔｅｍｓａｍａｎｉ，Ｊ．及びＶｉｄａｌ，Ｐ．２００４．「薬剤送達のための細胞透過性ペプチドの使用（Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．）」Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ ９、１０１２〜１０１９）。
【００４５】
ＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ阻害配列［Ｉ］は、タンパク質ＮＳ３とフラビウイルスのＮＳ２Ｂ（又はＮＳ３とヘパシウイルス及びペスチウイルスのＮＳ４Ａの間）との間の相互作用を阻害又は変更する能力を有し、このようにして、プロテアーゼ活性化プロセスに必要なＮＳ３ｐｒｏの正確な折り畳み構造に影響を及ぼす。本発明の一実施形態では、［Ｉ］はＤＶ２のタンパク質のＮＳ２Ｂの配列Ａｓｐ５０−Ｇｌｕ６２、又はその他のフラビウイルスの相同な配列である。この配列は、活性ＮＳ３ｐｒｏタンパク質のＮ末端ベータバレルに位置する残基と接触するタンパク質ＮＳ２Ｂのベータ鎖１に対応する残基を含有する。したがって、本発明で記載した形態によるペプチドは、ＮＳ３ｐｒｏタンパク質が折り畳まれる間、その活性型構造の使用について補因子ＮＳ２Ｂタンパク質の天然の配列と競合する。完全な活性化にはＮ末端ドメインだけでなく、Ｃ末端ベータバレルの構造の再編成も必要なので、不活性型ＮＳ３ｐｒｏ−ペプチド複合体の形成がもたらされる。プロテアーゼ活性化には、タンパク質ＮＳ２ＢのＧｌｕ６６−Ｉｌｅ８６領域がＮＳ３ｐｒｏのＣ末端ドメインにさらに結合することが必要であろう。さらに、部分［Ｉ］の結合は、これらのペプチドのＮ又はＣ末端伸長がＮＳ３の表面形態を変化させ、ウイルス及び／又は宿主タンパク質の相互作用を妨害することができるように、タンパク質ＮＳ３に対する本発明のペプチドのアンカーとして役立つ。このような相互作用には、基質認識及び／又はウイルス複製複合体の立体構造及び／又は機能に関連したその他の相互作用が含まれる。したがって、本発明の一実施形態では、第一の形態変種に対応する［Ｐ］部分は、細胞透過特性を有する以外に、フラビウイルスＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼの阻害剤でもあるポリ−Ｄ−アルギニンである（ＳＨＩＲＹＡＥＶ，Ｓ．Ａ．、ＲＡＴＮＩＫＯＶ，Ｂ．Ｉ．、ＣＨＥＫＡＮＯＶ，Ａ．Ｖ．、ＳＩＫＯＲＡ，Ｓ．、ＲＯＺＡＮＯＶ，Ｄ．Ｖ．、ＧＯＤＺＩＫ，Ａ．、ＷＡＮＧ，Ｊ．、ＳＭＩＴＨ，Ｊ．Ｗ．、ＨＵＡＮＧ，Ｚ．、ＬＩＮＤＢＥＲＧ，Ｉ．、ＳＡＭＵＥＬ，Ｍ．Ａ．、ＤＩＡＭＯＮＤ，Ｍ．Ｓ．及びＡｌｅｘ Ｙ．ＳＴＲＯＮＧＩＮ，Ａ．Ｙ．、２００６．「西ナイルウイルスＮＳ３プロセシングプロテイナーゼの切断標的及びＤ−アルギニンをベースにした阻害剤（Ｃｌｅａｖａｇｅ ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｄ−ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ．）」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３９３、５０３〜５１１）。したがって、［Ｉ］部分／アンカーのＮＳ３ｐｒｏへの結合は、プロテアーゼの基質結合部位におけるポリＡｒｇペプチドの適合性を高め、ペプチドによって固定された同じ鎖（シス阻害）又は異なる鎖（トランス阻害）によく対応する。類似の方法で、ヘパシウイルス及びペスチウイルスの阻害ペプチドには、フラビウイルスのＮＳ２Ｂタンパク質のベータ鎖１と構造的に類似したＮＳ４Ａタンパク質のＴｈｒ２０−Ｌｅｕ３１領域（ＨＣＶの番号）に対応する部分が［Ｉ］配列として組み込まれる。
【００４６】
フラビウイルスに適用した第２の実施形態では、［Ｉ］部分はＮＳ２Ｂ配列のいかなる特定の部分にも関係しないが、ＮＳ３ｐｒｏタンパク質に結合し、不活性型立体構造でＮ末端バレルを安定化する能力を備えたペプチド配列である。この場合、ペプチド配列はＤＶ２のＮＳ３ｐｒｏタンパク質のＴｙｒ２３−Ｔｙｒ３３に対応する部分、又はその他のフラビウイルスの対応する相同な領域と接触する。さらに、［Ｉ］部分はまた、タンパク質ＮＳ３ｐｒｏのＡｌａ１−Ｇｌｙ１４及びＡｌａ５６−Ｍｅｔ５９部分の残基との構造的接触を安定化させる。したがって、これらのペプチドはタンパク質ＮＳ３の天然の折り畳み構造を妨害することによって阻害効果を促進し、プロテアーゼの不活性型構造を導く折り畳み経路を誘導する。
【００４７】
このような［Ｉ］配列は、コンビナトリアルライブラリーを使用する理論的方法及び／又は実験的方法によって得ることができよう。理論的方法による設計の場合、本発明には、コンピュータによる分子モデリングの１種又は様々な方法の使用及び不活性型立体構造のタンパク質ＮＳ３ｐｒｏの三次構造モデルの使用が含まれる。コンピュータモデリング及び不活性型ＮＳ３ｐｒｏタンパク質の３Ｄ構造モデルの空間座標を使用すると、Ｎ末端ベータバレルのベータ鎖Ａ１に対応する部分を備えた逆平行ベータ鎖を形成する伸長型立体構造のポリペプチド主鎖を設計することができる。さらに、側鎖及びそのコンホマーの化学的特性がエネルギー的に有利な原子接触を意味するように、ポリペプチド鎖の側鎖を設計することができる。本発明には、ペプチド配列及び立体構造空間、ペプチド、さらにプロテアーゼの側鎖回転異性体空間をコンピュータ手段によって探索することと、得られたモデルのエネルギー評価によって、ペプチド−タンパク質相互作用の親和性が潜在的に高いことを示す最も有利なペプチド変種を選択することを組み合わせることが必要である。不活性型ＮＳ３ｐｒｏ構造モデルに対応する座標は、ｘ線回折及び／又はＮＭＲの方法によって、又はコンピュータモデリング法によって得られたモデルを使用することによって得られた実験データから引き出すことができた。ＤＶ２の場合、座標はタンパク質データバンク（ＰＤＢ）の１ＢＥＦファイルから入手することができた。その他のフラビウイルスについては、相同性モデリングの方法によって３Ｄモデルを得ることができる。
【００４８】
本発明では、本発明のこの第２の実施形態にしたがって設計した［Ｉ］配列：ＱＷＰＡＬＰＫＩＥＡＱＤＧを記載する。図１Ｄは、この実施形態に対応するＮＳ３ｐｒｏ−［Ｉ］複合体の３次元構造のコンピュータモデルを示している。このモデルによれば、［Ｉ］部分は、ＮＳ３ｐｒｏ（ＤＶ２番号付け）の部分Ｇｌｙ２９−Ｙ３３に関連して伸長型ベータ鎖構造をとる。
【００４９】
さらに、本発明の第２の実施形態で記載したペプチドと類似の特性を有する［Ｉ］配列を得るために、合成ペプチドのコンビナトリアルライブラリー又はファージディスプレイペプチドライブラリーを使用することができよう。この場合、組換えＮＳ３ｐｒｏタンパク質は、リガンド選択又はバイオパニングの標的として使用される。
【００５０】
本発明のその他の実施形態では、［Ｉ］部分はＤＶ２のタンパク質ＮＳ２Ｂの配列Ｓｅｒ７０−Ｇｌｙ８２、又はその他のフラビウイルスの相同な配列にある。この配列は、活性型ＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼの一部と接触し、形成するタンパク質ＮＳ２Ｂのベータ鎖３及び４を含有する。したがって、本発明で記載した形態によるペプチドは、ＮＳ３ｐｒｏタンパク質が活性型立体構造に折り畳まれる間に補因子ＮＳ２Ｂタンパク質の対応する部分と競合し、接合部ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３でのタンパク質分解性プロセシングを阻止する。これらのペプチドは基質結合部位、特に酵素触媒活性に必須のＰ２部位での正確な立体配置を妨害するので、不活性型ＮＳ３ｐｒｏ−ペプチド複合体の形成を誘導する。
【００５１】
さらに、本発明のペプチドに対応する［Ｉ］部分の結合は、これらのペプチドのＮ末端又はＣ末端伸長がＮＳ３の表面形態を変更し、このタンパク質とその他のウイルス又は宿主タンパク質との相互作用を妨害することができるように、タンパク質ＮＳ３に対するアンカーとして作用する。
【００５２】
以前のペプチド（表１のペプチド１０）に関連した実施形態では、［Ｉ］部分はＤＶ２のＮＳ２Ｂタンパク質の配列Ｓｅｒ７０−Ｉｌｅ８６又はその他のフラビウイルスの相同配列にある。この領域には、ベータ鎖３及び４の他に、ＮＳ２Ｂのベータ鎖５も含まれる。この場合、最初の形態学的変種に対応するペプチドには、Ｃ末端カルボキシル基と共に、３個又は４個の残基の［Ｌ２］部分及びトリペプチドＸＲＲから成る［Ｔ］部分を含むＣ末端伸長が含まれる。これらのペプチドの配列は、活性型立体構造をとるＮＳ３タンパク質への結合と矛盾せず、ベータ鎖５及び鎖４と５の間のループはＰ２部位の正確な形成を保証する。
【００５３】
さらに、部分［Ｉ］の結合は、活性化に必要なＣ末端ベータバレルにおける構造変化、例えば、Ｇｌｙ１５１、Ｇｌｙ１５３及びＴｙｒ１６１のような基質認識に関与する重要な残基を配置させるＥ２ｂ−Ｆ２ベータヘアピンの方向の変化を促進する。しかし、形成された複合体は、［Ｌ２］部分が、位置Ｓ１及びＳ２を占めるジペプチドＲＲと共に［Ｔ］部分の基質結合部位へのさらなる結合を可能にする安定化リンカーとして作用するので、不活性である。したがって、プロテアーゼ活性部位は、ペプチドによって遮断される。
【００５４】
本発明の部分［Ｌ１］、［Ｌ２］、［Ｌ３］及び［Ｌ４］は、形態学的変形形態に応じて、部分［Ｐ］、［Ｉ］及び［Ｔ］を連結する０〜６個の残基のリンカー配列である。これらのリンカー部分は、柔軟性をもたらす、主に小さな、かつ／又は極性のアミノ酸（Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ベータＡｌａ）を含有する。これらのリンカー部分はまた、ＮＳ３ｐｒｏタンパク質の残基と有利に相互作用することができる配列から成ることができ、本発明のペプチドにさらなる安定化効果をもたらす。
【００５５】
本発明の［Ｔ］部分は、ペプチドのＣ末端に位置する、アミノ酸０個から１０個の配列である。一実施形態では、［Ｔ］部分は、ＫＤＥＬ配列のようなＥＲ保持シグナルである。このシグナルを付加することによって、ＥＲへの逆方向輸送によるペプチドの輸送が促進される。ＥＲ内のペプチド濃度の増加は、サイトゾルへのペプチドの輸送の増加に寄与する。ＥＲ近傍における効果的なペプチド濃度の増加が引き起こされ、ウイルスポリタンパク質の合成、特にＮＳ３ｐｒｏの合成が生じる。
【００５６】
ＫＤＥＬシグナルのペプチド配列への組み込みは、ＥＲによる逆方向輸送が陽イオンペプチドのサイトゾルへの透過経路であると推定されるので、［Ｐ］部分としての陽イオン細胞透過性ペプチドの存在と適合する。この透過方法には、初期エンドソームからＥＲへのトランス−ゴルジネットワーク（ＴＧＮ）を介したペプチドの輸送が関与する。配列ＫＤＥＬは、ペプチドをＥＲに輸送するＴＧＮに存在するＫＤＥＬ受容体と相互作用し、ＥＲでペプチドは放出される。ＥＲ内腔からサイトゾルへのペプチド輸送は効率のよいプロセスで、トランスロコン複合体のＳｅｃ６１タンパク質によって形成されたＥＲ膜に存在するチャンネルを通じて行われる。サイトゾルへのこの透過方法は、コレラ毒素、リシン及びシュードモナスの外毒素Ａなどのような細菌毒素によって利用される。
【００５７】
細胞透過性ペプチドとしてのＦＧヘアピンベース部分の使用。ＤＶの細胞侵入に対するこの部分の阻害効果。
本発明の斬新さは、様々な機能を備えた部分又はモジュール、すなわち、抗ウイルス活性を備えた部分、細胞透過性ペプチド、輸送及び細胞内局在のためのシグナル、脂質付加などのシグナルを組み合わせたこれらのペプチドによって表されるモジュラー構造である。したがって、細胞及びｉｎ ｖｉｖｏにおいてペプチドの機能的活性を最大限にする非常に様々な情報を配列に組み込むために、２０〜３０個の残基のペプチドの能力を利用することができる。本発明では、ペプチド設計において二機能又は多機能モジュールも組み入れた。
【００５８】
本発明のペプチドによって表された抗ウイルス活性は、主にＮＳ３プロテアーゼ活性化プロセスの阻害に基づいている。ウイルスプロテアーゼ活性化プロセスの阻害剤として本発明で記載した［Ｉ］部分又はモジュールは、ＮＳ３ｐｒｏタンパク質に結合し、このタンパク質と、プロテアーゼの活性化に必要なフラビウイルスのウイルスタンパク質ＮＳ２Ｂ（ヘパシウイルスのＮＳ４Ａ）との間の相互作用を遮断する能力を有する。しかし、この部分の存在は、ペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいてウイルス感染を遮断できることを保証はしない。したがって、実施例３において、ＤＶ２のタンパク質ＮＳ２Ｂに対応する部分Ｓｅｒ７０−Ｇｌｙ８２が、細胞透過性ペプチドと一緒に同じポリペプチド鎖内に存在する場合にのみ、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてウイルス感染を阻害できることを示す。ウイルス感染を阻害するために、本発明のペプチドは細胞を透過し、サイトゾルに接近し、ＥＲ膜のサイトゾル面で折り畳みが生じるＮＳ３ｐｒｏタンパク質に結合することが必要である。
【００５９】
本発明の一実施形態では、細胞透過性部分として、ＤＶ１−４のエンベロープタンパク質のドメインＩＩＩのＦＧベータヘアピンに対応する配列を使用する。本発明では、これらの配列をベースにした［Ｐ］部分が細胞内に様々なペプチドカーゴを輸送できることを示している。以前に、ＤＶ１−２のＦＧヘアピンの配列に基づいた環状ペプチドが細胞受容体ＬＲＰ１と相互作用することが示された（特許出願：「フラビウイルス感染を予防及び治療するための方法及び分子（Ｍｅｔｏｄｏｓ ｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｓ ｐａｒａ ｌａ ｐｒｅｖｅｎｃｉｏｎ ｙ ｅｌ ｔｒａｔａｍｉｅｎｔｏ ｄｅ ｌａ ｉｎｆｅｃｃｉｏｎ ｃｏｎ Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ．）」ＣＵ ２００６−００９１．Ｈｕｅｒｔａ Ｖ、Ｃｈｉｎｅａ Ｇ、Ｆｌｅｉｔａｓ Ｎ、Ｍａｒｔｉｎ ＡＭ、Ｓａｒｒｉａ Ｍ、Ｇｕｉｒｏｌａ Ｏ、Ｔｏｌｅｄｏ ＰＧ、Ｓａｎｃｈｅｚ Ａ、Ｂｅｓａｄａ ＶＡ、Ｒｅｙｅｓ Ｏ、Ｇａｒａｙ ＨＥ、Ｃａｂｒａｌｅｓ Ａ、Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ Ａ、Ｐａｄｒｏｎ ＧＲ、Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＬＪ）。
【００６０】
ＬＲＰ１受容体は約３０個の天然のリガンド、中でも百日咳外毒素Ａと相互作用し、細胞内へ内部移行させることが知られている（Ｈｅｒｚ Ｊ、Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ＤＫ．（２００１）：「ＬＲＰ：多機能捕捉剤及びシグナル伝達受容体（ＬＲＰ：ａ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．）」Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：７７９〜８４．Ｋｏｕｎｎａｓ ＭＺ、Ｍｏｒｒｉｓ ＲＥ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＭＲ、ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ ＤＪ、Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ＤＫ、Ｓａｅｌｉｎｇｅｒ ＣＢ、１９９２．「アルファ２−マクログロブリン受容体／低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質はシュードモナス外毒素Ａと結合し内部移行させる（Ｔｈｅ ａｌｐｈａ ２−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｓ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｏｔｏｘｉｎ Ａ．）」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７：１２４２０〜１２４２３）。この受容体は、大多数の細胞の種類、組織及び器官で発現している。ＤＶはまた、多くの細胞系及び器官に感染する能力を有し、したがって、感染の疑いのある細胞への効果的な内部移行を実現するために、ＦＧヘアピンの配列に基づいた細胞透過性ペプチドを含有するペプチドを使用することは非常に好ましい。ＬＲＰ１の発現は、フラビウイルス科によって引き起こされる疾患の主要な標的器官である肝臓及び脳で高い。例えば、ＴＢＥ及びＪＥＶ複合体のウイルスは脳炎を引き起こし、ＹＦＶは主に内臓親和性で肝炎を引き起こす。同じ理由で、この部分はまた、本発明で記載した抗ＨＣＶペプチドに見られるように、ＨＣＶに対して効果的であろう。
【００６１】
特にデング感染の阻害剤として本発明で記載したキメラペプチドの場合、ＦＧヘアピンをベースにしたモジュールは二機能特性を有する。細胞透過性部分として既に記載された役割の他に、この部分はまた、それ自体抗ＤＶ抗ウイルス活性を示す。以前に、ＦＧヘアピンをベースにしたペプチドは、ウイルスが原形質膜に付着した後に起こるステップが関与する機構によって、ＤＶの感染増殖性細胞侵入を阻害することが示された（特許出願：「フラビウイルス感染を予防及び治療するための方法及び分子（Ｍｅｔｏｄｏｓ ｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｓ ｐａｒａ ｌａ ｐｒｅｖｅｎｃｉｏｎ ｙ ｅｌ ｔｒａｔａｍｉｅｎｔｏ ｄｅ ｌａ ｉｎｆｅｃｃｉｏｎ ｃｏｎ Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ．）」ＣＵ ２００６−００９１．Ｈｕｅｒｔａ Ｖ、Ｃｈｉｎｅａ Ｇ、Ｆｌｅｉｔａｓ Ｎ、Ｍａｒｔｉｎ ＡＭ、Ｓａｒｒｉａ Ｍ、Ｇｕｉｒｏｌａ Ｏ、Ｔｏｌｅｄｏ ＰＧ、Ｓａｎｃｈｅｚ Ａ、Ｂｅｓａｄａ ＶＡ、Ｒｅｙｅｓ Ｏ、Ｇａｒａｙ ＨＥ、Ｃａｂｒａｌｅｓ Ａ、Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ Ａ、Ｐａｄｒｏｎ ＧＲ、Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＬＪ）。これらのペプチドは、ウイルスが細胞内に侵入するとき溶液中に存在すると、高い効率でウイルス感染を阻害する。さらに、実施例２で示したように、ＦＧヘアピンをベースにした細胞透過性部分を有さず、その抗ウイルス効果がＮＳ３プロテアーゼ阻害モジュールのみに基づいている本発明のペプチドは、ウイルスと同時に媒体に投与された場合、効果は弱い。（ＦＧヘアピン部分が欠落した）これらのペプチドは、ウイルスを添加する前に細胞とプレインキュベーションした場合、最大限の抗ウイルス活性を示し、ＮＳ３プロテアーゼの活性化を阻害するために、阻害機構は細胞透過性及び効果的な細胞内局在を必要とすることと一致している。
【００６２】
したがって、本発明の新規要素は、細胞侵入阻害剤（細胞透過性ペプチドでもある）及びウイルスプロテアーゼ活性化阻害部分の組み合わせにある。
【００６３】
したがって、これらのキメラペプチドは、ウイルス感染の開始に対するペプチド添加時点間の関係を考慮すると、これらの部分の１つのみをベースにしたペプチドと比較してより有利な生物学的活性特性を有する。
【００６４】
細胞透過性及び細胞内動態。Ｎ末端脂質付加及びＥＲにおける保持。
本発明はまた、既に記載したキメラペプチドの脂質付加に適用される。本明細書で記載した脂質付加は一般的に、ペプチドのＮ末端のミリストイル化又はパルミトイル化である。本特許では、ミリストイル化として、アミド結合の手段によってペプチドのＮ末端基にミリスチン酸ＣＨ３（ＣＨ２）１２ＣＯ２Ｈを共有結合させることによってペプチドを化学修飾し、化学構造ＣＨ３（ＣＨ２）１２ＣＯ２−ＮＨ−Ｐ（Ｐはミリストイル化されたペプチドのアミノ酸配列である）を得ることを意味する。同様に、パルミトイル化によって、ＣＨ３（ＣＨ２）１４ＣＯ２Ｈパルミチン基の付加が生じる。脂質付加として、本明細書ではまた、ペプチドのＮ末端伸長として付加されたアミノ酸残基ＳＥＲ及び／又はＴＹＲの側鎖への脂質鎖の共有結合を意味する。主にＮＳ３プロテアーゼの活性化阻害に基づいた抗ウイルス活性を発揮させるために、本発明のペプチドは、細胞の種々の膜系から成る様々な生物学的障壁を通過することが必要である。
【００６５】
これらのペプチドは、細胞外空間から、抗ウイルス効果に最適な最終目的地、ＥＲのサイトゾル面に移行することが必要である。一般的に、脂質付加は、生物学的膜との相互作用に関して有利な特性であるペプチド親脂質性を高める。本発明では当初、ペプチドの脂質付加と、ペプチドの生物学的活性を高めるいくつかの輸送及び細胞局在シグナル（配列）の付加とを組み合わせた。したがって、この設計は、細胞に対するペプチド抗ウイルス活性の発現に関与した様々なステップ、原形質膜への吸着、細胞透過性、細胞内輸送／逆方向輸送、ＥＲ膜への細胞内局在及びＮＳ３ｐｒｏタンパク質との相互作用の効果を高めることが目的である。
【００６６】
ペプチド脂質付加に適した脂質（類）の化学的性質の選択は、小さなことではない。本発明のキメラペプチド設計の１つの前提は、化学修飾が抗ウイルス作用に関与する様々なプロセス、すなわち、原形質膜への結合、細胞透過性／エンドサイトーシス、細胞内輸送／逆方向輸送、サイトゾルへの輸送及びＮＳ３ｐｒｏへの結合に関するペプチドの物理化学的及び機能的特性に有利な影響を及ぼすように、ペプチドに対する化学結合に特異的な脂質（類）を選択することである。このプロセスの間、ペプチドは様々な生物物理学的特性の膜と相互作用し、様々な細胞内区画間の輸送に関与するであろう。個々のステップに関して最適な脂質がその他のステップに関しては有害であり得るので、本発明の抗ウイルスペプチドの脂質付加は指示されない。一例として、ＥＲ膜との相互作用を考慮すると、モノ飽和グリセロ脂質が潜在的に有利である。これらの脂質は、膜にはよくあり（Ｋｅｅｎａｎ Ｔ．Ｗ．及びＭｏｒｒｅａ，Ｄ．Ｊ．「ラット肝臓から単離したゴルジ体のリン脂質の種類及び脂肪酸組成並びにその他の細胞画分との比較（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｃｌａｓｓ ａｎｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｏｌｇｉ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｃｅｌｌ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ．）」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９：１９〜２５、１９７０）、スフィンゴ脂質、ステロール及び二飽和リン脂質の豊富な原形質膜と比較して高い流動性及び厚みの薄さが特徴である。したがって、ＥＲ膜への挿入に適した比較的短い鎖の不飽和脂質は、原形質膜では好ましくないであろう。この種類の脂質は、エンドサイトーシスに関与する脂質ラフトなどのスフィンゴ脂質及びコレステロールに富んだドメインから分離された原形質膜の最も流動性のあるドメインに局在すると有利である。疎水性尾部の性質が異なる脂質類似体のエンドサイトーシス経路の今までの様々な分析によって、短い尾部のある不飽和脂質は、エンドサイトーシス後、エンドサイトーシスリサイクリング区画（ＥＲＣ）を介して原形質膜に効率よく再利用され、長い尾部のある飽和脂質はエンドサイトーシス経路によって後期エンドソーム及びリソソームに送り出されることが示された（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｓ．、Ｓｏｅ，Ｔ．Ｔ及びＭａｘｆｉｅｌｄ，Ｆ．Ｒ．１９９９．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１４４、１２７１〜１２８４；Ｋｏｖａｌ，Ｍ．及びＲ．Ｅ．Ｐａｇａｎｏ、１９８９．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０８：２１６９〜２１８１；Ｍａｙｏｒ，Ｓ．、Ｊ．Ｆ．Ｐｒｅｓｌｅｙ及びＦ．Ｒ．Ｍａｘｆｉｅｌｄ、１９９３．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２１：１２５７〜１２６９；Ｓａｎｄｈｏｆｆ，Ｋ．及びＡ．Ｋｌｅｉｎ．、１９９４．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６：１０３〜１０７）。
【００６７】
以前の研究で、細胞透過性及び対応する細胞内標的におけるペプチドの生物学的活性を促進するペプチドミリストイル化の例が報告されている（Ｐ．Ｊ．Ｂｅｒｇｍａｎ，Ｋ．Ｒ．Ｇｒａｖｉｔｔ，Ｃ．Ａ．Ｏ’Ｂｒｉａｎ「ヒト乳癌細胞において多剤耐性回復薬として作用するＮ−ミリストイル化タンパク質キナーゼＣ−アルファ偽基質ペプチドはＰ−糖タンパク質基質ではない（Ａｎ Ｎ−ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ−ａｌｐｈａ ｐｓｅｕｄｏｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈａｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｖｅｒｓａｌ ａｇｅｎｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｎｏｔ ａ Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０（１９９７）４５３〜４５６．Ｂ．Ｒ．Ｋｅｌｅｍｅｎ、Ｋ．Ｈｓｉａｏ、Ｓ．Ａ．Ｇｏｕｅｌｉ、「細胞透過性ペプチドを使用したマイトジェン活性化タンパク質キナーゼのｉｎ ｖｉｖｏにおける選択的阻害（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２００２）８７４１〜８７４８．Ｔ．Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚ、Ｄ．Ｂ．ｄｅ Ｂｏｎｔ、Ｊ．ｄｅ Ｗｉｄｔ、Ｒ．Ｍ．Ｌｉｓｋａｍｐ、Ｈ．Ｌ．Ｐｌｏｅｇｈ、「ミリストイル化偽基質ペプチド、新規のタンパク質キナーゼＣ阻害剤（Ａ ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｅｄ ｐｓｅｕｄｏｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐｅｐｔｉｄｅ， ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１９９３）１９８２〜１９８６）。
【００６８】
しかし、ミリストイル化自体は、ペプチドの細胞への透過性を保証しない。実際に、細胞内に透過しないミリストイル化ペプチドの例があり、透過性はまた、ペプチドの性質に依存し、正味の電荷が正で、酸と疎水性残基の間に塩基性残基が均一に分布した特性が有利である、と仮定している（Ｃａｒｒｉｇａｎ，Ｃ．Ｎ．、Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ，Ｂ．２００５、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４１ ２９０〜２９８）。
【００６９】
本発明のペプチドと細胞との相互作用における最初の段階は、原形質膜への付着及び／又は膜上に存在する分子への結合である。ミリストイル基又はパルミトイル基の付加は、本発明のペプチドの親脂質性を高め、原形質膜へのペプチドの結合を促進する。脂質の存在の他に、本発明のペプチドは、膜中に存在する分子と相互作用する細胞透過性ペプチドの配列を含有する。一例は、グルコサミノグリカン、特にヘパリン様ヘパラン硫酸と相互作用する陽イオン細胞透過性ペプチドの場合である。
【００７０】
ヘパラン硫酸への結合は、陽イオンペプチドの細胞透過性に必須であることが示された。それらはまた、陰イオン脂質及びタンパク質のような原形質膜のその他の負に荷電した分子と相互作用することができる。同様に、エンドサイトーシスの細胞受容体と相互作用するその他のペプチドは、担体又は細胞内へのカーゴ分子の侵入を促進する細胞透過性ペプチドとして機能することができる。したがって、本発明のペプチドの脂質付加は、原形質膜への結合親和性を高め、さらにアンカー部位を提供する。
【００７１】
一般的に、ミリストイル化シグナルと並置して塩基性残基の集団を含有するミリストイル化タンパク質は、コレステロール及びスフィンゴ脂質の豊富な膜と有利に相互作用し（ＭｃＣａｂｅ，Ｊ．Ｂ及びＢｅｒｔｈｉａｕｍｅ，Ｌ．Ｇ．（１９９９）「細胞内局在における脂肪アシル化アミノ末端ドメインの機能的役割（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ｆａｔｔｙ ａｃｙｌａｔｅｄ ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．）」Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １０、３７７１〜３７８６．ＭｃＣａｂｅ，Ｊ．Ｂ．及びＢｅｒｔｈｉａｕｍｅ，Ｌ．Ｇ．（２００１）「Ｎ末端タンパク質のアシル化は、コレステロール、スフィンゴ脂質の豊富な膜に対する局在をもたらすが、脂質ラフト／カベオラへの局在はもたらさない（Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｃｙｌａｔｉｏｎ Ｃｏｎｆｅｒｓ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ， Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ Ｂｕｔ Ｎｏｔ ｔｏ Ｌｉｐｉｄ Ｒａｆｔｓ／Ｃａｖｅｏｌａｅ．）」Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １２、３６０１〜３６１７）、コレステロール及びスフィンゴ脂質はエンドサイトーシスプロセス及びタンパク質の様々な細胞内小器官及び細胞の特定の膜への輸送に関与する脂質ラフトの成分である（ＪＯＯＳＴ Ｃ．Ｍ．ＨＯＬＴＨＵＩＳ、ＴＨＯＭＡＳ ＰＯＭＯＲＳＫＩ、ＲＥＮＥＡ’Ｊ．ＲＡＧＧＥＲＳ、ＨＥＩＮ ＳＰＲＯＮＧ及びＧＥＲＲＩＴ ＶＡＮ ＭＥＥＲ．２００１．「細胞内膜輸送におけるスフィンゴ脂質の構成能力（Ｔｈｅ Ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ ｉｎ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．）」Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８１、１６８９〜１７２３．Ｓｉｍｏｎｓ，Ｋ．及びＩｋｏｎｅｎ，Ｅ．１９９７．「細胞膜における機能的ラフト（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒａｆｔｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．）」Ｎａｔｕｒｅ、３８７：５６９〜５７２）。したがって、ミリストイル化は、本発明のペプチド、特に、陽イオン細胞透過性ペプチド及び／又はＥＲ膜のサイトゾル面で保持するためのシグナルとしてのポリアルギニンを含有するペプチドの細胞透過能力に有利である。実際に、ある種の正電荷を含有する脂質付加されたペプチドは、細胞を透過することができることが示された（Ｃａｒｒｉｇａｎ，Ｃ．Ｎ．、Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ，Ｂ．２００５、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４１ ２９０〜２９８）。
【００７２】
スフィンゴ糖脂質及びコレステロールが豊富な膜の界面活性剤不溶性の特殊微小領域（ＤＲＭ）は、様々な細菌毒（コレラ毒素、リシン、滋賀毒素など）の細胞内への内部移行に必要で、ＧＭ１ガングリオシド及びスフィンゴ脂質Ｇｂ３のようなこれらのＤＲＭに結合した分子は、エンドサイトーシスによって細胞を透過するこれらの毒素のいくつかの受容体である（Ｓｐａｎｇｌｅｒ，Ｂ．Ｄ．（１９９２）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５６、６２２〜６４７．Ｆｕｊｉｎａｇａ Ｙ、Ｗｏｌｆ ＡＡ、Ｒｏｄｉｇｈｉｅｒｏ Ｃ、Ｗｈｅｅｌｅｒ ＴＥ、Ｔｓａｉ Ｂ、Ａｌｌｅｎ Ｌ、Ｊｏｂｌｉｎｇ ＭＧ、Ｒａｐｏｐｏｒｔ ＴＡ、Ｈｏｌｍｅｓ ＲＫ、Ｌｅｎｃｅｒ ＷＩ．２００３．「脂質ラフトに結合するガングリオシドは、コレラ及び関連毒素の原形質膜から小胞体への輸送を媒介する（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ ｔｈａｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｗｉｔｈ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｃｈｏｌｅｒａ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏｘｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｏ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．）」Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １４：４７８３〜４７９３．Ｆａｌｇｕｉｅｒｅｓ Ｔ、Ｍａｌｌａｒｄ Ｆ、Ｂａｒｏｎ Ｃ、Ｈａｎａｕ Ｄ、Ｌｉｎｇｗｏｏｄ Ｃ、Ｇｏｕｄ Ｂ、Ｓａｌａｍｅｒｏ Ｊ、Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ｌ．２００１．「滋賀毒素Ｂサブユニットの界面活性剤不溶性膜領域に関連した逆方向輸送経路へのターゲティング（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ Ｂ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｔｏ ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｒｏｕｔｅ ｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．）」Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １２：２４５３〜２４６８）。
【００７３】
これらの毒素は、エンドソームからＥＲへの輸送に直接又はＴＧＮを介して関連する逆方向輸送プロセスを通過した後、サイトゾルにおいて活性を発揮する（Ｓａｎｄｖｉｇ Ｋ、ｖａｎ Ｄｅｕｒｓ Ｂ．２００２．「タンパク質毒素によって利用される膜輸送（Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｆｆｉｃ ｅｘｐｌｏｉｔｅｄ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｘｉｎｓ．）」Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １８：１〜２４）。次に、これらの毒素は、また逆方向輸送によってＥＲからサイトゾルへ通過し、見かけ上ＥＲ関連分解機構（ＥＲＡＤ）を使用する（Ｌｏｒｄ，Ｊ．Ｍ．及びＲｏｂｅｒｔｓ，Ｌ．Ｍ．（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４０、７３３〜７３６．Ｌｏｒｄ，Ｊ．Ｍ．、Ｄｅｅｋｓ，Ｅ．、Ｍａｒｓｄｅｎ，Ｃ．Ｊ．、Ｍｏｏｒｅ，Ｋ．、Ｐａｔｅｍａｎ，Ｃ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｃ．、Ｓｐｏｏｎｅｒ，Ｒ．Ａ．、Ｗａｔｓｏｎ，Ｐ．及びＲｏｂｅｒｔｓ，Ｌ．Ｍ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３１、１２６０〜１２６２．ＡｂｕＪａｒｏｕｒ，Ｒ．Ｊ．、Ｄａｌａｌ，Ｓ．、Ｈａｎｓｏｎ，Ｐ．Ｉ．及びＤｒａｐｅｒ，Ｒ．Ｋ．２００５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０、１５８６５〜１５８７１）。
【００７４】
したがって、スフィンゴ脂質の豊富な膜ドメインにおいて本発明の脂質付加ペプチドが共存する可能性は、細菌毒素によって使用される前述の脂質依存性逆方向輸送に基づいた細胞透過機構を使用するそれらの潜在的能力と一致するだろう。
【００７５】
本発明のその他の実施形態では、設計されたペプチドは、細胞透過性ペプチドとして、ＤＶ３のエンベロープタンパク質のドメインＩＩＩのＦＧヘアピン又は血清型１、２及び４の相同ペプチドを使用する。以前に、これらのペプチドは細胞受容体ＬＲＰ１に結合することが示された（特許出願：「フラビウイルス感染を予防及び治療するための方法及び分子（Ｍｅｔｏｄｏｓ ｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｓ ｐａｒａ ｌａ ｐｒｅｖｅｎｃｉｏｎ ｙ ｅｌ ｔｒａｔａｍｉｅｎｔｏ ｄｅ ｌａ ｉｎｆｅｃｃｉｏｎ ｃｏｎ Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ．）」ＣＵ ２００６−００９１．Ｈｕｅｒｔａ Ｖ、Ｃｈｉｎｅａ Ｇ、Ｆｌｅｉｔａｓ Ｎ、Ｍａｒｔｉｎ ＡＭ、Ｓａｒｒｉａ Ｍ、Ｇｕｉｒｏｌａ Ｏ、Ｔｏｌｅｄｏ ＰＧ、Ｓａｎｃｈｅｚ Ａ、Ｂｅｓａｄａ ＶＡ、Ｒｅｙｅｓ Ｏ、Ｇａｒａｙ ＨＥ、Ｃａｂｒａｌｅｓ Ａ、Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ Ａ、Ｐａｄｒｏｎ ＧＲ、Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＬＪ）。この受容体は、約３０個のリガンドのエンドサイトーシスを媒介し、百日咳外毒素ＰＴｘによる細胞侵入に使用される（Ｈｅｒｚ Ｊ、Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ＤＫ．（２００１）「ＬＲＰ：多機能捕捉剤及びシグナル伝達受容体（ＬＲＰ：ａ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．）」Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：７７９〜８４．Ｋｏｕｎｎａｓ ＭＺ、Ｍｏｒｒｉｓ ＲＥ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＭＲ、ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ ＤＪ、Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ＤＫ、Ｓａｅｌｉｎｇｅｒ ＣＢ．「アルファ２−マクログロブリン受容体／低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質は、シュードモナス外毒素Ａに結合し内部移行させる（Ｔｈｅ ａｌｐｈａ ２−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｓ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｏｔｏｘｉｎ Ａ．）」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９２；２６７：１２４２０〜１２４２３）。
【００７６】
本発明では、ＦＧヘアピンに対応するペプチドが、ペプチドカーゴの細胞侵入を媒介できることを示した。これらのＦＧヘアピンを含有するペプチドの脂質付加（ミリストイル化又はパルミトイル化）は、脂質膜におけるペプチドの分配を増強することによって細胞受容体への効果的な親和性を高めるだろう。このペプチド脂質付加はまた、ＬＲＰ１受容体によって媒介されるエンドサイトーシスを介したペプチドの細胞透過能力の上昇と一致する。
【００７７】
１つの可能性として、これらのペプチドはＰＴｘと類似の方法で細胞に透過する。この毒素は、エンドソームから、ＴＧＮ、ＥＲを順次通過してサイトゾルまで逆方向輸送されてサイトゾルに接近する。ＰＴｘは、ＬＲＰ１相互作用によって媒介される少なくとも２種類の逆方向輸送経路、ａ）脂質依存性経路及びｂ）脂質独立経路を使用する能力を有する（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｃ．、Ｓｐｏｏｎｅｒ，Ｒ．Ａ．、Ｗａｔｓｏｎ，Ｐ．Ｄ．、Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｌ．、Ｈｏｄｇｅ，Ｔ．Ｗ、Ａｍｅｓｓｏｕ，Ｍ．、Ｊｏｈａｎｎｅｓ，Ｌ．、Ｌｏｒｄ，Ｊ．Ｍ．及びＲｏｂｅｒｔｓ，Ｌ．Ｍ．、２００６．「内部移行したシュードモナス外毒素Ａは、小胞体に到達するために複数の経路を使用することができる（Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｅｘｏｔｏｘｉｎ Ａ ｃａｎ Ｅｘｐｌｏｉｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐａｔｈｗａｙｓ ｔｏ Ｒｅａｃｈ ｔｈｅ Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．）」Ｔｒａｆｆｉｃ、７：３７９〜３９３）。脂質依存性経路は、原形質膜の脂質ラフトのＬＲＰ１分子の２０％の局在に関与するものと考えられる。脂質付加され、ＬＰＲ１と相互作用する能力を備えた本発明のペプチドは、より効果的に脂質依存性経路を使用できる可能性があり、特に（ＥＲ保持シグナルとして付加された）ポリアルギニンの塩基性集団を含むペプチドは、コレステロール及びスフィンゴ脂質の豊富なラフト隣接膜ドメインに局在するために有利な組成を有する。
【００７８】
本発明のその他の実施形態は、Ｃ末端にＫＤＥＬシグナルを有するペプチドである。これらのペプチドは、ＥＲの内腔での保持に機能的なＫＤＥＬシグナルを形成するために、カルボキシＣ末端を含んで合成される（Ｔｅａｓｄａｌｅ，Ｒ．Ｄ．＆ Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．、１９９６．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２、２７〜５４）。このシグナルのペプチド配列への付加は、ゴルジ体からＥＲへの逆方向輸送及びＥＲの内腔におけるこれらのペプチドの保持に有利に関与する。したがって、このシグナルは、逆方向輸送経路の少なくとも一部を使用するペプチドのサイトゾルへの透過性に関与する。効率の高い輸送は、ペプチドの高いサイトゾル濃度をもたらし、したがって、ＮＳ３プロテアーゼ活性化の阻害活性がより強くなる。実施例３において、本発明のペプチドにＫＤＥＬシグナルを付加すると、ペプチドの抗ウイルス活性の増加をもたらすことができることを示した。
【００７９】
ＫＤＥＬシグナルの付加は、Ｎ末端に脂質が結合した又は結合していない本発明のペプチドに有効である。これは、このシグナルがＥＲの可溶性タンパク質及びＩＩ型膜タンパク質の両方に見出されたという事実と一致する。ＥＲの内腔に存在する本発明の脂質付加されたペプチドは、ＩＩ型膜タンパク質と類似の形態をとる。
【００８０】
ＦＧヘアピン関連細胞透過性部分を有する本発明のペプチドの場合、ＫＤＥＬシグナルの付加は、これらのペプチドに受容体ＬＲＰ１の順方向輸送を妨害する能力をさらにもたらし、したがって、原形質膜上のそれらの受容体発現レベルの減少を導く。したがって、これらの配列／シグナルの組み合わせは、原形質膜の受容体の発現が減少している細胞へのウイルスの侵入に対して間接的な負の効果を有し、この効果はウイルスの細胞侵入を遮断する前述したＦＧヘアピンをベースにしたペプチドの直接的効果に付け加えられる。以前の証明によって、ＦＧヘアピンをベースにしたペプチドは、ＬＲＰ１とそのシャペロン受容体関連タンパク質ＲＡＰとの相互作用に有利に働くことが示された（特許出願：「フラビウイルス感染を予防及び治療するための方法及び分子（Ｍｅｔｏｄｏｓ ｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｓ ｐａｒａ ｌａ ｐｒｅｖｅｎｃｉｏｎ ｙ ｅｌ ｔｒａｔａｍｉｅｎｔｏ ｄｅ ｌａ ｉｎｆｅｃｃｉｏｎ ｃｏｎ Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ．）」ＣＵ２００６−００９１．Ｈｕｅｒｔａ Ｖ、Ｃｈｉｎｅａ Ｇ、Ｆｌｅｉｔａｓ Ｎ、Ｍａｒｔｉｎ ＡＭ、Ｓａｒｒｉａ Ｍ、Ｇｕｉｒｏｌａ Ｏ、Ｔｏｌｅｄｏ ＰＧ、Ｓａｎｃｈｅｚ Ａ、Ｂｅｓａｄａ ＶＡ、Ｒｅｙｅｓ Ｏ、Ｇａｒａｙ ＨＥ、Ｃａｂｒａｌｅｓ Ａ、Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ Ａ、Ｐａｄｒｏｎ ＧＲ、Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＬＪ）。これらのペプチドは、原形質膜通過中に細胞外への経路に存在する細胞内ＬＲＰ１と相互作用することができることを意味する。これらのペプチドはまた、ＫＤＥＬシグナルを含有するので、細胞内複合体ペプチド−ＬＲＰ１及び／又はペプチド−ＬＲＰ１／ＲＡＰはＫＤＥＬ受容体に結合することができ、したがってゴルジ体からＥＲに通過し、ＬＲＰ１の原形質膜への輸送に影響を及ぼし、ＬＲＰ１が媒介するウイルスの細胞侵入に間接的に影響を及ぼす。
【００８１】
本発明のペプチドの一般的な特性は、それらがＮＳ３プロテアーゼ活性の阻害に基づいて抗ウイルス活性を表すことである。プロテアーゼ活性化の阻害は、タンパク質ＮＳ２Ｂ（ヘパシウイルスではＮＳ４Ａ）とＮＳ３ｐｒｏドメインとの相互作用を特異的に遮断することによって実施され、この相互作用はプロテアーゼの正確な折り畳み及び完全な活性に必要な条件である。
【００８２】
プロテアーゼＮＳ３のタンパク質折り畳み及び活性化並びにコアタンパク質及び非構造タンパク質の残部の折り畳み及びプロセシングは、ＥＲ膜のサイトゾル面で生じる。したがって、本発明のペプチドの抗ウイルス活性の増強方法は、ＥＲ膜での細胞内局在の増加にある。この目的で、ペプチドのＮ末端に化学的に脂質付加することができた（ミリストイル化又はパルミトイル化）。脂質付加されたペプチドは、脂質膜と有利に相互作用する能力を有する。（脂質部分に支持された）脂質付加されたペプチドとＥＲ膜の良好な結合によって、ペプチドとＮＳ３ｐｒｏタンパク質との間の相互作用の見かけの効果的な親和性、すなわち、以下の要素、１）局所ペプチド濃度の増加、２）（膜の平面の）２方向で生じる生体分子の相互作用及び３）膜での脂質付加されたペプチドの迅速な外側への拡散に関連した効果が増大する。さらに、ＥＲ膜のサイトゾル面に関連するとき、Ｎ末端が脂質付加されたペプチドはＩ型膜タンパク質と形態学的に類似し、したがって、正確な局在だけでなく、ウイルスＮＳ２Ｂタンパク質（ヘパシウイルスのＮＳ４Ａ）に類似した膜に関する方向性も獲得する。
【００８３】
一般的に、パルミトイル化及び／又は塩基性集団のような他のシグナルがないとき、サイトゾルタンパク質のミリストイル化は、主にＥＲ膜でのこれらのタンパク質の局在を誘導する（ＭｃＣａｂｅ，Ｊ．Ｂ．及びＢｅｒｔｈｉａｕｍｅ，Ｌ．Ｇ．（１９９９）．「細胞内局在における脂肪アシル化アミノ末端ドメインの機能的役割（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ｆａｔｔｙ ａｃｙｌａｔｅｄ ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．）」Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １０、３７７１〜３７８６）。ミリスチン酸自体の膜への結合は余り強くなく、ＥＲ膜中のペプチドの保持全体を保証しない。しかし、ＥＲ膜は細胞内膜の６０％を構成し、膜の残部に関してペプチドの著しく有効な濃度が保証される。ミリストイル化に加えて、塩基性集団も存在すると、サイトゾルタンパク質は主に原形質膜の内面及びエンドソーム内に局在する。
【００８４】
本発明の様々なペプチドは、原形質膜の外面に局在する負に荷電した分子との有利な相互作用も保証する細胞透過性ペプチドとして陽イオン部分を含有する。本発明のいくつかのペプチドは、ＥＲ保持／方向変更シグナルでもある陽イオン部分としてアルギニンの集団を含有する（Ｔｅａｓｄａｌｅ，Ｒ．Ｄ．＆ Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２、２７〜５４．Ｚｅｒａｎｇｕｅ，Ｎ．、Ｓｃｈｗａｐｐａｃｈ，Ｂ．、Ｊａｎ，Ｙ．Ｎ．＆ Ｊａｎ，Ｌ．Ｙ．（１９９９）Ｎｅｕｒｏｎ ２２、５３７〜５４８．Ｓｃｈｕｔｚｅ，Ｍ．Ｐ．、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ａ．＆ Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．１３、１６９６〜１７０５）。これらのペプチドは、同時に両方の特性、効率的な細胞透過性及び主にＥＲ膜のサイトゾル面における細胞内局在を表す目的で設計された。ＥＲへのアルギニンをベースにした輸送シグナルは、効率が高く、膜タンパク質の品質管理機構に重要な役割を果たす（Ｃｈａｎｇ，Ｘ．Ｂ．、Ｃｕｉ，Ｌ．、Ｈｏｕ，Ｙ．Ｘ．、Ｊｅｎｓｅｎ，Ｔ．Ｊ．、Ａｌｅｋｓａｎｄｒｏｖ，Ａ．Ａ．、Ｍｅｎｇｏｓ，Ａ．＆ Ｒｉｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｒ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ４、１３７〜１４２．Ｍａｒｇｅｔａ−Ｍｉｔｒｏｖｉｃ，Ｍ．、Ｊａｎ，Ｙ．Ｎ．＆ Ｊａｎ，Ｌ．Ｙ．（２０００）Ｎｅｕｒｏｎ ２７、９７〜１０６）。
【００８５】
Ｉ型膜タンパク質のＣ末端に限定されているジリシンシグナルとは異なり、アルギニンをベースにしたシグナルは、Ｎ末端及びＣ末端並びにサイトゾル面に局在した内部ループを含む、一連の膜タンパク質の多くの位置で見出される。アルギニンをベースにした保持シグナルの多用途性は、それらとＣ末端ＫＤＥＬシグナルを一緒にしたペプチドを設計するために、本発明で使用した。したがって、これらのシグナルを含有する本発明のいくつかの脂質付加されたペプチドは、細胞内に侵入し、逆方向輸送によってサイトゾルに移行し、ＥＲに移行する間にＫＤＥＬシグナルに有利で、その後アルギニンをベースにしたシグナルによって支持されるＥＲ膜のサイトゾル面に保持される。
【００８６】
本発明の一実施形態では、配列がＥＲ膜のサイトゾル面に保持されるための２個の連続した推定保持シグナルを含有する、脂質付加されたペプチドの設計を含めた。得られた配列は、ＬＲＲＲＲＬＲＲＲＲＬで、中央のＬｅｕ残基で重複した２個の連続したＬＲＲＲＲＬ配列に相当する。疎水性残基が前にある４個の連続したアルギニンの配列は、ＲＥ保持配列の典型である（Ｚｅｒａｎｇｕｅ，Ｎ．、Ｍａｌａｎ，Ｍ．Ｊ．、Ｆｒｉｅｄ，Ｓ．Ｒ．、Ｄａｚｉｎ，Ｐ．Ｆ．、Ｊａｎ，Ｙ．Ｎ．、Ｊａｎ，Ｌ．Ｙ．及びＳｃｈｗａｐｐａｃｈ，Ｂ．２００１．ＰＮＡＳ、９８：２４３１〜２４３６）。これらに関して、本発明の新規態様の１つは、得られた配列が効果的なＲＥ保持シグナル及び細胞透過性ペプチドでもある二様性を有することである。得られた配列の細胞透過特性は、ポリアルギニン配列と類似した非常に効果的な陽イオンＰＴＤである８個のアルギニン残基によってもたらされる。
【実施例】
【００８７】
（実施例１）
フラビウイルス科感染のキメラペプチド阻害剤の設計及び合成
本発明で記載したフラビウイルス科感染のキメラペプチド阻害剤は、以下の形態による一次構造を有し、
［Ｐ］−［Ｌ１］−［Ｉ］−［Ｌ２］−［Ｔ］又は［Ｉ］−［Ｌ３］−［Ｐ］−［Ｌ４］−［Ｔ］
式中、［Ｐ］は通常１０〜３０個の残基の細胞透過性ペプチドのアミノ酸配列であり、ペプチド分子全体の細胞の細胞質内への内部移行を促進し、ＲＥＲ近傍に接近させる能力を備えており、［Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４］は０〜６個の残基のリンカー配列であり、［Ｉ］はＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼの活性化を遮断するアミノ酸配列であり、この部分の残基はフラビウイルスのＮＳ３ｐｒｏタンパク質のＣ末端ベータバレルドメインのベータ鎖Ｂ２ａ及びＢ２ｂ又はＮ末端ベータバレルドメインのベータ鎖Ａ１（又はヘパシウイルス若しくはペスチウイルスの構造的に対応する領域）の少なくとも１個のアミノ酸と接触し、ＮＳ３ｐｒｏタンパク質は活性型又は不活性型立体構造であり（図１）、［Ｔ］は、通常、配列ＫＤＥＬ及びＬＲＲＲＲＬのようなＥＲ中における１個若しくは２個の保持シグナルである０〜１０個の残基の配列又はプロテアーゼ活性部位に結合する能力を示す配列ＸＲＲである。
【００８８】
表１及び２は、形態１及び２それぞれによるキメラペプチドの配列を示す。基本的なペプチドの設計は、プロテアーゼ活性化阻害剤部分［Ｉ］及び細胞透過性部分［Ｐ］の存在に基づく。［Ｉ］として、部分には、ＤＶ１〜４のＮＳ２Ｂタンパク質の配列Ｄ５０−Ｅ６２、Ｓ７０−Ｇ８２及びＳ７０−Ｉ８６が含まれる。ＷＮＶ及びＨＣＶの対応する配列も含まれる。部分Ｄ５０−Ｅ６２は、ＮＳ３ｐｒｏのＮ末端ドメインに結合し、部分Ｓ７０−Ｇ８２及びＳ７０−Ｉ８６はＣ末端ドメインに結合する（図１Ａ〜Ｃ）。
表１ 形態［Ｐ］−［Ｌ１］−［Ｉ］−［Ｌ２］−［Ｔ］によるキメラペプチドの設計
【表１】
＊：カルボキシルＣ末端。Ｍｙｒ−：ミリストイル基のペプチドのＮ末端への共有結合。Ｐａｌ−：パルミトイル基のペプチドのＮ末端への共有結合。ｂＡ：ベータ−アラニン。ＦＧ−ｄｅｎ３：ＤＶ３のエンベロープタンパク質のドメインＩＩＩのＦＧヘアピンに対応する配列、ジスルフィド結合によって結合した２個のシステインがこの部分のＮ及びＣ末端に付加されている。
表２ 形態［Ｉ］−［Ｌ３］−［Ｐ］−［Ｌ４］−［Ｔ］によるキメラペプチドの設計
【表２】
＊：カルボキシルＣ末端。Ｍｙｒ−：ミリストイル基のペプチドのＮ末端への共有結合。Ｐａｌ−：パルミトイル基のペプチドのＮ末端への共有結合。ｂＡ：ベータ−アラニン。ＦＧ−ｄｅｎ３：ＤＶ３のエンベロープタンパク質のドメインＩＩＩのＦＧヘアピンに対応する配列、ジスルフィド結合によって結合した２個のシステインがこの部分のＮ及びＣ末端に付加されている。
【００８９】
本発明はまた、フラビウイルス科ファミリーのその他のメンバーに対する抗ウイルスキメラペプチドの設計に関する。その他のフラビウイルス科に対するペプチド阻害剤には、［Ｉ］部分として、ＮＳ２Ｂタンパク質配列（フラビウイルス）又はＮＳ４Ａ（ヘパシウイルス）に対応する類似部分が含まれる。本発明の配列のリストには、［Ｉ］部分がその他のフラビウイルス（ＹＦＶ、ＪＥＶ、ＴＢＥ、ＷＮＶ）及びヘパシウイルスＨＣＶに対応する、表１及び２に示されたものの他のキメラペプチド類似体が含まれる。
【００９０】
［Ｐ］部分として、ＴＡＴペプチド、Ｒ１０、ペネトラチン、陽イオン配列ＬＲＲＲＲＬＲＲＲＲＬ及びＬＲＲＲＲＬ−ｂＡｌａ−ＲＲＲＲＬ及びＤＶ３のエンベロープタンパク質の部分Ｓ３７６−Ｗ３９１（ドメインＩＩＩのループＦＧ）が考えられる。後者の部分は、Ｎ末端及びＣ末端にシステインを含み、ジスルフィド結合を形成し、エンベロープタンパク質の３次元構造に認められるベータヘアピン構造を安定化する。
【００９１】
末端［Ｔ］部分として、ＥＲ保持シグナルＬＲＲＲＲＬ、ＫＤＥＬ及びそれらの組み合わせＬＲＲＲＲＬＫＤＥＬが含まれる。これらのシグナルの存在は、ＥＲにおけるペプチドの効果的な局在を高め、抗ウイルス活性に有利な影響を与える。［Ｔ］部分として、トリペプチドＧＧＧによって配列Ｓ７０〜Ｉ８６の［Ｉ］部分に結合した配列ＧＲＲも含まれる。図１Ｃに示したように、この一次構造を有するペプチドは、ＮＳ３ｐｒｏタンパク質のＣ末端ドメインに結合し、ＧＲＲ部分はプロテアーゼ活性部位に局在し、基質との相互作用を遮断する。リンカー部分として、表１及び２にトリペプチドＧＧＧ、ジペプチドＧＧ及びアミノ酸ベータアラニンが含まれる。
【００９２】
Ｎ末端がミリストイル化及びパルミトイル化されたペプチドも含まれる。これらのペプチドの脂質付加は、原形質膜への付着効率、細胞侵入及び最終的なＲＥ膜への局在を高める。脂質付加は、化学的方法によって実施される。表１及び２において、脂質は、Ｎ末端又はＮ末端ベータアラニン残基に直接結合する。
【００９３】
表１及び２に含まれる様々なペプチド部分は、複数のシグナル機能を表す。部分ＬＲＲＲＲＬＲＲＲＲＬ及びＬＲＲＲＲＬ−ｂＡｌａ−ＲＲＲＲＬは、細胞透過性ペプチドである以外に、２個の連続したＥＲ保持シグナルを含む。
【００９４】
ＤＶ３のエンベロープタンパク質の領域Ｓ３７６−Ｗ３９１の配列に対応する［Ｐ］部分はまた、細胞透過性ペプチドである以外に、細胞内へのウイルス侵入の阻害剤である。したがって、本発明のペプチドにおけるこれらの部分の使用は、これらのペプチドの阻害効果を高める。
【００９５】
本発明のペプチドは、単独で、又は融合タンパク質の一部として、化学合成又は組換えＤＮＡ技術によって得ることができた。融合タンパク質として発現させると、発現レベル及び宿主プロテアーゼによる分解に対するペプチドの安定性を高めることができる。これらのペプチド配列は、特定のプロテアーゼの基質配列に対応するリンカーによって融合タンパク質に結合させることができ、したがって、このペプチドは、連続したタンパク質分解及び精製によって単離することができる。
【００９６】
ペプチド合成
固相ペプチド合成は、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ方法を使用して、Ｆｍｏｃ−ＡＭ−ＭＢＨＡで実施した（Ｂａｒａｎｙ，Ｇ及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．９９（１９７７）７３６３〜７３６５）。合成は、多孔性フリットを装着した１０ｍｌシリンジで手動によって実施し、反応物及び溶媒は全て真空濾過によって廃棄した。アミノ酸は、ＤＩＣ／ＨＯＢｔで活性化して結合させ、ニンヒドリンアッセイによって結合反応の完了をモニターした（Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．、Ｃｏｌｅｓｃｏｔｔ，Ｒ．Ｌ．、Ｂｏｓｓｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｄ．、Ｃｏｏｋ，Ｐ．Ｉ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４（１９７０）５９５〜５９８）。
【００９７】
合成したペプチドは、ＴＦＡ／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（９４％／２．５％／２．５％／１％）の溶液で処理することによって樹脂から脱離させ、エーテルで沈殿させ、７２時間凍結乾燥した。ジスルフィド結合の形成によるペプチドの環化は、ＤＭＳＯで酸化させることによって実施した（Ａｎｄｒｅｕ，Ｄ．、Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，Ｆ．、Ｓｏｌ，Ｎ．Ａ．、Ｍｕｎｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．、Ｆｅｒｒｅｒ，Ｍ．及びＢａｒａｎｙ，Ｇ．、Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｍ．Ｗ．及びＤｕｎｎ，Ｂ．Ｍ．編、「ペプチド合成方法、分子生物学的方法（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、１９９４、９１〜１６９頁）。いずれの場合も、ペプチドはＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、収集した画分は分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによって再度分析した。各ペプチドの最終調製物は、クロマトグラフィーによる純度が９９％以上である画分を収集することによって得られた。各最終調製物のペプチドの量は、ＥＳＩ−ＭＳ質量分析によって確認した。
【００９８】
質量スペクトルは、Ｚスプレー電子噴霧イオン化源を装着した、八角型（ｏｃｔａｇｏｎａｌ ｇｅｏｍｅｔｒｙ）ＱＴＯＦ−２ＴＭを有するハイブリッド質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、ＵＫ）で取得した。
【００９９】
スペクトルの獲得及びプロセシングのために使用したソフトウェアは、ＭａｓｓＬｉｎｘ、バージョン３．５（Ｗａｔｅｒｓ、ＵＳＡ）であった。
【０１００】
（実施例２）
ベロ細胞におけるウイルス感染の阻害
本発明で記載したキメラペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける抗ウイルス活性を検証するために、ペプチドをベロ細胞におけるプラーク減少中和アッセイ（ＰＲＮＴ）で試験した。ベロ細胞は、２４ウェルプレートで約９０％コンフルエンスまで増殖させ、ＦＣＳを含まないＭＥＭ培地で２回洗浄した。ペプチド希釈物は、特定のアッセイにしたがって添加し、通常３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウイルスは感染効率０．１で添加し、その後３７℃で１時間引き続きインキュベートした。ある種の実験では、ペプチドは（プレインキュベーションしないで）ウイルスと同時に添加するか、又はペプチドプレインキュベーション時間を変更した。２回目のインキュベーションの終了時に、未結合のウイルスを洗浄によって排除し、溶解性プラークの出現を抑えるために、細胞を高密度培地（非必須アミノ酸、１％ＦＣＳ、１％カルボキシメチルセルロースを補給したＭＥＭ）で３７℃で５日間インキュベートした。プラークは、酢酸ナトリウム０．１５Ｍｏｌ／Ｌに溶かした０．１％ナフトールブルーブラックで染色することによって視覚化した。各アッセイの実験点毎に複製を２つ使用して、３回の独立した測定を実施した。阻害割合は、式、
【化１】
にしたがって計算した。
【０１０１】
図２は、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴ（表１のペプチド１）が、用量依存的に、ＤＶ２による感染を阻害し、ＩＣ５０が約５０〜６０μＭであることを示している。このペプチドは、このアッセイ条件で、細胞に対して毒性の徴候を示さなかった。ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの配列は、２個の必須のモジュール、細胞透過性部分ＴＡＴ及びプロテアーゼのＣ末端ドメインを標的化するプロテアーゼＮＳ３ｐｒｏ活性化阻害剤部分を含有する。ＴＡＴペプチドは、抗ウイルス活性を示さず、プラークの数の増加を引き起こす（図２Ｂ）。この結果は、ペプチド設計と矛盾せず、抗ウイルス活性は、ＶＤ２（Ｓ１６８０３株）に特異的に関連した部分に存在する。ＴＡＴペプチドの存在下で認められたウイルス感染増強は、このペプチドのＰＴＤ特性によって促進されたウイルスの細胞への侵入の増加が関連し得る。ＰＴＤによって媒介されるウイルスの細胞透過性増加は、その他の系で既に観察されている（Ｇｒａｔｔｏｎ ＪＰ，Ｙｕ Ｊ、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ＪＷ他、「細胞透過性ペプチドは、細胞摂取及び細胞内及びｉｎ ｖｉｖｏにおける複製欠損ウイルスの治療遺伝子輸送を高める（Ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．）」Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００３；９：３５７〜６３）。
【０１０２】
ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの配列におけるＴＡＴペプチド部分の存在は、ＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化阻害剤部分［Ｉ］自体がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて抗ウイルス活性を示さないので、抗ウイルス活性に必要である（図５）。
【０１０３】
図２は、キメラペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの抗ウイルス活性は、ウイルスを添加する前にペプチドを細胞と１時間プレインキュベートすれば増大することを示している。この結果は、ペプチドの抗ウイルス活性の標的が細胞内現象であり、プレインキュベーションによって大量のペプチドを細胞内に透過させ、ウイルス複製開始前にＥＲ膜に局在させるという事実と一致する。
【０１０４】
ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの抗ウイルス活性に対するプレインキュベーションの効果を特徴付けるために、プラーク減少中和、プレインキュベーション時間とペプチド用量との間の関係を研究した。陰性対照として、ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴに類似した構造を表す非関連キメラペプチドを使用した。このペプチドは、Ｎ末端にＴＡＴペプチドの配列、Ｃ末端にヒト乳頭腫ウイルスのタンパク質Ｅ７に結合を示した配列を含有する。図３は、ペプチド濃度が１００μＭ未満の場合、プレインキュベーションが抗ウイルス活性に必要で、この活性はプレインキュベーション時間が０時間と１時間との間で増加することを示している。この結果は、抗ウイルス効果の標的が細胞内に局在すること、及び細胞外空間からサイトゾルへペプチドを輸送することが必要であることと一致する。
【０１０５】
しかし、プレインキュベーションの１時間と３時間との間には、大きな差は認められない。可能性のある１つの説明は、これらの時間で、サイトゾル中のペプチド蓄積の動態とペプチドの細胞内分解との間が平衡に達するということであろう。
【０１０６】
陰性対照ペプチドは、アッセイした条件のいずれにおいても抗ウイルス活性を示さず、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの抗ウイルス効果が特にＮＳ２Ｂタンパク質に対応する部分の配列によることを示している。
【０１０７】
図４は、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの抗ウイルス活性が細胞内効果に関連していることを示す他の証拠を示す。この場合、既に記載された通常のアッセイ条件の他に（図４Ａ）、ウイルスを添加する前に、細胞を連続的に洗浄することによってペプチドを培地から回収したとき、ペプチドの抗ウイルス活性も測定した（図４Ｂ）。両方のアッセイ条件下において、ペプチドの抗ウイルス活性は非常に類似しており、抗ウイルス効果は既に内部移行したペプチドに左右されることを示している。これらのアッセイにおいて、表１のペプチド１８は陰性対照として使用された。このペプチドは、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴと類似した設計であるが、Ｃ末端部分はＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴのＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化阻害剤［Ｉ］部分と同じ長さ及びアミノ酸組成の配列から成っているが、元の配列がランダム化されていた。このペプチドは、いずれの条件においても抗ウイルス活性を示さず、ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴの抗ウイルス活性は、ＮＳ２Ｂの選択された配列断片に左右されることを示している。
【０１０８】
（実施例３）
ペプチドの抗ウイルス活性に対する細胞透過性ペプチドの性質及びＥＲ保持シグナルの効果
細胞透過性ペプチド及びＥＲ保持シグナルの本発明のペプチドの抗ウイルス活性に対する役割を決定するために、表１のペプチド番号１、２、３及び４のベロ細胞のＶＤ２によるウイルス感染の阻害を実施例２で記載したアッセイを使用して試験した。
【０１０９】
ペプチド２及び３は、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴ（ペプチド１）と類似の一次構造を有するが、細胞透過性部分としてそれぞれペネトラチン及びデカアルギニンを表す。ペプチド４は、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴのＣ末端にＫＤＥＬシグナルが付加されている。ペプチド４のＣ末端基は、ＥＲ保持シグナルを機能させるために、カルボキシである。
【０１１０】
図５及び表３は、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２−ｐＲＲ（表１のペプチド３）がより高い抗ウイルス活性、すなわち、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴよりほとんど一桁大きな効力を表すことを示している。可能性のある１つの説明は、デカアルギニンペプチドは、細胞の細胞内環境においてタンパク質分解により耐性であることである（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｋ．、Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋ，Ｍ．及びＢｒｏｃｋ，Ｒ．２００４．「陽イオン細胞透過性ペプチドの細胞内での動態の段階的分析（Ａ ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆａｔｅ ｏｆ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９、１２６２５〜３５）。ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２−ｐＰ２（ペプチド２）は、ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴと類似の抗ウイルス活性を示すが、顕著な細胞傷害性を示す。ＫＤＥＬシグナルを付加すると、ペプチドの抗ウイルス活性が少し増加し、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴはサイトゾルに接近するために少なくとも部分的に逆方向輸送を使用することが示唆される。
【０１１１】
細胞透過性部分を欠落したペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２は、抗ウイルス活性を阻害せず、この種類の部分の包含が本発明のペプチドに必要であることを示している。
表３ ベロ細胞におけるペプチドのＰＲＮＴ５０及び細胞傷害性（ＣＴＥ）
【表３】
ＣＴＥ：細胞傷害性効果、値は、単層の５０％まで障害を与えるペプチド濃度を示す。
【０１１２】
（実施例４）
同種及び異種ウイルスに対するペプチドの抗ウイルス活性
抗ウイルス薬に期待される特性は、少なくとも関連する最も類似したウイルスに対して、広範囲の抗ウイルス活性を有することである。デングウイルスに対する抗ウイルス分子の開発においてもこのことは事実で、１）デングは実際に４種の異なるウイルスの複合体であり、２）早期の特異的な診断には困難があり、３）感染した国では、デングはしばしば風土性があり、複数の血清型の同時循環が生じる。
【０１１３】
４種類のデング血清型は、構造的及び非構造的タンパク質が類似のアミノ酸配列（同一性７０〜８０％）を有する関連ウイルスである。したがって、ＮＳ２Ｂ及び／又はＮＳ３ｐｒｏのアミノ酸配列の違いが本発明のペプチドの異種ウイルスに対する感染阻害能力に影響を及ぼし得ることは合理的である。
【０１１４】
本発明のペプチドの抗ウイルス活性の交差反応性及び血清型特異性を評価するために、表１のペプチド１、３及び６のベロ細胞のＤＶ１〜３によるウイルス感染の阻害を実施例２で記載したアッセイを使用して試験した。試験したウイルス株は、ＤＶ１のＷｅｓｔ Ｐａｃ ７４、ＤＶ２のＳ１６８０３及びＤＶ３のＣＨ５３４８９であった。ペプチド６（ＮＳ２Ｂｄｅｎ１＋ＴＡＴ）は、ＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴと類似の一次構造を有するが、ＤＶ１のタンパク質ＮＳ２Ｂに対応するＮＳ３活性阻害剤部分を有する。コンピュータ方法によって設計されたペプチド５の分析も含めた。
【０１１５】
図６は、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ｐＲＲ（表１のペプチド３）が３種類の血清型に対して同等の効力であることを示している。ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ２＋ＴＡＴはまた、抗ウイルス活性が低いが血清型１〜３を阻害する。しかし、ペプチドＮＳ２Ｂｄｅｎ１＋ＴＡＴ（ペプチド６）は、血清型１及び３に対して部分的な阻害しか示さない。この結果は、血清型１及び３が互いに系統学的に近く、それらのタンパク質はより類似している事実と一致する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのウイルスのＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化の少なくとも１個の部分阻害剤及び細胞透過性部分を含む一次構造を有し、ウイルスによる感染を阻害するか、又は軽減することができることを特徴とするキメラペプチド。
【請求項２】
ＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化の部分阻害剤を含有し、前記部分がＮＳ３ｐｒｏに結合し、ＮＳ２Ｂとフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）のＮＳ３ｐｒｏ又はヘパシウイルス（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）のタンパク質ＮＳ４Ａとの相互作用を遮断又は妨害することができるペプチドであり、前記遮断又は妨害が、減少したタンパク質分解活性を示すか又はタンパク質分解活性を示さないＮＳ３タンパク質の形成をもたらすことを特徴とする請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項３】
ＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化の部分阻害剤を含有し、前記部分がＮＳ３ｐｒｏに結合し、ＤＶ２のＮＳ３ｐｒｏタンパク質のＮ末端ドメインのＧｌｙ２１−Ｌｙｓ２８領域に含まれる少なくとも１個の残基又はその他のフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）のＮＳ３ｐｒｏタンパク質の構造的対応残基と接触することができるペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項４】
ＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化の部分阻害剤を含有し、前記部分がＮＳ３ｐｒｏに結合し、ＤＶ２のＮＳ３ｐｒｏタンパク質のＣ末端ドメインのＧｌｙ１１４−Ｔｈｒ１１８領域、Ｓｅｒ１２７及びＶａｌ１６２に含まれる少なくとも１個の残基又はその他のフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）のＮＳ３ｐｒｏタンパク質の構造的対応残基と接触することができるペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項５】
ＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化の前記部分阻害剤が、ＨＣＶのＮＳ３ｐｒｏタンパク質のＮ末端ドメインのＧｌｕ３２−Ｔｈｒ３８領域に含まれる少なくとも１個の残基又はその他のヘパシウイルス（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）のＮＳ３ｐｒｏタンパク質の構造的対応残基と接触する、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項６】
ＤＶ２のＮＳ２Ｂタンパク質のＡｓｐ５０−Ｇｌｕ６２領域又はその他のフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）のタンパク質ＮＳ２Ｂの構造的対応部分を含むＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化の部分阻害剤を含有するか、或いは同一性８０％以上の配列類似性を示すアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項７】
ＤＶ２のＮＳ２Ｂタンパク質のＳｅｒ７０−Ｇｌｙ８２領域又はその他のフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）のタンパク質ＮＳ２Ｂの構造的対応部分を含むＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化の部分阻害剤を含有するか、或いは同一性８０％以上の配列類似性を示すアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項８】
ＨＣＶのＮＳ４Ａタンパク質のＴｈｒ２０−Ｌｅｕ３１領域又はその他のヘパシウイルス（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）のタンパク質ＮＳ４Ａの構造的対応部分を含むＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化の部分阻害剤を含有するか、或いは同一性８０％以上の配列類似性を示すアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項９】
フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーの前記ウイルスが以下のフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ）、セントルイス脳炎ウイルス（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、ＤＶ１、ＤＶ２、ＤＶ３、ＤＶ４、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、黄熱病ウイルス（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、クンジンウイルス（Ｋｕｎｊｉｎ ｖｉｒｕｓ）、キャサヌール森林病ウイルス（Ｋｙａｓａｎｕｒ Ｆｏｒｅｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）、ダニ媒介脳炎ウイルス（Ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、マレー渓谷脳炎ウイルス（Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ ｖｉｒｕｓ）、ＬＡＮＧＡＴウイルス、跳躍病ウイルス（Ｌｏｕｐｉｎｇ ｉｌｌ ｖｉｒｕｓ）、ポワッサンウイルス（Ｐｏｗａｓｓａｎ ｖｉｒｕｓ）の１種である、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項１０】
フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーの前記ウイルスがヘパシウイルス（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）であり、具体的にはＨＣＶである、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項１１】
以下の陽イオンＰＴＤ、ＴＡＴペプチド、ヘプタアルギニン、オクタアルギン、ノナアルギニン、デカアルギニン、又は配列ＬＲＲＲＲＬＲＲＲＲＬ若しくはＬＲＲＲＲＬ−ｂＡｌａ−ＬＲＲＲＲＬのペプチドの１つである細胞透過性部分を含有することを特徴とする、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項１２】
ＤＶ２のエンベロープタンパク質のＳｅｒ３７６−Ｔｒｐ３９１領域又はデングウイルスのその他の血清型の構造的対応部分を含む細胞透過性部分を含有することを特徴とする、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項１３】
小胞体における保持及び／又は局在のシグナルを含有し、このシグナルの存在が前記ペプチドの抗ウイルス活性を高めることを特徴とする、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項１４】
脂質付加されており、前記脂質付加が前記ペプチドの抗ウイルス活性を高めることを特徴とする、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項１５】
配列表に含まれる一次構造を有することを特徴とする、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項１６】
請求項１に記載の１個又は複数のペプチドを含有し、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーの１種又は複数のウイルスによる感染に対する予防的及び／又は治療的処置に有効であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１】
フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのウイルスのＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化の少なくとも１個の部分阻害剤及び細胞透過性部分を含む一次構造を有し、ウイルスによる感染を阻害するか、又は軽減することができることを特徴とするキメラペプチド。
【請求項２】
ＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化の部分阻害剤を含有し、前記部分がＮＳ３ｐｒｏに結合し、ＮＳ２Ｂとフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）のＮＳ３ｐｒｏ又はヘパシウイルス（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）のタンパク質ＮＳ４Ａとの相互作用を遮断又は妨害することができるペプチドであり、前記遮断又は妨害が、減少したタンパク質分解活性を示すか又はタンパク質分解活性を示さないＮＳ３タンパク質の形成をもたらすことを特徴とする請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項３】
ＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化の部分阻害剤を含有し、前記部分がＮＳ３ｐｒｏに結合し、ＤＶ２のＮＳ３ｐｒｏタンパク質のＮ末端ドメインのＧｌｙ２１−Ｌｙｓ２８領域に含まれる少なくとも１個の残基又はその他のフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）のＮＳ３ｐｒｏタンパク質の構造的対応残基と接触することができるペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項４】
ＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化の部分阻害剤を含有し、前記部分がＮＳ３ｐｒｏに結合し、ＤＶ２のＮＳ３ｐｒｏタンパク質のＣ末端ドメインのＧｌｙ１１４−Ｔｈｒ１１８領域、Ｓｅｒ１２７及びＶａｌ１６２に含まれる少なくとも１個の残基又はその他のフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）のＮＳ３ｐｒｏタンパク質の構造的対応残基と接触することができるペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項５】
ＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化の前記部分阻害剤が、ＨＣＶのＮＳ３ｐｒｏタンパク質のＮ末端ドメインのＧｌｕ３２−Ｔｈｒ３８領域に含まれる少なくとも１個の残基又はその他のヘパシウイルス（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）のＮＳ３ｐｒｏタンパク質の構造的対応残基と接触する、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項６】
ＤＶ２のＮＳ２Ｂタンパク質のＡｓｐ５０−Ｇｌｕ６２領域又はその他のフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）のタンパク質ＮＳ２Ｂの構造的対応部分を含むＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化の部分阻害剤を含有するか、或いは同一性８０％以上の配列類似性を示すアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項７】
ＤＶ２のＮＳ２Ｂタンパク質のＳｅｒ７０−Ｇｌｙ８２領域又はその他のフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）のタンパク質ＮＳ２Ｂの構造的対応部分を含むＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化の部分阻害剤を含有するか、或いは同一性８０％以上の配列類似性を示すアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項８】
ＨＣＶのＮＳ４Ａタンパク質のＴｈｒ２０−Ｌｅｕ３１領域又はその他のヘパシウイルス（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）のタンパク質ＮＳ４Ａの構造的対応部分を含むＮＳ３ｐｒｏプロテアーゼ活性化の部分阻害剤を含有するか、或いは同一性８０％以上の配列類似性を示すアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項９】
フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーの前記ウイルスが以下のフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ）、セントルイス脳炎ウイルス（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、ＤＶ１、ＤＶ２、ＤＶ３、ＤＶ４、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、黄熱病ウイルス（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、クンジンウイルス（Ｋｕｎｊｉｎ ｖｉｒｕｓ）、キャサヌール森林病ウイルス（Ｋｙａｓａｎｕｒ Ｆｏｒｅｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）、ダニ媒介脳炎ウイルス（Ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、マレー渓谷脳炎ウイルス（Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ ｖｉｒｕｓ）、ＬＡＮＧＡＴウイルス、跳躍病ウイルス（Ｌｏｕｐｉｎｇ ｉｌｌ ｖｉｒｕｓ）、ポワッサンウイルス（Ｐｏｗａｓｓａｎ ｖｉｒｕｓ）の１種である、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項１０】
フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーの前記ウイルスがヘパシウイルス（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）であり、具体的にはＨＣＶである、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項１１】
以下の陽イオンＰＴＤ、ＴＡＴペプチド、ヘプタアルギニン、オクタアルギン、ノナアルギニン、デカアルギニン、又は配列ＬＲＲＲＲＬＲＲＲＲＬ若しくはＬＲＲＲＲＬ−ｂＡｌａ−ＬＲＲＲＲＬのペプチドの１つである細胞透過性部分を含有することを特徴とする、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項１２】
ＤＶ２のエンベロープタンパク質のＳｅｒ３７６−Ｔｒｐ３９１領域又はデングウイルスのその他の血清型の構造的対応部分を含む細胞透過性部分を含有することを特徴とする、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項１３】
小胞体における保持及び／又は局在のシグナルを含有し、このシグナルの存在が前記ペプチドの抗ウイルス活性を高めることを特徴とする、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項１４】
脂質付加されており、前記脂質付加が前記ペプチドの抗ウイルス活性を高めることを特徴とする、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項１５】
配列表に含まれる一次構造を有することを特徴とする、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項１６】
請求項１に記載の１個又は複数のペプチドを含有し、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーの１種又は複数のウイルスによる感染に対する予防的及び／又は治療的処置に有効であることを特徴とする医薬組成物。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１０−５２６０２２（Ｐ２０１０−５２６０２２Ａ）
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３４９７９（Ｐ２００９−５３４９７９）
【出願日】平成１９年１０月３０日（２００７．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００７／００００２０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５２４９０
【国際公開日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月３０日（２００７．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００７／００００２０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５２４９０
【国際公開日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
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