ヘントリアコンタノナエンの製造方法とその機能の利用方法
【課題】ヘントリアコンタノナエンを効率よく大量に生産することのできる製造方法、及びその用途を提供する。
【解決手段】ヘントリアコンタノナエンを生産することができる微生物を培養し、得られる菌体からヘントリアコンタノナエンを抽出する工程を含む、ヘントリアコンタノナエンの製造及び利用方法。
【解決手段】ヘントリアコンタノナエンを生産することができる微生物を培養し、得られる菌体からヘントリアコンタノナエンを抽出する工程を含む、ヘントリアコンタノナエンの製造及び利用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超長鎖多価飽和炭化水素であるへントリアコンタノナエン（Ｃ３１：９）を合成することのできる耐冷性細菌、または常温性細菌、該細菌を用いたへントリアコンタノナエンの製造方法、ヘントリアコンタノナエンを含有する化粧品やサプリメントなどとしての利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘントリアコンタノナエンは、炭素数３１個、二重結合数９個の多価不飽和炭化水素である。ヘントリアコンタノナエンは、１９９５年にＮｉｃｈｏｌｓらによって南極海域から単離された好冷菌に微量に存在していることが報告された（非特許文献１）。また、１９９８年に、Ｔａｍａｏｋａらは、深海に由来する好冷菌にヘントリアコンタノナエンが存在することを報告している（非特許文献２）。
【０００３】
ヘントリアコンタノナエン利用方法については従来全く報告がなされていないが、既知の分枝状多価不飽和炭化水素であるスクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチルテトラコサ−２，６，１０，１４，１８，２２−ヘキサエン、Ｃ３０Ｈ５０、４１０．７３ｇ／モル）とは長鎖の多価不飽和炭化水素である点で共通している。スクアレンは抗酸化物質として知られており、従来より化粧品、サプリメント等に含有されている（例えば、特許文献１等）。
【０００４】
上述したように、ヘントリアコンタノナエンはスクアレンと同様、多価不飽和炭化水素であるが、ヘントリアコンタノナエンを生産する細菌が、非特許文献１及び非特許文献２の記載から明らかなように、その増殖に低温を要求するもの（好冷菌）であるため、実用レベルでの培養が不可能であること、及びヘントリアコンタノナエンの生理機能が知られていないためであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】 特開２００７−００８８４７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】 Ｎｉｃｈｏｌｓ ＤＳ，Ｎｉｃｈｏｌｓ ＰＤ，＆ ＭｃＭｅｅｋｉｎ ＴＡ（１９９５）Ａ ｎｅｗ ｎ−Ｃ３１：９ ｐｏｌｙｅｎｅ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｆｒｏｍＡｎｔａｒｃｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １２５：２８１−２８５．
【非特許文献２】 Ｊ．Ｔａｍａｏｋａ，Ｍ．Ｙａｎａｇｉｂａｙａｓｈｉ，Ｃ．Ｋａｔｏ，＆ Ｋ．Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ（１９９８）Ａ ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｈｅｎｔｒｉａｃｏｎｔａｎｏｎａｅｎｅ（Ｃ３１Ｈ４６）ｆｒｏｍ ａ ｄｅｅｐ−ｓｅａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎ ＤＳＳ１２．Ｉｎ Ｐｒｏｇｒａｍ ＆ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｅｉｇｈｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ，ｐ．３１９．Ｅｄ Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｃａｎａｄａ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｈａｌｉｆａｘ，Ｃａｎａｄａ，Ａｕｇｕｓｔ ９−１４，１９９８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、ヘントリアコンタノナエンを大量に生産することは困難であった。そこで、本発明の目的は、ヘントリアコンタノナエンを大量に生産することのできる製造方法、及びその用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、常温域で生育可能な微生物がヘントリアコンタノナエンを生産することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、シーワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属、モリテラ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ）属、及びコルウエリア（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ）属などに属し、ヘントリアコンタノナエンを生産することができる微生物を提供する。
前記微生物としては、シーワネラ・（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ｏｓｈ０８；当該株を単にｏｓｈ０８株ということがある）又はＥＰＡまたはＤＨＡを合成する能力のある類縁菌が挙げられる。
前記微生物としては、１５〜４０℃の温度で増殖可能な微生物が挙げられる。
前記微生物としては、耐冷性、または常温性を有するシーワネラ属、モリテリア属、コルウェリア属などに属する菌株が挙げられる。
【００１０】
また、本発明は、ヘントリアコンタノナエンを生産することができる微生物を培養し、得られる菌体から効率的にヘントリアコンタノナエンを抽出する工程を含む、ヘントリアコンタノナエンの効率的製造方法を提供する。
前記微生物としては、シーワネラ・ｓｐ．ｏｓｈ０８株（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ｏｓｈ０８）又は類縁菌を用いることができる。
前記方法において、培養は、１５〜４０℃の温度で実施することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ヘントリアコンタノナエンを常温にて大量に生産することのできる微生物が提供される。
また、本発明によれば、ヘントリアコンタノナエンを常温にて大量に生産することのできる方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】 ｏｓｈ０８株の全ＦＡＭＥ画分のＥＩ−ＭＳの結果を示す。保持時間２５分以降のガスクロログラム（下段）と、未同定疎水性成分（化合物Ｘ：Ｃ３１：９）のＥＩ−ＭＳによるフラグメントパターン（上段）を示す。ＰＵＦＡに特徴的なパターンを示している。内部標準物質として２１：０を用いている。
【図２】 ｏｓｈ０８株に由来する全ＦＡＭＥの硝酸銀シリカゲル薄層クロマトグラムを示す。左レーンはスクアレンであり、中央レーンはｏｓｈ０８全脂肪酸メチルエステルであり、右レーンはスクアランである。丸く囲った部分のシリカゲルのヘキサン抽出物をＧＣで分析したところ、図１で示した化合物Ｘと同じ保持時間を示した。以上の結果から化合物ＸはＦＡＭＥではなく、炭化水素であると結論した。
【図３】 図３Ａ上段は、ＣＩ−ＭＳによる化合物Ｘの分析の結果を示す。ｍ／ｚ＝４７３である［Ｍ＋５４＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ＝４５９である［Ｍ＋４０＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ＝４１９である［Ｍ＋Ｈ］＋のイオンが確認されたことから、この物質のＭ＋（分子量）を４１８と決定した。図３Ａ下段は化合物ＸのＧＣプロファイルである。図３Ｂ上段は、水素添加処理した化合物ＸのＣＩ−ＭＳによる分析の結果を示す。ｍ／ｚ＝４７７である［Ｍ＋４０＋Ｈ］＋のイオン、ｍ／ｚ＝４３６である［Ｍ］＋イオンが確認され、分子量Ｍ＋は４３６であった。図３Ｂ下段は水素添加処理した化合物ＸのＧＣプロファイルであり、化合物ＸのＧＣでの保持時間は水素添加する（飽和形にする）ことによって短くなった。
【図４】 様々な濃度の過酸化水素存在下での大腸菌ＵＭ２の増殖に及ぼすＣ３１：９添加の影響。培養は３０°Ｃで行った。大腸菌ＵＭ２は０，６６ｍＭの過酸化水素存在下では生育できなかったが、５０μＭ、１００μＭのＣ３１：９を添加することによりその増殖能は回復した。また１００μＭのスクアレン添加でも大腸菌ＵＭ２の増殖能は回復したが、５０μＭのスクアレンでは生育の回復は見られなかった。このことはＣ３１：９はスクアレンよりも優れた抗酸化活性があることを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、先ず本発明の微生物について説明する。
本発明における微生物は、シーワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属やモリテラ属、コルウェリア属などに属し、ヘントリアコンタノナエンを生産することのできる微生物である。ここで、ヘントリアコンタノナエンとは、炭素数が３１個であり、二重結合数が９個の長鎖多価不飽和炭化水素を意味する。
【００１４】
本発明における微生物は、ヘントリアコンタノナエンの生産能を指標として、海水、海砂、海藻、ウニ腸内物等から単離することができる。ヘントリアコンタノナエンの生産能は、微生物細胞そのもの、もしくは細胞からのクロロフォルムなどの有機溶媒を使った抽出物をメタノリシスした産物をガスクロマトグラフィーにより分析し、脂肪酸メチルエステルとともにヘントリアコンタノナエンを検出することによって評価することができる。または、菌体中に含まれるヘントリアコンタノナエンは、菌体からメタノール−ヘキサンなどの有機溶媒を用いてそのヘキサン画分にヘントリアコンタノナエンを抽出した後、ガスクロマトグラフィー等によって検出することができる。
【００１５】
本発明者らは、このような手法によって、北海道小樽市の海水、海砂、海藻、ウニ腸内物の海水、海砂、海藻、ウニ腸内物から微生物を単離し、その中の１つがヘントリアコンタノナエンを合成する能力を有することを確認した。この単離株はシーワネラ属に属する新規微生物であり、Ｚｏｂｅｌｌ寒天培地、同液体培地、３％食塩、ＬＢ寒天培地、液体培地などで培養することにより、菌体中にヘントリアコンタノナエンを生産する能力を有することを示すことができる。本発明者らは、この新規微生物をシーワネラ・ｓｐ．ｏｓｈ０８株（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ｏｓｈ０８）と命名した。
【００１６】
本発明の微生物である、ｏｓｈ０８株は、以下の（ａ）形態的性質、（ｂ）培養的性質、（ｃ）生理学的性質、（ｄ）その他の性質を有する。下記において、「＋」は陽性を、「−」は陰性を示す。なお、ｏｓｈ０８株の増殖至適温度は３０℃であり、増殖の上限及び下限温度は、それぞれ、４０℃及び４℃であった。
【００１７】
（ａ）形態的性質
（培養条件：Ｚｏｂｅｌｌ寒天培地、３０℃）
コロニーの色、ピンク；形態、円形；大きさ、直径１．５ｍｍ
運動性： 有
【００１８】
（ｂ）培養的性質
肉汁寒天平板培養：色：ピンク；光沢：有；色素産生：有
肉汁液体培養；色：ピンク；色素産生：あり
【００１９】
（ｃ）生理学的性質
グラム染色性：陰性；ウレアーゼ：陰性；オキシダーゼ： 陽性；カタラーゼ： 陽性
生育の範囲（ｐＨ、温度など）： ｐＨ５．５〜１０．０ 温度４℃から４０℃
酸素に対する態度（好気性、嫌気性の区別など）： 好気性
【００２０】
本発明の微生物、ｏｓｈ０８株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、シーワネラ・バルティカ ＪＣＭ １４９３７Ｔ株（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｂａｓａｌｔｉｓ ＪＣＭ １４９３７Ｔ、塩基配列登録番号：ＥＵ１４３３６１）及びシーワネラ・フニエンシス ＮＢＲＣ １００９７５Ｔ株（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｈａｆｎｉｅｎｓｉｓ ＮＢＲＣ １００９７５Ｔ、塩基配列登録番号：ＡＢ２０５５６６）のものとそれぞれと９９．８％及び９８．４％一致した。このことから、ｏｓｈ０８株はシーワネラ・バルティカかシーワネラ・ハフニエンシス又はそれらの類縁菌であると思われるが、種レベルでの同定に至らなかったため、シーワネラ・ｓｐ．ｏｓｈ０８株（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ｏｓｈ０８）と命名した。
上記ｏｓｈ０８株は常温（３０℃前後の温度、１５〜３７℃の温度）で活発な増殖が可能であり、好冷菌や耐冷菌でなく、常温性を有しているものである。
【００２１】
次に、本発明のヘントリアコンタノナエンの製造方法について説明する。本発明のヘントリアコンタノナエンの製造方法は、ヘントリアコンタノナエンを生産することができる微生物を培養し、得られる菌体からヘントリアコンタノナエンを抽出する工程を含む。
本発明のヘントリアコンタノナエンの製造方法において用いられる微生物としては、上述した微生物を用いることができる。すなわち、シーワネラ・ｓｐ．ｏｓｈ０８株、又は類縁のシーアネラ属、モリテラ属、コルエリア属などヘントリアコンタノナエンを生産する細菌種を用いることができる。
【００２２】
本発明のヘントリアコンタノナエンの製造方法においては、まず、上記微生物を培養する。培養は、上記微生物が増殖することができ、かつ菌体内にヘントリアコンタノナエンを生産することのできる培地及び条件であれば、どのような培地及び条件であってもよいが、例えば、後述する、Ｚｏｂｅｌｌ寒天培地を用いて培養することができる。また、培養温度は、上記微生物が常温で増殖可能な培地であることから、１５〜３７℃の温度で培養することができるが、好ましくは３０℃付近の温度、例えば、２５〜３５℃程度の温度で培養を行う。
【００２３】
次いで、培養によって得られた菌体からヘントリアコンタノナエンを抽出する。抽出は有機溶媒を用いて実施することができる。用いることのできる有機溶媒としては、例えば、ｎ−ヘキサン、石油エーテル、クロロホルム、ジクロロメタン等が挙げられる。なお、抽出されたヘントリアコンタノナエンは、有機化学の分野において、有機化合物を精製するのに通常に用いられている方法によって精製することができる。精製方法としては、例えば、クロマトグラフィー、再結晶、昇華、二層分配等が挙げられる。
【００２４】
上述のようにして得られたヘントリアコンタノナエンは抗酸化作用を有している。ヘントリアコンタノナエンが抗酸化作用を有していることは、後述する実施例において明らかであり、このようなヘントリアコンタノナエンは、例えば、化粧品、食品、サプリメント、医薬品、医薬部外品等に適用可能である。
【００２５】
上述したように、本発明の微生物から得られるヘントリアコンタノナエンは抗酸化作用を有しており、例えば、酸化ＬＤＬが原因となる疾患、例えば、動脈硬化やこれに関連する疾患（動脈硬化性疾患）；活性酸素が原因となる疾患、例えば、癌、炎症、アレルギー性疾患、動脈硬化や虚血性心疾患等の循環器系疾患、肺気腫や喘息等の呼吸器系疾患、胃潰瘍や十二指腸潰瘍等の消化器系疾患、糖尿病、顔面色素以上沈着症等の皮膚疾患の予防又は改善剤の有効成分として有用である。従って、これらの疾患の予防又は改善用の医薬組成物、医薬部外品として、又は食品中に含ませて用いることができる。
【００２６】
ヘントリアコンタノナエンを医薬品又は医薬部外品として用いる場合、経口投与形態とすることができる。経口投与形態としては、医薬品の分野において通常に用いられている形態、例えば、固体形態（散剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤）や溶液形態（乳剤、液剤、シロップ剤）として製剤化することができる。
また、ヘントリアコンタノナエンを外用剤として用いることもでき、このような形態としては、例えば、軟膏、クリーム等として用いることができる。なお、前記経口投与形態や外用剤として用いる場合、その製剤化には、医薬品の分野において通常に用いられている賦形剤等を添加することができる。
【００２７】
賦形剤としては、固体形態の製剤を製造する場合には、例えば、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ゼラチン、澱粉、デキストリン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ケイ酸アルミニウム、酸化マグネシウム、乾燥水酸化アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、重炭酸ナトリウム、乾燥酵母等を用いることができる。また、溶液形態の製剤を製造する場合には、例えば、水、グリセリン、プロピレングリコール、単シロップ、エタノール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール等を用いることができる。また、各種の安定化剤、甘味剤、防腐剤、着香料、着色剤を用いてもよい。
【００２８】
軟膏やクリームとして製造する場合には、外用剤の形態に応じた各種の基剤、例えば精製水、低級アルコール、多価アルコール、油脂、界面活性剤、増粘剤、着色剤、防腐剤、香料等を用いることができる。
ヘントリアコンタノナエンを医薬品又は医薬部外品として用いる場合、その投与量は、１日あたり０．１〜５０００ｍｇ／体重１ｋｇ程度であり、好ましくは１日あたり１〜５０ｍｇ／体重１ｋｇ程度である。この量は、服用するヒトの性別や健康状態、体重、投与方法等を考慮して適宜調整することができる。
【００２９】
上記ヘントリアコンタノナエンは、食品に含有させて用いることもできる。ヘントリアコンタノナエンは、そのまま食品に含有させてもよく、又は食品に通常に用いられている賦形剤等を配合し、錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、粉末、カプセル剤、水和剤、乳剤、エキス剤等の剤形に製剤化して用いることもできる。
【００３０】
食品に通常に用いられている賦形剤としては、例えば、シロップ、アラビアゴム、ショ糖、乳糖、粉末還元麦芽糖、セルロース、マンニトール、マルチトール、デキストラン、澱粉類、ゼラチン、ソルビット、トラガント、ポリビニルピロリドン等の結合剤；ショ糖脂肪酸エステルグリセリン脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、ポリエチレングリコール等の滑沢剤、ジャガイモ澱粉等の崩壊剤、ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤等が挙げられる。また、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定化剤、乳化剤、分散剤、懸濁剤、防腐剤等を添加してもよい。
【００３１】
上記食品の摂取量は、ヘントリアコンタノナエンとして、１日あたり０．１〜５０００ｍｇ／体重１ｋｇ程度であり、好ましくは１日あたり１〜５０ｍｇ／体重１ｋｇ程度である。この量は、摂取する者の性別や健康状態、体重、症状等を考慮して適宜調節することができる。
【００３２】
なお、本発明が対象とする食品には、上記製剤形態を有するサプリメント［保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）及び栄養補書食品等の、いわゆる健康食品も含む）に加え、ヘントリアコンタノナエンを飲食物の製造原料の１種として用いて製造される食品、例えば、健康食品、保健機能食品（特定保健用食品や栄養機能食品）も含まれる。
【００３３】
食品の種類には特に制限されないが、例えば、乳飲料、乳酸菌飲料、果汁入り清涼飲料、炭酸飲料、果汁飲料、野菜飲料、野菜・果実飲料、アルコール飲料、コーヒー飲料、粉末飲料、スポーツ飲料、サプリメント飲料、紅茶飲料、緑茶、ゼリー入り飲料、ブレンド茶等の飲剤、プリン類、デザート類、冷菓類、ガム類、チョコレート類、ハードキャンディー、ソフトキャンディー、キャラメル類、焼き菓子類等の菓子類、パン類、スープ類、魚肉加工品、畜肉加工品、麺類、ソース類、惣菜等が挙げられる。
【００３４】
上記ヘントリアコンタノナエンは化粧品組成物に含有させることができる。このような化粧品組成物には、通常の化粧品に用いられる成分、例えば、精製水、低級アルコール、多価アルコール、油脂類、ロウ類、炭水化物等の基剤、保湿剤、界面活性剤、増粘剤、紫外線吸収剤、美白剤、安定剤、防腐剤、着色剤、香料等の成分を含有させることができる。化粧品組成物の形態に特に制限はなく、例えば、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール、エッセンス、パック、洗浄剤、ファンデーション、打粉、口紅等が挙げられる。化粧品組成物に配合されるヘントリアコンタノナエンの割合は、抗酸化効果を発揮し得る量であって、特に制限されないが、通常は、化粧品組成物の重量に対し、０．００５〜１０重量％程度である。
【００３５】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。なお、以下の実施例において％は特に断りのない限り重量％を表す。
実施例１
ｏｓｈ０８株の単離、増殖と脂肪酸の分析
試料として、北海道小樽市忍路海岸にて採集した海水、海砂、海藻（緑藻、紅藻、褐藻）、ウニ腸内物を用いた。細菌単離用培地としては、Ｚｏｂｅｌｌ寒天培地（０．５％ペプトン、０．１％酵母エキス、０．０１％リン酸鉄、１．５％寒天、５０％海水；以下Ｚ寒天培地）を用いた。海水については、寒天培地上に直接塗布して用い、海砂、海藻及びウニの腸内容物については海水抽出物を試料として用いた。試料をＺ寒天培地に塗布し、３０℃の温度で一晩培養した。形成された細菌のコロニーを白金耳を用いて新たなＺ寒天培地にスプレッドし、コロニーを単離した。この方法を繰り返すことにより、菌株を単離した。なお、各資料から、それぞれ６株以上のコロニーを単離した。
【００３６】
上述したＺ寒天上に形成されたコロニーから細胞をとり、これを１０％塩化アセチル−メタノール溶液に懸濁し、内部標準物質となるヘンエイコサン酸（１０μｇ；以下２１：１と略記）及び炭化水素テトラコサン（１０μｇ；以下Ｃ２４：０と略記）とともに１００℃にて１時間反応させメタノリシスした。得られた脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）をヘキサンで抽出し、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析した。脂肪酸の同定はガスクロマトグラフィ−マススペクトロメトリ（ＥＩ−ＭＳまたはＣＩ−ＭＳ）よって行った。
【００３７】
上記のように実施したＧＣによる分析により、紅藻由来の試料から得られた１株（ｏｓｈ０８株と命名した）に、微量のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）と思われるピークを確認した結果（図１下段参照）。ＧＣ−ＭＳによる分析の結果この成分はＧＣ分析における保持時間及びマスフラグメントパターン（データー示さず）から、ＥＰＡであることが分かった。図１（下段）から明らかなように、ＥＰＡのピークよりも更に保持時間が大きいピークが見られ、そのＧＣ−ＭＳによるフラグメントパターン（図１上段）をデータベースにより検索するとＥＰＡメチルエステルだけではなく、ＤＨＡメチルエステルのものとも一致した。しかし、ＤＨＡメチルエステルの保持時間は約３０．６分であることから、この成分（以下、化合物Ｘという）は炭素数が２２以上、二重結合数４個以上の多価不飽和脂肪酸であると予想された。上記培養条件、及び分析条件においてｏｓｈ０８株が含有するＥＰＡは全脂肪酸の０．２−０・４％であり、保持時間が大きな多価不飽和脂肪酸様物質は１．６−１．８％であった。
【００３８】
次いで、以下のようにして、化合物Ｘの同定を行った。
ｏｓｈ０８株より調製した全ＦＡＭＥをシリカゲル薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）によって分画した。化合物Ｘを含む全ＦＡＭＥのヘキサン溶液をマイクロピペットでスポットし、ｎ−ヘキサン：エーテル：酢酸（９０：１０：１、体積比）を溶媒として展開した。ＴＬＣプレートは窒素ガスを当てて乾燥させた。プリムリン溶液を吹きかけてから再度乾燥させ、紫外線でスポットを確認して鉛筆でマークした。プレート上での移動の比較のためにｎ−ドデカン、スクアランとスクアレンも同時に分析した。
上述のようにしてプレート上にマークした部分に相当するシリカゲルを掻き取り、メタノール：水：ｎ−ヘキサン（１：１：２、体積比）で抽出し、ｎ−ヘキサン画分を回収した。残りの画分に更にヘキサンを加えて回収した。この操作を更に１回繰り返した。ＴＬＣ分析の結果を図２に示す。図２に示すように、化合物Ｘの移動度はＦＡＭＥとは異なっており、スクアランとスクアレンとのほぼ中間であったことから、化合物Ｘは炭化水素であると結論した。化合物Ｘが乾燥細胞から直接抽出可能であることからも、この結論が支持される。なお、ヘキサン画分を一緒ににまとめ、濃縮後にＧＣに供した。
【００３９】
化合物Ｘは、不飽和結合を有する炭化水素であることがわかったので、この物質を、メタノリシスを経ないで、凍結乾燥細胞から直接抽出した。すなわち、１０ｍｇの乾燥細胞を１０ｍＬのメタノールに懸濁し、これに１０ｍＬのｎ−ヘキサンを加えて激しく混和した後、ヘキサン層を回収した。この操作を３回行った。
次いで、上記のようにして得られた化合物Ｘに対し、二酸化白金触媒下で水素添加処理を行った。少量（３．５μｇ）の当該化合物を含むメタノール溶液に二酸化白金を５ｍｇ加え、４０分間水素ガスを通気した。反応後、反応物をヘキサンにより抽出した。化合物Ｘ及びその水素添加処理産物をＧＣ−ＭＳにより分析した。分析法はＥＩ−ＭＳ法とアセトニトリルをイオン化試薬として用いたＣＩ−ＭＳ法である。
【００４０】
化合物ＸをＣＩ−ＭＳにより分析した結果を図３に示す。図３によると、化合物ＸのＧＣにおけるピーク（図３下段）は ｍ／ｚ ＝ ４７３である［Ｍ＋５４＋Ｈ］＋の顕著なイオンピークを示した（図３Ａ上段）ことから、その分子量は４１８であることがわかった。また、水素添加処理した炭化水素のＧＣにおけるピーク（図３Ｂ下段）の場合、ｍ／ｚ ＝ ４７７である ［Ｍ＋４０＋Ｈ］＋の顕著なイオンピークを示した（図３Ｂ上段）ことから、その分子量は４３６であり、炭素数３１のｎ−アルカンの分子量と計算上一致した。水素添加により化合物Ｘの分子量は１８マスユニット増加したことになり、これは当該化合物に９個の二重結合が存在することを示唆している。水素添加後の物質をＥＩ−ＭＳで分析すると、分子イオンは認められないが、マスフラグメントパターンは ｎ−アルカンのものと同等であった。以上の結果から、この化合物Ｘは炭素数３１、二重結合数９の炭化水素である、ヘントリアコンタノナエン（Ｃ３１：９）であることがわかった。
【００４１】
実施例２
ｏｓｈ０８株の増殖温度
単離株（ｏｓｈ０８）については増殖に与える温度の影響を調べた。ｏｓｈ０８株を、３％塩化ナトリウムを含むＬＢ培地（１．０％トリプトン、０．５％酵母エキス、３．０％塩化ナトリウム）にて、０、４、１５、２０、２５、３０、３７、４０、４２℃各温度にてそれぞれ培養し、時間ごとに増殖量を、７日目まで測定した。ｏｓｈ０８株は、４、１５、２０、２５、３０、３７、４０℃で増殖を示した。この中で、増殖の至適温度は３０℃であった。０℃、７日間では増殖は観察されなかった。また、４２℃、７日間での増殖も認められなかった。これらの性質からｏｓｈ０８は好冷菌ではなく、常温性の細菌であると結論した。Ｗｉｅｇｅｌ Ｊ（１９９０）Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｐａｎｓ ｆｏｒ ｇｒｏｗｔｈ：Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ７５：１５５−１６９は増殖の最低温度、至適温度、最高温度がそれぞれ５℃以下、１５℃以上、２０℃以上の微生物は温度耐性常温菌（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｔｏｌｅｒａｎｔ ｍｅｓｏｐｈｉｌｅ）と定義している。
【００４２】
実施例３
ｏｓｈ０８株のヘントリアコンタノナエン（３１：９）含量に及ぼす培養温度の影響
試験管で３ｍｌのＺ培地（１．０％ペプトン、１．０％酵母エキス、５０％海水）を用い、ｏｓｈ０８株を４，１５，２０，２５，３０，３７℃の温度でそれぞれ２日間（４℃のみ１週間）培養した。細胞をメタノリシス処理し、ヘキサンを用いてヘントリアコンタノナエン（Ｃ３１：９）をＦＡＭＥと共に抽出してＧＣに供した。脂肪酸２１：０と炭化水素Ｃ２４：０を内部標準として菌体に含まれる全脂肪酸メチルエステルと炭化水素の合計重量に対するＥＰＡとＣ３１：９の重量比（ｗ／ｗ％）を測定した。各温度で培養した細胞のＣ３１：９の全脂肪酸ＦＡＭＥ画分（炭化水素を含む）に対する存在比を表１に示す。Ｃ３１：９の全脂肪酸ＦＡＭＥ画分に対する存在比は、２５℃で培養した細胞で最大値３．２％を示した。Ｃ３１：９の全脂肪酸ＦＡＭＥ画分に対する存在比は、３０℃で１．７％、４℃で１．１％であり、低温になるほど含有量を増すＥＰＡとは全く異なる温度依存性を示した。
【００４３】
【表１】
【００４４】
実施例４
ヘントリアコンタノナエンの分布
各種微生物におけるヘントリアコンタノナエンの分布を調べた。本実験において用いた微生物を表２に記載した。表２において海洋性と記載されている微生物においては、３％ＮａＣｌを含むＬＢ培地を用いて２０℃又は１５℃で、２日間、それ以外の微生物については、ＬＢ培地を用いて２０又は３０℃で２日間培養を行った。培養を行った細胞について、実施例１及び３に示す方法によりメタノリシスを行い、ＦＡＭＥをＧＣ、ＧＣ−ＭＳにより分析した。表２に、ＥＰＡ、ＤＨＡ及びヘントリアコンタノナエンの生産性を示した。表２において、それぞれ検出された場合を＋、検出されなかった場合を−として示した。表２に示すようにヘントリアコンタノナエンは、ｏｓｈ０８株を含むＥＰＡ又はＤＨＡ（またはＥＰＡとＤＨＡの両方）を生成する海洋細菌と、ＥＰＡを生成する非海洋細菌Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ ＭＲ−１において生産されることが分かった。このことは従来知られているＥＰＡ産生菌やＤＨＡ産生菌がＣ３１：９の供給源として利用できることが示唆された。
【００４５】
【表２】
【００４６】
実施例５
ｏｓｈ０８株の同定
ｏｓｈ０８株から、常法に従いＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡを鋳型とし、二種類のＤＮＡ断片、９Ｆ：ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ（配列番号：１）、及び１５４１Ｒ：ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＣＣ（配列番号：２）をプライマーとしてＰＣＲを行い、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の全長を増幅した。増幅した遺伝子断片をｐＣＲ ２．１−ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いてＴＡクローニングを行い、大腸菌に導入した。形質転換した大腸菌を３０℃で１８時間培養した後、プラスミドを調製した。調製したプラスミドを鋳型にし、６種のプライマー、Ｍ１３Ｆ：ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ（配列番号：３）、３３８Ｆ：ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号：４）、８００Ｆ：ＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡ（配列番号：５）、５１８Ｒ：ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ（配列番号：６）、９２０Ｒ：ＣＣＣＣＧＴＣＡＡＴＣＣＴＴＴＧＡＧＴ（配列番号：７）及びＭ１３Ｒ：ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ（配列番号：８）を用いサイクルシークエンスを行った。
【００４７】
サイクルシークエンスの結果１５３４ｂｐの塩基配列が決定された（登録番号ＡＢ４４７９８７、［００５３］配列表参照）。この配列をＢＬＡＳＴＤＤＢＪ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）サーチに供したところ、ｏｓｈ０８株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列はシーワネラ・バルティカ ＪＣＭ １４９３７Ｔ株（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｂａｓａｌｔｉｓ ＪＣＭ １４９３７Ｔ、塩基配列登録番号：ＥＵ１４３３６１）及びシーワネラ・ハフニエンシス ＮＢＲＣ １００９７５Ｔ株（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｈａｆｎｉｅｎｓｉｓ ＮＢＲＣ １００９７５Ｔ、塩基配列登録番号：ＡＢ２０５５６６）のものとそれぞれと９９．８％及び９８．４％一致した。この結果より、ｏｓｈ０８株はＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ｂａｓａｌｔｉｓ又はＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ｈａｆｎｉｅｎｓｉｓ、あるいは、これらの種に極めて近縁のＳｈｅｗａｎｅｌｌａ属の菌での新株あると考えられる。本発明者らは、この菌株をＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ｏｓｈ０８株と命名した。
【００４８】
実施例６
ヘントリアコンタノナエンの抗酸化活性
実施例１により精製したヘントリアコンタノナエンは、ＧＣによる分析の結果、６３〜８２％の純度であったことから、その純度を高めるため、ＨＰＬＣによる精製を行った。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。溶媒（アセトニトリル）で平衡化したカラム（ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０ Ｔｓ、４．６ｍｍ×１５．０ｃｍ、ＴＯＳＯＨ）にヘントリアコンタノナエンを含む抽出物を約１．０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解し、その３００μＬを導入した。溶出条件は１．０ ｍＬ／ｍｉｎで、検出はＡ２０５の吸収により行った。：ヘントリアコンタノナエンは、保持時間１５．０分〜１７．５分に溶出したので、これを回収し、ＶＬＣＰＵＨＣ（又はＰＵＨＣ）とした。この操作によりヘントリアコンタノナエン純度は９８．８〜１００％になった。
【００４９】
Ｅ．ｃｏｌｉＵＭ２（カタラーゼ活性欠損株；エール大学大腸菌ストックセンター）を使ったＣ３１：９の過酸化水素耐性試験は以下の二通りの方法で調べた。
方法１：Ｅ．ｃｏｌｉＵＭ２をＬＢ培地にて３０°Ｃで１８時間培養したものを前培養液とした。各試験管にヘキサンに溶かしたＣ３１：９を終濃度０，１０，２０，５０μＭになるように入れて、ヘキサンを窒素ガスに当てて完全に揮発させた後、３ｍｌのＬＢ培地を加え超音波を３分間当てて調製した。ここにＵＭ２の前培養液を６０μｌ植菌して３０°Ｃにて１６０ｒｐｍで培養し、経時的に生育（ＯＤ６００の吸光値）を吸光度計（ｍｏｄｅｌ Ｕ−１８００、日立、東京）で測定した。対照として過酸化水素を添加していない系も同様に測定した。
方法２：９６穴マイクロプレート（イワキ、兵庫）を使用した。Ｃ３１：９を添加しない培養液（ＯＤ６００＝０．０１に調整）と５０μＭ、１００μＭのＣ３１：９を添加した培養液（ＯＤ６００＝０．０１に調整）、及び抗酸化活性のある炭化水素の対照として５０μＭ、１００μＭのスクアレンを添加した培養液（ＯＤ６００＝０．０１に調整）を用意し、マイクロプレートの各穴に１８０μｌずつ分注した。Ｃ３１：９とスクアレン添加する場合は、試験管に各炭化水素を入れてヘキサンを窒素ガスに当てて完全に揮発させた後、培地を加え超音波を３分間当てて前培養液をＯＤ６００＝０．０１になるよう加えて調整した。水または種々の濃度の過酸化水素水溶液２０μｌを添加し、終濃度０，０．１１，０．２２，０．３３，０．４４，０．５５，０．６６，０．７７，０．８８，０．９９ｍＭとして３０°Ｃで４８時間静置培養した。
【００５０】
上記抗酸化活性試験の結果
Ｃ３１：９の抗酸化機能について調べた結果、表Ｘに示すように、試験管で培養した方法１のＣ３１：９を与えた系では、過酸化水素０．０５５ｍＭによって抑制された生育が対照株よりも回復しやすいことが確認された。またこのときＣ３１：９の量が０，１０，２０，５０μＭと増加するに従って、Ｅ．ｃｏｌｉＵＭ２の生育も８時間後には１．６７，１．７３，１．８９．２．１（ＯＤ６００）と段階的に良くなる傾向が見られた。これによりＣ３１：９には抗酸化活性があることが分かった。また過酸化水素非存在下でＣ３１：９を添加しても、生育阻害は認められなかった。過酸化水素０．５５ｍＭではＣ３１：９を添加しても生育は確認されず、この系では酸化ストレスがＣ３１：９の抗酸化活性を上回ったためと考えられる。
また方法２を用いた実験でも同様に、Ｃ３１：９には抗酸化活性があることが示された（図Ｘ）。さらにこの実験では、抗酸化活性のある炭化水素として知られるスクアレンをＣ３１：９の対照として用いた。これによると、やはりＣ３１：９やスクアレンを添加した系では生育が回復することが分かる。
ここでＣ３１：９とスクアレンを５０μｌ添加した場合について比較すると、過酸化水素の生育阻害はＣ３１：９添加系で０．７７ｍＭまで、スクアレン添加系で０．６６ｍＭまでで起こり、このことからＣ３１：９はスクアレンよりも強い抗酸化活性を持つとが示された。スクアレンは強い抗酸化活性を持ち、実用的にも非常に有用な物質として知られているが、この研究によりＣ３１：９はスクアレンを上回る有用性がある可能性を示した。
【００５１】
【表３】
【００５２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超長鎖多価飽和炭化水素であるへントリアコンタノナエン（Ｃ３１：９）を合成することのできる耐冷性細菌、または常温性細菌、該細菌を用いたへントリアコンタノナエンの製造方法、ヘントリアコンタノナエンを含有する化粧品やサプリメントなどとしての利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘントリアコンタノナエンは、炭素数３１個、二重結合数９個の多価不飽和炭化水素である。ヘントリアコンタノナエンは、１９９５年にＮｉｃｈｏｌｓらによって南極海域から単離された好冷菌に微量に存在していることが報告された（非特許文献１）。また、１９９８年に、Ｔａｍａｏｋａらは、深海に由来する好冷菌にヘントリアコンタノナエンが存在することを報告している（非特許文献２）。
【０００３】
ヘントリアコンタノナエン利用方法については従来全く報告がなされていないが、既知の分枝状多価不飽和炭化水素であるスクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチルテトラコサ−２，６，１０，１４，１８，２２−ヘキサエン、Ｃ３０Ｈ５０、４１０．７３ｇ／モル）とは長鎖の多価不飽和炭化水素である点で共通している。スクアレンは抗酸化物質として知られており、従来より化粧品、サプリメント等に含有されている（例えば、特許文献１等）。
【０００４】
上述したように、ヘントリアコンタノナエンはスクアレンと同様、多価不飽和炭化水素であるが、ヘントリアコンタノナエンを生産する細菌が、非特許文献１及び非特許文献２の記載から明らかなように、その増殖に低温を要求するもの（好冷菌）であるため、実用レベルでの培養が不可能であること、及びヘントリアコンタノナエンの生理機能が知られていないためであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】 特開２００７−００８８４７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】 Ｎｉｃｈｏｌｓ ＤＳ，Ｎｉｃｈｏｌｓ ＰＤ，＆ ＭｃＭｅｅｋｉｎ ＴＡ（１９９５）Ａ ｎｅｗ ｎ−Ｃ３１：９ ｐｏｌｙｅｎｅ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｆｒｏｍＡｎｔａｒｃｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １２５：２８１−２８５．
【非特許文献２】 Ｊ．Ｔａｍａｏｋａ，Ｍ．Ｙａｎａｇｉｂａｙａｓｈｉ，Ｃ．Ｋａｔｏ，＆ Ｋ．Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ（１９９８）Ａ ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｈｅｎｔｒｉａｃｏｎｔａｎｏｎａｅｎｅ（Ｃ３１Ｈ４６）ｆｒｏｍ ａ ｄｅｅｐ−ｓｅａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎ ＤＳＳ１２．Ｉｎ Ｐｒｏｇｒａｍ ＆ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｅｉｇｈｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ，ｐ．３１９．Ｅｄ Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｃａｎａｄａ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｈａｌｉｆａｘ，Ｃａｎａｄａ，Ａｕｇｕｓｔ ９−１４，１９９８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、ヘントリアコンタノナエンを大量に生産することは困難であった。そこで、本発明の目的は、ヘントリアコンタノナエンを大量に生産することのできる製造方法、及びその用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、常温域で生育可能な微生物がヘントリアコンタノナエンを生産することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、シーワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属、モリテラ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ）属、及びコルウエリア（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ）属などに属し、ヘントリアコンタノナエンを生産することができる微生物を提供する。
前記微生物としては、シーワネラ・（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ｏｓｈ０８；当該株を単にｏｓｈ０８株ということがある）又はＥＰＡまたはＤＨＡを合成する能力のある類縁菌が挙げられる。
前記微生物としては、１５〜４０℃の温度で増殖可能な微生物が挙げられる。
前記微生物としては、耐冷性、または常温性を有するシーワネラ属、モリテリア属、コルウェリア属などに属する菌株が挙げられる。
【００１０】
また、本発明は、ヘントリアコンタノナエンを生産することができる微生物を培養し、得られる菌体から効率的にヘントリアコンタノナエンを抽出する工程を含む、ヘントリアコンタノナエンの効率的製造方法を提供する。
前記微生物としては、シーワネラ・ｓｐ．ｏｓｈ０８株（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ｏｓｈ０８）又は類縁菌を用いることができる。
前記方法において、培養は、１５〜４０℃の温度で実施することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ヘントリアコンタノナエンを常温にて大量に生産することのできる微生物が提供される。
また、本発明によれば、ヘントリアコンタノナエンを常温にて大量に生産することのできる方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】 ｏｓｈ０８株の全ＦＡＭＥ画分のＥＩ−ＭＳの結果を示す。保持時間２５分以降のガスクロログラム（下段）と、未同定疎水性成分（化合物Ｘ：Ｃ３１：９）のＥＩ−ＭＳによるフラグメントパターン（上段）を示す。ＰＵＦＡに特徴的なパターンを示している。内部標準物質として２１：０を用いている。
【図２】 ｏｓｈ０８株に由来する全ＦＡＭＥの硝酸銀シリカゲル薄層クロマトグラムを示す。左レーンはスクアレンであり、中央レーンはｏｓｈ０８全脂肪酸メチルエステルであり、右レーンはスクアランである。丸く囲った部分のシリカゲルのヘキサン抽出物をＧＣで分析したところ、図１で示した化合物Ｘと同じ保持時間を示した。以上の結果から化合物ＸはＦＡＭＥではなく、炭化水素であると結論した。
【図３】 図３Ａ上段は、ＣＩ−ＭＳによる化合物Ｘの分析の結果を示す。ｍ／ｚ＝４７３である［Ｍ＋５４＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ＝４５９である［Ｍ＋４０＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ＝４１９である［Ｍ＋Ｈ］＋のイオンが確認されたことから、この物質のＭ＋（分子量）を４１８と決定した。図３Ａ下段は化合物ＸのＧＣプロファイルである。図３Ｂ上段は、水素添加処理した化合物ＸのＣＩ−ＭＳによる分析の結果を示す。ｍ／ｚ＝４７７である［Ｍ＋４０＋Ｈ］＋のイオン、ｍ／ｚ＝４３６である［Ｍ］＋イオンが確認され、分子量Ｍ＋は４３６であった。図３Ｂ下段は水素添加処理した化合物ＸのＧＣプロファイルであり、化合物ＸのＧＣでの保持時間は水素添加する（飽和形にする）ことによって短くなった。
【図４】 様々な濃度の過酸化水素存在下での大腸菌ＵＭ２の増殖に及ぼすＣ３１：９添加の影響。培養は３０°Ｃで行った。大腸菌ＵＭ２は０，６６ｍＭの過酸化水素存在下では生育できなかったが、５０μＭ、１００μＭのＣ３１：９を添加することによりその増殖能は回復した。また１００μＭのスクアレン添加でも大腸菌ＵＭ２の増殖能は回復したが、５０μＭのスクアレンでは生育の回復は見られなかった。このことはＣ３１：９はスクアレンよりも優れた抗酸化活性があることを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、先ず本発明の微生物について説明する。
本発明における微生物は、シーワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属やモリテラ属、コルウェリア属などに属し、ヘントリアコンタノナエンを生産することのできる微生物である。ここで、ヘントリアコンタノナエンとは、炭素数が３１個であり、二重結合数が９個の長鎖多価不飽和炭化水素を意味する。
【００１４】
本発明における微生物は、ヘントリアコンタノナエンの生産能を指標として、海水、海砂、海藻、ウニ腸内物等から単離することができる。ヘントリアコンタノナエンの生産能は、微生物細胞そのもの、もしくは細胞からのクロロフォルムなどの有機溶媒を使った抽出物をメタノリシスした産物をガスクロマトグラフィーにより分析し、脂肪酸メチルエステルとともにヘントリアコンタノナエンを検出することによって評価することができる。または、菌体中に含まれるヘントリアコンタノナエンは、菌体からメタノール−ヘキサンなどの有機溶媒を用いてそのヘキサン画分にヘントリアコンタノナエンを抽出した後、ガスクロマトグラフィー等によって検出することができる。
【００１５】
本発明者らは、このような手法によって、北海道小樽市の海水、海砂、海藻、ウニ腸内物の海水、海砂、海藻、ウニ腸内物から微生物を単離し、その中の１つがヘントリアコンタノナエンを合成する能力を有することを確認した。この単離株はシーワネラ属に属する新規微生物であり、Ｚｏｂｅｌｌ寒天培地、同液体培地、３％食塩、ＬＢ寒天培地、液体培地などで培養することにより、菌体中にヘントリアコンタノナエンを生産する能力を有することを示すことができる。本発明者らは、この新規微生物をシーワネラ・ｓｐ．ｏｓｈ０８株（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ｏｓｈ０８）と命名した。
【００１６】
本発明の微生物である、ｏｓｈ０８株は、以下の（ａ）形態的性質、（ｂ）培養的性質、（ｃ）生理学的性質、（ｄ）その他の性質を有する。下記において、「＋」は陽性を、「−」は陰性を示す。なお、ｏｓｈ０８株の増殖至適温度は３０℃であり、増殖の上限及び下限温度は、それぞれ、４０℃及び４℃であった。
【００１７】
（ａ）形態的性質
（培養条件：Ｚｏｂｅｌｌ寒天培地、３０℃）
コロニーの色、ピンク；形態、円形；大きさ、直径１．５ｍｍ
運動性： 有
【００１８】
（ｂ）培養的性質
肉汁寒天平板培養：色：ピンク；光沢：有；色素産生：有
肉汁液体培養；色：ピンク；色素産生：あり
【００１９】
（ｃ）生理学的性質
グラム染色性：陰性；ウレアーゼ：陰性；オキシダーゼ： 陽性；カタラーゼ： 陽性
生育の範囲（ｐＨ、温度など）： ｐＨ５．５〜１０．０ 温度４℃から４０℃
酸素に対する態度（好気性、嫌気性の区別など）： 好気性
【００２０】
本発明の微生物、ｏｓｈ０８株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、シーワネラ・バルティカ ＪＣＭ １４９３７Ｔ株（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｂａｓａｌｔｉｓ ＪＣＭ １４９３７Ｔ、塩基配列登録番号：ＥＵ１４３３６１）及びシーワネラ・フニエンシス ＮＢＲＣ １００９７５Ｔ株（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｈａｆｎｉｅｎｓｉｓ ＮＢＲＣ １００９７５Ｔ、塩基配列登録番号：ＡＢ２０５５６６）のものとそれぞれと９９．８％及び９８．４％一致した。このことから、ｏｓｈ０８株はシーワネラ・バルティカかシーワネラ・ハフニエンシス又はそれらの類縁菌であると思われるが、種レベルでの同定に至らなかったため、シーワネラ・ｓｐ．ｏｓｈ０８株（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ｏｓｈ０８）と命名した。
上記ｏｓｈ０８株は常温（３０℃前後の温度、１５〜３７℃の温度）で活発な増殖が可能であり、好冷菌や耐冷菌でなく、常温性を有しているものである。
【００２１】
次に、本発明のヘントリアコンタノナエンの製造方法について説明する。本発明のヘントリアコンタノナエンの製造方法は、ヘントリアコンタノナエンを生産することができる微生物を培養し、得られる菌体からヘントリアコンタノナエンを抽出する工程を含む。
本発明のヘントリアコンタノナエンの製造方法において用いられる微生物としては、上述した微生物を用いることができる。すなわち、シーワネラ・ｓｐ．ｏｓｈ０８株、又は類縁のシーアネラ属、モリテラ属、コルエリア属などヘントリアコンタノナエンを生産する細菌種を用いることができる。
【００２２】
本発明のヘントリアコンタノナエンの製造方法においては、まず、上記微生物を培養する。培養は、上記微生物が増殖することができ、かつ菌体内にヘントリアコンタノナエンを生産することのできる培地及び条件であれば、どのような培地及び条件であってもよいが、例えば、後述する、Ｚｏｂｅｌｌ寒天培地を用いて培養することができる。また、培養温度は、上記微生物が常温で増殖可能な培地であることから、１５〜３７℃の温度で培養することができるが、好ましくは３０℃付近の温度、例えば、２５〜３５℃程度の温度で培養を行う。
【００２３】
次いで、培養によって得られた菌体からヘントリアコンタノナエンを抽出する。抽出は有機溶媒を用いて実施することができる。用いることのできる有機溶媒としては、例えば、ｎ−ヘキサン、石油エーテル、クロロホルム、ジクロロメタン等が挙げられる。なお、抽出されたヘントリアコンタノナエンは、有機化学の分野において、有機化合物を精製するのに通常に用いられている方法によって精製することができる。精製方法としては、例えば、クロマトグラフィー、再結晶、昇華、二層分配等が挙げられる。
【００２４】
上述のようにして得られたヘントリアコンタノナエンは抗酸化作用を有している。ヘントリアコンタノナエンが抗酸化作用を有していることは、後述する実施例において明らかであり、このようなヘントリアコンタノナエンは、例えば、化粧品、食品、サプリメント、医薬品、医薬部外品等に適用可能である。
【００２５】
上述したように、本発明の微生物から得られるヘントリアコンタノナエンは抗酸化作用を有しており、例えば、酸化ＬＤＬが原因となる疾患、例えば、動脈硬化やこれに関連する疾患（動脈硬化性疾患）；活性酸素が原因となる疾患、例えば、癌、炎症、アレルギー性疾患、動脈硬化や虚血性心疾患等の循環器系疾患、肺気腫や喘息等の呼吸器系疾患、胃潰瘍や十二指腸潰瘍等の消化器系疾患、糖尿病、顔面色素以上沈着症等の皮膚疾患の予防又は改善剤の有効成分として有用である。従って、これらの疾患の予防又は改善用の医薬組成物、医薬部外品として、又は食品中に含ませて用いることができる。
【００２６】
ヘントリアコンタノナエンを医薬品又は医薬部外品として用いる場合、経口投与形態とすることができる。経口投与形態としては、医薬品の分野において通常に用いられている形態、例えば、固体形態（散剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤）や溶液形態（乳剤、液剤、シロップ剤）として製剤化することができる。
また、ヘントリアコンタノナエンを外用剤として用いることもでき、このような形態としては、例えば、軟膏、クリーム等として用いることができる。なお、前記経口投与形態や外用剤として用いる場合、その製剤化には、医薬品の分野において通常に用いられている賦形剤等を添加することができる。
【００２７】
賦形剤としては、固体形態の製剤を製造する場合には、例えば、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ゼラチン、澱粉、デキストリン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ケイ酸アルミニウム、酸化マグネシウム、乾燥水酸化アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、重炭酸ナトリウム、乾燥酵母等を用いることができる。また、溶液形態の製剤を製造する場合には、例えば、水、グリセリン、プロピレングリコール、単シロップ、エタノール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール等を用いることができる。また、各種の安定化剤、甘味剤、防腐剤、着香料、着色剤を用いてもよい。
【００２８】
軟膏やクリームとして製造する場合には、外用剤の形態に応じた各種の基剤、例えば精製水、低級アルコール、多価アルコール、油脂、界面活性剤、増粘剤、着色剤、防腐剤、香料等を用いることができる。
ヘントリアコンタノナエンを医薬品又は医薬部外品として用いる場合、その投与量は、１日あたり０．１〜５０００ｍｇ／体重１ｋｇ程度であり、好ましくは１日あたり１〜５０ｍｇ／体重１ｋｇ程度である。この量は、服用するヒトの性別や健康状態、体重、投与方法等を考慮して適宜調整することができる。
【００２９】
上記ヘントリアコンタノナエンは、食品に含有させて用いることもできる。ヘントリアコンタノナエンは、そのまま食品に含有させてもよく、又は食品に通常に用いられている賦形剤等を配合し、錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、粉末、カプセル剤、水和剤、乳剤、エキス剤等の剤形に製剤化して用いることもできる。
【００３０】
食品に通常に用いられている賦形剤としては、例えば、シロップ、アラビアゴム、ショ糖、乳糖、粉末還元麦芽糖、セルロース、マンニトール、マルチトール、デキストラン、澱粉類、ゼラチン、ソルビット、トラガント、ポリビニルピロリドン等の結合剤；ショ糖脂肪酸エステルグリセリン脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、ポリエチレングリコール等の滑沢剤、ジャガイモ澱粉等の崩壊剤、ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤等が挙げられる。また、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定化剤、乳化剤、分散剤、懸濁剤、防腐剤等を添加してもよい。
【００３１】
上記食品の摂取量は、ヘントリアコンタノナエンとして、１日あたり０．１〜５０００ｍｇ／体重１ｋｇ程度であり、好ましくは１日あたり１〜５０ｍｇ／体重１ｋｇ程度である。この量は、摂取する者の性別や健康状態、体重、症状等を考慮して適宜調節することができる。
【００３２】
なお、本発明が対象とする食品には、上記製剤形態を有するサプリメント［保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）及び栄養補書食品等の、いわゆる健康食品も含む）に加え、ヘントリアコンタノナエンを飲食物の製造原料の１種として用いて製造される食品、例えば、健康食品、保健機能食品（特定保健用食品や栄養機能食品）も含まれる。
【００３３】
食品の種類には特に制限されないが、例えば、乳飲料、乳酸菌飲料、果汁入り清涼飲料、炭酸飲料、果汁飲料、野菜飲料、野菜・果実飲料、アルコール飲料、コーヒー飲料、粉末飲料、スポーツ飲料、サプリメント飲料、紅茶飲料、緑茶、ゼリー入り飲料、ブレンド茶等の飲剤、プリン類、デザート類、冷菓類、ガム類、チョコレート類、ハードキャンディー、ソフトキャンディー、キャラメル類、焼き菓子類等の菓子類、パン類、スープ類、魚肉加工品、畜肉加工品、麺類、ソース類、惣菜等が挙げられる。
【００３４】
上記ヘントリアコンタノナエンは化粧品組成物に含有させることができる。このような化粧品組成物には、通常の化粧品に用いられる成分、例えば、精製水、低級アルコール、多価アルコール、油脂類、ロウ類、炭水化物等の基剤、保湿剤、界面活性剤、増粘剤、紫外線吸収剤、美白剤、安定剤、防腐剤、着色剤、香料等の成分を含有させることができる。化粧品組成物の形態に特に制限はなく、例えば、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール、エッセンス、パック、洗浄剤、ファンデーション、打粉、口紅等が挙げられる。化粧品組成物に配合されるヘントリアコンタノナエンの割合は、抗酸化効果を発揮し得る量であって、特に制限されないが、通常は、化粧品組成物の重量に対し、０．００５〜１０重量％程度である。
【００３５】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。なお、以下の実施例において％は特に断りのない限り重量％を表す。
実施例１
ｏｓｈ０８株の単離、増殖と脂肪酸の分析
試料として、北海道小樽市忍路海岸にて採集した海水、海砂、海藻（緑藻、紅藻、褐藻）、ウニ腸内物を用いた。細菌単離用培地としては、Ｚｏｂｅｌｌ寒天培地（０．５％ペプトン、０．１％酵母エキス、０．０１％リン酸鉄、１．５％寒天、５０％海水；以下Ｚ寒天培地）を用いた。海水については、寒天培地上に直接塗布して用い、海砂、海藻及びウニの腸内容物については海水抽出物を試料として用いた。試料をＺ寒天培地に塗布し、３０℃の温度で一晩培養した。形成された細菌のコロニーを白金耳を用いて新たなＺ寒天培地にスプレッドし、コロニーを単離した。この方法を繰り返すことにより、菌株を単離した。なお、各資料から、それぞれ６株以上のコロニーを単離した。
【００３６】
上述したＺ寒天上に形成されたコロニーから細胞をとり、これを１０％塩化アセチル−メタノール溶液に懸濁し、内部標準物質となるヘンエイコサン酸（１０μｇ；以下２１：１と略記）及び炭化水素テトラコサン（１０μｇ；以下Ｃ２４：０と略記）とともに１００℃にて１時間反応させメタノリシスした。得られた脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）をヘキサンで抽出し、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析した。脂肪酸の同定はガスクロマトグラフィ−マススペクトロメトリ（ＥＩ−ＭＳまたはＣＩ−ＭＳ）よって行った。
【００３７】
上記のように実施したＧＣによる分析により、紅藻由来の試料から得られた１株（ｏｓｈ０８株と命名した）に、微量のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）と思われるピークを確認した結果（図１下段参照）。ＧＣ−ＭＳによる分析の結果この成分はＧＣ分析における保持時間及びマスフラグメントパターン（データー示さず）から、ＥＰＡであることが分かった。図１（下段）から明らかなように、ＥＰＡのピークよりも更に保持時間が大きいピークが見られ、そのＧＣ−ＭＳによるフラグメントパターン（図１上段）をデータベースにより検索するとＥＰＡメチルエステルだけではなく、ＤＨＡメチルエステルのものとも一致した。しかし、ＤＨＡメチルエステルの保持時間は約３０．６分であることから、この成分（以下、化合物Ｘという）は炭素数が２２以上、二重結合数４個以上の多価不飽和脂肪酸であると予想された。上記培養条件、及び分析条件においてｏｓｈ０８株が含有するＥＰＡは全脂肪酸の０．２−０・４％であり、保持時間が大きな多価不飽和脂肪酸様物質は１．６−１．８％であった。
【００３８】
次いで、以下のようにして、化合物Ｘの同定を行った。
ｏｓｈ０８株より調製した全ＦＡＭＥをシリカゲル薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）によって分画した。化合物Ｘを含む全ＦＡＭＥのヘキサン溶液をマイクロピペットでスポットし、ｎ−ヘキサン：エーテル：酢酸（９０：１０：１、体積比）を溶媒として展開した。ＴＬＣプレートは窒素ガスを当てて乾燥させた。プリムリン溶液を吹きかけてから再度乾燥させ、紫外線でスポットを確認して鉛筆でマークした。プレート上での移動の比較のためにｎ−ドデカン、スクアランとスクアレンも同時に分析した。
上述のようにしてプレート上にマークした部分に相当するシリカゲルを掻き取り、メタノール：水：ｎ−ヘキサン（１：１：２、体積比）で抽出し、ｎ−ヘキサン画分を回収した。残りの画分に更にヘキサンを加えて回収した。この操作を更に１回繰り返した。ＴＬＣ分析の結果を図２に示す。図２に示すように、化合物Ｘの移動度はＦＡＭＥとは異なっており、スクアランとスクアレンとのほぼ中間であったことから、化合物Ｘは炭化水素であると結論した。化合物Ｘが乾燥細胞から直接抽出可能であることからも、この結論が支持される。なお、ヘキサン画分を一緒ににまとめ、濃縮後にＧＣに供した。
【００３９】
化合物Ｘは、不飽和結合を有する炭化水素であることがわかったので、この物質を、メタノリシスを経ないで、凍結乾燥細胞から直接抽出した。すなわち、１０ｍｇの乾燥細胞を１０ｍＬのメタノールに懸濁し、これに１０ｍＬのｎ−ヘキサンを加えて激しく混和した後、ヘキサン層を回収した。この操作を３回行った。
次いで、上記のようにして得られた化合物Ｘに対し、二酸化白金触媒下で水素添加処理を行った。少量（３．５μｇ）の当該化合物を含むメタノール溶液に二酸化白金を５ｍｇ加え、４０分間水素ガスを通気した。反応後、反応物をヘキサンにより抽出した。化合物Ｘ及びその水素添加処理産物をＧＣ−ＭＳにより分析した。分析法はＥＩ−ＭＳ法とアセトニトリルをイオン化試薬として用いたＣＩ−ＭＳ法である。
【００４０】
化合物ＸをＣＩ−ＭＳにより分析した結果を図３に示す。図３によると、化合物ＸのＧＣにおけるピーク（図３下段）は ｍ／ｚ ＝ ４７３である［Ｍ＋５４＋Ｈ］＋の顕著なイオンピークを示した（図３Ａ上段）ことから、その分子量は４１８であることがわかった。また、水素添加処理した炭化水素のＧＣにおけるピーク（図３Ｂ下段）の場合、ｍ／ｚ ＝ ４７７である ［Ｍ＋４０＋Ｈ］＋の顕著なイオンピークを示した（図３Ｂ上段）ことから、その分子量は４３６であり、炭素数３１のｎ−アルカンの分子量と計算上一致した。水素添加により化合物Ｘの分子量は１８マスユニット増加したことになり、これは当該化合物に９個の二重結合が存在することを示唆している。水素添加後の物質をＥＩ−ＭＳで分析すると、分子イオンは認められないが、マスフラグメントパターンは ｎ−アルカンのものと同等であった。以上の結果から、この化合物Ｘは炭素数３１、二重結合数９の炭化水素である、ヘントリアコンタノナエン（Ｃ３１：９）であることがわかった。
【００４１】
実施例２
ｏｓｈ０８株の増殖温度
単離株（ｏｓｈ０８）については増殖に与える温度の影響を調べた。ｏｓｈ０８株を、３％塩化ナトリウムを含むＬＢ培地（１．０％トリプトン、０．５％酵母エキス、３．０％塩化ナトリウム）にて、０、４、１５、２０、２５、３０、３７、４０、４２℃各温度にてそれぞれ培養し、時間ごとに増殖量を、７日目まで測定した。ｏｓｈ０８株は、４、１５、２０、２５、３０、３７、４０℃で増殖を示した。この中で、増殖の至適温度は３０℃であった。０℃、７日間では増殖は観察されなかった。また、４２℃、７日間での増殖も認められなかった。これらの性質からｏｓｈ０８は好冷菌ではなく、常温性の細菌であると結論した。Ｗｉｅｇｅｌ Ｊ（１９９０）Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｐａｎｓ ｆｏｒ ｇｒｏｗｔｈ：Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ７５：１５５−１６９は増殖の最低温度、至適温度、最高温度がそれぞれ５℃以下、１５℃以上、２０℃以上の微生物は温度耐性常温菌（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｔｏｌｅｒａｎｔ ｍｅｓｏｐｈｉｌｅ）と定義している。
【００４２】
実施例３
ｏｓｈ０８株のヘントリアコンタノナエン（３１：９）含量に及ぼす培養温度の影響
試験管で３ｍｌのＺ培地（１．０％ペプトン、１．０％酵母エキス、５０％海水）を用い、ｏｓｈ０８株を４，１５，２０，２５，３０，３７℃の温度でそれぞれ２日間（４℃のみ１週間）培養した。細胞をメタノリシス処理し、ヘキサンを用いてヘントリアコンタノナエン（Ｃ３１：９）をＦＡＭＥと共に抽出してＧＣに供した。脂肪酸２１：０と炭化水素Ｃ２４：０を内部標準として菌体に含まれる全脂肪酸メチルエステルと炭化水素の合計重量に対するＥＰＡとＣ３１：９の重量比（ｗ／ｗ％）を測定した。各温度で培養した細胞のＣ３１：９の全脂肪酸ＦＡＭＥ画分（炭化水素を含む）に対する存在比を表１に示す。Ｃ３１：９の全脂肪酸ＦＡＭＥ画分に対する存在比は、２５℃で培養した細胞で最大値３．２％を示した。Ｃ３１：９の全脂肪酸ＦＡＭＥ画分に対する存在比は、３０℃で１．７％、４℃で１．１％であり、低温になるほど含有量を増すＥＰＡとは全く異なる温度依存性を示した。
【００４３】
【表１】
【００４４】
実施例４
ヘントリアコンタノナエンの分布
各種微生物におけるヘントリアコンタノナエンの分布を調べた。本実験において用いた微生物を表２に記載した。表２において海洋性と記載されている微生物においては、３％ＮａＣｌを含むＬＢ培地を用いて２０℃又は１５℃で、２日間、それ以外の微生物については、ＬＢ培地を用いて２０又は３０℃で２日間培養を行った。培養を行った細胞について、実施例１及び３に示す方法によりメタノリシスを行い、ＦＡＭＥをＧＣ、ＧＣ−ＭＳにより分析した。表２に、ＥＰＡ、ＤＨＡ及びヘントリアコンタノナエンの生産性を示した。表２において、それぞれ検出された場合を＋、検出されなかった場合を−として示した。表２に示すようにヘントリアコンタノナエンは、ｏｓｈ０８株を含むＥＰＡ又はＤＨＡ（またはＥＰＡとＤＨＡの両方）を生成する海洋細菌と、ＥＰＡを生成する非海洋細菌Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ ＭＲ−１において生産されることが分かった。このことは従来知られているＥＰＡ産生菌やＤＨＡ産生菌がＣ３１：９の供給源として利用できることが示唆された。
【００４５】
【表２】
【００４６】
実施例５
ｏｓｈ０８株の同定
ｏｓｈ０８株から、常法に従いＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡを鋳型とし、二種類のＤＮＡ断片、９Ｆ：ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ（配列番号：１）、及び１５４１Ｒ：ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＣＣ（配列番号：２）をプライマーとしてＰＣＲを行い、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の全長を増幅した。増幅した遺伝子断片をｐＣＲ ２．１−ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いてＴＡクローニングを行い、大腸菌に導入した。形質転換した大腸菌を３０℃で１８時間培養した後、プラスミドを調製した。調製したプラスミドを鋳型にし、６種のプライマー、Ｍ１３Ｆ：ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ（配列番号：３）、３３８Ｆ：ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号：４）、８００Ｆ：ＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡ（配列番号：５）、５１８Ｒ：ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ（配列番号：６）、９２０Ｒ：ＣＣＣＣＧＴＣＡＡＴＣＣＴＴＴＧＡＧＴ（配列番号：７）及びＭ１３Ｒ：ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ（配列番号：８）を用いサイクルシークエンスを行った。
【００４７】
サイクルシークエンスの結果１５３４ｂｐの塩基配列が決定された（登録番号ＡＢ４４７９８７、［００５３］配列表参照）。この配列をＢＬＡＳＴＤＤＢＪ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）サーチに供したところ、ｏｓｈ０８株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列はシーワネラ・バルティカ ＪＣＭ １４９３７Ｔ株（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｂａｓａｌｔｉｓ ＪＣＭ １４９３７Ｔ、塩基配列登録番号：ＥＵ１４３３６１）及びシーワネラ・ハフニエンシス ＮＢＲＣ １００９７５Ｔ株（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｈａｆｎｉｅｎｓｉｓ ＮＢＲＣ １００９７５Ｔ、塩基配列登録番号：ＡＢ２０５５６６）のものとそれぞれと９９．８％及び９８．４％一致した。この結果より、ｏｓｈ０８株はＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ｂａｓａｌｔｉｓ又はＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ｈａｆｎｉｅｎｓｉｓ、あるいは、これらの種に極めて近縁のＳｈｅｗａｎｅｌｌａ属の菌での新株あると考えられる。本発明者らは、この菌株をＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ｏｓｈ０８株と命名した。
【００４８】
実施例６
ヘントリアコンタノナエンの抗酸化活性
実施例１により精製したヘントリアコンタノナエンは、ＧＣによる分析の結果、６３〜８２％の純度であったことから、その純度を高めるため、ＨＰＬＣによる精製を行った。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。溶媒（アセトニトリル）で平衡化したカラム（ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０ Ｔｓ、４．６ｍｍ×１５．０ｃｍ、ＴＯＳＯＨ）にヘントリアコンタノナエンを含む抽出物を約１．０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解し、その３００μＬを導入した。溶出条件は１．０ ｍＬ／ｍｉｎで、検出はＡ２０５の吸収により行った。：ヘントリアコンタノナエンは、保持時間１５．０分〜１７．５分に溶出したので、これを回収し、ＶＬＣＰＵＨＣ（又はＰＵＨＣ）とした。この操作によりヘントリアコンタノナエン純度は９８．８〜１００％になった。
【００４９】
Ｅ．ｃｏｌｉＵＭ２（カタラーゼ活性欠損株；エール大学大腸菌ストックセンター）を使ったＣ３１：９の過酸化水素耐性試験は以下の二通りの方法で調べた。
方法１：Ｅ．ｃｏｌｉＵＭ２をＬＢ培地にて３０°Ｃで１８時間培養したものを前培養液とした。各試験管にヘキサンに溶かしたＣ３１：９を終濃度０，１０，２０，５０μＭになるように入れて、ヘキサンを窒素ガスに当てて完全に揮発させた後、３ｍｌのＬＢ培地を加え超音波を３分間当てて調製した。ここにＵＭ２の前培養液を６０μｌ植菌して３０°Ｃにて１６０ｒｐｍで培養し、経時的に生育（ＯＤ６００の吸光値）を吸光度計（ｍｏｄｅｌ Ｕ−１８００、日立、東京）で測定した。対照として過酸化水素を添加していない系も同様に測定した。
方法２：９６穴マイクロプレート（イワキ、兵庫）を使用した。Ｃ３１：９を添加しない培養液（ＯＤ６００＝０．０１に調整）と５０μＭ、１００μＭのＣ３１：９を添加した培養液（ＯＤ６００＝０．０１に調整）、及び抗酸化活性のある炭化水素の対照として５０μＭ、１００μＭのスクアレンを添加した培養液（ＯＤ６００＝０．０１に調整）を用意し、マイクロプレートの各穴に１８０μｌずつ分注した。Ｃ３１：９とスクアレン添加する場合は、試験管に各炭化水素を入れてヘキサンを窒素ガスに当てて完全に揮発させた後、培地を加え超音波を３分間当てて前培養液をＯＤ６００＝０．０１になるよう加えて調整した。水または種々の濃度の過酸化水素水溶液２０μｌを添加し、終濃度０，０．１１，０．２２，０．３３，０．４４，０．５５，０．６６，０．７７，０．８８，０．９９ｍＭとして３０°Ｃで４８時間静置培養した。
【００５０】
上記抗酸化活性試験の結果
Ｃ３１：９の抗酸化機能について調べた結果、表Ｘに示すように、試験管で培養した方法１のＣ３１：９を与えた系では、過酸化水素０．０５５ｍＭによって抑制された生育が対照株よりも回復しやすいことが確認された。またこのときＣ３１：９の量が０，１０，２０，５０μＭと増加するに従って、Ｅ．ｃｏｌｉＵＭ２の生育も８時間後には１．６７，１．７３，１．８９．２．１（ＯＤ６００）と段階的に良くなる傾向が見られた。これによりＣ３１：９には抗酸化活性があることが分かった。また過酸化水素非存在下でＣ３１：９を添加しても、生育阻害は認められなかった。過酸化水素０．５５ｍＭではＣ３１：９を添加しても生育は確認されず、この系では酸化ストレスがＣ３１：９の抗酸化活性を上回ったためと考えられる。
また方法２を用いた実験でも同様に、Ｃ３１：９には抗酸化活性があることが示された（図Ｘ）。さらにこの実験では、抗酸化活性のある炭化水素として知られるスクアレンをＣ３１：９の対照として用いた。これによると、やはりＣ３１：９やスクアレンを添加した系では生育が回復することが分かる。
ここでＣ３１：９とスクアレンを５０μｌ添加した場合について比較すると、過酸化水素の生育阻害はＣ３１：９添加系で０．７７ｍＭまで、スクアレン添加系で０．６６ｍＭまでで起こり、このことからＣ３１：９はスクアレンよりも強い抗酸化活性を持つとが示された。スクアレンは強い抗酸化活性を持ち、実用的にも非常に有用な物質として知られているが、この研究によりＣ３１：９はスクアレンを上回る有用性がある可能性を示した。
【００５１】
【表３】
【００５２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シーワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属、モワテラ属、コルウェリア属に属し、ヘントリアコンタノナエンを生産することができる微生物を用いてへントリアコンタノナエンを製造する方法。
【請求項２】
微生物がシーワネラ・ｓｐ．ｏｓｈ０８株（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ｏｓｈ０８）又は類縁菌である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
１５〜４０℃の温度で増殖可能である、請求項１又は２記載の微生物でヘントリアコンタノナエンを製造する方法。
【請求項４】
ヘントリアコンタノナエンがもつ抗酸化作用を利用してスクアレンなどの代替品とする方法。
【請求項１】
シーワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属、モワテラ属、コルウェリア属に属し、ヘントリアコンタノナエンを生産することができる微生物を用いてへントリアコンタノナエンを製造する方法。
【請求項２】
微生物がシーワネラ・ｓｐ．ｏｓｈ０８株（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ｏｓｈ０８）又は類縁菌である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
１５〜４０℃の温度で増殖可能である、請求項１又は２記載の微生物でヘントリアコンタノナエンを製造する方法。
【請求項４】
ヘントリアコンタノナエンがもつ抗酸化作用を利用してスクアレンなどの代替品とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−３４６７８（Ｐ２０１２−３４６７８Ａ）
【公開日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８７６２４（Ｐ２０１０−１８７６２４）
【出願日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【出願人】（５０３２５９４０６）株式会社ロム (3)
【出願人】（５０９０６３７８６）株式会社プログレッソ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【出願人】（５０３２５９４０６）株式会社ロム (3)
【出願人】（５０９０６３７８６）株式会社プログレッソ (1)
【Ｆターム（参考）】
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