ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメイン結晶
【課題】 創薬において重要であるインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインの結晶、及び、立体構造情報を提供することを目的とする。
【解決手段】 インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３のトランスペプチダーゼドメインを調製し、高品質の結晶、及び、その製造方法を提供する。
【解決手段】 インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３のトランスペプチダーゼドメインを調製し、高品質の結晶、及び、その製造方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｘ線結晶構造解析および阻害剤の設計等に利用するためのペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインの結晶に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰと称する）は細菌における細胞壁を構成する構造ユニットであるムレインモノマーを基質として細胞壁ペプチドグリカンを組み立てる一連の酵素群であり、細菌のペプチドグリカンの重合および架橋反応に働く膜結合型のタンパク質である。インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）には数種類のＰＢＰが確認されているが、耐性菌として増加傾向にあるβ−ラクタマーゼ非産生アンピシリン耐性（ＢＬＮＡＲ）インフルエンザ菌においては、ＰＢＰ３における変異がβ−ラクタム薬の感受性低下に大きく関与している（非特許文献１）。また、配列番号２に示されるＲｄ株（ＡＴＣＣ５１９０７）由来ＰＢＰ３においては、アミノ酸残基番号３７７のメチオニン、３８５のセリン、３８９のロイシン、５１７のアルギニンおよび５２６のアスパラギンが各々イソロイシン、スレオニン、フェニルアラニン、ヒスチジンおよびリジンに置換された変異が薬剤耐性に重要であることが示唆されている（非特許文献２）。従って、ＰＢＰ３の立体構造を結晶構造解析により解明することは、耐性のメカニズムを説明するだけでなく、耐性菌に有効な新薬を創出する上でも非常に重要である。
【０００３】
インフルエンザ菌由来ＰＢＰ３は、細胞内ドメイン、膜貫通領域、Ｎ末端ドメインおよびトランスペプチダーゼドメインから構成される膜結合型タンパク質であり、細胞内ドメインおよび膜貫通領域を除去し、膜結合機能を喪失させたＰＢＰ３可溶性部分の調製方法が明らかになっているが（非特許文献３）、ＰＢＰ３可溶性部分からさらにＮ末端ドメインを除去したトランスペプチダーゼドメインの調製方法は未だ明らかとなっていない。
結晶化に関しては、膜結合部位を除去したＰＢＰ３可溶性部分を発現、精製、結晶化した報告があるが、Ｎ末端、Ｃ末端部位は具体的に言及がなかった。その報告では、結晶の写真を提示した上で、ある方向から結晶にＸ線を照射した場合には分解能３．５Å程度の回折点が得られたものの、Ｘ線を照射する向きによっては回折点の強度が弱かったために、新規な構造を決定するために必要な回折データを収集することは困難であったと口頭で発表していた（非特許文献４）。従って、結晶構造解析によりＰＢＰ３の立体構造を決定し、効率的な阻害剤の設計を可能とする高品質のＰＢＰ３結晶の創出が望まれている。
【０００４】
一般にタンパク質のＮ末端、Ｃ末端やループ領域は構造が揺らいでいる場合があり、その際には複数のコンフォメーションを取り得ることから、タンパク質の揺らいでいる領域の除去やドメインの切り出しは均一のコンフォメーションから構成される高分解能のＸ線回折能を有する結晶を作製するために有効な手段である（非特許文献５）。インフルエンザ菌ＰＢＰ３においては、結晶化に最適のトランスペプチダーゼドメインの領域は未だ明らかでなく、ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶は報告されていない。本発明者は、ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶は、揺らいでいる領域が少ないため高品質となること、及び、ＰＢＰ３の立体構造を解明することに多いに貢献できると考えた。
【非特許文献１】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４５（６）１６９３−１６９９（２００１）
【非特許文献２】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４９（７）２８３４−２８３９（２００５）
【非特許文献３】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４８（５）１６３０−１６３９（２００４）
【非特許文献４】朴 三用、「ペニシリン結合タンパク質の構造による新抗生物質の開発」、２００６年１２月１３日、横浜市立大学第３回産学連携フォーラム「横浜市立大学・蛋白質構造解析コンソーシアム合同シンポジウム―タンパク質研究から創薬へ―」予稿集
【非特許文献５】ＢＩＯベンチャー ３（５）、３６−３９（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまでインフルエンザ菌ＰＢＰ３の結晶構造は報告されていない。そのため、創薬において重要であるＰＢＰ３の立体構造情報が存在せず効率的な阻害剤の設計が困難である。また、ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶の製造方法は不明である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、結晶化に適したＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインを調製し、高品質の結晶を製造することで上記課題を解決する。
【０００７】
本発明者はインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインを調製する工程において、少なくとも５０ｍＭ以上の塩化ナトリウムを常に添加することにより、目的タンパク質の収量を向上させる方法を見出した。また、結晶化条件探索の試行錯誤により酒石酸および酒石酸塩（好ましくは酒石酸ナトリウムが挙げられる。）からなる酒石酸緩衝液の存在下で成長するＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶を取得した。この結晶は少なくとも２．０Åの分解能までＸ線解析が可能である高品質の結晶であり、創薬研究に重要なＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの立体構造を決定した。
すなわち、本発明はＸ線結晶構造解析および阻害剤の設計等に利用するためのＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶に関する。
本発明によるＰＢＰ３の結晶は、具体的には、空間群がＰ１である。
より具体的には下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかの空間群および格子定数を有する。
（ａ）空間群がＰ１であり、格子定数がａ＝７４±７Å、ｂ＝８２±８Å、ｃ＝５４±５Å、α＝１０８±１１°、β＝９９±１０°、γ＝８２±８°
（ｂ）空間群がＰ１であり、格子定数がａ＝８３±８Å、ｂ＝１０８±１１Å、ｃ＝７４±７Å、α＝９０±９°、β＝９２±９°、γ＝９０±９°
【０００８】
本発明は以下の発明を含有する。
（１）ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）に属する微生物由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインの結晶。
（２）インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインの結晶。
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質から構成される（１）から（２）のいずれか一つに記載の結晶。
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する相同タンパク質から構成される（１）から（２）のいずれか一つに記載の結晶。
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する改変タンパク質から構成される（１）から（２）のいずれか一つに記載の結晶。
（６）空間群がＰ１である（１）から（５）のいずれか一項に記載の結晶。
（７）空間群がＰ１であり、格子定数がａ＝７４±７Å、ｂ＝８２±８Å、ｃ＝５４±５Å、α＝１０８±１１°、β＝９９±１０°、γ＝８２±８°である（１）から（５）のいずれか一つに記載の結晶。
（８）空間群がＰ１であり、格子定数がａ＝８３±８Å、ｂ＝１０８±１１Å、ｃ＝７４±７Å、α＝９０±９°、β＝９２±９°、γ＝９０±９°である（１）から（５）のいずれか一つに記載の結晶。
（９）（１）から（８）のいずれか一つに記載の結晶であって、該結晶を構成するタンパク質中の少なくとも１つのメチオニン残基がセレノメチオニンに置換されている結晶。
（１０）酒石酸または酒石酸塩の存在下で成長する（１）から（９）のいずれか一つに記載の結晶。
（１１）酒石酸塩が酒石酸ナトリウムである（１０）に記載の結晶。
（１２）（ｉ）少なくとも５０ｍＭ以上の塩化ナトリウムを常に添加した状態でアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを実施し、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインを調製する工程、並びに
（ｉｉ）酒石酸または酒石酸塩の存在下で、ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインを結晶化する工程
を含む、（１）から（１１）のいずれか一つに記載の結晶の製造方法。
（１３）少なくとも３．２Åの分解能までＸ線解析が可能である、（１）から（１１）のいずれか一つに記載の結晶。
（１４）少なくとも２．７Åの分解能までＸ線解析が可能である、（１）から（１１）のいずれか一つに記載の結晶。
（１５）少なくとも２．３Åの分解能までＸ線解析が可能である、（１）から（１１）のいずれか一つに記載の結晶。
（１６）少なくとも２．０Åの分解能までＸ線解析が可能である、（１）から（１１）のいずれか一つに記載の結晶。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶は、高分解能での結晶構造解析に利用可能であり、ＰＢＰ３を阻害する化合物の効率的な設計等に活用できるため、創薬において極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン＞
本発明のＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインを構成するタンパク質は、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）に属するインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来のタンパク質である。また、本発明において、「トランスペプチダーゼ」とは、細菌細胞壁の一つの成分であるペプチドグリカンの生合成の最終段階に関与し、ペプチドグリカン連鎖を構成しているＮ−アセチルムラミン酸から伸びるポリペプチド鎖の架橋を触媒する酵素を意味する。
さらに、「トランスペプチダーゼドメイン」とは、上記ポリペプチド鎖を架橋する能力を有し、β−ラクタム薬との結合が可能であるタンパク質、及び、活性残基である配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基番号３２７のセリンに変異を導入し上記ポリペプチド鎖を架橋する能力を失活させたタンパク質の構造単位であり、細胞内ドメイン、膜貫通領域、Ｎ末端ドメインを除去したタンパク質である。
本発明における「相同タンパク質」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインからなるタンパク質である。ここで示した相同性の数値は、当業者に公知の相同性検索プログラムであるＦＡＳＴＡ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４−２４４８（１９８８）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値を示す。
本発明における「改変タンパク質」とは、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインからなるタンパク質である。ここで、「置換、欠失、付加もしくは挿入」などの改変に係るアミノ酸の数は、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１２個である。
【００１１】
ＰＢＰ３は、細胞内ドメイン、膜貫通領域、Ｎ末端ドメインおよびトランスペプチダーゼドメインから構成される膜結合型タンパク質である。ＰＢＰ３可溶性部分とは、細胞内ドメインおよび膜貫通領域を除去し、膜結合機能を喪失させたＰＢＰ３である。ＰＢＰ３可溶性部分は由来となる株およびＮ末端およびＣ末端が異なる種々のものが存在可能であるが、インフルエンザ菌においては、好ましくは、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基番号６７から６１０に相当するアミノ酸で構成される。
ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインは、ＰＢＰ３可溶性部分からさらにＮ末端ドメインを除去したものであり、除去する領域の違いにより種々のものが存在可能である。ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインとしては、配列番号２においてアミノ酸番号２２５〜２６２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５６６〜６０７のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる配列からなるタンパク質が好ましい。また、より好ましくは配列番号２においてアミノ酸番号２３５、２４２、２４９、２５２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５７６、５８１、５８６、５９３、５９７のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる配列からなるタンパク質であり、さらに好ましくは配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００１２】
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの発現＞
ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインは、それをコードするＤＮＡ断片を、宿主細胞内で複製可能でかつ同遺伝子が発現可能な状態で含むＤＮＡ分子、特にＤＮＡ発現ベクターの形態とし、それによって宿主細胞の形質転換を行い、その形質転換体を培養することによって得られる。このＤＮＡ分子は、ベクター分子にＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインをコードするＤＮＡ断片を組み込むことによって得ることができる。
本発明の好ましい態様によれば、このベクターはプラスミドである。本発明において利用されるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案して、ウィルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択することができる。例えば宿主細胞が大腸菌の場合はｐＵＣ、ｐＢＲ系のプラスミド、枯草菌の場合はｐＵＢ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＲｐ、ＹＣｐ系のプラスミドベクターが挙げられる。宿主細胞としては、宿主−ベクター系が確立されているものであれば利用可能であり、好ましくは大腸菌が挙げられる。宿主細胞の形質転換により得られた形質転換体は、適当な条件で培養し、得られた形質転換体の細胞抽出液を慣用の方法に従い回収することができる。ここで、ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインに付加的ポリペプチド、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはヒスチジン残基に富むポリペプチド（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を融合タンパク質として発現することも慣用の技術により可能である。
【００１３】
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの精製＞
大腸菌で発現させたＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインは、慣用のクロマトグラフィーの技術により精製が可能である。Ｈｉｓ−ｔａｇを付加して発現させた場合はニッケルイオンを固定化したアフィニティーカラムにより精製が可能であり、タグを付加しない場合においても、イオン交換カラム、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ等の色素を利用したブルーカラム、ヘパリンカラム、ハイドロキシアパタイトカラム、疎水性相互作用カラムやゲルろ過カラム等を組み合わせることで精製できる。また、少なくとも５０ｍＭ以上の塩化ナトリウムを常に添加した状態で精製することにより、目的タンパク質の安定性を担保し、収量を向上させることが可能である。
【００１４】
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶化＞
一般的にタンパク質の結晶化は容易ではない。結晶化できる条件が比較的容易に見出される場合もあるが、通常は種々の結晶化条件をスクリーニングしなければならない。さらに結晶化剤の濃度、ｐＨ、塩の種類と濃度、添加剤などの条件を最適化することによって、Ｘ線結晶構造解析に供することができる良質の結晶が得られる。また、いかなる条件でも結晶化しない蛋白質も存在すると考えられている。タンパク質の結晶が得られなければＸ線結晶構造解析を行うことができない。また、Ｘ線結晶構造解析に用いるタンパク質の結晶は、結晶であればいかなるものでも解析可能であるわけではない。実際にＸ線を照射した際に、高分解能の回折強度データが得られることが必要である。
本発明によるＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶を得る方法は、蒸気拡散法（例えば、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法などが挙げられる）、バッチ法、透析法または自由界面拡散法などのいかなる方法を用いてもよく、好ましくは蒸気拡散法が挙げられ、さらに好ましくはシッティングドロップ法が挙げられる。本発明者の得た知見によれば、ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶はクラスター化する傾向にあるため、シーディング法により良質の単結晶を得ることが好ましい。結晶化の温度は４℃〜３０℃が一般的であるが、本発明では好ましくは１０〜２５℃、さらに好ましくは、２０℃である。
本発明の好ましい態様によれば、結晶化に用いるタンパク質としては配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましい。また、前記タンパク質中のメチオニン残基がセレノメチオニンに置換されたセレノメチオニン置換体も同様に結晶化に用いられる。結晶化に用いる精製タンパク質の濃度は、４〜２０ｍｇ／ｍＬ程度であることが好ましい。そして、蛋白質溶液に結晶化剤、塩類、緩衝液、添加剤などを適当量加えて、結晶化を行う。本発明のＰＢＰ３の結晶化に用いられる結晶化剤としては、硫酸アンモニウムなどの無機塩類、ポリエチレングリコールなどの水溶性高分子、イソプロパノールやエタノールなどの有機溶媒などが挙げられる。好ましくは、、ポリエチレングリコールなどである。
また、緩衝液としては、公知の緩衝液のいずれも用いることができる。好ましくは酒石酸および酒石酸塩からなる酒石酸緩衝液であり、さらに好ましくは、酒石酸および酒石酸ナトリウムからなる酒石酸緩衝液（ｐＨ ３．０−６．２）である。
さらに添加剤としては、種々の金属イオン、有機溶媒、還元剤等を用いることができる。セレノメチオニン置換体の場合には未置換体の場合における周辺の条件で結晶を作製できるが、セレン原子の酸化を抑制するためにジチオスレイトール等の還元剤を添加することが好ましい。還元剤を除く結晶化剤の組み合わせとしては、
（１）９−２７％ ポリエチレングリコール４０００、０−０．３Ｍ 酢酸マグネシウム、０．１Ｍ 酒石酸緩衝液 ｐＨ ５．０−６．０、
（２）３−１０％ ポリエチレングリコール４０００、５％ ２−プロパノール、０．１Ｍ 酒石酸緩衝液 ｐＨ ５．０−６．０、
（３）１６．７５％ ポリエチレングリコール４００、１３．４％ ポリエチレングリコール３３５０、０．１Ｍ 塩化マグネシウム、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ８．５、
（４）２０％ ポリエチレングリコール３３５０、０．２Ｍ 酒石酸カリウム緩衝液 ｐＨ ８．５、
（５）０．８Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ４．６、
（６）１Ｍ リン酸アンモニウム、０．１Ｍ 酒石酸緩衝液 ｐＨ ５．６、
（７）１５％ ポリエチレングリコール３３５０、０．１Ｍ コハク酸緩衝液ｐＨ ７．０、
（８）２０％ ポリエチレングリコール３３５０、マロン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ７．０
等が挙げられる。とりわけ（１）または（２）の組み合わせが好ましい。
【００１５】
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン結晶のＸ線回折強度データの収集＞
上記のようにして得られる結晶の外観、単位格子の種類・大きさなどはその結晶に固有のものであり、良質の結晶を用いれば、Ｘ線回折実験により高分解能の回折強度データを取得することができる。結晶を、多価アルコールを含有する抗凍結溶液中に浸した後凍結させ、凍結状態でＸ線回折データを収集し、Ｘ線回折像を得た。ここで、多価アルコールとしては、エチレングリコール、スクロース、トレハロース、グリセロールなどが挙げられる。これらの中で特にエチレングリコールが好ましい。抗凍結溶液中の多価アルコールの濃度は、好ましくは１０〜３５％である。Ｘ線を照射して回折強度データを取得するには、いかなるＸ線発生装置を用いることができるが、好ましくは、（財）高輝度光科学研究センターの大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８や大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構Ｐｈｏｔｏｎ Ｆａｃｔｏｒｙなどの放射光施設を利用することができる。得られたＸ線回折強度データを処理することにより、結晶学的パラメータを特定することが可能である。
前記結晶化剤の組み合わせの（１）で得られるＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶は、空間群がＰ１である。また、格子定数はａ＝７４±７Å、ｂ＝８２±８Å、ｃ＝５４±５Å、α＝１０８±１１°、β＝９９±１０°、γ＝８２±８°であり、より好ましくはａ＝７４±４Å、ｂ＝８２±４Å、ｃ＝５４±３Å、α＝１０８±５°、β＝９９±５°、γ＝８２±４°であり、さらに好ましくはａ＝７４±１Å、ｂ＝８２±１Å、ｃ＝５４±１Å、α＝１０８±１°、β＝９９±１°、γ＝８２±１°である。
また、前記組み合わせ（２）に１ｍＭ ジチオスレイトールを添加して得られるＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の結晶は、空間群がＰ１である。また、格子定数はａ＝８３±８Å、ｂ＝１０８±１１Å、ｃ＝７４±７Å、α＝９０±９°、β＝９２±９°、γ＝９０±９°であり、より好ましくはａ＝８３±４Å、ｂ＝１０８±５Å、ｃ＝７４±４Å、α＝９０±５°、β＝９２±５°、γ＝９０±５°であり、さらに好ましくはａ＝８３±１Å、ｂ＝１０８±１Å、ｃ＝７４±１Å、α＝９０±１°、β＝９２±１°、γ＝９０±１°である。
【００１６】
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶構造の決定＞
上記のように得られたデータを用いてＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶構造の決定が可能となる。一般に位相決定には、分子置換法、重原子同型置換法、多波長異常分散法（ＭＡＤ法）、単波長異常分散法（ＳＡＤ法）などが用いられる。目的蛋白質に対する類縁蛋白質の立体構造が未知あるいは相同性が低い場合には、その立体構造を利用した分子置換法による構造解析が不可能であるため、ＰＢＰ３結晶構造の決定には、重原子同型置換法、ＭＡＤ法またはＳＡＤ法などが好ましく、より好ましくはセレノメチオニン置換体結晶を用いたＭＡＤ法またはＳＡＤ法が用いられる。
【００１７】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は実施例によって限定されるものではない。また、各種ベクターの作製、蛋白質の発現等は、特に記載のない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ著，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ刊（２００１））などに記載の公知の手法に従って実施できる。
【実施例】
【００１８】
実施例１
＜インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインをコードする遺伝子の構築＞
インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインをコードするＤＮＡを単離するため以下のプライマーを設計した。
【００１９】
ＨＩ−ＰＢＰ３−２５２−５：５’−ｃａｇｃｃａｔａｔｇｇｔｔａｃｃｔｔａａｇｔａｔｃｇａｔｇａａａａａｔｔｇｃ−３’（配列番号３）
ＨＩ−ＰＢＰ３−５８１−３：５’−ｃｃｃｃｔｃｇａｇｔｔａｃｇｇａａｔａｇｃａｔｔｔｇｃａｃｇ−３’（配列番号４）
【００２０】
インフルエンザ菌Ｒｄ株ＰＢＰ３可溶性部分をコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドＤＮＡを鋳型に、前記プライマーを組み合わせて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を添付の説明書に従い実施した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素で消化し、この断片を予め制限酵素で切断したベクターｐＥＴ−２１ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を添付の説明書の方法に従い用い、サブクローニングした。得られた組換えプラスミドを大腸菌ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付の説明書の方法に従い導入し、形質転換体を得た。形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ ａｇａｒプレート上にて、３７℃で一晩培養し、薬剤耐性コロニーを取得した。取得したコロニーから組換えプラスミドｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿ＨＩ＿２５２−５８１を調製した。
【００２１】
実施例２
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの発現＞
実施例１記載の組み換えプラスミドｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿ＨＩ＿２５２−５８１を大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＳＢ培地（１．２％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、２．４％（ｗ／ｖ）Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０７２Ｍ リン酸水素二カリウム、０．０２８Ｍ リン酸二水素カリウム）中で６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が０．５−１に達するまで増殖させた。終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２０℃で一晩誘導後、遠心分離機によって集菌し、菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した後、再度、遠心分離機によって集菌し、−２０℃で凍結保存した。菌体を菌体破砕バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ８．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ、０．０５ｍｇ／ｍＬ リゾチーム）に懸濁し、氷上で３０分インキュベートした。超音波処理を施し、細胞を破砕し、遠心分離とそれに続く０．２μｍのフィルターによって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。
【００２２】
実施例３
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の発現＞
メチオニンの硫黄原子が重原子であるセレンに置換されたＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の発現を試みた。実施例１記載の組み換えプラスミドｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿ＨＩ＿２５２−５８１を大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地１００ｍＬにて、３７℃で一晩培養し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む４．８ＬのＬｅＭａｓｔｅｒ培地（組成は下記の表１に示す）に２４ｍＬ接種し、６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が約０．５に達するまで増殖させた。終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２０℃で一晩誘導後、遠心分離機によって集菌し、菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）２００ｍＬに懸濁した後、再度、遠心分離機によって集菌し、−２０℃で凍結保存した。菌体を菌体破砕バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ リゾチーム）に懸濁し、氷上で３０分インキュベートした。超音波処理を施し、細胞を破砕し、遠心分離とそれに続く０．２μｍのフィルターによって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。
【００２３】
【表１】
【００２４】
実施例４
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの精製＞
（１）陰イオン交換カラムによる精製
以下の精製操作はすべて４℃で行った。実施例２の方法で得られた細胞抽出液を陰イオン交換クロマトグラフィーで精製した。ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ ５ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を２本直列に連結して用いた。平衡化バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ８．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で平衡化した後、流速２．５ｍＬ／ｍｉｎでサンプルをアプライし、流速４ｍＬ／ｍｉｎで約３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ８．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の０−１０００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１００ｍＬ）で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより主要なフラクションをまとめて回収した。
【００２５】
（２）ブルーカラムによる精製
上記（１）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ 塩化ナトリウム）に対して透析した後、ＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅ ＨＰ ５ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は４ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の２００−２０００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１０カラム容量）で溶出し主要な溶出画分をまとめた。
【００２６】
（３）ヘパリンカラムによる精製
上記（２）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ 塩化ナトリウム）に対して透析した後、ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰ ５ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は４ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の５０−２０００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１０カラム容量）で溶出し主要な溶出画分をまとめた。
【００２７】
（４）陽イオン交換カラムによる精製
上記（３）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ 塩化ナトリウム）に対して透析した後、ＭｏｎｏＳ ＨＲ１０／１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は４ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の５０−４４０ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１０カラム容量）で溶出し主要な溶出画分をまとめ、保持分子量３００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ ３０，０００ ＭＷＣＯ（ミリポア社製）を用いてタンパク質濃度１５ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。大腸菌培養液４００ｍＬから１．５ｍｇのＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインを精製した。
【００２８】
実施例５
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの精製方法の改良＞
実施例４（１）陰イオン交換カラムによる精製では、塩化ナトリウムを添加しない条件でサンプルをカラムに吸着させていたが、塩化ナトリウム濃度が低い状態ではＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインは沈殿し易い傾向があったため、精製方法の改良を実施した。
【００２９】
（１）ブルーカラムによる精製
以下の精製操作はすべて４℃で行った。実施例２において、菌体破砕バッファーを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９、２００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ リゾチームに変更して得られた細胞抽出液をＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ４８ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は２．５ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、５カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の２００−２０００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１０カラム容量）で溶出し主要な溶出画分をまとめた。
【００３０】
（２）ヘパリンカラムによる精製
上記（１）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム）に対して透析した後、ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰ ５ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を２本直列に連結し、また、サンプルを８回に分けて精製した。流速は３ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の１５０−５７０ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（６カラム容量）で溶出し主要な溶出画分をまとめた。
【００３１】
（３）陽イオン交換カラムによる精製
上記（２）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム）に対して透析した後、ＭｏｎｏＳ ＨＲ１０／１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて、また、サンプルを８回に分けて精製した。流速は４ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の１５０−３５０ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（６．４カラム容量）で溶出し主要な溶出画分をまとめ、保持分子量３００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ ３０，０００ ＭＷＣＯ（ミリポア社製）を用いてタンパク質濃度３０ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。大腸菌培養液２．４Ｌから３１ｍｇのＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインを精製し、実施例４と比較して約３．４倍収量が向上した。
【００３２】
実施例６
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の精製＞
（１）ブルーカラムによる精製
以下の精製操作はすべて４℃で行った。実施例３の方法で得られた細胞抽出液をＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ４８ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は２．５ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール、２００ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール溶液中の２００−２０００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１０カラム容量）で溶出し主要な溶出画分をまとめた。
【００３３】
（２）ヘパリンカラムによる精製
上記（１）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール、８０ｍＭ 塩化ナトリウム）に対して透析した後、ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰ ５ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を２本直列に連結し、また、サンプルを４回に分けて精製した。流速は２．５ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール、１８６ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール溶液中の１８６−５４１ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（６カラム容量）で溶出し主要な溶出画分をまとめた。
【００３４】
（３）陽イオン交換カラムによる精製
上記（２）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール、１７６ｍＭ 塩化ナトリウム）に対して透析した後、ＭｏｎｏＳ ＨＲ１０／１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて、また、サンプルを４回に分けて精製した。流速は４ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１７６ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の１７６−３６８ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（８カラム容量）で溶出し主要な溶出画分をまとめ、保持分子量１００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ １０，０００ ＭＷＣＯ（ミリポア社製）を用いてタンパク質濃度２５ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。
【００３５】
実施例７
＜結晶化＞
（１）ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶化
ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散法により得た。実施例４で精製し、その後５ｍｇ／ｍＬに希釈したタンパク質溶液０．５μＬを結晶化剤（１４％ ポリエチレングリコール４０００、０．２Ｍ 酢酸マグネシウム、０．１Ｍ 酒石酸緩衝液 ｐＨ ５．５）０．５μＬと混合し結晶化ドロップとし、リザーバー溶液として上記結晶化剤１００μＬ分注し密閉した。プレートを２０℃の恒温槽内で一晩静置した後、類似の条件で予め作製した結晶からストリークシーディング法によりドロップに種を植えて、更に２０℃の恒温槽内に静置して結晶を作製した。得られた結晶の顕微鏡写真の一例を図１に示す。
【００３６】
（２）ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の結晶化
ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散法により得た。実施例５で精製し、その後５ｍｇ／ｍＬに希釈したタンパク質溶液０．５μＬを結晶化剤（４％ ポリエチレングリコール４０００、５％ ２−プロパノール、０．１Ｍ 酒石酸緩衝液 ｐＨ ５．５、１ｍＭ ジチオスレイトール）０．５μＬと混合し結晶化ドロップとし、リザーバー溶液として上記結晶化剤１００μＬ分注し密閉した。プレートを２０℃の恒温槽内で数時間静置した後、類似の条件で予め作製した結晶からストリークシーディング法によりドロップに種を植えて、更に２０℃の恒温槽内に静置して結晶を作製した。得られた結晶の顕微鏡写真の一例を図２に示す。
【００３７】
実施例８
＜Ｘ線回折強度データの収集＞
（１）ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン結晶のデータ収集
実施例７（１）において得られた結晶を２０％エチレングリコール含有の抗凍結剤溶液に移した後、−１７０℃の窒素ガス気流にて急速凍結した。これを大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構Ｐｈｏｔｏｎ ＦａｃｔｏｒｙのビームラインＢＬ−１７Ａを利用しＱｕａｎｔｕｍ ２７０ ＣＣＤカメラ（ＡＤＳＣ社製）を検出装置としてＸ線回折データを振動法にて測定した。Ｘ線の波長は１Å、振動角は１°／フレームであった。次に、回折強度データ処理プログラムＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒ(リガク社製)を使用して、回折強度データを分解能２．０Åで処理した。その結果、空間群がＰ１であり、格子定数がａ＝７３．８２Å、ｂ＝８２．２０Å、ｃ＝５４．３０Å、α＝１０７．９０°、β＝９８．８４°、γ＝８２．０５°であった。得られたデータのＣｏｍｐｌｅｔｅｎｅｓｓは８７．１％、Ｒｍｅｒｇｅは７．１％であった。データ収集の結果を下記の表２にまとめた。
【００３８】
【表２】
【００３９】
（２）ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体結晶の多波長異常分散（ＭＡＤ）データの収集
実施例７（２）において得られた結晶を３０％エチレングリコール含有の抗凍結剤溶液に移した後、−１７０℃の窒素ガス気流にて急速凍結した。これを大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構Ｐｈｏｔｏｎ ＦａｃｔｏｒｙのビームラインＢＬ−１７Ａを利用しＱｕａｎｔｕｍ ２７０ ＣＣＤカメラ（ＡＤＳＣ社製）を検出装置としてＸ線回折データを振動法にて測定した。このとき、セレンの異常散乱効果を用いて構造解析を行うために、波長は０．９７９３１、０．９７８７４および０．９６４０８Åの３波長、即ち、吸収端のエッジ、ピーク、リモートの３カ所でＭＡＤデータを収集した。振動角は１°／フレームであった。次に、回折強度データ処理プログラムＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒ(リガク社製)を使用して、回折強度データを分解能２．０Åで処理した。その結果、空間群がＰ１であり、格子定数がａ＝８２．９８Å、ｂ＝１０７．６６Å、ｃ＝７３．６９Å、α＝９０．１１°、β＝９１．８２°、γ＝８９．９１°であった。データ収集の結果を下記の表３にまとめた。
【００４０】
【表３】
【００４１】
（３）ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体結晶の単波長異常分散（ＳＡＤ）データの収集
実施例７（２）において得られた結晶を３５％エチレングリコール含有の抗凍結剤溶液に移した後、−１７０℃の窒素ガス気流にて急速凍結した。これを大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構Ｐｈｏｔｏｎ ＦａｃｔｏｒｙのビームラインＢＬ−１７Ａを利用しＱｕａｎｔｕｍ ２７０ ＣＣＤカメラ（ＡＤＳＣ社製）を検出装置としてＸ線回折データを振動法にて測定した。このとき、セレンの異常散乱効果を用いて構造解析を行うために、波長は０．９７８９４Å、即ち、吸収端のピークでＳＡＤデータを収集した。振動角は１°／フレームであった。次に、回折強度データ処理プログラムＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒ(リガク社製)を使用して、回折強度データを分解能２．０Åで処理した。その結果、空間群がＰ１であり、格子定数がａ＝８３．０７Å、ｂ＝１０７．８７Å、ｃ＝７３．７９Å、α＝９０．２１°、β＝９１．８５°、γ＝８９．９２°であった。データ収集の結果を下記の表４にまとめた。
【００４２】
【表４】
【００４３】
実施例９
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶構造決定＞
次に、プログラムＳＯＬＶＥ（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｎｇｅｒ， Ｔ．Ｃ． ＆ Ｂｅｒｅｎｄｚｅｎ，Ｊ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ ５５，８４９−８６１（１９９９））を用いて、実施例８で得たデータを処理し、セレン原子の位置を決定し初期位相を計算した。位相の改良及び初期モデルの構築はプログラムＲＥＳＯＬＶＥ（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ, Ｔ．Ｃ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ５６，９６５−９７２（２０００））を用いた。次に、プログラムＣｏｏｔおよびＲｅｆｍａｃ５（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ４（ｃｃｐ４））を利用したモデルの構築および修正を繰り返し実施し、ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインおよびＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の結晶構造を決定した。ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン結晶の非対称単位中にはＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインが４分子存在していた。分解能２．２５Åの結晶構造において、Ｒ因子の値は、０．２４２であった。さらに、精密化の段階で計算に入れなかった全反射の５％に相当する構造因子から計算されるＲｆｒｅｅ因子の値は０．２８９であった。また、ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体結晶の非対称単位中にはＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインが８分子存在していた。ＳＡＤのデータを用いた分解能２．０Åの結晶構造において、Ｒ因子の値は、０．２２６であった。さらに、精密化の段階で計算に入れなかった全反射の５％に相当する構造因子から計算されるＲｆｒｅｅ因子の値は０．２６２であった。決定したＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの構造を図３に示す。すなわち、今回製造したＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶は高分解能での結晶構造解析に活用できる有用な結晶であった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明のＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶は新規な結晶であり、阻害剤の効率的な設計等に有効な結晶構造情報取得に利用できる良質の結晶であるため、産業上極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン結晶の顕微鏡写真である。
【図２】ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体結晶の顕微鏡写真である。
【図３】決定したＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの構造をリボン図で示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｘ線結晶構造解析および阻害剤の設計等に利用するためのペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインの結晶に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰと称する）は細菌における細胞壁を構成する構造ユニットであるムレインモノマーを基質として細胞壁ペプチドグリカンを組み立てる一連の酵素群であり、細菌のペプチドグリカンの重合および架橋反応に働く膜結合型のタンパク質である。インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）には数種類のＰＢＰが確認されているが、耐性菌として増加傾向にあるβ−ラクタマーゼ非産生アンピシリン耐性（ＢＬＮＡＲ）インフルエンザ菌においては、ＰＢＰ３における変異がβ−ラクタム薬の感受性低下に大きく関与している（非特許文献１）。また、配列番号２に示されるＲｄ株（ＡＴＣＣ５１９０７）由来ＰＢＰ３においては、アミノ酸残基番号３７７のメチオニン、３８５のセリン、３８９のロイシン、５１７のアルギニンおよび５２６のアスパラギンが各々イソロイシン、スレオニン、フェニルアラニン、ヒスチジンおよびリジンに置換された変異が薬剤耐性に重要であることが示唆されている（非特許文献２）。従って、ＰＢＰ３の立体構造を結晶構造解析により解明することは、耐性のメカニズムを説明するだけでなく、耐性菌に有効な新薬を創出する上でも非常に重要である。
【０００３】
インフルエンザ菌由来ＰＢＰ３は、細胞内ドメイン、膜貫通領域、Ｎ末端ドメインおよびトランスペプチダーゼドメインから構成される膜結合型タンパク質であり、細胞内ドメインおよび膜貫通領域を除去し、膜結合機能を喪失させたＰＢＰ３可溶性部分の調製方法が明らかになっているが（非特許文献３）、ＰＢＰ３可溶性部分からさらにＮ末端ドメインを除去したトランスペプチダーゼドメインの調製方法は未だ明らかとなっていない。
結晶化に関しては、膜結合部位を除去したＰＢＰ３可溶性部分を発現、精製、結晶化した報告があるが、Ｎ末端、Ｃ末端部位は具体的に言及がなかった。その報告では、結晶の写真を提示した上で、ある方向から結晶にＸ線を照射した場合には分解能３．５Å程度の回折点が得られたものの、Ｘ線を照射する向きによっては回折点の強度が弱かったために、新規な構造を決定するために必要な回折データを収集することは困難であったと口頭で発表していた（非特許文献４）。従って、結晶構造解析によりＰＢＰ３の立体構造を決定し、効率的な阻害剤の設計を可能とする高品質のＰＢＰ３結晶の創出が望まれている。
【０００４】
一般にタンパク質のＮ末端、Ｃ末端やループ領域は構造が揺らいでいる場合があり、その際には複数のコンフォメーションを取り得ることから、タンパク質の揺らいでいる領域の除去やドメインの切り出しは均一のコンフォメーションから構成される高分解能のＸ線回折能を有する結晶を作製するために有効な手段である（非特許文献５）。インフルエンザ菌ＰＢＰ３においては、結晶化に最適のトランスペプチダーゼドメインの領域は未だ明らかでなく、ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶は報告されていない。本発明者は、ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶は、揺らいでいる領域が少ないため高品質となること、及び、ＰＢＰ３の立体構造を解明することに多いに貢献できると考えた。
【非特許文献１】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４５（６）１６９３−１６９９（２００１）
【非特許文献２】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４９（７）２８３４−２８３９（２００５）
【非特許文献３】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４８（５）１６３０−１６３９（２００４）
【非特許文献４】朴 三用、「ペニシリン結合タンパク質の構造による新抗生物質の開発」、２００６年１２月１３日、横浜市立大学第３回産学連携フォーラム「横浜市立大学・蛋白質構造解析コンソーシアム合同シンポジウム―タンパク質研究から創薬へ―」予稿集
【非特許文献５】ＢＩＯベンチャー ３（５）、３６−３９（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまでインフルエンザ菌ＰＢＰ３の結晶構造は報告されていない。そのため、創薬において重要であるＰＢＰ３の立体構造情報が存在せず効率的な阻害剤の設計が困難である。また、ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶の製造方法は不明である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、結晶化に適したＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインを調製し、高品質の結晶を製造することで上記課題を解決する。
【０００７】
本発明者はインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインを調製する工程において、少なくとも５０ｍＭ以上の塩化ナトリウムを常に添加することにより、目的タンパク質の収量を向上させる方法を見出した。また、結晶化条件探索の試行錯誤により酒石酸および酒石酸塩（好ましくは酒石酸ナトリウムが挙げられる。）からなる酒石酸緩衝液の存在下で成長するＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶を取得した。この結晶は少なくとも２．０Åの分解能までＸ線解析が可能である高品質の結晶であり、創薬研究に重要なＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの立体構造を決定した。
すなわち、本発明はＸ線結晶構造解析および阻害剤の設計等に利用するためのＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶に関する。
本発明によるＰＢＰ３の結晶は、具体的には、空間群がＰ１である。
より具体的には下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかの空間群および格子定数を有する。
（ａ）空間群がＰ１であり、格子定数がａ＝７４±７Å、ｂ＝８２±８Å、ｃ＝５４±５Å、α＝１０８±１１°、β＝９９±１０°、γ＝８２±８°
（ｂ）空間群がＰ１であり、格子定数がａ＝８３±８Å、ｂ＝１０８±１１Å、ｃ＝７４±７Å、α＝９０±９°、β＝９２±９°、γ＝９０±９°
【０００８】
本発明は以下の発明を含有する。
（１）ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）に属する微生物由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインの結晶。
（２）インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインの結晶。
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質から構成される（１）から（２）のいずれか一つに記載の結晶。
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する相同タンパク質から構成される（１）から（２）のいずれか一つに記載の結晶。
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する改変タンパク質から構成される（１）から（２）のいずれか一つに記載の結晶。
（６）空間群がＰ１である（１）から（５）のいずれか一項に記載の結晶。
（７）空間群がＰ１であり、格子定数がａ＝７４±７Å、ｂ＝８２±８Å、ｃ＝５４±５Å、α＝１０８±１１°、β＝９９±１０°、γ＝８２±８°である（１）から（５）のいずれか一つに記載の結晶。
（８）空間群がＰ１であり、格子定数がａ＝８３±８Å、ｂ＝１０８±１１Å、ｃ＝７４±７Å、α＝９０±９°、β＝９２±９°、γ＝９０±９°である（１）から（５）のいずれか一つに記載の結晶。
（９）（１）から（８）のいずれか一つに記載の結晶であって、該結晶を構成するタンパク質中の少なくとも１つのメチオニン残基がセレノメチオニンに置換されている結晶。
（１０）酒石酸または酒石酸塩の存在下で成長する（１）から（９）のいずれか一つに記載の結晶。
（１１）酒石酸塩が酒石酸ナトリウムである（１０）に記載の結晶。
（１２）（ｉ）少なくとも５０ｍＭ以上の塩化ナトリウムを常に添加した状態でアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを実施し、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインを調製する工程、並びに
（ｉｉ）酒石酸または酒石酸塩の存在下で、ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインを結晶化する工程
を含む、（１）から（１１）のいずれか一つに記載の結晶の製造方法。
（１３）少なくとも３．２Åの分解能までＸ線解析が可能である、（１）から（１１）のいずれか一つに記載の結晶。
（１４）少なくとも２．７Åの分解能までＸ線解析が可能である、（１）から（１１）のいずれか一つに記載の結晶。
（１５）少なくとも２．３Åの分解能までＸ線解析が可能である、（１）から（１１）のいずれか一つに記載の結晶。
（１６）少なくとも２．０Åの分解能までＸ線解析が可能である、（１）から（１１）のいずれか一つに記載の結晶。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶は、高分解能での結晶構造解析に利用可能であり、ＰＢＰ３を阻害する化合物の効率的な設計等に活用できるため、創薬において極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン＞
本発明のＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインを構成するタンパク質は、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）に属するインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来のタンパク質である。また、本発明において、「トランスペプチダーゼ」とは、細菌細胞壁の一つの成分であるペプチドグリカンの生合成の最終段階に関与し、ペプチドグリカン連鎖を構成しているＮ−アセチルムラミン酸から伸びるポリペプチド鎖の架橋を触媒する酵素を意味する。
さらに、「トランスペプチダーゼドメイン」とは、上記ポリペプチド鎖を架橋する能力を有し、β−ラクタム薬との結合が可能であるタンパク質、及び、活性残基である配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基番号３２７のセリンに変異を導入し上記ポリペプチド鎖を架橋する能力を失活させたタンパク質の構造単位であり、細胞内ドメイン、膜貫通領域、Ｎ末端ドメインを除去したタンパク質である。
本発明における「相同タンパク質」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインからなるタンパク質である。ここで示した相同性の数値は、当業者に公知の相同性検索プログラムであるＦＡＳＴＡ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４−２４４８（１９８８）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値を示す。
本発明における「改変タンパク質」とは、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインからなるタンパク質である。ここで、「置換、欠失、付加もしくは挿入」などの改変に係るアミノ酸の数は、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１２個である。
【００１１】
ＰＢＰ３は、細胞内ドメイン、膜貫通領域、Ｎ末端ドメインおよびトランスペプチダーゼドメインから構成される膜結合型タンパク質である。ＰＢＰ３可溶性部分とは、細胞内ドメインおよび膜貫通領域を除去し、膜結合機能を喪失させたＰＢＰ３である。ＰＢＰ３可溶性部分は由来となる株およびＮ末端およびＣ末端が異なる種々のものが存在可能であるが、インフルエンザ菌においては、好ましくは、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基番号６７から６１０に相当するアミノ酸で構成される。
ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインは、ＰＢＰ３可溶性部分からさらにＮ末端ドメインを除去したものであり、除去する領域の違いにより種々のものが存在可能である。ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインとしては、配列番号２においてアミノ酸番号２２５〜２６２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５６６〜６０７のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる配列からなるタンパク質が好ましい。また、より好ましくは配列番号２においてアミノ酸番号２３５、２４２、２４９、２５２のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸から始まり、アミノ酸番号５７６、５８１、５８６、５９３、５９７のいずれか一つのアミノ酸またはそれに相当するアミノ酸で終わる配列からなるタンパク質であり、さらに好ましくは配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００１２】
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの発現＞
ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインは、それをコードするＤＮＡ断片を、宿主細胞内で複製可能でかつ同遺伝子が発現可能な状態で含むＤＮＡ分子、特にＤＮＡ発現ベクターの形態とし、それによって宿主細胞の形質転換を行い、その形質転換体を培養することによって得られる。このＤＮＡ分子は、ベクター分子にＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインをコードするＤＮＡ断片を組み込むことによって得ることができる。
本発明の好ましい態様によれば、このベクターはプラスミドである。本発明において利用されるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案して、ウィルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択することができる。例えば宿主細胞が大腸菌の場合はｐＵＣ、ｐＢＲ系のプラスミド、枯草菌の場合はｐＵＢ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＲｐ、ＹＣｐ系のプラスミドベクターが挙げられる。宿主細胞としては、宿主−ベクター系が確立されているものであれば利用可能であり、好ましくは大腸菌が挙げられる。宿主細胞の形質転換により得られた形質転換体は、適当な条件で培養し、得られた形質転換体の細胞抽出液を慣用の方法に従い回収することができる。ここで、ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインに付加的ポリペプチド、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはヒスチジン残基に富むポリペプチド（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を融合タンパク質として発現することも慣用の技術により可能である。
【００１３】
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの精製＞
大腸菌で発現させたＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインは、慣用のクロマトグラフィーの技術により精製が可能である。Ｈｉｓ−ｔａｇを付加して発現させた場合はニッケルイオンを固定化したアフィニティーカラムにより精製が可能であり、タグを付加しない場合においても、イオン交換カラム、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ等の色素を利用したブルーカラム、ヘパリンカラム、ハイドロキシアパタイトカラム、疎水性相互作用カラムやゲルろ過カラム等を組み合わせることで精製できる。また、少なくとも５０ｍＭ以上の塩化ナトリウムを常に添加した状態で精製することにより、目的タンパク質の安定性を担保し、収量を向上させることが可能である。
【００１４】
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶化＞
一般的にタンパク質の結晶化は容易ではない。結晶化できる条件が比較的容易に見出される場合もあるが、通常は種々の結晶化条件をスクリーニングしなければならない。さらに結晶化剤の濃度、ｐＨ、塩の種類と濃度、添加剤などの条件を最適化することによって、Ｘ線結晶構造解析に供することができる良質の結晶が得られる。また、いかなる条件でも結晶化しない蛋白質も存在すると考えられている。タンパク質の結晶が得られなければＸ線結晶構造解析を行うことができない。また、Ｘ線結晶構造解析に用いるタンパク質の結晶は、結晶であればいかなるものでも解析可能であるわけではない。実際にＸ線を照射した際に、高分解能の回折強度データが得られることが必要である。
本発明によるＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶を得る方法は、蒸気拡散法（例えば、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法などが挙げられる）、バッチ法、透析法または自由界面拡散法などのいかなる方法を用いてもよく、好ましくは蒸気拡散法が挙げられ、さらに好ましくはシッティングドロップ法が挙げられる。本発明者の得た知見によれば、ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶はクラスター化する傾向にあるため、シーディング法により良質の単結晶を得ることが好ましい。結晶化の温度は４℃〜３０℃が一般的であるが、本発明では好ましくは１０〜２５℃、さらに好ましくは、２０℃である。
本発明の好ましい態様によれば、結晶化に用いるタンパク質としては配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましい。また、前記タンパク質中のメチオニン残基がセレノメチオニンに置換されたセレノメチオニン置換体も同様に結晶化に用いられる。結晶化に用いる精製タンパク質の濃度は、４〜２０ｍｇ／ｍＬ程度であることが好ましい。そして、蛋白質溶液に結晶化剤、塩類、緩衝液、添加剤などを適当量加えて、結晶化を行う。本発明のＰＢＰ３の結晶化に用いられる結晶化剤としては、硫酸アンモニウムなどの無機塩類、ポリエチレングリコールなどの水溶性高分子、イソプロパノールやエタノールなどの有機溶媒などが挙げられる。好ましくは、、ポリエチレングリコールなどである。
また、緩衝液としては、公知の緩衝液のいずれも用いることができる。好ましくは酒石酸および酒石酸塩からなる酒石酸緩衝液であり、さらに好ましくは、酒石酸および酒石酸ナトリウムからなる酒石酸緩衝液（ｐＨ ３．０−６．２）である。
さらに添加剤としては、種々の金属イオン、有機溶媒、還元剤等を用いることができる。セレノメチオニン置換体の場合には未置換体の場合における周辺の条件で結晶を作製できるが、セレン原子の酸化を抑制するためにジチオスレイトール等の還元剤を添加することが好ましい。還元剤を除く結晶化剤の組み合わせとしては、
（１）９−２７％ ポリエチレングリコール４０００、０−０．３Ｍ 酢酸マグネシウム、０．１Ｍ 酒石酸緩衝液 ｐＨ ５．０−６．０、
（２）３−１０％ ポリエチレングリコール４０００、５％ ２−プロパノール、０．１Ｍ 酒石酸緩衝液 ｐＨ ５．０−６．０、
（３）１６．７５％ ポリエチレングリコール４００、１３．４％ ポリエチレングリコール３３５０、０．１Ｍ 塩化マグネシウム、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ８．５、
（４）２０％ ポリエチレングリコール３３５０、０．２Ｍ 酒石酸カリウム緩衝液 ｐＨ ８．５、
（５）０．８Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ４．６、
（６）１Ｍ リン酸アンモニウム、０．１Ｍ 酒石酸緩衝液 ｐＨ ５．６、
（７）１５％ ポリエチレングリコール３３５０、０．１Ｍ コハク酸緩衝液ｐＨ ７．０、
（８）２０％ ポリエチレングリコール３３５０、マロン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ７．０
等が挙げられる。とりわけ（１）または（２）の組み合わせが好ましい。
【００１５】
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン結晶のＸ線回折強度データの収集＞
上記のようにして得られる結晶の外観、単位格子の種類・大きさなどはその結晶に固有のものであり、良質の結晶を用いれば、Ｘ線回折実験により高分解能の回折強度データを取得することができる。結晶を、多価アルコールを含有する抗凍結溶液中に浸した後凍結させ、凍結状態でＸ線回折データを収集し、Ｘ線回折像を得た。ここで、多価アルコールとしては、エチレングリコール、スクロース、トレハロース、グリセロールなどが挙げられる。これらの中で特にエチレングリコールが好ましい。抗凍結溶液中の多価アルコールの濃度は、好ましくは１０〜３５％である。Ｘ線を照射して回折強度データを取得するには、いかなるＸ線発生装置を用いることができるが、好ましくは、（財）高輝度光科学研究センターの大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８や大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構Ｐｈｏｔｏｎ Ｆａｃｔｏｒｙなどの放射光施設を利用することができる。得られたＸ線回折強度データを処理することにより、結晶学的パラメータを特定することが可能である。
前記結晶化剤の組み合わせの（１）で得られるＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶は、空間群がＰ１である。また、格子定数はａ＝７４±７Å、ｂ＝８２±８Å、ｃ＝５４±５Å、α＝１０８±１１°、β＝９９±１０°、γ＝８２±８°であり、より好ましくはａ＝７４±４Å、ｂ＝８２±４Å、ｃ＝５４±３Å、α＝１０８±５°、β＝９９±５°、γ＝８２±４°であり、さらに好ましくはａ＝７４±１Å、ｂ＝８２±１Å、ｃ＝５４±１Å、α＝１０８±１°、β＝９９±１°、γ＝８２±１°である。
また、前記組み合わせ（２）に１ｍＭ ジチオスレイトールを添加して得られるＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の結晶は、空間群がＰ１である。また、格子定数はａ＝８３±８Å、ｂ＝１０８±１１Å、ｃ＝７４±７Å、α＝９０±９°、β＝９２±９°、γ＝９０±９°であり、より好ましくはａ＝８３±４Å、ｂ＝１０８±５Å、ｃ＝７４±４Å、α＝９０±５°、β＝９２±５°、γ＝９０±５°であり、さらに好ましくはａ＝８３±１Å、ｂ＝１０８±１Å、ｃ＝７４±１Å、α＝９０±１°、β＝９２±１°、γ＝９０±１°である。
【００１６】
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶構造の決定＞
上記のように得られたデータを用いてＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶構造の決定が可能となる。一般に位相決定には、分子置換法、重原子同型置換法、多波長異常分散法（ＭＡＤ法）、単波長異常分散法（ＳＡＤ法）などが用いられる。目的蛋白質に対する類縁蛋白質の立体構造が未知あるいは相同性が低い場合には、その立体構造を利用した分子置換法による構造解析が不可能であるため、ＰＢＰ３結晶構造の決定には、重原子同型置換法、ＭＡＤ法またはＳＡＤ法などが好ましく、より好ましくはセレノメチオニン置換体結晶を用いたＭＡＤ法またはＳＡＤ法が用いられる。
【００１７】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は実施例によって限定されるものではない。また、各種ベクターの作製、蛋白質の発現等は、特に記載のない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ著，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ刊（２００１））などに記載の公知の手法に従って実施できる。
【実施例】
【００１８】
実施例１
＜インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインをコードする遺伝子の構築＞
インフルエンザ菌ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインをコードするＤＮＡを単離するため以下のプライマーを設計した。
【００１９】
ＨＩ−ＰＢＰ３−２５２−５：５’−ｃａｇｃｃａｔａｔｇｇｔｔａｃｃｔｔａａｇｔａｔｃｇａｔｇａａａａａｔｔｇｃ−３’（配列番号３）
ＨＩ−ＰＢＰ３−５８１−３：５’−ｃｃｃｃｔｃｇａｇｔｔａｃｇｇａａｔａｇｃａｔｔｔｇｃａｃｇ−３’（配列番号４）
【００２０】
インフルエンザ菌Ｒｄ株ＰＢＰ３可溶性部分をコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドＤＮＡを鋳型に、前記プライマーを組み合わせて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を添付の説明書に従い実施した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素で消化し、この断片を予め制限酵素で切断したベクターｐＥＴ−２１ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を添付の説明書の方法に従い用い、サブクローニングした。得られた組換えプラスミドを大腸菌ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付の説明書の方法に従い導入し、形質転換体を得た。形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ ａｇａｒプレート上にて、３７℃で一晩培養し、薬剤耐性コロニーを取得した。取得したコロニーから組換えプラスミドｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿ＨＩ＿２５２−５８１を調製した。
【００２１】
実施例２
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの発現＞
実施例１記載の組み換えプラスミドｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿ＨＩ＿２５２−５８１を大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＳＢ培地（１．２％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、２．４％（ｗ／ｖ）Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０７２Ｍ リン酸水素二カリウム、０．０２８Ｍ リン酸二水素カリウム）中で６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が０．５−１に達するまで増殖させた。終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２０℃で一晩誘導後、遠心分離機によって集菌し、菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した後、再度、遠心分離機によって集菌し、−２０℃で凍結保存した。菌体を菌体破砕バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ８．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ、０．０５ｍｇ／ｍＬ リゾチーム）に懸濁し、氷上で３０分インキュベートした。超音波処理を施し、細胞を破砕し、遠心分離とそれに続く０．２μｍのフィルターによって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。
【００２２】
実施例３
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の発現＞
メチオニンの硫黄原子が重原子であるセレンに置換されたＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の発現を試みた。実施例１記載の組み換えプラスミドｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿ＨＩ＿２５２−５８１を大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地１００ｍＬにて、３７℃で一晩培養し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む４．８ＬのＬｅＭａｓｔｅｒ培地（組成は下記の表１に示す）に２４ｍＬ接種し、６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が約０．５に達するまで増殖させた。終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２０℃で一晩誘導後、遠心分離機によって集菌し、菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）２００ｍＬに懸濁した後、再度、遠心分離機によって集菌し、−２０℃で凍結保存した。菌体を菌体破砕バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ リゾチーム）に懸濁し、氷上で３０分インキュベートした。超音波処理を施し、細胞を破砕し、遠心分離とそれに続く０．２μｍのフィルターによって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。
【００２３】
【表１】
【００２４】
実施例４
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの精製＞
（１）陰イオン交換カラムによる精製
以下の精製操作はすべて４℃で行った。実施例２の方法で得られた細胞抽出液を陰イオン交換クロマトグラフィーで精製した。ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ ５ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を２本直列に連結して用いた。平衡化バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ８．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で平衡化した後、流速２．５ｍＬ／ｍｉｎでサンプルをアプライし、流速４ｍＬ／ｍｉｎで約３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ８．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の０−１０００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１００ｍＬ）で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより主要なフラクションをまとめて回収した。
【００２５】
（２）ブルーカラムによる精製
上記（１）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ 塩化ナトリウム）に対して透析した後、ＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅ ＨＰ ５ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は４ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の２００−２０００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１０カラム容量）で溶出し主要な溶出画分をまとめた。
【００２６】
（３）ヘパリンカラムによる精製
上記（２）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ 塩化ナトリウム）に対して透析した後、ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰ ５ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は４ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の５０−２０００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１０カラム容量）で溶出し主要な溶出画分をまとめた。
【００２７】
（４）陽イオン交換カラムによる精製
上記（３）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ 塩化ナトリウム）に対して透析した後、ＭｏｎｏＳ ＨＲ１０／１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は４ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の５０−４４０ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１０カラム容量）で溶出し主要な溶出画分をまとめ、保持分子量３００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ ３０，０００ ＭＷＣＯ（ミリポア社製）を用いてタンパク質濃度１５ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。大腸菌培養液４００ｍＬから１．５ｍｇのＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインを精製した。
【００２８】
実施例５
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの精製方法の改良＞
実施例４（１）陰イオン交換カラムによる精製では、塩化ナトリウムを添加しない条件でサンプルをカラムに吸着させていたが、塩化ナトリウム濃度が低い状態ではＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインは沈殿し易い傾向があったため、精製方法の改良を実施した。
【００２９】
（１）ブルーカラムによる精製
以下の精製操作はすべて４℃で行った。実施例２において、菌体破砕バッファーを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９、２００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ リゾチームに変更して得られた細胞抽出液をＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ４８ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は２．５ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、５カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の２００−２０００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１０カラム容量）で溶出し主要な溶出画分をまとめた。
【００３０】
（２）ヘパリンカラムによる精製
上記（１）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム）に対して透析した後、ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰ ５ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を２本直列に連結し、また、サンプルを８回に分けて精製した。流速は３ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の１５０−５７０ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（６カラム容量）で溶出し主要な溶出画分をまとめた。
【００３１】
（３）陽イオン交換カラムによる精製
上記（２）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム）に対して透析した後、ＭｏｎｏＳ ＨＲ１０／１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて、また、サンプルを８回に分けて精製した。流速は４ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の１５０−３５０ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（６．４カラム容量）で溶出し主要な溶出画分をまとめ、保持分子量３００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ ３０，０００ ＭＷＣＯ（ミリポア社製）を用いてタンパク質濃度３０ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。大腸菌培養液２．４Ｌから３１ｍｇのＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインを精製し、実施例４と比較して約３．４倍収量が向上した。
【００３２】
実施例６
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の精製＞
（１）ブルーカラムによる精製
以下の精製操作はすべて４℃で行った。実施例３の方法で得られた細胞抽出液をＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ４８ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製した。流速は２．５ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール、２００ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール溶液中の２００−２０００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１０カラム容量）で溶出し主要な溶出画分をまとめた。
【００３３】
（２）ヘパリンカラムによる精製
上記（１）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール、８０ｍＭ 塩化ナトリウム）に対して透析した後、ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰ ５ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を２本直列に連結し、また、サンプルを４回に分けて精製した。流速は２．５ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール、１８６ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール溶液中の１８６−５４１ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（６カラム容量）で溶出し主要な溶出画分をまとめた。
【００３４】
（３）陽イオン交換カラムによる精製
上記（２）で精製したサンプルを透析バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール、１７６ｍＭ 塩化ナトリウム）に対して透析した後、ＭｏｎｏＳ ＨＲ１０／１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて、また、サンプルを４回に分けて精製した。流速は４ｍＬ／ｍｉｎであり、平衡化バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１７６ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ ７．５、１ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中の１７６−３６８ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（８カラム容量）で溶出し主要な溶出画分をまとめ、保持分子量１００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ １０，０００ ＭＷＣＯ（ミリポア社製）を用いてタンパク質濃度２５ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。
【００３５】
実施例７
＜結晶化＞
（１）ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶化
ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散法により得た。実施例４で精製し、その後５ｍｇ／ｍＬに希釈したタンパク質溶液０．５μＬを結晶化剤（１４％ ポリエチレングリコール４０００、０．２Ｍ 酢酸マグネシウム、０．１Ｍ 酒石酸緩衝液 ｐＨ ５．５）０．５μＬと混合し結晶化ドロップとし、リザーバー溶液として上記結晶化剤１００μＬ分注し密閉した。プレートを２０℃の恒温槽内で一晩静置した後、類似の条件で予め作製した結晶からストリークシーディング法によりドロップに種を植えて、更に２０℃の恒温槽内に静置して結晶を作製した。得られた結晶の顕微鏡写真の一例を図１に示す。
【００３６】
（２）ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の結晶化
ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散法により得た。実施例５で精製し、その後５ｍｇ／ｍＬに希釈したタンパク質溶液０．５μＬを結晶化剤（４％ ポリエチレングリコール４０００、５％ ２−プロパノール、０．１Ｍ 酒石酸緩衝液 ｐＨ ５．５、１ｍＭ ジチオスレイトール）０．５μＬと混合し結晶化ドロップとし、リザーバー溶液として上記結晶化剤１００μＬ分注し密閉した。プレートを２０℃の恒温槽内で数時間静置した後、類似の条件で予め作製した結晶からストリークシーディング法によりドロップに種を植えて、更に２０℃の恒温槽内に静置して結晶を作製した。得られた結晶の顕微鏡写真の一例を図２に示す。
【００３７】
実施例８
＜Ｘ線回折強度データの収集＞
（１）ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン結晶のデータ収集
実施例７（１）において得られた結晶を２０％エチレングリコール含有の抗凍結剤溶液に移した後、−１７０℃の窒素ガス気流にて急速凍結した。これを大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構Ｐｈｏｔｏｎ ＦａｃｔｏｒｙのビームラインＢＬ−１７Ａを利用しＱｕａｎｔｕｍ ２７０ ＣＣＤカメラ（ＡＤＳＣ社製）を検出装置としてＸ線回折データを振動法にて測定した。Ｘ線の波長は１Å、振動角は１°／フレームであった。次に、回折強度データ処理プログラムＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒ(リガク社製)を使用して、回折強度データを分解能２．０Åで処理した。その結果、空間群がＰ１であり、格子定数がａ＝７３．８２Å、ｂ＝８２．２０Å、ｃ＝５４．３０Å、α＝１０７．９０°、β＝９８．８４°、γ＝８２．０５°であった。得られたデータのＣｏｍｐｌｅｔｅｎｅｓｓは８７．１％、Ｒｍｅｒｇｅは７．１％であった。データ収集の結果を下記の表２にまとめた。
【００３８】
【表２】
【００３９】
（２）ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体結晶の多波長異常分散（ＭＡＤ）データの収集
実施例７（２）において得られた結晶を３０％エチレングリコール含有の抗凍結剤溶液に移した後、−１７０℃の窒素ガス気流にて急速凍結した。これを大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構Ｐｈｏｔｏｎ ＦａｃｔｏｒｙのビームラインＢＬ−１７Ａを利用しＱｕａｎｔｕｍ ２７０ ＣＣＤカメラ（ＡＤＳＣ社製）を検出装置としてＸ線回折データを振動法にて測定した。このとき、セレンの異常散乱効果を用いて構造解析を行うために、波長は０．９７９３１、０．９７８７４および０．９６４０８Åの３波長、即ち、吸収端のエッジ、ピーク、リモートの３カ所でＭＡＤデータを収集した。振動角は１°／フレームであった。次に、回折強度データ処理プログラムＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒ(リガク社製)を使用して、回折強度データを分解能２．０Åで処理した。その結果、空間群がＰ１であり、格子定数がａ＝８２．９８Å、ｂ＝１０７．６６Å、ｃ＝７３．６９Å、α＝９０．１１°、β＝９１．８２°、γ＝８９．９１°であった。データ収集の結果を下記の表３にまとめた。
【００４０】
【表３】
【００４１】
（３）ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体結晶の単波長異常分散（ＳＡＤ）データの収集
実施例７（２）において得られた結晶を３５％エチレングリコール含有の抗凍結剤溶液に移した後、−１７０℃の窒素ガス気流にて急速凍結した。これを大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構Ｐｈｏｔｏｎ ＦａｃｔｏｒｙのビームラインＢＬ−１７Ａを利用しＱｕａｎｔｕｍ ２７０ ＣＣＤカメラ（ＡＤＳＣ社製）を検出装置としてＸ線回折データを振動法にて測定した。このとき、セレンの異常散乱効果を用いて構造解析を行うために、波長は０．９７８９４Å、即ち、吸収端のピークでＳＡＤデータを収集した。振動角は１°／フレームであった。次に、回折強度データ処理プログラムＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒ(リガク社製)を使用して、回折強度データを分解能２．０Åで処理した。その結果、空間群がＰ１であり、格子定数がａ＝８３．０７Å、ｂ＝１０７．８７Å、ｃ＝７３．７９Å、α＝９０．２１°、β＝９１．８５°、γ＝８９．９２°であった。データ収集の結果を下記の表４にまとめた。
【００４２】
【表４】
【００４３】
実施例９
＜ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶構造決定＞
次に、プログラムＳＯＬＶＥ（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｎｇｅｒ， Ｔ．Ｃ． ＆ Ｂｅｒｅｎｄｚｅｎ，Ｊ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ ５５，８４９−８６１（１９９９））を用いて、実施例８で得たデータを処理し、セレン原子の位置を決定し初期位相を計算した。位相の改良及び初期モデルの構築はプログラムＲＥＳＯＬＶＥ（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ, Ｔ．Ｃ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ５６，９６５−９７２（２０００））を用いた。次に、プログラムＣｏｏｔおよびＲｅｆｍａｃ５（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ４（ｃｃｐ４））を利用したモデルの構築および修正を繰り返し実施し、ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインおよびＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体の結晶構造を決定した。ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン結晶の非対称単位中にはＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインが４分子存在していた。分解能２．２５Åの結晶構造において、Ｒ因子の値は、０．２４２であった。さらに、精密化の段階で計算に入れなかった全反射の５％に相当する構造因子から計算されるＲｆｒｅｅ因子の値は０．２８９であった。また、ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体結晶の非対称単位中にはＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインが８分子存在していた。ＳＡＤのデータを用いた分解能２．０Åの結晶構造において、Ｒ因子の値は、０．２２６であった。さらに、精密化の段階で計算に入れなかった全反射の５％に相当する構造因子から計算されるＲｆｒｅｅ因子の値は０．２６２であった。決定したＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの構造を図３に示す。すなわち、今回製造したＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶は高分解能での結晶構造解析に活用できる有用な結晶であった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明のＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの結晶は新規な結晶であり、阻害剤の効率的な設計等に有効な結晶構造情報取得に利用できる良質の結晶であるため、産業上極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメイン結晶の顕微鏡写真である。
【図２】ＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインのセレノメチオニン置換体結晶の顕微鏡写真である。
【図３】決定したＰＢＰ３トランスペプチダーゼドメインの構造をリボン図で示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）に属する微生物由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインの結晶。
【請求項２】
インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインの結晶。
【請求項３】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質から構成される請求項１または２のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する相同タンパク質から構成される請求項１または２のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項５】
配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する改変タンパク質から構成される請求項１または２のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項６】
空間群がＰ１である請求項１から５のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項７】
空間群がＰ１であり、格子定数がａ＝７４±７Å、ｂ＝８２±８Å、ｃ＝５４±５Å、α＝１０８±１１°、β＝９９±１０°、γ＝８２±８°である請求項１から５のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項８】
空間群がＰ１であり、格子定数がａ＝８３±８Å、ｂ＝１０８±１１Å、ｃ＝７４±７Å、α＝９０±９°、β＝９２±９°、γ＝９０±９°である請求項１から５のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の結晶であって、該結晶を構成するタンパク質中の少なくとも１つのメチオニン残基がセレノメチオニンに置換されている結晶。
【請求項１０】
酒石酸または酒石酸塩の存在下で成長する請求項１から９のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１１】
酒石酸塩が酒石酸ナトリウムである請求項１０に記載の結晶。
【請求項１２】
（ｉ）少なくとも５０ｍＭ以上の塩化ナトリウムを常に添加した状態でアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを実施し、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインを調製する工程、並びに
（ｉｉ）酒石酸または酒石酸塩の存在下で、ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインを結晶化する工程
を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の結晶の製造方法。
【請求項１３】
少なくとも３．２Åの分解能までＸ線解析が可能である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１４】
少なくとも２．７Åの分解能までＸ線解析が可能である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１５】
少なくとも２．３Åの分解能までＸ線解析が可能である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１６】
少なくとも２．０Åの分解能までＸ線解析が可能である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１】
ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）に属する微生物由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインの結晶。
【請求項２】
インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインの結晶。
【請求項３】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質から構成される請求項１または２のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する相同タンパク質から構成される請求項１または２のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項５】
配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでおり、かつトランスペプチダーゼドメインを有する改変タンパク質から構成される請求項１または２のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項６】
空間群がＰ１である請求項１から５のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項７】
空間群がＰ１であり、格子定数がａ＝７４±７Å、ｂ＝８２±８Å、ｃ＝５４±５Å、α＝１０８±１１°、β＝９９±１０°、γ＝８２±８°である請求項１から５のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項８】
空間群がＰ１であり、格子定数がａ＝８３±８Å、ｂ＝１０８±１１Å、ｃ＝７４±７Å、α＝９０±９°、β＝９２±９°、γ＝９０±９°である請求項１から５のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の結晶であって、該結晶を構成するタンパク質中の少なくとも１つのメチオニン残基がセレノメチオニンに置換されている結晶。
【請求項１０】
酒石酸または酒石酸塩の存在下で成長する請求項１から９のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１１】
酒石酸塩が酒石酸ナトリウムである請求項１０に記載の結晶。
【請求項１２】
（ｉ）少なくとも５０ｍＭ以上の塩化ナトリウムを常に添加した状態でアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを実施し、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインを調製する工程、並びに
（ｉｉ）酒石酸または酒石酸塩の存在下で、ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）３トランスペプチダーゼドメインを結晶化する工程
を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の結晶の製造方法。
【請求項１３】
少なくとも３．２Åの分解能までＸ線解析が可能である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１４】
少なくとも２．７Åの分解能までＸ線解析が可能である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１５】
少なくとも２．３Åの分解能までＸ線解析が可能である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項１６】
少なくとも２．０Åの分解能までＸ線解析が可能である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の結晶。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−２９２７７６（Ｐ２００９−２９２７７６Ａ）
【公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１４８７０１（Ｐ２００８−１４８７０１）
【出願日】平成２０年６月６日（２００８．６．６）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月６日（２００８．６．６）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
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