ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別に有用なＳＳＲプライマー対及びその利用
【課題】簡便、迅速かつ正確にペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別を行うためのプライマー対、特定マーカー遺伝子及びその品種識別方法を提供する。
【解決手段】ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのゲノム上のＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて設計したプライマー対、対象となるペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの遺伝子をバルクすることで個体間の遺伝子のばらつきを無くし、品種特異的なＳＳＲをＰＣＲで特異的に増幅させた識別対象の遺伝子の特定マーカーの塩基配列、及び増幅された遺伝子断片の長さの違いを検出することで、品種の識別を行う方法。
【効果】従来の形態形質及び出穂期などの品種区別法と比べて、必要とする工程数が少なく、複数個体のバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用するペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別方法を提供することができる。
【解決手段】ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのゲノム上のＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて設計したプライマー対、対象となるペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの遺伝子をバルクすることで個体間の遺伝子のばらつきを無くし、品種特異的なＳＳＲをＰＣＲで特異的に増幅させた識別対象の遺伝子の特定マーカーの塩基配列、及び増幅された遺伝子断片の長さの違いを検出することで、品種の識別を行う方法。
【効果】従来の形態形質及び出穂期などの品種区別法と比べて、必要とする工程数が少なく、複数個体のバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用するペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別方法を提供することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別用のプライマー及びその利用に関するものであり、更に詳しくは、ペレニアルライグラス７品種及びハイブリッドライグラス１品種の合計８品種を識別することを可能とする、特定のＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦプライマー及びＲプライマー対、及びその利用に関するものである。本発明は、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別用のＳＳＲプライマー、及び該プライマーを利用してイタリアンライグラス及びハイブリッドライグラスのゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅させた特定マーカー遺伝子、その増幅断片を比較することで品種を識別することを可能とするペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス品種の識別方法に関する新技術・新製品を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
ペレニアルライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ Ｌ．）及びハイブリッドライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ ｘ ｂｏｕｃｈｅａｎｕｍ Ｋｕｎｔｈ）は、主に飼料作物として利用される多年生の他殖性のイネ科植物である。先行技術として、主に飼料作物として利用される他殖性のイネ科牧草の品種識別法としては、イタリアンライグラスにおいて、１２品種を識別する方法が開発されている（特許文献１参照）。
【０００３】
この方法は、イタリアンライグラスのゲノム上のＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域をＰＣＲで増幅させ、増幅された断片の長さの違いを検出することで品種を識別するものである。しかし、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスにおいては、このような品種識別法が開発されていない。
【０００４】
このため、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別は、これまで、圃場での特性調査により行われてきた。圃場での特性調査とは、例えば、一検体につき１０個体６反復計６０個体を栽培し、草丈、出穂月日、草型、葉身長等の形質を調査し、共に栽培した６０個体の標準個体と比較して同品種かどうか判定を行う方法である。しかしながら、このような圃場での特性調査は、１）調査のための圃場が必要である、２）調査に多くの労力が必要である、３）調査結果が判明するまでに多くの時間が必要である、等の問題点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−２３７１８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、短期間で、簡便且つ正確にペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス８品種を識別できる新しい手法を開発することを目標として鋭意研究を重ねた結果、イタリアンライグラス及びペレニアルライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて作成したプライマーから増幅されるマーカーを用いることにより所期の目的を達成し得ることを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は、労力及び時間が必要な従来の圃場での特性調査に代わり、短期間で、簡便且つ正確にペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別を可能にするＰＣＲ用のプライマー対、該プライマー対を利用して、ＰＣＲ増幅させた特定マーカー遺伝子、及び該特定マーカーを利用したペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別用のプライマーであって、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対。
（２）イタリアンライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両端の塩基配列を用いて設計した遺伝子増幅用プライマー対であって、配列表の配列番号１〜８のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号９〜１６のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを１対とするプライマー対である、前記（１）に記載のプライマー対。
（３）ペレニアルライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両端の塩基配列を用いて設計した遺伝子増幅用プライマー対であって、配列表の配列番号１７〜２２のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号２３〜２８のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを１対とするプライマー対である、前記（１）に記載のプライマー対。
（４）前記（２）及び（３）に記載のプライマー対の単数又は複数の組合せからなることを特徴とするペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別用プライマーセット。
（５）前記（１）から（４）のいずれかに記載のプライマーを利用してペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域をＰＣＲ増幅させたことを特徴とする特定マーカー遺伝子。
（６）配列表の配列番号２９〜３６のいずれかの塩基配列を有する、前記（５）に記載の特定マーカー遺伝子。
（７）ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する前記（１）から（４）のいずれかに記載のプライマーから増幅されるマーカーを使用し、識別対象のペレニアルライグラス又はハイブリッドライグラスＤＮＡのＰＣＲ増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うことを特徴とするペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別方法。
（８）識別対象のペレニアルライグラス又はハイブリッドライグラス遺伝子のＰＣＲ増幅産物である特定マーカー遺伝子のサイズ又はバンドパターンに基づいて、品種の識別を行うことを特徴とするペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別方法。
（９）対象品種のバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用したペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に、数品種の識別を行う、前記（７）又は（８）に記載の方法。
（１０）エバガード、カリブラ、トーブ、ポコロ、ヤツカゼ、ヤツカゼ２、ヤツユタカの７品種からなるペレニアルライグラス、及びハイフローラの１品種からなるハイブリッドライグラスの合計８品種を識別する、前記（７）から（９）のいずれかに記載の方法。
【０００９】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別用のプライマーであって、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対の点に特徴を有するものである。また、本発明は、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別方法であって、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する上記のプライマーから増幅されるマーカーを使用し、識別対象のペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスＤＮＡのＰＣＲによる増幅を行い、その増幅産物の多型を確認することで、品種の識別を行うことを特徴とするものである。
【００１０】
本発明では、イタリアンライグラス及びペレニアルライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて作成したプライマー対から、識別対象のペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス遺伝子の特定マーカーをＰＣＲ増幅し、そのマーカー遺伝子のサイズ又はバンドパターン（複数の遺伝子座のバンドの有無による組み合わせ）を確認することで、品種の識別を行う。
【００１１】
本発明では、個体単位での解析が不要となるため、対象品種のバルクＤＮＡを使用したペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に、数品種の識別を行う。他殖性であるペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスは、個体間で遺伝的に異なるが、バルクＤＮＡをテンプレートとして用いることによって、この品種の非特異的な個体間の差異を無くし、且つ効率よく、品種の識別が可能となる。
【００１２】
本発明では、２〜５塩基が高頻度に繰り返された配列からなるＳＳＲ領域の両側を挟むように設計した遺伝子増幅用プライマーの１４対のプライマー（表１参照）で、単数又は複数のプライマー対を使用し、対象となるペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス８品種について、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅断片を比較することで、品種を識別する。
【００１３】
本発明では、実際の使用時に、バルクＤＮＡをテンプレートとすることを想定し、品種特異的なＳＳＲマーカーを選抜するため、対象品種のゲノムＤＮＡを複数個体バルクしたＤＮＡをテンプレートとすることにより識別を行う。そのため、本発明では、例えば、濃度を一定にしたペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのＤＮＡを１０個体合わせて、バルクＤＮＡテンプレートとして使用する。
【００１４】
本発明で使用されるＳＳＲプライマー対は、プライマー設計ソフトウエア「Ｐｒｉｍｅｒ０．５，ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｒｉｍｅｒ０．５」を使用して作成した。本発明のペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別に有用なプライマー対の配列を表１に示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】
次に、上記表１の配列のプライマー対の９品種内での増幅型の詳細について説明する（表２参照）。プライマー「０４−０９Ｆ」は、エバガードを識別するプライマー対で、３５０ｂｐ付近で増幅しない、すなわち、品種特異的に特定ｂｐの増幅がみられない、というパターンを示す。
【００１７】
プライマー「０３−０４Ｅ」は、エバガードを識別するプライマー対で、３５０ｂｐ付近で増幅する、すなわち、品種特異的に特定ｂｐの増幅がある、というパターンを示す。
【００１８】
プライマー「１０−１０Ｃ」は、ヤツユタカを識別するプライマー対で、２５０ｂｐ付近で増幅する、というパターンを示す。
【００１９】
プライマー「Ａ０９Ａ１８」は、エバガードを識別するプライマー対で、１２０ｂｐ付近で増幅する、というパターンを示す。
【００２０】
プライマー「Ａ０９Ｆ１１」は、ハイフローラを識別するプライマー対で、３００ｂｐ付近で増幅する、というパターンを示す。
【００２１】
プライマー「Ｃ０７Ｈ０６」は、エバガードを識別するプライマー対で、２００ｂｐ付近で増幅する、というパターンを示す。
【００２２】
プライマー「Ｄ０２Ｃ２２」は、エバガード及びカリブラを識別するプライマー対で、１０００ｂｐ付近でエバガードが増幅しない、というパターンを示し、２００ｂｐ〜２５０ｂｐの間でカリブラが増幅する、というパターンを示す。
【００２３】
プライマー「Ｄ０９Ｍ２２」は、エバガードを識別するプライマー対で、２５０ｂｐ〜３００ｂｐの間で増幅しない、というパターンを示す。
【００２４】
プライマー「ＥＳ６９９１１８」は、ヤツカゼ２を識別するプライマー対で、１４０ｂｐ付近で増幅しない、というパターンを示す。しかし、同サイズで、エバガード及びヤツカゼも増幅しない、というパターンを示すため、「０４−０９Ｆ」、「０３−０４Ｅ」、「Ａ０９Ａ１８」、「Ｃ０７Ｈ０６」、「Ｄ０２Ｃ２２」のいずれかのプライマー対を使用して、エバガードと比較するとともに、「ＥＳ７００４０３」のプライマー対を使用して、ヤツカゼと比較する必要がある。
【００２５】
プライマー「ＥＳ６９９１２６」は、ポコロを識別するプライマー対で、２５０ｂｐ付近で増幅しない、というパターンを示す。しかし、同サイズで、エバガードも増幅しない、というパターンを示すため、「０４−０９Ｆ」、「０３−０４Ｅ」、「Ａ０９Ａ１８」、「Ｃ０７Ｈ０６」、「Ｄ０２Ｃ２２」のいずれかのプライマー対を使用して、エバガードと比較する必要がある。
【００２６】
プライマー「ＥＳ６９９６８９」は、ヤツユタカを識別するプライマー対で、２００ｂｐ付近で増幅する、というパターンを示す。
【００２７】
プライマー「ＥＳ６９９９８３」は、トーブを識別するプライマー対で、１６０ｂｐ〜２００ｂｐの間で増幅する、というパターンを示す。しかし、同サイズで、カリブラも増幅が見られることから、「Ｄ０２Ｃ２２」又は「ＥＳ６９９１６４」のプライマー対を使用して、カリブラと比較する必要がある。
【００２８】
プライマー「ＥＳ７００４０３」は、ヤツカゼを識別するプライマー対で、１５０ｂｐ付近で増幅しない、というパターンを示す。
【００２９】
プライマー「ＥＳ６９９１６４」は、カリブラを識別するプライマー対で、３００ｂｐ付近で増幅しない、というパターンを示す。上記のプライマーを９品種内で比較した場合、見られるバンドパターンを、次の表２にまとめて示す。
【００３０】
【表２】
【００３１】
本発明では、ペレニアルライグラスのエバガード、カリブラ、トーブ、フレンド（本発明に含まれていない）、ポコロ、ヤツカゼ、ヤツカゼ２、ヤツユタカ及びハイブリッドライグラスのハイフローラの９品種から、ＣＴＡＢ法を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出する。
【００３２】
抽出したゲノムＤＮＡ溶液は、一定濃度に調整し、１０個体を混合し、バルクしたものをＰＣＲ用のテンプレートＤＮＡとして使用する。
【００３３】
ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス対象品種から抽出したバルクＤＮＡを用いて、ＰＣＲ反応液を調製する。ＰＣＲ反応液及びＰＣＲ条件は、後記する実施例に示したものが好適であるが、これらに制限されるものではなく、使用する機器に応じて、適宜修正することができる。
【００３４】
ＰＣＲ増幅産物は、色素マーカーを加え、ディネーチャーを行った後、遮光し、氷上に静置して、安定化させる。次いで、アクリルアミドゲルを使用して、電気泳動を行い、マーカーの増幅を確認する。本発明では、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの９品種のバルクＤＮＡを使用して、電気泳動を行い、９品種内の複数の品種を同時に比較することができる。
【００３５】
本発明では、識別対象のペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス遺伝子の特定マーカーをＰＣＲ増幅し、そのマーカー遺伝子のサイズを確認することにより、又はバンドパターンを確認すること、すなわち、複数の遺伝子座のバンドの有無による組み合わせを確認することにより、品種の識別を実施する。本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を、図１５〜１９に示す。
【発明の効果】
【００３６】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）本発明により、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種を識別するペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのＳＳＲマーカーが提供される。
（２）単数又は複数のプライマー対を使用したＰＣＲによる識別対象の遺伝子を増幅させ、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを検証することにより、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別を行うことができる。
（３）本発明により、エバガード、カリブラ、トーブ、ポコロ、ヤツカゼ、ヤツカゼ２、ヤツユタカ、ハイフローラからなる８品種相互での品種識別を行うことができる。
（４）個体単位の解析ではなく、複数個体のＤＮＡを混合するバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとすることにより、解析時間の短縮及び正確な品種識別が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】実施例における０４−０９Ｆを用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。Ｍは、サイズマーカーを示す。それぞれ５サンプルの電気泳動した結果を示す。図２〜１４も同様である。
【図２】実施例における０３−０４Ｅを用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図３】実施例における１０−１０Ｃを用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図４】実施例におけるＡ０９Ａ１８を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図５】実施例におけるＡ０９Ｆ１１を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図６】実施例におけるＣ０７Ｈ０６を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図７】実施例におけるＤ０２Ｃ２２を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図８】実施例におけるＤ０９Ｍ２２を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図９】実施例におけるＥＳ６９９１１８を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１０】実施例におけるＥＳ６９９１２６を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１１】実施例におけるＥＳ６９９６８９を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１２】実施例におけるＥＳ６９９９８３を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１３】実施例におけるＥＳ７００４０３を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１４】実施例におけるＥＳ６９９１６４を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１５】本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【図１６】本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【図１７】本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【図１８】本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【図１９】本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
次に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
本実施例で使用した機器は、以下の通りである。
すなわち、本実施例では、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ （タカラバイオ株式会社）、及び、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を用いた。
【００４０】
本実施例で使用した試薬は、以下の通りである。
〈６％アクリルアミドゲル〉
アクリルアミドゲルとして、尿素（和光純薬工業株式会社）、アクリルアミド／ビス４０％溶液１９：１（日本バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社）、１０ｘＴＢＥ ｂｕｆｆｅｒ、１０％ＡＰＳ、ＴＥＭＥＤ（和光純薬工業株式会社）を用いた。
【００４１】
〈ＰＣＲ反応液〉
ＰＣＲ反応液として、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）、１ｐｍｏｌ／μｌ Ｍ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ（−２９）Ｐｒｉｍｅｒ：ＩＲＤ７００もしくはＩＲＤ８００の蛍光標識を含む（日清紡）を用いた。色素マーカーとしては、ＧｅｎｅＳｃａｎ ５００（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）又は１００ｂｐ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｒｕｌｅｒ（日本バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社）を用いた。
【００４２】
本実施例では、ペレニアルライグラスのエバガード、カリブラ、トーブ、フレンド、ポコロ、ヤツカゼ、ヤツカゼ２、ヤツユタカ、及びハイブリッドライグラスのハイフローラの９品種をテンプレートとして使用した。
【００４３】
ペレニアルライグラスのエバガード、カリブラ、トーブ、フレンド、ポコロ、ヤツカゼ、ヤツカゼ２、ヤツユタカ及びハイブリッドライグラスのハイフローラの９品種から、ＣＴＡＢ法を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。
【００４４】
抽出したＤＮＡ溶液は、滅菌水でＤＮＡ濃度を５０ｎｇ／μｌに調整し、１０個体を混合し、バルクしたものを、ＰＣＲ用のテンプレートＤＮＡとして用いた。
【００４５】
ＰＣＲ反応液：計１０μｌは、以下の通りである。
ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス対象品種から抽出したバルクＤＮＡ：１μｌ
ＧｅｎｅＡｍｐ １０×ＰＣＲ Ｇｏｌｄ Ｂｕｆｆｅｒ：１μｌ
ＧｅｎｅＡｍｐ ｄＮＴＰ ＭＩＸ：１μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２：０．６μｌ
ｄｄＨ２Ｏ：５．６４μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｆｏｒｗａｄ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：０．０６μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：０．３μｌ
Ｍ１３Ｆｏｒｗａｒｄ（−２９）Ｐｒｉｍｅｒ：０．３μｌ
ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（５ Ｕｎｉｔｓ／μｌ）：０．１μｌ
【００４６】
ＰＣＲ条件は、以下の通りである。
９４℃１分−６５℃１分−７２℃１分３０秒（２サイクル）９４℃１分−６５℃１分−７２℃１分３０秒（１０サイクル。１サイクルごとに６５℃を１℃ずつ下げていく）９４℃１分−５５℃１分−７２℃１分３０秒（３０サイクル）で反応させた。ＰＣＲ増幅産物は、色素マーカー２０μｌを加え、９４℃３分のディネーチャーを行った後、遮光し、氷上で３分以上静置させた後、アクリルアミドゲルを使用して、電気泳動を行い、マーカーの増幅を確認した。
【００４７】
本実施例では、ペレニアルライグラス８品種、及びハイブリッドライグラス１品種の合計９品種それぞれのバルクしたＤＮＡを５サンプル使用して、電気泳動を行い、９品種を同時に比較した。
【００４８】
プライマー「０４−０９Ｆ」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１に示す。このプライマー対では、エバガードのみ３５０ｂｐ付近で増幅が無く、エバガードの識別に有効であった。
【００４９】
プライマー「０３−０４Ｅ」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図２に示す。このプライマー対では、エバガードのみ３５０ｂｐ付近で増幅を示し、エバガードの識別に有効であった。
【００５０】
プライマー「１０−１０Ｃ」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図３に示す。このプライマー対では、ヤツユタカのみ２５０ｂｐ付近で増幅を示し、ヤツユタカの識別に有効であった。
【００５１】
プライマー「Ａ０９Ａ１８」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図４に示す。このプライマー対では、エバガードのみ１２０ｂｐ付近で増幅を示し、エバガードの識別に有効であった。
【００５２】
プライマー「Ａ０９Ｆ１１」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図５に示す。このプライマー対では、ハイフローラのみ３００ｂｐ付近で増幅を示し、ハイフローラの識別に有効であった。
【００５３】
プライマー「Ｃ０７Ｈ０６」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図６に示す。このプライマー対では、エバガードのみ２００ｂｐ付近で増幅を示し、エバガードの識別に有効であった。
【００５４】
プライマー「Ｄ０２Ｃ２２」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図７に示す。このプライマー対では、エバガードのみ１０００ｂｐ付近で増幅が無く、エバガードの識別に有効であった。また、カリブラのみ２００〜２５０ｂｐの間で増幅を示し、カリブラの識別にも有効であった。
【００５５】
プライマー「Ｄ０９Ｍ２２」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図８に示す。このプライマー対では、エバガードのみ２５０〜３００ｂｐの間で増幅が無く、エバガードの識別に有効であった。
【００５６】
プライマー「ＥＳ６９９１１８」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図９に示す。このプライマー対では、ヤツカゼ２の１４０ｂｐ付近に増幅が無く、ヤツカゼ２の識別に有効であった。なお、エバガード及びヤツカゼも同サイズに増幅が無いため、「０４−０９Ｆ」、「０３−０４Ｅ」、「Ａ０９Ａ１８」、「Ｃ０７Ｈ０６」、「Ｄ０２Ｃ２２」のいずれかのプライマー対を使用して、エバガードと比較するとともに、「ＥＳ７００４０３」のプライマー対を使用して、ヤツカゼと比較する必要がある。
【００５７】
プライマー「ＥＳ６９９１２６」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１０に示す。このプライマー対では、ポコロの２５０ｂｐ付近に増幅が無く、ポコロの識別に有効であった。なお、エバガードも同サイズに増幅が無いため、「０４−０９Ｆ」、「０３−０４Ｅ」、「Ａ０９Ａ１８」、「Ｃ０７Ｈ０６」、「Ｄ０２Ｃ２２」のいずれかのプライマー対を使用して、エバガードと比較する必要がある。
【００５８】
プライマー「ＥＳ６９９６８９」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１１に示す。このプライマー対では、ヤツユタカのみ２００ｂｐ付近で増幅を示し、ヤツユタカの識別に有効であった。
【００５９】
プライマー「ＥＳ６９９９８３」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１２に示す。このプライマー対では、トーブの１６０〜２００ｂｐの間で増幅を示し、トーブの識別に有効であった。なお、カリブラも同サイズで増幅を示すため、「Ｄ０２Ｃ２２」又は「ＥＳ６９９１６４」のプライマー対を使用して、カリブラと比較する必要がある。
【００６０】
プライマー「ＥＳ７００４０３」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１３に示す。このプライマー対では、ヤツカゼのみ１５０ｂｐ付近で増幅が無く、ヤツカゼの識別に有効であった。
【００６１】
プライマー「ＥＳ６９９１６４」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１４に示す。このプライマー対では、カリブラのみ３００ｂｐ付近で増幅が無く、カリブラの識別に有効であった。本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を、図１５〜１９に示す。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
以上詳述したように、本発明は、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別に有用なＳＳＲプライマー対及びその利用に係るものであり、本発明により、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス８品種の特定のＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦプライマー及びＲプライマー対、該プライマーを利用してＰＣＲ増幅させた特定マーカー遺伝子を提供することができる。また、本発明は、単数又は複数のプライマー対を使用したＰＣＲにより識別対象の遺伝子を増幅させ、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを検証することにより、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別を行うことができる。本発明により、ペレニアルライグラスのエバガード、カリブラ、トーブ、ポコロ、ヤツカゼ、ヤツカゼ２、ヤツユタカ及びハイブリッドライグラスのハイフローラからなる８品種相互での品種識別を行うことができる。本発明は、短い時間で、正確なペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別を可能にする新しい品種識別方法を提供するものとして有用である。
【符号の説明】
【００６３】
１ エバガード
２ カリブラ
３ トーブ
４ フレンド
５ ポコロ
６ ヤツカゼ
７ ヤツカゼ２
８ ヤツユタカ
９ ハイフローラ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別用のプライマー及びその利用に関するものであり、更に詳しくは、ペレニアルライグラス７品種及びハイブリッドライグラス１品種の合計８品種を識別することを可能とする、特定のＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦプライマー及びＲプライマー対、及びその利用に関するものである。本発明は、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別用のＳＳＲプライマー、及び該プライマーを利用してイタリアンライグラス及びハイブリッドライグラスのゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅させた特定マーカー遺伝子、その増幅断片を比較することで品種を識別することを可能とするペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス品種の識別方法に関する新技術・新製品を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
ペレニアルライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ Ｌ．）及びハイブリッドライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ ｘ ｂｏｕｃｈｅａｎｕｍ Ｋｕｎｔｈ）は、主に飼料作物として利用される多年生の他殖性のイネ科植物である。先行技術として、主に飼料作物として利用される他殖性のイネ科牧草の品種識別法としては、イタリアンライグラスにおいて、１２品種を識別する方法が開発されている（特許文献１参照）。
【０００３】
この方法は、イタリアンライグラスのゲノム上のＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域をＰＣＲで増幅させ、増幅された断片の長さの違いを検出することで品種を識別するものである。しかし、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスにおいては、このような品種識別法が開発されていない。
【０００４】
このため、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別は、これまで、圃場での特性調査により行われてきた。圃場での特性調査とは、例えば、一検体につき１０個体６反復計６０個体を栽培し、草丈、出穂月日、草型、葉身長等の形質を調査し、共に栽培した６０個体の標準個体と比較して同品種かどうか判定を行う方法である。しかしながら、このような圃場での特性調査は、１）調査のための圃場が必要である、２）調査に多くの労力が必要である、３）調査結果が判明するまでに多くの時間が必要である、等の問題点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−２３７１８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、短期間で、簡便且つ正確にペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス８品種を識別できる新しい手法を開発することを目標として鋭意研究を重ねた結果、イタリアンライグラス及びペレニアルライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて作成したプライマーから増幅されるマーカーを用いることにより所期の目的を達成し得ることを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は、労力及び時間が必要な従来の圃場での特性調査に代わり、短期間で、簡便且つ正確にペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別を可能にするＰＣＲ用のプライマー対、該プライマー対を利用して、ＰＣＲ増幅させた特定マーカー遺伝子、及び該特定マーカーを利用したペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別用のプライマーであって、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対。
（２）イタリアンライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両端の塩基配列を用いて設計した遺伝子増幅用プライマー対であって、配列表の配列番号１〜８のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号９〜１６のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを１対とするプライマー対である、前記（１）に記載のプライマー対。
（３）ペレニアルライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両端の塩基配列を用いて設計した遺伝子増幅用プライマー対であって、配列表の配列番号１７〜２２のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号２３〜２８のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを１対とするプライマー対である、前記（１）に記載のプライマー対。
（４）前記（２）及び（３）に記載のプライマー対の単数又は複数の組合せからなることを特徴とするペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別用プライマーセット。
（５）前記（１）から（４）のいずれかに記載のプライマーを利用してペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域をＰＣＲ増幅させたことを特徴とする特定マーカー遺伝子。
（６）配列表の配列番号２９〜３６のいずれかの塩基配列を有する、前記（５）に記載の特定マーカー遺伝子。
（７）ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する前記（１）から（４）のいずれかに記載のプライマーから増幅されるマーカーを使用し、識別対象のペレニアルライグラス又はハイブリッドライグラスＤＮＡのＰＣＲ増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うことを特徴とするペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別方法。
（８）識別対象のペレニアルライグラス又はハイブリッドライグラス遺伝子のＰＣＲ増幅産物である特定マーカー遺伝子のサイズ又はバンドパターンに基づいて、品種の識別を行うことを特徴とするペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別方法。
（９）対象品種のバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用したペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に、数品種の識別を行う、前記（７）又は（８）に記載の方法。
（１０）エバガード、カリブラ、トーブ、ポコロ、ヤツカゼ、ヤツカゼ２、ヤツユタカの７品種からなるペレニアルライグラス、及びハイフローラの１品種からなるハイブリッドライグラスの合計８品種を識別する、前記（７）から（９）のいずれかに記載の方法。
【０００９】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別用のプライマーであって、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対の点に特徴を有するものである。また、本発明は、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別方法であって、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する上記のプライマーから増幅されるマーカーを使用し、識別対象のペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスＤＮＡのＰＣＲによる増幅を行い、その増幅産物の多型を確認することで、品種の識別を行うことを特徴とするものである。
【００１０】
本発明では、イタリアンライグラス及びペレニアルライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて作成したプライマー対から、識別対象のペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス遺伝子の特定マーカーをＰＣＲ増幅し、そのマーカー遺伝子のサイズ又はバンドパターン（複数の遺伝子座のバンドの有無による組み合わせ）を確認することで、品種の識別を行う。
【００１１】
本発明では、個体単位での解析が不要となるため、対象品種のバルクＤＮＡを使用したペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に、数品種の識別を行う。他殖性であるペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスは、個体間で遺伝的に異なるが、バルクＤＮＡをテンプレートとして用いることによって、この品種の非特異的な個体間の差異を無くし、且つ効率よく、品種の識別が可能となる。
【００１２】
本発明では、２〜５塩基が高頻度に繰り返された配列からなるＳＳＲ領域の両側を挟むように設計した遺伝子増幅用プライマーの１４対のプライマー（表１参照）で、単数又は複数のプライマー対を使用し、対象となるペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス８品種について、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅断片を比較することで、品種を識別する。
【００１３】
本発明では、実際の使用時に、バルクＤＮＡをテンプレートとすることを想定し、品種特異的なＳＳＲマーカーを選抜するため、対象品種のゲノムＤＮＡを複数個体バルクしたＤＮＡをテンプレートとすることにより識別を行う。そのため、本発明では、例えば、濃度を一定にしたペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのＤＮＡを１０個体合わせて、バルクＤＮＡテンプレートとして使用する。
【００１４】
本発明で使用されるＳＳＲプライマー対は、プライマー設計ソフトウエア「Ｐｒｉｍｅｒ０．５，ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｒｉｍｅｒ０．５」を使用して作成した。本発明のペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別に有用なプライマー対の配列を表１に示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】
次に、上記表１の配列のプライマー対の９品種内での増幅型の詳細について説明する（表２参照）。プライマー「０４−０９Ｆ」は、エバガードを識別するプライマー対で、３５０ｂｐ付近で増幅しない、すなわち、品種特異的に特定ｂｐの増幅がみられない、というパターンを示す。
【００１７】
プライマー「０３−０４Ｅ」は、エバガードを識別するプライマー対で、３５０ｂｐ付近で増幅する、すなわち、品種特異的に特定ｂｐの増幅がある、というパターンを示す。
【００１８】
プライマー「１０−１０Ｃ」は、ヤツユタカを識別するプライマー対で、２５０ｂｐ付近で増幅する、というパターンを示す。
【００１９】
プライマー「Ａ０９Ａ１８」は、エバガードを識別するプライマー対で、１２０ｂｐ付近で増幅する、というパターンを示す。
【００２０】
プライマー「Ａ０９Ｆ１１」は、ハイフローラを識別するプライマー対で、３００ｂｐ付近で増幅する、というパターンを示す。
【００２１】
プライマー「Ｃ０７Ｈ０６」は、エバガードを識別するプライマー対で、２００ｂｐ付近で増幅する、というパターンを示す。
【００２２】
プライマー「Ｄ０２Ｃ２２」は、エバガード及びカリブラを識別するプライマー対で、１０００ｂｐ付近でエバガードが増幅しない、というパターンを示し、２００ｂｐ〜２５０ｂｐの間でカリブラが増幅する、というパターンを示す。
【００２３】
プライマー「Ｄ０９Ｍ２２」は、エバガードを識別するプライマー対で、２５０ｂｐ〜３００ｂｐの間で増幅しない、というパターンを示す。
【００２４】
プライマー「ＥＳ６９９１１８」は、ヤツカゼ２を識別するプライマー対で、１４０ｂｐ付近で増幅しない、というパターンを示す。しかし、同サイズで、エバガード及びヤツカゼも増幅しない、というパターンを示すため、「０４−０９Ｆ」、「０３−０４Ｅ」、「Ａ０９Ａ１８」、「Ｃ０７Ｈ０６」、「Ｄ０２Ｃ２２」のいずれかのプライマー対を使用して、エバガードと比較するとともに、「ＥＳ７００４０３」のプライマー対を使用して、ヤツカゼと比較する必要がある。
【００２５】
プライマー「ＥＳ６９９１２６」は、ポコロを識別するプライマー対で、２５０ｂｐ付近で増幅しない、というパターンを示す。しかし、同サイズで、エバガードも増幅しない、というパターンを示すため、「０４−０９Ｆ」、「０３−０４Ｅ」、「Ａ０９Ａ１８」、「Ｃ０７Ｈ０６」、「Ｄ０２Ｃ２２」のいずれかのプライマー対を使用して、エバガードと比較する必要がある。
【００２６】
プライマー「ＥＳ６９９６８９」は、ヤツユタカを識別するプライマー対で、２００ｂｐ付近で増幅する、というパターンを示す。
【００２７】
プライマー「ＥＳ６９９９８３」は、トーブを識別するプライマー対で、１６０ｂｐ〜２００ｂｐの間で増幅する、というパターンを示す。しかし、同サイズで、カリブラも増幅が見られることから、「Ｄ０２Ｃ２２」又は「ＥＳ６９９１６４」のプライマー対を使用して、カリブラと比較する必要がある。
【００２８】
プライマー「ＥＳ７００４０３」は、ヤツカゼを識別するプライマー対で、１５０ｂｐ付近で増幅しない、というパターンを示す。
【００２９】
プライマー「ＥＳ６９９１６４」は、カリブラを識別するプライマー対で、３００ｂｐ付近で増幅しない、というパターンを示す。上記のプライマーを９品種内で比較した場合、見られるバンドパターンを、次の表２にまとめて示す。
【００３０】
【表２】
【００３１】
本発明では、ペレニアルライグラスのエバガード、カリブラ、トーブ、フレンド（本発明に含まれていない）、ポコロ、ヤツカゼ、ヤツカゼ２、ヤツユタカ及びハイブリッドライグラスのハイフローラの９品種から、ＣＴＡＢ法を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出する。
【００３２】
抽出したゲノムＤＮＡ溶液は、一定濃度に調整し、１０個体を混合し、バルクしたものをＰＣＲ用のテンプレートＤＮＡとして使用する。
【００３３】
ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス対象品種から抽出したバルクＤＮＡを用いて、ＰＣＲ反応液を調製する。ＰＣＲ反応液及びＰＣＲ条件は、後記する実施例に示したものが好適であるが、これらに制限されるものではなく、使用する機器に応じて、適宜修正することができる。
【００３４】
ＰＣＲ増幅産物は、色素マーカーを加え、ディネーチャーを行った後、遮光し、氷上に静置して、安定化させる。次いで、アクリルアミドゲルを使用して、電気泳動を行い、マーカーの増幅を確認する。本発明では、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの９品種のバルクＤＮＡを使用して、電気泳動を行い、９品種内の複数の品種を同時に比較することができる。
【００３５】
本発明では、識別対象のペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス遺伝子の特定マーカーをＰＣＲ増幅し、そのマーカー遺伝子のサイズを確認することにより、又はバンドパターンを確認すること、すなわち、複数の遺伝子座のバンドの有無による組み合わせを確認することにより、品種の識別を実施する。本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を、図１５〜１９に示す。
【発明の効果】
【００３６】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）本発明により、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種を識別するペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのＳＳＲマーカーが提供される。
（２）単数又は複数のプライマー対を使用したＰＣＲによる識別対象の遺伝子を増幅させ、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを検証することにより、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別を行うことができる。
（３）本発明により、エバガード、カリブラ、トーブ、ポコロ、ヤツカゼ、ヤツカゼ２、ヤツユタカ、ハイフローラからなる８品種相互での品種識別を行うことができる。
（４）個体単位の解析ではなく、複数個体のＤＮＡを混合するバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとすることにより、解析時間の短縮及び正確な品種識別が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】実施例における０４−０９Ｆを用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。Ｍは、サイズマーカーを示す。それぞれ５サンプルの電気泳動した結果を示す。図２〜１４も同様である。
【図２】実施例における０３−０４Ｅを用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図３】実施例における１０−１０Ｃを用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図４】実施例におけるＡ０９Ａ１８を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図５】実施例におけるＡ０９Ｆ１１を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図６】実施例におけるＣ０７Ｈ０６を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図７】実施例におけるＤ０２Ｃ２２を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図８】実施例におけるＤ０９Ｍ２２を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図９】実施例におけるＥＳ６９９１１８を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１０】実施例におけるＥＳ６９９１２６を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１１】実施例におけるＥＳ６９９６８９を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１２】実施例におけるＥＳ６９９９８３を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１３】実施例におけるＥＳ７００４０３を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１４】実施例におけるＥＳ６９９１６４を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１５】本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【図１６】本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【図１７】本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【図１８】本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【図１９】本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
次に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
本実施例で使用した機器は、以下の通りである。
すなわち、本実施例では、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ （タカラバイオ株式会社）、及び、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を用いた。
【００４０】
本実施例で使用した試薬は、以下の通りである。
〈６％アクリルアミドゲル〉
アクリルアミドゲルとして、尿素（和光純薬工業株式会社）、アクリルアミド／ビス４０％溶液１９：１（日本バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社）、１０ｘＴＢＥ ｂｕｆｆｅｒ、１０％ＡＰＳ、ＴＥＭＥＤ（和光純薬工業株式会社）を用いた。
【００４１】
〈ＰＣＲ反応液〉
ＰＣＲ反応液として、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）、１ｐｍｏｌ／μｌ Ｍ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ（−２９）Ｐｒｉｍｅｒ：ＩＲＤ７００もしくはＩＲＤ８００の蛍光標識を含む（日清紡）を用いた。色素マーカーとしては、ＧｅｎｅＳｃａｎ ５００（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）又は１００ｂｐ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｒｕｌｅｒ（日本バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社）を用いた。
【００４２】
本実施例では、ペレニアルライグラスのエバガード、カリブラ、トーブ、フレンド、ポコロ、ヤツカゼ、ヤツカゼ２、ヤツユタカ、及びハイブリッドライグラスのハイフローラの９品種をテンプレートとして使用した。
【００４３】
ペレニアルライグラスのエバガード、カリブラ、トーブ、フレンド、ポコロ、ヤツカゼ、ヤツカゼ２、ヤツユタカ及びハイブリッドライグラスのハイフローラの９品種から、ＣＴＡＢ法を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。
【００４４】
抽出したＤＮＡ溶液は、滅菌水でＤＮＡ濃度を５０ｎｇ／μｌに調整し、１０個体を混合し、バルクしたものを、ＰＣＲ用のテンプレートＤＮＡとして用いた。
【００４５】
ＰＣＲ反応液：計１０μｌは、以下の通りである。
ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス対象品種から抽出したバルクＤＮＡ：１μｌ
ＧｅｎｅＡｍｐ １０×ＰＣＲ Ｇｏｌｄ Ｂｕｆｆｅｒ：１μｌ
ＧｅｎｅＡｍｐ ｄＮＴＰ ＭＩＸ：１μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２：０．６μｌ
ｄｄＨ２Ｏ：５．６４μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｆｏｒｗａｄ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：０．０６μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：０．３μｌ
Ｍ１３Ｆｏｒｗａｒｄ（−２９）Ｐｒｉｍｅｒ：０．３μｌ
ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（５ Ｕｎｉｔｓ／μｌ）：０．１μｌ
【００４６】
ＰＣＲ条件は、以下の通りである。
９４℃１分−６５℃１分−７２℃１分３０秒（２サイクル）９４℃１分−６５℃１分−７２℃１分３０秒（１０サイクル。１サイクルごとに６５℃を１℃ずつ下げていく）９４℃１分−５５℃１分−７２℃１分３０秒（３０サイクル）で反応させた。ＰＣＲ増幅産物は、色素マーカー２０μｌを加え、９４℃３分のディネーチャーを行った後、遮光し、氷上で３分以上静置させた後、アクリルアミドゲルを使用して、電気泳動を行い、マーカーの増幅を確認した。
【００４７】
本実施例では、ペレニアルライグラス８品種、及びハイブリッドライグラス１品種の合計９品種それぞれのバルクしたＤＮＡを５サンプル使用して、電気泳動を行い、９品種を同時に比較した。
【００４８】
プライマー「０４−０９Ｆ」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１に示す。このプライマー対では、エバガードのみ３５０ｂｐ付近で増幅が無く、エバガードの識別に有効であった。
【００４９】
プライマー「０３−０４Ｅ」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図２に示す。このプライマー対では、エバガードのみ３５０ｂｐ付近で増幅を示し、エバガードの識別に有効であった。
【００５０】
プライマー「１０−１０Ｃ」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図３に示す。このプライマー対では、ヤツユタカのみ２５０ｂｐ付近で増幅を示し、ヤツユタカの識別に有効であった。
【００５１】
プライマー「Ａ０９Ａ１８」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図４に示す。このプライマー対では、エバガードのみ１２０ｂｐ付近で増幅を示し、エバガードの識別に有効であった。
【００５２】
プライマー「Ａ０９Ｆ１１」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図５に示す。このプライマー対では、ハイフローラのみ３００ｂｐ付近で増幅を示し、ハイフローラの識別に有効であった。
【００５３】
プライマー「Ｃ０７Ｈ０６」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図６に示す。このプライマー対では、エバガードのみ２００ｂｐ付近で増幅を示し、エバガードの識別に有効であった。
【００５４】
プライマー「Ｄ０２Ｃ２２」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図７に示す。このプライマー対では、エバガードのみ１０００ｂｐ付近で増幅が無く、エバガードの識別に有効であった。また、カリブラのみ２００〜２５０ｂｐの間で増幅を示し、カリブラの識別にも有効であった。
【００５５】
プライマー「Ｄ０９Ｍ２２」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図８に示す。このプライマー対では、エバガードのみ２５０〜３００ｂｐの間で増幅が無く、エバガードの識別に有効であった。
【００５６】
プライマー「ＥＳ６９９１１８」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図９に示す。このプライマー対では、ヤツカゼ２の１４０ｂｐ付近に増幅が無く、ヤツカゼ２の識別に有効であった。なお、エバガード及びヤツカゼも同サイズに増幅が無いため、「０４−０９Ｆ」、「０３−０４Ｅ」、「Ａ０９Ａ１８」、「Ｃ０７Ｈ０６」、「Ｄ０２Ｃ２２」のいずれかのプライマー対を使用して、エバガードと比較するとともに、「ＥＳ７００４０３」のプライマー対を使用して、ヤツカゼと比較する必要がある。
【００５７】
プライマー「ＥＳ６９９１２６」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１０に示す。このプライマー対では、ポコロの２５０ｂｐ付近に増幅が無く、ポコロの識別に有効であった。なお、エバガードも同サイズに増幅が無いため、「０４−０９Ｆ」、「０３−０４Ｅ」、「Ａ０９Ａ１８」、「Ｃ０７Ｈ０６」、「Ｄ０２Ｃ２２」のいずれかのプライマー対を使用して、エバガードと比較する必要がある。
【００５８】
プライマー「ＥＳ６９９６８９」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１１に示す。このプライマー対では、ヤツユタカのみ２００ｂｐ付近で増幅を示し、ヤツユタカの識別に有効であった。
【００５９】
プライマー「ＥＳ６９９９８３」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１２に示す。このプライマー対では、トーブの１６０〜２００ｂｐの間で増幅を示し、トーブの識別に有効であった。なお、カリブラも同サイズで増幅を示すため、「Ｄ０２Ｃ２２」又は「ＥＳ６９９１６４」のプライマー対を使用して、カリブラと比較する必要がある。
【００６０】
プライマー「ＥＳ７００４０３」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１３に示す。このプライマー対では、ヤツカゼのみ１５０ｂｐ付近で増幅が無く、ヤツカゼの識別に有効であった。
【００６１】
プライマー「ＥＳ６９９１６４」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１４に示す。このプライマー対では、カリブラのみ３００ｂｐ付近で増幅が無く、カリブラの識別に有効であった。本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を、図１５〜１９に示す。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
以上詳述したように、本発明は、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別に有用なＳＳＲプライマー対及びその利用に係るものであり、本発明により、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス８品種の特定のＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦプライマー及びＲプライマー対、該プライマーを利用してＰＣＲ増幅させた特定マーカー遺伝子を提供することができる。また、本発明は、単数又は複数のプライマー対を使用したＰＣＲにより識別対象の遺伝子を増幅させ、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを検証することにより、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別を行うことができる。本発明により、ペレニアルライグラスのエバガード、カリブラ、トーブ、ポコロ、ヤツカゼ、ヤツカゼ２、ヤツユタカ及びハイブリッドライグラスのハイフローラからなる８品種相互での品種識別を行うことができる。本発明は、短い時間で、正確なペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別を可能にする新しい品種識別方法を提供するものとして有用である。
【符号の説明】
【００６３】
１ エバガード
２ カリブラ
３ トーブ
４ フレンド
５ ポコロ
６ ヤツカゼ
７ ヤツカゼ２
８ ヤツユタカ
９ ハイフローラ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別用のプライマーであって、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対。
【請求項２】
イタリアンライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両端の塩基配列を用いて設計した遺伝子増幅用プライマー対であって、配列表の配列番号１〜８のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号９〜１６のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを１対とするプライマー対である、請求項１に記載のプライマー対。
【請求項３】
ペレニアルライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両端の塩基配列を用いて設計した遺伝子増幅用プライマー対であって、配列表の配列番号１７〜２２のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号２３〜２８のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを１対とするプライマー対である、請求項１に記載のプライマー対。
【請求項４】
請求項２及び３に記載のプライマー対の単数又は複数の組合せからなることを特徴とするペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別用プライマーセット。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のプライマーを利用してペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域をＰＣＲ増幅させたことを特徴とする特定マーカー遺伝子。
【請求項６】
配列表の配列番号２９〜３６のいずれかの塩基配列を有する、請求項５に記載の特定マーカー遺伝子。
【請求項７】
ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する請求項１から４のいずれかに記載のプライマーから増幅されるマーカーを使用し、識別対象のペレニアルライグラス又はハイブリッドライグラスＤＮＡのＰＣＲ増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うことを特徴とするペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別方法。
【請求項８】
識別対象のペレニアルライグラス又はハイブリッドライグラス遺伝子のＰＣＲ増幅産物である特定マーカー遺伝子のサイズ又はバンドパターンに基づいて、品種の識別を行うことを特徴とするペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別方法。
【請求項９】
対象品種のバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用したペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に、数品種の識別を行う、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
エバガード、カリブラ、トーブ、ポコロ、ヤツカゼ、ヤツカゼ２、ヤツユタカの７品種からなるペレニアルライグラス、及びハイフローラの１品種からなるハイブリッドライグラスの合計８品種を識別する、請求項７から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別用のプライマーであって、ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対。
【請求項２】
イタリアンライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両端の塩基配列を用いて設計した遺伝子増幅用プライマー対であって、配列表の配列番号１〜８のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号９〜１６のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを１対とするプライマー対である、請求項１に記載のプライマー対。
【請求項３】
ペレニアルライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両端の塩基配列を用いて設計した遺伝子増幅用プライマー対であって、配列表の配列番号１７〜２２のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号２３〜２８のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを１対とするプライマー対である、請求項１に記載のプライマー対。
【請求項４】
請求項２及び３に記載のプライマー対の単数又は複数の組合せからなることを特徴とするペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別用プライマーセット。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のプライマーを利用してペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域をＰＣＲ増幅させたことを特徴とする特定マーカー遺伝子。
【請求項６】
配列表の配列番号２９〜３６のいずれかの塩基配列を有する、請求項５に記載の特定マーカー遺伝子。
【請求項７】
ペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する請求項１から４のいずれかに記載のプライマーから増幅されるマーカーを使用し、識別対象のペレニアルライグラス又はハイブリッドライグラスＤＮＡのＰＣＲ増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うことを特徴とするペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別方法。
【請求項８】
識別対象のペレニアルライグラス又はハイブリッドライグラス遺伝子のＰＣＲ増幅産物である特定マーカー遺伝子のサイズ又はバンドパターンに基づいて、品種の識別を行うことを特徴とするペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラスの品種識別方法。
【請求項９】
対象品種のバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用したペレニアルライグラス及びハイブリッドライグラス遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に、数品種の識別を行う、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
エバガード、カリブラ、トーブ、ポコロ、ヤツカゼ、ヤツカゼ２、ヤツユタカの７品種からなるペレニアルライグラス、及びハイフローラの１品種からなるハイブリッドライグラスの合計８品種を識別する、請求項７から９のいずれかに記載の方法。
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１１−２１１９３３（Ｐ２０１１−２１１９３３Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−８１５３４（Ｐ２０１０−８１５３４）
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【出願人】（５０１０２５３８８）社団法人日本草地畜産種子協会 (11)
【出願人】（３０１０２９４０３）独立行政法人家畜改良センター (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【出願人】（５０１０２５３８８）社団法人日本草地畜産種子協会 (11)
【出願人】（３０１０２９４０３）独立行政法人家畜改良センター (12)
【Ｆターム（参考）】
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